CN109370925A - 一种淡紫拟青霉的固体发酵培养基以及淡紫拟青霉的培养方法 - Google Patents

一种淡紫拟青霉的固体发酵培养基以及淡紫拟青霉的培养方法 Download PDF

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CN109370925A CN201811564112.4A CN201811564112A CN109370925A CN 109370925 A CN109370925 A CN 109370925A CN 201811564112 A CN201811564112 A CN 201811564112A CN 109370925 A CN109370925 A CN 109370925A
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钱潘攀
骆毛喜
林克明
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Abstract

本发明提供了一种淡紫拟青霉的固体发酵培养基以及淡紫拟青霉的培养方法，属于微生物培养技术领域，所述固体发酵培养基包括以下重量份的组分：麦麸5～40份，谷壳1～10份，玉米芯1～10份，菇渣10～70份，水果渣10～70份。所述方法包括以下步骤：1)将活化的淡紫拟青霉接种到一级液体培养基一级培养获得一级种子液；2)将一级种子液接种到二级液体培养基中二级培养；3)将所述二级种子液接种到固体发酵培养基中进行固体发酵培养5～8d。利用本发明提供的固体发酵培养基培养淡紫拟青霉能够缩短发酵时间短、降低发酵成本低、提高淡紫拟青霉的产量。

Description

一种淡紫拟青霉的固体发酵培养基以及淡紫拟青霉的培养 方法
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，尤其涉及一种淡紫拟青霉的固体发酵培养基以及淡紫拟青霉的培养方法。
背景技术
线虫可侵袭和寄生植物，被侵袭和寄生的植物因线虫吸收体内营养而影响正常的生长发育，并且线虫代谢的分泌物会刺激寄主植物的细胞和组织，导致植株畸形。大多数植物线虫侵害植物的地下部分，如根、块茎等，根部可表现为结瘤、坏死、根短粗和丛生，导致农作物大量减产或质量严重下降。常见的植物线虫病有根结线虫病、大豆胞囊线虫病、小麦粒线虫病、甘薯茎线虫病、水稻干尖线虫病、柑橘半穿刺线虫病等。
淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus(Thorn.)Samson)属于内寄生性真菌，是一些植物寄生线虫的重要天敌，能够寄生于卵，也能侵染幼虫和雌虫，可有效防治多种作物根结线虫、胞囊线虫、茎线虫等植物线虫病的危害。淡紫拟青霉的寄主广、易培养，而且功效高，特别是在控制植物病原线虫方面具有显著功效。半个多世纪以来，国内外的研究学者对淡紫拟青霉进行了广泛而深入的研究，在生物学、生态学、控害效能与田间应用等方面取得了一系列的研究成果，在生物防治上表现出巨大的潜力，市场前景广阔，虽然传统的真菌发酵方法能够实现工业化生产，但是存在发酵时间长，成本高，收率低等问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种淡紫拟青霉的固体发酵培养基以及淡紫拟青霉的培养方法；所述方法利用农业废弃物培养淡紫拟青霉，具有发酵时间短、成本低、收率高等优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种淡紫拟青霉的固体发酵培养基，包括以下重量份的组分：麦麸5～40份，谷壳1～10份，玉米芯1～10份，菇渣10～70份和水果渣10～70份。
优选的，包括以下重量份的组分：麦麸10～20份，谷壳3～8份，玉米芯3～8份，菇渣40～50份和水果渣40～50份。
优选的，所述菇渣为木耳菇渣和/或杏鲍菇菇渣。
优选的，当所述菇渣为木耳菇渣和杏鲍菇菇渣时，所述木耳菇渣和杏鲍菇菇渣的质量比为1：(0.5～2)。
