CN103096721A - 细菌菌株以及包含所述细菌菌株的生物杀线虫剂和植物生长刺激物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于植物病原线虫生物防治的新型杀线虫产品，包含苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株N11、莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)菌株SR11和巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)菌株ALo1三种新分离物，其分别以保藏号CECT-7665、CECT-7666和CECT-5856保藏在西班牙典型培养物保藏中心(CECT)，其具有抗此类型病原体的高拮抗能力，以及具有通过不同机理刺激植物生长的性质。本发明还涉及所述产品的液体和固体制剂，其在室温下具有良好的稳定性，且可有效对植物致病线虫进行生物防治和刺激植物的生长。

Description

细菌菌株以及包含所述细菌菌株的生物杀线虫剂和植物生长刺激物
技术领域
本发明的目的是在苗床、温床、温室和广义种植业中具有强杀线虫活性并进一步具有生根和植物生长刺激和生物施肥能力的液体或固体生物学制备物。所述制备物的微生物组分的新分离物，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株N11、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株SR11和巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)菌株ALo1，以及生产制剂的方法也是本发明的目的。 
背景技术
多年以前，人们已认识到开发和扩展用于综合生产和生态农业的方法在作为农业中滥用化学产品的替代物以降低后者有害作用方面的需要和重要性。使用微生物生物制备物进行病虫害的生物防治和经济作物的施肥使其成为此背景下最具发展前景的替代方法之一。此外，由于可由可再生资源产生，这些生物制备物对可持续农业模式具有重要作用(Altieri,1997)。 
植物的寄生线虫破坏大多数植物的根或气生部份，若不对这些生物体进行一些防治，几乎不可能保持经济上可行的农业。许多寄生线虫在根部完成它们的生命周期，并以根部为食(通常与植物相关)。一些是内寄生虫，即它们生活在根、块茎、嫩枝、种子等的内部并以其为食。其它是外寄生虫，它们从植物壁取食。少数物种对宿主高度专一，例如大豆中的大豆胞囊线虫(Heterodera glycinis)和马铃薯中的马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)，但大多数物种具有很广的宿主(Guerena,2006)。 
从根外取食的内寄生虫是重要的经济害虫，包括瘤形成线虫(根结线虫属(Meloidogyne))、包囊形成线虫(胞囊线虫属(Heterodera))和枯斑形成线虫(短体线虫属(Pratylenchus))。然而，从根外取食的大多数经济重要的外寄生虫尤其包括拟毛刺线虫属(Paratrichodorus)、毛刺线虫属(Trichodorus)、剑线虫属(Xiphinema)、长针线虫属(Longidorus)、拟长针线虫属(Paralongidorus)、小环线虫属(Criconemella)、矮化线虫属 (Tylenchorhynchus)、默林线虫属(Merlinius)、短体线虫属(Pratylenchus)、螺旋线虫属(Helicotylenchus)、盘旋线虫属(Rotylenchus)和盾线虫属(Scutellonema)的物种(Guerena,2006)。 
植物致病线虫的防治通常以预防为主。为此，解决此问题的最好方法是将彼此互补的不同策略组合。基于间接使用农用化学品、物理和栽培方法、利用生物防治以及保持多种作物和栽培种的生物多样性，Bridge(1996)提出了四种处理植物致病线虫的策略，这增加了对线虫的抗性和耐性。此作者表明，尽管全部研究与此主旨相关，但是对于可持续农业系统中线虫的防治，实际中仍有许多问题尚待解决。 
植物致病线虫与极其不同的微生物共存在根围中，由于起到一些生物防治作用，它们中的许多是后者的拮抗物(Sikora 1992)。线虫的生物防治涵盖了生活在土壤中的极其不同的生物，包括病毒、立克次氏体、细菌、食线虫真菌、原生动物和缓步类，以及捕食者例如涡虫、线虫、线蚓科、螨虫、跳虫和其它昆虫(Kerry，1995)。除上述之外，真菌和细菌显示出最强的作为生物防治剂的潜力(BCA)(Spiegel等,2005)。根据Mahdy，M.,2002，真菌包括例如节丛孢属(Arthrobotrys)、拟青霉属(Paecilomyces)和轮枝孢属(Verticillium)(或轮枝菌(Lecanicillium))(尤其是JP11246323；DE202005020816；CN1663394)；细菌特别包括例如Pasteuria penetran(EP0217378；EP1967068)、芽孢杆菌属(Bacillus)的一些菌株(EP1922931；EP1967068；US6004774；US5651965；US5378460；US5350577；Sela等,1998；Giannakou等,2004；Guo等,2008)和微变冢村氏菌(Tsukamurella paurometabolum)，且它们可用作有效的生物杀虫剂(EP2154121；Mena,2002)。 
