CN101838310B - 碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽t3及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3及其应用。本发明所述碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3的氨基酸序列为AMKEDGRLLASKCVTD，核苷酸序列为GCTATGAAAGAAGACGGTCGTCTGCTGGCTTCCAAATGCGTTACCGAC。体外实验证明本发明的碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3在内皮细胞增殖、成管、肿瘤细胞增殖和迁移过程中具有明显的抑制作用。因此，本发明所述的碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3可用于制备多肽疫苗、肿瘤血管生长抑制剂或者肿瘤导向药物，而且其对于以bFGF受体为目标、诊断预测肿瘤的发生发展，探讨小分子多肽对肿瘤血管新生抑制剂的开发以及肿瘤导向性药物的开发和研究具有十分重要的参考价值。

Description

碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域和医学领域，特别涉及一种碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3及其应用。

背景技术

肿瘤是一种致死率非常高的疾病，现代研究表明，肿瘤组织的血管新生在肿瘤的发生发展和转移过程中起着相当重要的作用，特别是肿瘤新生初期，在其体积超过2mm³时，必须有血管生成而为其提供大量的营养。同时，血管的新生也为肿瘤细胞的生长和转移以及转移部位的肿瘤生长提供了一个渠道，使得恶性肿瘤不断增生转移危及人体的健康和生命。肿瘤生长与其血管新生有非常密切的关系，是肿瘤增生、扩散和微转移灶发展的重要条件之一，研究开发新生血管生成抑制剂成为目前肿瘤治疗的一种新策略。

碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)是广泛存在于人体和动物体内的生长因子，它作为目前成纤维细胞家族成员中发现最早研究最多的因子之一，具有广泛的生物学活性，在促进血管形成、胚胎发育、创伤愈合以及肿瘤形成过程中扮演着重要的角色。近年来有研究表明，恶性肿瘤组织中，bFGF有着强烈的、高水平的表达，并且在血清检测中显示较高程度的水平，这说明bFGF表达的增强与肿瘤的恶性程度以及侵袭能力的增强密切相关，甚至可以作为肿瘤早期诊断和预后的指标之一。近年来的研究发现，在整个肿瘤发生发展过程中，bFGF在肿瘤组织血管新生方面发挥着重要的作用。

噬菌体展示技术(Phage Display Technology)是一种将外源肽或者蛋白质与特定的噬菌体衣壳蛋白PIII或者PVIII相融合，展示于噬菌体表面来构建蛋白质或多肽文库，并从中筛选出目的蛋白、多肽或抗体的基因工程高新技术。它的优势在于可以将表现型与基因型直接联系在一起，确保能方便快捷的展示出目的蛋白以及该蛋白的基因序列。基于此，近年来在多肽序列鉴定、多肽模拟物的结构和功能的研究以及在人类病毒、细胞、肿瘤等多种生物靶组织多肽的研究方面，噬菌体展示技术发挥着重要的不可替代的作用。

自从Baird发现bFGF25-69以及24-121位上两个短肽序列能够与bFGF受体结合以来，随后的研究不断的将bFGF相应的具有受体结合活性或肝素结合活性的氨基酸残基进行精确定位，例如Kurukawa等发现105-115位是bFGF的亲受体位点、Ray等发现68-77位是bFGF在神经祖细胞上的受体结合位点等。这些结合短肽本身是否具有抗肿瘤和抗血管新生的活性还未完全确定，而目前在细胞因子模拟肽的相关多肽研究中，多数侧重于其在促进血管生成和胚胎发育、创伤愈合等方面的研究，而在抗肿瘤方面鲜有报道。而且bFGF相关的多肽多通过化学合成等手段得到，纯化时间长、成本高。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3。

本发明的另一目的在于提供所述碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3的应用

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3，其氨基酸序列为Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala SerLys Cys Val Thr Asp，即AMKEDGRLLASKCVTD。

所述碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3的核苷酸序列如下所示：GCTATGAAAGAAGACGGTCGTCTGCTGGCTTCCAAATGCGTTACCGAC；

所述的碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3用于制备多肽疫苗、肿瘤血管生长抑制剂或者肿瘤导向药物；

