JPH11503329A

JPH11503329A - グリコシド結合の酵素的合成

Info

Publication number: JPH11503329A
Application number: JP8531092A
Authority: JP
Inventors: デフリーズ，シャウン; ジェイ．ベイヤー，ロバート; ラトクリフ，マーレイ
Original assignee: サイテルコーポレイション
Priority date: 1995-04-11
Filing date: 1996-04-10
Publication date: 1999-03-26
Also published as: CA2218246C; DE69611442D1; EP0820519A1; US5728554A; WO1996032491A1; DE69611442T2; CA2218246A1; EP0820519B1; AU5387396A

Abstract

(57)【要約】本発明はグリコシド結合の形成方法を提供する。これらの方法は、式：ＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲの化合物の製造に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】グリコシド結合の酵素的合成発明の分野本発明はオリゴ糖の合成に関する。特に、本発明は、単一の容器中で容易に入手可能な出発材料を使用しての、このような化合物の改良された酵素的合成に関する。発明の背景細胞の表面上の認識因子としての炭水化物の役割の理解の増加は、定められた構造の炭水化物分子の製造における関心を増加した。例えば、シアリルレウィス（Ｌｅｗｉｓ）リガンド、シアリルレウィス^x（Ｌｅｗｉｓ^x）およびシアリルレウィス^a（Ｌｅｗｉｓ^a）を含んでなる化合物は白血球および非白血球の細胞系の中に存在し、ＥＬＡＭ−１およびＧＭＰ１４０レセプターのようなレセプターに結合する。Ｐｏｌｌｅｙｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：６２２４（１９９１）およびＰｈｉｌｌｉｓｐｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５０：１１３０（１９９０）、さらに米国特許出願第０８／０６３，１８１号を参照のこと。所望の炭水化物構造をつくる関心のために、グリコシルトランスフェラーゼおよび酵素で触媒された炭水化物合成におけるグリコシルトランスフェラーゼの役割は現在広範に研究されている。これらの酵素は高い特異性を示し、そして定められた配列の炭水化物構造の形成において有効である。結局、グリコシルトランスフェラーゼは治療および他の目的で使用される多数の炭水化物の合成において酵素触媒として使用が増加している。合成的炭水化物化学の分野への酵素の適用において、酵素的炭水化物合成におけるグリコシルトランスフェラーゼの使用は、酵素が提供する事実上完全な立体選択性および結合特異性のために、化学的方法を越えた利点を提供する（Ｉｔｏｅｔａｌ．、ＰｕｒｅＡｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．、６５：７５３（１９９３）、米国特許第５，３５２，６７０号、および米国特許第５，３７４，５４１号）。炭水化物化合物の酵素的合成の改良された方法は、多数の有益な化合物の製造を発展させるであろう。本発明はこれらおよび他の目的を満足する。発明の要約本発明は単糖をドナー基質からアクセプター糖に転移させる改良された方法を提供する。特に、本発明の方法は、（ａ）少なくとも１種のグリコシルトランスフェラーゼ、ドナー基質、アクセプター糖および可溶性の２価の金属カチオンを含んでなる反応媒質を準備し、そして（ｂ）単糖の転移を実質的に完結するために十分な時間の間、沈澱により失われたものを置換して反応媒質中で約１ｍＭ〜約７５ｍＭの濃度を達成するように、可溶性の２価の金属カチオンの濃度を補充する、ことからなる。２価の金属カチオンの補充は不連続的または連続的に実施することができる。この方法において使用する２価の金属カチオンは、Ｍｎ⁺⁺、Ｍｇ⁺⁺、Ｃａ⁺⁺、Ｃｏ⁺⁺、Ｚｎ⁺⁺、Ｃｕ⁺⁺またはそれらの組み合わせであることができる。典型的には、カチオンはＭｎ⁺⁺である。グリコシルトランスフェラーゼは、シアリルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、またはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼであることができる。本発明は、また、ＥＬＡＭ−１のそのリガンドへの結合を阻害できる炭水化物化合物の製造方法を提供する。これらの化合物は種々の治療および診断の用途において特に有用である。図面の簡単な説明第１図は、式：ＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃβ（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲの概略的図解を提供する。第２図は、本発明のガラクトシルトランスフェラーゼのサイクルを図解する。第３図は、フコシルトランスフェラーゼのサイクルを図解する。第４図は、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼのサイクルを図解する。第５図は、本発明のシアリルトランスフェラーゼのサイクルを図解する。第６図は、ガラクトシルトランスフェラーゼの部分的サイクルを図解する。第７図は、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼの部分的サイクルを図解する。第８図は、シアリルトランスフェラーゼの部分的サイクルを図解する。第９図は、ガラクトシルトランスフェラーゼのサイクルについての反応速度／金属イオン濃度を図解する。第１０図は、シアル酸をＧｌｃＮＡｃから発生させるシアリルトランスフェラーゼのサイクルを図解する。第１１図は、ＭｎＣｌ₂の連続的注入でガラクトシルトランスフェラーゼを処理する間に達成される金属イオンのレベルを図解する。発明の詳細な説明本発明は単糖をドナー基質からアクセプター糖に転移させる方法を提供する。この転移は、少なくとも１種のグリコシルトランスフェラーゼ、ドナー基質、アクセプター糖および可溶性の２価の金属カチオンを含んでなる反応媒質中で起こる。前記方法はグリコシルトランスフェラーゼを使用して、基質のサッカリドへのサッカリドの付加を触媒することに頼る。この付加は生体分子上のオリゴ糖または炭水化物部分の非還元性末端において起こる。本発明において定義される生体分子は下記のものを包含するが、これらに限定されない：生物学的に有意な分子、例えば、タンパク質（例えば、糖タンパク質）、および脂質（例えば、グリコリピド、リン脂質、スフィンゴ脂質およびガングリオシド）。本発明の方法において、２価の金属イオン濃度はグリコシド結合の形成の間に補充して、反応媒質中の可溶性の２価の金属カチオン濃度を約１ｍＭ〜約７５ｍＭに補充する。下記の略号を本明細書において使用する：Ａｒａ＝アラビノシル；Ｆｒｕ＝フルクトシル；Ｆｕｃ＝フコシル；Ｇａｌ＝ガラクトシル；ＧａｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクト；Ｇｌｃ＝グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコ；Ｍａｎ＝マンノシル；およびＮｅｕＡｃ＝シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）。オリゴ糖は、還元性末端におけるサッカリドが事実還元糖であるか否かにかかわらず、還元性末端と非還元性末端とを有する。容認された命名法に従い、オリゴ糖は本明細書において左に非還元性末端および右に還元性末端を有するように描写されている。本明細書において記載するすべてのオリゴ糖は、非還元性サッカリドの名称または略号（例えば、Ｇａｌ）、次いでグリコシド結合の立体配置（αまたはβ）、結合に関係する還元性サッカリドの環の結合、環の位置、次いで還元性サッカリドの名称または略号（例えば、ＧｌｃＮＡｃ）を使用して記載される。２つの糖の間の結合は、例えば、２，３、２→３、または（２，３）で表される。本発明の態様多数のグリコシルトランスフェラーゼのサイクル（例えば、第２図に描写されているガラクトシルトランスフェラーゼのサイクル、第３図に描写されているフコシルトランスフェラーゼのサイクル、第４図に描写されているＮ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、および第５図に描写されているシアリルトランスフェラーゼのサイクル）はオリゴ糖の製造に有用である。参照、米国特許第５，３７４，５４１号およびＷＯ第９４２５６１５号。これらの酵素サイクルは形成される生成物の各モルについて１または２モル以上の無機ピロリン酸を生成し、典型的には２価の金属イオンの存在において実施される。金属イオンはサイクルの各々において少なくとも１つの酵素のコファクターである。しかしながら、２価の金属カチオンはグリコシルトランスフェラーゼのサイクルにおいて二重の役割を演ずることを我々は今回発見した。特に、２価の金属イオンは、グリコシルトランスフェラーゼのサイクルにおける種々のプロセスにより生産される無機リン酸またはピロリン酸と、非常に低い溶解度の錯体を形成することを我々は発見した。結局、金属イオンは反応から沈澱によりＰｉまたはＰＰｉを除去することができる。これは、引き続いて、溶液中の金属イオンの量を減少させ、そして金属イオンのコファクターを必要とする酵素のための全体の代謝回転速度を対応して減少させる。この問題に対する１つの可能な解決法は、高い濃度の金属イオンのコファクターを使用する開始を含む。しかしながら、高い濃度の金属イオンのコファクターの使用は、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼの双方のサイクルに対して有害であることが証明された。高い濃度のマグネシウムイオンは、サイクルにおけるある種の酵素を不活性化する外に、ヌクレオシド糖、例えば、ＵＤＰ−グルコースおよびＵＤＰ−ガラクトースの分解を触媒できることが報告された（参照、Ｎｕｎｅｚ、ｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１５：３８４３−３８４７（１９７６））。また、他の研究者らは反応媒質中に無機ピロリン酸を混入して、ピロリン酸の除去により反応サイクルを完結まで推進させることを試みた。それにもかかわらず、無機ピロリン酸により生成されるオルトリン酸と金属イオンのコファクターとの間において、制限された溶解度の錯体が形成し、金属イオン濃度の効果的減少を伴う。本発明はこれらのサイクルにおける金属イオンの消耗の問題に対する別の解決法を提供し、これはサイクルのプロセスを通じて金属イオン濃度を連続的または不連続的に補充することである。したがって、本発明は本明細書において記載するサイクル的グリコシルトランスフェラーゼのプロセスにおいて用途を見出し、また、ドナー基質またはドナー糖のヌクレオシド部分が再循環されるか、または第２図〜第８図に示すものに類似する再循環プロセスの一部分として表すことができる、グリコシド結合のドメインの他の方法において用途を見出す。２価の金属カチオンの絶対的要件を証明したガラクトシルトランスフェラーゼのサイクルにおける酵素は、ガラクトシルトランスフェラーゼである（参照、Ｋｈａｔｒａ、ｅｔａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：５３７−５６０（１９７４））。反応速度の、例えば、Ｍｎ⁺⁺濃度、に対する依存性は、³ Ｈ−ガラクトースがＵＤＰ−³Ｈ−ガラクトースからＮ−アセチルグルコサミンに転移し、Ｎ−アセチルラクトサミンを形成する速度を測定することによって検査された（第９図参照）。第９図において見ることができるように、反応速度は２ｍＭ以下において急勾配に低下する。金属イオン濃度を１ｍＭ以上、好ましくは２ｍＭ以上に維持することによって、サイクルは最大の効率で進行することができる。しかしながら、高過ぎるＭｎ⁺⁺濃度は、一部分、高い濃度のＭｎ⁺⁺がヌクレオシド糖の加水分解を触媒するという既知の作用のために、有害であることが証明された。ピロリン酸またはリン酸が発生する反応において、低い溶解度の錯体が形成し、必要な金属コファクターが消耗される。ピロリン酸またはリン酸が発生しない反応において、この消耗は起こらない。１つのような反応は、第６図において、ガラクトシルトランスフェラーゼの部分的サイクルとして描写されている。この部分的サイクルにおいて、ガラクトシルトランスフェラーゼ、適当なアクセプター、および十分なＵＤＰ−ガラクトース（またはＵＤＰ−グルコースまたはＵＤＰ−ｇａｌ−４−エピメラーゼ）をＭｎ⁺⁺の存在においてインキュベートする場合、アクセプターはガラクトシル化されるであろう。それにもかかわらず、この反応は完結まで進行しないであろう。その代わりに、この反応は阻害性生成物のＵＤＰがそれ以上の反応を阻害するために十分なレベルに蓄積するまで進行するであろう。このような反応において、金属イオンの溶解度を減少する種が発生しないので、金属イオン濃度は感知し得る程度に変化しない。ＵＤＰによる阻害のための不完全な反応の問題に対する解決法は、阻害性ＵＤＰをＵＭＰ＋Ｐｉに変換し、次いでウリジン＋２Ｐｉに変換するホスファターゼ（例えば、アルカリ性ホスファターゼ）を添加することである。この場合において、発生するリン酸によりマンガンイオンが消耗されるためにマンガンイオン濃度はもはや一定に止まらない。この場合において、金属イオンを補充して反応を完結に推進できることが今回発見された。２価の金属カチオンが絶対的に要求されることが知られているガラクトシルトランスフェラーゼのサイクルにおける他の酵素は、ピルベートキナーゼ（参照、Ｖｉｌｌａｆｒａｎｃａ、ｅｔａｌ．、ＴＨＥＥＮＺＹＭＥＳ、ＸＸ：６３ −９４（１９９２））およびＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（参照、Ｔｕｒｎｑｕｉｓｔ、ｅｔａｌ．、ＴＨＥＥＮＺＹＭＥＳ、ＶＩＩＩ：５１− ７１（１９７３））である。高い濃度において、２価の金属カチオンはＵＤＰ− グルコースピロホスホリラーゼに対して阻害性であることが報告されている。シアリルトランスフェラーゼのサイクル（第５図）において、２価の金属カチオンが絶対的に要求される酵素は、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼである（参照、Ｋｅａｎ、ｅｔａｌ．、ＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ８：２０８−２１５（１９６６））。このシアリルトランスフェラーゼのサイクルにおいて２価の金属カチオンが絶対的に要求される酵素は、ピルベートキナーゼおよびミオキナーゼである（参照、Ｖｉｌｌａｆｒａｎｃａ、ｅｔａｌ．、ＴＨＥＥＮＺＹＭＥＳ、ＸＸ：６３− ９４（１９９２））。ガラクトシルトランスフェラーゼについて前述したように、シアリルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ、適当なアクセプター、シアル酸、ＣＴＰおよび適当な２価の金属カチオンを含んでなる部分的サイクルまたは化学量論的反応を実施することができる（第８図参照）。ガラクトシルトランスフェラーゼのサイクルと対照的に、このような反応における２価の金属イオンの濃度は、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの反応により発生する無機ピロリン酸のために、一定に止まらない。十分なＣＴＰおよびシアル酸が存在する場合、２価の金属カチオンが消耗されるか、または阻害性ＣＭＰが十分なレベルまで蓄積されるまで、反応は進行する。ガラクトシルトランスフェラーゼの部分的サイクルを使用するときのように、Ｐｉを発生する適当なホスファターゼで処理することによって、阻害性ヌクレオチドを除去することができる。これは２価の金属カチオンをさらに消耗させる。ＧｌｃＮＡｃサイクル（第４図）において、２価の金属カチオンが絶対的に要求される酵素はＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼである。ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼのサイクルにおける他の酵素はピルベートキナーゼである。ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼの部分的サイクルについて前述したように、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、適当なアクセプター、およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、またはＧｌｃＮＡｃ−１−リン酸とＵＴＰおよびＵＤＰＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ（第７図において大きい矢印で示す）との組み合わせを含んでなる部分的サイクルまたは化学量論的反応を実施できる。他のサイクルおよび部分的サイクルを使用するときのように、また、適当な２価の金属カチオンを使用する。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを使用して反応を開始させる場合において、ＵＤＰが十分なレベルまで蓄積するまで、反応は進行する。このような反応において、金属イオンの溶解度を減少する種が発生しないので、金属イオン濃度は感知し得る程度に変化しない。ガラクトシルトランスフェラーゼの部分的サイクルを使用するときのように、Ｐｉを発生する適当なホスファターゼ、例えば、アルカリ性ホスファターゼ）で処理することによって、阻害性ヌクレオチドを除去することができる。これは２価の金属カチオンをさらに消耗させる。ＵＴＰおよびＧｌｃＮＡｃ−１−リン酸を使用して部分的反応を開始させる場合において、状況はシアリルトランスフェラーゼについて論じた部分的サイクルに類似する。このような反応において、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの反応により発生する無機ピロリン酸のために、２価の金属イオンの濃度は一定に止まらない。さらに、適当なホスファターゼの添加により蓄積する阻害性ＵＤＰを除去すると、リン酸がさらに発生するために、必要な２価の金属はさらに消耗される（第７図参照）。酵素的グリコシル化反応を製造方法のために大規模化するとき、経済的および設備の考察から、反応をできるだけ濃縮された溶液中で実施して、原料の要件を減少し、合理的容器大きさを維持し、そして除去すべき水性溶媒の量を減少することが必要である。反応成分のより高い濃度において、発生するリン酸またはピロリン酸の濃度は比例的により大きくなる。反応を完全に推進するために所望のレベルを維持するために十分な２価の金属カチオンを最初に存在させると、実際に反応に対して有害であることが証明される。十分に高い反応濃度および速度において、沈澱により失われた２価の金属を２４時間毎の補充でさえ、添加後に、一時的に高い濃度が反応サイクルに対して有害であるような、大きい比率の添加を必要とする。この場合において、２価の金属イオンの連続的注入は反応において満足すべき濃度を達成し、そして好ましい方法である。グリコシルトランスフェラーゼ、ならびに本発明において提供される発見についての既知の要件にかんがみて、本発明は１つの面において単糖をドナー基質からアクセプター糖に転移させる方法を提供する。この方法において、少なくとも１種のグリコシルトランスフェラーゼ、ドナー基質、アクセプター糖および可溶性の２価の金属カチオンを含有する媒質（典型的には水溶液）を準備する。反応媒質中の２価の金属イオン濃度を補充して、グリコシルの転移を実質的に完結するために十分な時間の間、約１ｍＭ〜約７５ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約５〜約３０ｍＭの濃度を理想的には維持する。用語「実質的に完結する」は、本発明の合成方法に適用するとき、ｔｌｃまたはプロトンＮＭＲにより少なくとも約９０％、より好ましくは約９５％、なおより好ましくは約９８％完結したプロセスを意味する。反応媒質中の金属イオン濃度を連続的または不連続的にモニターしかつ追加量の２価の金属イオンにより反応媒質を補充することによって、反応サイクルを適当な時間フレーム内で完結に推進させることができる。さらに、２種以上のグリコシルトランスフェラーゼを使用する場合、中間生成物を単離しないで同一反応器中で連続的サイクルを実施することができる。そのうえ、阻害性ピロリン酸を除去することによって、反応サイクルを実質的により高い基質（アクセプター）濃度において実施することができる。本発明において使用するために好ましい２価の金属イオンは、Ｍｎ⁺⁺、Ｍｇ⁺⁺、Ｃｏ⁺⁺、Ｃａ⁺⁺、Ｚｎ⁺⁺、Ｃｕ⁺⁺およびそれらの組み合わせを包含する。より好ましくは、２価の金属イオンはＭｎ⁺⁺である。態様の１つのグループにおいて、グリコシルトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼである。シアリルトランスフェラーゼを使用するとき、反応媒質は好ましくは、シアリルトランスフェラーゼ、ドナー基質、アクセプター糖および２価の金属カチオンに加えて、（ｉ）触媒量のＣＭＰ−シアル酸シンセターゼ、（ｉｉ）シアル酸、および（ｉｉｉ）少なくとも２モルのリン酸ドナー／各モルのシアル酸、および触媒量のヌクレオシド三リン酸、リン酸をリン酸ドナーからヌクレオシド二リン酸に転移できるキナーゼ、および末端のリン酸をヌクレオシド三リン酸からＣＭＰに転移できるヌクレオシド一リン酸キナーゼを含んでなるＣＭＰ−シアル酸再循環系を含有するであろう。 α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ、しばしばシアリルトランスフェラーゼと呼ぶ、は、ＮｅｕＡｃα（２，３）Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃβ（１，３）ＧａｌβＯＲ（式中Ｒは下記において定義する通りである）の製造において本発明において利用する主要な酵素である。これは酵素はシアル酸をＧａｌに転移させると同時に、２つのサッカリドの間でα−結合を形成する。サッカリドの間の結合（連鎖）はＮｅｕＡｃの３−位置とＧａｌの３−位置との間に存在する。 α（２，３）シアリルトランスフェラーゼと呼ぶ典型的なα（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）は、シアル酸をＧａｌβ１→３Ｇｌｃ二糖またはグリコシドの非還元性末端のＧａｌに転移させる。参照、ＶａｎｄｅｎＥｉｊｎｄｅｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９（１９８１）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５（１９８２）およびＷｅｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１（１９９２）。他の典型的なα（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．４）は、シアル酸を二糖またはグリコシドの非還元性末端のＧａｌに転移させる。参照、Ｒｅａｒｉｃｋｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：４４４４（１９７９）およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１００４（１９９２）。他の典型的な酵素は、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃα（２，６）シアリルトランスフェラーゼ（参照、Ｋｕｒｏｓａｗａｅｔａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５−３８１（１９９４）、Ｋｕｒｏｓａｗａｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１４０２（１９９４）およびＧＭ３シンターゼ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２６２７３−７８（１９９３）およびα（２，８）シアリルトランスフェラーゼ（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１１５０４（１９９３））を包含する。本発明の方法において使用される第２の成分酵素はＣＭＰ−シアル酸シンセターゼである。この酵素は、以後詳細に論ずる、ＣＭＰ−シアル酸再生系において利用される。ＣＭＰ−シアル酸シンセターゼは、この分野においてよく知られている手法により、シンセターゼ酵素を含有する細胞および組織から単離および精製することができる。参照、例えば、Ｇｒｏｓｓｅｔａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６８：５９５（１９８７）、Ｖｉｊａｙｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５０（１）：１６４（１９７５）、Ｚａｐａｔａｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４（２５）：１４７６９（１９８９）およびＨｉｇａｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０（１５）：８８３８（１９８５）。この酵素の遺伝子は、また、配列決定された。参照、Ｖａｎｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２：１７５５６（１９８７）。また、遺伝子の過度の発現はＣＭＰ −ＮｅｕＡｃのグラム規模の合成において使用するために報告された。参照、Ｓｈａｍｅｓｅｔａｌ．、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１：１８７（１９９１）。また、この酵素は商業的に入手可能である。シアル酸がまた要求される。考えられるシアル酸は、アル酸それ自体（５−Ｎ −アセチルノイラミン酸；５−Ｎ−アセチルアミノ−３，５−ジデオキシ−Ｄ− グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロソン酸；ＮｅｕＡｃ、および時にはＡｃＮｅｕまたはＮＡＮＡと略される）を包含するばかりでなく、かつまた９−置換シアル酸、例えば、９−Ｏ−Ｃ₁−Ｃ₆アシル−ＮｅｕＡｃ、例えば、９−Ｏ−ラクチル−ＮｅｕＡｃまたは９−Ｏ−アセチル−ＮｅｕＡｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−ＮｅｕＡｃおよび９−アジド−９−デオキシ−ＮｅｕＡｃを包含する。これらの化合物の合成およびシアリル化法における使用は、国際出願ＷＯ９２／１６６４０号明細書（１９９２年１０月１日発行）に開示されている。他の適当なシアル酸は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、５−ヒドロキシノイラミン酸、５ −ＣｂｚＮＨ、５−ＣＨ₃ＯＣ（ＯＨ）ＮＨノイラミン酸（Ｓｈａｍｅｓｅｔａｌ．、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．１：１８７（１９９１））および５−Ｎ−アシルノイラミン酸を包含する。反応混合物は、また、シアリルトランスフェラーゼのアクセプターを含有する。適当なアクセプターは、例えば、下記のものを包含する：ガラクトシルアクセプター、例えば、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１→３Ａｒａ、Ｇａｌβ１→６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ（ラクトース）、Ｇａｌβ １→４Ｇｌｃβ１−ＯＣＨ₂ＣＨ₃、Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１−ＯＣＨ₂Ｃ₆Ｈ₅、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＨ− アシル、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｌｌｏｃ、Ｇａｌβ１−ＯＣＨ₃、メリビオース、ラフィノース、スタキオースおよびラクト−Ｎ−ネオテトラオース。適当なシアリルアクセプターは下記のものを包含する：シアリルα２−ＯＲまたはシアリルα２→８シアリル−ＯＲ、式中Ｒは水素、サッカリド、オリゴ糖または少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン基である（後述するように）。ＣＭＰ−シアル酸再循環系は、前述したように、ＣＭＰ−シアル酸シンセターゼを利用する。第５図において示すように、ＣＭＰ−シアル酸（第５図においてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃとして示されている）は、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼの存在においてシアリルトランスフェラーゼのアクセプターと反応して、ＮｅｕＡｃα（２，３）Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃβ（１，３）Ｇａｌ βＯＲ（式中Ｒは下記において定義する通りである）を形成する。本発明において使用されるＣＭＰ−シアル酸再生系は、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、ヌクレオシド三リン酸（例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、リン酸ドナー（例えば、ホスホエノールピルベートまたはアセチルリン酸）、リン酸をリン酸ドナーからヌクレオシド二リン酸に転移できるキナーゼ（例えば、ピルベートキナーゼまたはアセチルキナーゼ）および末端のリン酸をヌクレオシド三リン酸からＣＭＰに転移できるヌクレオシド一リン酸キナーゼを含んでなる。以前に論じられたα（２，３）シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸シンセターゼは、また、形式的にＣＭＰ−シアル酸再生系の一部分として見ることができる。しかしながら、２つの酵素は既に論じられたので、それらをそれ以上の本明細書において論じない。ＣＭＰ−シアル酸再生系に従い使用するために適当なヌクレオシド三リン酸は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、イノシン三リン酸（ＩＴＰ）およびチミジンチミジン（ＴＴＰ）である。好ましいヌクレオシド三リン酸はＡＴＰである。ヌクレオシド一リン酸キナーゼは、ヌクレオシド一リン酸のリン酸化を触媒する酵素である。本発明のＣＭＰ−シアル酸再生系に従い使用するヌクレオシド一リン酸キナーゼ（ＮＭＫ）またはミオキナーゼ（ＭＫ；ＥＣ２．７．４．３）を使用して、ＣＭＰのリン酸化を触媒する。ＮＭＫは商業的に入手可能である（ＳｉｇｍａＣｈｅｍ．Ｃｏ．、ミゾリー州セントルイス；ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、インジアナ州インジアナポリス）。リン酸ドナーおよび触媒量のリン酸のリン酸ドナーから活性化ヌクレオチドへの転移を触媒するキナーゼは、また、ＣＭＰ−シアル酸再生系の一部分である。再生系のリン酸ドナーはリン酸化化合物であり、そのリン酸基を使用してヌクレオシドリン酸をリン酸化することができる。リン酸ドナーの選択の唯一の制限は、リン酸ドナーのリン酸化された形態または脱リン酸化された形態がシアリル化アクセプターのサッカリドの形成に関係する反応を阻害できないということである。好ましいリン酸ドナーはホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）およびアセチルリン酸である。特に好ましいリン酸ドナーはＰＥＰである。本発明に従い使用する特定のキナーゼの選択は、使用するリン酸ドナーに依存する。アセチルリン酸をリン酸ドナーとして使用するとき、キナーゼは酢酸塩キナーゼである。ＰＥＰをリン酸ドナーとして使用するとき、キナーゼはピルベートキナーゼ（ＰＫ；ＥＣ２．７．１．４０）である。この分野においてよく知られているように、他のキナーゼをこれらおよび他のリン酸ドナーとして使用することができる。キナーゼは商業的に入手可能である（ＳｉｇｍａＣｈｅｍ．Ｃｏ．、ミゾリー州セントルイス；ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、インジアナ州インジアナポリス）。