大量的细菌已被用作不同作物中的生物防治剂，且其对线虫的防治具有很强潜力。长久以来，基于苏云金芽孢杆菌(Bt)的杀虫剂的使用局限于防治由小范围鳞翅目昆虫产生的害虫。然而，近些年，有证据表明这些杀虫剂对更大范围的害虫十分有效。例如，苏云金芽孢杆菌以色列亚种(B.thuringiensis subsp.israelensis)、苏云金芽孢杆菌莫氏亚种(B.thuringiensis subsp.morrisoni)等，目前它们已分别被用于防治双翅目昆虫和鞘翅目昆虫。最近有报道称，尽管特异且已知其变种，但是Cry蛋白对更广谱的昆虫有毒。目前已知不同的Bt菌株能够产生大于550种不同毒素，其中一些具有 杀线虫活性(Crickmore等,2009)。 
广泛用于线虫生物防治的策略是使用定殖根围的生物体，特别是细菌。这些微生物可以在根围中生长，因此它们形成保护根免受病原体侵扰的屏障，因此它们作为生物防治生物体通常很有效(Weller,1988)。根围菌具有定殖植物根的能力(Schroth和Hancock,1982)，因此它们对植物生长也具有有益作用。 
Sikora(1992)指出，甜菜、马铃薯和番茄根围细菌分离物中的7%至10%对形成包囊和瘤的线虫具有拮抗活性。Sikora和Hoffmann-Hergarten(1993)指出，植物促长根围菌(PGPR,plant growth-promoting rhizobacteria)对建立在寄生线虫和它们宿主植物之间的这种密切关系具有重要作用，其在寄生虫穿透入根的早期调节线虫的行为，这对作物产量及其重要。 
在1988年，Sikora发现枯草芽孢杆菌分离物能有效防治棉花和甜菜中的南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生中的花生根结线虫(M.arenaria)和棉花中的肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)。在1994年，Smith报道芽孢杆菌菌株23a降低番茄中爪哇根结线虫(M.javanica)的密度。荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株Pf1降低番茄根中南方根结线虫瘤和卵的数量(Santhi和Sivakumar,1995)。蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株S18也降低马铃薯中南方根结线虫的密度(Keuken,1996)。此外，Giannakou等,2004和Terefe等,2009表明基于坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)的产品Bionem在实验室、盆和田间条件下对根结线虫(Meloidogyne spp.)防治具有高活性。 
在引起植物疾病的生物体中，另一类重要的群体是植物致病真菌，其特别包括葡萄孢属(Botrytis)、腐霉属(Pythium)、丝核菌(Rhizoctonia)、交链孢属(Alternaria)、镰孢霉属(Fusarium)、疫霉属(Phytophthora)、根串珠霉属(Thielaviopsis)和葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)物种，它们可在土壤中存活许多年。 
这些病原体的生物防治现象用不同机理来阐释，例如特别是寄生、交叉保护、抗生作用、竞争和抗性诱导(Shoda,2000；Walsh等,2001)。 
研究最广泛的生态位(物种在生态系统中的亲缘位置)之一是根围，这是因为其中有植物和其它生物体之间建立的关系(Warrior,2000)。从20世纪80年代就已开始研究使用根围的微生物作为化学杀虫剂的可能替代物，以 防治大范围的病虫害。由于它们在土壤中的大量分布、它们定殖至植物根的能力以及产生多种有益化合物和大量病原体拮抗剂的能力，这些生物体十分适于病虫害的生物防治。(Anjaiah等,1998；Hill等,1994；Maurhofer等,1991；Rodriguez和Pfender.1997；Ross等,2000和Thomashow等,1997)。 
作为由微生物产生的病虫害的生物防治剂而被广泛研究的根围的微生物组包括由真菌组成的组。其已被成功用于防治属于葡萄孢属、镰孢霉属、腐霉属、疫霉属、丝核菌、核盘菌属(Sclerotinia)、青霉属(Penicillium)和壳球孢属(Macrophomina)等的致病真菌(特别是Whipps和Lumsden,2001；McQuilken等,2001；Jones和Whipps,2002)。考虑到它们不同的代谢，此微生物组能够产生用于生物防治的多种物质。为此，用于此目的的基于真菌的菌株和产物的数量正在变多且多样(特别是Cook等,1996；Whipps,1997；Fravel等,1998；EPA USA 2006；US 6,306,386和US 6,890,530)。 
