CN108473582A - 用于治疗纤维化和/或纤维化病症的抗－αV整合素抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过抗体来预防和/或治疗纤维化和/或纤维化疾病。首先，本发明涉及施用抗‑αv整合素(受体)抗体至罹患纤维化和/或纤维化疾病(包括但不限于系统性硬化症(SSc))的患者。更具体地，本发明涉及通过所述抗体来治疗皮肤、肺、心脏、肝和/或肾的纤维化疾病。甚至更具体地，本发明涉及通过抗‑αv整合素抗体DI17E6及其结构突变体或修饰体来施用靶向αv整合素的重组型脱免疫单克隆抗体至罹患系统性硬化症(包括但不限于皮肤、肺、心脏和/或肾的系统性硬化症)的患者。

Description

用于治疗纤维化和/或纤维化病症的抗-αv整合素抗体
发明领域
本发明涉及通过抗体来治疗纤维化和/或纤维化疾病。本发明进一步涉及通过抗体来预防纤维化和/或纤维化疾病。首先，本发明涉及施用抗-αv整合素(受体)抗体至罹患纤维化和/或纤维化疾病(包括但不限于系统性硬化症(SSc))的患者。更具体地，本发明涉及通过所述抗体来治疗皮肤、肺、心脏、肝和/或肾的纤维化疾病，和/或其预防。甚至更具体地，本发明涉及施用靶向αv整合素的重组型脱免疫单克隆抗体至罹患系统性硬化症(包括但不限于皮肤、肺、心脏和/或肾的系统性硬化症)的患者。特别地，本发明涉及通过抗-αv整合素抗体DI17E6(阿吐珠单抗(Abituzumab))及其结构突变体或修饰体(modification)来治疗所述患者。所述疗法的一个重要目标为减缓、暂停和/或复原患者的所述纤维化和/或纤维化疾病，因此优选地通常改良罹患纤维化和/或纤维化疾病的患者的状态。该疗法的一个其他重要目标为减缓、暂停和/或复原患者的系统性硬化症，因此优选地通常改良罹患所述系统性硬化症的患者的状态及生活质量。
本发明的另一个优选方面涉及通过施用抗-αv整合素抗体DI17E6(阿吐珠单抗)和/或其结构突变体或修饰体预防可能发生纤维化和/或纤维化病症的受试者，优选人类受试者中的纤维化和/或纤维化病症。
发明背景
优选地将纤维化定义为在器官或组织中，优选在修复性或反应性过程中形成过量的纤维组织，优选纤维结缔组织。这可优选定性为反应性、良性或病理状态。响应于损伤，优选称此为结疤，且若纤维化由单细胞系产生，则优选称此为纤维瘤。生理上而言，纤维化通常作用以沉积结缔组织，其可闭塞下方器官或组织的构造及功能。优选使用纤维化来描述纤维组织过量沉积的病理状态以及在愈合过程中的结缔组织沉积的过程。在本发明的情况下，优选使用术语纤维化来描述纤维组织过量沉积的病理状态。纤维化在病理意义上而言类似于结疤的过程，这是由于两者均涉及刺激的铺设结缔组织的细胞，包括胶原蛋白及糖胺聚糖。称为巨噬细胞的免疫细胞以及在称为组织间隙的表面之间的任何受损伤组织通常释放TGF-β。对此有多种原因，包括邻近组织的发炎或广义发炎状态，伴随着增加的循环介体。TGF-β刺激成纤维细胞的增殖及活化，其随后通常触发结缔组织的沉积。
纤维化可发生在身体中的许多器官的许多组织中，通常由发炎或损伤所致，且实例包括：
肺的纤维化，例如肺纤维化、囊性纤维化和/或特发性肺纤维化；肝的纤维化，例如肝硬化；
心脏的纤维化，例如心房纤维化、心内膜心肌纤维化和/或先前心肌梗塞的间接性损伤。
此外，纤维化，及尤其病理学纤维化，优选包括关节纤维化(主要在膝盖及肩膀，还发生在多种其他关节)、克罗恩病(肠)、杜普伊特伦挛缩(主要在手部和/或指部)、瘢瘤(主要影响皮肤)、纵膈纤维化(主要与纵膈膜的软组织相关)、骨髓纤维化(主要影响骨髓)、佩罗尼氏病(阴茎)、肾源性系统性纤维化(主要影响皮肤)、进行性大块纤维化(例如，肺部，常常为煤矿工人的尘肺病的间接性并发症)、腹膜后纤维化(主要影响腹膜后腔的软组织)、和/或硬皮病或系统性硬化症(主要影响皮肤和/或肺)。
本领域已知且理解术语纤维化、病理学纤维化及纤维化疾病或纤维化病症。
优选地，在本发明的情况下，纤维化的所有病理学形式(即，非直接与急性损伤和/或正常伤口愈合相关的形式)也称为纤维化病症。因此，纤维化病症优选是超过通常在所需恰当的伤口愈合过程中所发现的纤维化水平的那些纤维化状态。
系统性硬化症(SSc，ICD-10分类M34)是待根据本发明所治疗的尤其优选的纤维化病症。系统性硬化症通常也称为系统性硬皮病且有时称为进行性系统性硬化症。系统性硬化症是具有特征性但可变范围(spectrum)的临床及实验室表征的临床异质性多器官结缔组织疾病，其特征为自身免疫性、血管损伤及进行性纤维化，从而导致疼痛、失能、进行性功能障碍及重要器官(诸如肺、心脏或肾)最终衰竭。优选地，SSc可分化自称为局限性硬皮病的疾病的组，其优选包括诸如硬斑病、带状硬皮病及剑伤性硬皮病(scleroderma en-coup-de-sabre)的病状，且优选也包括模拟硬皮病的一种或多种征兆的其他病症。
目前尚未知SSc的病原学。然而，该范围的临床表征是几乎任何器官中可能潜在的可变程度的血管异常、免疫介导的损伤及纤维化的结果。当影响重要器官诸如肺、肝、肾及心脏时，在SSc中的器官受累可导致其功能衰退及早熟死亡。皮肤几乎总是受累。基于皮肤受累的模式，将SSc分类成弥漫性皮肤(dc)SSc及局限性皮肤(lc)SSc。在lcSSc中，皮肤受累通常从四肢末端延伸至膝盖及肘；在dcSSc中，皮肤受累通常向近端延伸，涉及躯干上肢和/或大腿。关于优选子集及疾病分类的更多细节可参见“分类”及“诊断及症状”部分。SSc可具有与其他结缔组织疾病(CTD)诸如系统性红斑狼疮、多发性肌炎、类风湿性关节炎或修格兰氏综合征重叠的特征。
SSc通常与以下组织病理学及病理生理学特征中的一者或多者相关联：
i)血管异常：
在SSc血管异常中的特征病理发现结果为涉及多血管床中的小型动脉及小动脉的非炎症增殖性/闭塞性血管病变。尽管在长期存在的SSc中，这些病灶(lesion)通常在无发炎时发生，但是在早期疾病中，在许多器官中炎性细胞浸润是显著的。可于受累及不受累皮肤中检测到纤维化之前存在血管损伤的组织病理学证据，其指示普遍过程。诸如雷诺氏现象的表现通常先于其他疾病表现。SSc血管病变的其他临床征兆包括皮肤毛细血管扩张、指甲皱褶毛细血管改变、肺动脉性高血压(PAH)、指凹坑形成(digital pit formation)、胃窦血管扩张及硬皮病肾危象。
在患有确诊SSc的患者中，最具特征的血管发现结果为在小型及中型动脉中的温和内膜增生。在该疾病的晚期，大量纤维蛋白沉积及血管周围纤维化引起进行性管腔闭塞，且病变组织中严重缺乏小型血管。血管供应减少导致慢性组织缺氧。
初始血管损伤显然是内皮细胞损伤。其次，血小板可被活化并释放可造成血管收缩、成纤维细胞活化及成肌纤维细胞转分化的介体。内皮功能障碍可导致异常血管扩张/收缩，使得血液流动响应受损及伴随放大血管损伤的氧化压力的缺血-再灌注的发作。据报导，患有SSc的患者中内皮素-1(已知的最强效血管收缩剂)升高，其中dcSSc中的水平比lcSSc更高。小型血管的阻塞性血管病变导致组织缺氧及所描述的组织重塑。血管生成可在SSc中受损并造成进行性血管损失的结果。
ii)组织纤维化：
纤维化的特征在于以下的过量累积：类型I胶原蛋白及其他纤维状胶原蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖及在细胞外基质(ECM)中的其他结缔组织分子。该过程导致组织构造破坏。在SSc中，皮肤及内脏中的间质及血管纤维化直接造成其的进行性功能障碍及最终衰竭。最显著受影响的是肺、胃肠道、心脏、腱鞘及围绕骨骼肌的束周组织。
皮肤中的纤维化(SSc的标志)导致真皮显著扩大。该过程闭塞毛囊、汗腺及其他皮肤附器。胶原蛋白纤维累积是在真皮深层中最显著，且逐步截留脂肪细胞来侵入近表面脂肪层。为成纤维细胞与收缩平滑肌细胞之间的中间体且在纤维生成中起主要作用的α-平滑肌正肌动蛋白阳性成肌纤维细胞的比例在病变皮肤中增加。
在早期肺病灶中，发现肺泡壁经淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞及嗜酸性粒细胞片状浸润。随着进展，肺间质纤维化及血管损伤占主导地位，常常共存于相同病灶中。肺动脉的内膜增厚是PAH的基础，且在剖检中常常与多发性肺栓塞及心肌纤维化相关联。肺活组织检查样本中发现的典型组织学类型为非特异性间质肺炎，特征为轻度至中度间质发炎的间质性肺病形式、类型II肺细胞增生及纤维化均匀分布。不太常见地，SSc与特征为分散的成纤维细胞病灶及纤维化片状分布的常见间质肺炎型样相关联。肺泡隔的进行性增厚最终导致闭塞空腔及蜂窝化，及肺血管的后果性损失。此过程损害气体交换并造成肺动脉张力升高。据报导，dcSSc患者中的间质性肺病的盛行率为约53％及lcSSc患者中为约35％。
在胃肠道中，病理变化可发生在从口至直肠的任何层级。事实上总是影响食道，具有在固有层、黏膜下层及肌层的纤维化、及特征性血管病灶。正常肠构造的替换导致蠕动活力失调、胃食道逆流及小肠动力障碍、假性梗阻及细菌过度生长。慢性胃食道逆流与食道发炎、溃疡及狭窄形成并发。
在肾中，血管病灶占主导，且肾小球肾炎是罕见的。慢性肾缺血是与肾小球萎缩及其他缺血性变化相关联。患有急性硬皮病肾危象的患者显示与其他形式的恶性高血压可无差别的巨大组织变化。SSc肾中的血管变化是在小型小叶间及弓状动脉中最显著，其显示弹性膜加倍、显著内膜增生及基质(ground substance)累积。也可于无肾危象的SSc患者中发现这些变化。可发现小动脉壁的纤维蛋白样坏死。内膜增厚导致内腔的严重狭窄及完全闭塞，常常伴随微血管病性溶血。
在剖检中，在70％患有SSc的患者中发现心脏受累的证据。中度心包积液是常见的；偶尔可发生伴随狭窄性心包炎的纤维化。特征性病理发现结果为心肌收缩带坏死，据认为其反映缺血-再灌注损伤。可在无明显临床心脏受累时发生显著间质及血管周围纤维化。
具有纤维化变化的其他器官包括甲状腺、与勃起功能障碍相关的阴茎血管、唾液腺及泪腺。滑液活组织检查样本显示在小型小动脉中的纤维化及特征性血管变化。
过量沉积胶原蛋白及其他ECM成分的细胞来源为成纤维细胞或类成纤维细胞。通常常驻于结缔组织中的成纤维细胞或常驻于血管周围的周细胞可由诸如TGF-β的生长因子进行活化，使得增殖及胶原蛋白合成增加。组织损伤、机械张力及TGF-β诱导活化类成纤维细胞及表现型变化，使得这些细胞转化为成肌纤维细胞，该过程被指定为成纤维细胞-成肌纤维细胞转化(FMT)。成肌纤维细胞的特征在于活动力提高、表达平滑肌肌动蛋白、胶原蛋白合成增加、金属蛋白酶的组织抑制剂及其他ECM组分。成肌纤维细胞是在纤维化响应期间的TGF-β活化的主要来源且造成早期肉芽组织的收缩。在病理纤维生成中，成肌纤维细胞持续存在，从而造成慢性疤痕的过度收缩的ECM特征。
免疫功能障碍：
免疫系统的先天性及适应性武器似乎在早期SSc中被活化，且自身免疫是显著的；然而，细胞及体液自身免疫效应子路径在致病原理中的作用尚未确定。
在该疾病早期，在病变皮肤、肺及其他受影响器官的血管周围区域观察到活化CD4及CD8淋巴细胞及单核球及巨噬细胞、及不太常见的B细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞及自然杀手细胞。皮肤中的单核球浸润物主要为CD3CD4阳性T细胞且其表达活化标记。
可在几乎所有患有SSc的患者中检测到具有多抗原特异性的循环自身抗体。
虽然SSc相关联的自身抗体具有经验证的作为诊断标记的临床效用，但是其对疾病表现的贡献尚未确定且未知这些自身抗体是先于血管损伤、组织伤害和/或纤维化，或是血管损伤、组织伤害和/或纤维化的结果。靶特异性及临床相关汇总于表1。
表1.自身抗体频率及其主要临床相关
缩写：PBC，原发性胆汁性肝硬化；PM/DM，多发性肌炎/皮肌炎；SDV，严重指血管病变；SRC，硬皮病肾危象。
SSc通常与以下临床特征中的一者或多者相关联：SSc的临床表现是多变的，反映出其复杂的基础病理。多种临床特征的频率根据该疾病的阶段及子集而有所不同。器官受累的过程及严重程度在个别患者中是不可预测的。此外，在制定治疗决策时需要考虑各并发症的严重程度及活性。疲劳及嗜睡常见于整个疾病中，虽然通常在其早期阶段更明显。反应性抑郁是此通常不间断且毁形性病症的常见伴随症状。
在表2中给出报告于教科书中的主要器官表现的盛行率。近来，欧洲硬皮病试验及研究(EUSTAR)群组基于7,655位患者的特征公开更高频率，所有满足不同受累器官系统的临床特征的1980ACR准则的是以表格概述(表2及3)呈现。通常，女性比男性更常受影响，据报导为3至5:1的优势。
表2.SSc的临床特征
表3.SSc的临床特征续
分类：SSc的标志为皮肤硬结及增厚(“硬皮病”)，而且SSc也可涉及许多内脏。两个主要临床子集经由皮肤受累型样及其他相关临床及实验室特征(表4)来区分。虽然已经基于临床特征组合来个体化CREST综合征(缩写词源自皮肤钙沉着症、雷诺氏现象、食道动力障碍、指端硬化、毛细血管扩张)，但是其可归类为lcSSc。SSc可具有其他结缔组织疾病的特征或满足其的准则。无皮肤受累的SSc(“硬皮病无皮肤硬化硬皮病(scleroderma sinescleroderma)”)是罕见的且由于无皮肤征兆通常在疾病历程的晚期才诊断出来。在儿童期及青少年期的SSc是极其罕见的。进一步分类可参见以“诊断及症状”为题的部分。
表4.SSc子集的关键临床特征
诊断及症状：
通常基于临床表现，特别地皮肤受累的型样来进行SSc的诊断。美国风湿病学会(American College of Rheumatology，ACR)已经提出诊断准则来分类患者。需要一个主要准则(即，近端硬皮病)或两个或更多个次要准则(即，[1]指端硬化，[2]指尖的指凹坑疤痕或远程指垫的物质减少，[3]双侧基部肺纤维化)来将患者分类为SSc。
