CN114480135A - 皂素渣在生产淡紫拟青霉中的应用及生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物利用技术领域，具体涉及皂素渣在生产淡紫拟青霉中的应用及生产方法。本发明提供了皂素渣在生产淡紫拟青霉中的应用，首次通过油茶皂素培养基对淡紫拟青霉的常见市售菌种进行抗性筛选，选择具有抗性茶皂素能力和不降解茶皂素能力的淡紫拟青霉菌株，进行功能优化，利用油茶籽衍生品中的油茶蒲、油茶籽壳、皂素渣、茶籽饼和茶粕原料，提供一种利用皂素渣生产淡紫拟青霉的方法，实现淡紫拟青霉微生物菌剂的生产，生产出了适用于滴灌行的淡紫拟青霉菌剂，缓解市场中农业应用领域淡紫拟青霉供小于需的问题，并提高了油茶行业油茶衍生产品的附加值。

Description

皂素渣在生产淡紫拟青霉中的应用及生产方法

技术领域

本发明属于微生物利用技术领域，具体涉及皂素渣在生产淡紫拟青霉中的应用及生产方法。

背景技术

皂素渣是山茶籽经压榨后茶籽饼脱除残余油脂产生的，含有较高含量的茶皂素，因为茶皂素具有较高的辛辣味和苦味，因具有溶血活性，不适用于作为畜禽牧畜的饲料，主要应用在虾蟹养殖清塘上使用，应用领域单一，产品价格受市场影响波动较大，且价格低。

根结线虫是高度专化型杂食性植物病原线虫，以口针吸取植物地下根部营养，危害地上茎、叶和果实，并传播真菌、细菌性冰原微生物，主要危害瓜类、茄果类等果蔬植物根部，因为防治困难，农业上以综合防治为主，化学、生物防治为辅，而近几年来，淡紫拟青霉是报告出有效防治根结线虫的生防真菌，能够有效抑制根结线虫繁殖。

目前淡紫拟青霉的繁殖生产，主要是两种方式，一种是固体发酵，一种是液体发酵，因受环境湿度、温度、营养物质的严格制约，现在淡紫拟青霉的生产大都是通过液体发酵罐高浓度菌种液体发酵扩繁后，在发酵罐中严格控制罐体温度、压力、营养条件等扩繁成功，而后再经低温喷雾干燥和中间载体吸附，生产过程复杂，能耗高，生产成本高；而固体发酵，目前主要以麸皮、大米、玉米粉、红薯粉和甘蔗渣等蛋白质含量高的物料进行配比，生产淡紫拟青霉，因为生产过程中杂菌容易滋生，使得固体发酵产生许多的废料，进而被淘汰，产品得率低，进而使得淡紫拟青霉的菌种销售市场供小于求，致使淡紫拟青霉的价格整体在3～5万元/吨左右。目前并没有一种生产成本低、且方法简单的淡紫拟青霉生产方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供皂素渣在生产淡紫拟青霉中的应用及生产方法，使淡紫拟青霉在自然条件下进行快速繁殖，缩短生产工艺，降低生产成本，增加产品市场价格竞争优势。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了皂素渣在生产淡紫拟青霉中的应用。

本发明还提供了利用皂素渣生产淡紫拟青霉的方法，包括以下步骤：(1)将淡紫拟青霉菌粉接种到液体培养基上进行有氧发酵，待淡紫拟青霉浓度≥100亿/mL时停止发酵，得淡紫拟青霉源菌液；所述液体培养基包括以下质量百分含量的组分：茶皂素液1％～5％，油茶饼粉12.5％～18％，水果渣浆20％～33％，乳酸链球菌素0.01％～0.02％，亚磷酸钾0.2％～0.5％和余量的水；

(2)将所述淡紫拟青霉源菌液喷淋到固体培养基上混合均匀，有氧发酵3d，得淡紫拟青霉生产菌种；所述固体培养基包括以下质量百分含量的组分：油茶蒲10％～20％，油茶籽壳10％～15％，皂素渣25％～30％，百藤果渣4％～8％，乳酸链球菌素0.01％～0.02％，碳酸氢纳0.4％～0.8％和余量的水。

