KR20140053829A - 접종물 및 제조 방법 - Google Patents

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KR20140053829A
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폴 프리스콧
이홍 왕
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에이엠에스 래버러토리스 피티와이 엘티디
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Abstract

본 발명은 미생물 접종물 및 특히 미생물의 참조 배양물을 생산하기 위한 표준화된 접종물에 관한 것이다. 본 발명은 주로 고형의 디스크-모양을 가진 접종물로서 사용하기 위해 개발되었으며 이러한 적용을 참고로 하여 본원에서 기술할 것이다. 그러나, 본 발명은 이러한 특정한 사용 분야로 한정되지 않는 것으로 인식될 것이다.

Description

접종물 및 제조 방법{INOCULUM AND METHOD OF PREPARATION}
본 발명은 미생물 접종물 및 특히 미생물의 참조 배양물을 생산하기 위해 표준화된 접종물에 관한 것이다.
본 발명은 주로 고형의 디스크-모양을 갖는 접종물로서 사용하기 위해 개발된 것이고 이러한 적용을 참고로 하여 하기에서 기술할 것이다. 그러나, 본 발명은 이런 특정한 사용 분야로 한정되지 아니하는 것으로 인식될 것이다.
본 명세서 전반에 걸쳐 선행 기술에 대한 어떠한 논의도 결코 이러한 선행 기술이 당 분야에서 널리 공지되거나 보편적이고 일반적인 지식의 일부를 형성함을 인정하는 것으로서 간주되어서는 안된다.
살아있는 미생물을 안정한 형태로 유지하는 것은 미생물학 연구를 위해 중요하다. 미생물을 동결-건조시키는 방법은 비교적 성공적이었다. 성공적으로 동결-건조된 세포는 냉동 조건없이 보관될 수 있기 때문에, 이러한 방법은 액체 질소 보관 시스템과 같은 과냉된(super-cooled) 시스템과 비교하여 더욱 편리하고 저렴하다.
일반적으로, 결정수(water crystal)의 손상 효과를 방지하기 위해 세포를 동결시킬 때에는 동결보호제가 동결하는 배지에 포함된다. 일반적으로 세포의 안정적인 동결 건조된 접종물을 제조함에 있어서 주요한 트라우마(trauma)는 동결 및 해동 공정 동안에 세포에 대한 물리적 영향의 결과로서 일어난다고 여겨진다. 동결보호제의 성분 변화는 동결하는 배지가 접종물을 더욱 안정적이고 정량적으로 유지하기 위해 유용한 동결보존 배지가 되도록 세포 생존력(viability)을 향상시킬 수 있다.
미생물학 연구실은 일상적으로 품질 관리 방법, 예를 들어 시험 방법 및 배양 배지의 효능을 입증하는 방법에서 미리 결정된 양의 미생물을 제공하는 표준화된 참조 배양물을 사용한다. 이들 참조 배양물은 일반적으로 밀리리터 당 추정된 수의 콜로니-형성 유닛 (CFU/ml)을 포함하는 신선한 세포 현탁액을 수득하기 위해 미생물 배양물을 희석함으로써 제조된다. 밀리리터 당 콜로니 형성 유닛의 수가 결정될 수 있는 정확도는 종종 희석하는 동안 작은 측정 오류의 외삽법으로 인한 것 뿐만 아니라 시료 그 자체의 생물학적 가변성으로 인해 상당히 달라진다. 이처럼 후속적으로 제조된 신선한 참조 배양물을 사용하는 것은, 일련의 실험에서 각각의 단일 접종물에 대해 밀리리터 당 콜로니 형성 유닛의 수를 일관되게 결정하는 것이 어렵기 때문에 허위 또는 무효한 결과에 대한 잠재성을 자연적으로 증가시킨다.
미생물학 산업을 위한 참조 배양물을 생산하기 위해 공지된 접종물에는 Bioball® (BTF)와 같은 제품이 포함된다. Bioball®은 재현가능한 변화량(평균으로부터 2미만의 표준편차)을 갖는 비교적 정확하고 일관된 수의 미생물을 포함하는 복수의 접종물을 제공할 수 있다. 그러나, Bioball®을 생산하는 방법은 복잡하고, 제조하는 동안의 제품 정밀도 요건은 생산시 제품을 상대적으로 고가가 되도록 한다.