これらのグリコシル化方法のあるもの自己含有およびサイクル特性のために、いったんすべての反応成分および酵素が存在すると、化学量論的基質（遊離ＮｅｕＡｃまたはＰＥＰ）の最初のものまたはアクセプターが消費されるまで、反応は連続する。したがって、シアリル化の例において、ＣＭＰはＣＤＰに変換され、その変換はＡＴＰの存在においてヌクレオシド一リン酸キナーゼまたはミオキナーゼにより触媒される。ＡＴＰはその副生物のＡＤＰから、添加されたホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）の存在において、ピルベートキナーゼ（ＰＫ）により触媒的に再生される。ＣＤＰはさらにＣＴＰに変換され、その変換はＰＥＰの存在においてＰＫにより触媒される。ＣＴＰはシアル酸と反応して無機ピロリン酸（ＰＰｉ）およびＣＭＰ−シアル酸を形成し、後者の反応はＣＭＰ−シアル酸シンセターゼにより触媒される。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼのアクセプター化合物のシアリル化後、解放されるＣＭＰは再生系の中に再び入って、ＣＤＰ、ＣＴＰおよびＣＭＰ−シアル酸を形成する。反応サイクルの過程の間に２価の金属イオン濃度を補充することによって、形成したＰＰｉまたはＰｉを沈澱を介して溶液から除去することができる。そのうえ、２価の金属カチオンの適当なレベルを維持することによって、金属イオンのコファクター依存性酵素をピークの効率で操作することができる。ピルベートはまた副生物であり、そして他の反応において作ることができ、この反応において、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）およびピルベートをＮｅｕＡｃアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．３）の存在において反応させてシアル酸を形成する。また、ＧｌｃＮＡｃのＭａｎＮＡｃへの異性化を利用することができ、そして高価でないＧｌｃＮＡｃをシアル酸発生のための出発材料として使用することができる。したがって、シアル酸の代わりにＭａｎＮＡｃ（またはＧｌｃＮＡｃ）および触媒量のＮｅｕＡｃアルドラーゼを使用することができる（第１０図参照）。ＮｅｕＡｃアルドラーゼはまた逆転反応（ＮｅｕＡｃ→ＭａｎＮＡｃおよびピルベート）を触媒するが、生成するＮｅｕＡｃはＣＭＰ−シアル酸シンセターゼにより触媒されるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを介して反応サイクルの中に不可逆的に組込まれる。さらに、出発材料のＭａｎＮＡｃは、また、この分野において知られている方法を使用してＧｌｃＮＡｃの化学的変換により製造することができる（参照、例えば、Ｓｉｍｏｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：７１５９（１９８８）。シアル酸およびその９−置換誘導体の酵素的合成、および得られるシアル酸の種々のシアリル化反応スキームにおける使用は、国際出願ＷＯ９２／１６６４０号明細書（１９９２年１０月１日発行、引用することによって本明細書の一部とされる）に開示されている。前述したように、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）はＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造の副生物である。好ましいＰＰｉを供給し戻して他の酵素を阻害し、こうしてグリコシル化を減少することができる。しかしながら、ＰＰｉを２価の金属カチオン（例えば、Ｍｎ⁺⁺またはＭｇ⁺⁺）で錯化することができる。例えば、ＰＰｉは無機ピロホスファターゼ（ＰＰアーゼ；ＥＣ３．６．１．１）、すなわち、商業的に入手可能なＰＰｉ異化酵素（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、ミゾリー州セントルイス；ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、インジアナ州インジアナポリス）を使用する加水分解により除去することができる。それにもかかわらず、この酵素的分解は、リアーゼリン酸（Ｐｉ）を生成し、これは２価の金属カチオンと沈澱を形成することができる。結局、本発明の方法は２価の金属カチオンの添加により完結まで推進される。本明細書おいて使用するとき、用語「ピロリン酸掃去剤」は本発明の反応混合物から無機ピロリン酸を除去する働きをする物質を意味する。以後説明するように、反応混合物からＰＰｉまたはＰｉを除去する好ましい方法は、媒質中で２価の金属カチオン濃度を維持することである。特に、カチオンおよび生成した無機リン酸は非常に低い溶解度の錯体を形成する。ピロリン酸との沈澱により失われるカチオンを補充することによって、反応速度を維持しかつ反応を完結させることができる（すなわち、１００％の変換率）。補充は連続的（すなわち、自動的）にまたは不連続的に実施することができる。用語「可溶性の２価の金属カチオン濃度を達成する」および他の関係する用語は、反応サイクルが実質的に阻害されないように、２価のカチオン濃度を一般に最適範囲内に止まらせる方法を意味する。したがって、用語は２価のカチオン濃度がある時間の間において最適範囲外に低下する方法を特別に包含する。下記において示すように、カチオン濃度がこのようにして維持されるとき、トランスフェラーゼの反応サイクルを完結まで推進させることができる。態様の他のグループにおいて、グリコシルトランスフェラーゼはガラクトシルトランスフェラーゼである。ガラクトシルトランスフェラーゼ使用するとき、反応媒質は好ましくは、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ドナー基質、アクセプター糖および２価の金属カチオンに加えて、少なくとも１モルのグルコース−１ −リン酸／各モルのアクセプター糖、リン酸ドナー、リン酸をリン酸ドナーからヌクレオシド二リン酸に転移できるキナーゼ、およびＵＴＰおよびグルコース− １−リン酸からＵＤＰ−グルコースを形成できるピロホスホリラーゼおよび触媒量のＵＤＰおよびＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼを含んでなるドナー基質再循環系を含有する。典型的なガラクトシルトランスフェラーゼは、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．１５１、参照、例えば、Ｄａｂｋｏｗｓｋｉｅｔａｌ．、ＴｒａｎｓｐｌａｎｔＰｒｏｃ．２５：２９２１（１９９３）およびＹａｍａｍｏｔｏｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ３４５：２２９−２３３（１９９０））、α（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．９０）、および細菌の β（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼ（参照、Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ、ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２１８１（１９９４））。態様の他のグループにおいて、グリコシルトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼとガラクトシルトランスフェラーゼとの組み合わせである。態様の他のグループにおいて、酵素および基質を最初の反応混合物中で組み合わせるか、または好ましくは第１ガラクトシルトランスフェラーゼサイクルが完結にいったん近づいたとき、第２グリコシルトランスフェラーゼサイクルの酵素および試薬を反応媒質に添加することができる。単一の容器中で２つのグリコシルトランスフェラーゼサイクルを順次に実施することによって、全体の収率は中間の種を単離する方法より改良される。そのうえ、掃除および余分の溶媒および副生物の廃棄が減少する。態様の他のグループにおいて、グリコシルトランスフェラーゼはフコシルトランスフェラーゼである。多数のフコシルトランスフェラーゼが当業者に知られている。簡単に述べると、フコシルトランスフェラーゼはＬ−フコースをＧＤＰ− フコースからアクセプター糖のヒドロキシ位置に転移させる酵素を包含する。好ましくはアクセプター糖はオリゴ糖のグリコシド中のβＧａｌ（１→４）βＧｌｃＮＡｃ基中のＧｌｃＮＡｃである。また、適当なフコシルトランスフェラーゼは下記のものを包含する：既知のβＧａｌ（１→３，４）βＧｌｃＮＡｃα（１ →３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＩＩＥ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）、これは人間の乳から得られる（参照、Ｐａｌｃｉｃ、ｅｔａｌ．、ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓ．１９０：１−１１（１９８９）；Ｐｒｉｅｅｌｓ、ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０４５６− １０４６３（１９８１）；およびＮｕｎｅｚ、ｅｔａｌ．、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５９：２０８６−２０９５（１９８１））およびβＧａｌ（１→４）βＧｌｃＮＡｃα（１→３）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ、およびＦＴＶＩＩ、Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）、これはヒトの血清の中に見出される。βＧａｌ（１→３，４）βＧｌｃＮＡｃα（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼの組換え型は、また、入手可能である（参照、Ｄｕｍａｓ、ｅｔａｌ．、Ｂｉｏｏｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓｌ１：４２５− ４２８（１９９１）およびＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｏ、ｅｔａｌ．、ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ４：１２８８−１３０３（１９９０））。他の典型的なフコシルトランスフェラーゼは、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６９）を包含する。酵素的フコシル化は、Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅ、ｅｔａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：１６９−１７６（１９９０）または米国特許第５，３７４，６５５号明細書に記載されている方法により実施することができる。シアリルトランスフェラーゼについて詳細に説明したように、他のグリコシルトランスフェラーゼを同様なトランスフェラーゼサイクルの中に置換することができることを当業者は理解するであろう。特に、グリコシルトランスフェラーゼは、また、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、例えば、Ａｌｇ８（Ｓｔａｇｌｊｏｖｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：５９７７（１９９４））またはＡｌｇ５（Ｈｅｅｓｅｎｅｔａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：７１（１９９４））であることができる。適当なＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｎａｇａｔａｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２−１２０８９（１９９２）およびＳｍｉｔｈｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２（１９９４））およびポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９（１９９３））を包含する。適当なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、ＧｎＴＩ（２．４．１．１０１、Ｈｕｌｌｅｔａｌ．、ＢＢＲＣ１７６：６０８（１９９１））、ＧｎＴＩＩ、およびＧｎＴＩＩＩ（Ｉｈａｒａｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：６９２（１９９３））、ＧｎＴＶ（Ｓｈｏｒｅｉｂａｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５３８１（１９９３））、Ｏ−連鎖および他のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：９３２６（１９９２）およびＧｏｔｓｃｈｌｉｃｈ、ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２１８１（１９９４））、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ（Ｒａｊｐｕｔｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８５：９８５（１９９２）、およびヒアルロナンシンターゼを包含する。適当なマンノシルトランスフェラーゼｈａ、α（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、β（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎシンターゼ、ＯＣｈｌ、およびＰｍｔｌを包含する。他の適当なグリコシルトランスフェラーゼサイクルは、Ｉｃｈｉｋａｗａｅｔａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２８３（１９９２）、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：４３４３（１９９２）、ＤｅＬｕｃａ、ｅｔａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：５８６９−５８７０（１９９５）、およびＩｃｈｉｋａｗａｅｔａｌ．、ｉｎＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓａｎｄＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓ。Ｙａｌｔａｍｉ編（ＡＴＬＰｒｅｓｓ、１９９３）。前述のグリコシルトランスフェラーゼサイクルについて、このプロセスにおいて使用する種々の試薬の濃度および量は、多数の因子、例えば、反応条件、例えば、温度およびｐＨ値、およびグリコシル化すべきアクセプターサッカリドの選択および量に依存する。グリコシル化プロセスは活性化ヌクレオチド、活性化されたドナー糖の再生、および触媒量の酵素の存在において製造されたＰＰｉの掃去を可能とするので、このプロセスは上記において論じた化学量論的基質の濃度または量により制限される。本発明の方法に従い使用できる反応成分の濃度の上限は、このような反応成分の溶解度により制限される。好ましくは、活性化ヌクレオチド、リン酸ドナー、ドナー糖および酵素の濃度は、アクセプターが消費されるまでグリコシル化が進行するように選択される。後述する濃度は、シアリルトランスフェラーゼに関するが、一般に他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルに適用可能である。酵素の各々は触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、その酵素の基質の濃度ならびに反応条件、例えば、温度、時間およびｐＨ値に従い変化する。前もって選択された基質の濃度および反応条件下に所定の酵素について触媒量を決定する手段は、この分野においてよく知られている。酵素の量または濃度は活性単位で表される。１活性単位は、所定の温度（典型的には３７℃）およびｐＨ値（典型的には７．５）／分において１μｍｏｌの生成物の形成を触媒する。