CN108815199B - 鼠衣原体在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明通过实验表明，鼠衣原体(Chlamydia muridarum，CM)能拮抗右旋葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium,DSS)诱导的野生型小鼠溃疡性结肠炎，提示CM具有抗溃疡性结肠炎的作用，可用于制备抗溃疡性结肠炎药物。

Description

鼠衣原体在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及鼠衣原体在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用。

背景技术

炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)是一种常见的消化系统慢性炎症性疾病。其临床症状主要有腹痛、腹泻和便血，也常出现皮肤、关节、眼、骨骼、肝胆管等肠道外的临床表现。IBD的发病机制复杂，发病环节多，病因不明确，且易复发、易癌变和难治愈，故被世界卫生组织列为现代难治病之一。流行病学调查发现，近年来该病发病率呈显逐年上升趋势，这严重危害着人们的身体健康和生活质量。虽然免疫抑制剂能在一定程度上控制部分患者的病情，但是鉴于长期使用免疫抑制剂存在价格昂贵，毒副作用强，而且并不是对所有患者都有效等问题。因此探讨其发病机制并寻找新的治疗手段一直是该病研究领域中急需解决的问题。

IBD的具体致病机制至今仍不明确。有人认为机体对肠道菌群的异常反应是造成IBD发病的重要原因。正常情况下宿主保护性免疫和肠道菌群之间的相互作用使肠道处于稳定平衡状态，也称为肠道稳态。各种原因引起的肠道菌群结构和功能变化(肠道菌群失调)，是导致肠道稳态被打破的重要原因之一，该稳态一旦被打破，即导致肠道功能失调，从而形成肠炎。Nishino等证实，肠炎患者的肠道菌群失调，肠道内变形菌门细菌较正常人显著性增多，但厚壁菌门，拟杆菌门细菌显著性减少。申请者在美访学期间前期研究发现：在正常人肠道内有衣原体的存在，衣原体可能是正常肠道菌群的一份子，对维持肠道稳态发挥一定的作用。

衣原体是一种革兰氏阴性，严格寄生在活细胞内的病原菌。能使人致病的衣原体主要有沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，Ct)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophilapneumoniae，Cpn)和鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci，Cps)。其中Ct主要感染泌尿生殖道上皮细胞，引起性传播疾病，严重时可导致异位妊娠、不孕不育等并发症，还可促进HIV的感染。Ct根据其生物学特性和致病性又分为三种生物型，即：鼠生物型、沙眼生物型和性病淋巴肉芽肿生物型。Ct鼠生物型主要感染小鼠引起小鼠肺炎，因而过去称为鼠肺炎型Ct(Mouse Pneumonitis agent，MoPn)，现将其划分为一新的衣原体种，即鼠衣原体(Chlamydia muridarum，CM)。目前对衣原体的研究主要集中在其致病性方面，尤其是对泌尿生殖道和呼吸系统的研究最多，而对消化系统的研究非常罕见，衣原体对肠道的作用及相关的分子机制鲜有相关文献报道。

发明内容

本发明通过实验表明，鼠衣原体(Chlamydia muridarum，CM)能拮抗右旋葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium,DSS)诱导的野生型小鼠溃疡性结肠炎，提示CM具有抗溃疡性结肠炎的作用，可用于制备抗溃疡性结肠炎药物。

附图说明

图1为鼠衣原体对DSS诱导的野生型小鼠体重的影响图；注：与CM+DSS组比较^*P<0.05；

图2为鼠衣原体对DSS诱导的野生型小鼠肠炎评分的影响图；注：与DSS组比较^*P<0.05；

图3为鼠衣原体对DSS诱导的野生型小鼠结肠长度的影响图；注：^*P<0.05；

图4为鼠衣原体对DSS诱导的MyD88^-/-小鼠体重的影响图；

图5为鼠衣原体对DSS诱导的MyD88^-/-小鼠肠炎评分的影响图；

图6为鼠衣原体对DSS诱导的MyD88^-/-小鼠结肠长度的影响图；

图7为鼠衣原体对DSS诱导的IL-22^-/-小鼠体重的影响图；

图8为鼠衣原体对DSS诱导的IL-22^-/-小鼠肠炎评分的影响图；

图9为鼠衣原体对DSS诱导的IL-22^-/-小鼠结肠长度的影响图。

具体实施方式

1.鼠衣原体具有抗溃疡性结肠炎的作用

(1)鼠衣原体(CM)在C57BL/6J野生型小鼠肠道内的生长情况(表1)

表1.CM在野生型小鼠肠道内的生长情况(log10

)

备注：ND代表未检出

鼠衣原体通过灌胃感染C57BL/6J野生型小鼠后，肛门试子检测肠道内衣原体的生长情况，IFA结果显示：衣原体在野生型小鼠肠道内的生长较稳定，这为后阶段研究鼠衣原体抗溃疡性结肠炎的作用奠定了基础。

(2)鼠衣原体(CM)抑制DSS诱导的C57BL/6J野生型小鼠体重下降(图1)

