CN105053014A - 一种含海藻基质的复合生防菌剂及制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含海藻基质的复合生防菌剂及制备方法和用途。该生防菌剂包括海藻渣、枯草芽孢杆菌2-1、解淀粉芽孢杆菌9-2，其中海藻渣与芽孢杆菌发酵液的用量比例为2～8:1(w/v)，枯草芽孢杆菌2-1与解淀粉芽孢杆菌9-2的用量比例为1:1～5。制备方法包括：接种发酵、含海藻基质的生防菌剂制备，干燥、包装备用。本发明的复合生防菌剂不仅对丹参、天南星等多种中药材的根腐病原菌具有较强的抑制作用，而且对蔬菜作物根腐病也有较好的防治效果，抑菌效果优于单株菌。
Description
技术领域
本发明属于生防菌剂领域，具体讲是一种含海藻基质的复合生防菌剂及制备方法和用途。
背景技术
生防芽孢杆菌种类多、分布广、抑菌谱广，抗病增产作用明显，优于其他拮抗微生物，目前国内外已有将其成功用于植物病害防治的报道。我国已登记注册的防治土传病害的微生物农药有14种，其中以芽孢杆菌作为生防菌的有6种，主要用于水稻和小麦纹枯病的防治，近几年已迅速推广应用到番茄青枯病、棉花黄萎病、辣椒枯萎病、西瓜枯萎病、烟草黑胫病、水稻稻瘟病、甘蓝黑腐病等各种农作物和/或果蔬病害。国外应用枯草芽孢杆菌防治植物病害较成功的实例有美国Agraquest公司用QST713菌株和QST2808菌株分别开发成功活菌杀菌剂SerenadeTM和SonataAS，并于2000年登记，用于防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃等多种作物的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病等，其他国家也有用于防治马铃薯、玉米、蔬菜类和观赏植物的真菌病害的芽孢杆菌菌剂。可见，芽孢杆菌用于生物防治已深受认可。
根腐病作为一种严重的土传病害，对中药材和蔬菜的品质及产量都造成了很大的影响。根腐病危害严重制约了蔬菜和丹参等根茎类中药材种植产业的发展，由于其致病菌可以在土壤中存活多年，并且随雨水和灌溉传播迅速，轮作倒茬很难消除，同时缺乏有效的抗病品种和安全无残留的防治药物，从而导致根腐病危害越来越严重。一直以来，人们对根腐病的防治大都依赖化学药剂及一些合理的耕作管理方法，但根腐病一旦病发，就需施用大量药物，一方面造
成了环境污染，另一方面还影响了中药材和蔬菜的出口贸易；此外，传统的生防菌剂粉剂常以硅藻土和碳酸钙等为载体，多次使用溶液造成土壤板结。由此可见，生物农药的推广是我国农业可持续发展的迫切需求。生物防治具有环保无污染的特点，因此将生防菌剂应用到中药材和蔬菜根腐病的防治中意义重大。目前用于防治中药材根腐病的生防菌剂在国内外还较为少见，国内登记的微生物农药主要用于小麦全蚀病，水稻和小麦纹枯病及果蔬枯萎病，其中有两种生防菌剂用于防治根腐病，分别为“百抗”和“根腐消”，且都是用于三七根腐病，但针对中药材丹参、天南星等根腐病的生防菌剂还很少报道，故值得深入研究。
发明内容
为克服以上缺陷，本发明将海藻渣与芽孢杆菌发酵液制成复合生防菌剂，提供了一种既营养又防病的新型含海藻基质的复合生防菌剂，该生防菌剂兼具海藻营养及生物菌剂的活体调节功能，能有效的防治中药材和蔬菜作物根腐病并提高中药材和蔬菜作物的品质和产量。实现了促进植物生长，防治根腐病害的双重目的。
本发明目的是由以下技术方案实现的：
一种含海藻基质的复合生防菌剂，该生防菌剂包括海藻渣、枯草芽孢杆菌2-1、解淀粉芽孢杆菌9-2，其中海藻渣与芽孢杆菌发酵液的用量比例为2～8:1(w/v)，枯草芽孢杆菌2-1与解淀粉芽孢杆菌9-2的用量比例为1:1～5。
进一步的，一种含海藻基质的复合生防菌剂，海藻渣与芽孢杆菌发酵液的用量比例为4～5:1(w/v)，枯草芽孢杆菌2-1与解淀粉芽孢杆菌9-2的用量比例为1:2～4。
进一步的，一种含海藻基质的复合生防菌剂，芽孢杆菌发酵液中活菌数≥1×108cfu/mL。
进一步的，一种含海藻基质的复合生防菌剂，菌剂基质载体为灭菌的新鲜或腐熟的海藻渣，所含成分及含量为：粗蛋白15～25％、粗纤维45～55％、灰分2～4％、余量为水分。
进一步的，一种含海藻基质的复合生防菌剂，海藻基质可以为褐藻、蓝藻、衣藻、绿藻中的至少一种，且并不限于上述藻类。
本发明还提供了一种含海藻基质的复合生防菌剂的制备方法，制备过程包括以下步骤：
1)接种发酵
