CN102257146A - 通过在转基因植物中引入磷酸酶来加速植物生长和改进产量的方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了生长速率提高、糖含量增加和产量上升的转基因植物及用于制备所述植物的方法。所述转基因植物具有在掺入到植物的基因组DNA中的异源启动子控制下的编码具有C-末端基序的磷酸酶的基因。

Description

通过在转基因植物中引入磷酸酶来加速植物生长和改进产量的方法

相关申请

本申请要求保护于2008年12月18日提交的临时申请序号61/138,918的优先权，其通过引用结合到本文中。

1.技术领域

本公开内容提供通过将具C-末端基序的磷酸酶引入到植物中来加速植物生长和提高植物产量的方法。本公开内容涉及具C-末端基序的磷酸酶及其各自编码的蛋白产物以及其片段、衍生物、同源物和变体。提供将这些基因引入到植物中以实现以下目的的方法：(1)加速植物生长速率；(2)提高植物的糖含量；和(3)增加植物的产量。

2.背景

紫色酸性磷酸酶(PAP)催化各种各样的活化磷酸单酯和磷酸二酯及酐的水解(Klabunde等，1996)。PAP蛋白特征在于5个保守基序XDXX、XDXXY、GNH(D/E)、XXXH、XHXH中的7个保守的氨基酸残基(以黑体显示)，其参与活性位点中双金属核心(Fe³⁺-Me²⁺)的配位(Li等，2002)，其中Me为过渡金属，而主要发现在哺乳动物中Me²⁺为Fe²⁺，在植物中Me²⁺为Zn²⁺或Mn²⁺(Klabunde和Krebs，1997，Schenk等，1999)。

紫色酸性磷酸酶以其特征紫色区别于其它磷酸酶，紫色由在560nm下从金属配位的酪氨酸到金属配体Fe³⁺的电荷转移跃迁产生(Klabunde和Krebs，1997；Schenk等，2000)。不同于其它酸性磷酸酶，PAP对酒石酸盐抑制不敏感，因此它们亦被称为抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)。

首先在红色菜豆中后来在以下植物中表征了某些植物PAP的生物化学特性：大豆悬浮细胞、大豆幼苗、稻培养物细胞、菠菜叶、甘薯块茎、西红柿、黄色羽扇豆种子、苜蓿和拟南芥(Arabidopsis)等(Schenk等，1999)。通常基于其水解磷酸盐化合物的能力认为植物PAP介导磷获得和再分配(Cashikar等，1997；Bozzo等，2004；Lung等，2008)。培养基或土壤中的外部磷酸盐水平调节某些植物PAP转录，这强烈表明PAP参与磷酸盐获得。例如，P胁迫下提高苜蓿根部MtPAP1的转录水平，这表明其在P获得或内部动员中的作用(Xiao等，2005；Xiao等，2006)。某些植物PAP可从根部细胞分泌到细胞外环境，然后水解各种磷酸酯。Lung等纯化了来自烟草的分泌性PAP磷酸酶，其可水解多种底物，有助于减轻P饥饿(Lung等，2008)。某些植物PAP亦可水解肌醇六磷酸，肌醇六磷酸为植物中磷的主要贮存化合物。Hegeman和Grabau(2001)纯化了发芽大豆幼苗子叶的新型的PAP(GmPhy)。将GmPhy引入到大豆组织培养物中，经测定显示有磷酸酶活性。最近，发现与该大豆PAP享有高度序列同源性(73-52％)的拟南芥AtPAP15和23表现出肌醇六磷酸酶的活性(Zhu等，2005；Zhang等，2008)。

除参与P获得外，植物PAP还可履行某些其它生理作用。例如，PAP AtACP5(AtPAP17)、SAP1和SAP2(del Pozo等，1999；Bozzo等，2002)不仅显示磷酸酶活性，而且还显示过氧化物酶活性，这表明其参与植物器官中活性氧化合物的除去。有人提出复活节百合(Esterlily)的花粉特异性PAP在成熟花粉中起铁载体的作用(Kim和Gynheung，1996)。其它研究表明植物PAP亦可参与NaCl胁迫适应或细胞再生(Kaida，2003；Liao等，2003)。

在拟南芥基因组中，基于序列比较鉴定了29种潜在的PAP基因。这些假定的酶中有24种含有参与金属结合的7个保守的氨基酸残基。一种(AtPAP13)缺乏这7个残基中的4个，其余4种(AtPAP14、16、28和29)缺乏5个保守基序中的第一个、第二个或两个基序都缺。28种在拟南芥中活跃地转录(Zhu等，2005)。

迄今为止，尽管表征了数个成员(del Pozo等，1999)，但对AtPAP生物化学性质和生理作用知道得相当少。首先知道AtPAP17(AtACP5)由磷饥饿所诱导。根据GUS活性测定，AtPAP17转录亦对ABA、盐胁迫(NaCl)、氧化应激(H₂O₂)和叶衰老起反应。在氮或钾饥饿和百草枯(paraquat)或水杨酸期间，未观察到AtPAP17表达变化。像其它5型酸性磷酸酶一样，AtPAP17显示过氧化反应活性，其在植物的受胁迫或衰老部分可参与活性氧类别代谢。

除了AtPAP17外，发现还有几种AtPAP参与拟南芥的磷代谢。P胁迫诱导根分泌AtPAP12，其调节主要在转录水平(Patel等，1998；Coello，2002/11)。AtPAP4以及AtPAP10、AtPAP11和AtPAP12参与磷饥饿响应，因为在磷酸盐剥夺期间其转录水平提高(Li等，2002；Wu等，2003)。与此相反，AtPAP20、21和22与P饥饿无关，其在Pi充足或缺乏条件中组成型表达。经由杆状病毒表达系统在细胞质中检测到荧光信号，这表明它们可在细胞质中起作用(Li和Wang，2003)。

纯化并表征了来自Pi-饥饿的拟南芥悬浮细胞培养物中的AtPAP26(Veljanovski等，2006)。其作为与55kDa的糖基化蛋白的同型二聚体存在，对多种底物表现出特异性，且对磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和多肽磷酸盐(polypeptide phosphate)有最大的活性。AtPAP26亦显示碱性过氧化物酶活性，且可能在活性氧类别代谢中起作用。蛋白质组学研究表明其可位于液泡中，并参与细胞内P代谢物的Pi再循环(Shimaoka等，2004)。

PAP可对各种各样的底物起作用，但它们并不是全部表现出肌醇六磷酸酶活性。涉及GST-AtPAP23融合蛋白的酶测定显示AtPAP23表现出肌醇六磷酸酶活性。GUS研究表明，AtPAP23在拟南芥花中独有地表达，可能在花发育中起某些作用(Zhu等，2005)。在最近报告中，还发现在大肠杆菌(E.coli)和酵母菌中表达并部分纯化的重组AtPAP15表现出肌醇六磷酸酶的活性(Zhang等，2008)。提出AtPAP15可参与抗坏血酸生物合成，其中肌醇六磷酸水解的终产物肌醇作为抗坏血酸合成的前体。

如上所述，表征的植物PAP的大部分功能与磷代谢相关。没有一种功能上或生物化学上表征的植物PAP携带跨膜基序，它们中没有一种显示与膜相关。此外，迄今为止，没有AtPAP或任何植物PAP显示影响植物的糖信号转导和碳代谢。

在植物中转基因表达植物PAP的首个报道在2005年报道(Xiao等，2005)。来自苜蓿的PAP-磷酸酶基因(MtPHY1)在转基因拟南芥中表达，导致提高了从琼脂培养基的肌醇六磷酸中获得P的能力(Xiao等，2005)。但是，未报告植物的生长性能与正常生长下不同。

3.简述

本公开内容提供通过将具C-末端基序的磷酸酶引入植物来加速植物生长和提高植物产量的方法。公开了具C-末端基序的磷酸酶及其各自编码的蛋白产物以及其片段、衍生物、同源物和变体。提供了将该类基因引入到植物以加速植物生长速率、提高植物的糖含量和增加植物的产量的方法。在不愿受任何特定理论所约束的情况下，认为C-末端基序起跨膜结构元件(跨膜基序)的作用。

如上背景章节所述，表征的植物PAP的大部分功能与磷代谢有关。没有一种功能上或生物化学上表征的植物PAP携带跨膜基序，它们中没有一种显示与膜有关联。此外，迄今为止，没有AtPAP或任何植物PAP显示影响植物的糖信号转导和碳代谢。

植物中转基因表达植物PAP的首个报道在2005年报道(Xiao等，2005)。来自苜蓿的PAP-磷酸酶基因(MtPHY1)在转基因拟南芥中表达，导致提高了从琼脂培养基的肌醇六磷酸中获得P的能力。但是，未报告植物的生长性能与正常生长下不同。

我们亦制备了过表达AtPAP15的转基因烟草和拟南芥，AtPAP15是具有磷酸酶活性的PAP，其不携带等同于AtPAP2的C-末端基序的任何C-末端基序；将磷酸酶活性分泌到细胞外生长培养基。在转基因植物中观察到磷酸酶活性的显著分泌，并且在补充外源肌醇六磷酸的琼脂和土壤中，转基因植物比对照植物显示更多的生物量。在肌醇六磷酸处理的过表达转基因系中亦获得更高的P含量。然而，当在K-P或无-P处理或在土壤中与野生型比较时，过表达AtPAP15的转基因植物的生长在生长表型方面未显示任何差异。

在本发明中，我们开发了通过在植物中过表达具C-末端基序的磷酸酶来加速植物生长并改进种子产量的技术。一个实例是使用紫色酸性磷酸酶(PAP)。本公开内容第一个报道，在转基因植物中过表达具C-末端基序的磷酸酶能够通过改变植物的碳代谢来加速植物生长、提高植物的糖含量和增加植物的产量。

目前的进展部分地基于来自植物的紫色酸性磷酸酶(SEQ ID NO：1-8和18-47)群的表征及以下观察：在植物中过表达该群的紫色酸性磷酸酶(AtPAP2，SEQ ID NO：1)导致植物快速生长、较高糖含量和较高产量。因此，本文公开了来自植物的共有C-末端基序/结构域的紫色酸性磷酸酶基因群的核苷酸序列(SEQ ID NO：1、3、5、7、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44和46)及其编码的蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2、4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47)以及本文定义的其片段、衍生物、同源物和变体。此外，本文公开了编码目标多肽的核酸分子，包括cDNA、基因组DNA和RNA。

本文所用基因的斜体名称应表示该基因，与此相反，由该基因名称表示的其编码的蛋白质或多肽产物无任何斜体。例如，“基因”应意指基因本身，而“基因”应表示基因本身的蛋白质或多肽产物。

在一个实施方案中，分离的核酸分子在本文所定义的严格条件下与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44或46序列的核酸或其同源物杂交，其中所述核酸分子编码表现出至少一种本发明多肽的结构和/或功能特征的蛋白质或多肽。

另一实施方案包括以下核酸分子，其适于用作检测编码所公开磷酸酶多肽或其它序列中的一种的核酸的引物或杂交探针。

又一实施方案包括载体例如重组表达载体，其包含本发明核酸分子。此外，公开了含有所述载体或经工程改造以含有和/或表达本发明核酸分子的宿主细胞和含有与异源启动子可操作地连接的本发明核苷酸序列的宿主细胞。

再一实施方案包括用于通过重组DNA技术制备本发明多肽的方法，其中培养含有编码本发明多肽的重组表达载体或编码本发明多肽的与异源启动子可操作地连接的核苷酸序列的宿主细胞，并制备本发明多肽。

在又一实施方案中，转基因植物含有编码分离的多肽或蛋白质的核酸分子，所述多肽或蛋白质包含紫色酸性磷酸酶5个保守基序，所述基序包括XDXX、XDXXY、GNH(D/E)、XXXH、XHXH，并与C-末端基序连接。

实施方案还提供与本发明多肽免疫特异性结合的抗体。所述抗体包括但不限于来自各种动物的抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab′)₂片段、二硫键连接的Fvs、含有VL或VH结构域或甚至互补决定区(CDR)的片段，它们与本发明多肽免疫特异性结合。

在另外的实施方案中，提供用于检测生物材料(例如细胞、培养基等)中本发明多肽或相似多肽的存在情况、活性或表达的方法。可通过让生物材料与可直接或间接检测本发明多肽的存在情况、活性或表达的物质接触，来确定样品中所述多肽的活性或表达相对于对照样品是提高还是降低。在特定实施方案中，所述物质为与所公开的多肽之一免疫特异性结合的抗体或其片段。

在再一实施方案中，提供包含生物活性分子和所公开多肽或其片段的一个或多个结构域的融合蛋白。具体而言，包含生物活性分子的融合蛋白与所公开多肽或其片段的一个或多个结构域重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合两种)。

我们亦制备过表达AtPAP15的转基因烟草和拟南芥，AtPAP15为具磷酸酶活性的PAP，其不携带任何C-末端基序，发现其被分泌到细胞外生长培养基中。在转基因植物中观察到磷酸酶活性的显著分泌，在补充外源肌醇六磷酸的琼脂和土壤中的转基因植物比对照植物显出更多的生物量。在肌醇六磷酸处理的过表达转基因系中亦获得更高的P含量。然而，当在K-P或无-P处理下或在土壤中与野生型比较时，过表达AtPAP15的转基因植物的生长在生长表型方面未显示任何差异。