野生型鼠衣原体(G13.32.1)经灌胃感染(intragastric infection，i.g.)C57BL/6J野生型小鼠，感染29天开始给予3.5％DSS饮水，持续5天，结果显示：与DSS组比较，CM+DSS组小鼠体重从给予DSS第八天(D8)开始有一定程度的恢复。

(3)鼠衣原体(CM)降低DSS诱导的C57BL/6J野生型小鼠肠炎评分(图2)

G13.32.1感染C57BL/6J野生型小鼠29天开始，给予3.5％DSS饮水，持续5天，结果显示：与DSS组比较，CM+DSS组小鼠肠炎评分(结合体重和粪便情况)显著性降低。

(4)鼠衣原体(CM)恢复DSS诱导的C57BL/6J野生型小鼠结肠长度(图3)

鼠衣原体G13.32.1感染C57BL/6J野生型小鼠29天后，给予3.5％DSS饮水，持续5天，结果显示：与正常组比较，DSS组小鼠结肠长度显著性变短，但是经过CM处理的小鼠其结肠长度显著性增长。

然而CM是通过什么机制来拮抗溃疡性结肠炎呢？目前普遍认为炎性反应是DSS诱导溃疡性结肠炎模型的主要成因之一。溃疡性结肠炎患者常伴有肠道菌群失调，在各种微生物抗原刺激下，激活体内免疫系统，引起炎症细胞活化和炎症因子产生，导致肠组织的炎症反应。文献报道，Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)在肠炎等炎性疾病发生过程中起到非常重要的作用。TLRs是先天性免疫模式识别受体，与特异性的配体结合后，借助TIR结构域(Toll/Interleukin-1 receptor domain)传递信号，引发肠道、生殖泌尿道和呼吸道炎性介质的释放，导致炎症反应。TLR家族成员TLR4介导的信号通路参与了肠炎的调控。某些中成药(比如黄芩汤，芍黄安肠汤和雷公藤多苷片等)通过抑制TLR4/MyD88信号通路的活化，下调IL-17等促炎细胞因子的表达和上调IL-10等抑炎因子的表达，从而缓解小鼠肠炎；西药阿伐他汀通过抑制TLR4信号通路，缓解2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠肠炎。TLR下游信号接头分子髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)在TLRs信号通路中起重要作用。TLR4通过MyD88依赖或非依赖途径激活下游的级联效应，启动一系列胞内信号传导体系，引发肠道IL-6、TNF-α等炎症介质的释放，导致肠炎的发生^[10-11]。申请者研究发现：CM能拮抗DSS诱导的野生型小鼠溃疡性结肠炎，但是不能拮抗DSS诱导的MyD88^-/-小鼠溃疡性结肠炎。这提示CM对溃疡性结肠炎的拮抗作用与MyD88有关。

2鼠衣原体对溃疡性结肠炎的拮抗作用与MyD88有关

(1)鼠衣原体(CM)在MyD88^-/-小鼠肠道内的生长情况(表2)

表2.CM在MyD88^-/-小鼠肠道内的生长情况(log10

)

备注：ND代表未检出

鼠衣原体通过灌胃感染MyD88^-/-小鼠后，肛门试子检测肠道内衣原体的生长情况，IFA结果显示：衣原体在MyD88^-/-小鼠肠道内的生长较稳定，这为后阶段研究鼠衣原体抗溃疡性结肠炎的作用及相关分子机制打下了基础。

(2)鼠衣原体(CM)不影响DSS诱导的MyD88^-/-小鼠体重下降(图4)

野生型鼠衣原体(G13.32.1)经灌胃感染(intragastric infection，i.g.)MyD88^-/-小鼠，感染29天后给予3.5％DSS饮水，持续5天，结果显示：DSS组与CM+DSS组MyD88^-/-小鼠体重的变化趋势相似，没有显著性差异，与图1野生型小鼠的体重变化结果完全不同(CM可抑制DSS诱导的野生型小鼠体重下降)，这表明鼠衣原体对溃疡性结肠炎的拮抗作用与MyD88有关。

(3)鼠衣原体(CM)不影响DSS诱导的MyD88^-/-小鼠肠炎评分(图5)

鼠衣原体G13.32.1感染MyD88^-/-小鼠第29天开始，给予3.5％DSS饮水，持续5天，结果显示：与DSS组比较，CM+DSS组MyD88^-/-小鼠疾病评分(结合体重和粪便情况)没有显著性差异，与图2野生型小鼠的肠炎评分结果完全不同(CM可降低DSS诱导的野生型小鼠肠炎疾病评分)，这进一步表明鼠衣原体对溃疡性结肠炎的拮抗作用与MyD88有关。

(4)鼠衣原体(CM)不能恢复DSS处理的MyD88^-/-小鼠结肠长度(图6)

鼠衣原体G13.32.1感染MyD88^-/-小鼠29天后，给予3.5％DSS饮水，持续5天，结果显示：与DSS组比较，CM+DSS组MyD88^-/-小鼠结肠长度没有显著性差异，与图3野生型小鼠的结肠长度结果完全不同(CM可修复DSS处理的野生型小鼠结肠长度)，这再一次表明鼠衣原体对溃疡性结肠炎的拮抗作用与MyD88有关。