优选的，所述水果渣为苹果渣和/或梨渣。
本发明还提供了利用所述固体发酵培养基培养淡紫拟青霉菌的方法，包括以下步骤：
1)将活化的淡紫拟青霉接种到一级液体培养基中25～30℃一级培养35～50h获得一级种子液；
2)将步骤1)中所述一级种子液接种到二级液体培养基中25～30℃二级培养55～75h获得二级种子液；
3)将所述二级种子液接种到固体发酵培养基中进行固体发酵培养5～8d；
步骤3)中所述固体发酵的1～3d，环境湿度为80～90％，环境温度为24～28℃，菌料温度为24～28℃；
在所述固体发酵的4～5d，环境湿度为40～50％，环境温度为26℃；菌料温度为26～28℃；
在所述固体发酵的6～7d，环境湿度为30～40％，环境温度为28～30℃，菌料温度为24～28℃；
步骤2)和步骤3)中所述培养为避光培养。
优选的，步骤3)中所述固体发酵培养的28～32h时进行翻盘散热。
优选的，步骤1)中所述一级培养的初始pH值为6.0～7.0，接种体积为0.5～1.5％；
所述一级培养的过程进行通气，所述一级培养的24h内，通气量为10～20m3/h，所述一级培养的24h后，通气量为15～24m3/h。
优选的，步骤2)中所述一级培养的初始pH值为6.0～7.0，接种体积为5～15％；
所述二级培养的过程进行通气，所述二级培养的24h内，通气量为130～170m3/h，所述二级培养的24h后，通气量为200～260m3/h；
优选的，步骤2)中所述二级培养的过程伴随搅拌，所述搅拌的频率为1～2次/h，每次搅拌的时间为10～20min。
本发明的有益效果：本发明中所述淡紫拟青霉的固体发酵培养基，包括麦麸，谷壳，玉米芯，菇渣和水果渣；原来均为农业副产品或废弃物，来源广泛，成本低；所述麦麸，谷壳，玉米芯，菇渣和水果渣按照上述比例复配组成的固体发酵培养基中营养成分丰富，含有大量的有机质和蛋白质，可以为微生物的生长提供充足的碳源和氮源，进过合适的配方调配，可以被微生物的工业化生产所利用。从而提高了资源的利用率，减少污染。利用本发明提供的固体发酵培养基培养淡紫拟青霉能够缩短发酵时间短、降低发酵成本低、提高淡紫拟青霉的收率。
具体实施方式
本发明提供了一种淡紫拟青霉的固体发酵培养基，包括以下重量份的组分：麦麸5～40份，谷壳1～10份，玉米芯1～10份，菇渣10～70份，水果渣10～70份。
本发明中，所述固体发酵培养基包括5～40份麦麸，优选为10～20份，更优选为12～18份；本发明对所述麦麸的来源和规格没有特殊限定，采用本领域常规市售麦麸即可。
本发明中，所述固体发酵培养基包括1～10份谷壳，优选为3～8份，更优选为4～6份；本发明对所述谷壳的来源和规格没有特殊限定，采用本领域常规市售谷壳即可。
本发明中，所述固体发酵培养基包括1～10份玉米芯，优选为3～8份，更优选为4～6份；本发明对所述玉米芯的来源和规格没有特殊限定，采用本领域常规市售玉米芯即可。
本发明中，所述固体发酵培养基包括10～70份菇渣，优选为40～50份，更优选为42～48份，本发明中，所述菇渣优选为木耳菇渣和/或杏鲍菇菇渣。当所述菇渣为木耳菇渣和杏鲍菇菇渣时，所述木耳菇渣和杏鲍菇菇渣的质量比优选为1：(0.5～2)，更优选为1:1。在本发明中所述菇渣为食用菌培养的废弃物。
本发明中，所述固体发酵培养基包括10～70份水果渣，优选为40～50份，更优选为42～48份。本发明中，所述水果渣优选为苹果渣和/或梨渣。本发明对所述苹果渣和梨渣的来源没有特殊限定，优选为水果加工工厂破碎压榨提汁后的剩余物，所述苹果渣和/或梨渣主要由果皮、果核和残余果肉组成，含有可溶性糖、维生素、矿物质及纤维素等丰富的营养物质。
本发明中，所述固体发酵培养基还包括木屑、豆粕、小米糠、棉籽壳、木薯渣、花生壳和面包渣中的一种或多种。本发明所述固体发酵培养基中木屑、豆粕、小米糠、棉籽壳、木薯渣、花生壳和面包渣的重量份优选独立为1～30份。
