ES2378040A1 - Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal y cultivos puros de las cepas denominadas n11, sr11 y alo1, contenidas en el mismo. - Google Patents

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Abstract

Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal y cultivos puros de las cepas denominadas N11, SR11 y ALo1, contenidas en el mismo.Esta invención se refiere a un nuevo producto nematicida para el control biológico de nematodos fitopatógenos que contiene tres nuevos aislados de Bacillus thuringiensis cepa N11, Bacillus mojavensis cepa SR11 y Azospirillum brasilense cepa ALo1, depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con las denominaciones CECT-7665, CECT-7666 y CECT-5856 respectivamente, las cuales poseen una elevada capacidad antagonista frente a este tipo de patógenos, así como la propiedad de estimular el crecimiento vegetal por diferentes mecanismos. La invención también se refiere a los formulados líquido y sólido del producto que poseen una buena estabilidad a temperatura ambiente y que resultan efectivos en el control biológico de nematodos fitopatógenos y para la estimulación del crecimiento de plantas.

Description

Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal y cultivos puros de las cepas denominadas N_{11}, SR_{11} y ALo_{1}, contenidas en el mismo.
Objeto de la invención
El objeto de la presente invención es un preparado biológico, líquido o sólido, que presenta una potente actividad nematicida y que posee además capacidad para la biofertilización y la estimulación del crecimiento vegetal y el enraizamiento, tanto en semilleros, como en viveros, invernaderos y producción vegetal en general. También constituye objeto de esta invención, los nuevos aislados de los microorganismos componentes del preparado, Bacillus thuringiensis cepa N_{11}, Bacillus subtilis cepa SR_{11} y Azospirillum brasilense cepa ALo_{1}, así como el procedimiento de producción de los formulados.
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Estado actual de la técnica
Desde hace años, ha sido reconocida la necesidad e importancia de desarrollar y ampliar los procedimientos de Producción Integrada y de Agricultura Ecológica, como alternativa al uso indiscriminado de productos químicos en la agricultura, para reducir los efectos nocivos de estos últimos. El uso de biopreparados microbianos, tanto para el control biológico de plagas y enfermedades como para la fertilización de cultivos de interés comercial, se presenta como una de las alternativas más prometedoras dentro de este contexto. Además, estos biopreparados desempeñan un importante papel en los modelos de agricultura sostenible debido a la posibilidad de producirse a partir de recursos renovables (Altieri, 1997).
Los nematodos parásitos de plantas atacan las raíces o la parte aérea de la mayoría de los cultivos, de modo que es prácticamente imposible mantener una agricultura, económicamente viable, sin algún tipo de control sobre estos organismos. Muchos de ellos desarrollan su ciclo de vida en la zona de las raíces, y se alimentan de éstas, encontrándose en general en asociación con las plantas. Algunos son endoparásitos, es decir que viven y se alimentan en el interior de las raíces, los tubérculos, los brotes, las semillas etc. Otros son ectoparásitos y se alimentan de las paredes de las plantas. Unas pocas especies son sumamente específicas del hospedero, como en el caso de Heterodera glycinis en la soja y Globodera rostochiensis en la patata, pero en general tienen un amplio rango de hospederos (Guerena, 2006).
Entre los nematodos endoparásitos que se alimentan de las raíces, que constituyen plagas de gran importancia económica, se hallan los formadores de nódulos (especies de Meloidogyne), los formadores de quistes (especies de Heterodera), y los de lesiones radicales (especies de Pratylenchus). Mientras que entre los ectoparásitos de mayor importancia económica que se alimentan de las raíces se encuentran especies de los géneros Paratrichodorus, Trichodorus, Xiphinema, Longidorus, Paralongidorus, Criconemella, Tylenchorhynchus, Merlinius, Pratylenchus, Helicotylenchus, Rotylenchus y Scutellonema entre otros (Guerena, 2006).
El control de nematodos fitopatógenos es en sentido general una actividad, preventiva. Por tal razón, la mejor vía para abordar este problema es mediante la combinación de diferentes estrategias complementarias entre sí. Bridge (1996), propone cuatro estrategias para el manejo de nematodos fitopatógenos basado en el uso no directo de agroquímicos, métodos culturales y físicos, uso del control biológico y mantenimiento de la biodiversidad de los múltiples cultivos y cultivares que incrementan la resistencia o tolerancia de los nematodos. Este mismo autor reconoce que a pesar de todos los estudios relacionados con este tema, aún no se tienen todas las respuestas en la práctica para el control de nematodos en sistemas agrícolas sustentables.
Los nematodos fitopatógenos coexisten en la rizosfera con gran diversidad de microorganismos, muchos de los cuales son antagonistas de estos, ya que ejercen algún tipo de control biológico (Sikora 1992). El control biológico de nematodos abarca una gran diversidad de organismos que viven en el suelo, que incluyen virus, rickettsias, bacterias, hongos nematófagos, protozoos y tardígrados, también depredadores como turbelarios, nematodos, enchitridos, ácaros, collembolos y otros insectos (Kerry, 1995). Dentro de ellos, los hongos y las bacterias muestran las mayores potencialidades como agentes de control biológico (ACB) (Spiegel et al, 2005). Según Mahdy, M., 2002 Entre los hongos encontramos especies tales como Arthrobotrys, Paecilomyces, y Verticillium (o Lecanicillium) (JP11246323, DE202005020816, CN1663394 entre muchas otras), mientras que entre las bacterias se destaca Pasteuria penetran (EP0217378, EP1967068), varias cepas de Bacillus (EP1922931, EP1967068, US6004774, US5651965, US5378460, US5350577 Sela et al. 1998, Giannakou, et al. 2004, Guo et al. 2008) y Tsukamurella paurometabolum con posibilidades de ser empleadas como eficaces bioplaguicidas (EP2154121, Mena, 2002).