在无菌操作条件下，用移液枪将甘油管保存的生防菌株2-1和生防菌株9-2各0.1mL分别接种到装有第一培养基的玻璃器平皿上，37℃培养18h进行菌种活化；
将活化后的菌株分别接种到装有第二培养基的三角培养瓶中，发酵得种子液，其中接种量为1～5％，发酵时间为16～24h，转速为120～200r/min，发酵温度为37℃；
将种子液分别移入装第三培养基的发酵罐中，接种量为1～3％，发酵时间为22～26h，转速为120～200r/min，温度为37℃，通气量200L/h；
2)含海藻基质的生防菌剂制备
将发酵成熟的菌液与海藻渣混合均匀，采用湿法造粒技术制成颗粒剂；
3)干燥；
4)包装备用。
进一步的，一种含海藻基质的复合生防菌剂的制备方法，第一培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH值为7.5；
第二培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5/L，氯化钠10g/L，pH值为7.5。
第三培养基配方为：酵母膏5～10g/L、可溶性淀粉8～16g/L、葡萄糖4～8g/L、黄豆饼粉8～16g/L、牛肉膏6～12g/L、玉米粉8～16g/L，PH值为6.5～8.0。
进一步的，一种含海藻基质的生防菌剂的制备方法，干燥的工艺条件为：用干燥设备在温度为40～50℃条件下干燥至颗粒含水量为6～18％。
本发明还提供了一种含海藻基质的生防菌剂的用途，该菌剂对中药材丹参腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)、天南星根腐病菌(Mucorcircinelloides)、北沙参立枯菌(Rhizoctoniasolani)、桔梗枯萎病菌(Fusariumoxysporum)以及蔬菜作物黄瓜尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、黄瓜立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、棉花尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)和棉花立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)等病原真菌有较强抑菌作用。
本发明的有益效果：
大部分固体生防菌剂的载体为硅藻土和碳酸钙等，硅藻土和碳酸钙等容易造成土壤板结，而液体生防菌剂储存和运输不方便。本发明的复合生防菌剂载体海藻渣中不但含粗蛋白、粗纤维、中微量元素、灰分等，海藻渣中还含特有的有效活性成分，不仅使其成为生防菌的载体应用到农业生产中，还可以作为优良的有机肥。本发明的一种含有海藻基质的复合生防菌剂的制备方法利用生物方法和制剂技术制备出的生防菌剂，兼具海藻营养及生物菌剂的活体调节功能，实现了促进植物生长，防治根腐病害的双重目的。2-1菌株主要对中药材根腐病原菌如毛霉、腐皮镰刀菌等具有较强的抑制作用，其主要抑菌机理为菌株产生的脂肽类抑菌物质，9-2菌株除对中药材根腐病原菌具有较强抑制作用外，还对蔬菜作物根腐病，如黄瓜枯萎病菌、立枯丝核菌、茄交镰刀菌等具有较强的抑制作用，其主要抑菌机理为菌株产生的脂肽类抑菌物质和表面活性素。因此利用本方法制备的复合生防菌剂不仅对丹参、天南星等多种中药材的根腐病原菌具有较强的抑制作用，而且对蔬菜作物根腐病也有较好的防治效果，抑菌效果优于单株菌。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明按照农用微生物菌剂国家标准(GB20287-2006)对菌剂技术指标和无害化指标进行检测，包括pH值、有效活菌数、霉菌杂菌数、杂菌率、水分、粒度等。
pH值的测定：按照方法6.3.7.3进行测定。
有效活菌数的测定：按照方法6.3.2进行测定，采用LB培养基，采用平板计数法，以出现20～300个菌落数的稀释度平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。
霉菌杂菌数的测定：按照方法6.3.3进行测定，采用马丁培养基，采用平板计数法，以出现20～300个菌落数的稀释度平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。
杂菌率的测定及计算：除样品有效菌外其他的菌均为杂菌，样品中杂菌率的计算公式为：杂菌率＝杂菌数÷(杂菌数+有效活菌数)×100。