优选的，步骤(1)所述淡紫拟青霉菌粉的接种质量为所述液体培养基质量的1％～5％。

优选的，步骤(1)所述液体培养基的制备方法，包括：将茶皂素液、油茶饼粉、水果渣浆和亚磷酸钾混合，得物料a；

将乳酸链球菌素和水混合均匀，得物料b，将物料b与物料a混合并定容，得所述液体培养基。

优选的，步骤(1)所述有氧发酵过程中伴随搅拌，所述搅拌的转速为200r/h，所述有氧发酵的温度为25～30℃。

优选的，步骤(2)所述固体培养基的制备方法，包括：将油茶蒲、油茶籽壳、皂素渣和百藤果渣混合后进行蒸汽爆破，冷却得物料c；

将乳酸链球菌素、碳酸氢纳和水混合，得物料d，将物料d与物料c混合，得所述固体培养基。

优选的，所述蒸汽爆破的温度为121℃，压力为1.91MPa。

优选的，步骤(2)所述淡紫拟青霉源菌液的喷淋质量为所述固体培养基质量的1％～5％。

优选的，步骤(2)所述有氧发酵时，将淡紫拟青霉源菌液和固体培养基的混合物料，平铺3～10cm厚进行所述有氧发酵，所述有氧发酵的温度为25～35℃。

优选的，在步骤(2)所述有氧发酵结束后，收集发酵完全的菌块，低温粉碎得淡紫拟青霉可溶性高细粉(淡紫拟青霉菌剂是一种微生物活体真菌孢子不是化学物质，本发明所述可溶性高细粉是指粉剂能够均匀分散在溶剂中，因粒径较小能够自由通过滴灌或喷雾孔直达植物根系或叶片，并不是指化学物质性质上的物质溶解的可溶性)。

有益效果：茶皂素具有优良的抗菌性能，在微生物菌剂的生产过程中，一般不作为微生物菌剂的生产原料，本发明首次打破这一偏见，通过油茶皂素培养基对淡紫拟青霉的常见市售菌种进行抗性筛选，选择具有抗性茶皂素能力和不降解茶皂素能力的淡紫拟青霉菌株，进行功能优化，利用油茶籽衍生品中的油茶蒲、油茶籽壳、皂素渣、茶籽饼和茶粕原料，提供一种利用皂素渣生产淡紫拟青霉的方法，分别对淡紫拟青霉液体和固体进行发酵的培养基组成、发酵工艺要点进行技术改进，实现淡紫拟青霉微生物菌剂的生产，生产出了适用于滴灌行的淡紫拟青霉菌剂，缓解市场中农业应用领域淡紫拟青霉供小于需的问题，并提高了油茶行业油茶衍生产品的附加值，拓宽油茶行业收益途径，扩大油茶的收益方向，增加油茶行业的经济效益，引领油茶行业健康发展。利用本发明的生产方法，首先经过液体培养基的筛选和扩繁，再经固体培养基的发酵生产，使得获得的菌体纯种率≥98％，解决淡紫拟青霉活性降低的问题，使得菌体活力旺盛，菌体防治线虫能力强。

附图说明

图1为一种利用皂素渣生产淡紫拟青霉的生产工艺流程图。

具体实施方式

本发明提供了皂素渣在生产淡紫拟青霉中的应用。

在本领域中，油茶蒲、油茶籽壳、皂素渣因均为油茶籽压榨茶油后的副产物，含有茶皂素，具有辛辣味和苦味，对鱼具有强烈的溶血性，所以不能作为饲料使用，只能随意的丢弃或者作为生物质燃料的填充物等，本发明通过技术改进创新，实现油茶产业中废弃物油茶蒲、油茶籽壳、皂素渣向高经济淡紫拟青霉产品的转变，解决了油茶产业中油茶蒲、油茶籽壳、皂素渣利用难的难题，扩大油茶产业中废弃产物的处理方向，经济效益的收入方向等。

本发明所述皂素渣优选包括油茶生产过程中产生的茶皂素液、油茶饼、油茶蒲、油茶籽壳和皂素渣，皂素渣作为发酵培养基原料，丰富的营养成分适合淡紫拟青霉大量繁殖，油茶蒲和油茶籽壳含有丰富的木质纤维，在发酵的过程中，可以增加不锈钢料块中的透气性。