Un gran número de bacterias han sido utilizadas como agentes de control biológico en diversos cultivos y tienen gran potencial para el control de nematodos. Durante años, el uso de plaguicidas a base de Bacillus thuringiensis (Bt) estuvo limitado a combatir plagas producidas por un estrecho rango de insectos lepidópteros. Sin embargo, en los últimos años se ha puesto en evidencia que estos plaguicidas son muy efectivos para un rango mucho más amplio de plagas. Tal es el caso de especies como B. thuringiensis subsp. israelensis, B. thuringiensis subsp. morrisoni, y otras, que son utilizadas en la actualidad para el control de insectos dípteros y coleópteros respectivamente. Más recientemente se ha informado que las proteínas Cry, aunque específicas y dada su variedad, resultan tóxicas a un espectro mucho más amplio de insectos. En la actualidad se sabe que las diferentes cepas de Bt son capaces de producir más de 550 toxinas diferentes, de las cuales, algunas poseen actividad nematicida (Crickmore y et al. 2009).
Una estrategia muy utilizada para el control biológico de nematodos es el empleo de organismos que colonizan la rizosfera y en particular las bacterias. Estos microorganismos pueden crecer en la rizosfera por lo que constituyen una barrera defensiva para las raíces contra el ataque de patógenos, por lo que en general resultan muy efectivos como organismos de control biológico (Weller, 1988). Las rizobacterias tienen la habilidad de colonizar las raíces de las plantas (Schroth y Hancock, 1982) y tienen también un efecto positivo sobre el crecimiento de las plantas.
Sikora (1992) señaló que entre el 7 y el 10% de los aislados bacterianos de la rizosfera de remolacha azucarera, patata y tomate posee actividad antagonista contra nematodos formadores de quistes y nódulos. Sikora y Hoffmann-Hergarten (1993) señalaron que las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR, por sus siglas en inglés) poseen una importante influencia en la relación íntima que se establece entre los nematodos parásitos y sus plantas hospederas, regulando el comportamiento de los nematodos durante la fase más temprana de penetración del parásito en la raíz, lo cual es extremadamente importante para el rendimiento de la cosecha.
Sikora en 1988 encontró que un aislado de Bacillus subtilis resultó efectivo en el control de Meloidogyne incognita en algodón y remolacha azucarera, M. arenaria en cacahuetes y Rotylenchulus reniformis en algodón. Smith en 1994 informó que Bacillus sp. Cepa 23a redujo la densidad de M. javanica en tomate. Pseudomonas fluorescens cepa Pf1 reduce el número de nódulos y huevos de M. incognita en raíces de tomate (Santhi y Sivakumar, 1995). También la cepa S18 de Bacillus cereus disminuye la densidad de M. incognita en tomate (Keuken, 1996). Por otra parte Giannakou, et al, 2004 y Terefe et al., 2009, demostraron que el producto Bionem, a base de Bacillus firmus, posee una elevada actividad en el control de Meloidogyne spp. En condiciones de laboratorio, maceta y campo.
Otro de los grupos de elevada importancia entre los organismos causantes de enfermedades de las plantas son los hongos fitopatógenos, que incluye especies de los géneros Botrytis, Pythium, Rhizoctonia, Alternaria, Fusarium, Phytophthora, Thielaviopsis y Botryosphaeria entre muchos otros, los cuales pueden sobrevivir durante muchos años en el suelo.
Diversos mecanismos han sido descritos para explicar el fenómeno de control biológico de estos patógenos, tales como parasitismo, protección cruzada, antibiosis, competición e inducción de resistencia, entre otros (Shoda, 2000, Walsh y col.. 2001).
Uno de los nichos ecológicos (posición relacional de una especie en un ecosistema) más estudiados ha sido la rizosfera, por las relaciones que aquí se establecen entre plantas y otros organismos (Warrior, 2000). Desde la década de los 80 se ha venido estudiando los microorganismos de la rizosfera, como posibles sustitutos de los plaguicidas químicos para controlar una amplia gama de plagas y enfermedades. Debido a su abundante distribución en suelo, su capacidad de colonizar las raíces de las plantas, y de producir una gran variedad de compuestos beneficiosos, así como antagonistas de un elevado número de patógenos, estos organismos resultan muy adecuados para el control biológico de plagas y enfermedades. (Anjaiah y col., 1998; Hill y col., 1994; Maurhofer y col., 1991; Rodríguez, y Pfender. 1997; Ross y col., 2000 y Thomashow y col., 1997).
Entre los grupos microbianos de la rizosfera, que han sido ampliamente estudiados como agentes de control biológico de plagas y enfermedades producidas por los microorganismos, se encuentra el constituido por los hongos. El mismo ha sido empleado con éxito en el control de hongos patógenos pertenecientes a los géneros Botrytis, Fusarium, Pythium, Phytophthora, Rhizoctonia, Sclerotinia, Penicillium, y Macrophomina y otros (Whipps y Lumsden, 2001, McQuilken y col., 2001, Jones y Whipps, 2002, entre otros). Dado su metabolismo tan diverso, este grupo microbiano es capaz de producir una gran variedad de sustancias útiles para el control biológico. Por estas razones, el número de cepas y productos a base de hongos para este fin es cada vez más amplio y variado (Cook y col., 1996, Whipps, 1997, Fravel y col., 1998, EPA USA 2006. US 6,306,386 y US 6,890,530 entre otros).
El de las PGPR para el control biológico de plagas y enfermedades ha sido también ampliamente estudiado. La particularidad fundamental de este tipo de agentes es que además de su efecto protector, poseen una amplia capacidad de colonizar las raíces de las plantas y un gran poder estimulador del crecimiento vegetal, lo que une al efecto protector una mejora general de la sanidad de los cultivos y de esta forma, la planta es también más resistente al ataque de los patógenos. Este grupo de agentes ha sido empleado en enfermedades producidas por hongos fitopatógenos pertenecientes a los géneros Rhizoctonia, Fusarium, Pythium, Thielaviopsis, Penicillium, Alternaria y Botrytis entre otros (Emmert y handelsman, 1999, Ligon, y col., 2000, Cavaglieri, y col., 2004 y Roberts, y col., 2005, US 7,118,739, ES 2306600, WO 2008/113873, entre otros).