本发明中所述淡紫拟青霉的固体发酵培养基，包括麦麸，谷壳，玉米芯，菇渣和水果渣；所述麦麸，谷壳，玉米芯，菇渣和水果渣按照上述比例复配组成的固体发酵培养基中营养成分丰富，在本发明的一个具体实施过程中，所述固体发酵培养基的原料的营养成分如表1所示。
表1淡紫拟青霉的固体发酵培养基组成原料的营养成分表
本发明还提供了利用所述固体发酵培养基培养淡紫拟青霉菌的方法，包括以下步骤：1)将活化的淡紫拟青霉接种到一级液体培养基中25～30℃一级培养35～50h获得一级种子液；2)将步骤1)中所述一级种子液接种到二级液体培养基中25～30二级培养55～75h获得二级种子液；3)将所述二级种子液接种到固体发酵培养基中进行固体发酵培养5～8d；步骤3)中所述固体发酵的1～3d，环境湿度为80～90％，环境温度为24～28℃，菌料温度为24～28℃；在所述固体发酵的4～5d，环境湿度为40～50％，环境温度为26℃；菌料温度为26～28℃；在所述固体发酵的第6～7d，环境湿度为30～40％，环境温度为28～30℃，菌料温度为24～28℃；步骤2)和步骤3)中所述培养为避光培养。
本发明将活化的淡紫拟青霉接种到一级液体培养基中25～30℃培养35～50h获得一级种子液。在本发明中，所述淡紫拟青霉的来源为常规市售菌种。本发明中所述活化培养采用本领域常规淡紫拟青霉活化培养的方法即可，无其他特殊要求；在本发明具体实施过程中，优选的将淡紫拟青霉菌种接种到PDA固体培养基中进行活化。本发明中所述一级液体培养基以1L计，优选的包括以下组分：蔗糖30～50g，黄豆粉15～25g，硝酸钠1～8g，磷酸氢二钾1.0～2.0g，硫酸锌0.18～0.30g，硫酸铁0.01～0.08g和余量的水。本发明中，所述一级培养的温度优选为26～29℃，所述一级培养的时间优选为38～48h；所述一级培养的初始pH值优选为6.0～7.0，更优选为6.2～6.8；所述接种的接种体积优选为0.5～1.5％，更优选为0.8～1.2％；本发明所述一级培养的过程优选的进行通气，所述一级培养的24h内，通气量优选为10～20m3/h，更优选为12～18m3/h；所述一级培养的24h后，通气量优选为15～24m3/h，更优选为18～22m3/h。本发明所述一级培养过程中进行避光处理，所述避光处理的目的是更适合淡紫拟青霉的生长。
本发明在获得所述一级种子液后，将所述一级种子液接种到二级液体培养基中25～30℃二级培养55～75h获得二级种子液。在本发明中，所述二级培养的温度优选为26～29℃，所述二级培养的时间优选为58～72h。本发明中所述二级液体培养基以1L计，优选的包括以下组分：蔗糖30～50g，黄豆粉15～25g，硝酸钠1～8g，磷酸氢二钾1.0～2.0g，硫酸锌0.18～0.30g，硫酸铁0.01～0.08g和余量的水。本发明中，所述二级培养的初始pH值优选为6.0～7.0，所述二级培养的接种体积优选为5～15％，更优选为8～12％，最优选为10％；本发明中，所述二级培养的过程进行通气，所述二级培养的24h内，通气量优选为130～170m3/h，更优选为140～160m3/h；所述二级培养的24h后，通气量优选为200～260m3/h；更优选为220～240m3/h。本发明所述二级培养过程伴随搅拌，所述搅拌的频率优选为1～2次/h，每次搅拌的时间为10～20min。本发明所述二级培养过程中进行避光处理，所述避光处理的目的是更适合淡紫拟青霉的生长。
本发明在获得所述二级种子液后，将所述二级种子液接种到固体发酵培养基中进行固体发酵培养5～8d。在本发明中，所述固体发酵培养基优选进行灭菌，所述灭菌优选为高温湿热灭菌；所述高温湿热灭菌的温度优选为121℃，所述高温湿热灭菌的时间优选为25～30min。本发明中所述固体发酵培养基优选的至于不锈钢可旋转的杀菌器(高压高温灭菌锅)中进行灭菌。本发明在所述固体发酵培养基灭菌后优选的进行冷却，待所述固体发酵培养基冷却至25℃以下，将所述二级种子培养液接种至所述固体发酵培养基中；所述二级种子培养液与所述固体发酵培养基的质量比优选为(0.5～1)：1，更优选为0.8:1.本发明在所述接种后，优选的进行旋转搅拌，所述旋转搅拌的时间优选为25～35min，更优选为30min；所述旋转搅拌结束后，优选的通过杀菌器反转，使物料倒出。本发明使用不锈钢可旋转杀菌器，处理效率高，灭菌彻底，杂菌率低，提高淡紫拟青霉生产的纯度。