所述的肿瘤优选为黑色素瘤。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明所述的碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3在内皮细胞增殖、成管，肿瘤细胞增殖和迁移过程中具有明显的抑制作用。对于以bFGF受体为目标、诊断预测肿瘤的发生发展，探讨小分子多肽对肿瘤血管新生抑制剂的开发以及肿瘤导向性药物的开发和研究具有十分重要的参考价值。本发明通过简便、易筛选的噬菌体展示技术制成小分子多肽，既降低了人工合成的成本，又便于纯化、富集。

附图说明

图1是重组载体T3-pCANTAB5-E酶切鉴定的电泳图。

图2是用bEGF单克隆抗体对碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3进行ELISA检测结果图。

图3是碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3抑制内皮细胞ECV304增殖的结果图。

图4是碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3抑制肿瘤细胞B16增殖的结果图。

图5是碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3抑制肿瘤细胞B16F10迁移的结果图。

图6是碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3抑制肿瘤细胞B16F10迁移的显微镜观察图。

图7是碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3抑制内皮细胞HUVEC成管的显微镜观察图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)通过生物信息学方法，模拟得到碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3(bFGF抗原表位模拟肽T3)序列：

GCTATGAAAGAAGACGGTCGTCTGCTGGCTTCCAAATGCGTTACCGAC；

(2)为了将只有48个碱基的bFGF抗原表位模拟肽T3高效的构建到噬菌体载体pCANTAB5-E上，先根据pCANTAB5-E上的碱基序列和酶切位点，设计引物1和引物2进行第一轮PCR，两者PCR产物作为第二轮PCR的模板。然后根据模模拟短肽T3的碱基序列以及第一轮PCR得到的产物碱基序列，设计引物A和引物B，进行第二轮PCR。扩增得到碱基长度在100～200bp、包含有bFGF抗原表位模拟肽T3的产物进行下一步实验。

引物1：AAGCTTTGGAGCCTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGC

引物2：GGCCGGCTGGGCCGCATAGAAAGGAACAACTAAAGGAATTGCGAATAATAATTTTTTCA

引物A：TATGCGGCCCAGCCGGCCGCTATGAAAGAAGACGGTCGTCTGCTGGCTTCCAAATG

引物B：GCGGCCGCGTCGGTAACGCATTTGGAAGCCAGCAGA

第一轮PCR扩增条件和体系：94℃ 5min，55℃ 5min，72℃ 5min，7个循环。

体系	50μl
		引物1	20μl
引物2	20μl
		Buffer	5μl
dNTP	4μl
		Taq酶	0.25μl
三蒸水	0.75μl

第二轮PCR扩增条件和体系：94℃预变性5min，94℃变性40s，56℃退火35s，72℃延伸40s，30个循环。

体系	50μl
		第一轮PCR产物	2μl
引物A	1μl
		引物B	1μl
Buffer	5μl
		dNTP	4μl
Taq酶	0.25μl
		三蒸水	36.75μl

(3)将第二轮PCR产物切胶回收，连入T载体(Takara公司)，转入DH5α大肠杆菌(Takara公司)中挑取单菌落，提质粒进行酶切鉴定，并送样测序。测序由上海生物工程技术服务有限公司完成。

载体的构建、连接及转化：通过HindIII和Not I进行双酶切反应将多肽片段切下，连入具有同样酶切位点的pCANTAB5-E载体(Pharmacia公司)中，得到重组载体T3-pCANTAB5-E。酶切条件和体系如下：37℃水浴酶切16h。

连接条件和体系如下：16℃水浴连接24h。

T4DNA连接酶	1μl
		pCANTAB5-E酶切产物	2μl
bFGF表位肽片段	15μl
		Buffer	2μl
总体系	20μl

将构建好的载体T3-pCANTAB5-E转化入TG1大肠杆菌(Pharmacia公司)中，挑取单克隆，提质粒进行酶切鉴定。酶切鉴定结果如图1所示。

(4)噬菌体展示和鉴定：用辅助噬菌体VCSM13(Stratagene公司)去感染构建好位于对数生长期的TG1菌，静置30min后加入卡那霉素至70mg/L；在4℃条件下8000rpm离心获得菌液上清，加入灭菌的饱和硫酸铵冰浴沉淀3h，4℃下8500rpm离心获得噬菌体沉淀，去除上清至无上清液流出状态，DMEM溶解，4℃保存；取10μl稀释后测滴度。T3滴度为1.0×10¹²pfu/mL。

