CN104232707A

CN104232707A - 一种低聚半乳的唾液酸衍生物及其合成方法

Info

Publication number: CN104232707A
Application number: CN201410462676.2A
Authority: CN
Inventors: 程剑松; 王鹏; 王园明
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2014-09-12
Filing date: 2014-09-12
Publication date: 2014-12-24

Abstract

本发明公开了一种低聚半乳的唾液酸衍生物及其合成方法与应用，HMO是人乳中低聚糖中的主要成分。本方法利用低聚半乳糖GOS和唾液酸（N-Acetylneuraminicacid，Sia）通过CMP-Sia合成酶和唾液酸转移酶，合成HMO类似物。低聚半乳糖（GOS）是利用β一半乳糖苷酶对乳糖进行水解及合成而得，它是母乳中低聚半乳糖的主要成分，一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1~7个半乳糖基，即(Gal)n-Glc/Gal(n=1-7)。本发明采用“一锅双酶法”合成了三种不同的GOS的唾液酸衍生物。解决了乳制品中唾液酸不足的问题，具有反应活性高，合成步骤简单，产率高等优点，是一种新型功能的低聚糖，具有广阔的应用前景。

Description

一种低聚半乳的唾液酸衍生物及其合成方法

技术领域

本发明属于糖工程技术领域，涉及一种HMO类似物的酶合成方法，特别是涉及到一种低聚半乳的唾液酸衍生物及其合成方法与应用。

背景技术

HMO在婴儿的发育过程中起着非常重要的作用，HMO由唾液酸残基部分和多糖两部分组成。人母乳中含量较多，婴儿体内的双歧杆菌菌群的建立很大程度上依赖母乳中的GOS 成分。含有唾液酸残基的低聚半乳糖广泛存在于母乳中。唾液酸在婴儿的早期生长中发挥着重要的作用，唾液酸残基具有抑制病毒，细菌和神经毒素的功能，新生儿合成的唾液酸很有限。因此，人乳中的唾液酸对于保证婴儿正常的生长发育至关重要。

低聚半乳糖(Galactooligosaccharides，GOS)是一种具有天然属性的功能性低聚糖，其分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1~7 个半乳糖基，即Gal-(Gal)n-Glc/Gal(n 为0-6)。在自然界中，动物的乳汁中存在微量的GOS，而人母乳中含量较多，婴儿体内的双歧杆菌菌群的建立很大程度上依赖母乳中的GOS 成分。

唾液酸(Sialic acid，SA)，是一类含9个碳原子的羧基化单糖酰化衍生物的总称，在人体的唾液酸主要为N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸两种，大多由葡萄糖代谢生成。唾液酸广泛分布于真核细胞表面糖蛋白或糖脂的寡糖链的最末端，是细胞膜上糖蛋白、糖脂的重要成分。根据唾液酸与糖残基的连接方式可将其分为α2,3-SA、α2,6-SA及α2,8-SA三大类。血清唾液酸来源于细胞表面，以糖结合唾液酸和脂结合唾液酸两种形式存在。除硫酸化的糖类外,唾液酸是糖蛋白在生理pH条件下唯一带净负电荷的单糖。

发明内容

本发明在低聚半乳糖的基础上通过酶合成的方法，提供了一种新型的低聚半乳糖的唾液酸衍生物以及他们的的制备和纯化的方法。

本发明的低聚半乳的唾液酸衍生物具有合成步骤简便，产物性质稳定，转化效率高的特点，可以很好的解决乳制品中唾液酸缺乏或者含量不足的问题。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

利用低聚半乳糖和唾液酸通过CMP-Sia合成酶和唾液酸转移酶合成的HMO类似物，具有如下的结构：

Pmst1酶催化合成的2,3-唾液酸连接的GOS唾液酸衍生物

Sia-a2,3-(Gal)n-Glc（n=1-7）

Pd2,6ST酶催化合成的2,6-唾液酸连接GOS唾液酸衍生物

Sia-a2,6-(Gal)n-Glc（n=1-7）

CSTII酶催化合成的2,3/8-唾液酸连接的GOS唾液酸衍生物

(Sia-a2,8)m-Sia-a2,3-(Gal)n-Glc（n=1-7）。

本发明进一步公开了HMO类似物的合成方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（a）酶法转化：利用生物酶在一定条件下作用于低聚半乳糖溶液，生成低聚半乳糖的唾液酸衍生物的混合物；其中所述的低聚半乳糖与生物酶的重量比例为：