本发明还提供了利用皂素渣生产淡紫拟青霉的方法，如图1所示，包括以下步骤：(1)将淡紫拟青霉菌粉接种到液体培养基上进行有氧发酵，待淡紫拟青霉浓度≥100亿/mL时停止发酵，得淡紫拟青霉源菌液；所述液体培养基包括以下质量百分含量的组分：茶皂素液1％～5％，油茶饼粉12.5％～18％，水果渣浆20％～33％，乳酸链球菌素0.01％～0.02％，亚磷酸钾0.2％～0.5％和余量的水；

(2)将所述淡紫拟青霉源菌液喷淋到固体培养基上混合均匀，有氧发酵3d，得淡紫拟青霉生产菌种；所述固体培养基包括以下质量百分含量的组分：油茶蒲10％～20％，油茶籽壳10％～15％，皂素渣25％～30％，百藤果渣4％～8％，乳酸链球菌素0.01％～0.02％，碳酸氢纳0.4％～0.8％和余量的水。

本发明将淡紫拟青霉菌粉接种到液体培养基上进行有氧发酵，待淡紫拟青霉浓度≥100亿/mL时停止发酵，得淡紫拟青霉源菌液。本发明所述淡紫拟青霉菌粉优选为本领域的常规市售产品，如在本发明实施例中，以购自购北京百欧博伟生物技术有限公司的淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus，平台编号bio-28605)为淡紫拟青霉的原始种，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。

本发明将所述淡紫拟青霉菌粉接种到液体培养基上，所述淡紫拟青霉菌粉的接种质量优选为所述液体培养基质量的1％～5％。本发明所述液体培养基的制备方法，优选包括：将茶皂素液、油茶饼粉、水果渣浆和亚磷酸钾混合，得物料a；将乳酸链球菌素和水混合均匀，得物料b，将物料b与物料a混合并定容，得所述液体培养基。本发明所述茶皂素液优选为购买的纯皂素液，纯度在99.0％以上。本发明所述水果渣优选为将混合水果与水按照1:1的质量比混合后，经压榨后的残留物。本发明对所述混合水果的水果类型并没有特殊限定，优选包括：葡萄、猕猴桃、西瓜、甜瓜和火龙果中的多种。

本发明优选在发酵罐中将物料b和物料a混合，并加水定容，而后在121℃温度下进行高压蒸汽灭菌45min，冷却到室温25～35℃后，通过液体发酵罐上的无菌导管，将市售的淡紫拟青霉菌粉添加到液体发酵罐中，调节发酵罐温度25～30℃，发酵罐内搅拌棒转速200r/h，进行淡紫拟青霉接种源菌的制备，发酵过程中，调整发酵罐上无菌阀门，进行发酵罐引气，增加发酵罐内氧气含量。

本发明在所述有氧发酵过程中，优选还包括通过发酵罐体上的无菌接液灌，每1小时取样20ml进入微生物检测实验室，检测发酵罐发酵液体中淡紫拟青霉的浓度，当淡紫拟青霉浓度大于等于100亿/mlL时，关闭发酵罐，此时发酵罐液体为淡紫拟青霉源菌液，将淡紫拟青霉源菌液送入生产车间，对原料进行淡紫拟青霉源菌的接种。

本发明将所述淡紫拟青霉源菌液喷淋到固体培养基上混合均匀，有氧发酵3d，得淡紫拟青霉生产菌种。本发明所述喷淋和有氧发酵优选在灭菌发酵房中进行，且在所述喷淋时，所述淡紫拟青霉源菌液的喷淋质量优选为所述固体培养基质量的1％～5％，边喷淋边混料，保证固体培养及和淡紫拟青霉源菌液中的微生物充分混匀。

本发明所述固体培养基的制备方法，优选包括：将油茶蒲、油茶籽壳、皂素渣和百藤果渣混合后进行蒸汽爆破，冷却得物料c；将乳酸链球菌素、碳酸氢纳和水混合，得物料d，将物料d与物料c混合，得所述固体培养基。本发明所述蒸汽爆破的温度优选为121℃，压力优选为1.91MPa，时间优选为30min。本发明将物料d与物料c混合，使得固体培养基的含水量为25％～58％，而后进行121℃，45min的高压蒸汽灭菌，冷却后得所述固体培养基。