본 발명의 목적은 선행 기술의 적어도 하나의 단점을 극복하거나 개선하거나, 유용한 대안을 제공하는 것이다.
본 발명은 접종물 및 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
다양한 구체예에서 본 발명은 고형의 디스크-모양을 가진 미생물 접종물, 동결보존 배지의 개선된 동결보존 제형, 및 이러한 접종물을 신뢰할 수 있고 용이하게 생산하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 접종물은, 미리 결정된 수의 세포 또는 미생물과 같은, 미리 결정된 양의 접종 물질을 사용자가 하나의 용기에서 또 다른 용기로 표준 연구실 장치를 사용하여 편리하고 정확하게 이동시키도록 해주는 모양과 크기를 갖는, 더욱 사용자-친화적인 형태로 생산하기 위해 비교적 저렴하다.
제1 양태에서, 본 발명은 동결보존 배지 및 미리 결정된 양의 접종 물질을 포함하는 고형의 건조 접종물로서, 접종물이 실질적으로 디스크-모양을 갖는 고형의 건조 접종물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 실질적으로 디스크-모양을 가진 접종물은 바람직하게는 반구형이고 볼록한 표면 및 이의 반대측에 대응되는 오목한 표면을 포함하며, 따라서 표준 실험실 접종 루프를 사용하여 하나의 용기로부터 또 다른 용기로의 용이한 이동을 수월하게 해준다.
편리하게도, 상기 접종물은 동결 건조에 의해 생산된다.
동결보존 배지는 전형적으로 소혈청 알부민, 미오-이노시톨(myo-inositol), 소고기 추출물(beef extract), 세균학적 펩톤, 젤라틴, 활성탄 및 물을 포함한다. 특히, 동결보존 배지의 바람직한 포뮬레이션은 소혈청 알부민 및 젤라틴을 거의 등분(equal part)으로(즉, 약 1:1의 비로) 포함한다. 접종 물질은 전형적으로 세균(bacterium) 또는 진균(fungus)과 같은 미생물일 수 있는 세포이고 각각의 접종물은 약 0 내지 약 108 개의 세포를 포함한다. 세균 세포는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus ); 바실러스 푸밀루스(B. pumilus ); 바실러스 서브틸리스(B. subtilis); 박테로이데스 프래질리스(Bacteroides fragilis ); 브레분디모나스 디미누타(Brevundimonas diminuta ); 보르데텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica); 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia ); 클로스트리디움 페르프린겐스( Clostridium perfringens ); 클로스트리디움 스포로게네스(C. sporogenes); 엔테로코쿠스 패칼리스( Enterococcus faecalis ); 엔테로코쿠스 히라에(E. hirae ); 에스케리치아 콜라이( Escherichia coli ); 게오바실러스 스테아로써모필루스( Geobacillus stearothermophilus ); 클렙시엘라 뉴모니아( Klebsiella pneumonia); 코쿠리아 리조필라( Kocuria rhizophila ); 락토바실러스 페르멘툼( Lactobacillus fermentum ); 리스테리아 모노사이토게네스( Listeria monocytogenes); 마이크로코쿠스 루테우스( Micrococcus luteus ); 슈도모나스 에어루지노사( Pseudomonas aeruginosa ); 살모넬라 엔테리카 아종( Salmonella enterica subsp.); 쉬젤라 플렉스네리( Shigella flexneri ); 스태필로코쿠스 아루레우스 아종( Staphylococcus aureus subsp .); 및 스트렙토코쿠스 피오게네스( Streptococcus pyogenes)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나 이로 한정되지 않는다. 세포가 진균인 경우에, 진균은 다음의 균주 아스퍼질러스 니게르( Aspergillus niger ); 칸디다 알비칸스( Candida albicans ); 및 사카로마이세스 세레비시애( Saccharomyces cerevisiae)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나 이로 한정되지 않는다.