总之，本公开内容第一个报道证明在转基因植物中过表达具C-末端基序的磷酸酶能够通过改变植物的碳代谢来加速植物生长，提高植物的糖含量，并增加植物的产量。

3.1定义

本文所用术语“酸性”或″“酸性pH”是指小于约6.0的pH值。

本文所用术语“同源物”是指以下多肽，其具有与由SEQ ID NO：2、4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47编码的多肽和/或这些多肽的片段类似或相同的功能，但不具有与这些多肽和/或这些多肽的片段相同的氨基酸序列。包括在术语“同源物”定义中的具有相似氨基酸序列的多肽，包括满足至少以下之一的多肽：(i)具有以下氨基酸序列多肽：所述氨基酸序列的同一性为至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％和至少约98％中的一种或多种；(ii)由以下核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列与编码SEQ ID NO：2、4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47的多肽和/或这些多肽的片段中的一个或多个核苷酸序列具有至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％和至少约98％同一性中的一种或多种和/或保守取代；(iii)由以下核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在本文所定义的严格条件下与SEQ ID NO：1、3、5、7、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44和6中的一个或多个核苷酸序列杂交；(iv)具有以下氨基酸序列的多肽：所述氨基酸序列具有至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％和至少约98％同一性中的一种或多种和/或保守取代；(v)编码以下氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％和至少约98％同一性中的一种或多种和/或保守取代；(vi)(i)到(v)中所述的任何多肽或核酸序列的片段，所述片段为以下情况之一：具有至少20个氨基酸残基、至少25个氨基酸残基、至少40个氨基酸残基、至少80个氨基酸残基、至少90个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基、至少125个氨基酸残基、至少150个氨基酸残基、至少175个氨基酸残基、至少200个氨基酸残基、至少225个氨基酸残基、至少250个氨基酸残基、至少275个氨基酸残基、至少300个氨基酸残基、至少325个氨基酸残基、至少350个氨基酸残基或至少375个氨基酸残基；(vii)具有与由SEQ ID NO：2、4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47编码的多肽和/或这些多肽的片段相似结构和功能的多肽，或编码所述具有相似结构和功能的多肽的核苷酸序列(所述相似结构和功能表现在抗原性、免疫原性、催化活性和其它易于测定的活性方面)，是指具有类似于这些多肽或这些多肽片段的二级、三级或四级结构的多肽。多肽结构可通过本领域技术人员已知的方法测定，所述方法包括但不限于X射线晶体学、核磁共振和晶体学电子显微术。本文所用术语“同源物”阐述具有序列同源性的序列。用标准分子生物学技术可制备具有序列同源性的序列，所述技术包括定点诱变，包括插入或缺失序列。术语“同源物”不限于源自不同物种的同源基因或蛋白质，并明确地包括对本文所公开序列的人工修饰。

术语“保守取代的变体”是指以下多肽或编码同源物多肽的核酸序列，所述多肽中如下所述，一个或多个氨基酸残基或密码子已通过用化学类型相似的氨基酸残基或编码所述氨基酸残基的密码子的保守取代来修饰。

本文所用术语“与由SEQ ID NO：2、4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47编码的多肽免疫特异性结合的抗体或抗体片段”，是指以下抗体或其片段，其与由SEQID NO：2、4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47编码的多肽或这些多肽的片段免疫特异性结合，但不与其它多肽非特异性结合。与由SEQ ID NO：2、4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47编码的多肽或这些多肽的片段免疫特异性结合的抗体或其片段，可与其它抗原交叉反应。优选与由SEQ ID NO：2、4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47编码的多肽或这些多肽的片段免疫特异性结合的抗体或其片段，不与其它抗原交叉反应。可通过例如免疫测定法或本领域技术人员已知的其它技术，来鉴定与由SEQ ID NO：2、4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47编码的多肽或这些多肽的片段免疫特异性结合的抗体或其片段。与由SEQ ID NO：2、4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47编码的多肽免疫特异性结合的抗体或抗体片段，可被互换地称为“抗PAP抗体”。

本文所用术语“衍生物”是指另外修饰的既定肽或蛋白质，所述另外修饰例如通过让任何类型的分子(优选具有生物活性)与所述肽或蛋白质共价连接来实现，并包括掺入非天然存在的氨基酸。所获得的生物活性保留所述肽蛋白的一种或多种生物学活性。

本文所用术语“片段”是指以下核酸分子片段，其含有以下核酸碱基长度之一的相关核酸分子并具有所述核酸分子的至少一种功能特征(或编码的蛋白质具有所述核酸分子编码的蛋白质的一种功能特征)：至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约100、至少约150、至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500、至少约550、至少约600、至少约650、至少约700、至少约750、至少约800、至少约850、至少约900、至少约950、至少约1000、至少约1050、至少约1100、至少约1150、至少约1200、至少约1250、至少约1300、至少约1350、约500-约2000、约1000-约2000、约200-约500、约500-约1000、约1000-约1500和约1500-约2000个核酸碱基；或以下蛋白质或多肽的片段，其含有以下氨基酸残基长度中的一种或多种的相关蛋白质或多肽并具有所述蛋白质或多肽的至少一种功能特征：至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约90、至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180、至少约200、至少约220、至少约240、至少约260、至少约280、至少约300、至少约320、至少约340、至少约360、约250-约660、约350-约660、约450-约660和约550-约660个氨基酸残基，所述功能特征包括与Fe³⁺-Me²⁺双金属核心结合并形成C-末端基序的能力。

“分离的”核酸分子为与存在于核酸分子的天然来源中的其它核酸分子分离的核酸分子。此外，“分离的”核酸分子例如cDNA分子，当其由重组技术产生时可基本上不含其它细胞材料或培养基，或当其为化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质，但不包括存在于重组DNA库中的核酸分子。在优选实施方案中，分离或纯化编码所公开的多肽/蛋白质的核酸分子。

本文所用术语“可操作地连接”是指当在“可操作地连接”的启动子控制下转录时，产生功能信使RNA，其翻译导致产生由可操作地连接该启动子的DNA所编码的多肽。

术语“严格条件下”是指杂交和洗涤条件，在该条件下彼此具有同源性的核苷酸序列保持彼此杂交。所述杂交条件阐述于例如但不限于：Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6.；Basic Methods in Molecular Biology，ElsevierScience Publishing Co.，Inc.，N.Y.(1986)，第75-78页和第84-87页；和Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1982)，第387-389页，并且为本领域技术人员所熟知。严格杂交条件的优选非限制性实例为在约68℃于6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5％SDS中杂交，接着于室温在2X SSC、0.5％SDS中洗涤一次或多次。严格杂交条件的另一优选非限制性实例为于约45℃在6X SSC中杂交，接着于约50-65℃在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。

本文所用术语“变体”是指既定肽天然存在的等位基因变化，或既定肽或蛋白质的重组制备的变化，其中已通过氨基酸取代、添加或缺失对一个或多个氨基酸残基进行修饰。

本文所用术语“比对”是指用标准算法例如BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在两个或更多个序列之间进行的同源性比对。

本文术语“通过TMHMM分析预测形成跨膜基序”或“通过TMHMM分析预测形成C-末端基序”(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)是指等于或大于约0.5的概率。

附图简述

以下图阐明实施方案，并非意欲限制权利要求包含的本发明的范围。

图1显示拟南芥基因组中PAP样序列的系统树。用ClustalX比对了29个PAP，通过MEGA4程序的邻接算法创建了系统树。来自玉米(Zea mays)(ZmPAP2)和稻(Oryza sativa)(OsPAP2)的含有PAP样跨膜样C-末端基序的多肽的检索号分别为ACG47621和BAC15853.1。

图2A为AtPAP2与其它PAP序列的氨基酸比对，该图显示各个序列的全长。这些序列包括来自欧洲油菜(B.napus)(BnPAP2)、大豆(G.max)(GmPAP2)和玉米(ZmPAP2)的同源序列。框中为5个保守基序(XDXX、XDXXY、GNH(D/E)、XXXH、XHXH)。阴影中的残基具有低同源性或没有同源性。这些多肽C-末端的疏水基序用条块在下面标出(第614-636个氨基酸)，AtPAP15序列没有该基序。如所示，AtPAP15没有对应于其它PAP序列的C-末端区。

图2B为在AtPAP2和其同源序列中的C-末端跨膜样基序的氨基酸比对。

图3显示通过TMHMM分析独特的疏水基序存在于AtPAP2和ZmPAP2的C-末端。AtPAP15中不存在该跨膜样C-末端基序。

图4显示T-DNA系的特征。T-DNA系(Salk_013567)得自TAIR。AtPAP2基因组序列携带两个外显子，将T-DNA插入外显子2中，导致AtPAP2mRNA瓦解(a)。设计三种PCR引物(A、B和C)用于区别野生型(WT)和T-DNA系(atpap2-8)，将它们用于PCR筛选从WT和T-DNA系提取的基因组DNA(b)。用TRIzol RNA分离方法从生长在含2％蔗糖的MS中的10日龄幼苗提取总RNA，用于RT-PCR(c)。将50μg幼苗蛋白质上样用于使用抗AtPAP2特异性抗血清的蛋白质印迹研究(6.3章节)。

图5为表达载体pBV-AtPAP2的示意图。CaMV 35S：花椰菜花叶病毒的35S启动子；NO：胭脂氨酸合成酶基因的多腺苷酸化信号；aadA：编码氨基糖苷-3″-腺苷转移酶的细菌链霉素/大观霉素抗性基因；pNOS:BAR：在胭脂氨酸合成酶启动子调控下的双丙氨膦(bialaphos)抗性基因；bom：pBR322的转移基础；ColE1：pBR322的复制起点；pVS1-REP：pVS1的复制起点；pVS1-STA：pVS1质粒的STA区域；LB：左缘T-DNA重复；RB：右缘T-DNA重复。(Hajdukiewicz等，1994)。

图6A显示AtPAP2的过表达系(OE)、野生型(WT)、T-DNA和互补系(CP)的蛋白质印迹分析结果，图6B显示AtPAP15的过表达系(C-15)和野生型(WT)的蛋白质印迹分析结果。

图7显示AtPAP2的表达分析。通过NASC的Spot History程序分析mRNA表达谱(a)。用抗PAP2抗血清通过蛋白质印迹分析以下植物的蛋白质表达谱：生长在土壤中的30日龄植物(b)；在MS琼脂上发芽的幼苗(c)；和转移到Pi-充足/Pi-缺乏MS琼脂上3天的2周龄植物(d)。

图8显示野生型、T-DNA和过表达系在土壤中的生长性能。种子在含2％蔗糖的MS琼脂中发芽10天。将具有两片可见的小莲座叶(约1mm)的幼苗转移到土壤中，并在16小时/8小时的光/暗周期下生长。

图9显示生长在土壤中的21日龄幼苗的莲座叶中的蔗糖和葡萄糖水平。

图10显示延长黑暗处理后的各个谱系的恢复。种子在含2％蔗糖的MS琼脂中发芽10天。将具有两片可见的小莲座叶(约1mm)的幼苗转移到土壤中，并在16小时/8小时的光/暗周期下生长12天。然后将生长室的灯关闭12天，然后允许植物在16小时/8小时的光/暗周期下恢复1周。每谱系n＝9-12。

图11通过蛋白质印迹检测亚细胞部分的AtPAP2蛋白。Mito.：线粒体；Chlorop.：叶绿体。

图12显示两个掺入AtPAP2基因的载体构建体的图示。

图13显示过表达缺失C-末端基序的AtPAP2蛋白的蛋白质印迹分析结果。

详述

5.1加速植物生长和改进作物产量的方法

本公开内容提供通过将具C-末端基序的磷酸酶引入到植物中来加速植物生长和提高植物产量的方法。在一个实施方案中，本公开内容涉及一类紫色酸性磷酸酶基因及其各自编码的蛋白产物以及其片段、衍生物、同源物和变体。提供了将该类基因引入到植物中以加速植物生长速率、提高植物的糖含量和增加植物产量的方法。

在多种植物基因组中鉴定了紫色酸性磷酸酶(PAP)群(图1、2A和2B)，所述紫色酸性磷酸酶携带在5个保守基序XDXX(实例GDXG(SEQ ID NO：48))、XDXXY(SEQ ID NO：49)、GNH(D/E)(SEQ ID NO：50-51)、XXXH(实例ZXGH(SEQ ID NO：52))、XHXH(SEQ ID NO：53)中的7个保守的氨基酸残基(以黑体显示)和位于其C-末端的跨膜样基序，其中X为任何氨基酸，Z为选自L、I、V、F和M的任何氨基酸。C-末端跨膜样基序的存在能够使该群PAP定位在膜部分(图3和11)。这种特性使得该群PAP不同于先前表征的其它PAP，因为先前表征的所有PAP不携带任何C-末端基序(图2A、2B和3)。通过将该群的代表性基因的蛋白质序列AtPAP2用于检索(blast)NCBI数据库和各种EST数据库，鉴定了编码携带PAP的5个保守基序XDXX、XDXXY、GNH(D/E)、XXXH、XHXH和C-末端跨膜基序的多肽的多种基因组或cDNA序列(图2A)。

