CN106190862A - 菌渣发酵基质、羊肚菌菌种培养基质及其制法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食用菌菌种生产领域，涉及一种菌渣发酵基质、羊肚菌菌种培养基质及其制法，具体涉及利用发酵的食用菌菌渣为主要原料制作的菌渣发酵基质，然后进一步制备羊肚菌菌种的方法。本发明羊肚菌菌种培养基质，是以菌渣为主要原料，经过灭菌→四孢脉胞菌JDF001‑B发酵使之糖化得菌渣发酵基质→灭菌再混合培养基质常用添加剂制备而得。本发明方法的关键改进在于：改变了羊肚菌菌种的制作原料，采用食用菌栽培后剩下的菌渣，取代了粮食原料，利用了农业废弃物，降低了成本，减少了污染，提高了羊肚菌产量，且施用的菌种未被羊肚菌消耗的部分还能作为有机肥，不仅改良土壤，还可为下一季作为提供养料。

Description

菌渣发酵基质、羊肚菌菌种培养基质及其制法

技术领域

本发明属于食用菌菌种生产领域，涉及一种菌渣发酵基质、羊肚菌菌种培养基质及其制法，具体涉及利用发酵的食用菌菌渣为主要原料制作的菌渣发酵基质，然后进一步制备羊肚菌菌种的方法。

背景技术

羊肚菌(Morchella spp.)又称羊肚菜，隶属于子囊菌纲盘菌目羊肚菌科羊肚菌属，是一种名贵珍稀食用真菌。羊肚菌营养价值高，富含人体必需氨基酸和菌多糖，价格昂贵。采集野生羊肚菌已无法满足羊肚菌消费市场的需求。

羊肚菌的人工驯化栽培曾经是世界性难题。近年来，羊肚菌人工栽培技术取得突破，多采用在农田中栽培的模式。羊肚菌菌种的生产及播种是栽培的第一步。现有的羊肚菌菌种制作与生产方法发明专利有：

公开号CN1793315A的专利“尖顶羊肚菌菌株的筛选及菌种制备”和公开号CN1793316A的专利“黑脉羊肚菌菌株的筛选及菌种制备”中，提供了一种羊肚菌菌种固体培养基配方：木屑79-90％，麸皮5-20％，磷肥1％，石膏1％，羊肚菌生长地腐殖土3％，含水量60％，pH自然。拌匀后，装入750ml的大口瓶中，压紧封口后在120℃灭菌60min。

公开号CN103141302A的专利“梯棱羊肚菌栽培种的制作方法”中，提供了一种羊肚菌栽培种配方：麦粒70-90％，土壤8-28％，石灰1-1.5％，过磷酸钙0.5-1％，含水量60-65％。充分搅拌均匀后，装入玻璃瓶中，121-126℃下灭菌2小时，或者100℃灭菌15-20小时。

公开号CN104686196A的专利“一种通过阴干子实体保存和分离羊肚菌菌种的方法”中，提供了一种用于羊肚菌菌种的麦粒培养基配方：选取无病虫害、饱满、较新鲜、去壳带皮的小麦麦粒，清水浸泡24小时，入锅加清水煮至麦粒无白心，无破皮，捞出沥水，盛入平皿，于121℃灭菌30min。

公开号CN101946634A的专利“一种羊肚菌母种制作方法”中，提供了一种羊肚菌母种培养基配方：按质量比将1～3份的新鲜无虫蛀圆叶杨碎枝条或圆叶杨树叶放入10份的水中煮沸25～30min，过滤取汁制得圆叶杨浸出液；圆叶杨浸出液和PDA培养液按质量比1:1混合后，按混合液的质量百分比再加入Na₃PO₄.12H₂O 0.2％，KH₂PO₄ 0.2％，MgSO₄ 0.05％，维生素B1 0.005％，搅拌均匀后在121±1℃下灭菌30min。

