CN113693026A - 一种溃疡性结肠炎动物模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及实验动物模型领域，特别涉及一种溃疡性结肠炎动物模型的构建方法。该构建方法具体为：试验动物空腹一段时间后，每日给予特定比例的柠檬酸杆菌和葡聚糖硫酸钠，给药3～5天后，得到溃疡性结肠炎动物模型。本发明通过柠檬酸杆菌致使小鼠免疫功能下降再联合使用葡聚糖硫酸钠致炎的新颖溃疡性结肠炎动物模型构建方法，可解决目前溃疡性结肠炎动物模型中存在的容易自愈、建模周期长、费用高及成功率低的问题。

Description

一种溃疡性结肠炎动物模型的构建方法

技术领域

本发明涉及实验动物模型领域，特别涉及一种溃疡性结肠炎动物模型的构建方法。

背景技术

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)，是以结直肠黏膜连续性、弥漫性炎症改变为特点的慢性非特异性肠道炎性疾病，其全球发病率正在上升。UC病变局限于大肠黏膜及黏膜下层，临床表现为腹泻、黏液脓血便、腹痛，病程迁延，不同患者的疾病严重程度和轻重不等，常反复发作。本病可见于任何年龄。在罕见的严重炎症病例中，特别是那些在诊断前长期未经治疗的UC患者，会出现体重减轻、发烧或穿孔的症状。在多达25％的患者中，术外表现可能早于胃肠道症状的出现。因UC治愈难度大，发病率呈逐年升高趋势，且有癌变倾向，已被WHO列为现代难治性疾病，被称为“绿色癌症”。

UC的发病机制是多因素的，且病因至今尚未完全明确，其发病机制主要包括遗传因素、上皮障碍缺陷、免疫反应失调和环境因素、心理因素等。溃疡性结肠炎患者从直肠开始有黏膜炎症，可以持续延伸到结肠的近端。

用动物模型可以复制某些不能直接在人类身上进行观察和研究的疾病，它是医学研究的重要手段，所以医学研究常使用动物模型作为临床和理论假说的实验基础，而一个理想的动物模型也是医学实验成功与否的关键因素。由于溃疡性结肠炎治愈难度大，易复发，且发病率和患病率逐年增加，因此，建立理想的UC动物模型对于深入研究UC发病机制、病变规律及用药治疗方案具有重要意义。然而到目前为止，还没有一个与人类UC发病机制及临床表现完全相符的实验动物模型，需根据不同研究目的选择不同的动物模型。

目前，建立溃疡性结肠炎动物模型的方法主要有以下几种：

1、化学刺激法

许多疾病模型都可以利用化学方法建立。

①乙酸(acetic acid，AA)

此模型通过乙酸的刺激作用使结肠上皮细胞凋亡，破坏黏膜屏障，引发炎症介质的大量表达，诱导炎症细胞的浸润。乙酸灌肠法建模后也在短期内表现出与人类UC相似的病变，如上皮细胞坏死，黏膜细胞高度水肿，中性粒细胞浸润以及出血等，而乙酸诱导UC模型中这样的症状通过低分子量肝素直肠栓剂的应用能够得到改善，为UC的治疗提供了新思路；孙茂庆等对新西兰兔以乙酸局部刺激也较好地复制了UC模型，并且他们通过对不同浓度(5％乙酸、8％乙酸和10％乙酸)的比较，发现5％浓度能够保证实验动物死亡率较低而模型复制程度较好，而以兔作为UC模型无论是在操作简便性还是在给药途径方面都比鼠类更优越。乙酸的来源广泛方便，故而成本低廉，使用直接灌肠的方法也能够被大多数实验人员接受并熟练掌握，所以应用较广。但是就目前所知临床上罕见由直接黏膜损伤所致UC，而这与AA所带来的化学刺激不相符合，故而在模拟人类UC的发病机制上值得权衡。另外，短期急性发作之后缺乏与人类UC相似的慢性复发的过程，而且乙酸刺激后容易发生自愈导致无法进行长期疗效的观测，这也是此方法的一大缺点。

②葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium，DSS)

自从1985年报道日本学者首次采用DSS制备出溃性结肠炎模型后，已有大量数据证明DSS结肠炎模型的病因、临床症状、病理改变及治疗应答均与人类溃疡性结肠炎相似。因此，DSS结肠炎模型对于研究UC病因、发病机制起到关键作用，成为了一种很重要治疗手段，也是目前应用最为广泛的UC模型之一。