제2 양태에서, 본 발명은,
a) 표면 상에 미리 결정된 양의 접종 물질을 포함하는 액체 동결보존 배지의 복수의 분취액을 위치시키는 단계;
b) 복수의 고형의 건조 접종물을 수득하기 위해 상기 표면 상에 위치된 각각의 분취액을 건조시키는 단계;
c) 상기 표면으로부터 상기 접종물을 회수하는 단계를 포함하는, 고형의 건조 접종물을 제조하는 방법으로서, 각각의 상기 접종물은 실질적으로 디스크-모양을 갖는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 접종물은 건조 단계 이후에 반구형 모양을 갖는다. 건조는 바람직하게는 위치된 분취액을 동결-건조함으로써 달성된다. 원하는 접종물을 생산하기 위해, 분취액은 일반적으로 약 10㎕ 내지 약 100㎕, 바람직하게는 약 15㎕ 내지 약 60㎕ 범위의 부피를 가지며, 접종 물질로서 약 0 내지 약 108 개의 세포의 미생물을 포함한다.
표면은 전형적으로 플라스틱 표면, 바람직하게는 페트리 디쉬 또는 등가물과 같은 표준 실험실 폴리스티렌 디쉬 또는 트레이의 폴리스티렌 표면이다.
제3 양태에서, 본 발명은 제2 양태의 방법에 의해 제조되는 고형의 건조 접종물에 관한 것이다.
제4 양태에서, 본 발명은 제1 또는 제3 양태에 따른 복수의 고형의 건조 접종물을 포함하는 용기/팩을 제공한다.
본 설명 및 청구항 전반에서 문맥상 달리 명확하게 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다", "포함하는" 등은 배타적이거나 완전한 의미와는 반대되는 포괄적인 의미; 다시 말해서, "포함하나, 이에 제한되지 않는"의 의미로 구성된 것이다.
본 명세서의 문맥에서, 용어 "접종물" (복수 "접종물들(inocula)")은 미리 결정된 양의 접종 물질을 포함하는 동결보존 배지의 분취액을 건조시킨 결과로 얻어지는 물리적 바디를 말한다. 본 발명의 하나 이상의 바람직한 구체예에 따른 접종물은 표준 실험실 장치를 사용하여 편리하게 다루도록 해주고 배양 배지에 접종하기 위해 사용되는, 접종물의 반-구형, 실질적으로 디스크 모양을 갖는 바디에 의해 정의된다.
본 발명의 하나 이상의 바람직한 구체예에 따른 "건조" 접종물은 실질적으로 모든 액체가 제거된 것이다. 대안적으로, 본 발명의 하나 이상의 바람직한 구체예에 따른 접종물을 언급할 때 용어 "건조"는 접종물이 잔여 수분을 포함할 수는 있지만 충분히 "건조"되어 표준 실험실 장치를 사용하여 편리하게 다루어질 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 하나 이상의 바람직한 구체예에 따른 "고형의" 접종물은 액체도 아니고 기체도 아니며, 그 자체의 무게로 인해 흐르지 않는 것을 말한다. 대안적으로, 본 발명의 하나 이상의 바람직한 구체예에 따른 접종물을 언급할 때 용어 "고형의"는 접종물이 충분히 단단하여 이의 디스크 모양의 바디를 유지하고 표준 실험실 장치를 사용하여 편리하게 다루어질 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 문맥에서 용어 "동결보존 배지"는 냉동 및 해동 동안의 물질적 영향으로부터 배지 내에 포함된 접종 물질의 손상을 보호하고/하거나 최소화할 수 있는 액체 조성물을 말한다.
본 발명의 바람직한 구체예는 수반하는 도면과 관련하여 단지 실시예의 방식으로 이제 기술될 것이다.
도 1은 본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 볼록한 표면 및 이의 반대측에 대응되는 오목한 표면을 포함하는 실질적으로 반구형의 디스크-모양을 갖는 복수의 접종물의 평면도이다.
도 2a는 본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 실질적으로 반구형의 디스크-모양을 갖는 접종물의 측면을 센티미터/밀리미터 척도로 보여주는 사진이며, 접종물은 볼록한 표면 및 이의 반대측에 대응되는 오목한 표면을 포함한다.
도 2b는 도2a에 도시된 접종물의 평면도이다.
도 3a는 본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 접종물의 평면도를 보여주는 사진으로서, 오목한 표면이 위를 향하도록 플라스틱 세균학적 루프에 옮겨진 접종물을 보여준다.
도 3b는 도 3a와 유사한 평면도로서, 도 3a에서 도시한 루프 다음으로 비어있는 세균학적 루프를 보여준다.
도 4는 본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 오목한 표면이 위로 향하고 있는 수많은 접종물의 사시도를 보여주는 사진이다.