したがって、１０単位の酵素は、３７℃の温度および７．５ｐＨ値において１分で１０μｍｏｌの基質が１０μｍｏｌの生成物に変換される酵素の量である。プロセスを通して再循環させる試薬はＣＭＰ／ＣＤＰ／ＣＴＰである。したがって、ＣＭＰ、ＣＤＰおよびＣＴＰの任意の単一の種または組み合わせを使用して反応を開始することができる。ＣＭＰが高価でなくかつそのグループが最も容易に入手可能であるかぎり、典型的にはＣＭＰを使用して反応を開始し、前述の量は使用する種または組み合わせの合計量についての量である。上記成分を水性反応媒質（溶液）中の混合により組み合わせる。その媒質は約６〜約８．５のｐＨ値を有する。媒質は酵素のコファクターと結合するキレート化剤、例えば、Ｍｇ⁺²またはＭｎ⁺²を欠く。媒質の選択はｐＨ値を所望のレベルに維持する媒質の能力に基づく。したがって、いくつかの態様において、媒質を、好ましくはＨＥＰＥＳで、約７．５のｐＨ値に緩衝化する。緩衝剤を使用しない場合、媒質のｐＨを塩基の添加により約６〜８．５、好ましくは約７．２〜７．８に維持すべきである。適当な塩基はＮａＯＨ、好ましくは６ＭのＮａＯＨである。反応媒質は、また、必要に応じて可溶化洗浄剤（例えば、トリトンまたはＳＤＳ）および有機溶媒、例えば、メタノールまたはエタノールを含むことができる。さらに、酵素は好ましくは遊離状態で溶液中で使用されるが、支持体、例えば、ポリマーに結合することができる。こうして、反応混合物は開始時に実質的に均質であるが、多少の沈澱が反応の間に形成することがある。上記プロセスを実施する温度は、凍結より少し高い温度から大部分の感受性酵素が変性する温度までの範囲であることができる。温度範囲は好ましくは約０℃ 以上から約４５℃まで、より好ましくは約２０℃〜約３０℃である。そのように形成した反応混合物は、アクセプターがシアリル化されて、所望のシアリルα２→３βガラクトシド（シアロシド）生成物を形成するために十分な時間の間維持される。その生成物のあるものを数時間後にしばしば検出することができ、回収可能な量は通常２４時間以内に得られる。このプロセスの収率を最適化することが好ましく、そして維持時間は通常約３６〜約２４０時間である。上記プロセスにより製造された生成物は精製しないで使用できる。しかしながら、生成物を回収することが通常好ましい。グリコシル化サッカリドを回収する標準的な、よく知られている技術、例えば、薄層または厚層クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または膜濾過を使用することができる。下記および本明細書において引用する文献において論じられているように、回収のために膜濾過を使用すること、より好ましくは逆浸透膜、または１または２以上のカラムクロマトグラフィー技術を利用することが好ましい。例えば、膜が約３０００〜約１０，０００の分子量のカットオフを有する膜濾過を使用してタンパク質を除去することができる。次いで、ナノ濾過または逆浸透を使用して塩を除去することができる。ナノフィルター膜は、１価の塩を通過させるが、使用する膜に依存して、約１００〜約７００ダルトンより大きい多価の塩および非帯電溶質を保持する逆浸透膜の１クラスである。したがって、典型的な用途において、本発明の方法により製造されたサッカリドは膜の中に保持され、そして汚染する塩は通過であろう。このような技術を使用すると、サッカリド（例えば、シアリルラクトース）を、プロトンＮＭＲまたはＴＬＣにより測定して、本質的に１００％の純度で製造することができる。他の面において、本発明は下記式を有する化合物の製造方法を提供する：ＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’ ）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲこの式において、Ｒは水素、サッカリド、オリゴ糖または少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン基である。Ｒ’は１〜１８個の炭素のアルキルまたはアシル（例えば、アセチル、またはアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ））、５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフトアミド、ベンズアミド、２−ナフトアミド、４− アミノベンズアミド、または４−ニトロベンズアミドである。用語「少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン基」は基−Ａ−Ｚを意味し、式中Ａは１〜１８個の炭素原子のアルキレン基であり、前記アルキレン基はハロゲン、チオール、ヒドロキシ、酸素、硫黄、アミノ、イミノ、またはアルコキシで置換されていてもよく、そしてＺは水素、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ₂、− ＮＨＲ¹、−Ｎ（Ｒ¹）₂、−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯ₂Ｒ¹、−ＣＯＮＨ₂、−ＣＯＮＨＲ¹ 、−ＣＯＮ（Ｒ¹）₂、−ＣＯＮＨＮＨ₂、または−ＯＲ¹であり、ここで各Ｒ¹は独立して１〜５個の炭素原子のアルキルである。さらに、Ｒは下記基であることができる：式中、ｎ、ｍ、ｏ＝１〜１８；（ＣＨ₂）_n−Ｒ²（式中、ｎ＝０〜１８）、ここでＲ²は種々に置換された芳香族環、好ましくは、フェニル基であり、これは１または２以上のアルコキシ基、好ましくはメトキシまたはＯ（ＣＨ₂）_mＣＨ₃（式中、ｎ＝０〜１８）、またはそれらの組み合わせで置換されている。特に好ましい態様において、Ｒは３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）プロピルである。これらの方法の工程は下記のものを含む：（ａ）ＵＤＰ−ガラクトースの存在において化合物：Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＲ’β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲを形成するために十分な条件下に、式ＧｌｃＮＲ’β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲの化合物をガラクトシルトランスフェラーゼでガラクトシル化し、（ｂ）シアル酸が非還元糖に転移される条件下にシアル酸のＣＭＰ誘導体の存在においてα（２，３）シアリルトランスフェラーゼを使用して（ａ）において形成された化合物をシアリルトランスフェラーゼでシアリル化して、化合物：ＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＲ’β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲを形成し、そして（ｃ）（ｂ）において形成された化合物をフコシル化して、ＮｅｕＡｃα（２ →３）Ｇａｌβ（１→４）（Ｆｕｃａ１→３）ＧｌｃＮＲ’β（１→３）Ｇａｌ β−ＯＲを形成する。さらに、本発明の方法のために、ガラクトシル化およびシアリル化工程の少なくとも１つを２価の金属カチオンを含有する反応媒質中で実施し、そして反応媒質に２価の金属カチオンを不連続的または連続的に補充して、金属イオン濃度を約１ｍＭ〜約７５ｍＭに維持する。ガラクトシル化およびシアリル化工程は、酵素的に、好ましくはグリコシド結合を形成する方法について前述した一般的条件下に実施される。したがって、ガラクトシル化工程は好ましくはガラクトシルトランスフェラーゼサイクルの一部分として実施され（第２図参照）そしてシアリル化工程は好ましくはシアリルトランスフェラーゼサイクルの一部分として実施される（第５図参照）。これらのサイクルの各々における他の種および酵素の好ましい条件および説明は記載された。好ましい態様において、ガラクトシル化およびシアリル化工程は、単一の容器中で実施された。フコシル化工程は化学的または酵素的に実施することができる。酵素的フコシル化は、適当なオリゴ糖をα（１→３）フコシルトランスフェラーゼおよびＬ− フコースと、フコースがオリゴ糖上に転移される条件下に、接触させることによって実施することができる。用語「α（１→３）フコシルトランスフェラーゼ」は、Ｌ−フコースをＧＤＰ−フコースからオリゴ糖グリコシド中のβＧａｌ（１ →４）βＧｌｃＮＡｃ基中のＧｌｃＮＡｃのヒドロキシ位置に転移させるフコシルトランスフェラーゼを意味する。適当なフコシルトランスフェラーゼは前述され、そして既知のβＧａｌ（１→３，４）βＧｌｃＮＡｃα（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼおよびβＧａｌ（１→４）β ＧｌｃＮＡｃα（１→３）フコシルトランスフェラーゼを包含する。適当な条件は、当業者に知られており、ｐＨおよび温度の適当な条件、例えば、６．５〜７．５のｐＨおよび０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜４５℃、より好ましくは３５℃〜４０℃の温度において、１２時間〜４日間、適当な緩衝液、例えば、０．１Ｍのナトリウムカコディレート中のオリゴ糖およびＧＤＰ−フコースの適当な混合物にα（１→３）フコシルトランスフェラーゼを添加することを包含する。生ずるフコシル化生成物を、慣用技術、例えば、膜濾過、ＨＰＬＣおよびゲル−、逆相−、イオン交換−、または吸着クロマトグラフィーを使用して、単離および精製することができる。また、工程（ｂ）において製造されたオリゴ糖のフコシル化を、米国特許出願第０８／０６３，１８１号（その開示は引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されている方法に従い化学的に実施する。好ましい態様において、Ｒはエチルであり、フコシル化工程を化学的に実施し、そしてガラクトシル化およびシアリル化を単一の容器中で実施する。他の好ましい態様において、第２図、第３図および第５図に描写されているトランスフェラーゼサイクルを使用して２価の金属イオンを補充しながら、ガラクトシル化、シアリル化およびフコシル化工程のすべてを酵素的に実施する。より好ましくは、酵素サイクルのすべてを単一の反応器中で実施する。なおより好ましくは、４つの酵素サイクルを単一の反応器中で実施して、下記式を有する五糖を製造する：ＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲ式中、ＲおよびＲ’は上記において定義した通りである。なお他の面において、本発明はＷＯ９４／２６７６０明細書に記載されているような化合物の製造方法を提供する。一般に、これらの化合物は下記式を有する：ＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ”）β−ＯＲ² この式において、Ｒ”は１〜１８個の炭素のアルキルまたはアシル、５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフトアミド、ベンズアミド、２−ナフトアミド、４−アミノベンズアミド、または４−ニトロベンズアミドである。Ｒ²は前述のＲと同一であるか、またはＧａｌβ−ＯＲ（Ｒは上記において定義した通りである）であることができる。上記において、用語は一般にそれらの標準的意味において使用される。用語「アルキル」は、本明細書おいて使用するとき、分枝鎖状もしくは直鎖状の、飽和もしくは不飽和の、１価または２価の、１〜２０個の炭素原子を有する炭化水素基、例えば、１〜８個の炭素原子の低級アルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ −プロピル、ブチル、ｎ−ヘキシル、およびその他、シクロアルキル（３〜７個の炭素原子）、シクロアルキルメチル（４〜８個の炭素原子）、およびアリールアルキルである。用語「アリール」は、芳香族炭化水素から１個の原子を除去することによって誘導された基、例えば、ベンゼンからのフェニルを意味する。芳香族炭化水素は２以上の不飽和炭素環、例えば、ナフチルを有することができる。用語「アルコキシ」は、分子の残部に酸素により結合したアルキル基、例えば、エトキシ、メトキシ、またはｎ−プロポキシを意味する。用語「アルキルチオ」は、分子の残部に硫黄により結合したアルキル基を意味する。用語「アシル」は、有機酸からヒドロキシルの除去により誘導された基を意味する。好ましい態様は前述した通りである。次いで前述の化合物は種々の用途、例えば、抗原、診断剤、または治療剤として使用することができる。したがって、本発明は、また、種々の症状を治療するとき使用できる医薬組成物を提供する。医薬組成物は、前述の方法に従い製造されたオリゴ糖から構成される。本発明の医薬組成物は、種々の薬剤送出系において使用するために適当である。本発明において使用するために適当な処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＭａｃｅＰｕｂｌｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州フィラデルフィア、第１７版（１９８５）の中に見出される。薬剤の送出法の概観については、下記の文献を参照のこと：Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）。医薬組成物は、非経口、鼻内、局所、経口または局所投与のために、例えば、エーロゾルまたは経皮的に、予防および／または治療を目的として意図される。通常、医薬組成物は非経口的に、例えば、静脈内に投与される。したがって、本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体、例えば、水、緩衝化水、生理食塩水、ＰＢＳおよびその他の中に溶解または懸濁された化合物を含んでなる、非経口投与用組成物を提供する。組成物は、生理的状態に近似させるために要求される薬学上許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節および緩衝化剤、張度調節剤、湿潤剤、洗浄剤およびその他を含有することができる。これらの組成物は慣用の滅菌技術により滅菌することができるか、または滅菌濾過することができる。得られる水溶液をそのまま使用するために包装するか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥された調製物を投与前に無菌の水性担体と一緒にする。調製物のｐＨは典型的には３〜１１、より好ましくは５〜９、最も好ましくは７〜８である。ある態様において、本発明のオリゴ糖を標準的小胞形成脂質から形成されたリポソームの中に組込むことができる。リポソームを製造する種々の方法は、例えば、下記の文献に記載されているように、入手可能である：Ｓｚｏｋａｅｔａｌ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、米国特許第４，５０１，７２８号および米国特許第４，８３７，０２８号。種々のターゲッティング剤（例えば、本発明のシアリルガラクトシド）を使用するリポソームのターゲッティングは、この分野においてよく知られている（参照、例えば、米国特許第４，９５７，７７３号および米国特許第４，６０３，０４４号）。ターゲッティング剤をリポソームに結合する標準的方法を使用することができる。これらの方法は、一般に、脂質成分、例えば、ホスファチジルエタノールアミン（これはターゲッティング剤の結合のために活性化することができる）、または誘導化された親油性化合物、例えば、本発明の脂質誘導化オリゴ糖をリポソームの中に組込むことを包含する。一般に、ターゲッティングのメカニズムは、標的成分が標的、例えば、細胞表面のレセプターとの相互作用に利用可能であるような方法において、ターゲッティング剤がリポソームの表面上に位置することを必要とする。本発明の炭水化物を脂質分子に結合した後、リポソームを当業者に知られている方法により形成することができる（例えば、炭水化物上に存在するヒドロキシル基をハロゲン化長鎖アルキルまたは脂肪酸で、それぞれ、アルキル化またはアシル化する）。また、膜を形成するとき、コネクター部分が最初に膜の中に組込まれるような方法において、リポソームを仕上げることができる。コネクター部分は、膜の中に堅固に埋め込まれかつ定着された親油性部分をもたなくてはならない。また、それはリポソームの水性表面上で化学的に利用可能な反応性部分をもたなくてはならない。反応性部分は、ターゲッティング剤または後に添加される炭水化物と安定な化学的結合を形成するために化学的に適当であるように、選択される。