DSS是葡聚糖的聚阴离子衍生物，由葡聚糖和氢磺酸的酯化反应形成，分子式为(C₆H₇Na₃O₁₄S₃)n，MW：36000-50000不等，含硫量一般为17％-20％，DSS常被用于诱导结肠炎模型，其诱导机制虽尚未明确。目前的研究主要认为DSS增加肠道通透性、破坏肠黏膜屏障、上调某些细胞因子(肿瘤坏死因子、白介素、干扰素)、激活某些通路(NF-KB通路和TRPV1通路)或肠道菌群失调等有关。根据给药时间以及给药周期可分为急性和慢性两种结肠炎模型。

急性DSS UC模型不需要长时间给药，而且自由饮用的方法极为简单，DSS所带来的免疫反应与人类UC相似，也可以用于致炎机制、免疫反应的研究；但是正由于是自由饮水，不能控制小鼠的饮水量，造成个体差异比较明显，再加上同样是因为急性化学损伤导致的炎症反应，不适宜研究慢性UC引发的结肠癌相关问题。慢性DSS UC能够很好地模拟人UC的症状和病理改变，但是要求的建模周期比较长，造成费用较高、耗时长，而且模型动物致死率也较高。

③三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-benzene-sulfonic acid，TNBS)

TNBS模型于1984年利用兔建立。实际应用中将TNBS溶解于乙醇建立TNBS－乙醇复合诱导的模型，结肠粘膜经乙醇刺激作用，TNBS进入粘膜内与构成组织蛋白的赖氨酸ε－氨基团结合成为完全抗原，激发肠粘膜免疫反应引起免疫应答。采用异戊巴比妥麻醉，一定量TNBS缓慢灌肠可以诱导急性肠炎大鼠模型；15d以后再次给予定量TNBS灌肠可以造成复发性结肠炎。徐阳等利用此方法并加以改进，在BALB/c小鼠中建立了稳定的UC模型，发现以灌胃针替代硅胶管灌肠可以提高造模效率和稳定性。孙载鑫等继续对此模型建模方法中TNBS和乙醇的混合液最适浓度比进行了探讨，发现TNBS溶于0.25mL 50％乙醇中的2％混合液按100mg/kg进行灌肠造模时可成功构建持续而稳定的溃疡性结肠炎大鼠模型，这表示TNBS模型能够模拟UC的慢性复发过程，症状和组织学改变与人类UC相似，但是其免疫反应以Th1/Th17反应为主，这与克罗恩病(CD)更加相近，所以在研究免疫机制和环节时更多用于CD的研究。

④恶唑酮(oxazolone，OXZ)

OXZ模型建立有两种大的模式，一种类似于TNBS模型直接灌肠，此种症状持续较短，模型鼠死亡率较高；而另一种则是先通过腹部剃毛并涂擦溶于100％乙醇中的恶唑酮致敏，然后再行恶唑酮灌肠，24h之后可以进行数据的记录和观察。

⑤二硝基氯苯(dinitrochlorobenzene，DNCB)－乙酸

DNCB-AA模型的建立机制同TNBS-乙醇模型相似。朱慧敏等利用DNCB-AA复合法建立UC大鼠模型的具体方法如下：大鼠颈背部脱毛后连续2周滴加2％二硝基氯苯丙酮，第15d二硝基氯苯丙酮0.25mL以灌胃针注入结肠，第16d同部位乙酸灌肠，准确定时，生理盐水冲洗；在他们的研究中同时发现相比单独的AA灌肠法，复合造模通过降低IL-2、增加IL-6、IL-17水平，可以加重和延长大鼠的免疫紊乱，从而保证模型动物在所需要的研究时间内较高的存活率。

此方法重复性好，也比较简单，病理表现与人类UC相似，模型动物的存活率也比较高，而且能够反映外源性抗原和机体自身抗原诱发的典型胃肠道迟发过敏反应，也适合研究免疫调控机制等，但是也存在自愈性的缺点。

2、免疫法

免疫法建模能够模拟自然的发病因素，对于研究人类UC的免疫反应和免疫环节有重要帮助，但是单纯的免疫法常常要求较严格而且成功率低，目前较少应用，更多的是与其他方法结合使用，如胎鼠结肠种植法、大鼠结肠细菌菌株法、结肠黏膜组织致敏法等。