通过转基因技术将该群磷酸酶的代表性基因AtPAP2引入到拟南芥基因组中，产生比野生型植物生长更快的转基因拟南芥(图8)，并将种子产量提高大约40％(表3)。然而，表达AtPAP15的转基因植物不显示这些表型。亦发现转基因系叶中的包括葡萄糖和蔗糖在内的糖含量比野生型高(图9)。

因此，本公开内容提供通过将磷酸酶引入到植物来加速植物生长和提高植物产量的方法。在一个实施方案中，阐述了紫色酸性磷酸酶基因群及其各自编码的蛋白产物以及其片段、衍生物、同源物和变体。

5.2磷酸酶的同源物、衍生物和变体

除了权利要求9-16中所阐述的核酸分子(SEQ ID NO：1、3、5、7、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44和46)和多肽(SEQ ID NO：2、4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47)外，所述核酸分子和多肽亦包括与上述核酸分子和多肽具有共同的生物学活性、相似的或相同的结构域和/或具有足够的核苷酸序列或氨基酸同一性(同源物)的核酸分子和多肽。

所述多肽的共同的生物学活性包括抗原性、免疫原性、催化活性尤其是磷酸酶活性、与Fe³⁺-Me²⁺双金属核心结合及折叠成或形成跨膜样C-末端基序的能力和技术人员易于检测的其它活性。

具有相似的氨基酸序列的多肽(同源物)是指满足至少以下之一的多肽：(i)具有以下氨基酸序列的多肽：所述氨基酸序列与AtPAP2(SEQID NO：2)和/或含跨膜样C-末端基序的其它PAP、AtPAP2片段的氨基酸序列具有至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％和至少约95％和至少约98％的同一性之一和/或保守取代，所述其它PAP包括SEQ ID NO：4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和/或47，而且所述具有所述氨基酸序列的多肽具有上述多肽的至少一种生物学特征；(ii)由以下核苷酸序列编码并具有AtPAP2的至少一种结构和/或生物学特征的多肽：所述核苷酸序列与编码AtPAP2(SEQ ID NO：1)和/或含跨膜样C-末端基序的其它PAP、AtPAP2片段的核苷酸序列具有至少约30％、至少约40％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％和至少约98％的同一性之一，所述其它PAP包括SEQ ID NO：3、5、7、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44和/或46；(iii)由以下核苷酸序列编码并具有AtPAP2的至少一种结构和/或生物学特征的多肽，所述核苷酸序列在本文所定义的严格条件下与编码AtPAP2(SEQ ID NO：1)和/或含基序的其它PAP、AtPAP2片段的核苷酸序列杂交，所述其它PAP包括SEQ ID NO：3、5、7、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44和/或46。具有与AtPAP2或AtPAP2片段相似结构的多肽是指具有AtPAP2、AtPAP2片段的相似二级、三级或四级结构，并具有AtPAP2的至少一种功能特征的多肽，所述功能特征包括结合Fe³⁺-Me²⁺双金属核心和折叠成或形成跨膜样C-末端基序的能力中的一种或多种。可通过本领域技术人员已知的方法测定多肽结构，所述方法包括但不限于X射线晶体学、核磁共振和晶体学电子显微术。

本领域技术人员将易于认识到，在不影响功能的情况下，在本文所公开的任何序列中可进行突变、缺失或插入，所述序列包括SEQ IDNO：1-8和18-47。可用于实施实施方案的序列包括以下序列：其与SEQID NO：1-8和18-47具有同源性，并且为具有结合双金属核心(Fe³⁺-Me²⁺)的功能的蛋白质、多肽或编码具有所述功能的这类蛋白质或肽的多核苷酸，并且为具有C-末端基序的蛋白质、多肽或编码具有C-末端基序的这类蛋白质或肽的多核苷酸。换句话说，本领域技术人员会认识到，在既不影响催化功能也不扰乱跨膜样C-末端基序的情况下，可对SEQ ID NO：1-8和18-47中的任何一个进行多种突变。将保留催化活性和跨膜样C-末端基序的这类经修饰序列定义为SEQ IDNO：1-8和18-47的同源物，并包括在有用序列的范围内。

在一个实施方案中，所述同源物可具有与本文所公开的序列约30％或更多的同一性。在另一实施方案中，所述同源物可具有与本文所公开的序列约40％或更多的同一性。在又一实施方案中，所述同源物可具有与本文所公开的序列约50％或更多的同一性。在再一实施方案中，所述同源物可具有与本文所公开的序列约60％或更多的同一性。在更一实施方案中，所述同源物可具有与本文所公开的序列约70％或更多的同一性。在另一实施方案中，所述同源物可具有与本文所公开的序列约80％或更多的同一性。在又一实施方案中，同源物可具有与本文所公开的序列约90％或更多的同一性。在再一实施方案中，同源物可具有与本文所公开的序列约98％或更多的同一性。

本领域技术人员会认识到，可对蛋白质和肽和/或编码蛋白质和肽的多核苷酸或其互补序列实施以下突变：用具有相似化学性质的其它氨基酸残基取代氨基酸残基(保守取代)，以及所述突变不太可能引起影响功能的结构变化，所述功能包括催化活性和/或跨膜样C-末端基序功能。保守取代氨基酸是用来自同一化学组的另一种氨基酸取代属于以下11个化学组中的任一个组别的氨基酸残基：(1)酸性(带负电荷)氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨氨酸；(2)碱性(带正电荷)氨基酸，例如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸，例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)中性非极性(疏水)氨基酸，例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(5)具有脂族侧链的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(6)具有脂族-羟基侧链的氨基酸，例如丝氨酸和苏氨酸；(7)具有含有酰胺的侧链的氨基酸，例如天冬酰胺和谷氨酰胺；(8)具有芳族侧链的氨基酸，例如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(9)具有碱性侧链的氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(10)具有含硫侧链的氨基酸，例如半胱氨酸和甲硫氨酸；(11)具有相似几何学和氢键模式的氨基酸，例如天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨氨酸和谷氨酰胺。

在一个实施方案中，同源物可具有与本文所公开的序列约30％或更多的同一性和/或保守取代。在另一实施方案中，同源物可具有与本文所公开的序列约40％或更多的同一性和/或保守取代。在又一实施方案中，同源物可具有与本文所公开的序列约50％或更多的同一性和/或保守取代。在再一实施方案中，同源物可具有与本文所公开的序列约60％或更多的同一性和/或保守取代。在另一实施方案中，同源物可具有与本文所公开的序列约70％或更多的同一性和/或保守取代。在再一实施方案中，同源物可具有与本文所公开的序列约80％或更多的同一性和/或保守取代。在再一实施方案中，同源物可具有与本文所公开的序列约90％或更多的同一性和/或保守取代。在更一实施方案中，同源物可具有与本文所公开的序列约98％或更多的同一性和/或保守取代。

实施方案进一步提供分离的核酸分子，所述核酸分子包含一种或多种以下长度的核苷酸或由一种或多种以下长度的核苷酸组成：SEQID NO：1、3、5、7、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44和46的核苷酸序列或其互补序列的至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约100、至少约150、至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500、至少约550、至少约600、至少约650、至少约700、至少约750、至少约800、至少约850、至少约900、至少约950、至少约1000、至少约1050、至少约1100、至少约1150、至少约1200、至少约1250、至少约1300、至少约1350、约500-约2000、约1000-约2000、约200-约500、约500-约1000、约1000-约1500和约1500-约2000个核苷酸，所述核苷酸编码具有以上核苷酸序列编码的蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：2、4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47)的一种或多种活性的蛋白质或多肽。所述活性包括抗原性、免疫原性、催化活性(例如磷酸酶活性)、结合Fe³⁺-Me²⁺双金属核心和折叠成或形成跨膜样C-末端基序的能力及易于测定的其它活性中的一种或多种。

实施方案提供分离的多肽或蛋白质，所述多肽或蛋白质由含有长度为以下之一的氨基酸的氨基酸序列组成：相关蛋白质或多肽的约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约90、至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180、至少约200、至少约220、至少约240、至少约260、至少约280、至少约300、至少约320、至少约340、至少约360、约250-约660、约350-约660、约450-约660和约550-约660个氨基酸碱，并具有所述蛋白质或多肽的至少一种功能特征，所述功能特征包括结合Fe³⁺-Me²⁺双金属核心和形成跨膜样C-末端基序的能力。

另外的实施方案为与上述SEQ ID NO：1-8和18-47具有同一性和/或保守取代的任何磷酸酶及其同源物，所述磷酸酶及其同源物又由具有紫色酸性磷酸酶的5个保守基序的蛋白质、多肽或编码具有所述5个保守基序的蛋白质的多核苷酸组成，所述5个保守基序包括XDXX、XDXXY、GNH(D/E)、XXXH、XHXH，其中X为任何氨基酸。在一个实施方案中，所述磷酸酶及其同源物由具有序列YHVCIGNHEYDF(SEQ ID NO：54)和YHVCIGNHEYDW(SEQ ID NO：55)之一的蛋白质、多肽或编码所述序列之一的多核苷酸组成。在一个实施方案中，所述磷酸酶及其同源物由具有含序列YHVCIGNHEYD(W/F)(SEQ IDNO：54)和YHVCIGNHEYN(W/F)(SEQ ID NO：55)之一的氨基酸残基序列的蛋白质、多肽或编码所述氨基酸残基序列的多核苷酸组成；或所述磷酸酶及其同源物由具有以下同源物的蛋白质、多肽或编码以下同源物的多核苷酸组成，所述同源物为仅具有对那些序列的如上述保守取代的前述序列之一的同源物。在又一实施方案中，所述磷酸酶及其同源物由具有含GNHE(SEQ ID NO：51)和GNHD(SEQ ID NO：50)序列之一的氨基酸残基序列的蛋白质、多肽或编码所述氨基酸残基序列的多核苷酸组成。在再一实施方案中，所述磷酸酶及其同源物由具有含GNHE(SEQ ID NO：51)和GNHD(SEQ ID NO：50)序列之一的氨基酸残基序列的蛋白质、多肽或编码所述氨基酸残基序列的多核苷酸组成，或由具有以下同源序列的蛋白质、多肽或编码具有以下同源序列的蛋白质的多核苷酸组成，所述同源序列为仅含保守取代的前述SEQ IN NO：50-51序列之一的同源序列。

另外的实施方案为与上述SEQ ID NO：1-8和18-47具有同一性和/或保守取代的任何磷酸酶及其同源物，其又由具有以下序列的蛋白质、多肽或编码以下序列的多核苷酸组成：当让所述序列与SEQ IDNO：2比对时，其具有与SEQ ID NO：2的302-315位氨基酸残基至少约70％或更多的同一性和/或保守取代。在另一实施方案中，所述磷酸酶及其同源物由具有与SEQ ID NO：2的302-315位氨基酸残基约80％或更多的同一性和/或保守取代(当所述序列与SEQ ID NO：2比对时)的蛋白质、多肽或编码所述蛋白质的多核苷酸组成。在另一实施方案中，所述磷酸酶及同源物由具有以下氨基酸残基序列的蛋白质、多肽或编码以下氨基酸残基序列的多核苷酸组成，所述氨基酸残基序列与HIGDISYARGYSW(SEQ ID NO：56)序列具有至少约70％或更多的同一性。在另一实施方案中，所述磷酸酶及其同源物由具有以下氨基酸残基序列的蛋白质、多肽或编码以下氨基酸残基序列的多核苷酸组成，所述氨基酸残基序列具有HIGDISYARGYSW(SEQ ID NO：56)序列，或所述磷酸酶及其同源物由具有以下同源序列的蛋白质、多肽或编码具有以下同源序列的蛋白质的多核苷酸组成，所述同源序列为仅具有对那些序列的如上述保守取代的前述序列的同源序列。

在另一实施方案中，所述磷酸酶及其同源物由具有以下氨基酸残基序列的蛋白质、多肽或编码以下氨基酸残基序列的多核苷酸组成，所述氨基酸残基序列与KEKLTVSFVGNHDGEVHD(SEQ ID NO：57)、KERLTLSYVGNHDGEVHD(SEQ ID NO：58)、REKLTLTYVGNHDGQVHD(SEQ ID NO：59)和KEKLTLTYIGNHDGQVHD(SEQ ID NO：60)序列具有至少约70％或更多的同一性。在再一实施方案中，所述磷酸酶及其同源物由具有以下氨基酸残基序列的蛋白质、多肽或编码以下氨基酸残基序列的多核苷酸组成，所述氨基酸残基序列具有一个或多个以下序列：KEKLTVSFVGNHDGEVHD(SEQ ID NO：57)、KERLTLSYVGNHDGEVHD(SEQ ID NO：58)、REKLTLTYVGNHDGQVHD(SEQ ID NO：59)和KEKLTLTYIGNHDGQVHD(SEQ ID NO：60)，或所述磷酸酶及其同源物由具有以下同源序列的蛋白质、多肽或编码具有以下同源序列的蛋白质的多核苷酸组成，所述同源序列为仅具有对那些序列的如上述保守取代的前述序列之一的同源序列。

