CN105838624A - 一种防止杂菌污染的蛹虫草子实体培养方法 - Google Patents

一种防止杂菌污染的蛹虫草子实体培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高蛹虫草子实体生产效率减少杂菌污染的方法，该方法包括菌种活化、液体菌种制作、蛹虫草培养3个步骤，其特征在于该方法中改变了培养容器的封口膜为封口袋，在于将目前半开放式发酵工艺彻底改变成密封式发酵，在于将培养室发菌改成在接种室原地发菌来实现的。本发明提高了蛹虫草子实体生产效率，减少杂菌尤其是“吃草菌”污染的方法，对大幅度提高产率和经济效益具有重要意义；本发明具有方便快捷的优点，适用于蛹虫草固体发酵大规模生产子实体。

Description

一种防止杂菌污染的蛹虫草子实体培养方法
技术领域
本发明涉及真菌发酵工程，具体而言涉及蛹虫草固体培养高产子实体落。
背景技术
蛹虫草（Cordycepsmilitaris(L.) Link），又称北冬虫夏草，是一种能寄生于鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫蛹及幼虫上的虫生真菌,菌性属中温型,生长在低海拔的平原地域,主要分布在东北、华北、西北等省区，但据报道,云南、贵州、四川、重庆等南方省区也有分布。
据估算我国每年仅蛹虫草干子实体产量就达3000吨以上（Wen et al., 2014），冬虫夏草产量在100吨左右，产值上百亿；另外以虫草及相关无性型发酵产品为原料生产的国药准字的药品有45种，其中金水宝和白令胶囊年销售总和超过20亿元；以虫草为原料生产的国食健字或卫食健字保健品有99种，有33家企业获得虫草类食品生产许可（www.sfda.gov.cn, 2014），国内外以虫草为原料生产的化妆品有好几种（Hydeet al.,2010）；从虫草及其相关真菌中发现了上百种新活性化合物（胡丰林和李增智，2007）；
蛹虫草子实体及其菌粉在我国作为一类新药（中药国药准字Z20030034/35)已获得国家药品监督管理局批准进入临床，产品标识其具有补肺益肾、止咳化痰之功效，能够调节机体免疫功能，提高机体综合抗病能力，主要用于慢性支气管炎、各种肿瘤及其它免疫系统疾病的治疗。经大量的研究证明，蛹虫草固体发酵生产的子实体（卫生部2009年批准的新资源食品）与天然冬虫夏草的成份极相似，并证明了它与天然冬虫夏草有相似的药理作用与临床效果，甚至在某些方面优于天然的冬虫夏草（如毒性比天然的小），可以代替冬虫夏草在临床广泛应用。
虫草多糖由于其显著的免疫活性和抗肿瘤作用，已被国家食品药品监督局受理进入临床审评阶段（CXZL0700014/15）。虫草菌素的抗菌、降血脂、减肥、抗肿瘤和抗癌作用愈来愈受到人们的重视。降血脂方面的效果尤为明显，与法国力博福尼制药公司生产的非诺贝特效果相当或优于非诺贝特；它还可作为核酸和染色体复制的终止剂,在生理生化研究方面有重要用途。在治疗白血病方面虫草菌素也由FDA批准进入了临床研究（1997年11月美国癌症研究所和OXiGENE (NASDAQ:OXGN)-NCT00003005，2008年7月OncoVista(NASDAQ:OVIT)-NCT00709215）。据美国OncoVista公司报道，虫草菌素的市场价值已达到3.5亿美圆。
虫草素来源主要是蛹虫草子实体，目前蛹虫草已实现了大规模固体培养，但子实体生产技术还不完善，发酵过程杂菌污染环节较难控制，尤其是“吃草菌”是一大天敌，处理不好不但严重污染当季生产，而且还污染整个厂房的空气和设备，导致后续生产陷入困境，技术和管控风险相当大。
近年来，人们关注提高虫草菌素含量的技术，涉及虫草菌素的专利申请有01124109.8号“发酵培养生产虫草素的方法（液体培养）”、200810068734.8号“红曲协同发酵提高蛹虫草子实体和虫草素产量的方法”等。然而，目前关于蛹虫草固体发酵的专利主要集中在子实体生产工艺研究方面，很少涉及大规模生产过程中污染的防控和“吃草菌”的预防。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高蛹虫草子实体生产效率，减少杂菌污染的方法，从而大幅度提高产率和经济效益，可以克服现有技术的不足。
本发明的技术方案是：提高蛹虫草子实体生产效率减少杂菌污染的方法，该方法包括菌种活化、液体菌种制作和蛹虫草培养三个步骤，其中
1.菌种活化
(1)配PDA培养基：马铃薯200g，水煮30min，用4层纱布过滤，取滤液，葡萄糖20g，琼脂15～20g, 加水至1000mL;
(2)将配好的PDA培养基分装到试管，包扎，121℃灭菌30mim;
(3)灭好菌的试管培养基凝固前摆斜面，冷却;
(4)将原始菌种从4℃冰箱中取出,室温下在超净操作台上无菌接种；
(5)接种蛹虫草的斜面置26℃下黑暗恒温培养；
(6)4～6天后，等菌种长满斜面，用无菌水洗斜面制成孢子悬液(在超净操作台上无菌操作)。
2.液体菌种制作