本发明进行所述有氧发酵时，优选在灭菌发酵房中，按照料厚3～10cm的标准，平铺在50cm×30cm灭菌的不锈钢铁盆上，然后放入灭菌发酵房的发酵架床之上发酵，保证灭菌发酵房的温度25～35℃，发酵培养3天。本发明在所述发酵培养过程中优选还包括定时检测杂菌，所述定时检测杂菌优选包括以五点取样法，取不锈钢铁盆四角和中间的物料各20g，进行电镜检测，杂菌率≤1‰为发酵合格，否则为不合格物料，将不合格样品置于有机肥生产车间，做生产有机肥的原料。

本发明优选在所述有氧发酵结束后，收集发酵完全的菌块，低温粉碎得淡紫拟青霉可溶性高细粉，所述发酵完全的标准优选包括：待不锈钢铁盘中物料表面长满淡紫色绒毛，看不见物料表面，轻起物料底部，料底干燥，被淡紫色毛霉包裹为发酵完全，收集菌块，进行低温粉碎。本发明所述低温粉碎优选包括将干燥的淡紫拟青霉菌块先经过重力碾碎成粕状，加入10％～30％的扶态粉之后，利用气流干法分级原理经过JZF气流分级机粉碎成淡紫拟青霉可溶性高细粉。本发明所述扶态粉的主要成分是可溶性淀粉和无机盐，作用是为了增加菌粕低温粉碎时的摩擦力，淡紫拟青霉高细粉中含有扶态粉可以保持淡紫拟青霉的活性，实施例中选择购自广州承兴生物科技有限公司的市售商品。在本发明中，淡紫拟青霉是微生物生命体，不溶于水，本发明所述可溶性是指发酵物料经过粉碎达到一定细度，其与水混合后，能够通过滴灌，将物料随着液体滴灌出来。

在本发明中，皂素渣作为发酵培养基原料，丰富的营养成分适合淡紫拟青霉大量繁殖，油茶蒲和油茶籽壳含有丰富的木质纤维，在发酵的过程中，可以增加不锈钢料块中的透气性，百藤果渣含有丰富的蛋白质，可以保证物料发酵时的氮素供应，碳酸氢纳可调节发酵底料的pH值，保证物料发酵淡紫拟青霉时，保持最适宜的生长环境，同时皂素渣中含有抑菌作用的茶皂素与乳酸链球菌素相互结合，防治杂菌的滋生，使得固体发酵成为可能，可以使得获得的菌体纯种率≥98％，并以扶态粉为淡紫拟青霉载体，解决淡紫拟青霉活性降低的问题，使得菌体活力旺盛，菌体防治线虫能力强。

利用本发明所述生产方法生产得到的淡紫拟青霉，与原始菌种相比，未发生基因变异，可用于制备适用于滴灌行的淡紫拟青霉菌剂。

下面结合实施例对本发明提供的皂素渣在生产淡紫拟青霉中的应用及生产方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.淡紫拟青霉接种源菌的制备

(1)培养基原料配方(质量分数计)：茶皂素液1％，油茶饼粉12.5％，水果渣浆20％，乳酸链球菌素0.01％，亚磷酸钾0.2％，水66.29％；

(2)液体培养基配制：

按照培养基原料组配(质量分数计)配方，将茶皂素液1％、油茶饼粉12.5％、水果渣浆20％、亚磷酸钾0.2％混合均匀在一起成为物品a。

按照培养基原料组配(质量分数计)配方，将乳酸链球菌素0.01％加入水中进行溶解，配置成乳酸链球菌素溶液，成为物品b。

将物品b缓缓的加入发酵罐中的物品a中，加水定容到发酵罐规定的最大安全刻度进行121℃，45min高压蒸汽灭菌。

(3)接菌：液体培养基温度冷却到室温25℃后，通过液体发酵罐上的无菌导管，将淡紫拟青霉菌粉，按照质量分数1％添加到液体发酵罐中，调节发酵罐温度30℃，发酵罐内搅拌棒转速200r/h，进行淡紫拟青霉接种源菌的制备，发酵过程中，调整发酵罐上无菌阀门，进行发酵罐引气，增加发酵罐内氧气含量。