本发明中，在所述固体发酵的1～3d，环境湿度为80～90％，优选为82～88％；环境温度24～28℃，菌料的温度为24～28℃；所述固体发酵培养的28～32h时优选的进行翻盘散热。本发明对所述翻盘散热的操作没有特殊要求，采用常规操作即可。本发明在所述固体发酵的4～5d，环境湿度为40～50％，优选为43～47％，环境温度为26℃；菌料温度为26～28℃；在所述固体发酵的第6～7d，环境湿度为30～40％，环境温度为28～30℃，菌料温度为24～28℃。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
活化培养基：PDA培养基
一级种子培养基：蔗糖40g/L，黄豆粉20g/L，硝酸钠5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸锌0.23g/L，硫酸铁0.05g/L，余量为水
二级种子培养基：蔗糖40g/L，黄豆粉20g/L，硝酸钠5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸锌0.23g/L，硫酸铁0.05g/L，余量为水。
淡紫拟青霉固体发酵培养基：
麦麸20份，谷壳5份，玉米芯5份，木耳菇渣20份，杏鲍菇菇渣20份，苹果渣50份。
步骤：
菌种活化：
配置PDA培养基，将菌种从保藏状态恢复到室温状态，将冷冻的菌种解冻，将保藏的菌种接种到PDA培养基中培养，挑选培养基茁壮的菌落，挑选其中部分菌落接种到新的PDA培养基中培养，重复此步骤2-3次，从而得到生长良好的活化的淡紫拟青霉。
一级种子液培养：
活化后的淡紫拟青霉按1％的接种量(体积)接种于淡紫拟青霉一级液体培养基中，培养的初始pH值为6.5，避光条件下，27℃进行一级液体培养45h，培养的过程进行通气，具体为：进入培养24h内，通气量为15m3/h，培养24h后，通气量为20m3/h；得到淡紫拟青霉一级种子液；
二级种子液培养：
将一级种子液接种于淡紫拟青霉二级液体培养基中避光条件下，27℃进行二级液体培养60h，培养的初始pH值为6.8，培养在黑暗中进行；培养的过程需要通气，具体为：进入培养24h内，通气量为150m3/h，培养24h后，通气量为230m3/h；培养在搅拌下进行，搅拌的频率为2次/h，每次搅拌的时间为18min.
固体发酵培养
将固体发酵基质按照配方倒入不锈钢可旋转的培养基杀菌器，蒸气进入灭菌锅夹套，进行升温加热，加热至121℃时，保持该温度30min，然后在夹套中通冷凝水进行降温，降至25℃以下，往杀菌器中添加经过二级液体培养的菌液，(菌液添加比例为80％,质量比。)并进行旋转搅拌，搅拌30min，搅拌完成后，通过灭菌锅反转，使物料倒出。
固体发酵培养的过程进行温度和湿度的控制，所述温度和湿度的控制程序具体为：在进入固体培养1～3d之内控制环境湿度为80～90％，环境温度为24～28℃，菌料温度控制为24～28℃，在进入固体培养4～5d之内，控制环境湿度为40～50％，环境温度为26℃，菌料温度为26～28℃；在所述固体发酵的第6～7d，环境湿度为30～40％，环境温度为28～30℃，菌料温度为24～28℃。
所述固体培养28～32h时进行翻盘散热。
测定淡紫拟青霉的产量，检测方法参照国标GB 20287农用微生物菌剂，结果：3.5×109个孢子/g。
实施例2
活化培养基：PDA培养基
一级种子培养基：蔗糖40g/L，黄豆粉20g/L，硝酸钠5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸锌0.23g/L，硫酸铁0.05g/L，余量为水。
二级种子培养基：蔗糖40g/L，黄豆粉20g/L，硝酸钠5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸锌0.23g/L，硫酸铁0.05g/L，余量为水。