将蛹虫草孢子悬液稀释到合适浓度，然后将孢子悬液接入液体母种培养基中，于18℃～25℃下摇床以180r/min的转速培养4d。
上述液体母种培养基的配方为蛋白胨2％，蔗糖2％，MgSO4·7H2O 0.05％, KH2PO40.1％，水1000mL，pH自然;装液量为200mL/500mL三角瓶。
蛹虫草培养
是用无色玻璃瓶中装入20份大米、小麦或大米和小麦的混合物，按1：1.6-1.8的料水比加入营养液；用耐高温塑料袋封口后在118-121℃，30min高压灭菌，冷却后立即打开耐高温塑料袋进行接种蛹虫草液体母种，接种后继续用耐高温塑料袋封口密封，在接种区原地置18-20℃下黑暗恒温培养5天；第6天将长满菌丝的培养瓶转移至培养室，从第6天起每天散射光光照不少于15h, 温度保持20-22℃，相对湿度提高至78-82％左右；蛹虫草子座长出后，每天散射光光照不少于10h，且增加光照强度至1500LX，温度保持20-25℃，空气湿度83-87％；待蛹虫草培养50天后，蛹虫草培养50天后收获橙黄色的子实体。
所述的耐高温塑料袋为耐高温透明聚丙烯塑料袋。
所述的耐高温透明聚丙烯塑料袋的深度为40-45cm。
4耐高温透明聚丙烯塑料袋通过皮筋密封连接在无色玻璃瓶瓶口。
所使用的菌株为：蛹虫草菌株（Cordycepsmilitaris）的无性型蛹草拟青霉（paecilomycesmilitaris）菌株。
与现有技术比较，本发明将目前培养容器的封口膜戳孔接种的半开放式发酵工艺彻底改变成不破坏封口袋的基础上打开封口皮筋接种后的密封式发酵，这样彻底杜绝发菌和生长过程中任何杂菌的污染。改变发菌地点，将目前接种后在培养室发菌改成在接种室原地发菌，这样减少了从接种室到培养室的运输过程，待3-5天后虫草菌完全覆盖配以后转移至培养室，这样进一步防止了污染。耐高温透明聚丙烯塑料袋的深度为40-45cm，这样可以确保子实体的伸展长度，不至于受压弯曲；不采用玻璃罐头瓶而采用直口瓶，这样方便将子实体取出。
同时本发明的能提高蛹虫草子实体生产效率，减少杂菌污染，经大量实验，采用本方法杂菌污染率为3%，相对现有的培养方法（杂菌污染了达10%）具有大幅度提高，其对提高整个蛹虫草子实体的产率和经济效益具有重要意义。
具体实施方式
实施例1：在10个容积为350ml、内径为6.2cm、高度为15cm的圆柱形无色玻璃瓶中分别装入20g大米，按1∶1.6的料水比加入32mL营养液（采用葡萄糖1％,蛋白胨1.5％,K2HPO4 0.05％, MgSO4·7H2O 0.05％, VB1 (2mg/L)，水1000mL，pH自然的配方配制而成的营养液），用耐高温透明聚丙烯塑料袋（长40㎝）封口后118℃，30min高压灭菌，冷却后立即打开耐高温透明聚丙烯塑料袋袋口接种蛹虫草液体母种，接种后继续用皮筋扎带封口，在接种区原地置18-20℃下黑暗恒温培养5天。第6天将长满菌丝的培养瓶转移至培养室，从第6天起每天散射光光照不少于15h, 温度保持20-22℃，相对湿度提高至78％；蛹虫草子座长出后，每天散射光光照不少于10h，且增加光照强度至1500LX，温度保持20℃左右，空气湿度83％；待蛹虫草培养50天后，每瓶收获橙黄色的新鲜子实体30g。
实施例2：在10个容积为350ml、内径为6.2cm、高度为15cm的圆柱形无色玻璃瓶中分别装入20g小麦，按1∶1.7的料水比加入34mL营养液（采用葡萄糖1％,蛋白胨1.5％,K2HPO4 0.05％, MgSO4·7H2O 0.05％, VB1 (2mg/L)，水1000mL，pH自然的配方配制而成的营养液），用耐高温透明聚丙烯塑料袋（长43㎝）封口后120℃，30min高压灭菌，冷却后立即打开耐高温透明聚丙烯塑料袋袋口接种蛹虫草液体母种，接种后继续用皮筋扎带封口，在接种区原地置18-20℃下黑暗恒温培养5天。第6天将长满菌丝的培养瓶转移至培养室，从第6天起每天散射光光照不少于15h, 温度保持20-22℃，相对湿度提高至80％；蛹虫草子座长出后，每天散射光光照不少于10h，且增加光照强度至1500LX，温度保持22℃左右，空气湿度85％；待蛹虫草培养50天后，每瓶收获橙黄色的新鲜子实体31g。
实施例2：在10个长20cm、宽12cm、高为15cm的白色透明聚丙烯培养盆中分别装入225g大米和225g小麦组合，按1∶1.8的料水比加入810mL营养液（采用葡萄糖1％,蛋白胨1.5％,K2HPO4 0.05％, MgSO4·7H2O 0.05％, VB1 (2mg/L)，水1000mL，pH自然的配方配制而成的营养液），用耐高温透明聚丙烯塑料袋（长45㎝）封口后121℃，30min高压灭菌，冷却后立即接种蛹虫草液体母种，在接种区原地置18-20℃下黑暗恒温培养5天。第6天将长满菌丝的培养瓶转移至培养室，从第6天起每天散射光光照不少于15h, 温度保持20-22℃，相对湿度提高至82％；蛹虫草子座长出后，每天散射光光照不少于10h，且增加光照强度至1500LX，温度保持25℃左右，空气湿度87％；待蛹虫草培养50天后，每盆收获橙黄色的新鲜子实体450g。