도면을 참고로 하여, 본 발명에 따른 고형의 건조 접종물은 실질적으로 디스크-모양의 바디(body)를 가지며, 이는 볼록한 표면 및 이의 반대측에 대응되는 오목한 표면을 포함한다.
하나의 바람직한 구체예에서, 도면에 도시된 바와 같이, 접종물의 특정한 모양은 멸균 조건하에서 사용자가 접종물을 수월하게 다룰 수 있도록 한다. 예를 들어, 이 모양은 도3A 및 도3B에 도시된 바와 같이 표준 미생물학적 접종 루프를 사용하여 접종물을 쉽게 다룰 수 있게 함으로써, 용기들 간 접종물의 이동을 수월하게 한다.
또한, 바람직한 구체예에서, 접종물은 미리 결정된 양의 접종 물질, 바람직하게는 약 108 개의 세포/접종물 까지의 양으로 세균 또는 진균과 같은 세포성 미생물, 및 접종물의 건조 및 후속 보관 과정 동안 다양한 상태에서 상기 세포를 보호하고 보존하기 위한 동결보존 배지를 포함한다. 이를 위해, 동결보존 배지는 바람직하게는 소혈청 알부민(BSA) 및 젤라틴을 대략 등분으로 포함할 뿐만 아니라 미오-이노시톨(myo-inositol), 소고기 추출물(beef extract), 세균학적 펩톤, 활성탄 및 물을 포함한다.
하나의 바람직한 구체예에서, 접종물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus); 바실러스 푸밀루스(B. pumilus ); 바실러스 서브틸리스(B. subtilis ); 박테로이데스 프래질리스(Bacteroides fragilis ); 브레분디모나스 디미누타(Brevundimonas diminuta ); 보르데텔라 브론치셉티카( Bordetella bronchiseptica); 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia ); 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens ); 클로스트리디움 스포로게네스(C. sporogenes); 엔테로코쿠스 패칼리스( Enterococcus faecalis ); 엔테로코쿠스 히라에(E. hirae ); 에스케리치아 콜라이( Escherichia coli ); 게오바실러스 스테아로써모필루스( Geobacillus stearothermophilus ); 클렙시엘라 뉴모니아( Klebsiella pneumonia); 코쿠리아 리조필라( Kocuria rhizophila ); 락토바실러스 페르멘툼( Lactobacillus fermentum ); 리스테리아 모노사이토게네스( Listeria monocytogenes); 마이크로코쿠스 루테우스( Micrococcus luteus ); 슈도모나스 에어루지노사( Pseudomonas aeruginosa ); 살모넬라 엔테리카 아종( Salmonella enterica subsp.); 쉬젤라 플렉스네리( Shigella flexneri ); 스태필로코쿠스 아루레우스 아종( Staphylococcus aureus subsp .); 및 스트렙토코쿠스 피오게네스( Streptococcus pyogenes)로 구성된 군으로부터 선택된 세균을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 접종물은 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger); 칸디다 알비칸스( Candida albicans ); 및 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae )로 구성된 군으로부터 선택된 진균을 포함한다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에 따르면, 건조된 접종물은 수 개월의 기간을 초과하여 세균성 또는 진균성 세포의 일정한 정도의 생존력을 유지한다. 세포의 생존력의 정도는 4℃에서 특정 보관 기간 후에 접종물 당 생산된 콜로니 형성 유닛(CFU)의 수에 의해 평가될 수 있다. 따라서, 세포 생존력의 감소는 접종물 당 생산된 CFU에서의 감소에 의해 나타날 것이다(하기 표1 참고).