ELISA鉴定：4℃过夜包被bFGF单克隆抗体(该单抗制备方法参见向军俭等《人bFGF单克隆抗体的制备及MabF7对黑色素瘤B16的体外抗瘤效应》，中华肿瘤防治杂志，2008(1)：19-22)，接着PBS-T洗板3次，每次3min，每孔加入200μl 5％脱脂奶粉37℃封闭1h，PBS-T洗板3次，每次3min，倍比稀释bFGF噬菌体表位肽每孔100μl 37℃反应1h，PBS-T洗板3次，每次3min，加入HRP酶标噬菌体二抗37℃反应30min，PBS-T洗板5次，每次3min，加入底物液反应10min后2MH₂SO₄终止液终止反应，A450nm处进行吸光度检测。检测结果如图2所示。

(5)对内皮细胞和肿瘤细胞增殖抑制作用的检测

A、MTT法测噬菌体表位肽对内皮细胞的增殖抑制作用：取对数生长期的内皮细胞ECV304(购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)，弃尽孔内培养液，加入适量0.25％胰酶溶液消化，轻摇使消化液均匀作用于细胞，当成片细胞圆缩、呈单个细胞状态时去除消化液，迅速加入适量培养基，用吸管轻轻吹打使成单细胞悬液；取该单细胞悬液计数后以每孔4000个细胞的浓度分至96孔板中，用含10％小牛血清的DMEM的培养液于37℃、含5％CO₂的恒温培养箱中培养24h；换用含0.2％胎牛血清的DMEM培养液继续培养24h至单层细胞状态；加入不同稀释度的噬菌体表位肽、M13噬菌体，并设立空白对照，于37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养48h；每孔加入5g/L MTT溶液20μl，37℃，继续孵育3h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μlDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔收值，记录结果。实验重复3次。实验结果表明该bFGF抗原表位模拟肽T3具有明显的抑制ECV304细胞增殖的效用，如图3所示。

B、MTT法测噬菌体表位肽对肿瘤细胞的增殖抑制作用：取对数生长期的黑色素瘤细胞B16(购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)，弃尽孔内培养液，加入适量0.25％胰酶溶液消化，轻摇使消化液均匀作用于细胞，当成片细胞圆缩、呈单个细胞状态时去除消化液，迅速加入适量培养基，用吸管轻轻吹打使成单细胞悬液；取该单细胞悬液计数后以每孔5000个细胞的浓度分至96孔板中，用含10％小牛血清的DMEM的培养液于37℃、含5％CO₂的恒温培养箱中培养24h；换用含0.2％胎牛血清的DMEM培养液继续培养24h至单层细胞状态；加入不同稀释度的噬菌体表位肽、M13噬菌体，并设立空白对照，于37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养48h；每孔加入5g/L MTT溶液20μl，37℃，继续孵育3h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μlDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔收值，记录结果。实验重复3次。实验结果表明该bFGF抗原表位模拟肽T3具有明显的抑制B16细胞增殖的效用，如图4所示。

(6)对肿瘤细胞迁移抑制作用的检测：

A、取对数生长期的黑色素瘤细胞B16F10(南京凯基生物有限公司)，用0.25％胰酶消化成单细胞悬液，计数，用RPMI1640基本培养基稀释细胞数至5×10⁵/ml。

B、在放入Tranwell小室的24孔培养板中，于小室下层加入含10％小牛血清的1640完全培养基600μl。

C、在小室上层加入B16F10细胞悬液100μl，并相应加入bFGF抗原表位模拟肽T3，浓度在10¹⁰pfu/ml，同时设立VCSM13(浓度为10¹⁰pfu/ml)对照和空白对照。