IL-22是IL-10超家族细胞因子的成员之一，广泛表达于肠道T辅助细胞以及固有淋巴细胞(Innate Lymphoid Cells,ILC)中。值得注意的是，IL-22对肠炎的调节具有双重性^[13-14]。文献报道：T细胞和NK细胞来源的IL-22抑制肠炎发展^[15]，而依赖IL-23R产生的IL-22和6-甲酰基吲哚并[3,2-b]咔唑(FICZ)诱导产生的IL-22促进肠炎的发展^[16-17]。此外，IL-22基因缺陷小鼠感染柠檬酸杆菌，肠炎沙门氏菌和念珠菌后，小鼠更容易出现肠炎^[18-19]；然而弓形虫感染IL-22基因缺陷小鼠，增强小鼠肠道免疫反应^[20]。IL-22在小肠中稳定表达，维持小肠上皮先天防御机制和屏障的完整性，防止肠道微生物的侵犯；而在大肠中，IL-22是诱导性表达的，正常情况下表达很低，但在肠炎等炎症条件下可大量表达^[15]。IL-22作为一种重要的肠道黏膜保护因子，在炎症性肠病中发挥了积极作用。IL-22与IL-22R1和IL-10R2组成的异二聚体受体结合后，激活JAK1和TYK2受体，导致STAT3分子磷酸化，然后诱导抗菌肽和黏蛋白等基因的表达，增强上皮先天防御机制和屏障的完整性，以此隔离免疫系统和管腔的共生细菌之间的直接相互作用，从而改善小鼠肠道炎症反应^[21]。体内与体外实验均证实^[22]TLR4可通过MyD88信号通路诱导IL-22的合成与分泌。本实验结果(如下)发现：CM能拮抗DSS诱导的野生型小鼠溃疡性结肠炎，但并不影响DSS诱导的IL-22^-/-小鼠溃疡性结肠炎。这提示CM对溃疡性结肠炎的拮抗作用与IL-22有关。结合申请者的研究结果以及国内外文献报道，我们认为：CM可能通过激活MyD88/IL-22信号通路来发挥抗溃疡性结肠炎的作用。

3鼠衣原体对溃疡性结肠炎的拮抗作用与IL-22有关

(1)鼠衣原体(CM)在IL-22^-/-小鼠肠道内的生长情况(表3)

表3.CM在IL-22^-/-小鼠肠道内的生长情况(log10

)

备注：ND代表未检出

鼠衣原体通过灌胃感染IL-22^-/-小鼠后，肛门试子检测肠道内衣原体的生长情况，IFA结果显示：衣原体在IL-22^-/-小鼠肠道内的生长较稳定，这为后阶段研究鼠衣原体抗溃疡性结肠炎的作用及相关分子机制打下了基础。

(2)鼠衣原体(CM)不影响DSS诱导的IL-22^-/-小鼠体重下降(图7)

野生型鼠衣原体(G13.32.1)经灌胃感染(intragastric infection，i.g.)IL-22^-/-小鼠，感染29天后给予3.5％DSS饮水，持续5天，结果显示：与DSS组比较，CM+DSS组IL-22^-/-小鼠体重的变化结果没有显著性差异，与图1野生型小鼠的体重变化结果完全不同(CM可抑制DSS诱导的野生型小鼠体重下降)，这表明鼠衣原体对溃疡性结肠炎的拮抗作用与IL-22有关。

(3)鼠衣原体(CM)不影响DSS诱导的IL-22^-/-小鼠肠炎评分(图8)

鼠衣原体G13.32.1感染IL-22^-/-小鼠第29天开始，给予3.5％DSS饮水，持续5天，结果显示：与DSS组比较，CM+DSS组IL-22^-/-小鼠疾病评分(结合体重和粪便情况)没有显著性差异，与图2野生型小鼠的肠炎评分结果完全不同(CM可降低DSS诱导的野生型小鼠肠炎疾病评分)，这进一步表明鼠衣原体对对溃疡性结肠炎的拮抗作用与IL-22有关。

(4)鼠衣原体(CM)不能恢复DSS处理的IL-22^-/-小鼠结肠长度(图9)

鼠衣原体G13.32.1感染IL-22^-/-小鼠29天后，给予3.5％DSS饮水，持续5天，结果显示：与DSS组比较，CM+DSS组IL-22^-/-小鼠结肠长度没有显著性差异，与图3野生型小鼠的结肠长度结果完全不同(CM可修复DSS处理的野生型小鼠结肠长度)，这再一次表明鼠衣原体对溃疡性结肠炎的拮抗作用与IL-22有关。

因此，CM能拮抗右旋葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium,DSS)诱导的野生型小鼠溃疡性结肠炎，提示CM具有抗溃疡性结肠炎的作用，可用于制备抗溃疡性结肠炎药物。

Claims (1)

1.鼠衣原体(Chlamydia muridarum) G13.32.1在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用。

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