ある場合において、ターゲッティング剤をコネクター部分に直接的に結合することが可能であるが、大部分の場合において、第３分子を使用して化学的架橋として作用させ、こうして膜の中に存在するコネクター分子を、小胞表面から３次元的に拡張したターゲッティング剤または炭水化物と、結合させることはいっそう適当である。オリゴ糖を含有する組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与可能である。治療的用途において、組成物を既に疾患に罹った患者に、前述したように、疾患およびその合併症の症状を治癒または少なくとも部分的阻止するために十分な量において投与する。これを達成するために適切な量は「治療的に有効な投与量」と定義される。この使用に有効な量は疾患の苛酷性および患者の体重および一般的状態に依存するが、一般に約０．５ｍｇ〜約２，０００ｍｇのオリゴ糖／日／７０ｋｇ患者の範囲であり、約５ｍｇ〜約２００ｍｇ／日の投与量の化合物が普通に使用される。予防的用途において、本発明のオリゴ糖を含有する組成物を特定の疾患の疑いがあるか、またはその危険にある患者に投与する。このような量は「予防的に有効な量」と定義される。この使用において、正確な量は再び患者の健康状態および体重に依存するが、一般に約０．５ｍｇ〜約１，０００ｍｇ／７０ｋｇ患者の範囲であり、より普通には約５ｍｇ〜約２００ｍｇ／７０ｋｇ体重である。組成物の単一または多数回の投与を実施することができ、投与のレベルおよびパターンは治療を行う医師により選択される。いずれの場合においても、医薬処方物は患者を治療するために有効な量の本発明のオリゴ糖を提供すべきである。オリゴ糖は、また、診断試薬としての用途を見出ことができる。例えば、標識化化合物を使用して、炎症を有することが推測される患者における炎症または腫瘍の転移の区域を捜し出すことができる。この使用のために、化合物を適当な放射性同位元素、例えば、²⁵Ｉ、¹⁴Ｃ、またはトリチウムで標識化することができる。本発明のオリゴ糖は、本発明の化合物と特異的に反応性のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生するための免疫原として使用することができる。種々の免疫グロブリン分子を産生しかつ操作する多数の技術は、当業者に入手可能であり、そして本発明において使用することができる。抗体は当業者によく知られている種々の手段により発生させることができる。非ヒト、例えば、ネズミ、ウサギ、ウマおよびその他のモノクローナル抗体の産生はよく知られており、そして、例えば、本発明のオリゴ糖を含有する調製物で動物を免疫化することによって達成することができる。免疫化された動物から得られた抗体産生細胞を永久分裂能化させ、スクリーニングするか、または最初に所望の抗体についてスクリーニングし、次いで永久分裂能化させる。モノクローナル抗体の産生の一般的手順についての説明については、下記の文献を参照のこと。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）。下記の実施例により、本発明を例示する。これらの実施例は本発明を限定または定義しない。実施例下記の実施例は、エチル（ナトリウム（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート））−（２ −３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−４）−Ｏ−（（α−Ｌ− フコピラノシル）−（１−３）−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β− Ｄ−グルコピラノシル）−（１−３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの製造に適用される本発明の方法を例示する。追加の実施例は、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼサイクルを使用するβＧａｌ（１，４）Ｇｌｃ（ラクトース）からの βＧｌｃＮＡｃ（１，３）βＧａｌ（１，４）Ｇｌｃの製造である。次いで、この三糖をさらにガラクトシルトランスフェラーゼサイクルを介してβＧａｌ（１，４）βＧｌｃＮＡｃ（１，３）βＧａｌ（１，４）Ｇｌｃ（ラクト−Ｎ−ネオ −テトラオース）に変換することができる。このオリゴ糖および前駆体および出発物質の完全な化学的合成は、米国特許出願第０８／０６３，１８１号明細書（前に引用することによって本明細書の一部とされる）において提供された。化合物の番号は、第１図の合成スキームの中に提供されている番号に対応する。実施例１この実施例は、実施例３のガラクトシルトランスフェラーゼサイクルにおいて基質として使用する、二糖のＧｌｃＮ（Ａｌｌｏｃ）（１→３）βＧａｌＯＥｔの合成を例示する。この実施例において製造される化合物の番号は第１図において提供されており、第１図は好ましい五糖の製造の略図である。エチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ）の製造炭酸銀（３．１３ｋｇ、１１．４ｍｏｌ）、４Ａモレキュラーシーブ（２．３７ｋｇ）、ジクロロメタン（１６リットル）、および無水エタノール（４．０リットル）を供給した反応器に、ジクロロメタン（４リットル）中の２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ガラクトシルブロミド（２，５ｋｇ）の溶液を２０〜２５ｍｌ／分の速度で添加した。撹拌を維持して、試薬を激しく混合した。臭化物の溶液を完全に添加した後２時間に、シリカゲルのＴＬＣをヘキサン：酢酸エチル（１：１）で展開すると、臭化物は示されなかった。その時において、反応混合物をセライトパッド（１ｋｇ）を通して濾過し、濾液を真空下に３０〜３５℃において蒸発させると、褐色油状物（１．９５ｋｇ）が得られた。この油状物を真空下に１７時間乾燥した。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃）δ：５．３６（１Ｈ、ｄ、Ｊ_3.4＝３．７Ｈｚ、Ｈ−４）、５．１７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ_2.3＝１１．０Ｈｚ、Ｈ−２）、４．９９（１Ｈ、ｄｄ、Ｈ−３）、４．４６（１Ｈ、ｄ、Ｊ_1. ₂ ＝８．３Ｈｚ、Ｈ−１）、２．１５、２．０５、２．０４、１．９５（１２Ｈ、４ｓ、ＯＡｃ）、１．２１（３Ｈ、ｔ、ＯＣＨ₂ＣＨ₃）。粗製エチルテトラアセチルガラクトピラノシド（１．９５ｋｇ）を無水メタノール（１１．７リットル）中に溶解し、メタノール中の２５％ナトリウムメトキシド溶液（９０ｍｌ）を滴下した。この溶液を１時間撹拌し、この時酢酸エチル：メタノール（２：１）で展開したシリカゲルのＴＬＣは出発物質が存在しないことを示した。生成物はＲｆ＝０．６を有した。この溶液を撹拌しながらアンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ⁺）樹脂（０．６ｋｇ）の添加により中和した。溶液のｐＨがｐＨ６とｐＨ７との間にあるとき、樹脂を濾過により除去し、濾液を真空下に蒸発させると、薄黄色固体状物が得られた。この固体状物を沸騰するエタノール（１１リットル）中に溶解した。生ずる溶液を２５℃に放冷し、次いで０℃に冷却すると、白色沈澱が得られた。この固体状物を濾過すると、エチルβ―Ｄ−ガラクトピラノシド（０．８５１ｋｇ）が得られた。¹ＨＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ：４．３８（１Ｈ、ｄ、Ｊ_1.2＝８．０Ｈｚ、Ｈ−１）、３．８９（１Ｈ、ｂｄ、Ｊ_3.4＝３．７Ｈｚ、Ｈ−４）、１．２（３Ｈ、ｔ、ＯＣＨ₂ＣＨ₃）。エチル４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＩ）の製造エチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ）（０．８５１ｋｇ、４．０９ｍｏｌ）を、トルエンスルホン酸（１．５ｇ、７．９ｍｍｏｌ）を含む２０リットルのロトバプ（ｒｏｔｏｖａｐ）フラスコの中に供給した。この蒸発器フラスコを蒸発器に固定し、ベンズアルデヒドジメチルアセタール（１．２３リットル、８．１８ｍｏｌ）を吸引により添加し、この混合物を４時間タンブルした。アセタールの添加後３０分と４０分との間において、ほぼ完全な溶液が得られ、次いで急速に重い沈澱が出現した。回転を４時間続け、この時トリエチルアミン（１．５ｍｌ）を添加して、反応混合物を中和した。真空を適用し、溶媒を除去すると、固体状塊が得られた。ヘキサン（６リットル）をフラスコの中に供給し、この混合物を０．５時間タンブルした。生ずる固体状物を濾過し、濾液上でヘキサン：エチルエーテル（１：１、２リットル）で洗浄した。そのようにして得られた白色固体状物を真空下に１７時間乾燥すると、純粋なエチル４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（１．０ｋｇ、３．３８ｍｏｌ）が８３％の収率で得られた。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃）δ：７．５３（２Ｈ、ｍ、芳香族）、７．３７（３Ｈ、ｍ、芳香族）、５．５７（１Ｈ、ｓｃ，ＣＨＰｈ）、４．２９（１Ｈ、ｄ、Ｊ_1.2＝７．０Ｈｚ、Ｈ−１）、４．２１（１Ｈ、ｄ、Ｊ_3.4＝３．２７Ｈｚ、Ｈ−４）、１．２９（３Ｈ、ｔ、ＯＣＨ₂ＣＨ₃）。エチル２−Ｏ−ベンゾイル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＩＩ）の製造空気ドライブ、ガス入口をもつ圧力平衡化滴下漏斗、冷却浴、およびガス出口を装備する２０リットルの反応器に、エチル４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ −ガラクトピラノシド（ＩＩ）（０．９２４ｋｇ、３．１２ｍｏｌ）を入れた。フラスコを密閉する前に、ジクロロメタン（９．３リットル）およびピリジン（２リットル）を添加すると、均質溶液が得られた。滴下漏斗に、塩化クロロアセチル（０．３８８ｋｇ、３．４３ｍｏｌ、２７３ｍｌ）をジクロロメタン中の６０％溶液として供給した。このフラスコを密閉し、乾燥窒素をゆっくり流し始めた。浴を−６５℃±５℃に冷却し、反応混合物を３０分間撹拌した。その時において、塩化アセチル溶液を３〜４ｍｌ／分の速度で滴下し始めた。この溶液の添加が完結した後、反応混合物をさらに１時間−６５℃±５℃に維持した。その時において、塩化ベンゾイル（０．６１４ｋｇ、４．３７ｍｏｌ、０．５０７リットル）を８〜１２ｍｌ／分の速度で反応混合物に添加した。反応混合物を室温に放温し、１７時間放置した。この混合物を濾過して沈澱した塩を除去し、濾液を真空濃縮してジクロロメタンの大部分を除去した。少量の試料をＮＭＲのために取って置いた。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃）δ：５．７５（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ_2.3＝１０．６Ｈｚ、Ｈ−２）、５．５６（１Ｈ、ｓ、ＣＨＰｈ）、５．２５（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ_3.4＝３．４４Ｈｚ、Ｈ−３）、４．６９（１Ｈ、ｄ、Ｊ_1.2＝８．４８Ｈｚ、Ｈ−１）、４．４８（１Ｈ、ｂｄ、Ｈ−４）、１．１５（３Ｈ、ｔ、ＯＣＨ₂ＣＨ₃）。水（１８０ｍｌ）を濃縮物に添加し、生ずる混合物を４０℃において２時間撹拌した。その時において、反応混合物さらに濃縮すると、黄色残留物が得られ、これをジクロロメタン（１１リットル）中に溶解し、５０リットルの抽出器に移した。有機溶液を氷冷水性０．５ＮＨＣｌ（１１リットル）、水性飽和炭酸水素ナトリウム（１１リットル）、冷水（１１リットル）で連続的に抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウム（１．０ｋｇ）で乾燥し、濾過し、濾液を蒸発させると、黄色が得られ、これを高真空下に乾燥した。この反応をヘキサン：酢酸エチル（１：１）で展開したシリカゲルのＴＬＣにより監視した。この固体状物を熱エタノール（９．５リットル）中に溶解し、これを冷却し、濾過すると、エチル２−Ｏ−ベンゾイル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（０．７３７ｋｇ、１．８５ｍｏｌ）が５９％の収率で得られた。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃）δ ：５．５９（１Ｈ、ｓ、ＣＨＰｈ）、５．３６（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ_2.3＝１０．０７Ｈｚ、Ｈ−２）、４．６４（１Ｈ、ｄ、Ｊ_1.2＝８．２１Ｈｚ、Ｈ−１）、１．１５（３Ｈ、ｔ、ＯＣＨ₂ＣＨ₃）。このベンゾエートがＣ−２に存在し、そしてＣ−３が遊離ヒドロキシル基を有することを確証するために、１滴のトリクロロアセチルイソシアネートをＮＭＲ試料に添加し、スペクトルを再び獲得した。このスペクトルはＣ−３においてエステル化したガラクトシドのＨ−３に典型的なδ＝５．２７において低い場の二重項の二重項を含有した。反応混合物から得られたもとの濾液は追加量の生成物を含有する。エチル２−Ｏ−ベンゾイル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＶ）の製造冷却浴、ガス入口をもつ圧力平衡化滴下漏斗、撹拌機、およびガス出口を装備する２０リットルの反応器に、エチル２−Ｏ−ベンゾイル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＩＩ）（１．００１ｋｇ、２．５ｍｏｌ）を入れた。窒素の流れ下にフラスコに、４Ａモレキュラーシーブ（１．０３ｋｇ）、ジクロロメタン（６．６リットル）、コリジン（０．３６７リットル、２．７７ｍｏｌ）を添加し、１５分間撹拌した後、最後にトリフルオロメタンスルホン酸銀（０．６８９ｋｇ、２．６４１ｍｏｌ）を添加した。ジクロロメタン（２．４０リットル）中に溶解した３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル臭化物（１．３１０ｋｇ、２．６４１ｍｏｌ）を滴下漏斗に供給した。この系を密閉し、窒素の低いパージを維持し、撹拌をまず室温において１時間開始し、次いで反応器の冷却（−２５ ℃）を開始し、混合物を低温においてさらに１時間撹拌した。次いで、臭化物の溶液を１〜２時間かけて添加した。生ずる混合物を周囲温度にさせ、１７時間後、セライトのパッドを通して混合物を濾過し、濾液を水性チオ硫酸ナトリウム（２Ｍ、３．０リットル）、水（３リットル）、塩酸（１Ｍ、２×２リットル）、炭酸水素ナトリウム（１Ｍ、３．０リットル）、最後に水（３リットル）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させると、固体状物が得られた。固体状物をイソプロパノール：酢酸エチル（１：１、３２リットル）中に還流において溶解した。一夜室温に冷却した後、濾過および乾燥すると、最初の収獲物のエチル２−Ｏ−ベンゾイル−４，６− Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ −２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシドが得られた。母液（１８リットル、蒸発させた）を濃縮し、生ずる溶液を室温において一夜放置すると、許容できる純度の第２収獲物が得られた。ＴＬＣ後、２つの収獲物をプールした（１．４７９ｋｇ、１．８１６ｍｏｌ、７２％）。¹ ＨＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃）δ：７．７５（１４Ｈ、ｍ、芳香族）、５．５７（１Ｈ、ｓ、ＣＨＰｈ）、５．３８（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝７．８９Ｈｚ、Ｊ＝１０．５Ｈｚ）．５．１６（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝９．９９Ｈｚ）、４．５２（１Ｈ、ｄ、Ｊ_1. ₂ ＝７．８９、Ｈ−１）、２．０８、２．０１、１．８８（３Ｈ、３ｓ、ＯＡｃ）、０．９５（３Ｈ、ｔ、ＯＣＨ₂ＣＨ₃）。