NMCSS/GOS=146ug/100mg；PMST1/GOS=172ug/100mg；

Pd2,6ST/GOS=272ug/100mg；CSTⅡ/GOS=616ug/100mg；

所述生物酶指的是：CMP-Sia合成酶NMCSS和PMST1、Pd2,6ST、CSTⅡ中的一种；

（b）酶分离：将反应产物煮沸终止反应，12000r/min离心20分钟，分离变性的酶和反应中的沉淀物，取上清液；

（c）底物和副产物的降解：将分离出的上清液用碱性磷酸酶处理，将反应中未完全反应的CTP、CMP、CMP-Sia降解为胞苷，采用HPLC检测；

（d）分离纯化：将（c）制得的上清液，经分离、冻干后，制得低聚半乳糖的唾液酸纯化后产物。

其中步骤（a）中所述的生物酶指的是：以 (Gal)n-Glc/Gal(n=1-7)作为底物；由来源于微生物中的两种酶通过“一锅双酶法”来催化合成反应，合成三种不同的低聚半乳糖的唾液酸衍生物。

所述作为底物的浓度为20mM/L；PMST1、Pd2,6ST催化的反应的CTP和Neu5Ac的浓度为40mM，CSTⅡ催化的反应的CTP和Neu5Ac的浓度为100mM，pH8 Tris-Hcl的浓度为100mM，Mg²⁺浓度为20mM反应的温度为37℃，反应时间为1-2h。

步骤（c）中HPLC的检测以磷酸盐缓冲液，C18柱，260nm吸收波长进行检测；所述的磷酸盐缓冲液指的是：磷酸氢二钠35.8ｇ、磷酸二氢钾13.6g加水900ml溶解用氢氧化钠溶液，调节pH至7.0，加入1.61g四甲基溴化铵，加水至1000ml。

步骤（d）中分离纯化：用规格15mm ID×100cm 的Bio-gel P2 色谱柱进行色谱分离，以水为流动相，色谱分离的样品上样量为1-2mL，洗脱流速为0.4-1 mL/min；最优的样品上样量为1mL，洗脱流速为1-2mL/min，收集洗脱样品。

步骤（a）和（d）中还包括分离后的薄层层析检测、合并迁移距离相同的产物的步骤；其薄层层析检测的步骤如下：

取0.5μL 洗脱液，薄层层析板点样，在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于酒精灯上显色；上述展层剂由乙酸乙酯：甲醇：水按体积比4 ：2：1混合配制；显色剂的配制为冰乙酸、茴香醛、浓硫酸和乙醇，体积分别为5.5ml、16ml、27ml和500ml。

本发明优选HMO类似物的合成方法，其特征在于：

（1）称取3份低聚半乳糖（GOS）100.00mg、CTP163.96mg、Neu5Ac 96.25mg溶于5mL ddH₂O中，分别向三个试管中加入1molTris-Hcl 1mL，1molMgCl₂ 200ul，NMCSS 150ug；

（2）向试管一种加入172ug PmST1，试管二中加入272ug Pd2,6ST，试管三中加入616ug CstⅡ，加水定容到10.417ml，混匀，37℃水浴1h，TLC检测反应进程；

（3）将反应后的溶液100℃煮5min，冷却，12000r/min离心10min，将上清液转移到干净的试管中；

（4）分别向三个试管中的上清液中加入碱性磷酸酶450ug，37℃水浴4h，HPLC检测反应进度，色谱柱为C18柱，采用二元梯度洗脱，磷酸盐缓冲液和乙腈体积15%-90%，反应液100℃煮5分钟，冷却，12000r/min离心10min，经0.22μm膜过滤冷冻干燥，通过BioGel P-2柱子除去杂质，TLC检测收集产物真空干燥，得到GOS-Sia产物，经色谱分析，纯度达到95%以上。