当应用于病例及疾病比较群组时，该准则具有97％的确定性SSc的灵敏度及98％的特异性。这些准则显得不包括所有患有SSc的患者。在EUSTAR(EULAR硬皮病试验及研究组)群组中，仅83.5％的患者满足1980ACR准则，患有早期疾病及重叠综合征的患者占排除组的最大比例。
为了克服此问题，ACR及欧洲抗风湿病联盟(European League AgainstRheumatism，EULAR)已经同意将应于2013年期间公开的经修订的SSc准则。经修订的准则提供于图1中。
优选不需要组织活体检查来诊断SSc。
表5：用于分类系统性硬化症的ACR-EULAR准则
1.这些准则适用于任何经考虑包含于SSc研究中的患者。
2.这些准则不适用于具有能更好地解释其表现的类系统性硬化症病症的患者，诸如：肾硬化性纤维化、糖尿病性硬肿症、硬化性黏液水肿、肢端红痛病(erythromyalgia)、卟啉症、硬化性苔癣、移植物抗宿主疾病及糖尿病性手关节病变(diabeticchierarthropathy)。也不将患有“保留手指的皮肤增厚(Skin thickening sparing thefingers)”的患者归类为患有SSc。
下文以表格形式(表6)给出SSc的典型症状。
表6.SSc的症状(临床征兆及其他临床特征参见表2及3)
据报导，所有SSc患者从确诊起的平均存活时间为约13年，而患有SSc-ILD的患者的5年存活率据报导为40至60％，这显示患有SSc-ILD的患者与总体SSc患者相比更高的死亡率。
通常由于SSc-器官受累(～53％)、癌症(～15％)或动脉粥样硬化导致SSc中的死亡。由SSc-器官受累所致的死亡是在患有弥漫性皮肤受累的患者、发作时年龄较老的患者及男性患者中更常见。
最近，欧洲抗风湿病联盟(EULAR)硬皮病试验及研究组(EUSTAR)数据库报告SSc中死亡的原因及风险因素。该数据库包括5,860位满足ACR 1980分类准则的SSc患者。死亡原因及共病数据为284人中234人致死。它们报告55％的死亡直接与SSc相关且41％与非SSc原因相关，其中剩下4％的病例经考虑为不可分类。在已故的284位患者中，54.6％患有弥散性皮肤疾病(dcSSc)且40.5％患有局限性皮肤疾病(lcSSc)。dcSSc的中值疾病持续时间为7.1年及lcSSc为15年。19％死于肺纤维化及14％死于肺动脉性高血压。SSc相关心肌疾病死亡为14％，其中大多数原因与心律不整相关。死亡的肾原因仅占4％，其全部与硬皮病肾危象相关。百分之三的患者因肠胃相关原因死亡。就非SSc相关死亡而言，原因如下：感染(所有死亡的13％)、肿瘤形成(13％)及心血管疾病(12％)。随后对非SSc相关死亡的患者进行SSc相关共病的分析。大量死于肺炎的患者也存在伴有或无吸入记录的胃食道逆流。十四位死于肺癌的患者中，九位患有伴发性肺纤维化。在此研究中，降低存活率的独立预测因子包括存在蛋白尿、肺动脉性高血压、具有低于80％预测值的用力肺活量的肺限制、存在大于纽约心脏协会(New York Heart Association)II类的呼吸困难、雷诺氏现象发作时年龄更大、更低的一氧化碳扩散能力及大于10的改良罗德曼(Rodman)皮肤得分。因为35％的所有SSc相关死亡可直接归因于ILD，及26％归因于PAH，所以此报告加强先前发现：ILD及PAH为SSc相关死亡的首要原因且可能造成非SSc相关死亡。在最近对包括12,829位患者的18个研究的系统评审及元分析中，具有心脏、ILD、肺部高血压及肾表现的死亡风险上升。
存在ILD与SSc中的死亡率显著相关联。FVC降低与死亡率相关联(VIRGINIAD.STEEN及THOMAS A.MEDSGER,JR.,ARTHRITIS&RHEUMATISM，第43卷，第11期，2000年11月，第2437至2444页，Assassi等人，Arthritis Rheum.2009年10月15日；61(10):1403–1411)。在SSc-ILD中，＜70％的FVC预测比＞70％者死亡率更高(Goh等人，ARTHRITIS&RHEUMATISM，第56卷，第6期，2007年6月，第2005至2012页)。据信FVC在前12、18及24个月内的衰退预示死亡。
在953位患有SSc的患者的回溯性研究中，患有严重ILD的患者具有约30％的9年存活率，而器官系统无严重受累的患有SSc的患者具有72％的9年存活率。
失能同样是纤维化疾病且尤其SSc的威胁性问题。例如，呼吸困难常见于SSc中(高达50％)。主要促成因素包括ILD及PAH，但支气管扩张、齿槽出血、由食道动力障碍所致的伴有吸入的胃食道逆流、关节炎、肥胖、贫血及由缺乏运动所致的失调也可促成。
呼吸困难是非常重要的且是功能及健康相关生活质量(HRQoL)的独立预测因子。FVC及肺动脉收缩压为呼吸困难的显著独立预测因子。
改良健康评定问卷(Health Assessment Questionnaire，HAQ)的失能指数(DI)与硬皮病心脏、肾病、肌腱摩擦、手挛缩及近端肌肉强度相关。HAQ-DI升高预示死亡且与拳闭合减少、手展开减少及存在压痛关节相关。SSc中的失能随时间而恶化，其中呼吸困难及疾病类型为失能的最强预测因子。患有指溃疡的患者具有显著更高的全局失能、手失能及焦虑。大多数患有SSc的患者具有日常活动限制且在家需要帮助增加。由改良罗德曼皮肤得分(mRSS)评估的皮肤受累与失能及疼痛强烈相关。比较患有SSc、牛皮癣性关节炎及类风湿性关节炎的患者，关节受累在SSc中比牛皮癣性关节炎更失能且SSc患者比患有类风湿性关节炎的患者经历更多疼痛。SSc与抑郁及焦虑的高盛行率相关联。抑郁与ILD相关联。健康相关生活质量在SSc患者中降低且与类风湿性关节炎患者相似。雷诺氏现象具有对失能(整体、抓握、吃穿)、疼痛及心情的影响。疼痛及抑郁症状为身体机能及社会适应的重要决定因素。
在患有SSc的患者中工作失能及生产力丧失是显著的，如最近的工作状态的元分析中所推断。所报导的标准就业率为介于0.70与0.77之间而被雇用的患者比例范围为在11.3％与82％之间。全职及兼职病假率也增加以及估计支付劳动力的生产力损失。据报导，SSc中的工作失能大于风湿性关节炎。
因此，在纤维化、纤维化疾病及尤其在SSc及相关适应症领域中对治疗选项有非常高的未满足的医疗需求。
此外，存在对预防选项的非常高的未满足的医疗需求，以防止在受试者(优选可能发展其的人体受试者)中的纤维化、纤维化疾病及在SSc及相关适应症中尤其如此。
发明概述
本发明人已发现，已知的单克隆抗-αv抗体DI17E6(也称为DI-17E、DI17e6、阿吐珠单抗(Abituzumab/abituzumab)、EMR62242或EMD 525797)在干扰与纤维化及尤其纤维化病症的发展、发生和/或表现相关的细胞信号传导过程中高度有效。此外，本发明人已发现，所述抗-αv抗体DI17E6在干扰与系统性硬化症的发展、发生和/或表现相关的细胞信号传导过程中高度有效。证据因此示于本文所给出的实验部分且如上文及下文所讨论。因此，本发明的目标为一种单克隆抗-αv抗体DI17E6和/或其生物活性变体或修饰体，其用于治疗纤维化和/或纤维化病症。本发明的优选目标为一种单克隆抗-αv抗体DI17E6和/或其生物活性变体或修饰体，其用于治疗系统性硬化症。因此本发明的另一目标为一种单克隆抗-αv抗体DI17E6和/或其生物活性变体或修饰体的用途，其用于制造用于治疗纤维化和/或纤维化病症及尤其用于治疗系统性硬化症的药剂；和/或一种用于治疗纤维化和/或纤维化病症及尤其用于治疗系统性硬化症的方法，其包括向患者施用该单克隆抗-αv抗体DI17E6和/或其生物活性变体或修饰体。由于其有利的安全性，单克隆抗αv抗体DI17E6和/或其生物活性变体或修饰体也被认为也适用于预防所述病症。
附图简述：
图1：阿吐珠单抗阻断在H358-成纤维细胞及Calu3-成纤维细胞共同培养物中的aSMA表达的升高
图2阿吐珠单抗阻断在H358-成纤维细胞共同培养物中的FMT相关基因表达的升高
图3TGF-β增加人类肺成纤维细胞中的整合素的表达
图4TGF-β增加肺成纤维细胞中的aSMA、IL-6及其他成肌纤维细胞标记基因的表达
图5阿吐珠单抗处理成纤维细胞培养物减少TGF-β所诱导的aSMA及IL-6的增加
图6阿吐珠单抗处理减少TGFb所诱导的胶原蛋白凝胶收缩
图7与抗-HEL-AB MSB0011523H-1及10D5各自相比较，阿吐珠单抗对αvβ6 6结合至LAP的抑制作用
图8寻找纤维化/SSc特征的策略
图9在GSE45485中SSc及正常皮肤的RGS5表达，以及比较RGS5在SSc与正常皮肤中的表达的中等t-检验的各自结果
图10在GSE24206中，早期IPF、晚期IPF及正常肺的COL15A1表达，以及分别比较COL15A1在早期IPF与健康肺及晚期IPF与健康肺中的表达的中等t-检验的各自结果
图11在GSE24206中，早期IPF、晚期IPF及正常肺的COL1A1表达，以及分别比较COL1A1在早期IPF与健康肺及晚期IPF与健康肺中的表达的中等t-检验的各自结果
图12在GSE48149中IPAH(PPH)、IPF、SSc-PAH、SSc-PF及正常肺(NL)的COMP表达，以及分别比较COMP在早期IPF与正常肺及SSc-PF与正常肺中的表达的中等t-检验的各自结果
图13在GSE48149中IPAH(PPH)、IPF、SSc-PAH、SSc-PF及正常肺(NL)的IGFBP2表达，以及分别比较IGFBP2在早期IPF与正常肺及SSc-PF与正常肺中的表达的中等t-检验的各自结果
图14a在GSE48149中IPAH(PPH)、IPF、SSc-PAH、SSc-PF及正常肺(NL)的SSP1表达，以及分别比较SSP1在早期IPF与正常肺及SSc-PF与正常肺中的表达的中等t-检验的各自结果
图14b在GSE45485中SSc及正常皮肤的19-基因纤维化/SSc特征的特征得分，以及比较SSc与正常皮肤中的19-基因特征得分的单侧t-检验的结果
图15a在GSE32413中SSc及正常皮肤的19-基因纤维化/SSc特征的特征得分，以及比较SSc与正常皮肤中的19-基因特征得分的单侧t-检验的结果
图15b在GSE32413中SSc及正常皮肤的9-基因TUAD特征的特征得分，以及比较SSc与正常皮肤中的9-基因特征得分的单侧t-检验的结果
图16a在GSE9285中SSc及正常皮肤的19-基因纤维化/SSc特征的特征得分，以及比较SSc与正常皮肤中的19-基因特征得分的单侧t-检验的结果
图16b在GSE9285中SSc及正常皮肤的9-基因TUAD特征的特征得分，以及比较SSc与正常皮肤中的9-基因特征得分的单侧t-检验的结果
图17a在GSE24206中，早期IPF、晚期IPF及健康肺的19-基因纤维化/SSc特征的特征得分，以及分别比较早期IPF与正常肺及晚期IPF与正常肺中的19-基因特征得分的单侧t-检验的结果
图17b在GSE24206中，早期IPF、晚期IPF及健康肺的9-基因TUAD特征的特征得分，以及分别比较早期IPF与正常肺及晚期IPF与正常肺中的9-基因特征得分的单侧t-检验的结果
图18a在GSE48149中IPAH(PPH)、IPF、SSc-PAH、SSc-PF及正常肺(NL)的19-基因纤维化/SSc特征的特征得分，以及分别比较IPF与正常肺及SSc-PF与正常肺中的19-基因特征得分的单侧t-检验的结果
图18b在GSE48149中IPAH(PPH)、IPF、SSc-PAH、SSc-PF及正常肺的9-基因TUAD特征的特征得分，以及分别比较IPF与正常肺及SSc-PF与正常肺中的9-基因特征得分的单侧t-检验的结果
图19a在GSE48452中Nash、脂肪变性、健康肥胖及正常肝的19-基因SSc/纤维化特征的特征得分，以及分别比较Nash、脂肪变性及健康肥胖相对于对照肝组织的19-基因特征得分的单侧t-检验的结果
图19b在GSE48452中Nash、脂肪变性、健康肥胖及正常肝的9-基因TUAD特征的特征得分，以及分别比较Nash、脂肪变性及健康肥胖相对于对照肝组织的9-基因特征得分的单侧t-检验的结果
图20a在GSE49541中的19-基因SSc/纤维化特征轻度及晚期肝纤维化的特征得分，以及单侧t-检验的结果
图20b在GSE49541中的9-基因TUAD特征轻度及晚期肝纤维化的特征得分，以及单侧t-检验的结果
图21a在GSE61260中Nash(非酒精性脂肪性肝炎)、PBC(原发性胆汁性胆管炎)、NAFLD(非酒精性脂肪肝病)、健康肥胖及正常肝的19-基因纤维化/SSc特征的特征得分，以及分别比较Nash、PSC、PBC及NAFLD相对于对照肝组织的19-基因特征得分的单侧t-检验的结果
图21b在GSE61260中Nash(非酒精性脂肪性肝炎)、PSC(原发性硬化性胆管炎)、PBC(原发性胆汁性胆管炎)、NAFLD(非酒精性脂肪肝病)、健康肥胖及正常肝的9-基因TUAD特征的特征得分，以及分别比较Nash、PSC、PBC及NAFLD相对于对照肝组织的9-基因特征得分的单侧t-检验的结果
图22a在GSE44426中原发性骨髓纤维化及正常骨髓的19-基因SSc/纤维化特征的特征得分，以及单侧t-检验的结果
图22b在GSE44426中原发性骨髓纤维化及正常骨髓的9-基因TUAD特征的特征得分，以及单侧t-检验的结果。
本发明的详细说明
已发现已知的单克隆抗-αv抗体DI17E6(本文也称为阿吐珠单抗(Abituzumab/abituzumab)、EMR62242或EMD 525797)在干扰与纤维化及尤其纤维化病症的发展、发生和/或表现相关的细胞信号传导过程中高度有效。