公开号CN105154342A的专利“一种羊肚菌液态菌种的培养方法”中，(1)提供了一种一级原种培养基：棉籽壳20-30g，杂木屑15-20g，谷壳20-30g，麦麸15-25g，玉米粉8-12g分别用水浸泡，过滤后分别加水煮沸、过滤沥干，然后混合，制得混合料，向所述混合料中加入蔗糖5-10g，碳酸钙1-5g和磷肥1-5g，混合均匀。(2)提供了一种二级原种培养基：松针100-200g、金针菇100-200g和水1200-1800ml进行混合、煮沸、冷却、过滤处理，制得羊肚菌二级原种营养液，然后将小麦20-30g、玉米25-40g、谷壳15-25g、米糠15-25g、蔗糖1-5g、石膏1-5g、磷肥1-5g混合均匀制得羊肚菌二级原种培养基混合料，并加入到与所述羊肚菌二级原种培养基混合料相同质量的所述羊肚菌二级原种培养液中，混合均匀。(3)提供了一种羊肚菌液态培养基配方：松树枝200-300g、土豆200-400g和水1200-1800ml进行混合，然后依次经过煮沸、冷却、过滤处理得到滤液，将糖类物质(蔗糖、葡萄糖和麦芽糖等)15-30g加入到所述滤液中并溶解制得羊肚菌液态菌种营养滤液，取所述羊肚菌液态菌种营养滤液150ml置于培养瓶中，向所述培养瓶中加入洗净烘干的谷壳10-30g和碳酸钙1-5g。

公开号CN102757291A的专利“一种羊肚菌栽培种培养基及其制备方法”中，提供了一种羊肚菌栽培种配方：以质量分数计，主料中包括2-10份的木屑、2-5份的棉籽壳和1-2份的麸皮；辅料中包括0.1-0.5份的蔗糖、0.1-0.6份的石膏、0.1-0.6份的石灰、0.1-0.5份的羊肚菌根际土、0-0.05份的硫酸镁和0.01-0.02份的维生素B1，添加了核桃枝浸提液，所述核桃枝浸提液是1-3份的核桃树枝条用其质量1.5-5倍的水煎煮后的过滤液。

公开号CN101743854A的专利“一种以石斛纤维为基质的羊肚菌菌丝体的制备方法”中，提供了一种羊肚菌固体培养基配方：铁皮石斛经粉碎提取浸膏后的纤维素渣滓70％-90％，玉米5％-20％，加入0.5％-1％亚硒酸钠、0.5％-1％二氧化锗、0.01％-0.2％磷酸二氢钾，含水量50％-60％，pH自然。

上述的羊肚菌菌种制作技术主要存在如下缺点：

(1)部分发明的配方及制作方法复杂，例如公开号CN105154342A的专利“一种羊肚菌液态菌种的培养方法”中的一级和二级原种培养基。

(2)部分发明的原材料难以取得，例如公开号CN1793315A的专利“尖顶羊肚菌菌株的筛选及菌种制备”和公开号CN1793316A的专利“黑脉羊肚菌菌株的筛选及菌种制备”中的配方需要添加羊肚菌生长地腐殖土，公开号CN102757291A的专利“一种羊肚菌栽培种培养基及其制备方法”中的配方需要添加羊肚菌根际土和核桃枝浸提液，公开号CN101743854A的专利“一种以石斛纤维为基质的羊肚菌菌丝体的制备方法”中的配方需要添加石斛纤维。

(3)普遍使用大量的粮食原料，如小麦、玉米等，不仅成本高，还造成粮食资源的耗费。

为解决上述缺陷，需要重新设计羊肚菌菌种的配方和制备方法，改用农业废弃物为主要原料，简化配方及制备方法，实现降低污染、节约粮食、降低成本、提高羊肚菌产量的目标。

菌渣又被称为菌糠，是人工栽培平菇、姬菇、金针菇、猴头菇、银耳、灵芝等食用菌之后剩余的渣状基料，通常含有秸秆、木屑、玉米芯、棉籽壳等原料以及残留的食用菌菌丝，富含纤维素、半纤维素等成分，且这些原料已经经过了食用菌菌丝的分解利用，有一部分已经被食用菌分泌的酶分解转化成更易被吸收利用的形式。当菌渣被特定细菌进一步分解发酵后，更多的纤维素和半纤维素转化为能被羊肚菌快速利用的糖类营养物质。

基于上述背景，发明人欲提供一种新的羊肚菌菌种培养基质配方及其制备方法，试图改变现有菌种培养基质的配方及生产步骤，使用常见易得的原材料，避免使用粮食资源。首次应用食用菌栽培后剩余的菌渣作为羊肚菌菌种培养基质的主要原料，采用四孢脉胞菌JDF001-B菌株发酵促进菌渣中的纤维素和半纤维素转化成易被羊肚菌利用的糖类。可以实现农业废弃物废物利用，变废为宝，节约粮食资源，降低羊肚菌菌种制作的原料成本，提高羊肚菌产量。