也已广泛研究了用于病虫害生物防治的PGPR组。此类制剂的基本特点在于除了它们的保护作用，它们还具有定殖植物根的显著能力和高的植物生长刺激能力，这将保护作用与整体的作物健康改善相结合，因此植物也能够更好地抗病原体侵扰。此组制剂已被用于植物致病真菌引起的疾病中，所述植物致病真菌属于特别是丝核菌、镰孢霉属、腐霉属、根串珠霉属、青霉属、交链孢属和葡萄孢属(特别是Emmert和Handelsman,1999；Ligon等,2000；Cavaglieri等,2004；和Roberts等,2005；US 7,118,739；ES 2306600；WO 2008/113873)。 
假单胞属(Pseudomonas)已成为近些年众多研究的目标，这是因为其是根围中最具活性和优势的物种之一(Geels和Schippers,1983；de Freitas和Germida 1991；de la Cruz等,1992；Ligon等,2000；US 7,087,424)。此属成员产生与植物疾病降低和抑制密切相关的不同抗生素。在此现象中起主要作用的另一个因素是铁载体的产生，其通过供应铁来进一步参与植物生长。这种能力在假单胞属成员中很普遍。然而，此属在生长期间无法产生抗性结构，这在某种程度上限制了从此属的均株获得的生物学制备物的稳定性和功效。 
芽孢杆菌属因在此方面有很好的潜力也已被广泛研究。其主要特性包括：其普遍存在于任何类型的土壤中并兼具高耐热性、在液体培养基中快速生长以及形成能允许其长时间存活的抗性孢子。全部这些使得此属的菌 株极具成为生物防治剂的潜力。美国环境保护机构(EPA)已有登记为生物杀虫剂，特别是生物杀真菌剂的超过10种的此属不同物种的菌株(EPA2006)。通过此属的菌株进行植物致病真菌生物防治的主要机理还包括特别是产生抗生素、铁载体、表面活性剂和水解酶，如几丁质酶(特别是Utkhede,1984；Acea等,1988；Stanghellini和Miller 1996；Shoda 2000；Banat等,2000；Zhang等,2001；Ruiz-García等,2005；US 7,087,424和EP1647188；ES2306600；WO 2008/113873)。 
其它属的细菌也已作为生物防治剂研究，包括肠杆菌属(Enterobacter)、产碱菌属(Alcaligenes)、窄食单胞菌属(Stenotrophomonas)和链霉菌属(Streptomyces)(特别是McClure等,1998；Brewster等,1997；Sabaratnam和Traquair,2002；Cavaglieri等,2004)。 
此外，微生物对土壤营养物的循环和植物营养的重要性是众所周知的。它们主动参与到有机质降解和矿化以及土壤营养物的固定和释放中，这对保持植物生产率很重要。在土壤微生物和植物根之间建立的相互作用满足二者对重要营养物的需求。根直接受到其中微生物群落组成和密度的影响，这被称为“根围效应”(Atlas,R.M.和Bartha,R.,1993)。数年前已知进行用促进植物生长的微生物来接种植物的实践(US 570,813)。 
在此现象中具有显著重要性的微生物组是参与到植物无法获取的磷源中磷溶解的微生物(Kucey等,1989)。许多微生物能够同化来自土壤的不溶性磷，以植物可利用的可溶性磷酸盐的形式部分释放，以此来促进植物营养(Chabot等,1993)。普遍接受的是，土壤中磷酸盐的溶解是因为产生有机酸和螯合来自糖的含氧酸(Leyval和Barthelin 1989；Deubel和Gransee 1996；Yadav和Dadarwal,1997)。目前的方法在施肥中使用溶磷微生物(特别是US.5,912,398；ES 2234417；WO 2009/027544)。 
肠杆菌属和泛菌属(Pantoea)已被用于农业中，其作为磷酸盐增溶剂且保护免受植物病害(特别是Gyaneshwar等,1999；EP1116632和EP1174030；ES 2149131；ES 2234417；WO 2009/027544)。芽孢杆菌属也已被广泛用于植物生长刺激和磷酸盐的溶解中(特别是RO 120556；CN 101439993；WO2009/070966)。 
实践中起重要作用的另一方面是使用固定大气氮的根围微生物。此实践也已知多年(US.1,212,196)。大量微生物已被用于此功能，包括特别是根 瘤菌属(Rhizobium)、固氮菌属(Azotobacter)和固氮螺菌属(Azospirillum)的细菌(ES 2093559；US 5,951,978；ES 2234417；WO 2009/027544)以及酿酒酵母(Saccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)(US 6,596,273)和曲霉属(Aspergillus)(US 4,670,037)的真菌。 
在20世纪70年代，在巴西进行的一些实验确定了由不同微生物固定的N2对植物的显著作用，其中重要的属是固氮螺菌属(特别是 
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和Day，1976；Neyra和 