El género Pseudomonas ha sido objeto de numerosos estudios a lo largo de años por ser uno de los agentes más activos y dominantes en la rizosfera (Geels y Schippers, 1983, de Freitas y Germida 1991, de la Cruz y col., 1992, Ligon, y col., 2000, US 7,087,424). Miembros del género producen diferentes antibióticos que están íntimamente relacionados con la reducción y supresión de enfermedades de plantas. Otro factor que juega un papel fundamental en este fenómeno es la producción de sideróforos, lo cual contribuye además, al crecimiento de las plantas por la vía del suministro de hierro. Esta habilidad está muy extendida en miembros del género Pseudomonas. Sin embargo, la incapacidad del género para producir estructuras de resistencia durante su crecimiento, limita en alguna medida la estabilidad y efectividad de los biopreparados obtenidos con cepas de este género.
El género Bacillus también ha sido ampliamente estudiado, por presentar grandes potencialidades en este sentido. Este tiene como características principales el hecho de estar prácticamente omnipresente en todo tipo de suelos, a lo cual une una elevada tolerancia térmica, un rápido crecimiento en medios líquidos y la formación de esporas de resistencia que le permite sobrevivir durante largos periodos de tiempo. Todo esto le confiere a las cepas del género un gran potencial como agentes de biocontrol. La Agencia Norteamericana de Protección del Medioambiente (EPA) tiene registradas más de diez cepas de diferentes especies de este género como bioplaguicidas y en particular biofungicidas (EPA 2006). Los principales mecanismos asociados al biocontrol de hongos fitopatógenos mediante cepas de este género, también incluyen la producción de antibióticos, sideróforos, surfactantes y enzimas hidrolíticos tales como quitinasas entre otros (Utkhede, 1984, Acea y col., 1988, Stanghellini y Miller 1996, Shoda 2000, Banat y col., 2000, Zhang, y col., 2001, Ruiz-García y col., 2005, US 7,087,424 y EP1647188, ES 2306600, WO 2008/113873, entre otros).
Otros géneros bacterianos han sido también estudiados como agentes para el biocontrol, entre los que se encuentran los géneros, Enterobacter, Alcaligenes, Stenotrophomonas y Streptomyces (McClure, y col., 1998, Brewster y col., 1997, Sabaratnam and Traquair, 2002, Cavaglieri y col., 2004 y otros).
Por otra parte, es bien conocida la importancia que tienen los microorganismos en el ciclo de los nutrientes en el suelo y su papel en la nutrición de las plantas. Su participación activa en la descomposición y mineralización de la materia orgánica, así como en la fijación y liberación de nutrientes del suelo, es crucial para el mantenimiento de la productividad de las plantas. Las interacciones que se establecen entre los microorganismos del suelo y las raíces de las plantas, satisfacen importantes requerimientos nutricionales para ambos. Las raíces están directamente influidas por la composición y densidad de la comunidad microbiana que en ellas se desarrolla, conociéndose esto como "Efecto Rizosfera" (Atlas, R.M. y Bartha, R., 1993) La práctica de la inoculación de plantas con microorganismos promotores del crecimiento vegetal es bien conocida desde hace muchos años (US.570,813).
Un grupo de microorganismos que tiene una notable importancia en este fenómeno es aquel que participa en la solubilización del fósforo de fuentes que de otra forma serían inaccesibles para las plantas. (Kucey y col, 1989). Muchos microorganismos son capaces de asimilar el fósforo insoluble del suelo, liberando una parte de este en forma de fosfatos solubles que a su vez pueden ser utilizados por las plantas, contribuyendo de esta forma a la nutrición vegetal (Chabot y col, 1993). En general es aceptado que la solubilización de fosfatos en el suelo es debida a la producción de ácidos orgánicos y oxo ácidos quelantes, a partir de azúcares (Leyval and Barthelin 1989, Deubel y Gransee 1996, Yadav y Dadarwal, 1997. En la actualidad existen procedimientos que emplean los microorganismos solubilizadores de fosfatos en la fertilización (US. 5,912,398, ES 2234417, WO 2009/027544, entre otras).
Los géneros Enterobacter y Pantoea han sido utilizados en la agricultura como solubilizadores de fosfato y para la protección contra enfermedades de las plantas (Gyaneshwar y col, 1999, EP1116632 y EP1174030, ES 2149131, ES 2234417, WO 2009/027544, entre otras). El género Bacillus también ha sido frecuentemente utilizado en la estimulación de crecimiento vegetal y la solubilización de fosfatos (RO 120556, CN 101439993, WO 2009/070966, entre otras).
Otro aspecto que en la práctica ocupa un lugar muy importante es el empleo de los microorganismos de la rizosfera fijadores de nitrógeno atmosférico. Esta práctica es también conocida desde hace muchos años (US. 1,212,196). Numerosos microorganismos han sido utilizados para esta función entre los que se encuentran bacterias de los géneros Rhizobium, Azotobacter y Azospirillum (ES 2093559; US 5,951,978, ES 2234417, WO 2009/027544), y hongos de los géneros Saccharomyces, Hansenula (US 6,596,273) y Aspergillus (US 4,670,037) entre otros.
En los años 70 varios experimentos realizados en Brasil determinaron la significativa contribución del N_{2} fijado para las plantas por diferentes microorganismos, encontrándose Azospirillum entre los géneros principales. (Döbereiner y Day, 1976; Neyra y Döbereiner, 1977 entre muchos otros). Estudios posteriores de cuantificación de la fijación biológica del nitrógeno (FBN) en caña de azúcar en este país, demostraron que prácticamente el 65% del total del N_{2} acumulado fue derivado de la FBN, lo que representa alrededor de 150 kg N_{2} x ha-1 x año-1, de lo que se derivó la recomendación de reducir al mínimo el uso de los fertilizantes nitrogenados, (Döbereiner, 1989; Urquiaga y Döbereiner, 1990).
Bashan y col (1990) demostraron que no es solo el nitrógeno el principal elemento involucrado en la relación Azospirillum-planta, sino que también el fósforo y el potasio juegan un papel fundamental en esta relación, concluyendo que en dependencia de la cepa utilizada, existirá un cambio cuantitativo en la toma de los minerales por la planta, aumentado significativamente algunas cosechas.