本发明进一步公开了HMO类似物在制备解决乳制品中唾液酸缺乏或含量不足方面的应用。

本发明采用“一锅双酶法”合成了三种不同的GOS的唾液酸衍生物，分别为：

本发明更加详细的描述如下：

一种高纯度的低聚半乳糖的连唾液酸的合成方法，其特征在于以下步骤：

1、HMO类似物合成的反应环境为Tris-Hcl 100mM，pH8.0缓冲液（称取212.14gtris溶于900ml水中，稀Hcl调pH至8.0后，水定容到1000ml），低聚半乳糖（GOS）的浓度为20mM，CTP和Neu5Ac的浓度为40mM，Mgcl₂的浓度为20mM，加入CMP-Sia合成酶脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)和唾液酸转移酶，37℃中反应反应30~60分钟，采用一锅双酶法大量制备HMO类似物。其中CMP-Sia合成酶和唾液酸转移酶的摩尔比为NMCSS/PMST1=146ug/172ug； NMCSS/Pd2,6ST=146ug/272ug；NMCSS/CSTⅡ=146ug/616ug。

2、采用“一锅双酶法”将唾液酸共价连接于低聚半乳糖的半乳糖上，反应体系中涉及两种酶，分别为参考文献报道的：

脑膜炎奈瑟氏菌 (Neisseria meningitidis)来源的CMP-Sia合成酶(NMCSS)和

多巴性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)来源的2,3-唾液酸转移酶PmST1；

美人鱼发光杆菌 (Photobacterium damsela)来源的a-2,6唾液酸转移酶的Pd2,6ST；

空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni ）来源的2,3/8-唾液酸转移酶CstⅡ。

3、 HMO类似物反应体系中加入焦磷酸水解酶（PmPpA）提高反应产率，80ug。

4 、将步骤1制得的反应于100℃煮沸终止反应， 12000 r/ min离心20 分钟，弃去沉淀，取上清液。

5 、采用薄层色谱法(TLC) 跟踪反应1的进程，展开剂为Ethyl acetate：Methanol：H₂O（乙酸乙酯：甲醇：水）=4:2:1来检测。

6、向步骤4中的上清液中加入碱性磷酸酶（PhoA）440ug，将未反应的底物CTP，反应中未利用完全的中间产物CMP-Sia和其降解的副产物CMP全部降解为胞苷，37℃水浴4小时，HPLC检测直至完全降解。

7 、步骤6的HPLC的检测条件：取反应溶液，100℃水浴3-5min，12000r/min离心5min，取上清液，240nm 流速0.8ml/min 进样量10ul。

流动相：0.2mol/L磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钠35.8g 、磷酸二氢钾13.6g加水900mL溶解，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，加入四丁基溴化铵1.61g加水至1000ml摇匀）-乙腈（二元梯度洗脱，15-90%）。

8、将步骤6的反应液煮沸终止反应，12000 r/min离心20 分钟，取上清液，过0.22um的滤膜，采用抽真空冷冻的方法浓缩上清液，直至溶液的体积为1ml左右。

9、将步骤7的浓缩后的上清液通过Bio-gel P2（聚丙烯酰胺凝胶）色谱柱进行色谱分离，以水为流动相，收集洗脱样品，弃去溶液中的胞苷、唾液酸、盐离子等杂质。

10 将色谱分离后的低聚半乳糖真空冷冻干燥，制得高纯度的HMO类似物， 2,3-唾液酸连接的GOS唾液酸衍生物142.1mg；2,6-唾液酸连接GOS唾液酸衍生物143.8mg；2,3/8-唾液酸连接的GOS唾液酸衍生物237.2mg。