不受上文和/或下文所详细讨论且尤其下文所讨论的机理的束缚，强烈据信且在含于本文中的实施例及数据中经充分证明，由于抗体DI17E6及优选如本文所讨论的其生物活性变体或修饰体的靶向位点、结合亲和性/结合性质及选择性概况(profile)的独有组合，抗体DI17E6及优选也如本文所讨论的其生物活性变体或修饰体与在纤维化的发展中至关重要的信号传导路径及尤其对治疗纤维化和/或纤维化病症，尤其本文所述的纤维化病症至关重要的路径相互作用。根据我们对构成本发明的结果及数据的理解，下文更详细地讨论相关路径。
一般而言，纤维化疾病的特征为由于细胞外基质的产生、沉积及收缩所致的过度结疤，据信其由成肌纤维细胞的增殖及活化驱动。纤维化疾病代表最大的疾病组之一，其至今无有效疗法。纤维化过程通过在前纤维化及抗纤维化介体的网络中的一系列复杂的相互作用进行调节。据信TGF-β(即，转化生长因子β，也常常称为TGFb、TGF b、TGFB、TGF B、TGF-b、TGF-B、TGFbeta、TGF beta或TGF-beta)信号传导在成纤维细胞至成肌纤维细胞转变(FMT)中起重要作用，其造成细胞外基质沉积增加，且因此据信其为疾病的主要驱动因素。
作为与含有潜在型相关肽(LAP)区的潜伏TGF-β结合蛋白质复合的潜伏前体合成TGF-β异形体。于这些过程期间存在αv整合素与TGF-β之间串扰的实质证据。TGF-β1的LAP含有与整合素αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6及αvβ8相互作用导致TGF-β1活化的RGD基序(motif)。阿吐珠单抗为泛-αv整合素抗体，发现其异位至结合配体的αv次单元且因此阻止配体结合至所有αvβ异二聚体且因此抑制潜伏TGF-β的αv整合素依赖性活化且因此阻断成纤维细胞及其他前体获取成肌纤维细胞表达型。
所得数据证实，单克隆抗-αv抗体DI17E6和/或其生物活性变体或修饰体能够阻断αv整合素的多种功能，包括结合至在αv-整合素配体中的含有RGD的序列，诸如玻连蛋白、纤维连接蛋白(fibronection)及TGF-β1的潜在型结合蛋白(LAP-β1)。
因此，发现αv整合素的显著功能之一为控制TGF-β的活化。因此，基于本文所讨论的数据，据信细胞因子TGF-β为生理纤维生成及病理纤维化(包括如本文所述的SSc)的主要调节因子，及抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体能够以看起来有利于治疗纤维化、纤维化疾病和/或系统性硬化症的方式来控制TGF-β的活化。
除此作用以外，TGF-β还具有在组织修复、血管生成、免疫调节及细胞增殖与分化中的许多其他功能。TGF-β可由血小板、单核细胞/巨噬细胞、T细胞及成纤维细胞分泌。其的信号传导及细胞调节是高度复杂的。
大多数产生TGF-β的细胞将其产生作为呈潜伏复合物存在于ECM储器中的生物学无活性前体分子且不能与其受体相互作用。潜伏TGF-β至其能够结合其细胞表面受体的活性型的转化是通过诸如凝血酶敏感蛋白-1、某些αvβx整合素异二聚体(图1)及多种蛋白酶的分子来介导，且经严格地调控。经活化的TGF-β结合至II型TGF-β受体，触发导致诱导靶基因的细胞内信号转导级联。迄今为止，存在αvβ3、αvβ3、αvβ6及αvβ8可控制TGF-β活化的证据。上文和/或下文更详细地对此进行描述及讨论。
细胞因子TGF-β被视为生理纤维生成及病理纤维化(包括SSc)的主要调节因子(也参见与“组织病理学及病理生理学特征”相关的部分)。本文描述TGF-β的多种细胞效应，且在表7(以下)中给出TGF-β的最相关作用中的一些，包括其与整合素的连接和/或缔合。
表7.TGF-β的纤维生成活性
因此，本发明的优选目标涉及一种抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其用于治疗罹患纤维化疾病及尤其系统性硬化症(SSc)的患者。优选地，术语“纤维化疾病”和/或“系统性硬化症”具有如本领域中已知的意义及特征。更优选地，术语“纤维化疾病”和/或“系统性硬化症”具有如上文和/或下文所述的意义及特征。
因此，本发明的优选目标涉及一种抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其用于系统性硬化症，其中该系统性硬化症包括肺、肝、肾、心血管系统和/或皮肤的系统性硬化症。更优选地，待根据本发明治疗的疾病选自肺、肝及肾的系统性硬化症。尤其优选地，待根据本发明治疗的疾病为肺的系统性硬化症或包括肺的系统性硬化症。
同样优选的是抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其用于系统性硬化症，优选用于如上文和/或下文所更详细描述的系统性硬化症，优选其中该系统性硬化症影响一个或多个选自由肺、肝、肾、心脏及皮肤组成的组的器官，更优选地影响肺、肝、肾和/或心脏，且尤其影响肺或心脏。
也同样优选的是抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其用于治疗系统性硬化症，优选用于治疗如上文和/或下文所更详细描述的系统性硬化症，其中该系统性硬化症影响心血管系统、血管和/或血液。因此，待根据本发明治疗的疾病优选选自舒张功能障碍及骨髓纤维化。
因此，甚至更优选的是抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其用于使用，优选用于如上文和/或下文所更详细描述的使用，其中该系统性硬化症包括一种或多种选自由以下组成的组的适应症：特发性肺纤维化、原发性硬化性胆管炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、原发性局灶性肾小球硬化、原发性节段性肾小球硬化、糖尿病性肾病、舒张功能障碍及骨髓纤维化。
因此，甚至更优选的是抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其用于使用，优选用于如上文和/或下文所更详细描述的使用，其中该系统性硬化症包括适应症或疾病，其中存在局灶性肾小球硬化或原发性局灶性肾小球硬化与节段性肾小球硬化或原发性节段性肾小球硬化两者的临床现象或表现中一者或多者。因此，甚至更优选的是抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其用于，优选如上文和/或下文所更详细描述般用于治疗局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)。
因此，尤其优选的是系抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其用于使用，优选用于如上文和/或下文所更详细描述的使用，其中所述治疗包括罹患肺纤维化和/或肺泡炎(间质性肺病，ILD)的患者。
或者，优选的是抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其如权利要求1所使用，其中该待治疗的疾病为皮肤的系统性硬化症。
优选地，皮肤的系统性硬化症选自由弥漫性皮肤系统性硬化症(dcSSc)及局限性皮肤系统性硬化症(lcSSc)组成的组。
本发明的尤其优选的目标包括：
抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，优选抗-αv整合素抗体DI17E6，其用于治疗肺纤维化、肺泡炎(间质性肺病，ILD)和/或硬皮病性间质性肺病(SSc-ILD)。
抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，优选抗-αv整合素抗体DI17E6，其用于如上文和/或下文所述的治疗中，其中所述治疗包括施用一定剂量，优选有效剂量的所述抗体或其生物活性变体或修饰体，施用量为每周或每两周10mg至1000mg。
抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，优选抗-αv整合素抗体DI17E6，其用于如上文和/或下文所述的治疗中，其中所述治疗包括施用一定剂量，优选有效剂量的所述抗体或其生物活性变体或修饰体，施用量为在4周内或1一个月内约500mg、约1000mg或约1500mg。优选地，所述剂量的施用分别每4周或每月重复数次。
抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，优选抗-αv整合素抗体DI17E6，其用于如上文和/或下文所述的治疗中，其中所述治疗包括施用一定剂量，优选有效剂量的所述抗体或其生物活性变体或修饰体，施用量为每4周约500mg。
抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，优选抗-αv整合素抗体DI17E6，其用于如上文和/或下文所述的治疗中，其中所述治疗包括施用一定剂量，优选有效剂量的所述抗体或其生物活性变体或修饰体，施用量为每4周约1000mg。
抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，优选抗-αv整合素抗体DI17E6，其用于如上文和/或下文所述的治疗中，其中所述治疗包括施用一定剂量，优选有效剂量的所述抗体或其生物活性变体或修饰体，施用量为每4周约1500mg。
优选地，每4周或每个月的所述剂量的所述施用分别重复至少4次，更优选至少8次，甚至更优选至少16次，和特别是至少24次。
典型地，每4周或每个月的所述剂量的所述施用重复约一年，约一年半，约2年，或约二年半或约三年。
因此，每4周或每个月的所述剂量的所述施用分别优选重复不超过约36次，更优选不超过约28次，甚至更优选不超过约24次，和特别是不超过约16次或约12次。
因此，所述重复施用期间的优选范围为4至36个月，8至36个月，12至36个月，8至28个月，12至28个月或16至28个月。
然而，原则上说，所述重复施用没有上限。然而，在大约半年之后，大约一年之后，大约一年半之后，大约2年之后或大约两年半之后，停止重复施用可能是合理的，例如为了了解患者的状态是如何发展的并决定是否开始新的重复施用。上述描述的重复施用对于阿吐珠单抗是特别优选的。
抗αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，优选抗αv整合素抗体DI17E6，用于如上文和/或下文所述的治疗，并且优选如直接上文的段落中所述使用，其中剂量，优选有效剂量以单次剂量施用。
抗αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，优选抗αv整合素抗体DI17E6，用于如上文和/或下文所述的治疗，并且优选如直接上文的两个段落中的一个，其中所述抗体或所述其生物活性变体或修饰体是作为单一疗法进行施用。
抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，优选抗-αv整合素抗体DI17E6，其如上文和/或下文所述般使用，其中所述生物活性变体或修饰体包括DI17E6的CDR区及重链及轻链可变区，该可变区与DI17E6的可变区相比较在氨基酸序列上有至少80％相同，优选与DI17E6的可变区相比较在氨基酸序列上有至少90％相同，更优选与DI17E6的可变区相比较在氨基酸序列上有至少95％相同，甚至更优选与DI17E6的可变区相比较在氨基酸序列上有至少98％相同，且尤其与DI17E6的可变区相比较在氨基酸序列上有至少99％相同。
DI17E6抗体，其如上文和/或下文所述，且尤其如正上段落所述般使用，其包括在重链框架区内的一种或多种修饰体：
FR1:QVQLQQSGAELAEPGASVKMSCKASGYTFS(SEQ ID No.16)
FR2:WVKQRPGQGLEWIG(SEQ ID No.17)
FR3:KATMTADTSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYYCAS(SEQ ID No.18)
FR4:WGQGTSVTVSS(SEQ ID No.19),
其中加粗及下划线位置的一者或多者是经突变且与原始各自序列相比较是不同的。
DI17E6抗体和/或其生物活性变体或修饰体，其如上文和/或下文所述般使用，其中该生物活性变体或修饰体包括恒定区，其与DI17E6的恒定区相比较在氨基酸序列上有至少80％相同，优选地其与DI17E6的恒定区相比较在氨基酸序列上有至少90％相同，更优选地其与DI17E6的恒定区相比较在氨基酸序列上有至少95％相同，甚至更优选地其与DI17E6的恒定区相比较在氨基酸序列上有至少98％相同，且尤其其与DI17E6的恒定区相比较在氨基酸序列上有至少99％相同。
DI17E6抗体和/或其生物活性变体或修饰体，其如上文和/或下文所述般使用，其包括人类IgG1恒定区代替人类IgG2，或人类IgG2铰链区代替人类IgG1铰链。
本发明的其他尤其优选的目标包括：
一种治疗纤维化疾病，优选系统性硬化症且尤其如上文和/或下文所述的系统性硬化症的方法，其包括将DI17E6抗体和/或其生物活性变体或修饰体施用至患者，其中该生物活性变体或修饰体包括CDR区及重链及轻链可变区，其与DI17E6的可变区相比较在氨基酸序列上有80％至95％相同。
一种治疗纤维化疾病，优选系统性硬化症且尤其如上文和/或下文所述的系统性硬化症的方法，其包括将DI17E6抗体和/或其生物活性变体或修饰体施用至患者，其中该生物活性变体或修饰体包括恒定区，其与DI17E6的恒定区相比较在氨基酸序列上有至少80％至98％相同。
一种治疗纤维化疾病，优选系统性硬化症且尤其如上文和/或下文所述的系统性硬化症的方法，其包括将DI17E6抗体和/或其生物活性变体或修饰体施用至患者，其包括在重链结构区内的一种或多种修饰体
FR1:QVQLQQSGAELAEPGASVKMSCKASGYTFS(SEQ ID No.16)