发明内容

本发明所解决的第一个技术问题是提供一种新的羊肚菌菌种培养基质，包括其配方和制备方法。本发明羊肚菌菌种培养基质，是以菌渣为主要原料，经过灭菌→四孢脉胞菌JDF001-B发酵使之糖化得菌渣发酵基质→灭菌再混合培养基质常用添加剂制备而得。

本发明羊肚菌菌种培养基质的制备方法包括如下步骤：

1)收集菌渣，灭菌；

2)菌渣平铺，厚度为2-4cm；

3)向步骤2)菌渣遍面布置四孢脉胞菌JDF001-B的固体培养物，喷水至菌渣含水量为65-80％；盖上带孔的塑料膜保湿，发酵得菌渣发酵基质；

4)步骤3)发酵所得菌渣发酵基质与生石灰混合，灭菌，冷却即得培养基质。

羊肚菌菌种培养基质的制备方法的步骤1)中：

所述灭菌用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌1.5-2.5小时，优选的为2小时。

羊肚菌菌种培养基质的制备方法的步骤2)中：

所述菌渣是指人工栽培食用菌所用的有机物料在食用菌出菇收获后的剩余物。

进一步的，所述食用菌包括但不限于平菇、金针菇、姬菇、银耳、猴头菇、灵芝中任意一种；优选平菇或姬菇。

所述人工栽培食用菌所用有机物料的主料包括秸秆、木屑、棉籽壳、玉米芯、甘蔗渣中的任意一种或几种。其中，主料重量占菌渣的总重量比大约90-99％。

典型的食用菌栽培原料中含有(按重量百分比计)20-95％的秸秆，20％-40％的木屑，10-60％的棉籽壳，20-40％的玉米芯。经过食用菌栽培后，栽培原料中生长有大量食用菌菌丝，同时部分营养被分解利用，成为菌渣。

羊肚菌菌种培养基质的制备方法的步骤3)中：

所述菌渣与四孢脉胞菌JDF001-B的固体培养物按重量配比菌渣2000-1000份与四孢脉胞菌JDF001-B的固体培养物1份布置，优选按重量配比菌渣1000份与四孢脉胞菌JDF001-B的固体培养物1份布置。

所述发酵的条件根据温度不同而变化：

(1)当温度10-20℃时发酵10-15天；优选当温度10-20℃时发酵15天；

(2)当温度21-30℃时发酵8-10天；优选当温度21-30℃时发酵10天。

(3)确保温度不得低于10℃，否则需在室内进行或采取保温措施。

羊肚菌菌种培养基质的制备方法的步骤4)中：

所述菌渣发酵基质加入重量百分比为2-4％的生石灰。优选的为4％。

所述灭菌为121℃灭菌2-3小时，优选121℃灭菌3小时。这步是为了彻底杀死残留的四孢脉胞菌JDF001-B，以防作为污染杂菌干扰后续的羊肚菌生长。

本发明解决的第二个技术问题是提供了一种新的羊肚菌菌种的制作方法：

(1)二级菌种(又称原种)制作：取羊肚菌菌种培养基质装入培养容器灭菌，冷却，无菌操作接入羊肚菌母种琼脂块，培养至菌丝布满羊肚菌菌种培养基质，得二级菌种。

(2)三级菌种(又称栽培种)制作：取羊肚菌菌种培养基质装入培养容器，灭菌，冷却，无菌操作接入步骤(1)所得二级菌种，培养至菌丝布满培养基质得三级菌种，即为羊肚菌菌种。