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1977)。在巴西，随后在甘蔗中对生物固氮(BNF)的定量研究表明约65%的总积累N2来自BNF，这表示约150kg N2x公倾-1 x 年-1，这使得推荐最大程度降低含氮肥料的使用 
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1989；Urquiaga和 1990)。 
Bashan等(1990)指出不仅氮是参与固氮螺菌属-植物关系的主要元素，而且磷和钾也在此关系中发挥主要作用，由此可知，无论使用何种菌株，由植物摄入的矿物质将呈现数量的变化，显著增产一些作物。 
必须指出，许多作者同时认为，由接种微生物带来的对植物生长的有益作用不仅是因为磷酸盐的增溶或生物固氮。例如特别是植物激素和铁载体的产生、1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的活性等机理也显著导致此效果(特别是Datta等,1992；Chabot等,1993；Deubel和Gransee 1995；Frietas等,1997；El-Khawas等,1998；Cassán等,2001)。 
已在生物固氮和磷酸盐增溶中成功进行固氮螺菌属和芽孢杆菌属的联合开发，其显示两个属之间不存在不相容，且由于代谢调节机制不同，它们可在给定的生态系统中发挥不同功能(Sukumar,2001；El-Komy,H.M.2005；Tabrizi等,2008)。具有不同代谢能力的土壤微生物的混合培养物彼此之间以及与植物之间可以发展出协作关系，使得植物的营养物吸收更为有效，且它们可以进一步产生植物生长刺激物质，增加作物的产率，并保护作物免受致病微生物侵扰。在尝试获得两种微生物的益处时，已成功获得表达芽孢杆菌毒素的固氮螺菌属的菌株(Goundera和Rajendrana 2001)，虽然目前对开放转基因生物(GMOs)的法律限制尚不允许大量引入此类型的菌株。 
目前用微生物接种植物的趋势意在使用增加以下现象的混合培养物(也称为“consortia”)，例如特别是保护免受致病生物体产生的疾病的侵扰、增加通过根来吸收磷的效率、生物固氮、通过产生植物生长调节物质和铁 载体进行植物生长刺激(ES 2093559；EP1166632；US 5,147,441；US6,277,167和US 6,596,273；WO 00/51435)。此实践已显示出在生物施肥中最有效。其它背景可参见US 5,071,4623、US 5,578,486、WO93/19604、WO00/73244、WO 00/64837、WO 02/20431、WO 02/070436。此外，具有生物杀线虫活性的苏云金芽孢杆菌的菌株描述在文献US 5,378,460和WO99/09819中。 
对于生物防治而言十分重要的方面是使用不同防治剂的混合物或组合物，特别是当它们具有可最终互补的不同的作用机制。事实上，在实践中此现象自然发生，因此其应用很有益处。微生物的这些组合大体上表明，将植物生长促进和营养的效果与不同病虫害的抑制或抵制效果相结合可产生更高功效，因此对于它们在农业上应用，它们表现出是一种高潜力的备选方案。然而，重要的是考虑此类产品的制备，即混合物中没有组分会对另一种组分产生抑制作用，或没有组分会过度干扰生态系统的正常微生物群落(Whipps,2000)。在此类生物产品制备中一个最重要的问题是获得从生产和配方的实际角度而言可行的技术。 
发明内容
本发明的目的是在苗床、温床、温室和广义种植业中具有强杀线虫活性并进一步具有生根和植物生长促进和生物施肥能力的液体或固体生物学制备物。该产品由微生物制备物组成，其包含本发明作者分离的新分离物苏云金芽孢杆菌菌株N11、莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)菌株SR11和巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)菌株ALo1的细胞。所述微生物保藏在西班牙典型培养物保藏中心(CECT)，保藏号分别为CECT-7665、CECT-7666和CECT-5856，保藏日分别为2010年1月14日、2010年1月26日和2003年12月3日。细菌由作者鉴定，并进一步要求CECT鉴定，它们的特征得到确认。所述制备物由细菌细胞形成的液体或固体产品组成，并进一步包含必要组分以确保它们在储存期间、以及在环境中和在植物处理中应用后的活力。所述制备物是由苏云金芽孢杆菌菌株N11(对植物致病线虫具有高拮抗能力)、莫海威芽孢杆菌菌株SR11(对植物致病线虫的拮抗活性具有协同作用，且对土壤中磷酸盐和其它矿物质的溶解具有重要功效，以及能够产生植物生长刺激物质)形成的微生物同生群，并进一步包含巴西固氮螺菌菌株ALo1(具有高产植物生长促进物质能力的环境固氮剂)。所述同生群(consortium)具有高杀线虫能力，并进一步表现出生根和植物生长促进活性，且其是优异的植物健康增强剂。 