Hay que destacar que muchos autores coinciden en señalar que los efectos beneficiosos por la inoculación con microorganismos sobre el crecimiento vegetal, no son solo debidos a la solubilización de fosfatos o a la fijación biológica del nitrógeno. Existen mecanismos tales como la producción de fitohormonas y sideróforos o la actividad de la enzima 1-aminociclopropano 1-carboxilato desaminasa entre otros, que contribuyen notablemente en este efecto (Datta y col, 1992, Chabot y col, 1993, Deubel and Gransee 1995, Frietas y col, 1997, El-Khawas y col, 1998; Cassán y col 2001 entre otros).
El desarrollo asociativo de los géneros Azospirillum y Bacillus ha sido llevado a cabo exitosamente en la fijación biológica de nitrógeno y la solubilización de fosfatos, demostrándose que no existen incompatibilidades entre ambos géneros y que al mostrar diferentes los mecanismos de regulación metabólica pueden realizar diferentes funciones en un ecosistema dado (Sukumar, 2001, El-Komy, H.M. 2005, Tabrizi, et al. 2008). Los cultivos mixtos de microorganismos del suelo, con diferentes capacidades metabólicas pueden desarrollar relaciones de cooperación entre sí y con las plantas que hacen más eficiente la adsorción de nutrientes por éstas y además pueden producir sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal, aumentando la productividad de las cosechas y protegiéndolas contra los microorganismos patógenos. También se ha llevado a cabo con éxito la obtención de cepas de Azospirillum que expresan toxinas de Bacillus intentando obtener los beneficios de ambos microorganismos (Goundera and Rajendrana 2001), aunque las limitaciones actuales de la legislación sobre liberación de organismos genéticamente modificados (GMOs), no ha permitido una introducción masiva de este tipo de cepas.
Las tendencias actuales en la inoculación de plantas con microorganismos se orientan en el sentido de utilizar cultivos mixtos (llamados también consorcios) que potencien fenómenos tales como la protección contra enfermedades producidas por organismos patógenos, el incremento de la eficiencia de la absorción del fósforo por las raíces, la fijación biológica del nitrógeno, la estimulación del crecimiento vegetal por la producción de sustancias reguladoras del crecimiento vegetal, así como sideróforos entre otros (ES 2093559; EP1166632; US 5,147,441; US 6,277,167 y US 6,596,273 WO 00/51435). Esta práctica se ha revelado como la más efectiva en la biofertilización. Otros antecedentes aparecen en US 5,071,4623, US 5,578,486, WO93/19604, WO 00/73244, WO 00/64837, WO 02/20431, WO 02/070436. Por otro lado cepas del Bacillus thuringiensis con actividad bionematicida aparece descritas en los documentos US 5,378,460 y WO 99/09819.
Un aspecto muy importante a tener en cuenta en el control biológico es el empleo de mezclas o combinaciones de diversos agentes de control, particularmente si éstos poseen diferentes mecanismos de acción, los cuales pueden llegar a ser complementarios. De hecho, en la práctica, este es el fenómeno que se presenta en la naturaleza, por lo que su uso puede resultar muy beneficioso. Estas combinaciones de microorganismos, han demostrado en general una mayor eficacia, combinando efectos de nutrición y promoción del crecimiento vegetal con el de inhibición o supresión de diferentes plagas y enfermedades por lo que se presentan como una alternativa de gran potencial para su uso en la agricultura. Sin embargo, es muy importante tener en cuenta para la elaboración de este tipo de productos, que ningún componente de la mezcla tenga alguna acción inhibitoria sobre los demás o pueda interferir excesivamente con la microbiota normal del ecosistema (Whipps, 2000). Uno de los problemas más importantes en la producción de este tipo
de biopreparados es el lograr una tecnología asequible desde el punto de vista práctico de producción y formulación.
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Breve descripción de la invención
El objeto de la presente invención es un preparado biológico, líquido o sólido, que presenta una potente actividad nematicida y que posee además capacidad biofertilizante y potenciadora del crecimiento y el enraizamiento tanto en semilleros, como en viveros, invernaderos y producción vegetal en general. El producto consiste en un preparado microbiano que contiene células de nuevos aislados de Bacillus thuringiensis cepa N_{11}, Bacillus mojavensis cepa SR_{11} y Azospirillum brasilense cepa ALo_{1} que los autores de la presente invención han logrado aislar. Dichos microorganismos han sido depositados en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) que les ha asignado los números de depósito CECT-7665, CECT-7666 y CECT-5856 respectivamente. Las bacterias fueron identificadas por los autores y se solicitó además la identificación en la CECT verificándose su identidad. El citado preparado consiste en un producto líquido o sólido, compuesto por las células bacterianas y que contiene además los componentes necesarios para garantizar su supervivencia durante el almacenamiento, así como en el ambiente, después de su aplicación en el tratamiento de las plantas. Dicho preparado es un consorcio microbiano formado por Bacillus thuringiensis N_{11} con una gran capacidad antagonista de nematodos fitopatógenos, Bacillus mojavensis cepa SR_{11} con acción sinérgica en la actividad antagonista de nematodos fitopatógenos y gran eficiencia para la solubilización de fosfatos y otros minerales del suelo, así como capacidad de producir sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal y que contiene además Azospirillum brasilense cepa ALo_{1} fijadora de nitrógeno atmosférico con una elevada capacidad para producir sustancias promotoras del crecimiento vegetal. Dicho consorcio posee una elevada capacidad nematicida y presenta además actividad, promotora del crecimiento vegetal, el enraizamiento, y es un excelente potenciador de la salud de las plantas.
El microorganismo Bacillus thuringiensis N_{11} CECT-7665 constituye igualmente objeto de esta invención. El mismo fue obtenido utilizando un procedimiento que combina el aislamiento en medio sólido y la selección mediante un proceso de tamizado secuencial, de crecimiento en medios agarizados para la determinación de diferentes actividades enzimáticas. Posterior se determinó su capacidad nematicida en bioensayos frente a la raza 2 de Meloidogyne incognita en base a su poder ovicida en placas y para inhibir la formación de nódulos en plántulas de pepino in vitro. La cepa N_{11} posee además la capacidad de de solubilizar fosfatos y otros minerales del suelo lo cual fue demostrado a través de su cultivo en medio sólido y la determinación del PO_{4}^{3-} solubilizado en medio líquido agitados, empleando en ambos casos Ca_{3}PO_{4} como única fuente de fósforo. Quedó demostrado mediante análisis por HPLC y bioensayo en insectos que Bacillus thuringiensis cepa N_{11} no produce \beta-exotoxinas. Dicha cepa capaz de degradar la lecitina así como el colágeno.