11、得到的产物通过MALDI-TOF 鉴定

12、实验中所用到的酶的纯化都采用亲和层析的方法，通过Ni⁺和咪唑环特异性亲和的原理将NMCSS、PMST1、Pd2,6ST和CSTⅡ纯化，其详细步骤如下：

挑取单菌落活化于含50μg/mL的氨苄青霉素的4 mL LB液体培养基中，37℃，200 r/min培养6 h后，重新接种扩大培养（37℃，200 r/min培养约4h），待菌液OD ₆₀₀值达到0.6，加入0.1 mmol/L IPTG，诱导蛋白的表达（13-16℃，110 r/min）。诱导20 h后，8 000 r/min离心10 min收集菌体，PBS预洗1次后，按照每克湿菌体加入10 mL PBS (pH 8.0)柱平衡缓冲液（PBS）的量充分悬浮菌体，在冰浴条件下超声破碎菌体(160 W，工作2 s，间歇4 s，10-20 min)，然后4℃、12 000 r/min离心30 min。收集上清，将上清液用0.22 μm水膜过滤后，与预装好的且经PBS预洗过的Ni-NTA填料在4℃混合孵育10 min，让液体经重力流经填料，弃流穿液，再依次用10 mmol/L，30 mmol/L，40 mmol/L溶液梯度洗脱镍柱，去掉杂蛋白。最后用250 mmol/L的咪唑溶液洗脱镍柱，并收集洗脱的溶液即目的蛋白溶液。

13、克隆碱性磷酸酶的基因，将碱性磷酸酶的基因连接到pET-22b(+)的质粒上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，然后表达出碱性磷酸酶。

上游引物为： 5’-AAATCATATGAAACAAAGCACTATTGCACTGGCA

下游引物为： 5’-GCGCTCGAGTTTCAGCCCCAGAGCGGCTTTCATG

14、 PCR扩增条件为：95℃预变性5 分钟；反应33 个循环（95℃变性30 秒，50℃退火30秒，72℃延伸100秒）；33 个循环结束后72℃延伸10 分钟。

15、通过真空冷冻干燥所得的产物的纯度在95%以上，产率在85%以上。

本发明制备的三种不同的GOS的唾液酸衍生物的理化性质：

三种低聚半乳糖的唾液酸衍生物纯化以后呈纯白色絮状固体,极易溶于水,不宜水解,长时间加热会有微量的水解，能被唾液酸水解酶水解和部分双歧杆菌利用。

本发明公开的高纯度的唾液酸化的低聚半乳糖的合成方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）本发明制备的高纯度的唾液酸化的低聚半乳糖，属于一种新型的合成方法，该方法具有操作简单，可控性强；反应迅速，容易实施特点。同时合成的成本低，产率高，纯度达到95%以上。

（2）本方法利用低聚半乳糖GOS和唾液酸通过CMP-Sia合成酶和唾液酸转移酶合成HMO类似物。低聚半乳糖（GOS）是利用β一半乳糖苷酶对乳糖进行水解及合成而得，它是母乳中低聚半乳糖的主要成分，一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1~7 个半乳糖基，即 (Gal)n-Glc/Gal(n=1-7)。本发明采用“一锅双酶法”合成了三种不同的GOS的唾液酸衍生物。解决了乳制品中唾液酸不足的问题，具有反应活性高，合成步骤简单，产率高等优点，是一种新型功能的低聚糖，具有广阔的应用前景。

附图说明：

图1为GOS-Sia产物纯化后TLC图；

图2为Pmst1酶催化合成的2,3-唾液酸连接的GOS的质谱图；

图3为Pd2,6ST酶催化合成的2,6-唾液酸连接的GOS的质谱图；

图4为CSTII酶催化合成的2,3/8-唾液酸连接的GOS的质谱图；

图5为HMO类似物合成过程图。

具体实施方法：

下面将通过实施例对本发明做进一步描述，这些实施例的描述并不是对本发明的内容做限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。

名称缩写对照：

实施例1：

称取3份低聚半乳糖（GOS）100.00mg，CTP 163.96mg，Neu5Ac 96.25mg溶于5mL的ddH₂O中，分别向三个试管中加入1mol的Tris-Hcl 1mL，1mol的MgCl₂200ul，NMCSS 150ug，向试管一种加入172ug PmST1，试管二中加入272ug Pd2,6ST试管三中加入616 ug CstI，加水定容到10.417ml，混匀，37℃水浴1h，TLC检测反应进程。将反应后的溶液100℃煮5min，冷却，12000r/min离心10min，将上清液转移到干净的试管中。向上清液中加入碱性磷酸酶450ug，37℃水浴4h，HPLC检测反应进度，色谱柱为C18柱，流动相为磷酸缓冲液（磷酸氢二钠35.8ｇ、磷酸二氢钾13.6g加水900ml溶解用氢氧化钠溶液，调节pH至7.0，加入1.61g四甲基溴化铵，加水至1000ml摇匀）和水，反应液100℃煮5分钟，冷却，12000r/min离心10min，经0.22μm膜过滤冷冻干燥，通过BioGel P-2柱子除去杂质，TLC检测收集产物真空干燥，得到GOS-Sia产物，经色谱分析，纯度达到95%以上。