3、复合法

复合法主要包括：免疫复合物+TNBS+乙醇、免疫致敏结合局部乙酸刺激、慢性束缚应激+DSS、噪声应激+免疫复合物、中医症候法等。

4、基因修饰

在研究UC的发病机制、免疫机制以及各种信号通路的过程中，针对单个基因进行修饰(缺失或过度表达)不仅能够清楚阐明该基因在UC发病和进展过程中所起到的作用，更为深入研究其在机体内的功能作用提供了便利。利用基因修饰建立的动物模型，无论是对机制研究还是药物研发亦或临床治疗都是十分重要的部分。但这种方法同时也受到技术水平、喂养繁殖条件以及价格的限制，在国内并不能被广泛地应用。

虽然目前复制溃疡性结肠炎动物模型有多种，但尚未有一种模型与UC在致病因素、病理生理过程、免疫反应、临床表现、治疗手段等诸方面完全相同。现有造模的方法都存在一定的不足之处。如，化学法中乙酸造模的缺点是短期急性发作之后缺乏与人类UC相似的慢性复发的过程，而且乙酸刺激后容易发生自愈导致无法进行长期疗效的观测。单纯DSS急性或慢性造模的缺点是建模周期比较长，费用高，而且模型动物致死率也较高。其他一些模型也存在实验周期长，技术要求高，易感染，成功率低，没有相应设备、条件和技术的试验人员、炎症程度过轻等。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种溃疡性结肠炎动物模型的构建方法。本发明通过柠檬酸杆菌致使小鼠免疫功能下降再联合使用DSS致炎的新颖UC动物模型构建方法，可解决目前UC动物模型中存在的容易自愈、建模周期长、费用高及成功率低的问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种溃疡性结肠炎动物模型的构建方法，该构建方法具体为：试验动物空腹一段时间后，每日给予特定比例的柠檬酸杆菌和葡聚糖硫酸钠，给药3～5天后，得到溃疡性结肠炎动物模型。

作为优选，柠檬酸杆菌的每日剂量为1×10¹⁰～1×10¹³CFU/g·bw。

优选地，柠檬酸杆菌的每日剂量为(1～10)×10¹²CFU/g·bw。

作为优选，葡聚糖硫酸钠的每日剂量为5～15mg/g·bw。

优选地，葡聚糖硫酸钠的每日剂量为7～10mg/g·bw。

作为优选，试验动物空腹10～20h。

在本发明提供的具体实施例中，试验动物空腹12h。

作为优选，柠檬酸杆菌和葡聚糖硫酸钠的给予途径为灌胃或腹腔注射。

优选地，柠檬酸杆菌和葡聚糖硫酸钠的给予途径为灌胃。

在本发明提供的具体实施例中，每日给予柠檬酸杆菌和葡聚糖硫酸钠，经过3天后正常饲养。

作为优选，葡聚糖硫酸钠的分子量为36000～50000。

作为优选，柠檬酸杆菌为柠檬酸杆菌ATCCS1459。

作为优选，试验动物为小鼠、大鼠、兔、犬、猫、灵长类、禽类或畜类。

在本发明提供的具体实施例中，试验动物为Balb/c小鼠。

本发明提供了一种溃疡性结肠炎动物模型的构建方法。该构建方法具体为：试验动物空腹一段时间后，每日给予特定比例的柠檬酸杆菌和葡聚糖硫酸钠，给药3～5天后，得到溃疡性结肠炎动物模型。本发明具有的技术效果为：

本发明提出的通过柠檬酸杆菌联合DSS诱导溃疡性结肠炎动物模型的构建方法，简易可行，造模周期大大缩短，解决急性造模期间自愈问题；同时，本发明的模型构建方法大大减少了用药浓度，成本降低，仅仅需要连续3天灌胃即可以解决目前急性UC造模中出现的模型维持时间短及自愈的问题。本发明提出的Cr+DSS的UC造模方法所构建的UC模型，其病症维持时间长，可以诱导UC病症持续时间长达3周左右，且造模期间，模型的发病症状比较稳定，有利于在造模期间对UC病症机理的研究。相比于之前自由饮用或灌胃法的单纯DSS模型，不仅缩短了造模时间，更节省了给药量，也降低对小鼠的伤害程度。柠檬酸杆菌感染小鼠后，再用DSS诱导UC的发生更简单且UC病症持续时间长久，解决了目前UC造模的自愈问题。