上述羊肚菌菌种的制作方法的步骤(1)中：

所述培养容器为玻璃瓶、聚丙烯塑料菌种瓶或聚丙烯塑料袋任意一种。

所述灭菌为121℃高压蒸汽灭菌1.5-2小时，优选121℃高压蒸汽灭菌2小时。

所述羊肚菌菌种培养基质与羊肚菌母种琼脂块按照下述比例添加：每500g羊肚菌菌种培养基质，接入1-2平方厘米大小的羊肚菌母种琼脂块。

从节约利用菌种的角度，优选的，每500g羊肚菌菌种培养基质，接入1平方厘米大小的羊肚菌母种琼脂块。

所述培养至菌丝布满羊肚菌菌种培养基质中的培养温度15-25℃，优选培养温度为18-20℃。在上述培养温度下，培养时间大概为15-20天。

上述羊肚菌菌种的制作方法的步骤(2)中：

所述培养容器为玻璃瓶、聚丙烯塑料菌种瓶或聚丙烯塑料袋任意一种。

所述灭菌为121℃高压蒸汽灭菌1.5-2小时，优选121℃高压蒸汽灭菌2小时。

所述羊肚菌菌种培养基质与二级菌种按照下述重量配比添加：羊肚菌菌种培养基质30-50份，二级菌种1份。

优选的，羊肚菌菌种培养基质30份，二级菌种1份。

所述培养至菌丝布满羊肚菌菌种培养基质中的培养温度15-25℃，优选培养温度为18-20℃。在上述培养温度下，培养时间大概为15-20天。

所述脉胞菌JDF001-B，是四川省农业科学院土壤肥料研究所分离并保有的一株脉胞菌属新菌株。

该菌株为四孢脉胞菌(Neurospora tetrasperma)，编号JDF001-B，该菌株于2016年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.12515。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

四孢脉胞菌JDF001-B菌株的ITS序列与Genbank检索号KM588213的Neurosporasitophila M21菌株和Genbank检索号JX136749的Neurospora tetrasperma XF35菌株的ITS序列相同，具有较强的分解纤维素和半纤维素的活性。

本发明方法的关键改进在于：改变了羊肚菌菌种的制作原料，采用食用菌栽培后剩下的菌渣，取代了粮食原料，利用了农业废弃物，降低了成本，减少了污染，提高了羊肚菌产量，且施用的菌种未被羊肚菌消耗的部分还能作为有机肥，不仅改良土壤，还可为下一季作为提供养料。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，说明但不限制本发明。

实施例1：

制备：

时间：2015年4月10日

地点：四川省成都市，省农业科学院土壤肥料研究所内

1)收集平菇菌渣，121℃灭菌2小时；

2)菌渣平铺，厚度为2-4cm；

3)向步骤2)菌渣遍面布置四孢脉胞菌JDF001-B的固体培养物，按重量配比菌渣1000份与四孢脉胞菌JDF001-B的固体培养物1份布置，喷水至菌渣含水量为75％；盖上带孔的塑料膜保湿，发酵10天；

4)步骤3)发酵所得菌渣发酵基质，加入重量百分比为4％的生石灰，121℃灭菌3小时。冷却即得羊肚菌菌种培养基质；

5)二级菌种制作：取500克羊肚菌菌种培养基质装入750毫升聚丙烯菌种瓶，121℃灭菌2小时。冷却，无菌操作接入1平方厘米羊肚菌母种琼脂块，培养至菌丝布满羊肚菌菌种培养基质，得二级菌种；

6)三级菌种制作：取500克羊肚菌菌种培养基质装入750毫升聚丙烯菌种瓶，121℃灭菌2小时。冷却，无菌操作接入步骤(1)所得二级菌种，羊肚菌菌种培养基质与二级菌种按照重量配比30:1添加。培养至菌丝布满培养基质得三级菌种，即为羊肚菌菌种。

栽培：

1.地点：四川省成都市金堂县，土质为灰潮土。

2.播种前准备：用常规方法对农田进行施肥、平整、松土。

3.播种时间在2015年10月下旬。取本实施例制备的羊肚菌三级菌种(栽培种)播种，每平方米播种菌种0.5-0.6kg。所述播种采用矮箱垄作、双沟条播的方法，垄高15cm，垄宽800cm。垄之间的沟宽60cm。

4.播种第3天后开始补水，始终保持土壤表层1-3cm含水量50-70％。

5.在地表形成大量羊肚菌菌丝后25天，放置四川金地菌类有限公司提供的营养袋。放置前用钉板在营养袋的一面打3-4排小孔，每排8-10个小孔，每个小孔直径1-3mm。每亩放置2000个营养袋，每垄横向2袋，纵向间隔35cm。小孔朝下摆放。随后搭建遮阳棚，棚高2-3米，所覆盖遮阳网透光率5％。

6.栽培第二年温度升至10-12℃时，喷雾补水催菇，使大棚内空气湿度60-90％，土壤表层1-3cm的含水量50-70％，出菇后大棚内气温维持在8-20℃之间，直至采收结束。