实施例2：

称取3份低聚半乳糖（GOS）10.00mg，CTP 85.4mg，Neu5Ac 9.6mg溶于1mL的ddH₂O中，分别向三个试管中加入1mol的Tris-Hcl 100uL，1mol的MgCl₂ 20ul，NMCSS 10ug，向试管一种加入14ug PmST1，试管二中加入27ug Pd2,6ST试管三中加入80ug CstI，加水定容到10ml，混匀，37℃水浴1-2h，TLC检测反应进程。将反应后的溶液100℃煮3min，冷却，12000r/min离心10min，将上清液转移到干净的试管中。向上清液中加入碱性磷酸酶50ug，37℃水浴3h，HPLC检测反应进度，色谱柱为C18柱，流动相为磷酸缓冲液（磷酸氢二钠35.8ｇ、磷酸二氢钾13.6g加水900ml溶解用氢氧化钠溶液，调节pH至7.0，加入2.5g四甲基溴化铵，加水至1000ml摇匀）和水，反应液100℃煮3分钟，冷却，12000r/min离心10min，经0.22μm膜过滤冷冻干燥，通过BioGel P-2柱子除去杂质，TLC检测收集产物真空干燥，得到GOS-Sia产物，经色谱分析，纯度达到90%以上。

实施例3：

称取3份低聚半乳糖（GOS）50.00mg，CTP 100.0mg，Neu5Ac 50.0mg溶于5mL的ddH₂O中，分别向三个试管中加入1mol的Tris-Hcl 500uL，1mol的MgCl₂ 100ul，NMCSS 30ug，向试管一种加入60ug PmST1，试管二中加入85ug Pd2,6ST试管三中加入150 ug CstI，加水定容到5ml，混匀，37℃水浴0.5h，TLC检测反应进程。将反应后的溶液100℃煮4min，冷却，12000r/min离心10min，将上清液转移到干净的试管中。向上清液中加入碱性磷酸酶200ug，37℃水浴4h，HPLC检测反应进度，色谱柱为C18柱，流动相为磷酸缓冲液（磷酸氢二钠35.8ｇ、磷酸二氢钾13.6g加水900ml溶解用氢氧化钠溶液，调节pH至7.0，加入1.61g四甲基溴化铵，加水至1000ml摇匀）和水，反应液100℃煮4分钟，冷却，12000r/min离心10min，经0.22μm膜过滤冷冻干燥，通过BioGel P-2柱子除去杂质，TLC检测收集产物真空干燥，得到GOS-Sia产物，经色谱分析，纯度达到90%以上。

实施例4

应用实例

分别取三种纯化好的GOS的唾液酸产物，培养婴儿双歧杆菌（ATCC15697，购于广东微生物菌种保藏中心），培养基的成分为：1%细菌蛋白胨（wt/vol）、0.5%酵母提取物（wt/vol）、0.2%磷酸二氢钾（wt/vol）、0.5%乙酸钠（wt/vol）、0.2%柠檬酸（wt/vol）、0.02%铵硫酸镁（wt/vol）、0.005%硫酸锰（wt/vol）、0.1%吐温80（vol/vol）和2%的三种GOS唾液酸纯产物。37℃，96孔板上厌氧培养，OD=600测菌的生长浓度。40小时后三种产物培养的婴儿双歧杆菌均能够生长，2,3-唾液酸连接的GOS唾液酸衍生培养婴儿杆菌的OD>0.8；2,6-唾液酸连接GOS唾液酸衍生物培养的婴儿杆菌的OD>0.8；2,3/8-唾液酸连接的GOS唾液酸衍生物培养的婴儿双歧杆菌的OD>0.4。