(4)检测：通过发酵罐体上的无菌接液灌，每1小时取样20mL进入微生物检测实验室，检测发酵罐发酵液体中淡紫拟青霉的浓度，当淡紫拟青霉浓度大于等于100亿/mL时，关闭发酵罐，此时发酵罐液体为淡紫拟青霉源菌液，将淡紫拟青霉源菌液送入生产车间，对原料进行淡紫拟青霉源菌的接种。

将淡紫拟青霉源菌液送检测序，其ITS序列如SEQ ID NO.1所示，根据测序结果通过NCBI网站同源性进行比对，菌株与淡紫拟青霉(purpureocillium lilacinum)序列同源性最高达到99.9％，证明无变异。

2.无菌生产车间淡紫拟青霉菌剂的制备

(5)固体发酵生产原料的配方(质量分数计)：油茶蒲10％，油茶籽壳10％，皂素渣25％，百藤果渣4％，乳酸链球菌素0.01％，碳酸氢纳0.4％，水50.59％；

(6)固体发酵培养基的配制：

固体发酵生产原料的配方，将油茶蒲10％，油茶籽壳10％，皂素渣25％，百藤果渣4％，混合均匀进入蒸汽爆破设备，121℃，压力1.91MPa下进行高温蒸汽高压爆破，时间为30分钟结束后，进行冷却，成为物品c。

将乳酸链球菌素和碳酸氢纳加入水中进行溶解，保证溶液中乳酸链球菌素的质量分数为0.01％，碳酸氢纳的质量分数为0.4％，配置成乳酸链球菌素碳酸氢钠混合溶液，成为物品d。

将物品d缓缓的加入物品c中，保证物料的含水量在50.59％,进行121℃，45分钟高压蒸汽灭菌，物品冷却后，成为物料e。

(7)接种菌源：物料e进入灭菌发酵房中的混料设备，按照质量分数，喷淋1％的淡紫拟青霉源菌液，边喷淋便混料，保证物料e和淡紫拟青霉源菌液中的微生物充分混匀。

(8)铺床发酵：拌入淡紫拟青霉源菌源的物料在灭菌发酵房中，按照料厚3厘米的标准，平铺在50cm×30cm灭菌的不锈钢铁盆之上，然后放入灭菌发酵房的发酵架床之上发酵，保证灭菌发酵房的温度30℃，发酵培养3天。

(9)杂菌定时检测：以五点取样法，取不锈钢铁盆四角和中间的物料各20克，进行电镜检测，保证杂菌率≤1‰，为发酵合格，否则为不合格物料，进入有机肥生产车间，做生产有机肥的原料。

(10)发酵完全：待不锈钢铁盘中物料表面长满淡紫色绒毛，看不见物料表面，轻起物料底部，料底干燥，被淡紫色毛霉包裹为发酵完全，收集菌块，进行低温粉碎。

(11)低温粉碎：干燥的淡紫拟青霉菌块先经过重力碾碎成粕状，加入20％的扶态粉之后，利用气流干法分级原理经过JZF气流分级机粉碎成淡紫拟青霉可溶性高细粉(80目)。

实施例2

一种利用皂素渣生产淡紫拟青霉的方法和应用，具体包括以下步骤：

1.淡紫拟青霉接种源菌的制备

(1)培养基原料配方(质量分数计)：茶皂素液2.5％，油茶饼粉15.25％，水果渣浆26.5％，乳酸链球菌素0.01％，亚磷酸钾0.4％，水55.34％；

(2)液体培养基配制：

按照培养基原料组配(质量分数计)配方，将茶皂素液2.5％、油茶饼粉15.25％、水果渣浆26.5％、亚磷酸钾0.4％，混合均匀在一起成为物品a。

按照培养基原料组配(质量分数计)配方，将乳酸链球菌素0.01％,加入水中进行溶解，配置成乳酸链球菌素溶液，成为物品b。

将物品b缓缓的加入发酵罐中的物品a中，加水定容到发酵罐规定的最大安全刻度进行121℃，45min高压蒸汽灭菌。

(3)接菌：液体培养基温度冷却到室温25℃后，通过液体发酵罐上的无菌导管，将淡紫拟青霉菌粉，按照质量分数3％添加到液体发酵罐中，调节发酵罐温度30℃，发酵罐内搅拌棒转速200r/h，进行淡紫拟青霉接种源菌的制备，发酵过程中，调整发酵罐上无菌阀门，进行发酵罐引气，增加发酵罐内氧气含量。