微生物苏云金芽孢杆菌N11(CECT-7665)是本发明的另一目的。其使用这样的方法获得，所述方法将固体培养基分离与通过顺序筛选过程进行的选择(在用于确定不同酶活性的琼脂培养基中生长)相结合。随后基于在平板上它们杀卵的能力和在体外黄瓜中抑制瘤形成来确定它们在抗2型南方根结线虫的生物分析中的杀线虫能力。菌株N11进一步具有增溶土壤中磷酸盐和其它矿物质的能力，其通过在固体培养基中的培养物和确定搅拌液体培养基中溶解的PO4 3-来说明(在两种情况下使用Ca3PO4作为单独的磷源)。HPLC分析和昆虫中的生物分析表明苏云金芽孢杆菌菌株N11不产生β-外毒素。所述菌株能够降解卵磷脂以及胶原。 
本发明的另一个目的是微生物莫海威芽孢杆菌SR11(CECT-7666)。其使用这样方法获得，所述方法将在含1N Tris HCl pH 8缓冲液的琼脂培养基中通过琼脂清除面积进行的分离(Gyaneshwar等,1999)与通过确定搅拌液体培养基中溶解的PO4 3-进行的选择(Nautiyal 1999)相结合(在两种情况下使用Ca3PO4作为单独的磷源)。环境固氮能力通过将所述菌株在不含氮的半固体NFb培养基上培养来建立(Kreig和 
Figure BDA00002328302600081
1984)。1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的存在通过使用1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)作为单一氮源在固体培养基上的生长来验证(Penrose 2001)。 
微生物巴西固氮螺菌ALo1(CECT 5856)也是本发明的一个目的。其通过这样方法获得，所述方法将在半固体NFb培养基中的分离(Kreig and 
Figure BDA00002328302600082
1984)与通过其植物生长刺激能力以及产生生长素和其它植物激素的能力进行的选择相结合。其通过这些生物分析验证，菌株ALo1具有与其它分析的分离物相比更高的植物生长刺激作用。吲哚-3-乙酸(IAA)的产生通过比色法(Pilet和Chollet 1970)和HPLC法(Olivella等,2001)来验证，且也检测到细胞分裂素类型的其它植物激素的存在。在200mg x L-1色氨酸中，IAA的产生实现此氨基酸的100-180mg x mL-1的浓度和多至90%的转化百分比。此菌株中存在的1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的活性通过使用1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)作为单一氮源在培养基上的生长来验证(Penrose2001)。 
根据Bashan等,1986、Fernández 1995和Bashan 1998所述的方法，通 过实验室和温室生物分析来验证生物杀线虫剂对植物生长的刺激能力。 
本发明专利的另一个目的是制备上述制备物中所用的菌株和培养肉汤的方法，其由四个步骤组成： 
·使浸入培养物中的菌株N11在特定培养基中增殖，所述培养基刺激孢子形成以及产生蛋白水解酶和几丁质水解酶的能力，且在发酵结束时在其组分中包含高杀虫活性。 
·使菌株SR11在培养基中增殖，所述培养基刺激孢子形成以及产生表面活性剂物质的能力，且在发酵结束时在其组分中包含杀真菌活性以及生根和植物生长刺激能力。 
·使菌株ALo1在基于天然物质和矿物盐的培养基中增殖，其中进一步产生高浓度的生根和植物生长促进物质。 
·按比例最终混合这三种发酵肉汤，其获得这样的液体，所述液体具有高细胞浓度(大于109菌落形成单位(CFU)x mL-1)和抗植物致病线虫的强杀虫活性，以及显著的生根和植物生长刺激能力，且十分有助于植物的健康和营养。 
获得制剂的方法也是本发明的目的，其由以下步骤组成： 
液体制剂： 
·将壳聚糖溶液按比例加入至前述方法获得的液体中，使其终浓度为0.1-1%，搅拌直至完全溶解。由此配制的产品具有在室温下不小于6个月的稳定性。 
固体制剂中的细胞固定： 
·将以下组分通过连续搅拌加入到通过制备菌株和培养肉汤的方法获得的液体中： 
脱脂奶      1-3% 
蔗糖        2-4% 
麦芽糊精    3-5% 
·连续搅拌1小时，使得不同组分之间相互作用，随后将其加入至喷雾干燥器以进行干燥过程，直至终湿度为4-6%。 
通过喷雾干燥的方法进行的包封此组合物的方法能够保证产品不小于1年的稳定性并有助于其应用。作者已成功使用这些方法形成用于生物防治和生物施肥的其它微生物制剂。 
附图说明
图1显示了在限菌培养中黄瓜幼苗的生物分析。 
图2说明了在培养室中番茄植物皿中的生物分析。 
图3和4显示用生物杀虫剂处理的西瓜植物(图3)和未处理的对照植物(图4)进行的测定的实例。 
图5和6说明用生物杀虫剂处理的番茄植物(图5)和未处理的对照植物(图6)进行的肉眼测定的实例。 
图7和8说明用生物杀虫剂处理的黄瓜植物(图7)和未处理的对照植物(图8)进行的肉眼测定的实例。 
图9和10说明用生物杀虫剂处理的花椰菜植物(图9)和用Vydate处理的植物(图10)进行的肉眼测定的实例。 
图11显示反映所述不同处理方法之间比较的三维图。 
具体实施方式
将获得的液体产品通过体外生物分析以及在生产条件下的实验温室和田间分析来进行不同的评估。所述评估的结果显示如下。 