在另一实施方案中，所述磷酸酶及其同源物由具有以下氨基酸残基序列的蛋白质、多肽或编码以下氨基酸残基序列的多核苷酸组成，所述氨基酸残基序列具有序列(F/Y)(V/I)GNHDGXXH(SEQ ID NO：61-64)。其中所述序列的第一个残基可为F或Y，所述序列的第二个残基可为V或I。在再一实施方案中，所述磷酸酶及其同源物由具有以下氨基酸残基序列的蛋白质、多肽或编码以下氨基酸残基序列的多核苷酸组成，所述氨基酸残基序列具有序列(F/Y)(V/I)GNHDGXXH(SEQ ID NO：61-64)，其中所述序列的第一个残基可为F或Y，所述序列的第二个残基可为V或I；或所述磷酸酶及其同源物由具有以下同源序列的蛋白质、多肽或编码具有以下同源序列的蛋白质的多核苷酸组成，所述同源序列为仅具有对前述序列的如上述保守取代的前述序列的同源序列。在更一实施方案中，所述磷酸酶及其同源物由具有以下氨基酸残基序列的蛋白质、多肽或编码以下氨基酸残基序列的多核苷酸组成，所述氨基酸残基序列具有序列(F/Y)(V/I)GNHDGXXH(SEQ ID NO：61-64)，其中所述序列的第一个残基可为F或Y，所述序列的第二个残基可为V或I；或所述磷酸酶及其同源物由有以下同源序列的蛋白质、多肽或编码有以下同源序列的蛋白质的多核苷酸组成，所述同源序列与前述序列具有至少约70％同一性和/或如上述的保守取代。

在一个实施方案中，所述磷酸酶及其同源物由具有以下氨基酸残基序列的蛋白质、多肽或编码以下氨基酸残基序列的多核苷酸组成，所述氨基酸残基序列与SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：65)的614-636位残基比对时，与SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：65)的614-636位氨基酸残基具有至少约60％或更多的同一性和/或保守取代，和/或与SEQ IDNO：4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33和47的23个氨基酸残基序列具有至少约60％或更多的同一性和/或保守取代，其中通过TMHMM分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，与SEQ IDNO：2的614-636位氨基酸残基比对的氨基酸残基，经预测形成跨膜样C-末端基序。在一个实施方案中，所述磷酸酶及其同源物由具有以下氨基酸残基序列的蛋白质、多肽或编码以下氨基酸残基序列的多核苷酸组成，所述氨基酸残基序列与SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：65)的614-636位残基比对时，与SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：65)的614-636位氨基酸残基具有至少约70％或更多的同一性和/或保守取代，和/或与SEQ ID NO：4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33和47的23个氨基酸残基序列具有至少约60％或更多的同一性和/或保守取代，其中通过TMHMM分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，与SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：65)的614-636位氨基酸残基比对的氨基酸残基，经预测形成跨膜样C-末端基序。在一个实施方案中，所述磷酸酶及其同源物由具有以下氨基酸残基序列的蛋白质、多肽或编码以下氨基酸残基序列的多核苷酸组成，所述氨基酸残基序列与SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：65)的614-636位残基比对时，与SEQ ID NO：2的614-636位氨基酸残基具有至少约80％或更多的同一性和/或保守取代，和/或与SEQ ID NO：4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33和47的23个氨基酸残基序列具有至少约60％或更多的同一性和/或保守取代，其中通过TMHMM分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，与SEQ ID NO：2(SEQ IDNO：65)的614-636位氨基酸残基比对的氨基酸残基，经预测形成跨膜样C-末端基序。在一个实施方案中，所述磷酸酶及其同源物由具有以下氨基酸残基序列的蛋白质、多肽或编码以下氨基酸残基序列的多核苷酸组成，所述氨基酸残基序列与SEQ ID NO：2的614-636位残基比对时，与SEQ ID NO：2的614-636位氨基酸残基具有至少约90％或更多的同一性和/或保守取代，和/或与SEQ ID NO：4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33和47的23个氨基酸残基序列具有至少约90％或更多的同一性和/或保守取代，其中通过TMHMM分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，与SEQ ID NO：2的614-636位氨基酸残基比对的氨基酸残基，经预测形成跨膜样C-末端基序。

在一个实施方案中，所述磷酸酶或磷酸酶基因由具有以下序列的蛋白质、多肽或编码以下序列的多核苷酸组成，所述序列为(L/M/V)-(L/M/V)-Z-(G/A)-(V/A/L)-Z-Z-G-(F/Y)-X-Z-G(SEQ ID NO：66)，其中Z为疏水残基L、I、V、F和M中的任何一种。在另一实施方案中，所述磷酸酶或磷酸酶基因由具有以下序列的蛋白质、多肽或编码以下序列的多核苷酸组成，所述序列为(L/M/V)-(L/M/V)-Z-(G/A)-(V/A/L)-Z-Z-G-(F/Y)-X-Z-G(SEQ ID NO：66)；或所述磷酸酶或磷酸酶基因由具有与前述序列具有至少70％同一性和/或保守取代的序列的蛋白质、多肽或编码所述序列的多核苷酸组成。

实施方案亦包括所公开多肽的衍生物。例如但不限于，衍生物可包括例如通过以下修饰的肽或蛋白质：糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护基团/封闭基团衍生化、蛋白酶剪切、连接细胞配体或其它蛋白质等。可通过已知技术实施众多化学修饰中的任何一种，所述技术包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化等。另外，衍生物可含有一种或多种非典型氨基酸。

在另一方面，分离的核酸分子编码多肽变体，其中通过遗传工程改造修饰氨基酸序列，以便提高或降低多肽的生物活性，或在不显著改变生物活性的情况下改变其局部结构。在一个方面，这些变体可作为激动剂或拮抗剂起作用。激动剂可基本上保留多肽的相同或部分生物活性，拮抗剂可抑制多肽的一种或多种活性。所述修饰包括氨基酸取代、缺失和/或插入。可通过本领域已知的任何方法实施氨基酸修饰，本领域技术人员可获得不同的方法，且对于他们为常规方法。

例如，可按照本领域已知的任何技术实施诱变，所述技术包括但不限于合成具有在待修饰的既定多肽序列内的一种或多种修饰的寡核苷酸。可用特定寡核苷酸序列进行多肽的位点特异性诱变，所述寡核苷酸序列除了含足够数量的邻接核苷酸外，还编码含有所需突变的核苷酸序列。所述寡核苷酸可作为引物，该引物可在横跨缺失连接的两侧形成稳定的双链体。通常优选长约15-约75个核苷酸或更长的引物，其中序列连接的两侧有约10-约25个或更多个残基被改变。可使用多种在一个或多个位置引入多个不同突变的这类引物来产生突变体库。

位点特异性诱变技术在本领域众所周知，如各种出版物所述(例如Kunkel等，Methods Enzymol.，154：367-82，1987，其通过引用以其整体结合于本文中)。一般而言，定点诱变如下进行，首先获得单链载体或两条链解链分开的双链载体，其在其序列内包括编码所需肽的DNA序列。通常合成地制备荷有所需突变序列的寡核苷酸引物。然后让该引物与单链载体退火，经受DNA聚合酶例如T7DNA聚合酶，以便完成荷有突变的链的合成。因此，形成异源双链体分子，其中一条链编码原始非突变序列，第二条链荷有所需的突变。然后将该异源双链体载体用于转化或转染合适的细胞，例如大肠杆菌细胞，选择包括荷有突变序列排列的重组载体的克隆。如所了解的，该技术通常采用以单链形式和双链形式两种形式存在的噬菌体载体。可用于定点诱变的典型载体包括诸如M13噬菌体等载体。这些噬菌体易于市购，其使用通常为本领域技术人员熟知。在定点诱变中亦常规采用双链质粒，这消除将目的基因从质粒转移到噬菌体的步骤。

或者，可将含市购耐热酶例如Taq DNA聚合酶的PCR应用用于将诱变的寡核苷酸引物掺入到扩增的DNA片段中，然后可将所述DNA片段克隆到合适的克隆载体或表达载体中。参见例如Tomic等，Nucleic Acids Res.，18(6)：1656，1987和Upender等，Biotechniques，18(1)：29-30，32，1995关于PCR介导的诱变程序，它们以其整体结合到本文中。除了耐热聚合酶外，采用耐热连接酶的PCR亦可用于将磷酸化诱变寡核苷酸掺入到扩增的DNA片段中，然后可将该片段克隆到合适的克隆载体或表达载体(参见例如Michael，Biotechniques，16(3)：410-2，1994，其通过引用以其整体结合到本文中)。

可使用产生既定多肽或其片段的序列变体的本领域技术人员已知的其它方法。例如，可用诱变剂例如羟胺处理编码多肽或其片段的氨基酸序列的重组载体，以获得序列变体。

任选待修饰的氨基酸残基为表面暴露的残基。另外，在进行氨基酸取代中，优选待取代的氨基酸残基为保守氨基酸取代，例如，极性残基被极性残基取代，亲水残基被亲水残基取代，疏水残基被疏水残基取代，带正电荷的残基被带正电荷的残基取代，或带负电荷的残基被带负电荷的残基取代。此外，可被修饰的氨基酸残基并不是在所有品系或物种中都高度或完全保守的，和/或是对保持蛋白质的生物活性关键的。

因此，包括在本公开内容范围内的核酸分子是编码本发明多肽的核酸分子，所述本发明多肽含有对其生物学活性并不关键的氨基酸修饰。

5.3融合蛋白

本公开内容还包括融合蛋白，其中多肽或其片段与异源多肽(即无关多肽或其部分，优选所述多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸)重组融合或化学缀合(例如共价和非共价缀合)，来产生融合蛋白。可直接融合，但也可通过接头序列进行融合。

在一个方面，融合蛋白包含在其N-末端与异源信号序列融合的多肽。例如，多肽中天然存在的信号序列可被源自异源来源的信号序列置换。可市购各种信号序列。

在另一实施方案中，多肽可与标签序列融合，标签序列为例如六-组氨酸肽及其它序列，它们中很多可市购。例如，如Gentz等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：821-824所述，六-组氨酸为融合蛋白提供纯化方便。肽标签的其它实例有血细胞凝聚素“HA”标签和“flag”标签(Knappik等，1994，Biotechniques，17(4)：754-761)，“HA”标签对应于得自流感血细胞凝集素蛋白的表位(Wilson等，1984，Cell，37：767)。这些标签尤其可用于重组产生的多肽的纯化。

可通过标准重组DNA技术或通过蛋白质合成技术(例如通过使用DNA合成仪)产生融合蛋白。例如，可通过包括自动DNA合成仪在内的常规技术合成编码融合蛋白的核酸分子。或者，可用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物在产生两个保守基因片段之间产生互补突出端，随后可使所述片段退火并重新扩增产生嵌合基因序列(参见例如Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑，JohnWiley和Sons，1992)。

可将编码融合蛋白的核苷酸序列插入到合适的表达载体中，所述合适表达载体即含有对转录和翻译所插入的蛋白质编码序列所必需的元件的载体。

在特定实施方案中，由诱导型启动子来调控融合蛋白的表达。

5.4转基因植物的制备

碳流是植物生物学中的关键过程，植物通过光合作用收获高能碳分子(例如葡萄糖)。然后将碳分子转化为更复杂的碳水化合物分子，例如淀粉、纤维素等。纤维素是细胞壁的主要组分，淀粉是植物细胞和植物种子中葡萄糖的主要储存形式。因此，碳流过程的效率和/或平衡成为植物生长和作物产量的限制因子。

本公开内容基于以下发现：过表达膜结合磷酸酶可通过改变其碳代谢来提高植物生长性能，所述碳代谢通过例如较快的生长速率、较高的糖含量和较高的种子产量来表示。

在一个实施方案中，本公开内容提供含有编码并表达具有C-末端跨膜样结构域的磷酸酶的核酸分子的转基因植物。本文所公开的转基因植物与未经工程改造的植物即同一物种(品系)比较具有较快的生长速率和较高的种子产量。在特定实施方案中。所述磷酸酶来自具有磷酸酶活性和C-末端基序的植物物种。在另一实施方案中，本文所公开的转基因植物包含编码磷酸酶的核酸分子，并表达AtPAP2(SEQ IDNO：2)和/或含C-末端基序的其它PAP，所述其它PAP包括SEQ ID NO：4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47中的一种或多种。在另一实施方案中，磷酸酶在细胞膜上表达，例如在ER或高尔基体上表达。可如下在植物中实现磷酸酶的这种膜表达：通过将编码C-末端基序肽的核苷酸序列融合到C-末端，所述C-末端基序肽可在由既定植物细胞进行磷酸酶翻译时与该磷酸酶有效连接。因此，在另一实施方案中，转基因植物包含编码磷酸酶的核酸分子，并表达AtPAP2(SEQ ID NO：2)和/或包括SEQ ID NO：4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47在内的具有C-末端基序的其它PAP，，但通过遗传工程改造用异源植物信号肽置换SEQ ID NO：2的1-80位氨基酸残基的全部或部分、尤其是N-末端部分，优选SEQ ID NO：2的1-30位氨基酸残基的全部或部分，或SEQ ID NO：4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45或47的1-80位氨基酸残基的全部或部分、尤其是N-末端部分，优选1-30位氨基酸残基的全部或部分。在所述转基因植物中，将磷酸酶导向细胞的各种细胞器/区室。在另一实施方案中，转基因植物包含编码磷酸酶的核酸分子，并表达具有磷酸酶多肽的至少一种功能特征和/或结构特征的其同源物、衍生物和/或片段。在所有实施方案中，当SEQ ID NO：4、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和/或47的N-末端部分的全部或部分被置换时，所述实施方案包括如上所述序列的同源物，其具有磷酸酶多肽的至少一种功能特征和/或结构特征。在又一实施方案中，转基因植物包含以下核酸分子，其在本文所定义的严格条件下与具有序列SEQ ID NO：1、3、5、7、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44或46或者其互补序列的核酸分子杂交，并编码表现出所公开磷酸酶多肽的至少一种结构和/或功能特征的蛋白质或多肽。确切来说，提供过表达膜结合磷酸酶的转基因植物的制备，所述膜结合磷酸酶有助于改进植物生理(例如植物生长速率)和特性(例如种子产量)。