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따른 접종물은 일정하게 신선하고 동등한 참조 배양물들을 제조하기 위해 배양 배지의 일정하고 표준화된 접종을 위한 정량적이고 안정적인 접종물을 제공한다. 이러한 참조 배양물은 미생물학적 품질 관리 과정에서 일상적으로 사용될 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기된 실질적으로 고형이고 실질적으로 건조된 복수의 접종물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 복수의 접종물은 표준 실험실 폴리스티렌 페트리 디쉬(Petri Dish)의 폴리스티렌 표면 상에 약 10㎕ 내지 약 100㎕, 바람직하게는 약 15㎕ 내지 약 60㎕의 부피를 가지며 대략 108 개의 세균 또는 진균 세포를 포함하는 비말(droplet)의 형태로, 대응하는 액체 동결보존 배지의 복수의 분취액을 위치시킴으로써 제조된다. 접종물 내의 세균 또는 진균의 수는 접종물의 원하는 용도에 따라 더 높거나 더 낮을 수 있는 것으로 이해될 것이다. 그런 다음 각각의 비말은 폴리스티렌 표면 상에서 동결되고 후속적으로 동결-건조되어, 표준 미생물학적 접종 루프를 사용하여 다루기에 수월하도록 편리하게 디스크-모양을 갖는 고형의 건조 접종물이 수득된다. 상세하게는, 접종물이 페트리 디쉬의 폴리스티렌 표면으로부터 회수된 후에, 접종물은 실질적으로 볼록한 표면 및 이의 반대측에 대응되는 실질적으로 오목한 표면을 포함하며 상기한 바와 같이 멸균 접종 루프를 사용하여 용기들 간에 쉽게 이동될 수 있다. 고형의 건조 접종물의 최종 직경은 사용된 비말의 크기에 의해 상당 부분 좌우된다. . 하나 이상의 구체예에서, 상기 방법에 의해 제조될 때 고형의 건조 접종물은 보관 및 판매를 위해 팩키징될 수 있다. 비교적 쉽고 저렴하게 생산되는 한편, 이러한 패키지 내에 포함된 각각의 접종물은 실질적으로 동일하고 미리 결정된 양의 접종 물질을 포함하는 안정적이고 정량적인 접종물을 제공한다.
비-제한적인 실시예를 참고로 하여 이제 본 발명을 보다 상세하게 기술할 것이다.
실시예
1. 동결보존 배지 ( CM )
동결보존 배지의 성분:
● 소혈청 알부민, BSA (Sigma, A9056) 5.0 %
● 미오-이노시톨 (Sigma, I5125) 10.0 %
● 소고기 추출물(Beef Extract) (BD, 212303) 0.3 %
● 세균학적 펩톤 (Oxoid, LP0037) 0.5 %
● 젤라틴 (Sigma, G9382) 5.0 %
● 활성탄 (Sigma, C9157) 0.3 %
동결보존 배지의 제조
CM 파트 A:
이노시톨 용액:
● 미오-이노시톨 10g
● 소고기 추출물 0.3g
● 세균학적 펩톤 0.5g
● 증류수 40ml
혼합물을 15분 동안 121℃에서 가열하였다 (pH 7.4±0.2).
BSA 용액:
● 소혈청 알부민 5g
● 증류수 30ml
용액을 0.22 ㎛ 여과에 의해 멸균하였다.
40ml 이노시톨 용액과 30ml BSA 용액을 혼합하여 CM 파트 A를 생산하였다.
7ml CM 파트 A를 멸균된 플라스틱 병에 분병하여 -20℃에 보관하였다.
CM 파트 B:
● 젤라틴 5g
● 활성탄 0.3g
● 증류수 30ml
혼합물을 15분 동안 121℃에서 가열하였다.
3ml CM 파트 B를 멸균된 플라스틱 병에 분병하여 -20℃에 보관하였다.
2. 동결보존 배지에 재현탁하기 위한 세포의 제조
스태필로코쿠스 아우레우스 및 슈도모나스 에어루지노사 세포의 제조 방법
스태필로코쿠스 아우레우스
슈도모나스 에어루지노사
이들 생물을 트립톤 소야 아가 (TSA, CM131 Oxoid) 플레이트에 플레이팅하고, 스태필로코쿠스 아우레우스의 경우에는 37℃에서 24시간 동안 배양하고 슈도모나스 에어루지노사의 경우에는 30℃에서 24시간 동안 배양하여 각 미생물의 세균 론(lawn)을 생성시켰다.
플레이트(표준 90mm 폴리스티렌 페트리 디쉬) 당 5ml 펩톤 워터(Pepton Water) (Oxoid)를 사용하여 각 세균 론을 세척하고 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고 6분 동안 4500 rpm에서 원심분리시켰다. 상층액을 부어버렸다(그리고 폐기하였다).
침전물을 10ml 펩톤 워터에 재현탁하고 다시 회전시켰다; 이 방법을 2회 반복하였다.
2차 세척 후에 상층액을 부어버리고, 수집된 세포의 총 수를 포토-스펙트로메트리에 의해 결정하고 세포를 하기한 바와 같이 비말 형성을 위한 동결보존 배지에 재현탁하기 위해 보존하였다.