(4)检测：通过发酵罐体上的无菌接液灌，每1小时取样20ml进入微生物检测实验室，检测发酵罐发酵液体中淡紫拟青霉的浓度，当淡紫拟青霉浓度大于等于100亿/ml时，关闭发酵罐，此时发酵罐液体为淡紫拟青霉源菌液，将淡紫拟青霉源菌液送入生产车间，对原料进行淡紫拟青霉源菌的接种。

同样对淡紫拟青霉源菌液送检，ITS序列如SEQ ID NO.1所示，根据测序结果通过NCBI网站同源性进行比对，菌株与淡紫拟青霉(purpureocillium lilacinum)序列同源性最高达到99.9％，证明无变异。

2.无菌生产车间淡紫拟青霉菌剂的制备

(5)固体发酵生产原料的配方(质量分数计)：油茶蒲15％，油茶籽壳12.5％，皂素渣27.5％，百藤果渣7％，乳酸链球菌素0.02％，碳酸氢纳0.6％，水37.38％；

(6)固体发酵培养基的配制：

固体发酵生产原料的配方，将油茶蒲15％，油茶籽壳12.5％，皂素渣27.5％，百藤果渣7％，混合均匀进入蒸汽爆破设备，121℃，压力1.91MPa下进行高温蒸汽高压爆破，时间为30分钟结束后，进行冷却，成为物品c。

将乳酸链球菌素和碳酸氢纳加入水中进行溶解，保证溶液中乳酸链球菌素的质量分数为0.02％，碳酸氢纳的质量分数为0.6％，配置成乳酸链球菌素碳酸氢钠混合溶液，成为物品d。

将物品d缓缓的加入物品c中，保证物料的含水量在37.38％，进行121℃，45分钟高压蒸汽灭菌，物品冷却后，成为物料e。

(7)接种菌源：物料e进入灭菌发酵房中的混料设备，按照质量分数，喷淋4％的淡紫拟青霉源菌液，边喷淋便混料，保证物料e和淡紫拟青霉源菌液中的微生物充分混匀。

(8)铺床发酵：拌入淡紫拟青霉源菌源的物料在灭菌发酵房中，按照料厚3厘米的标准，平铺在50cm×30cm灭菌的不锈钢铁盆之上，然后放入灭菌发酵房的发酵架床之上发酵，保证灭菌发酵房的温度30℃，发酵培养3天。

(9)杂菌定时检测：以五点取样法，取不锈钢铁盆四角和中间的物料各20克，进行电镜检测，保证杂菌率≤1‰，为发酵合格，否则为不合格物料，进入有机肥生产车间，做生产有机肥的原料。