水分的测定：温度为105±2℃，时间为0.5h，按照方法6.3.5进行测定。粒度的测定：按照方法6.3.3.2进行测定。
实施例1
一种含海藻基质的复合生防菌剂，该生防菌剂包括海藻渣、枯草芽孢杆菌2-1、解淀粉芽孢杆菌9-2，其中海藻渣与芽孢杆菌发酵液的用量比例为2:1(w/v)，枯草芽孢杆菌2-1与解淀粉芽孢杆菌9-2的用量比例为1:1。枯草芽孢杆菌2-1、解淀粉芽孢杆菌9-2均已于2014年5月29日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。其中，枯草芽孢杆菌2-1的保藏编号为：CGMCCNo.9256，分类命名为：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；解淀粉芽孢杆菌9-2的保藏编号为：CGMCCNo.9257，分类命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
一种含海藻基质的复合生防菌剂的制备方法，制备过程包括以下步骤：
1)接种发酵
a、在无菌操作条件下，用移液枪将甘油管保存的生防菌株2-1和生防菌株9-2根据不同用量分别接种到装有第一培养基的玻璃器平皿上，37℃培养18h进行菌种活化；
第一培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH值为7.5；
b、将活化后的菌株分别接种到装有第二培养基的三角培养瓶中，发酵得种子液，其中接种量为1％，发酵时间为16h，转速为180r/min，发酵温度为37℃；
第二培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5/L，氯化钠10g/L，pH值为7.5；
c、将种子液分别移入装第三培养基的发酵罐中，接种量为3％，发酵时间为22h，转速为120r/min，温度为37℃，通气量200L/h；
第三培养基配方为：酵母膏5g/L、可溶性淀粉8g/L、葡萄糖4g/L、黄豆饼粉8g/L、牛肉膏6g/L、玉米粉8g/L，PH值为6.5；
2)含海藻基质的生防菌剂制备
将发酵成熟的菌液与新鲜的褐藻藻渣混合均匀，采用湿法造粒技术制成颗粒剂；
3)干燥，用干燥设备在温度为40～50℃条件下干燥至颗粒含水量为6～18％。
菌剂检测结果如下：pH值为6.7、有效活菌数为3亿个/g、霉菌杂菌数为2.0×103个/g、杂菌率为10.05％、水分为8.45％、粒度为3～5mm。
结论：本发明的菌剂检测结果符合规定。
菌剂有效期为12个月。
实施例2
一种含海藻基质的复合生防菌剂，该生防菌剂包括海藻渣、枯草芽孢杆菌2-1、解淀粉芽孢杆菌9-2，其中海藻渣与芽孢杆菌发酵液的用量比例为8:1(w/v)，枯草芽孢杆菌2-1与解淀粉芽孢杆菌9-2的用量比例为1:2。
一种含海藻基质的复合生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)接种发酵
a、在无菌操作条件下，用移液枪将甘油管保存的生防菌株2-1和9-2根据不同用量分别接到装有第一培养基的玻璃器平皿上，37℃培养18h进行菌种活化；
第一培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH值为7.5；
b、将活化后的菌株分别接种到装有第二培养基的三角培养瓶中，发酵得种子液，其中接种量为5％，发酵时间为24h，转速为200r/min，发酵温度为37℃；
第二培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5/L，氯化钠10g/L，pH值为7.5；
c、将种子液分别移入装第三培养基的发酵罐中，接种量为1％，发酵时间为26h，转速为200r/min，温度为37℃，通气量200L/h；
第三培养基配方为：酵母膏10g/L、可溶性淀粉16g/L、葡萄糖8g/L、黄豆饼粉16g/L、牛肉膏12g/L、玉米粉16g/L，PH值为8.0；
2)含海藻基质的生防菌剂制备
将发酵成熟的菌液与新鲜的蓝藻藻渣混合均匀，采用湿法造粒技术制成颗粒剂；
3)干燥，用干燥设备在温度30～40℃条件下干燥至颗粒含水量为6～18％。
菌剂检测结果如下：pH值为6.8、有效活菌数为3亿/g、霉菌杂菌数为2.0×103个/g、杂菌率为9.81％、水分为8.13％、粒度为3-5mm。
结论：本发明的菌剂检测结果符合规定。
菌剂有效期为12个月。
实施例3