附图说明

图1不同造模条件下体质量的变化；

图2不同造模方式对结肠长度的影响；

图3不同造模方式小鼠结肠病理HE染色显微镜下表现；其中，3A：空白对照组；3B：Cr₀组；3C：DSS组；3D：DSS+Cr组。

具体实施方式

本发明公开了溃疡性结肠炎动物模型的构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1材料和方法

1.1试剂

生理盐水；柠檬酸杆菌(ATCCS1459)冻存液；0.9％氯化钠溶液；LB肉汤培养基；LB琼脂培养基；萘啶酮酸；DSS(MW4×10⁴)；HE染色试剂盒；生理盐水；ELISA试剂盒；PCR试剂盒；流式细胞术相关抗体。

1.2仪器器材

FA2004N电子天平(分析天平)；EXL800酶标仪；切片机；离心机；流式细胞仪；生化培养箱；高压灭菌器；荧光定量PCR仪；注射器；灌胃针(8号)、96孔细胞培养板、一次性接种环等。

1.3实验动物

健康Balb/c小鼠，5-6周龄，体质量为(22±2)g，雌性，SPF级，济南朋悦实验动物繁育有限公司。室内温度21～25℃，相对湿度40％～70％，自由饮水且用标准饲料喂养，人工控制光照昼夜12h，垫料1周更换2次。实验过程中，对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》，按照3R原则给予实验动物人道关怀。

1.4实验方法

1.4.1菌液和DSS溶液配制

①柠檬酸杆菌(Cr)菌液培养

柠檬酸杆菌菌液培养：将冷冻的Cr储备液在LB琼脂平板上划线，37℃培养过夜。挑取单菌落接种在LB(Luria-Bertani)肉汤培养基中，37℃，200rpm过夜培养。按1％接种于新的LB培养基中200rpm 37℃孵育12-14h，测定OD₅₉₅，根据标准曲线确定菌液浓度，通过离心收集，然后重悬于LB培养基中。

②DSS溶液配制

1.4.2分组及造模

1.4.2.1分组

分两个实验过程进行：

(一)第一过程的小鼠分组情况为：

将DSS组分为低、中、高剂量组，将Cr组分为低、中、高剂量组，在这一个过程中，确定出来DSS与Cr的最佳组合剂量组。具体剂量分组情况为：

取81只5～6周龄的雌性Balb/c小鼠，适应性饲养1周后，随机分为2.5％DSS灌胃组(DSS-a)、3.5％DSS灌胃组(DSS-b)、4.5％DSS灌胃组(DSS-c)；低剂量(5×10⁸CFU柠檬酸杆菌的生理盐水100μL)柠檬酸杆菌菌液组(Cr-L)、中剂量(5×10⁹CFU柠檬酸杆菌的生理盐水100μL)柠檬酸杆菌菌液组(Cr-M)、高剂量(5×10¹⁰CFU柠檬酸杆菌的生理盐水100μL)柠檬酸杆菌菌液组(Cr-H)，每组9只。第一过程小鼠分组情况见下表1。

表1：第一实验过程小鼠分组情况

(二)第二实验过程：

分组情况：在第一批次确定出来的最佳浓度下，取32只5～6周龄的雌性Balb/c小鼠，适应性饲养1周后，随机分为设置空白对照组(Bc)、纯DDS组(DSS₀)、纯柠檬酸杆菌菌液组(Cr₀)和Cr+DSS组，每组各8只。

在第二实验过程中，确定不同造模方法的病变程度和UC病变的稳定程度。

1.4.2.2造模

第一批次小鼠：

①Cr造模组：小鼠空腹12h后，使用灌胃法对Cr造模组每只小鼠，一次性灌注各浓度柠檬酸杆菌菌液8mL(上午和下午各灌注一次，每次4mL)，共连续灌注3天后，继续正常饲养。

②DSS造模组：小鼠空腹12h后，使用灌胃法对DSS造模组每只小鼠，一次性灌注各浓度DSS溶液各8mL(上午和下午各灌注一次，每次4mL)，共连续灌注3天后，继续正常饲养。

③Cr+DSS造模组：小鼠空腹12h后，使用灌胃法对Cr+DSS造模组中每只小鼠，一次性灌注各浓度柠檬酸杆菌菌液和DSS溶液各4mL，共连续灌注3天后，继续正常饲养。