FR2:WVKQRPGQGLEWIG(SEQ ID No.17)
FR3:KATMTADTSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYYCAS(SEQ ID No.18)
FR4:WGQGTSVTVSS(SEQ ID No.19),
其中加粗及下划线位置的一者或多者是经突变且与原始各自序列相比较是不同的。
如上文和/或下文所述，优选如正上方所述的各自方法，其包括施用包括人类IgG1恒定区代替人类IgG2，或人类IgG2铰链区代替人类IgG1铰链区的经修饰DI17E6抗体。
1期开放卷标研究的安全结果显示，在四种剂量水平的各水平下重复输注单剂DI17E6(EMD 525797)通常是良好耐受的且显示对患者是安全的。不存在剂量限制性毒性(DLT)及输注反应。就剂量而言，在TEAE、NCI-CTCAE(3.0版本)等级或药物关系的分布中未观察到倾向。此外，不存在任何特异性事件在个别群组中累积的证据。十一位患者经历视为药物相关的TEAE。就此而言，在总共四位患者中报告的皮肤症状(诸如搔痒、红斑及疹)是与DI17E6(EMD 525797)相关联的可预测不良事件，考虑到整合素负责维持上皮表达型。黏膜发炎及舌肿胀的症状也可为EMD 525797的作用机理的特征，但其与疲劳结合时，也可为潜在(underlying)疾病的症状。在八位患者中所观察到的血液学及生物化学毒性转移也可由潜在疾病以及合并用药来解释。
在单剂量及多剂量的研究药物后的PK评定表明，DI17E6(EMD 525797)表达地与如针对其他靶向膜相关联受体的抗体所描述的受体介导的清除率模型一致。与在健康志愿者中的早期研究的发现一致，DI17E6(EMD 525797)在mCRPC患者中的PK是剂量依赖性的，其中清除率主要由未结合受体的利用率决定。对在本研究中所用的剂量而言，可以认为在1000mg或更高的剂量下，几乎所有受体均是饱和的且对药物清除率具有少量贡献。可于一些(16％)患者中检测到针对DI17E6的免疫触发抗体；然而，未发现对PK或安全性的影响。
总之，呈单剂量或多剂量给出的单剂EMD 525797在患者中显示良好耐受。不存在可识别安全性问题且在许多患者中存在临床效益的初步证据。由于其靶及安全性，DI17E6(EMD 525797)是用于单剂和/或组合疗法的有前景的试剂。
因此，本发明的优选目标因此为：
·如上文和/或下文所述用于治疗如上文和/或下文所述的病症的DI17E6抗体，其中该抗体的剂量，优选有效剂量，为每两周500mg至1500mg或每月1000至3000mg，优选每两周500至1000mg或每月1000至2000mg。
·如上文和/或下文所述用于治疗如上文和/或下文所述的病症的DI17E6抗体，其中该抗体的剂量，优选有效剂量，为约每月500mg、约每月1000mg、约每月1500mg或约每月2000mg。
·如上文和/或下文所述用于治疗如上文和/或下文所述的病症的DI17E6抗体，其中500至1000mg的剂量，优选有效剂量是通过单次输注进行施用。
·一种如上文和/或下文所述用于治疗如上文和/或下文所述的病症的DI17E6抗体，其中1000至2000mg的剂量，优选有效剂量是通过单次输注进行施用。
·如上文和/或下文所述用于治疗如上文和/或下文所述的病症的DI17E6抗体，其中500至1000mg的剂量，优选有效剂量是通过一个月一次的单次输注进行施用。
·如上文和/或下文所述用于治疗如上文和/或下文所述的病症的DI17E6抗体，其中1000至2000mg的剂量，优选有效剂量是通过一个月一次的单次输注进行施用。
·如上文和/或下文所述用于治疗如上文和/或下文所述的病症的DI17E6抗体，其中约500mg的剂量，优选有效剂量是通过单次输注进行施用。
·如上文和/或下文所述用于治疗如上文和/或下文所述的病症的DI17E6抗体，其中约1000mg的剂量，优选有效剂量是通过单次输注进行施用。
·如上文和/或下文所述用于治疗如上文和/或下文所述的病症的DI17E6抗体，其中约1500mg的剂量，优选有效剂量是通过单次输注进行施用。
·如上文和/或下文所述用于治疗如上文和/或下文所述的病症的DI17E6抗体，其中约1500mg的剂量，优选有效剂量是通过一个月一次的单次输注进行施用。
·如上文和/或下文所述用于治疗如上文和/或下文所述的病症的DI17E6抗体，其中约1500mg的剂量，优选有效剂量是通过每四周一次的单次输注进行施用。
·如上文和/或下文所述用于治疗如上文和/或下文所述的病症的DI17E6抗体，其中该抗体是以无其他共同治疗剂的单一疗法设定进行施用。
·如上文和/或下文所述用于治疗如上文和/或下文所述的病症的DI17E6抗体，其中该抗体是以与其他共同治疗剂组合的组合疗法设定进行施用。
·如上文和/或下文所述用于治疗如上文和/或下文所述的病症的DI17E6抗体，其中该抗体是以与MMF(霉酚酸酯(Mycophenolat/Mycophenolate))组合的组合疗法设定进行施用。
·如上文和/或下文所述用于治疗患有SSc-ILD的患者的DI17E6抗体，其中该抗体是以与MMF(霉酚酸酯(Mycophenolat/Mycophenolate))组合的组合疗法设定进行施用。
·如上文和/或下文所述用于治疗患有SSc-ILD的患者的DI17E6抗体，其中该抗体是以约每月500mg的量，优选作为一个月一次的单次施用以约500mg的量，以与MMF(霉酚酸酯(Mycophenolat/Mycophenolate))组合的组合疗法设定进行施用。
·如上文和/或下文所述用于治疗患有SSc-ILD的患者的DI17E6抗体，其中该抗体是以约每月1.000mg的量，优选作为一个月一次的单次施用以约1.000mg的量，以与MMF(霉酚酸酯(Mycophenolat/Mycophenolate))组合的组合疗法设定进行施用。
·如上文和/或下文所述用于治疗患有SSc-ILD的患者的DI17E6抗体，其中该抗体是以约每月1.500mg的量，优选作为一个月一次的单次施用以约1.500mg的量，以与MMF(霉酚酸酯(Mycophenolat/Mycophenolate))组合的组合疗法设定进行施用。
·如上文和/或下文所述用于治疗纤维化，优选过量和/或病理纤维化的DI17E6抗体，优选以如上文和/或下文所述的方式进行治疗。
·如上文和/或下文所述用于治疗纤维化病症，优选如上文和/或下文所述的纤维化病症的DI17E6抗体，优选以如上文和/或下文所述的方式进行治疗。
·如上文和/或下文所述用于治疗系统性硬化症(SSc)的DI17E6抗体，优选以如上文和/或下文所述的方式进行治疗。
·如上文和/或下文所述用于治疗如上文和/或下文所述的病症的DI17E6抗体，其中经所述病症所影响的器官选自由肺、肝、肾、心血管系统或皮肤组成的组。
·如上文和/或下文所述用于治疗纤维化，优选过量和/或病理纤维化的DI17E6抗体，优选以如上文和/或下文所述的方式进行治疗，其中该纤维化、过量纤维化和/或病理纤维化影响一个或多个选自由肺、肝、肾、心脏及皮肤组成的组的器官。
·如上文和/或下文所述用于治疗纤维化病症，优选如上文和/或下文所述的纤维化病症的DI17E6抗体，优选以如上文和/或下文所述的方式进行治疗，其中所述纤维化病症影响一个或多个选自由肺、肝、肾、心脏及皮肤组成的组的器官。
·如上文和/或下文所述用于治疗系统性硬化症(SSc)的DI17E6抗体，其中该系统性硬化症包括肺、肝、肾、心血管系统和/或皮肤的系统性硬化症。
·如上文和/或下文所述用于治疗系统性硬化症(SSc)的DI17E6抗体，其中所述系统性硬化症影响一个或多个选自由肺、肝、肾、心脏及皮肤组成的组的器官。
·如上文和/或下文所述用于治疗系统性硬化症(SSc)的DI17E6抗体，其中该系统性硬化症影响心血管系统、血管和/或血液。
·如上文和/或下文所述用于治疗系统性硬化症(SSc)的DI17E6抗体，其中所述系统性硬化症影响肺和/或皮肤。
·如上文和/或下文所述用于治疗系统性硬化症(SSc)的DI17E6抗体，其中所述系统性硬化症影响肺。
·如上文和/或下文所述用于治疗系统性硬化症(SSc)的DI17E6抗体，其中所述系统性硬化症影响皮肤。
·如上文和/或下文所述用于治疗系统性硬化症(SSc)的DI17E6抗体，其中所述系统性硬化症影响肝。
·如上文和/或下文所述用于治疗系统性硬化症(SSc)的DI17E6抗体，其中所述系统性硬化症影响肾。
·如上文和/或下文所述用于治疗系统性硬化症(SSc)的DI17E6抗体，其中所述系统性硬化症影响心脏。
·如上文和/或下文所述用于治疗系统性硬化症(SSc)的DI17E6抗体，其中该系统性硬化症包括一种或多种选自由以下组成的组的适应症：特发性肺纤维化、原发性硬化性胆管炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、原发性局灶性肾小球硬化、原发性节段性肾小球硬化、糖尿病性肾病、舒张功能障碍及骨髓纤维化。
·如上文和/或下文所述用于治疗系统性硬化症(SSc)的DI17E6抗体，其中所述系统性硬化症包括肺纤维化和/或肺泡炎(间质性肺病，ILD)。
·如上文和/或下文所述的DI17E6抗体，其用于治疗肺纤维化和/或肺泡炎(间质性肺病，ILD)。
·如上文和/或下文所述的DI17E6抗体，其用于治疗SSc-ILD或硬皮病-ILD。
·如上文和/或下文所述的DI17E6抗体，其用于治疗罹患SSc-ILD的患者。
·如上文和/或下文所述的DI17E6抗体，其用于治疗罹患硬皮病-ILD的患者。
·如上文和/或下文所述的DI17E6抗体，其用于治疗皮肤系统性硬化症(dcSSc)或局限性皮肤系统性硬化症(lcSSc)。
·如上文和/或下文所述的DI17E6抗体，其用于治疗患有系统性硬化症相关联的间质性肺病(SSc-ILD)的受试者，优选人类受试者。
·阿吐珠单抗，其用于治疗患有系统性硬化症相关联的间质性肺病(SSc-ILD)的受试者，优选人类受试者。
·如上文和/或下文所述的DI17E6抗体，其用于治疗已经接受霉酚酸酯的患有SSc-ILD的受试者，优选人类受试者。
·如上文和/或下文所述的DI17E6抗体，其用于治疗已经接受霉酚酸酯，优选恒定剂量的霉酚酸酯的患有SSc-ILD的受试者，优选人类受试者。
·阿吐珠单抗，其用于治疗已经接受霉酚酸酯的患有SSc-ILD的受试者，优选人类受试者。
·如上文和/或下文所述的所述抗-αv整合素抗体DI17E6的生物活性变体或修饰体，其用于治疗纤维化和/或纤维化病症，其中所述生物活性变体或修饰体包括DI17E6的CDR区及重链及轻链可变区，其与DI17E6的可变区相比较在氨基酸序列上有至少80％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少98％相同或至少99％相同。
·如上文和/或下文所述的所述抗-αv整合素抗体DI17E6的生物活性变体或修饰体，其用于治疗纤维化和/或纤维化病症，其中所述生物活性变体或修饰体包括DI17E6的重链和/或轻链可变区，其与DI17E6的各自重链和/或轻链可变区相比较在氨基酸序列上有至少90％相同、至少95％相同、至少98％相同、至少99％相同或至少99.5％相同。
·如上文和/或下文所述的所述抗-αv整合素抗体DI17E6的生物活性变体或修饰体，其用于治疗纤维化和/或纤维化病症，其中所述生物活性变体或修饰体包括DI17E6的重链和/或轻链CDR区，其与DI17E6的各自重链和/或轻链CDR区相比较在氨基酸序列上有至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同或至少99％相同。
·如上文和/或下文所述的所述抗-αv整合素抗体DI17E6的生物活性变体或修饰体，其包括在重链结构区内的一种或多种修饰体
FR1:QVQLQQSGAELAEPGASVKMSCKASGYTFS(SEQ ID No.16)
FR2:WVKQRPGQGLEWIG(SEQ ID No.17)
FR3:KATMTADTSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYYCAS(SEQ ID No.18)
FR4:WGQGTSVTVSS(SEQ ID No.19),
其中加粗及下划线位置的一者或多者经突变且与DI17E6的原始各自序列相比较是不同的，其用于治疗如上文和/或下文所述的纤维化和/或纤维化病症。
·如上文和/或下文所述的所述抗-αv整合素抗体DI17E6的生物活性变体或修饰体，其用于治疗纤维化病症，优选如上文和/或下文所述的纤维化病症，优选以如上文和/或下文所述的方式进行治疗，其中所述纤维化病症影响一个或多个选自由肺、肝、肾、心脏及皮肤组成的组的器官。
·如上文和/或下文所述的所述抗-αv整合素抗体DI17E6的生物活性变体或修饰体，其用于治疗系统性硬化症(SSc)，其中该系统性硬化症包括肺、肝、肾、心血管系统和/或皮肤的系统性硬化症。
·如上文和/或下文所述的所述抗-αv整合素抗体DI17E6的生物活性变体或修饰体，其用于治疗系统性硬化症(SSc)，其中所述系统性硬化症影响一个或多个选自由肺、肝、肾、心脏及皮肤组成的组的器官。
·如上文和/或下文所述的所述抗-αv整合素抗体DI17E6的生物活性变体或修饰体，其用于治疗系统性硬化症(SSc)，其中该系统性硬化症影响心血管系统、血管和/或血液。
·如上文和/或下文所述的所述抗-αv整合素抗体DI17E6的生物活性变体或修饰体，其用于治疗系统性硬化症(SSc)，其中所述系统性硬化症影响肺和/或皮肤。