(10)发酵完全：待不锈钢铁盘中物料表面长满淡紫色绒毛，看不见物料表面，轻起物料底部，料底干燥，被淡紫色毛霉包裹为发酵完全，收集菌块，进行低温粉碎。

(11)低温粉碎：干燥的淡紫拟青霉菌块先经过重力碾碎成粕状，加入20％的扶态粉之后，利用气流干法分级原理经过JZF气流分级机粉碎成淡紫拟青霉可溶性高细粉。

实施例3

一种利用皂素渣生产淡紫拟青霉的方法和应用，具体包括以下步骤：

1.淡紫拟青霉接种源菌的制备

(1)培养基原料配方(质量分数计)：茶皂素液5％，油茶饼粉18％，水果渣浆33％，乳酸链球菌素0.02％，亚磷酸钾0.5％，水43.48％；

(2)液体培养基配制：

按照培养基原料组配(质量分数计)配方，将茶皂素液5％、油茶饼粉18％、水果渣浆33％、亚磷酸钾0.5％混合均匀在一起成为物品a。

按照培养基原料组配(质量分数计)配方，将乳酸链球菌素0.02％加入水中进行溶解，配置成乳酸链球菌素溶液，成为物品b。

将物品b缓缓的加入发酵罐中的物品a中，加水定容到发酵罐规定的最大安全刻度进行121℃，45分钟高压蒸汽灭菌。

(3)接菌：液体培养基温度冷却到室温25℃后，通过液体发酵罐上的无菌导管，将淡紫拟青霉菌粉，按照质量分数5％添加到液体发酵罐中，调节发酵罐温度30℃，发酵罐内搅拌棒转速200r/h，进行淡紫拟青霉接种源菌的制备，发酵过程中，调整发酵罐上无菌阀门，进行发酵罐引气，增加发酵罐内氧气含量。

(4)检测：通过发酵罐体上的无菌接液灌，每1小时取样20ml进入微生物检测实验室，检测发酵罐发酵液体中淡紫拟青霉的浓度，当淡紫拟青霉浓度大于等于100亿/ml时，关闭发酵罐，此时发酵罐液体为淡紫拟青霉源菌液，将淡紫拟青霉源菌液送入生产车间，对原料进行淡紫拟青霉源菌的接种。

同样对淡紫拟青霉源菌液送检，ITS序列同SEQ ID NO.1所示，根据测序结果通过NCBI网站同源性进行比对，菌株与淡紫拟青霉(purpureocillium lilacinum)序列同源性最高达到99.9％，证明无变异。

2.无菌生产车间淡紫拟青霉菌剂的制备

(5)固体发酵生产原料的配方(质量分数计)：油茶蒲18％，油茶籽壳14％，皂素渣27％，百藤果渣8％，乳酸链球菌素0.02％，碳酸氢纳0.8％，水32.18％；

(6)固体发酵培养基的配制：

固体发酵生产原料的配方，将油茶蒲18％，油茶籽壳14％，皂素渣27％，百藤果渣8％，混合均匀进入蒸汽爆破设备，121℃，压力1.91MPa下进行高温蒸汽高压爆破，时间为30分钟结束后，进行冷却，成为物品c。

将乳酸链球菌素和碳酸氢纳加入水中进行溶解，保证溶液中乳酸链球菌素的质量分数为0.02％，碳酸氢纳的质量分数为0.8％，配置成乳酸链球菌素碳酸氢钠混合溶液，成为物品d。

将物品d缓缓的加入物品c中，保证物料的含水量在32.18％,进行121℃，45分钟高压蒸汽灭菌,物品冷却后，成为物料e。

(7)接种菌源：物料e进入灭菌发酵房中的混料设备，按照质量分数，喷淋5％的淡紫拟青霉源菌液，边喷淋便混料，保证物料e和淡紫拟青霉源菌液中的微生物充分混匀。

(8)铺床发酵：拌入淡紫拟青霉源菌源的物料在灭菌发酵房中，按照料厚3厘米的标准，平铺在50cm×30cm灭菌的不锈钢铁盆之上，然后放入灭菌发酵房的发酵架床之上发酵，保证灭菌发酵房的温度30℃，发酵培养3天。

(9)杂菌定时检测：以五点取样法，取不锈钢铁盆四角和中间的物料各20克，进行电镜检测，保证杂菌率≤1‰，为发酵合格，否则为不合格物料，进入有机肥生产车间，做生产有机肥的原料。

(10)发酵完全：待不锈钢铁盘中物料表面长满淡紫色绒毛，看不见物料表面，轻起物料底部，料底干燥，被淡紫色毛霉包裹为发酵完全，收集菌块，进行低温粉碎。

(11)低温粉碎：干燥的淡紫拟青霉菌块先经过重力碾碎成粕状，加入20％的扶态粉之后，利用气流干法分级原理经过JZF气流分级机粉碎成淡紫拟青霉可溶性高细粉。

对实施例1～3中固体发酵阶段的淡紫拟青霉浓度和不锈钢托盘中物料的变化情况进行统计，结果如表1和表2所示，在一定的含水量范围内，随着物料水分的降低，配方基料质量分数的增加，淡紫拟青霉在发酵基料中的浓度逐渐的增加，淡紫拟青霉的得率逐渐的提高。在一定的含水量范围内，随着物料水分的降低，配方基料质量分数的增加，淡紫拟青霉的发酵速度逐渐增加，当发酵完全之后，物料的表面和底部均被紫色的菌丝覆盖，物料干燥，停止发酵。