7.采收：当羊肚菌子实体成熟，菌盖长度达到3-6cm，颜色由深灰色转为棕色时，既可采摘。用刀片轻轻横切断菌柄，将子实体轻放入采收容器中。

实施例2：

制备：

时间：2015年4月15日

地点：四川省成都市，省农业科学院新都菌种厂

1)收集金针菇和姬菇菌渣，1:1混合，121℃灭菌2小时；

2)菌渣平铺，厚度为2-4cm；

3)向步骤2)菌渣遍面布置四孢脉胞菌JDF001-B的固体培养物，按重量配比菌渣1000份与四孢脉胞菌JDF001-B的固体培养物1份布置，喷水至菌渣含水量为70％；盖上带孔的塑料膜保湿，发酵10天；

4)步骤3)发酵所得菌渣发酵基质，加入重量百分比为4％的生石灰，121℃灭菌3小时。冷却即得羊肚菌菌种培养基质；

5)二级菌种制作：取500克羊肚菌菌种培养基质装入750毫升玻璃菌种瓶，121℃灭菌2小时。冷却，无菌操作接入1平方厘米羊肚菌母种琼脂块，培养至菌丝布满羊肚菌菌种培养基质，得二级菌种；

6)三级菌种制作：取500克羊肚菌菌种培养基质装入750毫升聚丙烯菌种瓶，121℃灭菌2小时。冷却，无菌操作接入步骤(1)所得二级菌种，羊肚菌菌种培养基质与二级菌种按照重量配比30:1添加。培养至菌丝布满培养基质得三级菌种，即为羊肚菌菌种。

栽培：

1.地点：四川省成都市青白江县，柑橘林下，土质为水稻土。

2.播种前准备：用常规方法对地表进行松土，施肥。

3.播种时间在2015年11月初。取本实施例制备的羊肚菌栽培种菌种，播种，每平方米播种菌种0.5-0.6kg。所述播种采用高箱垄作、双沟条播的方法，垄高30cm，垄宽100cm。垄之间的沟宽30cm。

4.播种第3天后开始补水，始终保持土壤表层1-3cm含水量50-70％。

5.在地表形成大量羊肚菌菌丝后25天，放置四川金地菌类有限公司提供的营养袋。放置前用钉板在营养袋的一面打3-4排小孔，每排8-10个小孔，每个小孔直径1-3mm。每亩放置2000个营养袋，每垄横向2袋，纵向间隔35cm。小孔朝下摆放。随后搭建遮阳棚，棚高2-3米，所覆盖遮阳网透光率5％。

6.栽培第二年温度升至10-12℃时，喷雾补水催菇，使大棚内空气湿度60-90％，土壤表层1-3cm的含水量50-70％，出菇后大棚内气温维持在8-20℃之间，直至采收结束。

7.采收：当羊肚菌子实体成熟，菌盖长度达到3-6cm，颜色由深灰色转为棕色时，既可采摘。用刀片轻轻横切断菌柄，将子实体轻放入采收容器中。

对照例：

在实施例1和实施例2的同样栽培地点，采用公开号CN103141302A、CN104686196A和CN105154342A的专利提供的羊肚菌菌种及其制备方法进行栽培。

方案实施效果

表1不同专利种提供的菌种的每亩成本投入，含原料成本和制作营养袋的人力成本(单位：元/亩)

表2采用不同专利中提供的菌种的羊肚菌亩产(单位：kg每亩，重量为干重)

以上结果表明，采用本发明提供的羊肚菌菌种配方及制备方法制备的菌种，能节省每亩在菌种上的成本投入，并且能显著提高羊肚菌的产量，有取代已有羊肚菌菌种配方及制备方法的价值，值得推广使用。

Claims (8)