首先，为了使用琼脂中黄瓜幼苗的限菌培养进行生物分析，进行体外分析以确定对根结线虫属寄生线虫的拮抗能力(Fernández 2004)。方法总结如下： 
生物分析物的制备
将黄瓜种子(商购的品种Marketmore 76)在5%次氯酸钠溶液中浸润3分钟。随后将它们用过量无菌蒸馏水清洗。随后将他们置于湿室中，萌发72小时。将萌发的种子转移至包含30mL营养琼脂溶液(Hoffland等,1989)的60mL锥形底塑料管(3x9cm)中，并随后置于培养室中(25°C，湿度80%，光周期包括16小时光照和8小时黑暗)。一旦出现第一片真叶，将植物用待分析的产品处理。 
处理
进行两类处理：将植物用年轻和成年根结线虫及其卵的混合接种物感染，并随后用产品处理，反之亦然(即首先处理植物，随后用线虫感染)。在 两类处理中，一次接种和下次之间的时间间隔为24小时。 
感染接种物的制备
制备混合感染的接种物，以对基于不同时期的病原体生物周期的拮抗能力进行选择。从2型南方根结线虫感染的番茄植物(表现出很多疾病症状)上取一些根，提取瘤并用流水清洗，随后将它们用含尽可能少量水的手动浆式搅拌机轻微破碎。使用含不同生理周期病原体的此悬液感染植物。每个处理通过至少5个管来进行分析。 
拮抗能力的测定
在接种后10日，评估用产品处理的感染幼苗的根中和未处理对照中瘤的形成。相对于对照，感染管有至少50%降低，由此认为已有杀线虫活性。在所进行的多次重复中，所分析产品对瘤形成抑制的有效性是80-100%。 
图1显示了在生物分析期间黄瓜幼苗的照片。在此图的中下方可观察到根中形成的瘤。 
琼脂中限菌培养的生物分析
随后，使用来自苗床的番茄植物进行体外生物分析。进行此步骤以确认在之前生物分析(另一个培养物且条件更实际)中所获得的结果。此生物分析由以下组成： 
生物分析物的制备
从苗床取番茄植物(Raf品种)，并将根浸润在感染接种物中过夜。随后将它们移植至44x27x7cm皿中，所述皿包含之前已灭菌的蛭石作为底材，并已添加营养性Hoagland溶液(Hoagland和Arnon 1950)。随后将它们用灌入皿的细菌接种物处理。随后将植物置于培养室(25°C，湿度80%，光周期包括16小时光照和8小时黑暗，持续15天)中。 
感染接种物的制备
类似于管中的生物分析，制备混合的感染接种物，以对基于不同生理时期的病原体生物周期的拮抗能力进行选择。从2型南方根结线虫感染的 番茄植物(表现出很多疾病症状)上取一些根，提取瘤并用流水清洗，随后将它们用含尽可能少量水的手动浆式搅拌机轻微破碎。 
拮抗能力的测定
在接种后15日，评估被不同分离物感染并处理的植物根中以及未处理对照中形成的瘤数量。相对于对照，有至少50%降低，由此认为已有杀线虫活性。 
如图2所示，皿中培养能够使害虫更好发育，这能够更好形成瘤以及更精确评估分离物和所制备产品的杀线虫活性。 
在使用蛭石作为底材的皿中的植物生物分析
在筛选过程末期选择芽孢杆菌属两个菌株(N11和SR11)的混合物，假定其比单独的任一种分离物具有更好结果。 
将菌株ALo1加入到由此制备的产品(假定其具有强植物生长刺激活性)中，以显著改善植物健康并增强其对致病生物体袭击的抵抗。 
植物生长刺激生物分析
为了确定植物生长刺激能力，在实验温室中进行生物分析，以确定产品对商业上感兴趣的不同作物的作用。此类分析在不同体积的盆和植物盒中进行。 
确定绿色组织或气生部分的鲜重以及根的鲜重以作为评价标准。 
对于所制备产品的生根和植物生长刺激能力，这些生物分析的结果大体上是很好的。表1显示对于液体生物杀线虫制剂，在莴苣培养中获得的结果。可见，相对于对照，全部处理刺激生物生长和生根。在全部分析的处理中，结果最好的是生物杀线虫产品。在所分析的不同培养物中重复了这些结果。 
Figure BDA00002328302600131
图表1 
在莴苣植物中不同菌株和生物杀线虫剂的生物分析 
田间分析 
滴灌分析 
分析的综合信息 
Figure BDA00002328302600132
生物杀虫剂数据 
施用数据 
表面相关数据 
    分析01   分析02   分析03
  对照表面积(m2)   300m2   2,000m2   1000m2
  处理的土地表面(m2)   300m2   2,000m2   1000m2
课题分组(thesis)相关数据 
分析01 
Figure BDA00002328302600142
分析02 
Figure BDA00002328302600143
分析03 
Figure BDA00002328302600144
分析中所用的设计分析中课题分组的分布 
分析使用如下随机分布进行： 
  对照土地   处理的土地
确定相关数据功效 
评估、描述和方法：取土壤样品以确定线虫种群的发展，并分析这些不同课题分组的植物的大致外观。 
结果： 
分析01： 
从所进行的测定中可观察到(图3和4)在以下两组之间具有显著差异；在对照土地中，植物的活力和颜色丧失，叶片质量较小，这是对照植物与施用生物杀虫剂的植物的差异，后者生长更好且颜色更绿。这大致表明产品的植物生长刺激特征。 
表1.线虫分析结果的总结 
表2：两种课题分组的差异 
Figure BDA00002328302600152
短体线虫属和矮化线虫属的寄生虫占优势。 