Asimismo constituye objeto de la presente invención el microorganismo Bacillus mojavensis SR_{11} CECT-7666. El mismo fue obtenido utilizando un procedimiento que combina el aislamiento en medios agarizados con tampón Tris HCl 1N pH 8, por zonas de aclaramiento del agar (Gyaneshwar y col 1999) y selección mediante determinación del PO_{4}^{3-} solubilizado en medios líquidos agitados (Nautiyal 1999), empleando en ambos casos Ca_{3}PO_{4} como única fuente de fósforo. La capacidad para fijar nitrógeno atmosférico se estableció cultivando dicha cepa en medio NFb semi-sólido (Kreig y Döbereiner, 1984), libre de nitrógeno. La presencia del enzima 1-aminociclopropano 1-carboxilato desaminasa se comprobó a través del crecimiento en medio sólido con ácido 1-aminociclopropano 1-carboxílico (ACC) como única fuente de nitrógeno (Penrose 2001).
El microorganismo Azospirillum brasilense ALo_{1} CECT 5856 y es también motivo de la presente invención. El mismo fue obtenido mediante un procedimiento que combina el aislamiento en medio NFb semi-sólido (Kreig y Döbereiner, 1984) y la selección a través su capacidad para estimular el crecimiento vegetal y producir auxinas y otras fitohormonas. La capacidad para estimular el crecimiento vegetal. Se comprobó, mediante estos bioensayos que la cepa ALo_{1} posee un potente efecto estimulador del crecimiento vegetal, muy superior en comparación con los otros aislados ensayados. La producción de ácido 3 indol acético (AIA) fue verificada por métodos colorimétricos (Pilet y Chollet 1970) y HPLC (Olivella y col 2001), así como se detectó la presencia de otras fitohormonas del tipo citoquininas. En la producción de AIA, en con 200 mg x L-1 de triptófano, se logran concentraciones de 100-180 mg x mL-1 y un por ciento de transformación de hasta el 90% de este aminoácido. Se comprobó también la actividad del enzima 1-aminociclopropano 1-carboxilato desaminasa presente en esta cepa, a través del crecimiento en medios con ácido 1-aminociclopropano 1-carboxílico (ACC) como única fuente de nitrógeno (Penrose 2001).
La capacidad del bionematicida para estimular el crecimiento vegetal fue comprobada mediante bioensayos de laboratorio e invernadero, según los métodos descritos por Bashan y col 1986, Fernández 1995 y Bashan 1998.
También constituye objeto de esta patente de invención el procedimiento de producción de las cepas y los caldos de cultivo utilizados en el citado preparado, el cual consta de cuatro pasos:
\bullet
Propagación de la cepa N_{11} en cultivo sumergido, en un medio específico que estimula la esporulación y la capacidad para producir enzimas proteolíticas y quitinolíticas y que al final de la fermentación contiene en su composición una elevada actividad plaguicida.
\bullet
Propagación de la cepa SR_{11} en un medio de cultivo que estimula la esporulación y la capacidad de producir sustancias surfactantes y que al final de la fermentación contiene en su composición actividad fungicida y capacidad para estimular el crecimiento vegetal y el enraizamiento.
\bullet
Propagación de la cepa ALo_{1} en un medio a base de sustancias naturales y sales minerales en el cual se produce además una elevada concentración de sustancias promotoras de crecimiento vegetal y del enraizamiento.
\bullet
Mezcla final de esto tres caldos fermentados en partes proporcionales, lo que da como resultado un líquido con una elevada concentración celular, mayor de 10^{9} unidades formadoras de colonias (UFC) x mL-1 y una potente actividad plaguicida frente a nematodos fitopatógenos, así como una notable capacidad para estimular el crecimiento y el enraizamiento vegetal y contribuir en eficazmente a la nutrición y a la salud de las plantas.
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De igual manera son objetos de esta invención los procedimientos de obtención de los formulados, los cuales constan de los siguientes pasos:
Formulado líquido:
\bullet
Al líquido obtenido por el procedimiento anterior se le añade una solución quitosano en una proporción tal que quede a una concentración final del 0,1-1% y se agita hasta disolución total. El producto así formulado tiene una estabilidad a temperatura ambiente no menor de 6 meses.
Inmovilización celular en formulado sólido:
\bullet
Al líquido obtenido mediante el procedimiento de producción de las cepas y los caldos de cultivo, se le añade los siguientes componentes agitando continuamente:
Leche descremada
1-3%
Sacarosa
2-4%
Maltodextrina
3-5%
\bullet
Se continúa con la agitación durante una hora para permitir la interacción entre los diferentes componentes y luego se procede a alimentar un secador por aspersión (Spray Dryer) para llevar a cabo el proceso de secado hasta una humedad final de 4-6%.
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El proceso de encapsulación de la composición desarrollada mediante secado por aspersión, ha permitido garantizar la estabilidad del preparado por no menos de un año y facilitar su aplicación. Estos procedimientos han sido usados con éxito por los autores en la realización de otros preparados microbianos para el control biológico y la biofertilización.
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Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra un bioensayo en cultivo gnotobiótico de plántulas de pepino.
La Fig. 2 ilustra un bioensayo en bandejas de plantas de tomate en cámara de cultivo.
Las Figs. 3 y 4 muestran ejemplos de valoraciones realizadas a partir de plantas de sandía tratadas con el bioplaguicida (Fig. 3) y de plantas testigo sin tratar (Fig. 4).
Las Fig. 5 y 6 ilustran ejemplos de valoraciones visuales realizadas a partir de ensayos de plantas de tomate tratadas con el bioplaguicida (Fig. 5) y de plantas testigo sin tratar (Fig. 6).