칸디다 알비칸스 세포의 제조 방법
칸디다 알비칸스
이 생물을 사보우라우드 덱스트로오스 아가(Sabouraud Dextrose Agar) (SDA, CM41 Oxoid) 플레이트에 플레이팅하고 30℃에서 24시간 동안 배양시켰다.
플레이트 당 5ml 펩톤 워터(Oxoid)를 사용하여 진균 론(lawn)을 세척하고 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고 6분 동안 4500 rpm에서 원심분리시켰다. 상층액을 부어버렸다(그리고 폐기하였다).
침전물을 10ml 펩톤 워터에 재현탁하고 다시 회전시켰다; 이 방법을 2회 반복하였다.
2차 세척 후에 상층액을 부어버리고, 수집된 세포의 총 수를 포토-스펙트로메트리에 의해 결정하고 세포를 하기한 바와 같이 비말 형성을 위한 동결보존 배지에 재현탁하기 위해 보존하였다.
바실러스 서브틸리스 및 클로스트리디움 스포로게네스 포자의 제조 방법
바실러스 서브틸리스
클로스트리디움 스포로게네스
바실러스 서브틸리스를, 0.3% MnSO4를 함유한 트립톤 소야 아가(TSA, CM131 Oxoid) 플레이트에 플레이팅하고 37℃에서 9일 동안 배양시켰다.
클로스트리디움 스포로게네스를 레인포시드 클로스트리디아 아가(Reinforced Clostridia Agar) (RCA, CM151 Oxoid) 플레이트에 플레이팅하고 37℃에서 14일 동안 혐기성 조건하에서 배양시켰다.
플레이트 당 5ml 펩톤 워터(Oxoid)를 사용하여 진균 론을 세척하고 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고 6분 동안 4500 rpm에서 원심분리시켰다. 상층액을 부어버렸다(그리고 폐기하였다).
침전물을 10ml 펩톤 워터에 재현탁하고 다시 회전시켰다; 이 방법을 2회 반복하였다.
2차 세척 후에 상층액을 부어버리고, 후속하여, 침전물을 20분 동안 80℃에서 가열한 다음 20분 동안 빙수에서 냉각시켰다. 포자 생성을 포자 염색에 의해 확인하였다(참조: P 642, Merck; Microbiology Manual 12th Edition). 형성된 포자의 백분율이 육안 검사에 의해 90%를 초과하는 것으로 확인되었고 포자를 하기된 바와 같이 비말 형성을 위해 보관하였다.
아스퍼질러스 니게르 포자의 제조 방법
아스퍼질러스 니게르
이 생물을 사보우라우드 덱스트로오스 아가(SDA, CM41 Oxoid) 경사면(100 ml 메디컬 플랫(medical flat)에서; Schott-Duran)에서 성장시키고 배양물의 표면 전체가 검게 될 때까지 30℃에서 배양시켰다.
플랫 당 5ml 펩톤 워터(Oxoid)를 사용하여 플랫으로부터 전면 성장물을 세척해내고 현탁액을 맥카트니(McCartney) 병(Techno Plas, Australia)으로 옮겼다. 현탁액을 종이 필터(Whatman No. 2)를 통해 통과시키고 여과물을 원심분리 튜브에 옮기고 6분 동안 4500 rpm에서 원심분리시켰다. 그런 다음 상층액을 부어버렸다(그리고 폐기하였다).
침전물을 10ml 펩톤 워터에 재현탁시키고 다시 회전시켰다; 이 방법을 2회 반복하였다.
2차 세척 후에 상층액을 부어버리고, 수집된 세포의 총 수를 포토-스펙트로메트리에 의해 결정하고 세포를 하기 기술된 바와 같이 비말 형성을 위한 동결보존 배지에 재현탁하기 위해 보존하였다.
3. 비말 형성
장치 및 재료:
페트리 디쉬: 폴리스티렌(PS), 에틸렌 옥사이드(EO)로 멸균됨
파이펫: 에펜도르프(Eppendorf), 멀티파타이트 플러스 리피터 파이펫(Multipartite Plus Repeater Pipette)
팁: 500㎕ (25x20㎕)
방법:
특정 양의 세포 현탁액을 7ml CM 파트 A에 첨가하고 재현탁시켰다. 약 0 내지 약 108 개의 세균 또는 진균 세포가 포함된 세포 현택액을 상기된 방법에 의해 수집하여 2ml 부피까지 되도록 하였다(필요시에는 최초 수집된 세포를 펩톤 워터로 희석하였다).