淡紫拟青霉固体发酵培养基：
麦麸15份，谷壳4份，玉米芯6份，木耳菇渣40份，苹果渣25份，梨渣10份。
步骤：
菌种活化：
配置PDA培养基，将菌种从保藏状态恢复到室温状态，将冷冻的菌种解冻，将保藏的菌种接种到PDA培养基中培养，挑选培养基茁壮的菌落，挑选其中部分菌落接种到新的PDA培养基中培养，重复此步骤2-3次，从而得到生长良好的活化的淡紫拟青霉。
一级种子液培养：
活化后的淡紫拟青霉按1.2％的接种量(体积)接种于淡紫拟青霉一级液体培养基中，培养的初始pH值为6.8，避光条件下，28℃进行一级液体培养50h，培养的过程进行通气，具体为：进入培养24h内，通气量为12m3/h，培养24h后，通气量为18m3/h；得到淡紫拟青霉一级种子液；
二级种子液培养：
将一级种子液接种于淡紫拟青霉二级液体培养基中避光条件下，28℃进行二级液体培养70h，培养的初始pH值为6.5，培养在黑暗中进行；培养的过程需要通气，具体为：进入培养24h内，通气量为180m3/h，培养24h后，通气量为250m3/h；培养在搅拌下进行，搅拌的频率为1次/h，每次搅拌的时间为15min.
固体发酵培养
将固体发酵基质按照配方倒入不锈钢可旋转的培养基杀菌器，蒸气进入灭菌锅夹套，进行升温加热，加热至121℃时，保持该温度30min，然后在夹套中通冷凝水进行降温，降至25℃以下，往杀菌器中添加经过二级液体培养的菌液，(菌液添加质量为固体发酵培养基质量的60％。)并进行旋转搅拌，搅拌30min，搅拌完成后，通过灭菌锅反转，使物料倒出。
固体发酵培养的过程进行温度和湿度的控制，所述温度和湿度的控制程序具体为：在进入固体培养1～3d之内控制环境湿度为82～86％，环境温度为25～27℃，菌料温度控制为25～27℃，在进入固体培养4～5d之内，控制环境湿度为43～47％，环境温度为26℃，菌料温度为26～28℃；在所述固体发酵的第6～7d，环境湿度为30～40％，环境温度为28～30℃，菌料温度为24～28℃。
所述固体培养28～32h时进行翻盘散热。
测定淡紫拟青霉的产量，检测方法参照国标GB 20287农用微生物菌剂，结果：3.2×109个孢子/g。
实施例3
活化培养基：PDA培养基
一级种子培养基：蔗糖40g/L，黄豆粉20g/L，硝酸钠5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸锌0.23g/L，硫酸铁0.05g/L，余量为水。
二级种子培养基：蔗糖40g/L，黄豆粉20g/L，硝酸钠5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸锌0.23g/L，硫酸铁0.05g/L，余量为水。
淡紫拟青霉固体发酵培养基：
麦麸20份，谷壳8份，玉米芯5份，杏鲍菇渣45份，苹果渣30份，梨渣20份。
步骤：
菌种活化：
配置PDA培养基，将菌种从保藏状态恢复到室温状态，将冷冻的菌种解冻，将保藏的菌种接种到PDA培养基中培养，挑选培养基茁壮的菌落，挑选其中部分菌落接种到新的PDA培养基中培养，重复此步骤2-3次，从而得到生长良好的活化的淡紫拟青霉。
一级种子液培养：
活化后的淡紫拟青霉按1.2％的接种量(体积)接种于淡紫拟青霉一级液体培养基中，培养的初始pH值为6.8，避光条件下，28℃进行一级液体培养50h，培养的过程进行通气，具体为：进入培养24h内，通气量为12m3/h，培养24h后，通气量为18m3/h；得到淡紫拟青霉一级种子液；
二级种子液培养：
将一级种子液接种于淡紫拟青霉二级液体培养基中避光条件下，28℃进行二级液体培养70h，培养的初始pH值为6.5，培养在黑暗中进行；培养的过程需要通气，具体为：进入培养24h内，通气量为180m3/h，培养24h后，通气量为250m3/h；培养在搅拌下进行，搅拌的频率为1次/h，每次搅拌的时间为15min。
固体发酵培养