Las Figs. 7 y 8 ilustran ejemplos de valoraciones visuales realizadas a partir de ensayos de plantas de pepino tratadas con el bioplaguicida (Fig. 7) y de plantas testigo sin tratar (Fig. 8).
Las Figs. 9 y 10 muestran ejemplos de valoraciones visuales realizadas a partir de ensayos de plantas de coliflor tratadas con el bioplaguicida (Fig. 9) y de plantas tratadas con Vydate (Fig. 10).
La Fig. 11 muestra un diagrama tridimensional que muestra la comparación de las medias de los diferentes tratamientos explicados.
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Descripción detallada y Modo de realización de la invención
El producto líquido obtenido fue sometido a diferentes evaluaciones mediante bioensayos in vitro, así como ensayos de invernadero experimental y en campo en condiciones de producción. Los resultados de dichas evaluaciones se presentan a continuación.
En primer lugar se realizaron ensayos in vitro, para determinar la capacidad antagonista de éstas frente a nematodos parásitos del género Meloidogyne para lo cual se llevó a cabo un bioensayo utilizando el cultivo gnotobiótico de plántulas de pepino en agar, (Fernández 2004). La metodología resumida es como sigue:
Preparación del bioensayo
Se sumergen semillas comerciales de pepino variedad Marketmore.76 en una disolución de hipoclorito de sodio al 5% durante 3 min. Posteriormente son lavadas con abundante agua destilada estéril. A continuación se ponen a germinar durante 72 h en cámara húmeda. Las semillas germinadas se trasplantan a tubos plásticos de fondo cónico de 60 mL (3x9 cm), conteniendo 30 mL de agar-solución nutritiva (Hoffland, et al. 1989) y se colocan en cámara de cultivo a 25ºC, 80% de humedad con ciclos de iluminación de 16 h de luz y 8 de oscuridad. Una vez que aparece la primera hoja verdadera, las plantas son sometidas a los tratamientos con el producto a ensayar.
Tratamientos
Se realizaron dos tipos de tratamientos: infectar las plantas mediante un inoculo mixto de huevos, juveniles y adultos de Meloidogyne sp. y posteriormente tratar con el producto y viceversa, primero tratar las plantas y después infectarlas con los nematodos. En ambos tratamientos se deja un intervalo de 24 h entre una inoculación y la otra.
Preparación de los inóculos infectivos
Se preparó un inoculo infectivo mixto con el objetivo de llevar a cabo la selección basándose en su capacidad antagonista frente a los diferentes estadios del ciclo biológico del patógeno. A partir de plantas de tomate infectadas con la raza 2 de Meloidogyne incognita que presentan abundantes síntomas de la enfermedad, se toman trozos de raíces y se van extrayendo los nódulos que son lavados con agua corriente y a continuación se rompen suavemente con una batidora manual de cuchilla en la menor cantidad de agua posible. Esta suspensión, con los diferentes estadios fisiológicos del patógeno es utilizada para infectar las plantas. El ensayo se realiza con 5 tubos por tratamiento como mínimo.
Determinación de la capacidad antagonista
A los 10 días de incubación se evalúa la formación de nódulos en las raíces de las plántulas infectadas, tratadas con el producto y los controles sin tratar. Se considera que ha habido actividad nematicida cuando existe una reducción mínima del 50% de los tubos infectados con respecto al control. El producto ensayado tuvo una efectividad del 80-100% en la inhibición de la formación de nódulos en las múltiples repeticiones que se llevaron a cabo.
En la figura 1 se presentan las fotos de las plántulas de pepino durante el bioensayo. En la imagen inferior, centro de esta figura, se pueden observar los nódulos formados en las raíces.
Bioensayo de cultivo gnotobiótico de plantas en agar
A continuación se llevó a cabo un bioensayo in vitro en bandejas, usando plantas de tomate provenientes de semillero. Este paso se realiza para confirmar los resultados obtenidos en el bioensayo anterior, pero en otro cultivo y en condiciones más reales. Este bioensayo consiste en lo siguiente:
Preparación del bioensayo
Se toman plantas de tomate variedad Raf, procedentes del semillero y se sumergen las raíces en el inoculo infectivo durante toda la noche. A continuación son trasplantadas a bandejas de 44x27x7 cm, las cuales contienen como sustrato vermiculita previamente esterilizada a la que se ha añadido una solución nutritiva de Hoagland (Hoagland y Arnon 1950). Posteriormente son tratadas con el inoculo bacteriano, el cual es añadido a la bandeja mediante riego. Las plantas son entonces colocadas en cámara de cultivo a 25ºC, 80% de humedad y con ciclos de iluminación de 16 h de luz y 8 de oscuridad durante 15 días.
Preparación de los inóculos infectivos
Como en el bioensayo en tubos, se preparó un inoculo infectivo mixto con el objetivo de llevar a cabo la selección basándose en su capacidad antagonista frente a los diferentes estadios fisiológicos del ciclo biológico del patógeno. A partir de plantas de tomate infectadas con la raza 2 de Meloidogyne incognita que presentan abundantes síntomas de la enfermedad, se toman trozos de raíces y se van extrayendo los nódulos que son lavados con agua corriente y se rompen suavemente con una batidora manual de cuchilla en la menor cantidad de agua posible.
Determinación de la capacidad antagonista
A los 15 días se evalúa el número de nódulos formados en las raíces de las plantas infectadas y tratadas con los diferentes aislados, así como los controles sin tratar. Se considera que ha habido actividad nematicida cuando existe una reducción mínima del 50% con respecto al control.
Como se puede apreciar en la figura 2, el cultivo en bandejas, permite un mejor desarrollo de la plaga, lo cual posibilita una mayor formación de nódulos y una evaluación más precisa de la actividad nematicida de los aislados y los productos elaborados.
Bioensayo de plantas en bandejas usando vermiculita como sustrato
Al final del proceso de tamizado, se seleccionó, una mezcla de dos cepas del género Bacillus, N_{11} y SR_{11}, dado que produjo mejores resultados que cualquiera de los aislados individualmente.