一种含海藻基质的复合生防菌剂，该生防菌剂包括海藻渣、枯草芽孢杆菌2-1、解淀粉芽孢杆菌9-2，其中海藻渣与芽孢杆菌发酵液的用量比例为4:1(w/v)，枯草芽孢杆菌2-1与解淀粉芽孢杆菌9-2的用量比例为1:3。
一种含海藻基质的复合生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)接种发酵
a、在无菌操作条件下，用移液枪将甘油管保存的生防菌株2-1和9-2根据不同用量分别接种到装有第一培养基的玻璃器平皿上，37℃培养18h进行菌种活化；
第一培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH值为7.5；
b、将活化后的菌株分别接种到装有第二培养基的三角培养瓶中，发酵得种子液，其中接种量为3％，发酵时间为20h，转速为120r/min，发酵温度为37℃；
第二培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5/L，氯化钠10g/L，pH值为7.5；
c、将种子液分别移入装第三培养基的发酵罐中，接种量为2％，发酵时间为24h，转速为150r/min，温度为37℃，通气量200L/h；
第三培养基配方为：酵母膏8g/L、可溶性淀粉12g/L、葡萄糖6g/L、黄豆饼粉13g/L、牛肉膏9g/L、玉米粉10g/L，PH值为7.0；
2)含海藻基质的生防菌剂制备
将发酵成熟的菌液与腐熟的衣藻藻渣混合均匀，采用湿法造粒技术制成颗粒剂；
3)干燥，用干燥设备在温度为50～60℃条件下干燥至颗粒含水量为6～18％。
菌剂检测结果如下：pH值为6.8、有效活菌数为3亿/g、霉菌杂菌数为2.0×103个/g、杂菌率为10.12％、水分为8.50％、粒度3-5mm。
结论：本发明的菌剂检测结果符合规定。
菌剂有效期为12个月。
实施例4
一种含海藻基质的复合生防菌剂，该生防菌剂包括海藻渣、枯草芽孢杆菌2-1、解淀粉芽孢杆菌9-2，其中海藻渣与芽孢杆菌发酵液的用量比例为5:1(w/v)，枯草芽孢杆菌2-1与解淀粉芽孢杆菌9-2的用量比例为1:5。
一种含海藻基质的复合生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)接种发酵
a、在无菌操作条件下，用移液枪将甘油管保存的生防菌株2-1和9-2根据不同用量分别接到装有第一培养基的玻璃器平皿上，37℃培养18h进行菌种活化；
第一培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH值为7.5；
b、将活化后的菌株分别接种到装有第二培养基的三角培养瓶中，发酵得种子液，其中接种量为4％，发酵时间为20h，转速为130r/min，发酵温度为37℃；
第二培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5/L，氯化钠10g/L，pH值为7.5；
c、将种子液分别移入装第三培养基的发酵罐中，接种量为3％，发酵时间为25h，转速为180r/min，温度为37℃，通气量200L/h；
第三培养基配方为：酵母膏7g/L、可溶性淀粉14g/L、葡萄糖5g/L、黄豆饼粉15g/L、牛肉膏10g/L、玉米粉14g/L，PH值为7.5；
2)含海藻基质的生防菌剂制备
将发酵成熟的菌液与腐熟的绿藻藻渣混合均匀，采用湿法造粒技术制成颗粒剂；
3)干燥，用干燥设备在温度为45～55℃条件下干燥至颗粒含水量为6～18％。
菌剂检测结果如下：pH值为6.7、有效活菌数为3亿/g、霉菌杂菌数为2.0×103个/g、杂菌率为9.13％、水分为8.02％、粒度为3-5mm。
结论：本发明的菌剂检测结果符合规定。
菌剂有效期为12个月。
实施例5本发明菌剂的抑菌试验
病原菌为：丹参根腐病原菌、天南星根腐病原菌、立枯丝核菌、黄瓜枯萎、茄子枯萎。
对照品分别为：用实施例1的制备方法制备的枯草芽孢杆菌2-1菌剂及用实施例1的制备方法制备的解淀粉芽孢杆菌9-2菌剂。
试验品为：实施例1～4制备的复合菌剂1～4。
抑菌结果见表1
表1生防菌剂对土传病原菌的抑菌活性测定
结论：抑菌结果表面，本发明的复合菌剂抑菌效果明显高于单纯一种菌剂的抑菌效果。
实施例6本发明菌剂的大田试验
试验方法：将大田生长丹参平均分为4部分，其中3部分为对照组，一部分为试验组。对照组1部分为阴性对照组，2部分为阳性对照组，阳性对照组一部分施用采用实施例1的制备方法制备的枯草芽孢杆菌2-1菌剂，一部分施用采用实施例1的制备方法制备的解淀粉芽孢杆菌9-2菌剂。试验组施用采用本发明的实施例1制备的复合菌剂。对丹参的长势、及根腐病的发病率进行比较。