D、将24孔板置于37℃含5％CO₂培养箱中，培养18h。

E、将小室取出，用RPMI1640基本培养基淋洗2次，室温下放入70％乙醇中固定15min。

F、将固定完毕的小室用0.015M pH7.4的PBS淋洗3次，风干，放回24孔板中，小室上层加入100μl吉姆萨染液，下层加入800μl吉姆萨染液，染色15min后取出，用0.015M pH7.4的PBS淋洗3-4次，用棉签轻轻将小室上层的细胞擦去、风干。

G、放入显微镜下计数(40×)，结果表明，bFGF抗原表位模拟肽T3能有效抑制肿瘤细胞迁移作用，如图5和图6所示。

(7)对内皮细胞成管抑制作用的检测

A、原代人脐静脉内皮细胞HUVEC的分离和培养：取新生儿脐带一段(华侨医院妇产科提供)，用PBS将静脉冲洗干净，用止血钳夹闭血管一端；用0.25％胰酶消化液灌注，室温消化15min；用含10％小牛血清的培养液冲洗并终止胰蛋白酶的消化作用，将冲洗液收集到50mL无菌离心管中，1500rpm离心10min；加入含有20％胎牛血清的完全SFM(购自Gibco公司)培养液，接种于培养瓶中，37℃、5％CO2恒温培养箱中培养24h，换液，去除红细胞和其他未贴壁细胞；待细胞贴壁生长至90％融合状态后消化传代。

B、取450μl的ECM gel置于4℃活化过夜。将ECM gel与450μl的DMEM混匀，每孔取60μl铺于96孔板中，室温静置5min，待其铺平后置于37℃CO₂培养箱中备用。取原代人脐静脉血管内皮细胞HUVEC，用0.025％的胰酶消化成单细胞悬液，吹匀，以1.5×10⁴/50μl的量加入铺好ECM gel的96孔板中。取bFGF抗原表位模拟肽T3以及VCSM13用1640基本培养基稀释至1/100，加入96孔板中，同时设立空白对照，将96孔板置于37℃CO₂培养箱中培养5hr后观察拍照(40×)。结果表明，bFGF抗原表位模拟肽T3能有效抑制HUVEC的成管作用，如图7所示。

以上实验结果表明，本发明所述的源自人的碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽，可在体外可以抑制内皮细胞增殖、成管以及肿瘤细胞的增殖和迁移作用。而目前在细胞因子模拟肽的相关多肽研究中，多数侧重于其在促进血管生成和胚胎发育、创伤愈合等方面的研究，在抗肿瘤方面鲜有报道。本发明所得到的T3多肽，在未来的疫苗开发和研究中，有望诱导机体产生专门针对bFGF的抗体。在临床肿瘤治疗中，该多肽本身的抗肿瘤效用的发挥以及其诱导产生的抗bFGF抗体可以在恶性肿瘤组织中发挥双重的抗肿瘤抗血管新生效果，将会对人体内恶性肿瘤的治疗发挥巨大作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>暨南大学

<120>碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3及其应用

<130>1

<160>6

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>16

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3的氨基酸序列

<400>1

Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp

1               5                   10                  15

<210>2

<211>48

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3的核苷酸序列

<400>2

gctatgaaag aagacggtcg tctgctggct tccaaatgcg ttaccgac   48

<210>3

<211>54

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物1

<400>3

aagctttgga gccttttttt tggagatttt caacgtgaaa aaattattat tcgc    54

<210>4

<211>59

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物2

<400>4

ggccggctgg gccgcataga aaggaacaac taaaggaatt gcgaataata attttttca    59

<210>5

<211>56

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物A

<400>5

tatgcggccc agccggccgc tatgaaagaa gacggtcgtc tgctggcttc caaatg    56

<210>6

<211>36

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物B

<400>6

gcggccgcgt cggtaacgca tttggaagcc agcaga    36

Claims (4)

1.一种碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3，其特征在于：所述碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3的氨基酸序列如下所示：

Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp。

2.根据权利要求1所述的碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3，其特征在于：所述碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3的核苷酸序列如下所示：

GCTATGAAAGAAGACGGTCGTCTGCTGGCTTCCAAATGCGTTACCGAC。

3.权利要求1或2所碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3的应用，其特征在于：所述碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽T3用于制备多肽疫苗、肿瘤血管生长抑制剂或者肿瘤导向药物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤为黑色素瘤。

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