Al producto así elaborado se le añadió la cepa ALo_{1} dado su potente actividad estimuladora del crecimiento vegetal con el objetivo de mejorar notablemente la salud de las plantas y reforzar su resistencia frente al ataque de organismos patógenos.
Bioensayos de estimulación del crecimiento vegetal
Para determinar la capacidad estimuladora del crecimiento vegetal, se llevaron a cabo bioensayos en invernadero experimental, encaminados a determinar los efectos de los productos sobre diferentes cultivos de interés comercial. Este tipo de ensayo se realizó en macetas y jardineras de diferentes volúmenes.
Como criterio de evaluación se determinó el peso fresco del tejido verde o parte aérea, así como el peso fresco de la raíz.
Los resultados de estos bioensayos resultaron en general muy positivos en cuanto a la capacidad de estimulación del crecimiento vegetal y el enraizamiento de los productos elaborados. En el Diagrama 1 se presentan los resultados obtenidos en el cultivo de lechugas para el formulado bionematicida líquido. Como puede observarse, todos los tratamientos estimularon el crecimiento vegetal y el enraizamiento con respecto al control. De todos los tratamientos ensayados, el que mejores resultados dio fue el producto bionematicida. Estos resultados se repitieron en los diferentes cultivos ensayados.
1
2
3 
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Resultados
Ensayo 01
De las valoraciones realizadas se pudo observar (figuras 3 y 4) que hubo una diferencia notable entre las dos tesis, en la parcela testigo se apreció una pérdida de vigor y color en las plantas, así como una menor masa foliar, a diferencia de las plantas a las que se aplicó el BIOPLAGUICIDA, donde el crecimiento fue mayor y el color verde más intenso. Esto demuestra en general el carácter estimulador del crecimiento vegetal del producto.
TABLA 1 Resumen de los resultados de los análisis hematológicos
5 
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TABLA 2 Diferencias entra las dos tesis
6
De las tablas 1 y 2 se puede inferir que hubo una reducción drástica del número de nematodos en general y particularmente de los fitopatógenos, manteniéndose la plaga controlada en todo momento. Esto se corresponde también con el aspecto general de las plantas. El producto ha demostrado que no solo es un bionematicida eficaz, sino que por la vía de la estimulación del crecimiento vegetal, hace a las plantas más saludables y resistentes al ataque de los patógenos.
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Ensayo 02
De las valoraciones visuales se pudo observar (figuras 5 y 6) que hubo una diferencia notable entre las dos tesis, en los controles se apreció una perdida de vigor y color en las plantas, así como una menor masa foliar, a diferencia de las plantas en las que se aplicó el BIOPLAGUICIDA, donde el crecimiento fue mayor y el color verde más intenso. Aquí también se demuestra la capacidad del producto para estimular el crecimiento vegetal.
TABLA 3 Resumen de los resultados de los análisis
7
En este ensayo también se observó una elevada reducción de las poblaciones de nematodos, así como una buena estimulación del crecimiento vegetal, resultando muy eficaz en el control de la plaga todo lo cual se puede comprobar en las tablas 3.
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Ensayo 03
De las valoraciones visuales se pudo observar, como en los casos anteriores, una diferencia notable entre las dos tesis (figuras 7 y 8). Las plantas tratadas con el BIOPLAGUICIDA presentan una masa foliar mucho mayor y su aspecto en general es más saludable que las plantas testigo. El sistema radicular en estas últimas está mucho menos desarrollado y en la foto 6 se observa claramente el ataque de nemátodos a diferencia de las plantas tratadas que poseen una masa radicular mucho mayor y una elevada presencia de raíces secundarias y pelos absorbentes lo que corrobora el carácter nematicida y estimulador del crecimiento vegetal del producto.
Aquí también se pudo observar, como en los ensayos anteriores, una reducción notable de los nematodos en general y de los fitopatógenos en particular, lo que ratifica la capacidad nematicida del producto BIOPLAGUICIDA. En particular en este ensayo, dada la presencia del género Meloidogyne, además de los análisis nematológicos, en la figura 7 se puede comprobar la ausencia de nódulos característicos de la infección por este género, a diferencia de la figura 8 donde se observan claramente éstos en las plantas sin tratar, lo que demuestra la capacidad del BIOPLAGUICIDA para el control de nematodos fitopatógenos.
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TABLA 4 Resumen de los resultados de los análisis
8
9
10
Evaluación, descripción y métodos: Se toman muestras de suelo para determinar la evolución de las poblaciones de nematodos y se valora el aspecto general de las plantas de las diferentes tesis.
Resultados
Como se puede observar en la tabla 5, después de haber aplicado los 30 litros por hectárea del BIOPLAGUICIDA, vemos una reducción en el contenido de nematodos superior al 80% en todos los casos con respecto al análisis inicial, mientras que con la aplicación de Vydate se logran reducciones de más del 60%. Esto demuestra que el BIOPLAGUICIDA presenta una elevada eficacia en el control de nematodos e incluso superior al producto químico de referencia con lo cual queda establecido que, en el cultivo utilizado y en las condiciones del ensayo, el producto líquido elaborado a base de las cepas autóctonas N_{11}, SR_{11} y ALo_{1} resultó muy efectivo en el control de nematodos fitopatógenos, al menos de los géneros presentes.
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TABLA 5 Resumen de los resultados de los análisis nematológicos
11
Por otra parte se llevaron a cabo valoraciones visuales de las diferentes tesis constatándose diferencias entre las distintas tesis. En la parcela testigo se apreció una notable diferencia de vigor y color, así como una menor masa foliar, en relación con las plantas tratadas con el BIOPLAGUICIDA, las cuales son similares a las plantas tratadas con VIDATE. En estas dos últimas parcelas el crecimiento de las plantas fue mayor y su aspecto mucho mejor en cuanto a color y masa foliar. Como se puede observar en las fotos figuras 9 y 10, no hubo una diferencia significativa entre estos tratamientos.
El día de la recolección se procedió a pesar 50 piezas de coliflor por tesis, para ver las posibles diferencias en cuanto a peso. El resultado se presenta en la figura 11.
Como se aprecia en la figura 11 existen diferencias importantes en cuanto a producción donde se han aplicado los nematicidas, con respecto a la parcela testigo.