因此，亦提供用于植物的遗传修饰的嵌合基因构建体，以提高其生长速率并改进产量。嵌合基因构建体包含基本上仅编码携带C-末端跨膜样基序的磷酸酶的序列。所述磷酸酶可源自紫色酸性磷酸酶家族。在特定实施方案中，嵌合基因构建体包含具有SEQ ID NO：1、3、5、7、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44或46序列的核酸。在另一实施方案，嵌合基因构建体包含编码其具有磷酸酶多肽的至少一种功能特征和/或结构特征的同源物或片段的核酸分子。在另一特定实施方案中，嵌合基因构建体包含在本文所定义的严格条件下与具有序列SEQ ID NO：1、3、5、7、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44或46或其互补序列的核酸杂交的序列，其中所述序列编码表现出磷酸酶多肽的至少一种结构和/或功能特征的蛋白质或多肽。此外，由嵌合基因构建体中含有的核酸分子编码的磷酸酶可为与本文所述的磷酸酶具有相似结构特点的任何其它磷酸酶，所述结构特点为例如具有C-末端跨膜样基序。所述磷酸酶包括但不限于以下多肽：玉米紫色酸性磷酸酶(检索号：ACG47621)；和稻紫色酸性磷酸酶(检索号：BAC15853.1)。

将编码磷酸酶的序列与上游和下游调节组分(优选对磷酸酶序列为异源)可操作地连接；例如CMV 35S启动子，其在植物细胞中发挥作用引起基因表达(产生酶)(参见6.2章节)。当通过常规转化方法(例如微粒轰击、农杆菌感染或显微注射)将含有本公开内容磷酸酶基因的构建体引入到植物细胞时，所述基因在调控序列的控制下在细胞中表达。表达的磷酸酶成功地与天然存在于植物细胞中的生物合成体系相互作用，改变碳代谢。本文所述方法亦通过改变碳代谢来促进植物生长速率，产生更快速的生长速率和更高的产量。因而，缩短了植物成熟所需时间及开花所需时间。亦提供用于提高植物生长速率及产量的方法，所述方法包括将嵌合基因构建体插入所述植物细胞或所述整个植物的细胞的步骤。

在特定实施方案中，采用拟南芥(参见第6章)为模型系统。将过表达编码磷酸酶的基因的构建体引入到拟南芥中。

在一个实施方案中，使用来自拟南芥的磷酸酶。本公开内容获得的结果表明，通过过表达该基因提高了转基因拟南芥的生长速率和种子产量(参见6.5章节和图8及表3)。

尽管任何植物物种都可用本文所述表达盒和方法修饰，但在非限制的情况下优选包括在内的物种来自以下属，其中括号中的为代表性种：

单子叶植物：天门冬属(Asparagus)(芦笋)、雀麦属(Bromus)(早雀麦)、萱草属(Hemerocallis)(萱草)、大麦属(Hordeum)(大麦)、黑麦草属(Lolium)(黑麦草)、稻属(Oryza)(稻)、稷属(Panicum)(柳枝稷)、狼尾草属(Pennisetum)(喷泉草)、甘蔗属(Saccharum)(甘蔗)、蜀黍属(Sorghum)、胡卢巴属(Trigonella)(胡卢巴(fenu grass))、小麦属(Triticum)(小麦)、玉蜀黍属(Zea)(玉米)；和

双子叶植物：金鱼草属(Antirrhinum)(开花品种(flower sp.))、拟南芥属(拟南芥)、落花生属(Arachis)(花生)、颠茄属(Atropa)(颠茄)、芸苔属(Brassica)(油菜)、布洛华丽属(Browallia)、辣椒属(Capsicum)(胡椒)、红蓝花属(Carthamus)(红花)、菊苣属(Cichorium)(菊苣)、柑桔属(Citrus)(橘子，柠檬)、茼蒿属(Chrysanthemum)、香瓜属(Cucumis)(黄瓜)、曼陀罗属(Datura)(曼陀罗)、胡萝卜属(Daucus)(胡萝卜)、毛地黄属(Digitalis)(毛地黄)、草莓属(Fragaria)(草莓)、老鹳草属(Geranium)(开花品种)、大豆属(Glycine)(大豆)、向日葵属(Helianthus)(向日葵)、天仙子属(Hyscyamus)、番薯属(Ipomoea)(牵牛花)、莴苣属(Latuca)(莴苣)、亚麻属(Linum)(亚麻子)、百脉根属(Lotus)(开花品种)、番茄属(Lycopersicon)(番茄)、Majorana、锦葵属(Malva)(棉花)、木薯属(Manihot)、苜蓿属(Medicago)(苜蓿)、龙面花属(Nemesia)、烟草属(Nicotiana)(烟草)、驴食豆属(Onobrychis)、天竺葵属(Pelargonium)(驱蚊香草(citrosa))、碧冬茄属(Petunia)(开花品种)、毛茛属(Ranunculus)(开花品种)、萝卜属(Raphanus)(萝卜)、美人襟属(Salpiglossis)、千里光属(Senecio)(开花品种)、白芥属(Sinapis)(白芥子(albae semen))、茄属(Solanum)(土豆)、车轴草属(Trifolium)(车轴草)、豇豆属(Vigna)(绿豆、蚕豆)、葡萄属(Vitis)(葡萄)。

可以以若干方法实现对植物的遗传工程改造。最常用的方法是农杆菌-介导的转化。在该方法中改变了根癌农杆菌(A.tumefaciens)，而所述根癌农杆菌通过将引起肿瘤的基因插入到植物的基因组来自然感染植物。在实验室条件下将所选基因工程改造到根癌农杆菌的细菌Ti(诱导肿瘤的)质粒的T-DNA中，使得当T-DNA通过细菌自己的内部转移机制转移到植物时，所述基因可被整合到植物染色体中。T-DNA唯一不必可少的部分是其两个小(25个碱基对)边缘重复，植物转化至少需要其中之一。从T-DNA切除编码促进肿瘤生长的植物激素的细菌基因，用通常含以下部分的DNA序列来取代：选择性标记(例如抗生素抗性基因；通常为卡那霉素抗性)、限制性位点-具有特异性核苷酸序列的位点，限制酶在此处切割DNA；和待掺入植物的所需基因(B.Tinland，1996.The integration of T-DNA into plant genomes(T-DNA整合到植物基因组).Trends in Plant Science 1，178-184；D.Grierson(编辑)1991.Plant Genetic Engineering.Blackie，Glasgow)。可将农杆菌加入到培养中的植物原生质体(除去细胞壁的植物细胞)中，然后使其在非转化植物会被抗生素杀死的点下重新产生细胞壁，对于该抗生素转化的植物已获得抗性基因。然后用标准植物组织培养技术由幸存的转化细胞再生小植株。在备选技术中，将植物营养部分的无菌盘或片段置于含农杆菌的液体培养基中，然后用激素诱导根部从而再生在选择培养基中生长的小植株。对于诸如拟南芥等某些植物，可能有递送基因的第三种技术，其中可通过种皮让农杆菌或甚至″裸露的″DNA注入，产生转化(Clough SJ和Bent AF，1998.Floral dip：asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana(花序浸渍法：用于拟南芥的农杆菌介导转化的简化方法).Plant J 16：735-43)。

最近开发了用于植物遗传工程的生物弹射法，并变得更为广泛使用。在该方法中，用静电脉冲、空气压力或火药冲击以高速将用生物学活性DNA包被的钨或金的极小粒子(微弹)推进到植物细胞。当粒子通过细胞时，DNA溶解，然后可整合到该细胞及其后代的基因组中。业已证明该方法可产生稳定的转化体(Christou，P.，等，1988.Stabletransformation of soybean callus by DNA-coated gold particles(通过DNA包被的金粒稳定转化大豆愈伤组织)，Plant Physiology87：671-674)。可在整个植物上实施该方法，对分生组织尤其有效。其亦能够将DNA递送到细胞核或线粒体(Johnston，S.A.，等，1988.Mitochondrial transformation in yeast by bombardment withmicroprojectiles(用微弹轰击在酵母菌中进行线粒体转化)，Science240，1538-41)和叶绿体(Svab，Z.，等，1990，Stable transformation ofplastids in higher plants(高等植物质体中的稳定转化)，Proc Natl AcadSci.USA 87，8526-8530)中。

植物遗传工程的电穿孔方法很少成功。在该技术中，当用某些膜活性剂或用电穿孔(高压直流快速脉冲)处理时，培养物中的原生质体吸收纯DNA。一旦DNA进入原生质体，其即可被整合到细胞基因组中。然后用标准组织培养技术再生转基因植物。

植物遗传工程的显微注射方法或许最难了。在该方法中，以在动物中所用的类似方法用极细的玻璃针将DNA显微注射到靶标植物细胞中。对于产生大量转基因植物而言，该技术费力、低效并且不实用。

用于遗传工程改造植物的所选方法几乎都视靶标植物物种而定，并业已证明哪些方法在其中有效。

5.5抗体制备

可用特异性识别所述磷酸酶多肽或其片段之一的抗体，来检测、筛选和分离本发明多肽或其片段或可编码来自其它生物的相似酶的相似序列。例如，在一个特定实施方案中，可将免疫特异性结合AtPAP2或其片段的抗体用于各种体外检测测定，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、蛋白质印迹等，以检测样品中的本发明多肽或其片段、衍生物、同源物或变体或具有与磷酸酶多肽相似的酶活性的相似分子，所述样品为例如生物材料，包括植物细胞、植物、食物、饮料或来自植物的任何材料。

可通过本领域已知的任何合适方法产生特异于所述磷酸酶多肽的抗体。可通过本领域熟知的各种方法产生针对目标抗原的多克隆抗体。例如，可将得自磷酸酶多肽的抗原给予各种宿主动物(包括但不限于兔、小鼠、大鼠等)，来诱导产生含有特异于所述抗原的多克隆抗体的抗血清。可视宿主物种而定用各种佐剂来提高免疫应答，所述佐剂包括但不限于福氏(完全和不完全)佐剂、矿物凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、泊洛沙姆多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚和对人潜在有用的佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。所述佐剂在本领域亦众所周知。

可用本领域已知的各种技术制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术或其组合。例如，可用杂交瘤技术产生单克隆抗体，所述技术包括本领域已知的和例如在以下文献中教导的技术：Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring HarborLaboratory Press，第2版.1988)；Hammerling，等，Monoclonal Antibodiesand T-Cell Hybridomas，第563-681页(Elsevier，N.Y.，1981)(二者都通过引用以其整体结合到本文中)。本文所用术语″单克隆抗体″不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指来自包括任何真核、原核或噬菌体克隆在内的单个克隆的抗体，而不是指其制备方法。

用杂交瘤技术制备和筛选特异性抗体的方法为常规方法，在本领域众所周知。在一个非限制性实例中，可用目标抗原或表达所述抗原的细胞免疫小鼠。当检测到免疫应答时，例如在小鼠血清中检测到特异于抗原的抗体时，收获小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过众所周知的技术让该脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞融合。通过有限稀释来选择和克隆杂交瘤。然后通过本领域已知的方法测定杂交瘤克隆的分泌能够结合所述抗原的抗体的细胞。可通过用阳性杂交瘤克隆腹膜内接种小鼠，来产生通常含有高水平抗体的腹水。

可通过已知技术产生识别特异性表位的抗体片段。例如，可通过用酶例如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab′)₂片段)蛋白酶剪切免疫球蛋白分子，来产生Fab和F(ab′)₂片段。F(ab′)₂片段含有完整的轻链和重链的可变区、CH1区及铰链区。