·如上文和/或下文所述的所述抗-αv整合素抗体DI17E6的生物活性变体或修饰体，其用于治疗系统性硬化症(SSc)，其中该系统性硬化症包括一种或多种选自由以下组成的组的适应症：特发性肺纤维化、原发性硬化性胆管炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH或Nash)、原发性局灶性肾小球硬化、原发性节段性肾小球硬化、糖尿病性肾病、舒张功能障碍及骨髓纤维化。
·如上文和/或下文所述的所述抗-αv整合素抗体DI17E6的生物活性变体或修饰体，其用于治疗系统性硬化症(SSc)，其中所述系统性硬化症包括肺纤维化和/或肺泡炎(间质性肺病，ILD)。
·如上文和/或下文所述的所述抗-αv整合素抗体DI17E6的生物活性变体或修饰体，其用于治疗肺纤维化和/或肺泡炎(间质性肺病，ILD)。
·如上文和/或下文所述的所述抗-αv整合素抗体DI17E6的生物活性变体或修饰体，其用于治疗SSc-ILD或硬皮病-ILD。
·一种通过施用抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体来治疗受试者的纤维化和/或纤维化疾病的方法，其中所述受试者的特征为从包括2个或更多个，优选5个或更多个，更优选9个或更多个，甚至更优选15个或更多个且尤其16、17、18或19个基因的多基因特征计算的高于阈值得分，该基因选自由以下基因组成的组：COL15A1(NM_001855)、COL1A1(NM_000088)、COMP(NM_000095)、RGS5(NM_003617)、COL10A1(NM_000493)、COL5A1(NM_000093)、IGFBP2(NM_000597)、NM_005576、MOXD1(NM_015529)、ADRA2A(NM_000681)、COL5A2(NM_000393)、MMP10(NM_002425)、TNFRSF21(NM_014452)、ITGA7(NM_002206)、TGF-β3(NM_003239)、MMP11(NM_005940)、SPP1(NM_000582)、CCL2(NM_002982)及TNC(NM_002160)，特别是基于基因COL15A1(NM_001855)、COL1A1(NM_000088)、COMP(NM_000095)、COL10A1(NM_000493)、COL5A1(NM_000093)、COL5A2(NM_000393)、ITGA7(NM_002206)、MMP11(NM_005940)及TNC(NM_002160)的9-基因特征，下文也称为TUAD特征。
·一种通过追踪从包括2个或更多个，优选5个或更多个，更优选9个或更多个，甚至更优选15个或更多个且尤其16、17、18或19个基因的多基因特征计算的得分的改变来监测受试者的纤维化疾病中纤维化的严重程度和/或在可能发展出纤维化的疾病中纤维化的出现的方法，该基因选自由以下基因组成的组：COL15A1(NM_001855)、COL1A1(NM_000088)、COMP(NM_000095)、RGS5(NM_003617)、COL10A1(NM_000493)、COL5A1(NM_000093)、IGFBP2(NM_000597)、NM_005576、MOXD1(NM_015529)、ADRA2A(NM_000681)、COL5A2(NM_000393)、MMP10(NM_002425)、TNFRSF21(NM_014452)、ITGA7(NM_002206)、TGF-β3(NM_003239)、MMP11(NM_005940)、SPP1(NM_000582)、CCL2(NM_002982)及TNC(NM_002160)，特别是基于基因COL15A1(NM_001855)、COL1A1(NM_000088)、COMP(NM_000095)、COL10A1(NM_000493)、COL5A1(NM_000093)、COL5A2(NM_000393)、ITGA7(NM_002206)、MMP11(NM_005940)及TNC(NM_002160)的9-基因特征，下文也称为TUAD特征。
·一种通过施用抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体来治疗受试者的纤维化和/或纤维化疾病的方法，其中所述受试者的特征为包括2个或更多个，优选5个或更多个，更优选10个或更多个，甚至更优选15个或更多个且尤其16、17、18或19个基因的基因特征，该基因选自由以下基因组成的组：COL15A1(NM_001855)、COL1A1(NM_000088)、COMP(NM_000095)、RGS5(NM_003617)、COL10A1(NM_000493)、COL5A1(NM_000093)、IGFBP2(NM_000597)、NM_005576、MOXD1(NM_015529)、ADRA2A(NM_000681)、COL5A2(NM_000393)、MMP10(NM_002425)、TNFRSF21(NM_014452)、ITGA7(NM_002206)、TGF-β3(NM_003239)、MMP11(NM_005940)、SPP1(NM_000582)、CCL2(NM_002982)及TNC(NM_002160)，特别是基于基因COL15A1(NM_001855)、COL1A1(NM_000088)、COMP(NM_000095)、COL10A1(NM_000493)、COL5A1(NM_000093)、COL5A2(NM_000393)、ITGA7(NM_002206)、MMP11(NM_005940)及TNC(NM_002160)的9-基因特征，下文也称为TUAD特征。
·DI17E6或其生物活性变体或修饰体，优选如本文所述的其生物活性变体或修饰体，且尤其阿吐珠单抗的用途，其用于制造用于预防和/或治疗纤维化和/或纤维化病症的药剂。
·DI17E6或其生物活性变体或修饰体，优选如本文所述的其生物活性变体或修饰体，且尤其阿吐珠单抗的用途，其用于制造用于预防和/或治疗如本文所述的纤维化和/或纤维化病症，且尤其预防和/或治疗一种或多种选自由以下组成的组的适应症的药剂：特发性肺纤维化、原发性硬化性胆管炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、原发性局灶性肾小球硬化、原发性节段性肾小球硬化、糖尿病性肾病、舒张功能障碍及骨髓纤维化。
·阿吐珠单抗的用途，其用于制造用于预防和/或治疗如本文所述的纤维化和/或纤维化病症，且尤其预防和/或治疗一种或多种选自由以下组成的组的适应症的药剂：特发性肺纤维化、原发性硬化性胆管炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、原发性局灶性肾小球硬化、原发性节段性肾小球硬化、糖尿病性肾病、舒张功能障碍及骨髓纤维化。
·阿吐珠单抗的用途，其用于制造用于预防和/或治疗系统性硬化症，优选包括肺纤维化、肺泡炎(间质性肺病，ILD)和/或硬皮病性间质性肺病(SSc-ILD)的药剂。
·阿吐珠单抗的用途，其用于制造用于预防和/或治疗局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)的药剂。
·DI17E6或其生物活性变体或修饰体，优选如本文所述的其生物活性变体或修饰体，且尤其阿吐珠单抗的用途，其用于制造用于预防和/或治疗如本文所述的纤维化和/或纤维化病症的药剂，其中该治疗另外包括施用一种或多种选自由霉酚酸、霉酚酸酯、霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolate mofetil)、霉酚酸钠、甲氨喋呤(methotrexate)、氨甲喋呤(amethopterin)及泼尼松组成的组的活性成分。
·阿吐珠单抗的用途，其用于制造用于预防和/或治疗如本文所述的纤维化和/或纤维化病症的药剂，其中该治疗另外包括施用霉酚酸、霉酚酸酯、霉酚酸吗啉乙酯和/或霉酚酸钠。
·阿吐珠单抗的用途，其用于制造用于预防和/或治疗如本文所述的纤维化和/或纤维化病症的药剂，其中该治疗另外包括施用甲氨喋呤和/或氨甲喋呤。
·阿吐珠单抗的用途，其用于制造用于预防和/或治疗如本文所述的纤维化和/或纤维化病症的药剂，其中该治疗另外包括施用泼尼松。
由于其独有的不同作用方式，DI17E6或其生物活性变体或修饰体，优选如本文所述的其生物活性变体或修饰体，且尤其阿吐珠单抗被视为可适用于与基本上所有应用于预防和/或治疗纤维化和/或纤维化病症，尤其如本文所述的纤维化和/或纤维化病症的治疗选项组合。
因此，将DI17E6或其生物活性变体或修饰体，优选如本文所述的其生物活性变体或修饰体，且尤其阿吐珠单抗添加至包括施用治疗纤维化和/或纤维化病症的典型标准药剂的治疗方案，该标准药剂包括但不限于一种或多种选自由霉酚酸、霉酚酸酯、霉酚酸吗啉乙酯、霉酚酸钠、甲氨喋呤、氨甲喋呤及泼尼松组成的组的活性成分。
因此，特别优选如上文和/或下文所述(优选如上所述)使用的抗αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中所述抗体或其所述修饰体是具有注册的国际非专利名称(INN)阿吐珠单抗的抗体。同样地，特别优选如上文和/或下文所述(优选如上所述)的方法，其中所述抗体或其所述修饰体是具有注册的国际非专利名称(INN)阿吐珠单抗的抗体。同样地，特别优选的是抗αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体用于制备用于预防和/或治疗纤维化和/或纤维化病症的药剂，优选如上文和/或下文所述，并且特别优选如上所述，其中所述抗体或其所述修饰体是具有注册的国际非专利名称(INN)阿吐珠单抗的抗体。
根据本发明，抗-αv整合素抗体DI17E6，优选本文中也称为阿吐珠单抗(Abituzumab/abituzumab)是经特别工程改造定制的针对αv整合素(受体)的IgG2杂合单克隆抗体。此抗体更详细地描述于WO2009/010290中，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
其高度变异区(CDR)衍生自鼠科mAb 17E6(EMD 73034)。此亲本小鼠IgG1抗体是由例如Mitjans等人(1995；J.Cell Sci.108,2825)及专利US 5,985,278及EP 719 859描述。小鼠mAb 17E6是由融合瘤细胞系272-17E6制得并以登录编号DSM ACC2160寄存。
其轻链域衍生自人源化单克隆抗-EGFR抗体425(马兹替尼(matuzumab))。此抗体是于例如EP 0 531 472B1中详细描述，且衍生自其鼠类对应体425(小鼠MAb 425，ATCCHB9629)。该抗体是针对人类A431癌细胞系所产生且发现其结合至人类表皮生长因子受体(EGFR)的外域上的多肽抗原决定基。马兹替尼在临床试验中显示高疗效。
一般而言，如本发明所用的抗-αv整合素抗体DI17E6包括：
(i)衍生自小鼠单克隆抗-αv整合素抗体17E6的CDR轻链及重链区
(ii)获自人源化单克隆抗-EGFR抗体425的轻链结构区，
(iii)衍生自小鼠单克隆抗-αv整合素17E6的重链结构区，任选地在特定位置上包括一个或多个氨基酸突变，及
(iv)衍生自人类IgG2的重链恒定区及人类恒定κ轻链区，其中在所述IgG2域中，IgG2铰链区由人类IgG1铰链区代替，且；其中任选地在IgG2内进行一种或多种突变。
具体而言，用于所要求保护的治疗及如上文及下文所述的临床试验中的DI17E6(称为“DI17E6γ2h(N297Q)”或“EMD 525797”)具有以下氨基酸序列：
(i)可变及恒定轻链序列(SEQ ID No.1)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYYTSKIHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISS LQPEDIATYYCQQGNTFPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC及
(ii)可变及恒定重链序列(SEQ ID No.2)：
QVQLQQSGGELAKPGASVKVSCKASGYTFSSFWMHWVRQAPGQGLEWIGYINPRSGYTEYNEIFRDKATMTTDTSTS TAYMELSSLRSEDTAVYYCASFLGRGAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK，
其中下划线序列表示具有CDR的可变区(加粗，与亲本小鼠抗体相同)。经修饰的IgG1铰链区由EPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID No.3)表示，且AQ是在IgG2域内的取代。
然而，如WO 2009/010290所显示，也可根据本发明的教导使用DI17E6的变异体。因此，DI17E6变异体在重链结构区内包括一种或多种修饰体
FR1:QVQLQQSGAELAEPGASVKMSCKASGYTFS(SEQ ID No.16)
FR2:WVKQRPGQGLEWIG(SEQ ID No.17)
FR3:KATMTADTSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYYCAS(SEQ ID No.18)
FR4:WGQGTSVTVSS(SEQ ID No.19),
其中加粗及下划线位置的一者或多者是经突变，可用于治疗如所述的前列腺癌患者。更详细而言，以下位置重链结构区是在以下可经突变的位置的一者、多者或全部上发生突变：A9、E13、M20、K38、R40、A72、S76、Q82、G85、T87、S91及S113。这些变异体与由上文的其序列所定义的DI17E6相比较，显示相同或极相似的生物活性及疗效。