将固体发酵基质按照配方倒入不锈钢可旋转的培养基杀菌器，蒸气进入灭菌锅夹套，进行升温加热，加热至121℃时，保持该温度30min，然后在夹套中通冷凝水进行降温，降至25℃以下，往杀菌器中添加经过二级液体培养的菌液，(菌液添加质量为固体发酵培养基质量的60％。)并进行旋转搅拌，搅拌30min，搅拌完成后，通过灭菌锅反转，使物料倒出。
固体发酵培养的过程进行温度和湿度的控制，所述温度和湿度的控制程序具体为：在进入固体培养1～3d之内控制环境湿度为85％，环境温度为26℃，菌料温度控制为26℃，在进入固体培养4～5d之内，控制环境湿度为43～47％，环境温度为26℃，菌料温度为26～28℃；在所述固体发酵的第6～7d，环境湿度为30～40％，环境温度为28～30℃，菌料温度为24～28℃。
所述固体培养29～30h时进行翻盘散热。
测定淡紫拟青霉的产量，检测方法参照国标GB 20287农用微生物菌剂，结果：3.8×109个孢子/g。
由上述实施例可知，本发明提供的淡紫拟青霉固体发酵培养基及培养方法，能够有效的利用的农业废弃物，降低污染，节能环保。提高淡紫拟青霉产量，从对比例的平均5亿/克，提高到平均35亿/克。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种淡紫拟青霉的固体发酵培养基，其特征在于，包括以下重量份的组分：麦麸5～40份，谷壳1～10份，玉米芯1～10份，菇渣10～70份和水果渣10～70份。
2.根据权利要求1所述的固体发酵培养基，其特征在于，包括以下重量份的组分：麦麸10～20份，谷壳3～8份，玉米芯3～8份，菇渣40～50份和水果渣40～50份。
3.根据权利要求1或2所述的固体发酵培养基，其特征在于，所述菇渣为木耳菇渣和/或杏鲍菇菇渣。
4.根据权利要求3所述的固体发酵培养基，其特征在于，当所述菇渣为木耳菇渣和杏鲍菇菇渣时，所述木耳菇渣和杏鲍菇菇渣的质量比为1：(0.5～2)。
5.根据权利要求1或2所述的固体发酵培养基，其特征在于，所述水果渣为苹果渣和/或梨渣。
6.利用权利要求1～5任意一项所述固体发酵培养基培养淡紫拟青霉菌的方法，包括以下步骤：
1)将活化的淡紫拟青霉接种到一级液体培养基中25～30℃一级培养35～50h获得一级种子液；
2)将步骤1)中所述一级种子液接种到二级液体培养基中25～30℃二级培养55～75h获得二级种子液；
3)将所述二级种子液接种到固体发酵培养基中进行固体发酵培养5～8d；
步骤3)中所述固体发酵的第1～3d，环境湿度为80～90％，环境温度为24～28℃，菌料温度为24～28℃；
在所述固体发酵的第4～5d，环境湿度为40～50％，环境温度为26℃；菌料温度为26～28℃；在所述固体发酵的第6～7d，环境湿度为30～40％，环境温度为28～30℃，菌料温度为24～28℃；
步骤2)和步骤3)中所述培养为避光培养。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述固体发酵培养的28～32h时进行翻盘散热。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述一级培养的初始pH值为6.0～7.0，接种体积为0.5～1.5％；
所述一级培养的过程进行通气，所述培养的24h内，通气量为10～20m3/h，所述培养的24h后，通气量为15～24m3/h。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述二级培养的初始pH值为6.0～7.0，接种体积为5～15％；
所述二级培养的过程进行通气，所述二级培养的24h内，通气量为130～170m3/h，所述二级培养的24h后，通气量为200～260m3/h。
10.根据权利要求6或9所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的二级种子液的培养过程伴随搅拌，所述搅拌的频率为1～2次/h，每次搅拌的时间为10～20min。
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