3ml CM 파트 B를 혼합물에 첨가하고 교반시켜 완전히 혼합시켰다.
에펜도르프 멀리파타이트 플러스 파이펫을 20㎕의 부피로 설정하고, 500㎕의 팁을 사용하였다.
20㎕ 세균 CM 현탁액을 PS 페트리 디쉬 상에 수직으로 그리고 연속적으로 배분하고 각 비말을 다른 비말과 적당한 거리를 유지시켜서 개별 비말이 우발적으로 혼합되지 않도록 했다.
그런 다음 즉시 PS 페트리 디쉬를 30분 동안 -20℃ 냉동고로 이동시켰다(사전-냉동).
사전-냉동이 완료된 후에, PS 페트리 디쉬를 -80℃ 냉동고로 옮기고 밤새 정치시켰다.
4. 동결-건조
동결 건조 사이클 전에 30분 동안 콘덴서 온도를 -50℃로 낮춤으로써 동결 건조기 (FD-1B-50, Bi Yi Kang, China)를 준비해 놓았다. 냉동된 비말이 있는 PS 페트리 디쉬를 동결 건조기 내에 놓았다. 동결 건조기 선반 온도를 -10℃에서 25℃로 증가시키고 최대 진공을 적용하도록 사이클을 설정하였다. 최대 진공 수준에 도달했을 때(20Pa 하에서) 사이클을 종료하였다. 동결건조된 디스크(디스크-모양의 접종물)를 페트리 디쉬의 후면을 탭핑함으로써 표면으로부터 회수하였다. 후속적으로, 멸균 금속 또는 플라스틱 세균학적 루프(Techno Plas, Australia)를 사용하여 동결건조된 디스크 전부를 멸균된 유리병 내로 수집하였다. 동결건조된 디스크를 개별적인 멸균된 바이알 내로 분배하고 (사전-멸균된) 동결 건조 마개를 각 바이알 위에 주의깊게 올려두어 마개가 바이알을 밀봉하지 않도록 하였다. 그런 다음 바이알 전부를 동결 건조기 내에 위치시키고 최대 진공을 가하였다. 최대 진공 수준에 도달했을 때(20Pa 하에서), 동결 건조기 안에서 바이알은 마개가 닫혔다. 보관 전에, 알루미늄 크림프(crimp)를 사용하여 바이알을 크림핑(crimping)하였다.
Figure pct00001
Figure pct00002
예시된 본 발명은 저렴하고, 보다 편리한 사용을 위한 크기 및 모양을 갖는 실질적으로 고형의 건조 접종물을 제공하는 것으로 이해될 것이다. 본 발명이 특정한 실시예를 참고로 하여 기술되었음에도 불구하고, 당업자는 본 발명이 다른 많은 형태로 구현될 수 있음을 이해할 것이다.