亦可通过本领域已知的用于合成抗体的任何方法来制备抗体或其片段，所述合成抗体的方法具体而言为通过化学合成，或优选通过重组表达技术的方法。

可根据本领域技术人员可获得的任何信息(即Genbank、文献或通过常规克隆)获得编码抗体的核苷酸序列。如果不能获得含有编码特定抗体或其表位结合片段的核酸的克隆，但该抗体分子或其表位结合片段的序列已知，那么编码该免疫球蛋白的核酸可由化学合成，或可自合适来源(例如抗体cDNA文库，或自表达所述抗体的任何组织或细胞例如经选择表达抗体的杂交瘤细胞产生的cDNA文库，或自上述任何组织或细胞分离的核酸，优选poly A+RNA)如下获得：通过用可与该序列的3′和5′端杂交的合成引物进行PCR扩增，或通过用特异于特定基因序列的寡核苷酸探针来进行克隆以鉴定例如来自编码该抗体的cDNA文库的cDNA克隆。然后可用本领域熟知的任何方法将通过PCR产生的扩增核酸克隆到可复制克隆载体中。

当测定抗体的核苷酸序列后，即可用本领域熟知的操作核苷酸序列的方法来操作抗体的核苷酸序列，以通过例如引入氨基酸取代、缺失和/或插入到抗体的表位结合结构域区或可提高或降低抗体生物活性的抗体的任何部分，来产生具有不同氨基酸序列的抗体，所述操作方法为例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(参见例如，描述于以下文献中的技术：Sambrook等，上述；和Ausubel等编辑，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，NY，它们两者都通过引用以其整体结合到本文中)。

抗体的重组表达需要构建含有编码该抗体的核苷酸序列的表达载体。当获得编码抗体分子或抗体的重链或轻链或其部分的核苷酸序列后，即可通过重组DNA技术用先前章节论述的本领域熟知的技术来制备用于制备抗体分子的载体。可使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有抗体编码序列和合适的转录及翻译调控信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。可将编码抗体的重链可变区、轻链可变区、重链和轻链二者的可变区、重链可变区和/或轻链可变区的表位结合片段或一个或多个互补决定区(CDR)的核苷酸序列，克隆到所述载体用于表达。然后可将由此制备的表达载体引入到合适的宿主细胞用于表达抗体。因此，实施方案包括含有编码特异于所公开磷酸酶多肽或其片段的抗体的多核苷酸的宿主细胞。

可用两个表达载体共转染宿主细胞，第一载体编码源自重链的多肽，第二载体编码源自轻链的多肽。两个载体可含有能够使重链和轻链多肽同等表达的相同选择性标记，或不同的选择性标记以确保保持两种质粒。或者，可使用编码并能够表达重链和轻链多肽二者的单个载体。在所述情况下，应该将轻链置于重链之前，以避免有毒的游离重链过量(Proudfoot，1986，Nature，322：52；和Kohler，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：2197)。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。

在另一实施方案中，亦可用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生抗体。在噬菌体展示方法中，在携带编码功能抗体结构域的多核苷酸序列的噬菌体粒子表面展示该功能抗体结构域。在特定实施方案中，可使用所述噬菌体来展示抗原结合结构域，例如Fab和Fv或二硫键稳定的Fv，其自全套抗体或组合抗体文库(例如人或鼠)表达。可用抗原选择或鉴定表达结合目标抗原的抗原结合结构域的噬菌体，例如用标记的抗原或结合到或俘获到固体表面或珠粒的抗原。这些方法中所用的噬菌体通常为丝状噬菌体，包括fd和M13。抗原结合结构域作为与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合的蛋白来表达。可用于制备免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示方法实例包括以下文献中公开的方法：Brinkman等，1995，J.Immunol.Methods 182：41-50；Ames等，1995，J.Immunol.Methods 184：177-186；Kettleborough等，1994，Eur.J.Immunol.，24：952-958；Persic等，1997，Gene，187：9-18；Burton等，1994，Advances in Immunology 57：191-280；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开号WO 90/02809；WO 91/10737；WO92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；它们中的每一篇都通过引用以其整体结合到本文中。

如上述文献所述，选择噬菌体后，可分离来自噬菌体的抗体编码区，并将其用于产生全抗体，包括人抗体或任何其它所需片段，并在任何所需宿主中表达，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌和细菌，其例如以下所详述。例如，亦可使用本领域已知的方法采用重组产生Fab、Fab′和F(ab′)₂片段的技术，所述方法例如公开于PCT公开号WO 92/22324；Mullinax等，1992，BioTechniques12(6)：864-869；和Sawai等，1995，AJRI 34：26-34；和Better等，Science，240：1041-1043，1988(每一篇都通过引用以其整体结合到本文中)。可用于产生单链Fv和抗体的技术实例包括以下文献中阐述的实例：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等，1991，Methods inEnzymology 203：46-88；Shu等，1993，PNAS 90：7995-7999；和Skerra等，1988，Science 240：1038-1040。

当通过上述任何方法制备了抗体分子后，然后即可通过本领域已知的任何纯化免疫球蛋白分子的方法来使其纯化，例如通过色谱法(例如离子交换色谱、亲和色谱和大小排阻柱色谱，尤其是在蛋白A或蛋白G纯化后针对特异性抗原的亲和色谱)、离心、溶解度差或通过纯化蛋白质的任何其它标准技术。此外，可将抗体或其片段与本文所述异源多肽序列或本领域已知的其它异源多肽序列融合以促进纯化。

可在体外免疫测定及本领域众所周知的纯化方法(例如亲和色谱法)中使用与异源多肽融合或缀合的抗体。参见例如PCT公开号WO93/21232；EP 439,095；Naramura等，1994，Immunol.Lett.39：91-99；美国专利5,474,981；Gillies等，1992，PNAS 89：1428-1432；和Fell等，1991，J.Immunol.146：2446-2452，它们通过引用以其整体结合到本文中。

亦可让抗体与固相支持体连接，所述固相支持体尤其可用于所述多肽或其片段、衍生物、同源物或变体或与本发明多肽具有相似酶活性的相似分子的免疫测定或纯化。所述固相支持体包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。

5.6检测测定

检测生物样品中过表达的磷酸酶多肽或插入的编码磷酸酶的核酸的存在与否的例示性方法，涉及从各种来源获得生物样品，并让能够检测多肽或核酸(例如mRNA、基因组DNA)的化合物或作用剂与所述样品接触，以检测样品中异源多肽或核酸的存在情况。检测编码插入的磷酸酶多肽的mRNA或基因组DNA的例示性作用剂，为能够与编码任何所述磷酸酶多肽的mRNA或基因组DNA杂交的标记的核酸探针。核酸探针可为例如全长cDNA，例如SEQ ID NO：1，3、5、7、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44或46的核酸或其部分，例如长度为以下中的至少一种且足以在严格条件下与编码本发明多肽的mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸：至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约50、至少约100、至少约250、至少约500个或更多个核苷酸。

检测过表达磷酸酶多肽的例示性作用剂为能够结合插入的磷酸酶基因的磷酸酶多肽产物的抗体，优选含可检测标记的抗体。抗体可为多克隆的或更优选单克隆的。可使用完整抗体或其片段(例如Fab或F(ab′)₂)。亦参见章节5.5中关于抗体的详细说明。

关于探针或抗体的术语″标记的″意欲包括通过将可检测物质与探针或抗体偶联(即物理上连接)来直接标记探针或抗体，以及通过与另一种直接标记的试剂反应来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括用荧光标记的第二抗体及含生物素(以便可用荧光标记的链霉亲和素检测)的末端标记的DNA探针检测第一抗体。可将检测方法用于检测体外和体内样品中的mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，检测mRNA的体外技术包括RNA杂交和原位杂交。检测异源多肽的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。检测基因组DNA的体外技术包括DNA杂交。此外，检测异源多肽的体内技术包括将针对多肽的标记抗体引入到受试生物体中。例如，可用放射性标记物来标记抗体，可通过标准成像技术包括放射自显影来检测所述放射性标记物在受试生物体中的存在情况及位置。

在特定实施方案中，所述方法进一步涉及从对照受试者获得对照样品，让该对照样品与能够检测过表达多肽产物或mRNA转录产物或编码所插入的磷酸酶基因的基因组DNA的化合物或作用剂接触，以检测所述多肽或mRNA或编码所述磷酸酶多肽的基因组DNA的存在情况，并将对照样品中磷酸酶多肽或mRNA或编码多肽的基因组DNA的存在情况与测试样品中多肽或mRNA或编码内源性磷酸酶多肽的基因组DNA的存在情况进行比较。

实施方案亦包括用于检测测试样品中异源多肽或核酸存在情况的试剂盒。

例如，试剂盒可包括能够检测测试样品中的多肽或编码多肽的mRNA的标记化合物或作用剂，和用于测定样品中的多肽或mRNA的量的工具(例如结合多肽的抗体或结合编码多肽的DNA或mRNA的寡核苷酸探针)。试剂盒亦可任选包括使用说明书。

对于基于抗体的试剂盒，所述试剂盒可包括例如：(1)结合磷酸酶多肽的第一抗体(例如与固相支持体连接)；和任选(2)结合多肽或第一抗体并与可检测物质缀合的不同的第二抗体。

对于基于寡核苷酸的试剂盒，所述试剂盒可包括例如：(1)寡核苷酸，例如可检测标记的寡核苷酸，其与编码插入的磷酸酶多肽的核酸序列杂交；或(2)可用于扩增编码插入的磷酸酶多肽的核酸分子的引物对。试剂盒亦可包括例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒亦可包括对检测可检测物质(例如酶或底物)所需的组分。试剂盒亦可含有可测定并可与含有的测试样品进行比较的一种或一系列对照样品。试剂盒的每一种组分通常装入单独容器内，所有各种容器连同使用说明书都在单独包装之内。

5.7转基因植物的商业应用

产生的转基因植物可具有很多有用应用，包括食物、饲料、生物量、生物燃料(淀粉、纤维素、种子脂质)和木浆。转基因植物的提高的生长速率可每年为每公顷土地提供额外的二氧化碳固定，从而产生碳信用(carbon credit)。

6.实施例

以下实施例阐明AtPAP2克隆、其在转基因拟南芥中的过表达及转基因植物表征。这些实施例不应该解释为限制。以下实施例阐明某些实施方案。除非在以下实施例及本说明书和权利要求中的别处另外指出，否则所有份额和百分比都以重量计，所有温度都是摄氏度，压力是或接近大气压。

6.1序列比对和系统发生分析

在拟南芥Col-0生态型(http://www.arabidopsis.org)中鉴定了PAP2基因座及其包括其内含子/外显子边缘在内的基因组组织。用MEGA4(Kumar等，2004)和ClustalW程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)进行序列比对和系统发生树。用CLC Sequence Viewer 5.1.1(www.clcbio.com)实施氨基酸序列比对。

鉴定了来自拟南芥基因组的29种PAP样序列，通过邻接算法产生系统树(图1)。AtPAP2基因座(At1g13900)由两个外显子组成，编码区长度为1971bp(SEQ ID NO：1)，预测其编码约73.7-KD的多肽。在这29种PAP样蛋白序列中，通过TMHMM分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)，只有AtPAP2和AtPAP9在其C-末端携带独特的疏水基序(图3)。发现AtPAP2与AtPAP9氨基酸序列具有72％的序列同一性。发现来自玉米(检索号：ACG47621)和稻(检索号：BAC15853.1)的两种序列与AtPAP2分别具有58％和57％的氨基酸同一性。其序列在图2中比对。

通过tblastn程序用AtPAP2氨基酸序列作为搜索序列，从植物GDB数据库(http://www.plantgdb.org/)和NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中检索了在其C-末端携带疏水基序的来自其它植物物种的AtPAP2样序列。在以下物种中鉴定了与AtPAP2具有高度同源性的cDNA和蛋白质序列：玉米(SEQ ID NO：7和8)、芜菁(Brassica rapa)(SEQ ID NO：18和19)、大麦(Hordeumvulgare)(SEQ ID NO：20和21)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)(SEQID NO：22和23)、展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)(SEQ ID NO：24和25)、毛果杨(Populus trichocarpa)(SEQ ID NO：26和27)、甘蔗(Saccharum officinarum)(SEQ ID NO：28和29)、马铃薯(Solanumtuberosum)(SEQ ID NO：30和31)、葡萄(Vitis vinifera)(SEQ ID NO：32和33)、稻(SEQ ID NO：34和35)、陆地棉(Gossypium hirsutum)(SEQ IDNO：36和37)、柳枝稷(Panicum virgatum)(SEQ ID NO：38和39)、番茄(Solanum lycopersicum)(SEQ ID NO：40和41)、两色蜀黍(Sorghumbicolor)(SEQ ID NO：42和43)和小麦(Triticum aestivum)(SEQ ID NO：44和45)。

通过RT-PCR用根据相应的EST序列设计的引物从本地大豆(Glycine max)品种(SEQ ID NO：5)和欧洲油菜(Brassica napus)栽培种Westar(SEQ ID NO：46)扩增AtPAP样序列的cDNA序列，可从植物GDB数据库(http://www.plantgdb.org/)检索所述EST序列。