エチル３−Ｏ−（２−Ｎ−アリルオキシカルボニル−２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル（Ｖ）の製造エチル２−Ｏ−ベンゾイル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＶ）（１．０１７ｋｇ、１．２５ｍｏｌ）に、８０％酢酸（１０リットル）を添加した。生ずる混合物を９０℃に１．２５時間加熱し、次いで酢酸エチルで展開したシリカゲルのＴＬＣはＲｆ＝０．５〜０．６を有する生成物および出発物質の完全な消費を示した。この溶液を蒸発乾固し、残留物を７０℃において１：１エタノール：アセトン（６リットル）中に溶解した。脱イオン水（９．０リットル）を生ずる溶液に添加して生成物を沈澱させた。生成物を濾過し、水：アセトン９：１（６リットル）で洗浄し、１６時間空気乾燥し、次いで真空下に水酸化ナトリウムペレットで乾燥した。脱イオン水（４．５リットル）を母液に添加することによって、第２収獲物を単離した。この物質を前述したように乾燥した。このジオールの収量は０．７０７ｋｇ（８１％）であった。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃） δ：５．６７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ₃'_.4'＝９．０７Ｈｚ、Ｊ₂'_.3'＝１１．２３Ｈｚ、Ｈ−３’）、５．５７（１Ｈ、ｄ、Ｊ₁'_.2'＝９．２１Ｈｚ、Ｈ−１’）、５．３２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ_2.3＝１０．０８Ｈｚ、Ｈ−２）、５．１２（１Ｈ、ｔ、Ｊ₄'_.5'＝９．０７Ｈｚ、Ｈ−４’）、４．４６（１Ｈ、ｄ、Ｊ_1.2＝８．６４、Ｈ−１）、２．１４、２．０３、１．７８（９Ｈ、３ｓ、ＯＡｃ）、０．９８ (３Ｈ、ｔ、ＯＣＨ₂ＣＨ₃)。エチル２−Ｏ−ベンゾイル−３−Ｏ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２ −デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（０．６４５ｋｇ、０．８８２ｍｏｌ）をエタノール（６．５リットル）中に加熱還流しかつ撹拌しながら溶解した。透明な溶液が得られたとき、ヒドラジン水和物（０．４リットル、８．２５ｍｏｌ）を添加し、この混合物を連続的に撹拌しながら加熱還流させた。沈澱が現われ始め、１６時間後、酢酸エチル：酢酸：メタノール：水１２：３：３：２で展開したシリカゲルのＴＬＣで判定すると、反応は完結した。生成物はＲｆ＝０．１５を有した。反応混合物を周囲温度に冷却し、次いで撹拌しながらアセトン（５リットル）を添加した。撹拌を続けると、均質懸濁液が得られ、これを濾過すると、五酸化リンの存在において高真空下に乾燥後、粗製のエチル３−Ｏ−（２−アミノ−２− デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシルが白色、非晶質粉末状物（０．４ｋｇ）として得られた。この粗製の物質をメタノール（５．５リットル）と水（０．３リットル）との混合物に添加した。炭酸水素ナトリウム（０．９０ｋｇ、１０．７ｍｏｌ）を添加し、この混合物を３０分間撹拌した。その時において、室温において連続的に撹拌しながらアリルクロロホルメート（０．１４０リットル、１．３２ｍｏｌ）を添加した。１時間後、酢酸エチル：酢酸：メタノール：水１２：３：３：２で展開したシリカゲルのＴＬＣはＲｆ＝０．６を有する生成物および反応の完結を示した。この混合物を濾過し、固体状物をメタノール（０．５リットル）で洗浄した。濾液を蒸発させると、残留物が得られた。残留物を水（３．０リットル）中に取り、ジクロロメタン（４．０リットル）で抽出した。水性層を分離し、ジクロロメタン（１．０リットル）で洗浄し、濃縮すると、固体状物が得られた。固体状塊をアセトン：酢酸エチル（１：２、３リットル）とともに２時間撹拌した。この懸濁液を濾過し、固体状物を酢酸エチルで洗浄した。五酸化リンの存在において１７時間高真空下に乾燥すると、灰色粉末状物が得られた（０．４４４ｋｇ）。¹ＨＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ：５．９３(１Ｈ、ｍ、ＯＣＨ₂ＣＨ＝ＣＨ₂)、５．３５−５．１７(２Ｈ、ｍ、ＯＣＨ₂ＣＨ＝ＣＨ₂)、４．６７（１Ｈ、ｄ、Ｊ₁'_.2’＝８．１３Ｈｚ、Ｈ−１’ ）、４．３５（１Ｈ、ｄ、Ｊ_1.2＝８．１０Ｈｚ、Ｈ−１）、４．０９（１Ｈ、ｄ、Ｊ_3.4＝３．０Ｈｚ、Ｈ−４）、１．１９（３Ｈ、ｔ、ＯＣＨ₂ＣＨ₃）。実施例２この実施例において、マンガンイオンのコントロールの存在および不存在においてグリコシルトランスフェラーゼの反応を比較である。さらに、連続的または不連続的である金属イオンの補充を比較する。２．１マンガンイオンのコントロールの存在および不存在におけるＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼのサイクル６０ｍｌのラクトース、７０ｍＭのｇｌｃＮＡｃ−１−リン酸、８０ｍＭのホスホエノールピブレート、２ｍＭのウリジン５’−二リン酸、０．０５％のアジ化ナトリウム、０．１％のＢＳＡ、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、および３．５Ｕ／ｍｌのピルベートキナーゼ、０．６Ｕ／ｍｌのＵＤＰｇｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ、および０．１３Ｕ／ｍｌのグルタチオンセファローズ４Ｂに結合したｇｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ／グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を含有する溶液に、（Ａ）１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのＭｎＣｌ₂、または（Ｂ）１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、３０ｍＭのＭｎＣｌ₂を添加した。この溶液を室温において撹拌しながらインキュベートした。マンガンイオンをクロマトグラフィーにより監視し、下記のようにして試料Ｂに補充した：７２時間において、シリカゲル上の薄層クロマトグラフィーにより溶離剤として６５％アセトニトリル、１０％酢酸および２５％水を使用して（オルシノールで可視化した）試料Ａおよび試料Ｂを比較した。補充しない反応（Ａ）は薄層クロマトグラフィーにより３０〜４０％であると推定されたが、マンガンを補充した反応（Ｂ）は１００％完結したと推定された。２．２金属イオンの不連続的／連続的補充８０ｍＭのアクセプター、８０ｍＭのＧｌｃＮ（Ａｌｌｏｃ）（１→３）βＧａｌＯＥｔ、５５ｍＭのホスホエノールピブレート、９０ｍＭのグルコース−１ −リン酸、１ｍＭのＵＤＰ、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＮａＮ₃、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５０００単位／リットルのピルベートキナーゼ、２００単位／リットルのＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、８００単位／リットルのＵＤＰ−ｇａｌ−４−エピメラーゼ、および１０５０単位／リットルのガラクトシルトランスフェラーゼを含有するガラクトシルトランスフェラーゼサイクル反応混合物を調製した。一部分に、金属イオンをそれ以上含まない１０ＭｎＣｌ₂を添加した。他の部分に、下記のようにしてマンガンを周期的に補充した：他の部分に１０ｍＭのＭｎＣｌ₂を添加し、注射器を介して１ＭのＭｎＣｌ₂の注入を送出して（最初に５４ｍＭ／日において）金属イオン濃度を約４〜約２７ｍＭの間に維持した。反応のすべてを監視し、必要に応じてＰＥＰを補充した。注入ポンプによりＭｎＣｌ₂を添加した反応は４日までに完結に到達した。周期的にＭｎＣｌ₂を添加した反応は７日までに完結に到達した。１０ｍＭの最初のＭｎＣｌ₂を添加しかつ補充を行わなかった反応は１３日後においてさえ完結しなかった。２．３適度なアクセプター濃度におけるＭｎ⁺⁺の不連続的／周期的補充下記の成分を含有するガラクトシルトランスフェラーゼサイクルの反応混合物を構成した：４０ｍＭのＧｌｃＮ（Ａｌｌｏｃ）（１→３）βＧａｌＯＥｔ、５５ｍＭのホスホエノールピブレート、４５ｍＭのグルコース−１−リン酸、１ｍＭのＵＤＰ、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＮａＮ₃、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２５００単位／リットルのピルベートキナーゼ、１００単位／リットルのＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、４００単位／リットルのＵＤＰ−ｇａｌ−４−エピメラーゼ、および５２５単位／リットルのガラクトシルトランスフェラーゼ。異なる初期濃度のＭｎＣｌ₂でサイクルを構成し、ゆっくり撹拌し、注射器ポンプを介して１ＭのＭｎＣｌ₂を連続的に添加した。注射器ポンプを使用する添加速度を、連続的よりむしろ、増分的に調節した。比較のために、試験サイクルに前述したように１回／日３０、２５、２０および１５ｍＭのＭｎ⁺⁺を補充した。注射器ポンプによりおおよそ維持された１０ｍＭのＭｎＣｌ₂を使用する実験結果を第１１図に示す。ＭｎＣｌ₂の添加速度を、示すように、３６ｍＭ／日から２４ｍＭ／日に、次いで１２ｍＭ／日に変化させた。同様な反応を構成して、一定の５ｍＭおよび一定の１５ｍＭのマンガンイオン濃度維持した。結果を下記に要約する：補充のモード完結までの時間一定の注入により５ｍＭ４日一定の注入により１０ｍＭ４日一定の注入により１５ｍＭ４日毎日の添加により３０、２５、２０および１５ｍＭ４日これらの結果が示すように、約４０ｍＭのアクセプター濃度で、いくつかのモードのいずれによっても、マンガンイオン濃度の補充を実施することができる。実施例３この実施例は、マンガンイオン濃度をコントロールしてガラクトシルトランスフェラーゼサイクルによるβＧａｌ（１→４）Ｇｌｃ（Ａｌｌｏｃ）（１→３） βＧａｌＯＥｔの酵素的合成を例示する。ポリプロピレン容器中で、ＨＥＰＥＳ（６９５．３ｇ、２．９２ｍｏｌ）および２４リットルのＨ₂Ｏを一緒にし、ｐＨを６ＭのＮａＯＨで７．５に調節した。ホスホエノールピブレート１カリウム塩（２４５．５ｇ、１．４６ｍｏｌ）、グルコース−１−リン酸（４７０．３ｇ、１．３１ｍｏｌ）およびウシ血清アルブミン（２９．２ｇ）を添加し、ｐＨを再び６ＭのＮａＯＨで７．５に調節した。塩化カリウム（１５２ｇ、２．０４ｍｏｌ）、アジ化ナトリウ（１４．６ｇ）、ウリジン二リン酸（１５．２ｇ、２９．３ｍｍｏｌ）およびＧｌｃＮ（Ａｌｌｏｃ）（１→３）βＧａｌＯＥｔ（５２０ｇ正味、１．１５ｍｏｌ）を添加し、次いでＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ（１１５．７ｇ、０．５８ｍｏｌ）およびＭｇＣｌ₂ ・４Ｈ₂Ｏ（５９．３ｇ、０．２９２ｍｏｌ）のほぼ１Ｍの溶液を添加した。ピルベートキナーゼ（７３，０００単位）、ＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（３０００単位）、ＵＤＰ−Ｇａｌ−４−エピメラーゼ（１８０，０００単位）、およびガラクトシル（β１→４）トランスフェラーゼ（１０，４００単位）を添加し、反応混合物の体積をＨ₂Ｏでほぼ２９リットルに調節した。生ずる反応混合物を室温に維持し、毎日薄層クロマトグラフィー（ｔｌｃ）およびイオンクロマトグラフィーにより監視した。３０ｍＭのＭｎＣｌ₂および３０ｍＭのＭｇＣｌ₂を含有する標準からのイオンクロマトグラムと反応混合物からのイオンクロマトグラムを比較することによって、マンガンおよびマグネシウムの定量を実施した。下記表に示すように、マンガンイオン濃度を測定し、補充した。第９日に、反応はＴＬＣにより本質的に完結した（米国特許出願第０８／０６３，１８１号明細書に記載されている合成法により製造された真性試料と生成物との比較による）。反応生成物は、精製しないで、下記の実施例５において使用した。表中の結果が示すように、Ｍｎ⁺⁺が消耗するために、追加量のＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏをほとんど毎日添加して金属イオン濃度を維持した。マンガンイオンはガラクトシルトランスフェラーゼサイクルにおける少なくとも１つの酵素のためのコファクターである。しかしながら、マンガンイオンおよび生成した無機ピロリン酸（第２図参照）は非常に低い溶解度の錯体を形成する。同様なガラクトシルトランスフェラーゼサイクルからの沈澱は、プロトン誘発Ｘ線放出（ＰＩＸＥ）により、３１．５濃度質量百分率のマンガンおよび１８．７濃度質量百分率のリンとして分析され、沈澱した物質が主としてピロリン酸マンガンであることが確証された。この制限された溶解度のために、トランスフェラーゼサイクルは進行し続けることができるが、反応速度は減少する。ピロリン酸の沈澱により失われるマンガンイオンを補充することによって、反応速度を維持することができる。したがって、マンガンイオン濃度を最適範囲に維持するとき、ガラクトシルトランスフェラーゼの反応サイクルを完結に推進させることができる。実施例４この実施例は、ガラクトシルトランスフェラーゼサイクルに対するマンガンイオンの高い濃度の有害作用を例示する。４．１最初に９０ｍＭに設定されたＭｎ⁺⁺濃度２０ｍＭのＭｎ⁺⁺を含有する実施例３からの初期反応混合物（第０日に調製された混合物）の１０ｍｌのアリコートを取り出し、マンガンイオン濃度をＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏの添加により９０ｍＭに調節した。生ずる混合物を前述したように毎日監視したが、マンガンイオンをそれ以上添加しなかった。第９日に、実施例３からの反応が本質的に完結したとき（ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏの添加の結果）、アリコートの試料における反応はＴＬＣによりわずかに約１０〜２０％だけ完結した。４．２増加したＭｎ⁺⁺の非可逆的面を証明するためのＥＤＴＡの使用酵素のサイクルに対する高いＭｎ⁺⁺濃度の有害な作用の他の研究を下記のようにして実施した：４０ｍＭのＧｌｃＮ（Ａｌｌｏｃ）（１→３）βＧａｌＯＥｔ、５５ｍＭのホスホエノールピブレート、４５ｍＭのグルコース−１−リン酸、１ｍＭのＵＤＰ、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＮａＮ₃、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２５００単位／リットルのピルベートキナーゼ、１００単位／リットルのＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、４００単位／リットルのＵＤＰ−ｇａｌ−４−エピメラーゼ、および５２５単位／リットルのガラクトシルトランスフェラーゼ。１ＭのＭｎＣｌ₂を添加して７０ｍＭの濃度達成した。２日後、Ｍｎ⁺⁺の濃度は４２ｍＭに低下し、それ以上の反応の進行は劇的に遅くなった。２０ｍＭまでのＥＤＴＡの添加、またはサイクル酵素のすべての追加の部分の添加、または１ｍＭのＵＤＰ、または１ｍＭのＵＤＰ＋２０ｍＭのＥＤＴＡは反応を完結まで進行させなかった。しかしながら、２０ｍＭのＥＤＴＡをサイクル酵素のすべての追加の部分と組み合わせて添加すると、サイクルは完結まで進行した。ＥＤＴＡ単独のための作用の欠如は、高いＭｎ⁺⁺濃度の有害作用が可逆的でないことを示す。すべての酵素の添加は、また、反応サイクルを完結まで推進させない。Ｍｎ⁺⁺濃度を低下させるために十分なＥＤＴＡの存在におけるすべての酵素の添加は、反応を完結まで推進させた。この結果が示すように、１または２以上の酵素は高いレベルのＭｎ⁺⁺の存在において不活性化される。実施例５この実施例は、マンガンイオンをコントロールしてシアリルトランスフェラーゼを使用するガラクトシルトランスフェラーゼサイクルの生成物からのαＮＡＮＡ（２→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮ（Ａｌｌｏｃ）（１→３）βＧａｌＯＥｔの「ワンポット」合成を例示する。水（１６リットル）およびＨＥＰＥＳ（９１５．８ｇ、３．