Claims (30)

  1. 동결보존 배지 및 미리 결정된 양의 접종 물질을 포함하는 고형의 건조 접종물로서, 실질적으로 디스크-모양을 갖는 접종물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 접종물이 볼록한 표면을 포함하는 접종물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 볼록한 표면이 대응하는 오목한 표면의 반대측에 있는 접종물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접종물이 미생물학적 접종 루프를 사용하여 용기들 간에 이의 이동이 원활하도록 하는 크기 및 모양을 갖는 접종물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접종물이 동결-건조된 접종물인 접종물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존 배지가 소혈청 알부민 및 젤라틴을 거의 등분(equal part)으로 포함하는 접종물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존 배지가 소혈청 알부민, 미오-이노시톨(myo-inositol), 소고기 추출물(beef extract), 세균학적 펩톤, 젤라틴, 활성탄 및 물을 포함하는 접종물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접종 물질이 세포인 접종물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 접종물이 약 108 개의 세포를 포함하는 접종물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접종 물질이 미생물인 접종물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 미생물이 세균 및 진균으로 구성된 군으로부터 선택되는 접종물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세균이 바실러스 세레우스(Bacillus cereus ); 바실러스 푸밀루스(B. pumilus ); 바실러스 서브틸리스(B. subtilis ); 박테로이데스 프래질리스(Bacteroides fragilis ); 브레분디모나스 디미누타( Brevundimonas diminuta); 보르데텔라 브론치셉티카( Bordetella bronchiseptica ); 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia ); 클로스트리디움 페르프린겐스( Clostridium perfringens); 클로스트리디움 스포로게네스(C. sporogenes ); 엔테로코쿠스 패칼리스( Enterococcus faecalis ); 엔테로코쿠스 히라에(E. hirae ); 에스케리치아 콜라이( Escherichia coli ); 게오바실러스 스테아로써모필루스( Geobacillus stearothermophilus); 클렙시엘라 뉴모니아( Klebsiella pneumonia ); 코쿠리아 리조필라( Kocuria rhizophila ); 락토바실러스 페르멘툼( Lactobacillus fermentum ); 리스테리아 모노사이토게네스( Listeria monocytogenes ); 마이크로코쿠스 루테우스( Micrococcus luteus ); 슈도모나스 에어루지노사( Pseudomonas aeruginosa ); 살모넬라 엔테리카 아종( Salmonella enterica subsp .); 쉬젤라 플렉스네리( Shigella flexneri); 스태필로코쿠스 아루레우스 아종( Staphylococcus aureus subsp .); 및 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로 구성된 군으로부터 선택되는 접종물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 진균이 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger ); 칸디다 알비칸스( Candida albicans ); 및 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)로 구성된 군으로부터 선택되는 접종물.
  14. a) 미리 결정된 양의 접종 물질을 포함하는 액체 동결보존 배지의 복수의 분취액을 표면에 위치시키는 단계;
    b) 복수의 고형의 건조 접종물을 수득하기 위해 상기 표면 상에서 각각의 상기 분취액을 건조시키는 단계; 및
    c) 상기 표면으로부터 상기 접종물을 회수하는 단계를 포함하는 고형의 건조 접종물을 제조하는 방법으로서, 각각의 상기 접종물이 실질적으로 디스크-모양을 갖는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 각각의 상기 접종물이 볼록한 표면을 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 볼록한 표면이 대응하는 오목한 표면의 반대측에 있는 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건조가 동결-건조에 의해 달성되는 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 분취액이 약 10㎕ 내지 약 100㎕의 부피를 갖는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 각각의 상기 분취액이 약 15㎕ 내지 약 60㎕의 부피를 갖는 방법.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면이 플라스틱 표면인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 표면이 폴리스티렌 표면인 방법.
  22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접종 물질이 세포인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 접종물이 약 108 개의 세포를 포함하는 방법.
  24. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접종 물질이 미생물인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 미생물이 세균 및 진균으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 세균이 바실러스 세레우스; 바실러스 푸밀루스; 바실러스 서브틸리스; 박테로이데스 프래질리스; 브레분디모나스 디미누타; 보르데텔라 브론치셉티카; 부르크홀데리아 세파시아; 클로스트리디움 페르프린겐스; 클로스트리디움 스포로게네스; 엔테로코쿠스 패칼리스; 엔테로코쿠스 히라에; 에스케리치아 콜라이; 게오바실러스 스테아로써모필루스; 클렙시엘라 뉴모니아; 코쿠리아 리조필라; 락토바실러스 페르멘툼; 리스테리아 모노사이토게네스; 마이크로코쿠스 루테우스; 슈도모나스 에어루지노사; 살모넬라 엔테리카 아종; 쉬젤라 플렉스네리; 스태필로코쿠스 아우레우스 아종; 및 스트렙토코쿠스 피오게네스로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 진균이 아스퍼질러스 니게르; 칸디다 알비칸스; 및 사카로마이세스 세레비시애로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  28. 제14항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 실질적으로 고형이고 실질적으로 건조된 접종물.
  29. 제1항 내지 제13항 또는 제28항 중 어느 한 항에 따른 실질적으로 고형이고 실질적으로 건조된 접종물을 포함하는 패키지.
  30. 비교 실시예를 제외하고, 상기 실시예들 중 하나 이상을 참고로 하여 본 명세서에 실질적으로 기술되어 있는 바와 같이, 제1항 또는 제28항에 따른 고형의 건조 접종물; 제14항에 따른 방법; 또는 제29항에 따른 패키지.
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