④Bc组：小鼠空腹12h后，使用灌胃法对空白对照组(Bc组)小鼠每只灌注同等量的生理盐水。灌胃结束后正常饲养，并在确定时间观察记录并取样检测。

第二批次小鼠：

小鼠空腹12h后，使用相同的灌胃法，给予DSS₀组小鼠灌胃最佳浓度下的DSS溶液(DSS-a)8mL/天，给予Cr₀组小鼠灌胃最佳浓度下的柠檬酸杆菌菌液(Cr-H)8mL/天，给予Cr+DSS组小鼠灌胃Cr-H浓度柠檬酸杆菌菌液和DSS-a浓度溶液各4mL/天；给予空白对照组小鼠相同量的生理盐水；连续灌胃3天。灌胃结束后正常饲养，并在确定的时间点观察记录并取样检测。

1.4.2.3样本采集

造模成功后，用10％水合氯醛溶液(3.5mL/kg体质量)麻醉处死小鼠。取结肠大体观察肠壁，沿肠系膜缘剪开肠腔，生理盐水冲洗粪便，称量湿重，计算脏器指数(脏器指数＝各脏器质量/体质量×100％)。将结肠内壁向上平铺在白纸上，测量其长度、宽度，参照相关标准进行相应的评分。

剖取部分结肠组织，以10％福尔马林固定，石蜡包埋，病理切片(HE染色)，显微镜下观察结肠黏膜变化情况。

将称取的病变结肠组织剪碎，加上生理盐水，用匀浆器制成20％匀浆，然后在4℃下以4800r/min离心12min，提取血清，置于-20℃冰箱冻存，为待测标本用于细胞因子检测。

1.4.2.4考察指标

(1)体重变化：实验开始和结束时分别于早晨称各组小鼠体重，计算平均值，进行统计学比较。

(2)一般情况：疾病活动度评分(disease activity index，DAI)：实验期间，每天记录各组小鼠的饮水量、体质量、粪便性状及便血、体温等情况，进行疾病活动指数评分。

(DAI＝体质量下降的评分+大便性状的评分+隐血情况的评分)，DAI评分标准如表2所示。

表2：疾病活动指数(DAI)评分标准

体质量下降比	粪便性状	粪便隐血/肉眼血便	计分
				0	正常	正常	0
1-5	松散	隐血阳性	1
				5-10	松散	隐血阳性	2
10-15	稀便	肉眼血便	3
				＞15	稀便	肉眼血便	4

注释：粪便性状正常，指成形粪便；松散，指不黏附于肛门的糊状、半成形粪便；稀便，指可黏附于肛门的稀水样便。DAI评分＝三项指标计分总和/3。

(3)结肠长度变化

(4)血清细胞因子变化

采用酶联免疫吸附测定法测定血清中IL-6、IL-8、TNF-α的浓度，严格按照试剂盒说明书操作。

(5)HE染色情况

(6)组织病理学评分(HS)，组织病理学评分标准如表3所示。

表3：组织病理学评分(HS)标准

(7)结肠黏膜损伤情况评分(CMDI)

小鼠剖腹后立即进行肉眼观察结肠黏膜，用放大镜观察肠黏膜有无充血水肿、糜烂及溃疡形成，进行结肠黏膜损伤程度评分(CMDI)评分。

表4：结肠黏膜损伤程度评分(CMDI)标准

1.5数据分析

实验数据以

形式表示，采用SPSS17.0统计软件进行分析，两组间比较采用T检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.6实验结果

1.6.1第一实验过程小鼠结果

一般情况：正常对照组小鼠毛色光滑发亮、精神饱满、饮食饮水正常、灵活好动、体质量增加、粪便质地较硬，其余9组小鼠经Cr或DSS刺激后精神萎靡、毛色枯黄粗糙、体质量明显下降，出现拱背、扎堆、嗜睡等现象，粪便呈黄色稀便并伴有恶臭。

造模后第1天至第15天，与正常对照组相比，小鼠的DAI评分结果显示：各组模型组小鼠模型成功建立(P＜0.01或P＜0.05)；造模后第7天，通过DAI评分选择各组评分最低与最高的各2只小鼠处死观察结肠，第15天，处死剩余7只小鼠观察结肠，分别进行CMD评分。根据小鼠存活率、DAI评分、CMDI评分结果可知，造模结果比较理想的是G组，详细结果见表5。