表1不同实施例3天淡紫拟青霉的浓度变化

	1d(×10<sup>9</sup>g/mL)	2d(×10<sup>9</sup>g/mL)	3d(×10<sup>9</sup>g/mL)
				实施例1	1.48	7.84	19.67
实施例2	2.42	11.26	38.83
				实施例3	3.43	15.78	49.51

表2不同实施例3天不锈钢托盘中物料的变化情况

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江久晟油茶科技有限公司

<120> 皂素渣在生产淡紫拟青霉中的应用及生产方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 545

<212> DNA

<213> 淡紫拟青霉(purpureocillium lilacinum)

<400> 1

aacccactgt gaaccttacc tcagttgcct cggcgggaac gccccggccg cctgcccccg 60

cgccggcgcc ggacccaggc gcccgccgca gggaccccaa actctcttgc attacgccca 120

gcgggcggaa tttcttctct gagttgcaca agcaaaaaca aatgaatcaa aactttcaac 180

aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga 240

attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgcccgc cagcattctg 300

gcgggcatgc ctgttcgagc gtcatttcaa ccctcgagcc cccccggggg cctcggtgtt 360

gggggacggc acaccagccg cccccgaaat gcagtggcga ccccgccgca gcctccctgc 420

gtagtagcac acacctcgca ccggagcgcg gagccggtca cgccgtaaaa cgcccaactt 480

tcttagagtt gacctcggat caggtaggaa tacccgctga acttaagcca tatcaataaa 540

gcggc 545

Claims (10)

1.皂素渣在生产淡紫拟青霉中的应用。

2.利用皂素渣生产淡紫拟青霉的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将淡紫拟青霉菌粉接种到液体培养基上进行有氧发酵，待淡紫拟青霉浓度≥100亿/mL时停止发酵，得淡紫拟青霉源菌液；所述液体培养基包括以下质量百分含量的组分：茶皂素液1％～5％，油茶饼粉12.5％～18％，水果渣浆20％～33％，乳酸链球菌素0.01％～0.02％，亚磷酸钾0.2％～0.5％和余量的水；

(2)将所述淡紫拟青霉源菌液喷淋到固体培养基上混合均匀，有氧发酵3d，得淡紫拟青霉生产菌种；所述固体培养基包括以下质量百分含量的组分：油茶蒲10％～20％，油茶籽壳10％～15％，皂素渣25％～30％，百藤果渣4％～8％，乳酸链球菌素0.01％～0.02％，碳酸氢纳0.4％～0.8％和余量的水。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述淡紫拟青霉菌粉的接种质量为所述液体培养基质量的1％～5％。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述液体培养基的制备方法，包括：将茶皂素液、油茶饼粉、水果渣浆和亚磷酸钾混合，得物料a；

将乳酸链球菌素和水混合均匀，得物料b，将物料b与物料a混合并定容，得所述液体培养基。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述有氧发酵过程中伴随搅拌，所述搅拌的转速为200r/h，所述有氧发酵的温度为25～30℃。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述固体培养基的制备方法，包括：将油茶蒲、油茶籽壳、皂素渣和百藤果渣混合后进行蒸汽爆破，冷却得物料c；

将乳酸链球菌素、碳酸氢纳和水混合，得物料d，将物料d与物料c混合，得所述固体培养基。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述蒸汽爆破的温度为121℃，压力为1.91MPa。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述淡紫拟青霉源菌液的喷淋质量为所述固体培养基质量的1％～5％。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述有氧发酵时，将淡紫拟青霉源菌液和固体培养基的混合物料，平铺3～10cm厚进行所述有氧发酵，所述有氧发酵的温度为25～35℃。

10.根据权利要求2或9所述的方法，其特征在于，在步骤(2)所述有氧发酵结束后，收集发酵完全的菌块，低温粉碎得淡紫拟青霉可溶性高细粉。

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