结果：施用本发明的实施例1制备的复合菌剂的丹参长势明显好于阳性对照组和阴性对照组，施用本发明的复合菌剂根腐病发病率为1.34％，施用枯草芽孢杆菌2-1菌剂的丹参根腐病发病率为15.37％，施用解淀粉芽孢杆菌9-2菌剂的丹参根腐病发病率为18.27％，阴性对照组发病率为54.23％。
结论：本发明的复合菌剂生防及营养效果均较好。
本发明所提及而未详述的内容均为公知技术，以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种含海藻基质的复合生防菌剂，其特征在于，该生防菌剂包括海藻渣、枯草芽孢杆菌2-1、解淀粉芽孢杆菌9-2，其中海藻渣与芽孢杆菌发酵液的用量比例为2～8:1(w/v)，枯草芽孢杆菌2-1与解淀粉芽孢杆菌9-2的用量比例为1:1～5。
2.根据权利要求1所述的一种含海藻基质的复合生防菌剂，其特征在于，海藻渣与芽孢杆菌发酵液的用量比例为4～5:1(w/v)，枯草芽孢杆菌2-1与解淀粉芽孢杆菌9-2的用量比例为1:2～4。
3.根据权利要求1所述的一种含海藻基质的复合生防菌剂，其特征在于，芽孢杆菌发酵液中每株菌的活菌数均≥1×108cfu/mL。
4.根据权利要求1所述的一种含海藻基质的复合生防菌剂，其特征在于，菌剂基质载体为灭菌的新鲜或腐熟的海藻渣，所含成分及含量为：粗蛋白15～25％、粗纤维45～55％、灰分2～4％、余量为水分。
5.根据权利要求1所述的一种含海藻基质的复合生防菌剂，其特征在于，海藻基质可以为褐藻、蓝藻、衣藻、绿藻中的至少一种，且并不限于上述藻类。
6.照权利要求1～5任一项所述的一种含海藻基质的复合生防菌剂的制备方法，其特征在于，制备过程包括以下步骤：
1)接种发酵
a、在无菌操作条件下，用移液枪将甘油管保存的生防菌株2-1和生防菌株9-2各0.1mL分别接种到装有第一培养基的玻璃平皿上，37℃培养18h进行菌种活化；
b、将活化后的菌株分别接种到装有第二培养基的三角培养瓶中，发酵得种子液，其中接种量为1～5％，发酵时间为16～24h，转速为120～200r/min，发酵温度为37℃；
c、将种子液分别移入装第三培养基的发酵罐中，接种量为1～3％，发酵时间为22～26h，转速为120～200r/min，温度为37℃，通气量200L/h；
2)含海藻基质的生防菌剂制备
将发酵成熟的菌液与海藻渣混合均匀，采用湿法造粒技术制成颗粒剂；
3)干燥；
4)包装备用。
7.根据权利要求6所述的一种含海藻基质的生防菌剂的制备方法，其特征在于，
第一培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH值为7.5；
第二培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5/L，氯化钠10g/L，pH值为7.5；
第三培养基配方为：酵母膏5～10g/L、可溶性淀粉8～16g/L、葡萄糖4～8g/L、黄豆饼粉8～16g/L、牛肉膏6～12g/L、玉米粉8～16g/L，PH值为6.5～8.0。
8.根据权利要求6所述的一种含海藻基质的生防菌剂的制备方法，其特征在于，干燥的工艺条件为：用干燥设备在温度为40～50℃条件下干燥至颗粒含水量为6～18％。
9.根据权利要求1～5任一项所述的一种含海藻基质的复合生防菌剂的用途，其特征在于，该菌剂对中药材丹参腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)、天南星根腐病菌(Mucorcircinelloides)、北沙参立枯菌(Rhizoctoniasolani)、桔梗枯萎病菌(Fusariumoxysporum)以及蔬菜作物黄瓜尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、黄瓜立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、棉花尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)和棉花立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)等病原真菌有较强抑菌作用。
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