８４ｍｏｌ）をポリプロピレン容器中で一緒にし、ｐＨを６ＭのＮａＯＨで７．５に調節した。ホスホエノールピブレート１カリウム塩（５１１．８ｇ、３．０５ｍｏｌ）、ウシ血清アルブミン（３８．５ｇ）およびアジ化ナトリウ（１９．２５ｇ）を添加し、ｐＨを再び６ＭのＮａＯＨで７．５に調節した。シアル酸（４２０ｇ、１．３６ｍｏｌ）を添加し、ｐＨを再び６ＭのＮａＯＨで７．５に調節した。シチジン −５’−１リン酸（４３．７ｇ、０．１３５ｍｏｌ）およびアデノシン三リン酸（８．１ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）を添加し、ｐＨを再び６ＭのＮａＯＨで７．５に調節した。ピルベートキナーゼ（３６０，０００単位）、ミオキナーゼ（７５，０００単位）、ＣＭＰＮｅｕＡｃシンターゼ（５０００単位）、およびα２，３シアリルトランスフェラーゼ（２４００単位）を添加し、混合した。ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ（４０２．１ｇ、２．０３ｍｏｌ）をほぼ１Ｍの溶液として実施例３からの生成物に添加し、次いで上記のシアリルトランスフェラーゼサイクルの成分の混合物および追加の２０．４リットルの水を添加した。生ずる混合物を室温に維持し、毎日薄層クロマトグラフィー（ｔｌｃ）およびイオンクロマトグラフィーにより監視した。３０ｍＭのＭｎＣｌ₂を含有する標準からのイオンクロマトグラムと反応混合物からのイオンクロマトグラムを比較することによって、マンガンの定量を実施した。下記表に示すように、マンガンイオン濃度を測定し、補充した。出発物質はＴＬＣにより検出できなかったので、反応は６日までに完結した。実施例６この実施例は、エチル（アンモニウム５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ −α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート）−（２，３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−（α−Ｌフコピラノシル）−（１，３）−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを製造するためのオリゴ糖の酵素的フコシル化を例示する。エチル（アンモニウム５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート）−（２，３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，３）−Ｏ−β− Ｄ−ガラクトピラノシド（１２５ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ）を、水（６．２ｍｌ）、ナトリウムカコジレート（１Ｍ、ｐＨ６．５、０．７２ｍｌ）、ＭｎＣｌ₂ （１Ｍ、０．２ｍｌ）およびＧＤＰ−β−フコース２ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ、１３０ｍｇ、０．２１２ｍｍｏｌ）の溶液中に溶解した。アルカリ性プロテアーゼ（ウシ腸、３２μｌ）およびフコシルトランスフェラーゼＶ（ビーズ、１００ｍＵ）を添加し、反応混合物を３日間ティップ（ｔｉｐ）した。次いで反応混合物をクロマトグラフィー(ＢｉｏｇｅｌＰ−２、０．１ＭのＮＨ₄ＨＣＯ₃) にかけると、凍結乾燥後、７０ｍｇの出発物質および７６ｍｇ（５２％）のＸＩ）が白色固体状物として得られた；Ｒｆ＝０．４３（シリカ、３０％の１ＭのＮＨ₄ＯＡｃ／イソプロパノール）。実施例７この実施例は、実施例５の四糖を使用して開始する、ＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃβ（１→３）Ｇａｌβ−ＯＥｔの化学的合成を例示する。エチル（メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７，８，９− テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート））−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ− ガラクトピラノシル）−（１−４）−Ｏ−（３，６−ジ−Ｏ−アセチル−２−Ｎ −アロキシカルボニル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１−３）−Ｏ−２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＶＩＩＩ）の製造二糖（Ｖ）（０．３２０ｋｇ）に適当なコファクターの存在においてガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼを順次に作用させて製造したエチル（ナトリウム（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノヌロピラノシロネート））−（２− ３）−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−４）−Ｏ−（２−Ｎ−アロキシカルボニル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１−３）−Ｏ −β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＶＩＩ）の水溶液（４０リットル）を紙に通過させて濾過した。濾液を３０００または１０，０００の分子量カットオフを有する膜に通過させて、所望生成物からタンパク質を除去した。溶離液を濃縮し、適当な装置中で逆浸透膜に対して透析させた。生成物を含有する保持物質を５０リットルのロタベイポール（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）中で蒸発させると、濃厚なシロップ状物が得られた。必要に応じて、保持物質をキレート化樹脂で処理して、２価のカチオンを除去した。濾過後、濾液は塩を実質的に含有ぜずかつ高い純度の状態の所望生成物を含有した。このシロップ状物をピリジン（２×２リットル）とともに２回共蒸発させ、次いで真空下に２０時間保持した。蒸発フラスコにピリジン（１２リットル）中のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（２０ｇ）の溶液を供給した。ロタベイポール浴に氷水混合物を供給し、回転を続けながら、無水酢酸（６リットル）を１時間の間に添加した。添加の完結後２時間において、無水酢酸（２リットル）を添加し、生ずる混合物を室温において２０時間ゆっくり回転した。アシル化の完結を確実にするために、さらに無水酢酸（１リットル）を添加し、この混合物をさらに２４時間回転した。反応をＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサン：エタノール、１０：１０：３）により検査した。反応が完結したとき、真空を適用し、１４リットルの蒸留物を集めた。得られる残留物に、メタノール（１５リットル）を１時間かけて添加し、この混合物を室温において２０時間撹拌した。その時において、シリカゲル上のＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサン：エタノール、１０：１０：３およびジクロロメタン：アセトン、３：２）は、ラクトンがメチルエーテルモノヒドロキシ化合物である遅く動くスポットに完全に変換したことを示した。次いでこの混合物を濃縮し（１８リットル、蒸発した）、混合物を氷水中で冷却しながら、無水酢酸（３リットル）を３０分かけて添加した。この混合物を２０時間放置した。シリカゲル上のＴＬＣ（ジクロロメタン：アセトン、３：２）は完全なアシル化を示し、生成物はわずかにより高く展開した。メタノール（１リットル）を添加して、過剰の無水酢酸を破壊し、その間わずかの発熱が認められた。１時間後、この混合物を濃縮すると、シロップ状物が得られ、これを酢酸エチル−水混合物（１３／１３リットル）の助けにより５０リットルの抽出器に移した。この混合物を激しく撹拌した。相分離後、下の水性層を抜き出し、残留する有機層を紙に通過させて濾過した。濾液を５％の水性塩酸（１５リットル、水性層は洗浄後ｐＨ紙に対してまだ強く酸性であろう）および水性の１Ｍの重炭酸ナトリウム（１５リットル、水性層は洗浄後ｐＨ紙に対してまだ強くアルカリ性であろう）で洗浄した。次いで有機層を２０リットルの容器に移し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を半固体状物に濃縮した。この残留物をジクロロメタン（３リットル）中に溶解し、ジクロロメタン中で充填したシリカゲルのカラム（１０ｋｇ）に適用した。まずジクロロメタン（２５リットル）で溶離し、次いで３：１ジクロロメタン：アセトン（２５リットル）で溶離し、最後に１：１ジクロロメタン：アセトン（５０リットル）で溶離した。基線分離は二糖物質から達成されたが、非常にわずかの分離は微量のより速く動く物質から達成された。生成物を含有する画分を蒸発させ、ジクロロメタン（１．５リットル）中に再溶解した。この溶液をエチルエーテル（７．５リットル）とヘキサン（１０リットル）との激しく撹拌する混合物にゆっくり添加した。生ずる沈澱を濾過し、２：１エーテル：ヘキサンで洗浄し、一夜空気乾燥し、次いで高真空中で４８時間乾燥した。沈澱（０．６１ｋｇ）はＮＭＲにより標題化合物であることが示された。¹ＨＮＭＲは少量の残留溶媒（１〜５％、ｗ／ｗ）を含有した。¹ＨＮＭＲ(ＣＤＣＬ₃)δ：４．６７（ｄ，１Ｈ、Ｈ− １”）、４．４９（ｄ、１Ｈ、Ｈ−１’）、４．３３（ｄ、１Ｈ、Ｈ−１）。エチル（メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７，８，９− テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート））−（２，３）−Ｏ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ− ガラクトピラノシル）−（１，４）−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ− ６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＸ）の製造乾燥テトラヒドロフラン（８リットル）中のブロックされた四糖（ＶＩＩＩ）（０．５３２ｋｇ、０．３７ｍｏｌ）の溶液に、ポリメチルヒドロシロキサン（ＰＭＳＨ、４６ｍｌ、０．１４ｍｏｌ）を添加した。次いでＰｄ（ＰＰＨ₃）₄（１４ｇ、１．１７ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を真空下に脱気した。次いで得られる反応混合物を室温において１７時間撹拌し、このときＴＬＣ（１０：１０：３、酢酸エチル：ヘキサン：エタノール）は反応の完結を示した。反応混合物に、酢酸（３６ｍｌ、０．５５ｍｏｌ）およびピペリジン（６０ｍｌ、０．６５ｍｏｌ）を添加した。ＴＬＣ（９５：５、ジクロロメタン：メタノール）が反応の完結を示すまで、混合物を室温において一夜撹拌した。溶媒を真空蒸発させると、残留物が得られ、これをジクロロメタン（４リットル）中に溶解した。この溶液を順次に水（４リットル）、２％水性塩酸（４リットル）、水性炭酸水素ナトリウム（４リットル）、および最後に水（４リットル）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濾液を蒸発させると、シロップ状物が得られた。このシロップ状物をメタノール（２リットル）中に溶解し、活性炭（２００ｇ）を添加し、生ずる混合物を撹拌しながら５５℃に２時間加熱した。冷却後、混合物を濾過し、濾液を濃縮すると、残留物が得られた。この残留物をジクロロメタン（１リットル）中に溶解し、ヘキサン：エーテルの混合物（１：１、１２リットル）に滴下すると、０．４６ｋｇの標題化合物が白色固体状物として得られた。¹ＨＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ：１．１５（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、−ＯＣＨ₂ＣＨ₃）；１．５０（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝１２．３Ｈｚ、ＮＡＮＡのＨ−３ａ）；１．８０、１．９１、１．９６、２．０１、２．０２、２．０４、２．０５、２．０７、２．０８、２．０９、２．１０、２．１６、２．２６（１３−Ａｃ）；２．５５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．６、１２．３Ｈｚ、ＮＡＮＡのＨ−３ｅ）；３．８４（Ｓ、３Ｈ、ＣＯＯＣＨ₃）。エチル（メチル（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−４，７，８，９− テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート））−（２，３）−Ｏ−（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ− ガラクトピラノシル）−（１−４）−Ｏ−（（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル −α−Ｌ−フコピラノシル）−（１−３））−Ｏ−（２−アセトアミド−６−Ｏ −アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，３）−Ｏ−２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−β− Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ）の製造ジクロロメタン（２５０ｍｌ）とジメチルホルムアミド（６０ｍｌ）との混合物中のアルコール（ＩＸ）（０．１１８ｋｇ、０．０９０ｍｏｌ）の溶液に、臭化テトラエチルアンモニウム（１８．８ｇ、０．０９０ｍｏｌ）を添加した。次いでこの混合物をモレキュラーシーブ（４Ａ、０．２５０ｋｇ）とともに窒素雰囲気下に室温において６時間撹拌した。上記混合物に、ジクロロメタン（１００ｍｌ）中の新しく調製された臭化トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシル（０．１８０ｋｇ、０．３６０ｍｏｌ）を添加した。次いでＴＬＣ（１０：１０：３、酢酸エチル：ヘキサン：エタノール）が反応の完結を示すまで、混合物を窒素雰囲気下に室温において３６時間撹拌した。反応混合物をメタノール（３０ｍｌ）とジイソプロピルエチルアミン（３０ｍｌ）との混合物で処理し、室温において３０分間撹拌した。この混合物を１リットルのジクロロメタンで希釈し、セライトのベッドに通過させて濾過した。濾液を水性飽和重炭酸ナトリウム（１．５リットル）および水（２リットル）で洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮すると、シロップ状物が得られた。このシロップ状物をシリカゲル上のクロマトグラフィー（３．５ｇのシリカゲル、２３０〜４００メッシュ、酢酸エチル：ヘキサン：エタノール、５：５：１）にかけると、標題化合物（０．１１０ｋｇ、７３％）が非晶質固体状物として得られた。¹ＨＮＭＲ( ＣＤＣｌ₃)δ：１．１７(ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、−ＯＣＨ₂ＣＨ₃)；１．１８(ｄ、３Ｈ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、ＦｕｃのＣＨ₃)；１．６０、１．７８、１．８４、１．９９、２．０１、２．０２、２．０４、２．０４、２．０６、２．０６、２．０７、２．１５、２．１９（１３−Ａｃ）；２．５５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．４、１２．２Ｈｚ、ＮＡＮＡのＨ−３ｅ）；３．８２(Ｓ、３Ｈ、ＣＯＯＣＨ₃)、７．４−７．６（１５Ｈ、芳香族）。エチル（ナトリウム（５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロネート））−（２，３）−Ｏ−（β −Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−４）−Ｏ−（（α−Ｌ−フコピラノシル） −（１−３））−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの製造酢酸（９００ｍｌ）中の化合物Ｘの溶液に、木炭担持水酸化パラジウム（２０ｇ、２０％Ｐｄ）を添加した。