表5：第一过程小鼠造模实验结果

注释：与空白对照组比较：*代表p＜0.05；**代表p＜0.01。

1.6.2第二实验过程小鼠各指标变化情况

1.6.2.1体重变化

造模后，DSS₀组、Cr₀组和Cr+DSS组小鼠体质量均呈下降趋势(图1)。造模第4天开始，与空白组比较，造模组小鼠体质量开始有下降趋势。从造模的第6天开始，DSS+Cr组小鼠体质量下降更明显，明显低于DSS₀组、Cr₀组。说明Cr+DSS方法，造模更成功。

1.6.2.2各组疾病活动指数(DAI)评分比较

在造模后，每天记录小鼠体质量下降、粪便性状、便血积分及体温，计算DAI，结果见表6。从表6中可以看出，只有Cr+DSS组，在造模后的第4、6、10、15、20天，其DAI评分与对照组相比，均有显著性；且与单纯Cr或DSS组比较，不同时间的DAI评分结果也有一定的差异性(p＜0.01或p＜0.05)。而单纯用Cr造模，或单纯用DSS造模的方法，其DAI得分与对照组相比，仅在造模前几天DAI得分有一定的差异性但不显著。这些结果说明，通过Cr降低小鼠免疫力再通过DSS引致溃疡性结肠炎的造模方法是有效可行的，本发明的这种Cr+DSS的造模方法，诱导的结肠组织损伤程度更大，持续时间更长，UC模型更稳定。

表6：各组小鼠DAI不同时间比较(分，

)

注释：

①与空白对照组比较：*表示有差异p＜0.05；**表示有显著性差异p＜0.01。

②与Cr₀组比较：#表示有差异p＜0.05；##表示有显著性差异p＜0.01。

③与DSS₀组比较：▼表示有差异p＜0.05；▼▼表示有显著性差异p＜0.01。

1.6.2.3结肠长度的变化结果

结肠萎缩是溃疡性结肠炎的一个重要病理特征。本研究发现，Cr₀组、DSS₀组和Cr+DSS组小鼠结肠均有不同程度的萎缩。与空白对照组比较，Cr+DSS组小鼠结肠萎缩更明显，差异显著。见图2。

1.6.2.4各组小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α浓度比较

IL-6、IL-8和TNF-α等促炎症细胞因子被公认为是能介导溃疡性结肠炎发病的因子，从表7实验结果可以看出：

Cr+DSS模型组：血清IL-6、IL-8、TNF-α浓度均高于正常对照组，IL-6、与TNF-α有显著性差异(P＜0.01)，IL-8有差异(P＜0.05)；且与单纯用Cr或DSS造模比较，也均有差异性(P＜0.01或P＜0.05)。而单纯用Cr造模，与空白对照组比较，仅仅IL-8有差异性但不显著(P＜0.05)；单纯用DSS造模，仅仅IL-6有差异性也不显著(P＜0.05)。

以上结果均说明：先通过Cr造成小鼠免疫力低下后用DSS法诱导溃疡性结肠炎的造模方法是有效的，可以较为准确的模拟UC病症。

表7：各组小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α浓度比较(

pg/mL)

组别	n	IL-6	IL-8	TNF-α
					Bc组	8	87.07±20.01	193.69±67.79	66.93±15.06
Cr<sub>0</sub>组	8	137.27±17.85	455.48±112.19<sup>*▼</sup>	85.11±9.97<sup>▼</sup>
					DSS<sub>0</sub>组	8	123.72±15.61<sup>*</sup>	432.64±108.67<sup>#</sup>	84.36±8.69
Cr+DSS组	8	137.54±20.51<sup>**#▼▼</sup>	458.38±165.4<sup>3*##▼</sup>	85.77±13.68<sup>**#▼▼</sup>

注释：

①与空白对照组比较：*表示有差异p＜0.05；**表示有显著性差异p＜0.01。

②与Cr₀组比较：#表示有差异p＜0.05；##表示有显著性差异p＜0.01。

③与DSS₀组比较：▼表示有差异p＜0.05；▼▼表示有显著性差异p＜0.01。

1.6.2.5HE染色结果

造模结束后，解剖，取肛门至回盲部的结肠，进行结肠大体病变观察，造模成功的小鼠均可见结肠部肿大并残留血性大便，结肠标本肉眼观察可见水肿。对结肠组织HE染色观察(结果见图3)后同时进行组织学损伤评估。