一般而言，如所述的本发明也包括与未经修饰的DI17E6在功能上和/或医药上相同或相似的DI17E6抗体的修饰体及变异体，且其中CDR区及重链及轻链可变区与DI17E6的各自可变区相比较，在其氨基酸序列上有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同。此外，本发明也包括与未经修饰的DI17E6在功能上和/或医药上相同或相似的DI17E6抗体的修饰体及变异体，且其中恒定区与DI17E6的各自恒定区相比较，在其氨基酸序列上有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％或至少99％相同。抗体的IgG链的恒定区中的改变可改良特异性质，如免疫原性、ADCC等等。
优选地，如所述的本发明也包括与(未经修饰的)DI17E6或阿吐珠单抗在功能上和/或医药上相同或相似的DI17E6抗体的修饰体及变异体，且其中重链及轻链可变区与DI17E6的各自重链及轻链可变区相比较，在其氨基酸序列上有至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。此外，本发明也包括与未经修饰的DI17E6在功能上和/或医药上相同或相似的DI17E6抗体的修饰体及变异体，优选如此段上文中所述，其中恒定区与DI17E6的各自恒定区相比较，在其氨基酸序列上有至少90％、或至少95％、或至少99％、或至少99.5％或至少99.9％相同。抗体的IgG链的恒定区中的改变可改良特异性质，如免疫原性、ADCC等等。
甚至更优选地，如所述的本发明也包括与(未经修饰的)DI17E6或阿吐珠单抗在功能上和/或医药上相同或相似的DI17E6抗体的修饰体及变异体，且其中可变重链和/或轻链上的CDR区与DI17E6的可变重链和/或轻链区上的各自CDR区相比较，在其氨基酸序列上有至少90％、至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同。此外，本发明也包括与未经修饰的DI17E6在功能上和/或医药上相同或相似的DI17E6抗体的修饰体及变异体，优选如此段上文中所述，其中恒定区与DI17E6的各自恒定区相比较，在其氨基酸序列上有至少90％、或至少95％、或至少99％、或至少99.5％或至少99.9％相同。
尤其优选地，如所述的本发明也包括与(未经修饰的)DI17E6或阿吐珠单抗在功能上和/或医药上相同或相似的DI17E6抗体的修饰体及变异体，其中重链及轻链CDR区是与(未经修饰的)DI17E6或阿吐珠单抗100％相同，但其中除所述CDR区之外的重链及轻链可变区与DI17E6的各自重链及轻链可变区相比较在其氨基酸序列上有至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。此外，本发明优选也包括与未经修饰的DI17E6在功能上和/或医药上相同或相似的DI17E6抗体的修饰体及变异体，优选如此段上文中所述，其中恒定区与DI17E6的各自恒定区相比较在其氨基酸序列上有至少90％、或至少95％、或至少99％、或至少99.5％或至少99.9％相同。
尤其优选地，如所述的本发明也包括与(未经修饰的)DI17E6或阿吐珠单抗在功能上和/或医药上相同或相似的DI17E6抗体的修饰体及变异体，其中可变重链和/或轻链上的CDR区与DI17E6的可变重链和/或轻链区上的各自CDR区相比较在其氨基酸序列上有至少90％、至少92％、至少94％、至少96％或至少98％相同，且其中除了所述CDR区之外的重链及轻链可变区与DI17E6的各自重链及轻链可变区相比较在其氨基酸序列上有至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。此外，本发明优选也包括与未经修饰的DI17E6在功能上和/或医药上相同或相似的DI17E6抗体的修饰体及变异体，优选如此段上文中所述，其中恒定区与DI17E6的各自恒定区相比较在其氨基酸序列上有至少90％、或至少95％、或至少99％、或至少99.5％或至少99.9％相同。
尤其优选地，DI17E6抗体或阿吐珠单抗为如上文及下文所述的IgG2子类的重组型脱免疫单克隆抗体，其靶向人类αv整合素并抑制配体结合至人类αv整合素。尤其优选地，通常存在于所述DI17E6抗体或阿吐珠单抗的Fc区中的碳水化合物结构已通过基因改变通常充当使分子无糖基化的附接点的氨基酸残基来移除。抗体尤其优选地由4条多肽链组成，2条相同重链各由447个氨基酸组成及2条相同轻链各有214个氨基酸组成。通常地，4条链通过共价(二硫键)及非共价键的组合来固定在一起。分子的近似分子量为145kDa。
更具体地，本文所述的DI17E6抗体及尤其阿吐珠单抗或EMD 525797的特征为高亲和力泛-αv整合素抑制剂，其活体外显示抑制潜伏TGF-β的整合素依赖性活化、抑制FMT、阻止成肌纤维细胞上的整合素上调及阻断成肌纤维细胞收缩。因此，其特异性结合至特异性针对人类αv整合素链的独有抗原决定基。此外，其不与其他整合素(诸如α4β1)及血小板纤维蛋白原受体αIIbβ3交叉反应(crossreact)且优选不触发ADCC及CDC。
根据本发明，据信DI17E6在罹患纤维化疾病，更优选系统性硬化症的患者中且尤其在本文所述的系统性硬化症的一种或多种适应症中高度有效。更具体地，据信阿吐珠单抗在罹患纤维化疾病，更优选系统性硬化症的患者中且尤其在本文所述的系统性硬化症的一种或多种适应症中高度有效。
此外，据信如本文所述的DI17E6，且尤其阿吐珠单抗适于提供针对如本文所述的纤维化疾病更有效和/或更安全的疗法，其相比先前已知的疗法中所见将更良好耐受且可刺激更良好免疫响应。优选地，据信使用阿吐珠单抗的治疗在治疗患有SSc-ILD的患者，优选还有已经接受恒定剂量的霉酚酸酯的患者中更有效、更安全，将更良好耐受且可刺激更良好免疫响应。
如本发明所述，显示TGF-β为组织纤维化的主控介体。结合患有SSc的患者中的发现，TGF-β信号传导路径经活化，且αvβx整合素异二聚体中的一些控制TGF-β的活化，据信抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体在SSc中具有有益效果，由于其显示干扰TGF-β活化，且另外由于其对所发现参与纤维化的αv整合素的TGF非依赖性功能。因此，EMD 525797可经由多种作用模式在患有SSc的患者中有益。上文和/或下文更详细地对此进行描述。然而，因为缺乏交叉反应性，DI17E6不能直接在啮齿动物纤维化模型中进行测试(参见A3.1.3作用模式部分)。非人灵长类中针对SSc或SSc-ILD的纤维化的临床前模型视为是困难的，若非不可行的话。利用除DI17E6外的阻断αv抗体的临床前实验利用人类细胞进行，但是来自活体内实验的相矛盾的结果限制其关联性。因此，本文中我们描述在啮齿动物的临床前纤维化模型中，不存在基因或替代抗体介导的αv整合素阻断效果，及另外，相比其他器官中的SSc表现，存在αv整合素阻断支持SSc-ILD疾病适应症(急性肺损伤反应、异常上皮创伤闭合反应、EMT)的更多证据。
虽然活体外αvβ3及αvβ5整合素的抗体介导的阻断在采取自SSc或特发性肺纤维化(IPF)患者的组织样本的人类成纤维细胞中显示抑制TGF-β依赖性反应(Asano等人，American Journal of Pathology，第168卷，第2期，2006年2月，The Journal ofImmunology,2005,175:7708–7718,ARTHRITIS&RHEUMATISM，第52卷，第9期，2005年9月，第2897至2905页，Journal of Investigative Dermatology(2006)126,1761–1769,Scotton等人，J.Clin.Invest.119:2550 –2563(2009))，但迄今为止，不存在这些整合素在活体内活化TGF-β的有说服力的证据。例如，αvβ3及αvβ5的基因缺失对博来霉素诱导的肺纤维化无影响(Atabai等人，J.Clin.Invest.119:3713–3722(2009))。然而，基因切除β8整合素(Itgb8)与抗体抑制αvβ6的组合显示导致比在Itgb8-/-动物中更严重的表达型但与在Tgfb1无效小鼠中所见相似的表达型(Aluwihare等人，Journal of Cell Science 122,2009,227-232)，这讨论任一种或两种整合素是否可在小鼠的胚胎至成年小鼠的不同分化状态下的生物学发育中活体内活化TGF-β中起作用。
Takahashi等人(Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.第24卷，第264至271页，2001)研究骨桥蛋白在小鼠的博来霉素诱导的肺纤维化的致病原理中的作用。据报导，骨桥蛋白(OPN)是由活化巨噬细胞产生的细胞因子中的一种且通过与av整合素相互作用来介导多种功能(包括细胞附着及迁移)。
通过在此模型中添加抗鼠av整合素单克隆抗体(RMV-7)显著抑制OPN对成纤维细胞的这些作用。
转变生长因子β(TGF-β)是肺纤维化的重要驱动因素且正寻求抑制其作用的治疗策略。然而，TGF-β具有可造成治疗抑制问题的其他稳态作用。Horan等人(Am J RespirCrit Care Med，第177卷，第56至65页，2008)因此在鼠类博莱霉素诱导的肺纤维化模型中，使用阻断经avb6介导的TGF-β活化的单克隆pSmad2/3一级抗体来研究整合素avb6(肺中的TGF-β的关键活化因子)的抑制作用。据描述，使用所述avb6整合素抗体部分抑制TGF-β是在阻断鼠类肺纤维化中有效而不会使该鼠类模型中发炎恶化。
据描述，含有RGD序列的合成肽能够在不同细胞系统中抑制整合素相关功能。Moon等人(Respiratory Research 2009,10:18)研究合成Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS)肽对于小鼠的对气管内(i.t.)脂多糖(LPS)治疗的关键发炎反应及对急性肺损伤的发展期间整合素发信号促分裂原活化蛋白(MAP)激酶路径的作用。使用RGDS的预处理在4或24小时LPS处理后抑制支气管肺泡灌洗术(BAL)流体中的LPS诱导的嗜中性粒细胞及巨噬细胞数量、总蛋白质水平及TNF-α及MIP-2水平、及基质金属蛋白酶-9的活性的增加。重要地，当在LPS处理后2小时施用此肽时，发炎反应及激酶路径的抑制仍明显。类似地，针对αv整合素的阻断抗体显著抑制LPS后4或24小时BAL流体中的LPS诱导的发炎细胞迁移至肺中、蛋白质累积及促发炎介体产生。这些结果表明具有对αv整合素高特异性的RGDS在此鼠类模型中于LPS诱导的急性肺损伤发展期间使发炎级联减弱。
已报导，由αvβ6整合素活化潜伏TGF-β是在急性肺损伤的发展中的一个关键步骤。Jenkins等人(J.Clin.Invest.116:1606–1614(2006))显示凝血酶及蛋白酶活化受体1(PAR1)的其他激动剂以αvβ6整合素特异性方式活化TGF-β。此效应是PAR1特异性且据信其由RhoA及Rho激酶介导。气管内滴入PAR1-特异性肽TFLLRN在高潮气容积通气期间使肺水肿增强，且描述此作用是通过阻断抗αvβ6整合素的抗体而完全抑制。然而，通过αvβ6来活化TGF-β可能不仅仅需要结合至LAP，因为我们已经识别结合LAP但不使TGF-β活化的细胞质突变体。此外，αvβ1及α8β1整合素两者均能够结合LAP而不使TGF-β活化。在这些活体外实验中所发现的αvβ6依赖性TGF-β活化的PAR1介导的增强可解释为一种凝血级联的活化造成急性肺损伤的发展的机理。
转变生长因子(TGF)-β家族成员经由作用于细胞增殖、基质产生及组织发炎来调节创伤修复的多个方面，但TGF-β对创伤闭合的作用本身存在争议。Neuohr等人(Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.第35卷，第252至259页，2006)报导，在该气道上皮细胞培养模型中，使用的TGF-β的阻断抗体增强主气道上皮单细胞层的划痕创伤的闭合度，而外源TGF-1β的添加抑制闭合度，这表明TGF-β的内源活化可充当创伤闭合度的止动器。TGF-β1的阻断增强创伤闭合度，而TGF-β2的阻断在此细胞培养模型中无作用。此处，TGF-β1(而非TGF-β2)可通过整合素家族中的两个成员(αvβ6及αvβ8)来活化，发现两者均在所述气道上皮细胞中表达。在所述模型中，细胞层受创经由两种整合素的作用诱导TGF-β活化，但所选的抗人类αvβ8的小鼠单克隆抗体(37E1)增强创伤闭合度，而所选的抗人类αvβ6的小鼠单克隆抗体(抗-HEL-AB MSB0011523H-1，10D5)不增强创伤闭合度。
转变生长因子-b1(TGF-β1)是成纤维细胞分化为成肌纤维细胞的高效介体，其通过细胞骨架蛋白质a-平滑肌肌动蛋白的出现表征。Lygoe等人(Wound Rep.Reg.2004；12:461–470)描述以所选单克隆小鼠抗-人类抗体(抗αvβ3的LM609、抗β1的P4C10、抗αvβ5的P1F6、抗β1的A11B2、抗αv的L230)阻断αv和/或β1整合素防止TGF-β1诱导的成肌纤维细胞的分化，由在三个人类成纤维细胞系(口、皮肤及肾)中a-平滑肌肌动蛋白的表达增加及胶原蛋白凝胶收缩增强可见。此外，阻断αv特异性整合素αvβ5及αvβ3抑制在口及皮肤的成纤维细胞中的成肌纤维细胞的分化；然而在肾细胞中，仅在阻断αvβ5整合素而非αvβ3时可见对分化的阻止。这些数据指示αv整合素在口、皮肤及肾中的人类成纤维细胞分化为成肌纤维细胞中的作用且表明可能存在共同分化路径。