反応混合物を水素で２回パージし、次いでシリカゲル上のＴＬＣ（９０：１０、ジクロロメタン：メタノール）が反応の完結を示すまで、混合物を水素雰囲気下に８時間撹拌した。反応器を数回窒素でパージし、反応混合物をセライトのベッドに通過させて濾過して触媒を除去した。セライトを数回酢酸エチルで洗浄した。濾液を濃縮すると、脱ベンジル化生成物が白色ガラス状物質として得られた（約９７ｇ）。この白色ガラス状物質を一夜高真空下に乾燥し、酢酸エチル（５００ｍｌ）中に溶解した。１リットルのエーテルとヘキサンとの混合物（８：２）を添加すると、生成物のトリオール（７９ｇ、８９％）が沈澱した。生成物のプロトンスペクトルは、芳香族プロトンの不存在を示した。メタノール（１リットル）中のトリオール（７９ｇ、５０ｍｍｏｌ）の溶液に、ナトリウムメトキシドの溶液（７０ｍｌ、２５％ｗ／ｖ）を添加した。反応混合物を室温において１７時間撹拌した。水（１００ｍｌ）を添加し、シリカゲル上のＴＬＣ（７：２：１、イソプロパノール：ＮＨ₄ＯＨ：Ｈ₂Ｏ）が反応の完結を示すまで、この混合物を室温においてさらに２４時間撹拌した。反応混合物に、メタノールでよく洗浄した１５０ｍｌのＡＧ−５０Ｈ＋イオン交換樹脂を添加し、生ずる混合物を室温において３０分間撹拌した。イオン交換樹脂を濾過により除去し、濾液を濃縮すると、白色ガラス状物質が得られた。この物質をメタノール（３００ｍｌ）中に溶解し、０．２２μのナイロン膜を通して濾過した。濾液をエチルエーテル（３００ｍｌ）で希釈すると、遊離五糖（４８ｇ、８４％）が白色固体状物として得られた。¹ＨＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ：１．１０(ｄ、３Ｈ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、ＦｕｃのＣＨ₃)；１．１６(ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、 −ＯＣＨ₂ＣＨ₃)；１．７４（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝１２．２Ｈｚ、ＮＡＮＡのＨ−３ａ）；１．９５、１．９６（２−Ａｃ）；２．７２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．４、１２．２Ｈｚ、ＮＡＮＡのＨ−３ｅ）；４．３２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、、β−芳香族）；４．４６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、β−芳香族）；４．６５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、β−芳香族）；５．０６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．１Ｈｚ、フコースのα−芳香族）。実施例８あるいは、五糖を実施例１の化合物Ｖから出発して酵素的に製造することができるが、ただしＮ−アリルオキシカルボニルの代わりにＮ−アセチルを使用する。前述の方法を使用して、出発物質を酵素的ガラクトシル化し、シアリル化し、そしてフコシル化する。この明細書において述べたすべての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許および特許出願が特別にかつ個々に引用することによって本明細書の一部とされることを示しているのと同一程度に、この明細書の中に引用することによって本明細書の一部とされる。上記説明は例示であり、限定的ではない。本発明の多数の変化は当業者にとってこの開示を概観したとき明らかとなるであろう。単なる例として、多数の基質、酵素、および反応条件を、本発明の範囲から逸脱しないで、本発明の一部分としてグリコシルトランスフェラーゼサイクルの中に置換することができる。したがって、本発明の範囲は上記説明を参照して決定されず、添付された請求の範囲をそれらと同等の態様とともに参照して決定されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ラトクリフ，マーレイアメリカ合衆国，カリフォルニア 92008, カールスバッド，スタンフォードストリート 4362

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）少なくとも１種のグリコシルトランスフェラーゼ、ドナー基質、アクセプター基質および可溶性の２価の金属カチオンを含んでなる反応媒質を準備し、そして（ｂ）合成を実質的に完結するために十分な時間の間、前記反応媒質中で約１ｍＭ〜約７５ｍＭの濃度を達成するように前記可溶性の２価の金属カチオンの濃度を補充する、ことを含んでなる単糖をドナー基質からアクセプター基質へ転移させる方法。２．前記反応媒質がホスファターゼをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。３．前記可溶性の２価の金属カチオンがＭｎ⁺⁺、Ｍｇ⁺⁺、Ｃａ⁺⁺、Ｃｏ⁺⁺、Ｚｎ⁺⁺、Ｃｕ⁺⁺およびそれらの組み合わせから成る群より選択されるメンバーである、請求項１に記載の方法。４．前記補充が不連続的である、請求項１に記載の方法。５．前記補充が連続的である、請求項１に記載の方法。６．前記酵素がガラクトシルトランスフェラーゼである、請求項１に記載の方法。７．前記酵素がガラクトシルトランスフェラーゼであり、そして前記反応媒質がシアリルトランスフェラーゼをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。８．前記酵素がフコシルトランスフェラーゼである、請求項１に記載の方法。９．前記酵素がＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである、請求項１に記載の方法。１０．前記ドナー基質がＣＭＰ−ＮｅｕＡｃでありかつそれをその場で発生させ、前記２価の金属カチオンがＭｎ⁺⁺であり、前記アクセプター基質がラクトースであり、前記酵素がシアリルトランスフェラーゼであり、そして前記反応媒質がＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ、シアリル酸およびＣＴＰをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。１１．前記ドナー基質がＵＤＰ−Ｇａｌでありかつそれをその場で発生させ、前記２価の金属カチオンがＭｎ⁺⁺であり、前記アクセプター基質がＧｌｃＮＡｃＧａｌＧｌｃであり、前記酵素がガラクトシルトランスフェラーゼであり、そして前記反応媒質がＵＤＰ−Ｇａｌ−４−エピメラーゼ、ＵＤＰ−Ｇｌｃおよびホスファターゼをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。１２．前記ドナー基質がＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃであり、前記２価の金属カチオンがＭｎ⁺⁺であり、前記アクセプター基質がＧａｌＧｌｃであり、前記酵素がＮ −アセチルグルコサミントランスフェラーゼであり、そして前記反応媒質がホスファターゼをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。１３．前記ドナー基質がドナー糖であり、そして前記反応媒質が、（ｉ）触媒量のドナー糖シンセターゼ、（ｉｉ）ドナー糖前駆体、および（ｉｉｉ）ドナー糖再循環系、をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。１４．前記反応媒質が、（ｉ）触媒量のＣＭＰ−シアル酸シンセターゼ、（ｉｉ）シアル酸、および（ｉｉｉ）少なくとも２モルのリン酸ドナー／各モルのシアル酸、および触媒量のヌクレオシド三リン酸、シチジン一リン酸、リン酸を前記リン酸ドナーからヌクレオシド二リン酸に転移できるキナーゼ、および末端のリン酸をヌクレオシド三リン酸からＣＭＰに転移できるヌクレオシド一リン酸キナーゼを含んでなるＣＭＰ−シアル酸再循環系、をさらに含んでなり、そして前記アクセプター糖がガラクトシル単位を有する前記シアリルトランスフェラーゼのアクセプターである、請求項１３に記載の方法。１５．前記シアリルトランスフェラーゼがα（２，３）シアリルトランスフェラーゼである、請求項１４に記載の方法。１６．前記シアリルトランスフェラーゼがα（２，３）シアリルトランスフェラーゼであり、そして前記可溶性の２価の金属カチオンがＭｎ⁺⁺である、請求項１４に記載の方法。１７．前記シアル酸が５−Ｎ−アセチルノイラミン酸である、請求項１４に記載の方法。１８．前記アクセプター糖がＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲおよびＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＲから成る群より選択されるメンバーであり、ここでＲは水素、サッカリド、オリゴ糖および少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン基から成る群より選択される、請求項１４に記載の方法。１９．前記シアル酸が５−Ｎ−アセチルノイラミン酸である、請求項１８に記載の方法。２０．前記反応サイクルを約６〜約８のｐＨ値を有する緩衝化水性媒質で行う、請求項１４に記載の方法。２１．前記ドナー基質がβ−ガラクトシル単位を含有し、前記ガラクトシルトランスフェラーゼが触媒量で存在し、そして前記反応媒質が少なくとも１モルのグルコース−１−リン酸／各モルのアクセプター糖；触媒量のＵＤＰ、ピルベートキナーゼ、ＵＤＰ−グルコース−ピロホスホリラーゼおよびＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼを含んでなるドナー基質再循環系をさらに含んでなる、請求項６に記載の方法。２２．前記アクセプター糖がＧｌｃＮ（Ａｌｌｏｃ）（１→３）βＧａｌＯＥｔおよびＧｌｃＮＡｃ（１→３）βＧａｌＯＥｔから成る群より選択される、請求項２１に記載の方法。２３．前記反応媒質が、（ｉ）少なくとも１モルのグルコース−１−リン酸／各モルのアクセプター基質；触媒量のＵＤＰ、ピルベートキナーゼ、ＵＤＰ−グルコース−ピロホスホリラーゼおよびＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼを含んでなるドナー基質再循環系、（ｉｉ）触媒量のＣＭＰ−シアル酸シンセターゼ、（ｉｉｉ）シアル酸、（ｉｖ）少なくとも２モルのリン酸ドナー／各モルのシアル酸、および触媒量のヌクレオシド三リン酸、シチジン一リン酸、リン酸を前記リン酸ドナーからヌクレオシド二リン酸に転移できるキナーゼ、および末端のリン酸をヌクレオシド三リン酸からＣＭＰに転移できるヌクレオシド一リン酸キナーゼを含んでなるＣＭＰ−シアル酸再循環系、をさらに含んでなる、請求項７に記載の方法。２４．前記フコシルトランスフェラーゼがα（１→３）フコシルトランスフェラーゼであり、そして前記ドナー基質がＧＤＰ−フコースである、請求項８に記載の方法。２５．（ａ）ＵＤＰ−ガラクトースの存在において化合物：Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲを形成するために十分な条件下に、式ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲの化合物をガラクトシルトランスフェラーゼでガラクトシル化し、（ｂ）シアル酸が非還元糖に転移される条件下にシアル酸のＣＭＰ誘導体の存在においてα（２，３）シアリルトランスフェラーゼを使用して（ａ）において形成された前記化合物をシアリルトランスフェラーゼでシアリル化して、化合物：ＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲを形成し、そして（ｃ）前記（ｂ）において形成された前記化合物をフコシル化して、ＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１ →３）Ｇａｌβ−ＯＲを形成し、ここで前記ガラクトシル化およびシアリル化工程を可溶性の２価の金属カチオンを含んでなる反応媒質中で実施し、そして前記媒質に前記可溶性の２価の金属カチオンを補充して約１ｍＭ〜約７５ｍＭの前記２価の金属カチオン濃度を維持する、ことを含んでなる、ＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）（Ｆｕｃα １→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲ（式中、Ｒは水素、サッカリド、オリゴ糖および少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン基から成る群より選択され、そしてＲ’はアセチルおよびアリルオキシカルボニルである）を製造する方法。２６．Ｒ’がアリルオキシカルボニルであり、そして前記フコシル化工程を化学的に実施する、請求項２５に記載の方法。２７．前記フコシル化工程を酵素的に実施する、請求項２５に記載の方法。２８．前記グリコシル化および前記シアリル化を単一の容器中で実施する、請求項２５に記載の方法。２９．工程（ｃ）の前に、工程（ｂ）の生成物を約１００〜約１０，０００の分子量のカットオフを有する膜を使用する膜濾過により精製する、請求項２５に記載の方法。３０．前記分子量のカットオフが約２００〜約１０００である、請求項２９に記載の方法。３１．前記ガラクトシル化工程が少なくとも１モルのグルコース−１−リン酸／各モルのＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲおよび触媒量のＵＤＰ、ピルベートキナーゼ、ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼおよびＵＤＰ− ガラクトース−４−エピメラーゼを含んでなるＵＤＰ−ガラクトース再循環系を使用することからなる、請求項２５に記載の方法。３２．前記シアリル化工程が少なくとも２モルのリン酸ドナー／各モルのシアル酸、および触媒量のヌクレオシド三リン酸、シチジン一リン酸、リン酸を前記リン酸ドナーからヌクレオシド二リン酸に転移できるキナーゼ、および末端のリン酸をヌクレオシド三リン酸からＣＭＰに転移できるヌクレオシド一リン酸キナーゼを含んでなるＣＭＰ−シアル酸再循環系を使用することからなる、請求項２５に記載の方法。３３．Ｒがエチルであり；前記ガラクトシル化工程が少なくとも１モルのグルコース−１−リン酸／各モルのＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲおよび触媒量のＵＤＰ、ピルベートキナーゼ、ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼおよびＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼを含んでなるＵＤＰ−ガラクトース再循環系を使用することを含んでなり；前記シアリル化工程が少なくとも２モルのリン酸ドナー／各モルのシアル酸、および触媒量のヌクレオシド三リン酸、シチジン一リン酸、リン酸を前記リン酸ドナーからヌクレオシド二リン酸に転移できるキナーゼ、および末端のリン酸をヌクレオシド三リン酸からＣＭＰに転移できるヌクレオシド一リン酸キナーゼを含んでなるＣＭＰ−シアル酸再循環系を使用することを含んでなり；前記フコシル化工程を化学的に実施し；そして工程（ａ）および（ｂ）を単一の容器中で実施する、請求項２５に記載の方法。３４．（ａ）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ、シアル酸、ＣＴＰおよび可溶性の２価の金属カチオンを含んでなる反応媒質を準備し、そして（ｂ）合成を実質的に完結するために十分な時間の間、前記反応媒質中で約１ｍＭ〜約７５ｍＭの濃度を達成するように前記可溶性の２価の金属カチオンの濃度を補充する、ことからなる、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを合成する方法。３５．前記シアル酸を現場で発生させ、そして前記反応媒質がＧｌｃＮＡｃ、ピルビン酸およびシアル酸アルドラーゼをさらに含んでなる、請求項３４に記載の方法。