1.菌渣发酵基质的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)收集菌渣，灭菌；

2)菌渣平铺，厚度为2-4cm；

3)向步骤2)菌渣遍面布置四孢脉胞菌JDF001-B的固体培养物，喷水至菌渣含水量为65-80％；盖上带孔的塑料膜保湿，发酵得菌渣发酵基质。

2.根据权利要求1所述的菌渣发酵基质的制备方法，其特征在于：至少满足以下任意一项：

步骤1)中：

所述灭菌用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌1.5-2.5小时；

优选的，所述灭菌用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌2小时；

步骤2)中：

所述菌渣是指人工栽培食用菌所用的有机物料在食用菌出菇收获后的剩余物；

进一步的，所述食用菌包括但不限于平菇、金针菇、姬菇、银耳、猴头菇、灵芝中任意一种；优选平菇或姬菇；

所述人工栽培食用菌所用有机物料的主料包括秸秆、木屑、棉籽壳、玉米芯、甘蔗渣中的任意一种或几种；

优选的，所述人工栽培食用菌所用有机物料的主料重量占菌渣的总重量比大约90-99％；

步骤3)中：

所述菌渣与四孢脉胞菌JDF001-B的固体培养物按重量配比菌渣2000-1000份与四孢脉胞菌JDF001-B的固体培养物1份布置；

优选的，优选所述菌渣与四孢脉胞菌JDF001-B的固体培养物按重量配比菌渣1000份与四孢脉胞菌JDF001-B的固体培养物1份布置；

所述发酵的温度不低于10℃：

进一步的，所述发酵的条件如下：

(1)当温度10-20℃时发酵10-15天；优选当温度10-20℃时发酵15天；

(2)当温度21-30℃时发酵8-10天；优选当温度21-30℃时发酵10天；

所述四孢脉胞菌JDF001-B，保藏编号为CGMCC No.12515。

3.权利要求1或2所述制备方法所得的菌渣发酵基质。

4.羊肚菌菌种培养基质，其特征在于：以权利要求3所述的菌渣发酵基质为主要原料，与生石灰混合，灭菌，冷却制备而得。

5.根据权利要求4所述的羊肚菌菌种培养基质，其特征在于：至少满足以下任意一项：所述菌渣发酵基质加入重量百分比为2-4％的生石灰；

优选所述菌渣发酵基质加入重量百分比为4％的生石灰；

所述灭菌为121℃灭菌2-3小时，优选121℃灭菌3小时。

6.羊肚菌菌种的制作方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)二级菌种制作：取权利要求4或5所述的羊肚菌菌种培养基质装入培养容器灭菌，冷却，无菌操作接入羊肚菌母种琼脂块，培养至菌丝布满羊肚菌菌种培养基质，得二级菌种；

(2)三级菌种制作：取权利要求4或5所述的羊肚菌菌种培养基质装入培养容器，灭菌，冷却，无菌操作接入步骤(1)所得二级菌种，培养至菌丝布满培养基质得三级菌种，即为羊肚菌菌种。

7.根据权利要求6所述的羊肚菌菌种的制作方法，其特征在于：步骤(1)中：

所述培养容器为玻璃瓶、聚丙烯塑料菌种瓶或聚丙烯塑料袋任意一种；

所述灭菌为121℃高压蒸汽灭菌1.5-2小时；

优选，所述灭菌为121℃高压蒸汽灭菌2小时；

所述羊肚菌菌种培养基质与羊肚菌母种琼脂块按照下述比例添加：每500g羊肚菌菌种培养基质，接入1-2平方厘米大小的羊肚菌母种琼脂块；

优选的，所述羊肚菌菌种培养基质与羊肚菌母种琼脂块按照下述比例添加：每500g羊肚菌菌种培养基质，接入1平方厘米大小的羊肚菌母种琼脂块；

所述培养至菌丝布满羊肚菌菌种培养基质中的培养温度15-25℃，培养时间为15-20天；

优选的，所述培养至菌丝布满羊肚菌菌种培养基质中的培养温度18-20℃，培养时间为15-20天。

8.根据权利要求6所述的羊肚菌菌种的制作方法，其特征在于：上述步骤(2)中：

所述培养容器为玻璃瓶、聚丙烯塑料菌种瓶或聚丙烯塑料袋任意一种；

所述灭菌为121℃高压蒸汽灭菌1.5-2小时；

优选，所述灭菌为121℃高压蒸汽灭菌2小时；

所述羊肚菌菌种培养基质与二级菌种按照下述重量配比添加：羊肚菌菌种培养基质30-50份，二级菌种1份；

优选的，所述羊肚菌菌种培养基质与二级菌种按照下述重量配比添加：羊肚菌菌种培养基质30份，二级菌种1份；

所述培养至菌丝布满羊肚菌菌种培养基质中的培养温度15-25℃，培养时间为15-20天；

优选的，所述培养至菌丝布满羊肚菌菌种培养基质中的培养温度18-20℃，培养时间为15-20天。