从表1和2可推知，大体上线虫数量和植物病原体(特别是每次被防治的害虫)数量显著降低。这也对应于植物的大致外观。表明所述产品不仅是有效的生物杀线虫剂，而且通过刺激植物生长使得植物更健康且抗病原体侵扰。 
分析02： 
从肉眼测定中可观察到(图5和6)在以下两组之间具有显著差异；在对照中植物的活力和颜色丧失，叶片质量较小，这与使用生物杀虫剂的植物不同，后者生长更好且颜色更绿。这也表明了产品对于刺激植物生长的能力。 
表3：分析结果的总结 
    总数   寄生虫   寄生虫数
  初始18/06/09   7.700   2.880   4,813
  对照29/07/09   7.460   3.879   3,584
  生物杀虫剂29/07/09   980   231   749
  降低率%   87%   94%   79%
短体线虫属和矮化线虫属的寄生虫占优势。 
在此分析中，还观察到线虫种群的大幅降低以及良好的植物生长刺激，这对害虫的防治十分有效，参见表3。 
分析03： 
与之前情况不同，这两种之间的显著差异可由肉眼确定(图7和8)。用生物杀虫剂处理的植物具有更高的叶片质量，且其外观大体比对照植物更健康。后者的根系统发育很差，且在照片6中，清楚的观察到线虫的侵扰，这与处理的植物不同，处理的植物具有更高的根质量，且大量存在次生根和吸收根，这确认了产品的杀线虫和植物生长刺激特性。 
也可以观察到大体上线虫和特别是植物病原体的显著减少，与之前分析类似，这证实了生物杀虫剂产品的杀线虫能力。特别地，在此分析中， 考虑到根结线虫属的存在，除了杀线虫分析外，在图7中能观察到缺少被此属感染的瘤特征，这与图8不同，在图8中未处理植物中可清楚观察到此类瘤，这表明生物杀虫剂防治植物致病线虫的能力。 
表4：分析结果的总结 
    总数   寄生虫   寄生虫数
  初始2/07/09   2080   520   1560
  对照17/09/09   1580   758   822
  生物杀虫剂17/09/09   860   0   860
  降低率%   58%   100%   45%
根结线虫属和短体线虫属的寄生虫占优势。 
漫灌分析 
分析的综合信息 
  作物/变种  花椰菜
  学名  Brassica oleracea L
  条件  室外
  灌溉系统  漫灌
  土壤类型  砂壤土
  种植日期  25/09/09
  种植模式  0.65m x 0.50m
  种植密度  28,000植物/公顷
生物杀虫剂数据 
Figure BDA00002328302600171
参比杀线虫产品数据 
Vydate:10% 草氨酰 w/v SL 
施用数据 
Figure BDA00002328302600172
Figure BDA00002328302600181
表面相关数据 
  对照表面积(m2)   1000m2
  生物杀虫剂处理的土地表面(m2)   4000m2
  10%草氨酰处理的土地表面(m2)   5000m2
课题分组相关数据 
Figure BDA00002328302600182
分析中所用的设计分析中课题分组的分布 
分析使用如下随机分布进行： 
Figure BDA00002328302600183
确定相关数据功效 
评估、描述和方法：取土壤样品以确定线虫种群的发展，并分析不同课题分组的植物的大致外观。 
结果： 
从表5中可观察到，在施用30l/公顷生物杀虫剂后，与初始分析相比， 在全部情况中可见线虫数量的降低大于80%，同时Vydate施用减少大于60%。这表明生物杀虫剂在线虫防治中很有效且甚至优于参比化学产品，这说明在所用的培养和分析条件中，基于本土菌株N11、SR11和ALo1制备的液体产品对防治植物致病线虫(至少是展现的属)十分有效。 
表5.线虫分析结果的总结 
    总数   植物病原体   植物病原体数量
  初始06/10/09   7910   3116   4794
  生物杀虫剂01/12/09   1360   501   859
  生物杀虫剂降低率%   82   84   82
  VYDATE 01/12/09   2870   1241   1489
  VYDATE降低率%   64   60   69
短体线虫属、茎线虫属(Ditylenchus)和矮化线虫属的寄生虫占优势。 
此外，进行不同课题分组的肉眼确定，观察不同课题分组之间的差异。相对于用生物杀虫剂处理的植物(类似于用VYDATE处理的植物)，在对照土地中，观察到活力和颜色的显著差异以及较小的叶片质量。在至少两个土地中，植物的生长较好且它们具有更好的外观颜色和叶片质量。从图9和10中的照片可见，这些处理之间无显著差异。 
在收获日，对每个课题分组的50片花椰菜进行称重，以观察可能的质量差异。结果显示在图11中。 
如图11可见，相比于对照土地，在已施用杀线虫剂的土地产量有重要差异。 
在所进行的全部分析中也进行植物毒性的测定： 
在每个课题分组的全部表面上进行测定，记录施用后制剂对植物的可能毒性。 
所述制剂的课题分组特别引人关注。 
观察到植物在周期发育中无任何变化(生长抑制或失败、音位变化(phonological modification)、没有开花或结果、某些器官的无表型等)。 
定性和定量地观察是否变化存在于大量作物中。 