αv整合素也可经由与多种生长因子(诸如血小板衍生性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)及成纤维细胞生长因子(FGF)因子)相互作用参与血管生成的最佳功能。因为BIBF-1120(一种获自Boehringer Ingelheim的新颖化学实体(NCE))靶向这些受体的酪氨酸激酶且在特发性肺纤维化(IPF)(具有与SSc-ILD相同的特征的另一种形式的肺纤维化)的PoC试验中显示初步疗效，所以预期DI17E6经由抑制这些受体具有潜在有益效果。这符合在人类细胞中观察到之由DI17E6抑制VEGF诱导的ERK磷酸化。
不受下文所讨论的机理的束缚，基于构成本发明的结果，我们相信上皮至间叶转变(EMT)造成纤维化、纤维化病症和/或纤维性肺病症的结果。据信TGF-β及αvβx整合素涉及此转分化过程及由抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体阻断这些整合素的功能会下调EMT且因此变得在纤维化、纤维化病症和/或纤维性肺病症中有利。
据信氧化压力在纤维化疾病中起作用。据信表达αvβx整合素的细胞保护其免于氧化压力诱导的细胞凋亡。因此，显而易见可阻断这些整合素的功能的药剂可增加成纤维细胞及成肌纤维细胞的细胞凋亡。
发现αvβx整合素中的一些在SSc-ILD及其他形式的肺纤维化中过度表达，且在患有SSc-ILD及IPF的患者的肺活组织检查中的呼吸上皮通过免疫组织化学表达升高水平的αvβ6。相比正常对照，在患有SSc的患者的支气管肺泡灌洗流体中发现表达αvβ3、αvβ5及β6的T细胞的数量增加(Luzina等人，Am J Respir Crit Care Med第177卷，第56至65页，2008)。然而，已显示β6整合素基因剔除小鼠发展肺发炎，但在博来霉素曝露后不继续发展肺纤维化(Luzina等人，ARTHRITIS&RHEUMATISM，第48卷，第8期，2003年8月，第2262至2274页)。
患有SSc的患者的真皮成纤维细胞显示αvβ3及αvβ5表达增强及TGF-β活化升高，其是通过阻断针对αvβ5的抗体P1F6来抑制(Asano等人，ARTHRITIS&RHEUMATISM第52卷，第9期，2005年9月，第2897至2905页；Journal of Immunology,2005,175:7708–7718；AmericanJournal of Pathology，第168卷，第2期，2006年2月；Journal of InvestigativeDermatology(2006)126,1761–1769)。在患有IPF的患者的肺中的成纤维细胞变异区中发现使用抗-αvβ5抗体的免疫染色增加(Scotton等人，J.Clin.Invest.119:2550–2563(2009))。
软骨寡聚蛋白质(COMP)为常驻于软骨、肌腱及其他结缔组织中的细胞外基质(ECM)蛋白质。在患有SSc的患者的皮肤活组织检查中过度表达COMP。在SSc中，血清COMP水平升高，预示死亡率且与肺功能衰退及皮肤纤维化相关联，如使用改良罗德曼皮肤得分(mRSS)所测得。COMP还是SSc皮肤中预示皮肤受累的严重程度的四种特征RNA中的一种。
Yang等人描述在硬皮病的小鼠模型中骨膜蛋白经由PI3K/Akt依赖性机理促进皮肤硬化症(Yang L、Serada S、Fujimoto M、Terao M、Kotobuki Y等人(2012)PLoS ONE 7(7):e41994 doi:10.1371/journal.pone.0041994)。使用患者及健康供体的皮肤，也通过免疫组织化学及免疫墨点分析来评估骨膜蛋白的表达。此外，发现重组型小鼠骨膜蛋白直接诱导Col1a1活体外表达，且通过使用抗-av功能阻断抗体或使用PI3K/Akt激酶抑制剂LY294002阻断经av整合素介导的PI3K/Akt信号传导来抑制此作用。因此，结论为骨膜蛋白在小鼠的博来霉素诱导的硬皮病的致病原理中起至关重要的作用及骨膜蛋白可代表用于人类硬皮病的潜在治疗靶。
Wu等人(Journal of Investigative Dermatology(2012)132,1605–1614)研究在小鼠的博莱霉素诱导的纤维化模型中骨桥蛋白(OPN)(一种具有促发炎及促纤维化性质的基质细胞蛋白质)在系统性硬化症及真皮纤维化的作用。根据该研究，在所述纤维化模型中，OPN缺乏小鼠与野生型(WT)小鼠相比较发展更少真皮纤维化。最后，它们发现由OPN缺乏巨噬细胞产生的TGF-β与WT相比较有所减少。总之，据报导，OPN水平在SSc患者中增加，且所得数据视为表明OPN可在小鼠的真皮纤维化发展中起重要作用及OPN因此可为SSc中的治疗靶。
由Lorenzen等人(Rheumatology 2010；49:1989–1991 doi:10.1093/rheumatology/keq223 Advance Access publication 2010年7月20日)对总计70位患有SSc的患者的血浆进行分析，其中二十位年龄匹配的健康志愿者及59位患有特发性肺性高血压的患者作为对照。结果可指示使用OPN抑制剂作为T细胞趋化性的新颖治疗靶的可能性，因为单克隆OPN抗体已经用于胶原蛋白诱导的关节炎模型。总之，据描述，OPN水平与SSc中的肺纤维化的发展相应(parallel)且因此可为此并发症的具有吸引力的生物标记。
总之，基于构成本发明的结果及数据，我们强烈相信DI17E6及优选亦本文所述的其生物活性变体或修饰体与αvβx整合素的特异性相互作用以解决纤维化、纤维化病症(包括SSc)的致病原理的特别有利的方式控制TGF-β的活化及多种其他机理。因此，预期与纤维化、纤维化病症，优选SSc中，且特别地SSc-ILD中的信号传导的相互作用的有利的有益效果。
预期EMD 525797在多种癌症适应症中的优异安全性及耐受性与在纤维化疾病(包括SSc且尤其包括SSc-ILD)中相似。结合所预期的EMD 52579的效益，EMD 525797在SSc-ILD中的效益/风险比在SSc-ILD中应为积极的且大于对于CYC而言的。因此据信EMD 525797亦对SSc的其他表现有益。
术语“细胞因子”为一细胞群体所释放的蛋白质的通用术语，该蛋白质是作为细胞间介体作用于另一细胞。这些细胞因子的实例为淋巴因子、单核细胞因子及传统多肽激素。包括于细胞因子中的有生长激素，诸如人类生长激素、N-甲硫氨酰基人类生长激素及牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，诸如促滤泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)及促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；小鼠促性腺激素关联肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGFβ；血小板生长因子；转变生长因子(TGF)，诸如TGF-α及TGF-β；红血球生成素(EPO)；干扰素，诸如IFNα、IFNβ及IFNγ；集落刺激因子，诸如M-CSF、GM-CSF及G-CSF；白介素，诸如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；及TNFα或TNFβ。根据本发明的优选细胞因子为干扰素及TNFa。
“抗-血管生成剂”是指阻断或在一定程度上干扰血管发展的天然或合成化合物。抗-血管生成分子可例如为结合至血管生成生长因子或生长因子受体并将其阻断的生物学分子。本文的优选抗血管生成分子结合至受体，优选结合至整合素受体或VEGF受体。根据本发明，该术语也包括整合素(受体)抑制剂。
术语“整合素抑制剂”或“整合素受体抑制剂”是指阻断及抑制整合素受体的天然或合成分子。在某些情况下，该术语包括针对所述整合素受体的配体的拮抗剂(诸如，针对αvβ3：玻连蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、血管性血友病因子、血小板应答蛋白、层粘连蛋白；针对αvβ5：玻连蛋白；αvβ1：纤维连接蛋白及玻连蛋白；αvβ6：纤维连接蛋白)。根据本发明，针对整合素受体的拮抗剂是优选的。整合素(受体)拮抗剂可为天然或合成肽、非肽、肽模拟物、免疫球蛋白(诸如抗体或其功能片段)或免疫偶联物(融合蛋白质)。本发明的优选整合素抑制剂针对αv整合素的受体(例如，αvβ3、αvβ5,αvβ6及子群)。优选的整合素抑制剂为αv拮抗剂，且特别是αvβ3拮抗剂。根据本发明的优选的αv拮抗剂为RGD肽、肽模拟物(非肽)拮抗剂及抗-整合素受体抗体，诸如阻断αv受体的抗体。例示性的非免疫学αvβ3拮抗剂描述于US 5,753,230及US 5,766,591的教导中。优选的拮抗剂为线性及环状含有RGD的肽。一般而言，环状肽更稳定且引出增强型血清半衰期。然而，本发明的优选的其他整合素拮抗剂为环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(EMD 121974,Merck KGaA,Germany；EP0770 622)，其是在阻断整合素受体αvβ3及αvβ5中有效的，和在阻断αvβ1、αvβ6、αvβ8、αIIbβ3中是较少程度有效的。根据本发明，在纤维化疾病患者中的DI17E6结合西仑吉肽(Cilengitide)的组合疗法可以是有效的。
通常通过静脉注射来施用DI17E6，然而本领域中针对抗体/蛋白质药剂而言方便的其他施用形式是适用的。所有标准输注溶液及制剂是适用的，诸如WO 2005/077414或WO2003/053465中所描述，包括微脂体制剂。另外，有利的是提供载有DI17E6及任选(以增加细胞毒性)化学疗法药剂的人类血清白蛋白纳米粒子(Biomaterials 2010,8,2388-98；Wagner等人)。
根据本发明的作为抗-αv整合素抗体DI17E6或DI17E6尤其优选的是具有注册的国际非专利名称(INN)阿吐珠单抗(Abituzumab)的抗体。
与本发明相关，阿吐珠单抗为IgG2子类的重组型脱免疫单克隆抗体，其靶向人类αv整合素并阻断配体结合至人类αv整合素。另外，通常存在于Fc区中的碳水化合物结构已通过基因改变通常充当使分子无糖基化的附接点的氨基酸残基来移除。因此，该抗体阿吐珠单抗优选是由四条多肽链(两条优选相同的重链各由447个氨基酸组成及两条优选相同的轻链各有214个氨基酸组成)组成。四条链通过共价(二硫键)及非共价键的组合来固定在一起。分子的近似分子量为145kDa。
可通过在无血清生长培养基中的哺乳动物细胞培养制备抗体阿吐珠单抗。通过亲和力及离子交换层析法纯化抗体。方法也可包括特异病毒减活及移除步骤。抗体阿吐珠单抗可随后转移至配制缓冲剂中并使其达到所需浓度。
一种优选医学产品的说明及组成：
例如浓度为250mg/10mL的阿吐珠单抗可用作呈预期用于静脉内(i.v.)施用的无菌溶液的最终药品。阿吐珠单抗药品可以30R类型I玻璃小瓶供应，例如用灰色丁基橡胶塞密闭及例如用铝/红聚丙烯弹开(flip-off)密封垫密封。这些小瓶可使用作为单次使用的小瓶容器，例如含有250mg的呈25mg/mL无防腐剂的经柠檬酸缓冲的盐水溶液的阿吐珠单抗，例如含有聚山梨醇酯80(80)作为稳定剂。这些小瓶可含有足够过剩以移除10mL体积的阿吐珠单抗最终药品。一般而言，对于此阿吐珠单抗的最终药品，仅使用视为安全且符合现行欧洲药典(EP)或美国药典(USP)或两者的赋形剂。
尤其优选地，阿吐珠单抗为经基因改造以不诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的人源化IgG2抗体。所述阿吐珠单抗抗体以高特异性结合至人类αv-整合素受体次单元，由此抑制配体结合至αv异二聚体(αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8)。其特异性抑制αv整合素并阻断经αv整合素介导的细胞附着及迁移。其不与其他整合素交叉反应，包括血小板纤维蛋白原受体αIIbβ3，且仅识别人类及猴αv整合素。阿吐珠单抗识别在αv整合素受体次单元上的不位于或靠近配体空穴的抗原决定基。因此，其作用机理与针对诸如环状RGD肽的纯配体竞争性拮抗剂所述的作用机理不同。整合素αvβ3及αvβ5是在活化内皮细胞(EC)、静息血小板、平滑肌细胞、在甲状腺中、一些肾内皮及上皮、输卵管内皮及破骨细胞中选择性表达。此外，αv整合素是在来自不同肿瘤实体(包括结肠直肠癌及前列腺癌)的恶性细胞中以可变程度表达。因此，阿吐珠单抗结合至其靶优选地在功能上阻断整合素受体且因此抑制其结合至对应细胞外基质(ECM)配体(即，玻连蛋白)。
在人类及不同动物物种中的免疫组织化学(IHC)检查显示阿吐珠单抗具有高度物种特异性：阿吐珠单抗仅结合至人类及石蟹猕猴αv整合素，具有相当的人类组织与猴组织之间的交叉反应。阿吐珠单抗显示在活体外干扰涉及肿瘤血管生成的多个方面，诸如EC附着至ECM、局灶性接点的去稳定化、EC迁移、血管生成生长因子信号传导的传递(VEGF诱导的ERK磷酸化)及EC生存力。阿吐珠单抗还直接影响肿瘤细胞。活体外实验显示阿吐珠单抗可影响细胞黏附至αv整合素的配体及肿瘤细胞的增殖。
在活体内，针对肿瘤异种移植模型(例如，黑色素瘤、NSCLC、CRC、前列腺癌)使用表达不同αv整合素的肿瘤细胞系来评价阿吐珠单抗的抗肿瘤效应。因为阿吐珠单抗对人类及猴αv整合素具有特异性，所以其抗-血管生成活性不能在常规啮齿动物的异种移植肿瘤模型中研究。因此，在小鼠中的异种移植肿瘤实验单独证实阿吐珠单抗的潜在抗肿瘤活性。阿吐珠单抗能够抑制在使用不同适应症(例如，黑色素瘤、NSCLC、前列腺癌及CRC)的癌细胞系或原代外植体的活体内肿瘤实验中的生长。