结论：婴儿双歧杆菌能够利用这三种产物，而婴儿双歧杆菌是人体肠道的益生菌。

（1）婴儿双歧杆菌能都利用2,3-唾液酸连接的GOS和2,6-唾液酸连接GOS

（2）2,3/8-唾液酸连接的GOS培养的婴儿双歧杆菌只长到OD=0.4左右，是因为婴儿双歧杆菌利用产物的同时生成很多酸性物质，pH降低，菌的生长减慢或者停止，但是人体能够将酸碱度维持在正常水平。

实施例5

对比试验

SEQUENCE LISTING

<110> 南开大学

<120> 一种低聚半乳的唾液酸衍生物及其合成方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaatcatatg aaacaaagca ctattgcact ggca 34

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcgctcgagt ttcagcccca gagcggcttt catg 34

Claims

1.利用低聚半乳糖和唾液酸通过CMP-Sia合成酶和唾液酸转移酶合成的HMO类似物，具有如下的结构：

Pmst1酶催化合成的2,3-唾液酸连接的GOS唾液酸衍生物

Sia-a2,3-(Gal)n-Glc（n=1-7）

Pd2,6ST酶催化合成的2,6-唾液酸连接GOS唾液酸衍生物

Sia-a2,6-(Gal)n-Glc（n=1-7）

CSTII酶催化合成的2,3/8-唾液酸连接的GOS唾液酸衍生物

(Sia-a2,8)m-Sia-a2,3-(Gal)n-Glc（n=1-7）。

2.权利要求1所述HMO类似物的合成方法，其特征在于按如下的步骤进行：

酶法转化：利用生物酶在一定条件下作用于低聚半乳糖溶液，生成低聚半乳糖的唾液酸衍生物的混合物；其中所述的低聚半乳糖与生物酶的重量比例为：

NMCSS/GOS=146ug/100mg；PMST1/GOS=172ug/100mg；

Pd2,6ST/GOS=272ug/100mg；CSTⅡ/GOS=616ug/100mg；

酶分离：将反应产物煮沸终止反应，12000r/min离心20分钟，分离变性的酶和反应中的沉淀物，取上清液；

底物和副产物的降解：将分离出的上清液用碱性磷酸酶处理，将反应中未完全反应的CTP、CMP、CMP-Sia降解为胞苷，采用HPLC检测；

分离纯化：将（c）制得的上清液，经分离、冻干后，制得低聚半乳糖的唾液酸纯化后产物。

3.权利要求1所述HMO类似物的合成方法，其中步骤（a）中所述的生物酶指的是：以 (Gal)n-Glc/Gal(n=1-7)作为底物；由来源于微生物中的两种酶通过“一锅双酶法”来催化合成反应，合成三种不同的低聚半乳糖的唾液酸衍生物。

4.权利要求2所述HMO类似物的合成方法，其中所述作为底物的浓度为20mM/L；PMST1、Pd2,6ST催化的反应的CTP和Neu5Ac的浓度为40mM，CSTⅡ催化的反应的CTP和Neu5Ac的浓度为100mM，pH8 Tris-Hcl的浓度为100mM，Mg²⁺浓度为20mM反应的温度为37℃，反应时间为1-2h。

5.权利要求2所述HMO类似物的合成方法，其中所述步骤（c）中HPLC的检测以磷酸盐缓冲液，C18柱，260nm吸收波长进行检测；所述的磷酸盐缓冲液指的是：磷酸氢二钠35.8ｇ、磷酸二氢钾13.6g加水900ml溶解用氢氧化钠溶液，调节pH至7.0，加入1.61g四甲基溴化铵，加水至1000ml。

6.权利要求2所述HMO类似物的合成方法，其中所述步骤（d）中分离纯化：用规格15mm ID×100cm 的Bio-gel P2 色谱柱进行色谱分离，以水为流动相，色谱分离的样品上样量为1-2mL，洗脱流速为0.4-1 mL/min；最优的样品上样量为1mL，洗脱流速为1-2mL/min，收集洗脱样品。

7.权利要求2所述HMO类似物的合成方法，其中所述步骤（a）和（d）中还包括分离后的薄层层析检测、合并迁移距离相同的产物的步骤；其薄层层析检测的步骤如下：

8.权利要求1所述HMO类似物的合成方法，其特征在于：

9.权利要求所述1所述的HMO类似物在制备解决乳制品中唾液酸缺乏或含量不足方面的应用。