6.2在拟南芥中筛选T-DNA系并制备过表达系及互补系

从拟南芥生物资源中心获得Col生态型的PAP2基因的T-DNA插入系(拟南芥基因组基因座名称：Salk_013567)(Alonso等，2003)。通过基因组PCR筛选从SIGnAl数据库(http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress)鉴定同源T-DNA系，所述PCR通过用引物(LBa1，5’-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3’，SEQID  NO：9)和PAP2特异性正向引物(P2LP，5’-TTGAAGTTTAACATGCCTGGG-3，SEQ ID NO：10)和反向引物(P2RP，5’-TCCAATGCTCGA TTGATTAGC-3’，SEQ ID NO：11)来实现。测定PCR产物的序列，确证T-DNA插入位点。为了排除另一T-DNA基因座干扰PAP2突变位点的可能，让同源pap2突变系与野生型回交，以稀释可能的T-DNA位点。让产生的杂合pap2突变体在含有50mg/ml卡那霉素的MS板上生长。耐受植物对敏感植物的比率为约3∶1。这些结果证明T-DNA系(pap2-8)的单一插入基因座位点。

通过RT-PCR确证T-DNA系不能表达全长AtPAP2mRNA。利用用DNA酶I处理的TRIzol RNA分离方法(Invitrogen)从生长在含2％(w/v)蔗糖的MS上的10日龄幼苗提取总RNA。用SuperscriptIII逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)用寡dT引物产生cDNA。将两种基因特异性引物P2YF(5’-GGCCGTCGACATGATCGTTAATTTCTCTTTC-3’SEQ ID NO：12)和P2NR(5’-CCGGACTAGTTCATGTCTCCTCGTTCTTGAC-3’SEQ ID NO：13)用于扩增AtPAP2的1971bp编码区。对于每一样品而言，用50℃的退火温度对1μg的cDNA扩增30个循环，将延伸因子(EF)引物EF-1(5′-GTTTCACATCAACATTGTGGTCA TTGG-3，SEQ ID NO：14)和EF-2(5′-GAGTACTTGGGGGTAGTGGCATCC-3，SEQ ID NO：15)(Axelos等，1989)用于对照实验。

通过蛋白质印迹分析来确证T-DNA系不能表达蛋白质(图4)。如6.3章节所述在兔中产生特异于AtPAP2的抗血清。

为制备转基因AtPAP2过表达系或在敲除突变体中表达该基因，通过PCR用引物P2YF(SEQ ID NO：12)和P2NR(SEQ ID NO：13)扩增AtPAP2cDNA的全长编码区。分别将SalI位点和SpeI位点工程改造到P2YF和P2NR中。将所得产物(1976bp)插入到双元载体(binaryvector)的XhoI/Spe I位点，在花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的紧接下游(图5)。

将载体引入根癌农杆菌菌株GV3101，然后通过花序浸渍法(Clough和Bent，1998)转化到野生型Col-0以产生PAP2-过表达系，或转化到同源pap2植物(T-DNA系)以产生互补系。通过在含50mg/lBasta(Riedel-deHaen)的MS琼脂板上选择2代，获得同源35S:PAP2转基因系。将该抗性植物转移到土壤中生长至成熟，并通过PCR和免疫印记分析进一步确证其转基因情形。如图6A所示，在OE系中过表达AtPAP2蛋白，但在T-DNA系中没有。将转基因植物的纯合T3种子用于进一步分析。

为了制备转基因AtPAP15过表达系，亦通过RT-PCR扩增AtPAP15的cDNA，然后将其亚克隆到植物双元载体中，该载体仅有卡那霉素抗性基因和花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV)。然后通过冻融转化将该指定的表达构建体动员到根癌农杆菌菌株EHA105中(Hofgen和Willmitzer，1988)，然后转化到拟南芥中。通过PCR和用抗AtPAP15抗血清的免疫印迹分析进一步确证转基因情形。如图6B所示，在OE系中过表达AtPAP15蛋白。将转基因植物的纯合T3种子用于进一步分析。

6.3制备PAP2多克隆抗血清和蛋白质印迹分析

用正向引物P2AF(5’-GGTTGAGCTCGATTCTAAAGCGACCATTTC-3’，SEQ ID NO：16)和反向引物P2AR(5’-TTTTGGTACCTCAGGATCCGAA AGTCAGC-3’，SEQ ID NO：17)扩增对应于N末端120个氨基酸(从21-141)的AtPAP2cDNA片段。通过SacI和KpnI裂解PCR产物，并将其克隆到pRsetA载体(Invitrogen)中，以让AtPAP2的前120个氨基酸的编码序列与His-标签序列融合。将得到的质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。让BL21细胞于30℃在0.1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷中诱导4小时，并重悬在100mM NaCl和50mM Tris-HCl，pH 7.5，2mM苯甲磺酰氟(PMSF)中。将裂解物超声5次每次30秒。让包含体中过表达的His-AtPAP2融合蛋白以5000xg离心15分钟，将离心沉淀溶于150mM NaCl、8M尿素和20mM Tris-HCl，pH 7.5中。在HisTrap FF(GEHealthcare)柱上纯化了该融合蛋白，并将其用于兔的标准免疫方案。

6.4AtPAP2mRNA的表达分析及其蛋白质水平

通过Spot History程序(http://affymetrix.arabidopsis.info/narrays/spothistory.pl)分析AtPAP2的mRNA表达水平，所述Spot History程序呈现成千上万微阵列(Affymetrix ATH1微阵列)数据库中的既定基因的表达水平。Spot history分析表明，AtPAP2表达为组成型，但在大部分实验情况下相当低(图7a)。为了测定AtPAP2表达水平，采集野生型拟南芥(Col-0)的不同组织。

亦通过蛋白质印迹用从6.3章节产生的抗AtPAP2抗血清研究蛋白质表达水平。从存于冰上的研磨缓冲液(含有150mM NaCl，1mMEDTA，0.2mM PMSF的Tris-HCl 50mM，pH7.4)中的野生型拟南芥、T-DNA系、AtPAP2-过表达系中提取总的植物可溶性蛋白。让蛋白提取物以16000x g离心，收集上清液用于Bradford蛋白浓度测定。将等量蛋白质样品(不同实验中50-90μg/道)上样并在12％(w/v)SDS-PAGE中分离。将分离的蛋白质转移到Hybond C-Extra膜(Amersham Biosciences)(400mA，1小时)。用含5％(w/v)脱脂奶的TTBS洗涤缓冲液(pH 7.6)封闭膜2小时，并在4℃以1∶1000稀释度用特异性抗AtPAP2抗血清探测3小时或过夜。在半小时内换用三次TTBS洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.6、136mM NaCl、0.1％Tween20)漂洗膜后，加入用TTBS洗涤缓冲液以1∶10,000稀释的HRP-标记的第二抗体。2小时后，洗涤膜三次，然后通过加强化学发光方法(Enhanced Chemiluminescence method)(Amersham Biosciences)显现带。如图7b中所示，在所有的测定组织(叶、花、茎、根、长角果)中以等量水平表达AtPAP2蛋白。发芽期间的AtPAP2蛋白表达水平亦很稳定(图7c)，且不依赖于磷的状态(图7d)。

6.5WT、T-DNA系和OE系的生长表型

将拟南芥种子于4℃在水中浸泡3天。对种子表面消毒，在补充2％(w/v)蔗糖的Murashige和Skoog(MS)培养基中播种10天。将具有相同大小的2片莲座叶的幼苗转移到长日照(22℃16小时光照/18℃8小时黑暗)或短日照(22℃8小时光照/18℃16小时黑暗)条件下的植物生长室的土壤中。当莲座叶上面的第一个花序开花达到1cm时，通过为莲座叶和茎生叶数量记分来开始测量开花时间。对每一系为10-20株植物记分(Liu等，2008；Wu等，2008)。

AtPAP2的OE系花序比WT和T-DNA系的花序出现早(长日照5-6天，短日照14-16天)(表1)。在长日照条件下，花序出现期间OE系的莲座叶数量比WT少(5-6片叶)(表1和图8)。在第28天(长日照)，AtPAP2的OE系比WT和T-DNA系具有更多的茎生叶和花序，但有较少的莲座叶(表2)。至少重复4次这种表型观察，此处显示实验之一的结果。

表1 AtPAP2 OE系在早期发育阶段开花

AEI：花序出现的平均日期

NRL：花序首次出现时的莲座叶数量

^*统计学上(p＜0.001)不同于野生型(n＝15)。

表2 AtPAP2 OE系在第28天的表型(长日照)

^*统计学上(p＜0.001)不同于野生型(n＝15)。

在成熟(长日照)时，记录从各系中收获的长角果数量和种子总重。表3A和3B中显示两个独立的实验性试验。我们的结果表明，过表达AtPAP2导致增加每株植物的长角果数量和每株植物的种子产量增加。与野生型相比，表3A中所示的两种过表达系的种子产量都增加38-40％。与野生型相比，表3B中所示的两种过表达系的种子产量都增加54-58％。

表3A OE系产生更多的长角果和种子(试验1)

统计学上(p＜0.02^*，p＜0.01^**，p＜0.001^#)不同于野生型。

表3B OE系产生更多长角果和种子(试验2)

统计学上(p＜0.0001^*)不同于野生型。

然而，AtPAP15 OE系正常生长，与野生型没有区别。因此，生长性能提高是由于过表达在其C-末端荷有跨膜样基序的AtPAP2(图2和3)。

6.6截短的AtPAP2构建体的生长表型

亦用与上述类似的技术构建采用AtPAP2序列的备选载体构建体。如图12所示，构建了等同于丢失C-末端基序(SEQ ID NO：2的614-636位残基)的AtPAP2OE系的构建体(P2C系)。用基本上与上述相同的技术产生转基因植物。将蛋白质印迹分析用于确证转化植物系中AtPAP2片段蛋白的过表达。蛋白质印迹分析的表现与以上报告的一样。如图13所示，P2C系强烈过表达。P2C系的生长表型似乎与野生型无差异，这表明AtPAP2C-末端结构域在形成提高的生长表型方面的重要性。

6.7叶中蔗糖和葡萄糖水平的MS/MS分析

在21日龄植物的光照期结束时收获不同发育阶段的植物莲座叶。用氯仿/甲醇方法(Lunn等，2006；Antonio等，2007；Luo等，2007)从拟南芥中提取可溶性糖。在液氮中将100mg植物组织碾磨为细粉，与250μl冰冷的氯仿∶甲醇(3∶7，v/v)混合并旋涡振荡。然后在-20℃过夜提取可溶性代谢物。将200μl水在重复振摇下加入到混合物中。让提取物以16000x g离心10分钟，收集上清液。用200μl水重新提取沉淀，如上述通过离心收集上清液。用SpeedVac让合并的上清液蒸发到干燥，将沉淀重新溶于200μl水中。最后，通过16000x g离心30分钟除去碎片。

通过API-3000三重四极杆质谱仪(Applied Biosystems)经由电离喷雾离子源分析20μl过滤的样品。由0-40μg/ml葡萄糖和蔗糖标准品优化的参数如下：帘气(CUR)25、喷雾气(GS1)50、辅助气(GS2)30、离子喷雾电压-4.5k V、温度400℃、去簇电位(DP)-106V、入口电位(EP)-8.5V、碰撞池入口电位(CEP)-46.7V、碰撞能(CE)20V。通过与葡萄糖和蔗糖标准品比较确定峰，由这些糖的标准曲线定量测定糖的量。将Analyst 1.3.1软件(Applied Biosystems)用于数据获得、峰积分和计算。生长在土壤中的21日龄植物的枝条在光照结束时的蔗糖和葡萄糖的量示于图9中。发现两者糖的水平都显著比WT中的高。

6.8延长时间黑暗处理后的植物的恢复

让野生型、T-DNA、OE7和OE21系的种子在MS(2％蔗糖)培养基中发芽10天。将具有相同大小的2片小的可见莲座叶(1mm)的幼苗转移到土壤中，在正常生长条件(长日照，16小时/光照(22℃)/8小时黑暗(18℃))下生长12天。然后将生长室的光源关闭12天。然后让植物在16小时/光照(22℃)/8小时黑暗(18℃)周期下恢复10天。在表4中记录保持绿色并继续出现花序的植物。

表4.延长时间黑暗处理后的存活率及开花比率

延长黑暗时间可诱导碳饥饿(Thompson等，2005)。我们的数据显示，OE系在长时间(12天)黑暗处理下表现出100％的恢复率，这比WT和T-DNA系都高(图10)。这可归因于OE系的较高的内源性糖水平(图9)。

6.9在NaCl和ABA处理下的植物表型

将生长在MS琼脂中的5日龄幼苗转移到含NaCl(50mM、100mM、150mM)、ABA(0.1uM、0.2uM、0.5uM、1uM、2uM)或山梨醇(300mM、400mM、500mM)的MS琼脂中。或者，让种子直接在处理培养基中发芽。在以上条件下野生型、T-DNA和OE系未显示显著的表型差异。