También se realizaron valoraciones de Fitotoxicidad en todos los ensayos realizados:
La valoración se hizo sobre la totalidad de la superficie ocupada por cada tesis apuntando la posible toxicidad del formulado sobre las plantas después de la aplicación.
Se miró con especial interés las tesis de los formulados.
Se observan las plantas anotando cualquier modificación en el desarrollo del ciclo (inhibición o fallo en el crecimiento, modificación fenológica, fallos en floración o frutos, la no aparición de ciertos órganos, etc.).
Se observó si existían modificaciones en la cantidad o calidad del cultivo tanto cualitativa como cuantitativamente.
Se intentó detectar las deformaciones morfológicas (enrollamientos, atrofias, elongaciones, cambios en la talla o volumen de copa, marchitamientos, etc.).
Escala % de toxicidad
12
Resultados
No hubo ningún síntoma de fitotoxicidad en las plantas tratadas en ninguno de los ensayos realizados.
Conclusiones
En las pruebas de eficacia realizadas con el bioplaguicida de la invención, en los diferentes cultivos ensayados, aplicados en riego por goteo e inundación, a la dosis de 30 L/ha, quedó demostrado que el producto es capaz de controlar los nemátodos fitopatógenos, produciendo una reducción importante de su concentración en el suelo y raíces de las plantas, del orden del 70-90%, con respecto a los testigos sin tratar y superior al producto químico de referencia utilizado en el caso del ensayo de coliflor. En este último ensayo se pudo apreciar la presencia de agallas en las plantas testigo, a diferencia de las tesis donde se aplicaron los nematicidas.
En las valoraciones visuales se pudo observar una diferencia notable entre las dos tesis, en los controles se apreció una perdida de vigor y color en las plantas testigo, así como una menor masa foliar y el sistema radicular estaba menos desarrollado lo que demuestra la actividad de nematodos fitopatógenos, a diferencia de las plantas en las que se aplicaron los nematicidas y particularmente el BIOPLAGUICIDA donde, pocos días después de la primera aplicación, ya se observó que el crecimiento fue mayor y el color verde más intenso lo que se mantuvo a lo largo de todo el ensayo, en cada caso. Esto demuestra en general el carácter estimulador del crecimiento vegetal del producto.
No se observó fitotoxicidad en ninguno de los ensayos realizados, por el contrario los efectos del producto están relacionados con una mejora general de la salud de las plantas.

Claims (15)

1. Un cultivo puro de la cepa denominada N_{11} de la especie Bacillus thuringiensis, caracterizada por poseer una elevada actividad nematicida, así como actividad colagenasa, no producir \beta-exotoxina y que posee la capacidad para solubilizar fosfatos, depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número CECT-7665.
2. Un cultivo puro de la cepa denominada SR_{11} de la especie Bacillus mojavensis, caracterizada por su capacidad para solubilizar fosfatos del suelo y estimular el crecimiento vegetal, siendo capaz de producir ácido indol-3-acético y crecer en ácido 1-aminociclopropano 1-carboxílico (ACC) como única fuente de nitrógeno, habiendo sido depositada dicha cepa en la CECT con el número CECT-7666.
3. Un cultivo puro de la cepa denominada ALo_{1} de la especie Azospirillum brasilense, caracterizada por producir, ácido 3 indol acético con un por ciento de conversión de entre 70-90% del triptófano añadido en el medio de cultivo, sideróforos y otras sustancias reguladoras del crecimiento vegetal, así como de fijar nitrógeno atmosférico y con capacidad para crecer en ácido 1-aminociclopropano 1-carboxílico (ACC) como única fuente de nitrógeno, depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número CECT-5856.
4. Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal caracterizado por contener Bacillus thuringiensis cepa N_{11} (CECT-7665), Bacillus mojavensis cepa SR_{11} (CECT-7666) y Azospirillum brasilense cepa ALo_{1} (CECT-5856).
5. Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal según la reivindicación 4, caracterizado porque las células microbianas son obtenidas mediante uno o varios procesos de fermentación sumergida en la cual se alcanzan concentraciones celulares mayores de 109 UFC/mL.
6. Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal según la reivindicación 4 ó 5 caracterizado por contener células vivas de dichas tres bacterias en proporciones adecuadas para alcanzar una concentración final total mayor de 109 UFC x mL-1, en una formulación líquida.
7. Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal según reivindicación 4 ó 5, caracterizado por contener células vivas de estas tres bacterias en proporciones adecuadas para alcanzar una concentración final total mayor de 1010 UFC x mL-1, en una formulación sólida.
8. Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado por contener además de las células viables, materia orgánica y otras sustancias con actividad plaguicida y reguladoras del crecimiento de plantas.
9. Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal según la reivindicación 6 caracterizado que presenta una estabilidad de hasta seis meses a temperatura ambiente.
10. Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal según reivindicación 9, caracterizado porque la estabilidad es garantizada mediante el empleo de sustancias inhibidoras del crecimiento microbiano.
11. Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal según la reivindicación 7 caracterizado que presenta una estabilidad de hasta un año a temperatura ambiente.
12. Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal según la reivindicación 11, caracterizado porque la estabilidad es garantizada mediante un proceso de secado por aspersión utilizando sustancias protectoras de la viabilidad celular.
13. Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal según una cualquiera de las reivindicaciones 7, 11 ó 12, caracterizado porque las sustancias protectoras de la viabilidad celular son la leche descremada en polvo, la Maltodextrina y la sacarosa, y la estabilidad es garantizada mediante un proceso de secado por aspersión utilizando sustancias protectoras de la viabilidad celular.
14. Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal según una cualquiera de las reivindicaciones 7, 11 ó 12, caracterizado porque las concentraciones de las sustancias protectoras son: leche descremada en polvo es usada entre el 1-3%, Maltodextrina 3-5% y sacarosa 2-4%. y la estabilidad es garantizada mediante un proceso de secado por aspersión utilizando sustancias protectoras de la viabilidad celular.
15. Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal según una de las reivindicaciones 4 a 14 caracterizado porque presenta una elevada actividad al ser aplicado tanto en riego por goteo como por inundación.
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