从图3中可以看出，病理HE切片中，空白对照组小鼠的腺体结构正常，边绒毛膜结构正常，杯状细胞数量也正常(见图3A)；造模组中DSS+Cr组，腺体排列紊乱，杯状细胞显著减少，隐窝腔扩张，部分或全部的隐窝被破坏、变形或排列紊乱，分支状畸形，黏膜广泛缺失，上皮过度增生，炎症细胞广泛浸润，呈典型炎症症状，见图3D。说明通过柠檬酸杆菌降低小鼠免疫力再通过DSS溶液诱导溃疡性结肠炎的造模方法，即Cr+DSS造模方法，是十分成功的，且Cr+DSS的UC造模法，出现的炎症症状与人类UC症状十分相似，再次说明Cr+DSS造模法是适合于研究人类UC病理机制的。

而其他两种造模方法，HE切片中，光镜下腺体结构破坏不够明显，杯状细胞数量变化不明显，且没有典型的炎症细胞出现。再次说明，单纯用DSS造模和单纯用Cr造模的方法，不如用Cr与DSS同时造模(Cr+DSS法)，其模型UC症状更明显。

1.6.2.6组织病理学评分(HS评分)情况

从表8数据结果可以看出：用Cr+DSS造模，在造模的第8、14、20天时，与空白组比较，组织病理学评分均有显著性差异(p＜0.01)；在第5、11天时，HS评分与空白组比较也有差异性(p＜0.05)。而单纯用Cr或单纯用DSS造模，仅仅在造模的前几天，HS评分与空白组比较有一定的差异性【单纯Cr造模，第5天和第11天与空白组比较HS得分有差异但不显著(p＜0.05)；单纯用DSS造模，仅在第5天与空白组比较HS得分有差异但不显著(p＜0.05)】，这就说明，单纯用Cr或DSS造模，UC病症持续时间较短，甚至自愈，不适合于UC病理机制的长期研究过程；而通过Cr+DSS的造模方法，可以让UC病症持续时间延长，克服了UC急性造模过程中出现的自愈问题。目前急性UC模型的各种建立方法，大部分UC症状都仅能持续一周左右，而本发明的UC造模方法，可以诱导UC病症持续时间长达3周左右，且造模周期短，造模成本低，本发明造模方法简易可行，且解决了UC急性造模期间给药治疗过程因自愈问题造成无法研究用药治疗机制的问题。

表8：各组小鼠不同时间HS评分比较结果

注释：

①与空白对照组比较：*表示有差异p＜0.05；**表示有显著性差异p＜0.01。

②与Cr₀组比较：#表示有差异p＜0.05；##表示有显著性差异p＜0.01。

③与DSS₀组比较：▼表示有差异p＜0.05；▼▼表示有显著性差异p＜0.01。

1.6.2.7各组造模小鼠结肠黏膜损伤情况评分(CMDI)

各组小鼠结肠黏膜损伤情况评分(CMDI)比较，结果见表9。从表中可以看出，只有Cr+DSS组模型中UC病变程度与空白组有显著性差异，说明用Cr+DSS造模方法的可行性。

表9：各组小鼠CMDI评分比较(分，

)

组别	n	结肠形态	结肠黏膜
				空白对照组	8	0	0
Cr<sub>0</sub>组	8	1.51±0.21	2.38±0.16*
				DSS<sub>0</sub>组	8	0.07±0.13	0.54±0.27
Cr+DSS组	8	2.91±0.14**	4.54±0.23**

注释：与空白对照组比较：*表示有差异但不显著，p＜0.05，**表示有显著性差异p＜0.01。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种溃疡性结肠炎动物模型的构建方法，其特征在于，试验动物空腹一段时间后，每日给予特定比例的柠檬酸杆菌和葡聚糖硫酸钠，给药3～5天后，得到溃疡性结肠炎动物模型。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述柠檬酸杆菌的每日剂量为1×10¹⁰～1×10¹³CFU/g·bw。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述柠檬酸杆菌的每日剂量为(1～10)×10¹²CFU/g·bw。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述葡聚糖硫酸钠的每日剂量为5～15mg/g·bw。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述葡聚糖硫酸钠的每日剂量为7～10mg/g·bw。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述试验动物空腹10～20h。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述柠檬酸杆菌和葡聚糖硫酸钠的给予途径为灌胃或腹腔注射。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述柠檬酸杆菌和葡聚糖硫酸钠的给予途径为灌胃。

9.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述葡聚糖硫酸钠的分子量为36000～50000。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述试验动物为小鼠、大鼠、兔、犬、猫、灵长类、禽类或畜类。

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