6.10亚细胞分级分离

收获3周龄野生型(Col-0)拟南芥的莲座叶，并储存在-80℃冷藏室中直到使用。在液氮中用带有杵的研钵将组织(4-5g)碾磨成细粉。将粉末转移到10ml碾磨缓冲液(0.3M蔗糖、40mM Tris-HCl(pH 7.8)、5mM MgCl₂、1mM PMSF)中，在冰上膨胀5分钟。在高速设定下以30秒脉冲实施均质化。通过两层Miracloth(Tetko，Elmsford，N.Y.，USA)过滤匀浆。随后通过在4℃以350g离心10分钟来分离匀浆。将沉淀(粗细胞核)在Eppendorf管中的1ml的2.3M蔗糖、50mM Tris-HCl(pH8.8)、5mM MgCl₂上进一步成层用于于4℃以15,000g离心10分钟，以在获得的沉淀中获得细胞核级分。让来自第一次低速离心(350g)的上清液于4℃以12,000x g离心20分钟。沉淀含有包括线粒体、叶绿体和过氧化物酶体在内的大颗粒。让上清液于4℃以100,000x g进一步离心1小时，以在获得的上清液中获得可溶性细胞溶胶级分。将代表膜级分的沉淀重悬在0.1ml碾磨缓冲液中。按照Bradford法(Bradford，1976)用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒I测定提取物中的蛋白质浓度。

为分离细胞壁，在碾磨缓冲液(62.5mM Tris-HCl，pH 7.5、5mMDTT、1％(v/v)牛血清白蛋白、2mM苯甲磺酰氟、2μg/ml亮抑酶肽、2μg/ml E-64、2μg/ml胃蛋白酶抑制剂A)中用Polytron(全速，3×10秒)匀浆叶组织。让匀浆以1,000×g离心3分钟。用冰冷的碾磨缓冲液(无1％BSA)洗涤沉淀10次。最后，通过将(细胞壁)沉淀重悬在500mM CaCl₂、20mM NaCl、62.5mM Tris-HCl，pH 7.5中并以10,000×g离心15分钟来洗涤沉淀(He等，1996)。

在SDS-PAGE凝胶中电泳亚细胞级分，并用抗AtPAP2抗血清探测。在膜中及可溶性蛋白质级分中检测到AtPAP2，但在细胞核、线粒体或叶绿体中未检测到(图11)。

总之，用AtPAP2基因转化的拟南芥植物当与野生型比较时具有以下表型：(1)较快的生长速率(表1和2)；(2)较高的蔗糖含量(图9)；(3)较高的葡萄糖含量(图9)；和(4)较高的作物产量(表3)。

本领域技术人员会认识到或仅用常规实验就能够确定很多本文所述特定实施方案的等同物。所述等同物意欲包括在以上权利要求中。

关于既定特性的任何数值或数值范围，来自一种范围的数值或参数可与来自同一特性的不同范围的另一数值或参数组合，以产生数值范围。

本说明书提及的所有出版物、专利及专利申请都在此通过引用结合到说明书中，其程度如同每一个单独的出版物、专利或专利申请都被具体且单独地指出通过引用结合到本文中的程度一样。

本文对参考文献的引用或论述不应解释为承认所述参考文献为本专利申请的现有技术。

尽管已针对某些实施方案对实施方案进行了解释，但应该理解，在阅读本说明书时其各种修改对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，应该理解，本文所公开的实施方案意欲包括落在随附权利要求范围内的所述修改。两个或更多个任何以上实施方案中的特征可联合形成其它的实施方案。

除了操作实施例中或其它另外指出的地方外，在本说明书及权利要求中使用的所有关于成分的量、反应条件等的数字、数值和/或表达，应理解为在所有情况下都由术语″约″来修饰。

6.11蔗糖代谢中涉及的酶的测定

测定了20日龄植物枝条的蔗糖磷酸合成酶(SPS)、蔗糖合成酶(SuSy)、细胞溶胶转化酶和细胞壁转化酶的活性。在光照黑暗期后8小时采集样品(长日照)。在最佳(Vmax)和有限(Vlimit)两者测定条件(Park等，2008)下测量SPS活性。亦测定SuSy、细胞溶胶转化酶和不溶性细胞壁转化酶的活性(Doehlert，1987)。测定重复了三次，在所有三次重复实验中，两个独立系的SPS(Vmax和Vlimit)活性都显著比野生型和T-DNA系中的高。代表性实验中的数据示于表5中。与SPS相反，各系中的SuSy、细胞溶胶转化酶和细胞壁转化酶的活性没有差别。

表5.酶测定

(^**P＜0.01；^*P＜0.05)

文章

Alonso，J.M.，Stepanova，A.N.，Leisse，T.J.，Kim，C.J.，Chen，H.，Shinn，P.，Stevenson，D.K.，Zimmerman，J.，Barajas，P.，Cheuk，R.，Gadrinab，C.，Heller，C.，Jeske，A.，Koesema，E.，Meyers，C.C.，Parker，H.，Prednis，L.，Ansari，Y.，Choy，N.，Deen，H.，Geralt，M.，Hazari，N.，Hom，E.，Karnes，M.，Mulholland，C.，Ndubaku，R.，Schmidt，I.，Guzman，P.，Aguilar-Henonin，L.，Schmid，M.，Weigel，D.，Carter，D.E.，Marchand，T.，Risseeuw，E.，Brogden，D.，Zeko，A.，Crosby，W.L.，Berry，C.C.和Ecker，J.R.(2003)Genome-wideinsertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana(拟南芥的基因组范围的插入诱变).Science，301，653-657.

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Claims (41)

1.一种制备转基因植物的方法，所述转基因植物具有提高的植物生长速率和提高的植物产量，所述方法包括：

将编码磷酸酶的基因引入到植物中，所述磷酸酶基因编码以下多肽，其包含具有SEQ ID NO：66序列或其同源物的C-末端基序，和选自SEQ ID NO：48-53中的一个或多个序列。

2.权利要求1的方法，其中所述磷酸酶基因为包含编码以下多肽的核苷酸序列的紫色酸性磷酸酶基因，所述多肽包含选自SEQ IDNO：2、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35和47及其同源物中的一个或多个的氨基酸序列。

3.权利要求1的方法，其中所述磷酸酶基因为包含选自SEQ IDNO：1、5、7、18、20、22、24、26、28、30、32、34和46及其同源物的核苷酸序列的紫色酸性磷酸酶基因。

4.权利要求2的方法，其中所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO1、5、7、18、20、22、24、26、28、30、32、34和46及其同源物中的一个或多个。

5.权利要求2的方法，其中所述核苷酸序列包含编码以下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含选自SEQ ID NO：2及其保守取代变体的氨基酸序列。

6.权利要求2的方法，其中所述核苷酸序列包含编码以下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含选自SEQ ID NO：54和55及其保守取代变体的氨基酸序列。

7.权利要求6的方法，其中所述核苷酸序列包含编码以下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含选自SEQ ID NO：50和51的氨基酸序列。

8.权利要求2的方法，其中所述核苷酸序列包含编码以下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含选自SEQ ID NO：57-60及其保守取代变体的氨基酸序列。

9.权利要求8的方法，其中所述核苷酸序列包含编码以下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含选自SEQ ID NO：50和51的氨基酸序列。

10.权利要求2的方法，其中所述核苷酸序列包含编码以下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含选自SEQ ID NO：61-64的氨基酸序列。

11.权利要求1的方法，其中相对于野生型植物，在所述转基因植物中引入所述磷酸酶基因增量调节蔗糖磷酸合酶的酶活性。

12.权利要求1的方法，其中相对于野生型植物，在所述转基因植物中引入所述磷酸酶基因增量调节蔗糖和/或葡萄糖水平。

13.权利要求1的方法，其中相对于野生型植物，引入所述磷酸酶基因提高所述转基因植物的生长速率。

14.权利要求1的方法，其中相对于野生型植物，引入所述磷酸酶基因导致所述转基因植物较高的作物产量。

15.权利要求1的方法，其中所述植物为选自以下属之一的种：天门冬属、雀麦属、萱草属、大麦属、黑麦草属、稷属、狼尾草属、甘蔗属、蜀黍属、胡卢巴属、小麦属、玉蜀黍属、金鱼草属、拟南芥属、落花生属、颠茄属、芸苔属、布洛华丽属、辣椒属、红蓝花属、菊苣属、柑桔属、茼蒿属、香瓜属、曼陀罗属、胡萝卜属、毛地黄属、草莓属、老鹳草属、大豆属、向日葵属、天仙子属、番薯属、莴苣属、亚麻属、百脉根属、茄属番茄属(Solanum lycopersicon)、Majorana、锦葵属、棉属、木薯属、苜蓿属、龙面花属、烟草属、驴食豆属、天竺葵属、碧冬茄属、毛茛属、萝卜属、美人襟属、千里光属、白芥属、茄属、车轴草属、豇豆属和葡萄属。

16.权利要求1的方法，其中所述植物为选自芸苔科的种。

17.一种转化植物，所述转化植物包括：

相对于对应的野生型植物包含至少一种编码磷酸酶的额外基因的植物，所述磷酸酶基因编码以下多肽，其包含具有SEQ ID NO：66序列或其同源物的C-末端基序，和选自SEQ ID NO：48-53中的一个或多个序列。

18.权利要求17的转化植物，其中所述磷酸酶基因为包含编码以下多肽的核苷酸序列的紫色酸性磷酸酶基因，所述多肽包含选自SEQ ID NO：2、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35和47及其同源物中的一个或多个的氨基酸序列。

19.权利要求17的转基因植物，其中所述磷酸酶基因为包含以下核苷酸序列的紫色酸性磷酸酶基因，所述核苷酸序列选自SEQ IDNO：1、5、7、18、20、22、24、26、28、30、32、34和46及其同源物。

20.权利要求17的转基因植物，其中所述磷酸酶基因为包含选自SEQ ID NO：1或其同源物的核苷酸序列的紫色酸性磷酸酶基因。

21.权利要求17的转化植物，其中所述磷酸酶基因为包含编码以下多肽的核苷酸序列的紫色酸性磷酸酶基因，所述多肽包含选自SEQ ID NO：2或其同源物中的一个或多个的氨基酸序列。

22.权利要求17的转化植物，其中所述植物属于单子叶物种。

23.权利要求17的转化植物，其中所述植物属于双子叶物种。

24.权利要求17的转化植物，其中所述植物为选自以下属之一的种：天门冬属、雀麦属、萱草属、大麦属、黑麦草属、稷属、狼尾草属、甘蔗属、蜀黍属、胡卢巴属、小麦属、玉蜀黍属、金鱼草属、拟南芥属、落花生属、颠茄属、芸苔属、布洛华丽属、辣椒属、红蓝花属、菊苣属、柑桔属、茼蒿属、香瓜属、曼陀罗属、胡萝卜属、毛地黄属、草莓属、老鹳草属、大豆属、向日葵属、天仙子属、番薯属、莴苣属、亚麻属、百脉根属、茄属番茄属、Majorana、锦葵属、棉属、木薯属、苜蓿属、龙面花属、烟草属、驴食豆属、天竺葵属、碧冬茄属、毛茛属、萝卜属、美人襟属、千里光属、白芥属、茄属、车轴草属、豇豆属和葡萄属。

25.权利要求17的转化植物，其中所述植物为选自芸苔科的种。

26.一种包含质粒的载体，所述质粒包含磷酸酶基因，所述磷酸酶基因包含选自SEQ ID NO：1、5、7、18、20、22、24、26、28、30、32、34和46及其同源物的核酸序列，其中所述质粒能够转化细菌细胞。

27.权利要求26的载体，其中所述细菌细胞为根癌农杆菌。

28.权利要求26的载体，其中所述磷酸酶基因编码以下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自SEQ ID NO：2、6、8、19、21、23、25、27、29、31、33、35和47及其同源物中的一个或多个，但这些氨基酸序列的1-50位氨基酸残基中的所有或N-末端部分被植物信号肽所置换，使得在转化宿主植物细胞中表达所述磷酸酶基因时，将所述多肽分选到植物细胞的各种细胞器或区室。

29.权利要求26的载体，其中所述磷酸酶基因包含选自SEQ IDNO：1或其同源物的核酸序列。

30.一种包含权利要求26的载体的宿主细胞。

31.权利要求30的宿主细胞，其中将所述包含磷酸酶基因的载体可操作地连接到异源启动子。

32.权利要求31的宿主细胞，其中所述异源启动子为植物启动子。

33.权利要求31的宿主细胞，其中所述异源启动子为源自花椰菜花叶病毒的启动子。

34.权利要求30的宿主细胞，其中所述宿主细胞为植物物种。

35.一种用于制备能够在宿主细胞中表达紫色酸性磷酸酶的细胞或其后代的方法，所述方法包括：

用权利要求26的载体转化细菌细胞；和

通过将DNA从所述细菌细胞转移到所述宿主细胞来转化所述宿主细胞。

36.权利要求35的方法，其中所述细菌细胞为根癌农杆菌，所述宿主细胞为植物细胞。

37.权利要求36的方法，其中所述宿主细胞来自芸苔科。

38.一种包含磷酸酶基因的表达盒，所述磷酸酶基因包含编码具有磷酸酶活性的酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在严格条件下与选自SEQ ID NO：1、5、7、18、20、22、24、26、28、30、32、34和46的核苷酸序列杂交，并与调控核苷酸序列可操作地连接，使得所述调控核苷酸序列引起所述核苷酸序列在植物细胞中表达。

39.权利要求38的表达盒，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1核苷酸序列杂交。

40.权利要求38的表达盒，其中所述调控核苷酸序列为花椰菜花叶病毒启动子。

41.一种喂饲动物的方法，所述方法包括：

为动物提供包含源自权利要求17的转化植物的物质的饲料，用于所述动物消费。

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