尝试检测形态学变形(卷曲、萎缩、延伸、冠大小或体积变化、萎蔫等)。 
毒性比例% 
  比例值   受感染表面   植物中观察到的症状
  0   0   无植物毒性
  1   0至5%   植物毒性开始，至多5%的面积
  2   5至10%   出现植物毒性，受感染面积的5至10%
  3   10至25%   中等侵扰，受感染面积的10至25%
  4   25至50%   强侵扰，受感染面积的25至50%
  5   50至75%   很强侵扰，受感染面积的50至75%
  6   75至100%   叶片完全感染，100%感染
结果
在所进行分析的任何处理植物中无植物中毒现象。 
结论
在使用本发明生物杀虫剂对不同培养物进行的功效测试中(以滴灌和漫灌进行分析，剂量30L/公顷)，表明产品能防治植物病原线虫，使线虫在土壤和植物根的浓度显著降低70-90%数量级(相对于未处理的对照，且大于花椰菜分析的情况中所使用的参比化学品)。在后一分析中，在对照植物中可见虫瘿的存在，这与施用杀线虫剂的课题分组不同。 
在肉眼测定中可观察到两种课题分组之间的显著差异；在对照中，对照植物的活力和颜色丧失，以及叶片质量较小，且根体系发育较差，其说明了植物致病线虫的活性，这与施用杀线虫剂且特别是生物杀线虫剂的植物不同，后者在第一次施用后数天就已观察到生长更旺盛且颜色更绿，其贯穿于各个情况的整个分析中。这大致表明产品的植物生长刺激特征。 
在所进行的任一分析中未观察到植物毒性；相反，产品的效果与植物健康的整体改进相关。 

Claims (15)

1.苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的菌株N11的纯培养物，其特征在于具有高杀线虫活性以及胶原酶活性，不产生β-外毒素且具有溶解磷酸盐的能力，保藏于西班牙典型培养物保藏中心(CECT)，保藏号为CECT-7665。
2.莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)的菌株SR11的纯培养物，其特征在于其溶解土壤磷酸盐和刺激植物生长的能力，能够产生吲哚-3-乙酸且能够在1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)作为单一氮源下生长，所述菌株保藏在CECT，保藏号为CECT-7666。
3.巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)的菌株ALo1的纯培养物，其特征在于以70%-90%的转化百分比转化添加于培养基中的色氨酸产生吲哚-3-乙酸，产生铁载体和其它植物生长调节物质，以及大气固氮，具有在1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)作为单一氮源下生长的能力，所述菌株保藏在西班牙典型培养物保藏中心(CECT)，保藏号为CECT-5856。
4.生物杀线虫剂和植物生长刺激物的生物学制备物，其特征在于包含苏云金芽孢杆菌菌株N11(CECT-7665)、莫海威芽孢杆菌菌株SR11(CECT-7666)和巴西固氮螺菌菌株ALo1(CECT-5 856)。
5.权利要求4的生物杀线虫剂和植物生长刺激物的生物学制备物，其特征在于所述微生物细胞通过一或多种浸没发酵方法获得，其中达到大于109CFU/mL的细胞浓度。
6.权利要求4或5的生物杀线虫剂和植物生长刺激物的生物学制备物，其特征在于包含合适比例的所述三种细菌的活细胞，以达到液体制剂中最终总浓度大于109CFU/mL。
7.权利要求4或5的生物杀线虫剂和植物生长刺激物的生物学制备物，其特征在于包含合适比例的所述三种细菌的活细胞，以达到固体制剂中最终总浓度大于1010CFU/mL。
8.权利要求4至7中任一项的生物杀线虫剂和植物生长刺激物的生物学制备物，其特征在于除了包含所述活细胞，还包含有机质和具有杀虫活性的其它物质以及植物生长调节物质。
9.权利要求6的生物杀线虫剂和植物生长刺激物的生物学制备物，其特征在于其在室温下具有长达6个月的稳定性。
10.权利要求9的生物杀线虫剂和植物生长刺激物的生物学制备物，其特征在于所述稳定性通过使用微生物生长抑制物质来确保。
11.权利要求7的生物杀线虫剂和植物生长刺激物的生物学制备物，其特征在于其在室温下具有长达1年的稳定性。
12.权利要求11的生物杀线虫剂和植物生长刺激物的生物学制备物，其特征在于所述稳定性通过使用细胞活力保护物质的喷雾干燥方法来确保。
13.权利要求7、11和12中任一项的生物杀线虫剂和植物生长刺激物的生物学制备物，其特征在于所述细胞活力保护物质为脱脂奶粉、麦芽糊精和蔗糖，且所述稳定性通过使用细胞活力保护物质的喷雾干燥方法来确保。
14.权利要求7、11和12中任一项的生物杀线虫剂和植物生长刺激物的生物学制备物，其特征在于所述保护物质的浓度为：脱脂奶粉1-3%、麦芽糊精3-5%和蔗糖2-4%，且所述稳定性通过使用细胞活力保护物质的喷雾干燥方法来确保。
15.权利要求4-14中任一项的生物杀线虫剂和植物生长刺激物的生物学制备物，其特征在于当以滴灌和漫灌施用时，其均呈现高活性。
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