Claims (4)

1.一种提高蛹虫草子实体生产效率减少杂菌污染的方法，该方法包括菌种活化、液体菌种制作和蛹虫草培养三个步骤，其特征在于：蛹虫草培养是用无色玻璃瓶中装入20份大米、小麦或两者的混合物，按1：1.6-1.8的料水比加入营养液；用耐高温塑料袋封口后在118-121℃，30min高压灭菌，冷却后立即打开耐高温塑料袋进行接种蛹虫草液体母种，接种后继续用耐高温塑料袋封口密封，在接种区原地置18-20℃下黑暗恒温培养5天；第6天将长满菌丝的培养瓶转移至培养室，从第6天起每天散射光光照不少于15h, 温度保持20-22℃，相对湿度提高至78-82％左右；蛹虫草子座长出后，每天散射光光照不少于10h，且增加光照强度至1500LX，温度保持20-25℃，空气湿度83-87％；待蛹虫草培养50天后，蛹虫草培养50天后收获橙黄色的子实体。
2.根据权利要求1所述的提高蛹虫草子实体生产效率减少杂菌污染的方法，其特征在于：所述的耐高温塑料袋为耐高温透明聚丙烯塑料袋。
3.根据权利要求1或2所述的提高蛹虫草子实体生产效率减少杂菌污染的方法，其特征在于：所述的耐高温透明聚丙烯塑料袋的深度为40-45cm。
4.根据权利要求3所述的提高蛹虫草子实体生产效率减少杂菌污染的方法，其特征在于：耐高温透明聚丙烯塑料袋通过皮筋密封连接在无色玻璃瓶瓶口。
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