在人类皮肤异种移植/肿瘤细胞系实验中，在恶性细胞上无目标αv整合素的情况下评价阿吐珠单抗的抗血管生成作用机理。将抑制人类αv整合素缺陷性黑色素瘤细胞的生长的阿吐珠单抗输注至已经移植至SCID小鼠上的人类皮肤中。因为其本身无肿瘤细胞上的靶，所以阿吐珠单抗可仅靶向人类内皮细胞，且最有可能通过抑制肿瘤血管生成来减少肿瘤生长。阿吐珠单抗在石蟹猕猴中的系统性施用阻断在含有刺激血管生成的血管生成生长因子的皮下植入基质胶栓塞中的血管生成的诱导。
根据本发明，尤其优选的是如本文所述的主题，其中两种或更多种优选、更优选和/或尤其优选的实施方式、方面和/或主题的特征组合至一个实施方式、方面和/或主题中。优选地，根据本发明，优选主题或实施方式可与其他优选主题或实施方式组合；更优选主题或实施方式可与其他较不优选或甚至更优选主题或实施方式组合；尤其优选的主题或实施方式可与其他仅为优选或仅为甚至更优选的主题或实施方式及其类似主题或实施方式组合。
本文针对数量、数字、范围和/或含量所用的术语“约”优选意指“大约”和/或“近似”。那些术语的意义是本领域中所熟知且优选包括为加/减15％且尤其为加/减10％的各自数量、数字、范围和/或含量的变量、偏差和/或可变性。
在任何情况下，本文针对数量、数字、范围和/或含量所用的术语“约”优选意指“大约”和/或“近似”。那些术语的意义是本领域中所熟知且优选包括为加/减5％的各自数量、数字、范围和/或含量的变量、偏差和/或可变性。
本文使用的术语“病症(一种或多种)”和“疾病(一种或多种)”在本领域是公知的和理解的。在本发明的上下文中，它们优选用作同义词，并且因此优选可互换，如果它们在本文中使用的情况中不强烈暗示其他方面的话。因此，本文使用的术语“纤维化病症(一种或多种)”和“纤维化疾病(一种或多种)”在本领域中也是公知的和理解的。在本发明的上下文中，它们优选用作同义词，并且因此优选可互换，如果它们在本文中使用的情况中不强烈暗示其他方面的话。
在医学方面，包括但不限于治疗方案，给药方案和临床试验设计，为了方便和/或易于患者，医务人员和/或医师使用，以及结果的可靠性和/或再现性等。可以使用术语“周”/“一周”，“月”/“一个月”和/或“年”/“一年”，其略微偏离公历的定义。例如，在所述医学方面，一个月通常被称为28天，而一年通常被称为48周。
因此，在本发明的上下文中，术语“周”或“一周”优选是指约5，约6或约7天，更优选约7天的时间段。
在医学方面，术语“月”或“一个月”优选指约28，约29，约30或约31天，更优选约28，约30或约31天的时间段。
在医学方面，术语“年”或“一年”优选是指约12个月的时间段或约48周，约50周，或约52周的时间段，更优选12个月或约48或约52周。
下文通过实施例更详细地解释本发明。优选地，本发明可在整个所要求保护的范围中实施且不受本文所给定的实施例限制。
此外，给出以下实施例以帮助本领域技术人员通过示例更优选地理解本发明。实施例无意限制由权利要求书所赋予的保护范围。针对实施例中所定义的方法、化合物、组合物和/或用途所例示的特征、性质及优点可让渡给在实施例中未明确描述和/或定义的其他方法、化合物、组合物和/或用途，但落在权利要求书中所定义的范围中。
因此，以下实施例更详细地描述本发明但不限制本发明及如所要求保护的范围。
实施例
实施例1
成肌纤维细胞分化是在上皮-成纤维细胞共同培养物中诱导并通过阿吐珠单抗抑制
缩写列表
αSMA： α平滑肌肌动蛋白
BSA： 牛血清血蛋白
Cy5： 花青素5
DAPI： 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚
ECM： 细胞外基质
FGM： 成纤维细胞生长培养基
FMT： 成纤维细胞至成肌纤维细胞转变
FITC： 荧光异硫氰酸盐
IXM： Image Xpress Micro筛选系统
ug： 微克
mg： 毫克
mL： 毫升
ng： 毫微克
NHDF： 正常人类真皮成纤维细胞
NHLF： 正常人类肺成纤维细胞
PBS： 经磷酸盐缓冲的盐水
TGF-β1： 转变生长因子-β1
ELISA： 酶联免疫吸附试验
FBS： 胎牛血清
IL 白介素
概述
TGF-β1是成纤维细胞至成肌纤维细胞转变(FMT)的高效介体，其造成细胞外基质沉积增加且是纤维化疾病的主要驱动因素。这些过程期间存在αv整合素与TGF-β之间串扰的实质证据。TGF-β是以含有潜在型相关肽(LAP)区的潜伏形式分泌。TGF-β1的LAP含有与整合素αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6及αvβ8相互作用使得TGF-β1活化的RGD基序。阿吐珠单抗是对αv具有特异性的人类抗体且因此抑制αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6及αvβ8。
使用上皮细胞/成纤维细胞共同培养物，模拟在经历纤维化的组织中的上皮细胞与成纤维细胞的潜在相互作用来检查阿吐珠单抗阻断FMT的能力。NCI-H358或Calu3细胞与成纤维细胞的共同培养导致aSMA及作为FMT标记的多种mRNA转录的诱导且也使IL-6产生增加。在此系统中，这些标记通过阿吐珠单抗处理而减少，从而证实αv整合素在FMT中起作用。
介绍
纤维化疾病的特征为由于细胞外基质的产生、沉积及收缩所致的过度结疤且据信其由成肌纤维细胞的增殖及活化驱动。纤维化疾病代表最大的疾病组之一，其无有效疗法。纤维化过程经由在前纤维化及抗纤维化介体的网络中的一系列复杂的相互作用进行调节。据信TGF-β信号传导在成纤维细胞至成肌纤维细胞转变(FMT)中起重要作用，其造成细胞外基质沉积增加且是疾病的主要驱动因素。
合成将TGF-β异形体合成为与含有潜在型相关肽(LAP)区的潜伏TGF-β结合蛋白质复合的潜伏前体。这些过程期间存在αv整合素与TGF-β之间串扰的实质证据。TGF-β1的LAP含有与整合素αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6及αvβ8相互作用使得TGF-β1活化的RGD基序。阿吐珠单抗为泛-αv整合素抗体，其异位结合至结合配体的αv次单元且因此阻止配体结合至所有αvβ异二聚体且因此抑制潜伏TGF-β的αv整合素依赖性活化且因此阻断成纤维细胞及其他前体获取成肌纤维细胞表达型。
研究的本质及目的
本研究的目的为测定阿吐珠单抗阻断活体外TGF-β活化及FMT的能力且因此显示其作为用于纤维化疾病的治疗剂的潜能。
材料及方法
测试系统
测试系统为上皮细胞/成纤维细胞共同培养物，模拟在经历纤维化的组织中的上皮细胞与成纤维细胞的潜在相互作用。将来自健康供体的正常人类肺成纤维细胞(NHLF)或正常人类真皮成纤维细胞(NHDF)与NCI-H358或Calu 3细胞系共同培养。
测试材料及刺激
供应及仪器
实验设计
概述研究设计
成纤维细胞培养基(含有2％FBS的FGM)：FGMTM-2 BulletKitTM(CC-3132)含有一瓶500ml的成纤维细胞基础培养基(CC-3131)及具有以下生长补充料的成纤维细胞子弹套组(CC-4126)：0.5ml hFGF-B(CC-4065J)；0.5ml胰岛素(CC-4021J)；10ml FBS(CC-4101J)；0.5ml GA-1000(CC-4081J)。
用于FMT试验的成纤维细胞培养基(含有0.1％FBS的FGM)：FGMTM-2 BulletKitTM(CC-3132)含有一瓶500ml的成纤维细胞基础培养基(CC-3131)及具有以下生长补充料的成纤维细胞子弹套组(CC-4126)：0.5ml hFGF-B(CC-4065J)；0.5ml胰岛素(CC-4021J)；0.5mlFBS(CC-4101J)；0.5ml GA-1000(CC-4081J)。
NCI-H358培养基：含有55ml经热灭活的FBS+5ml丙酮酸钠的500ml RPMI
Calu-3培养基：含有55ml经热灭活的FBS的500ml DMEM
在试验当天，NHLF及NHDF是在T150组织培养瓶中于含有2％FBS的FGM中生长，直到它们达到70至80％汇合。在室温下，用6ml经HEPES缓冲的盐水溶液(Lonza目录号CC-5022)淋洗该细胞，用6ml胰蛋白酶/EDTA(Lonza目录号CC-5012)进行胰蛋白酶化持续5分钟。使用6ml胰蛋白酶中和溶液(Lonza目录号CC-5002)灭活胰蛋白酶，在400g下离心沉降(spundown)4分钟并用含有2％FBS的FGM清洗一次。
对于成像研究而言，成纤维细胞(NHLF或NHDF)是以10,000个细胞/孔接种于胶原蛋白1Cellware 96孔黑色/透明板中。在含有2％FBS的FGM中培养细胞8小时。吸出培养基并使细胞于含有0.1％FBS的FGM中饥饿过夜。吸出培养基并添加100ul含有浓度为20ng/ml的阿吐珠单抗或抗-HEL IgG的含0.1％FBS的FGM并培养30分钟。对于共同培养而言：将NCI-H358或Calu-3以100ul的NCI-H358或Calu-3培养基中含2,000个细胞的密度涂铺至含有成纤维细胞的孔中。5天后，收集培养基并在-80℃下储存以用于IL-6检测。固定细胞并根据α平滑肌肌动蛋白(αSMA)染色程序进行染色。
对于基因表达研究而言，将成纤维细胞(NHLF或NHDF)以200,000个细胞/孔接种于24孔培养板中。在含有2％FBS的FGM中培养细胞8小时。吸出培养基并使细胞于含有0.1％FBS的FGM中饥饿过夜。吸出培养基并添加300ul含有浓度为20ng/ml的阿吐珠单抗或抗-HELIgG的含0.1％FBS的FGM并培养30分钟。对于共同培养而言：将NCI-H358或Calu-3以300ul的NCI-H358或Calu-3培养基中含40,000个细胞的密度涂铺至含有成纤维细胞的孔中。7天后，收集培养基并在-80℃下储存以用于IL-6检测。在-80℃下储存细胞直到准备用于RNA分离及RT-PCR。
aSMA免疫荧光染色：用PBS清洗细胞2次(200ul于96孔板中)，并随后使用固定/渗透溶液在室温下固定45分钟(50uL于96孔板中)。随后用1X BD渗透洗涤缓冲液(经蒸馏水以1:10的稀释度稀释)以5分钟的培育清洗细胞3次。在室温下使用Odyssey阻断缓冲液(50ul于96孔板中)阻断细胞60分钟。用1X BD渗透洗涤缓冲液(200ul于96孔板中)清洗板2次，在各次清洗之间培育5分钟。在洗涤缓冲液中以1:100的稀释度添加抗-SMA抗体并在室温下培育3小时。随后用1X BD渗透洗涤缓冲液(200ul于96孔板中)清洗板2次。以最终体积为100ul在渗透洗涤缓冲液中以1:200的稀释度使用与Alexa Fluor 488共轭的二级Ab山羊抗-小鼠IgG并在室温下培育1小时。用200ul 1X BD渗透洗涤缓冲液清洗细胞2次，在各次清洗之间培育5分钟。将DAPI以1:1000的稀释度添加至洗涤缓冲液中并添加200ul至板，在室温下培育5分钟，吸出溶液并更换为200ul 1X BD渗透洗涤缓冲液。
对于基因表达分析而言。根据包括于RNeasy 96套组(Qiagen)中的“使用真空技术从动物细胞单离细胞质RNA的RNeasy 96程序(RNeasy 96 Protocol for Isolation ofCytoplasmic RNA from Animal Cells-using Vaccum Technology)”萃取RNA。根据RT2分析工具PCR阵列手册(Qiagen)中所述的程序，在用于Applied Biosystems循环器的循环条件下，使用RT2 First Strand套组及用于RT2分析工具PCR阵列的实时PCR完成cDNA合成。
读出
用于成像的板读取程序
使用Image Xpress Micro(IXM)机器及MetaXpress软件程序进行图像采集及分析。对于2种颜色染色：DAPI及FITC染色而言，使用板采集成像程序：“2014-YW-SMA488-DAPI-10x”。对于数据分析而言，使用多波长细胞得分分析参数程序“2014-5-7-YW-SMA488-DAPI-4x-2 para a”来量化由于FMT的SMA纤维诱导的量。以BMP文件下载各个孔的图像。
IL-6 ELISA
遵循制造商使用说明，使用市售IL-6 ELISA试验(Human Duoset IL-6，R&DSystems)测定人类IL-6的水平。使用Spectramax M5e读数器(Molecular Devices)进行在450nm下的光学密度读数(OD)并自使用来自IL-6内标的OD读数计算的四参数逻辑曲线拟合来外推出各样本的IL-6浓度。
基因表达分析
在RT-PCR已完成在QuantStudio 12k flex Applied Biosystem循环器中的运行后，将所有孔的CT值下载至Excel电子表格以用于计算相对表达。
所用的计算机程序
相对基因表达(基础水平)及倍数变化计算
CT阈值循环。CT是反应中生成的荧光与阈值线交叉的循环次数。CT值为对数且是直接用于定量分析。
对于相对基因表达(基础水平)而言：
计算ΔCT值。ΔCT＝CT目标–CT参照(GAPDH)
计算2-ΔCT作为基础水平的相对基因表达。
对于相对基因表达(处理后的倍数变化)而言：
计算ΔCT值。ΔCT＝CT目标–CT参照(GAPDH)
计算ΔΔCT值。ΔΔCT＝ΔCT测试样本(经处理)–ΔCT校准样本(未经处理)
标准化为内源参照基因(endogenous reference)(例如，GAPDH)且相对于校准基因(calibrator)(处理前或对照)的目标基因(target)的量由2–ΔΔCT给定。
结果
阿吐珠单抗阻断在H358-成纤维细胞及Calu3-成纤维细胞共同培养物中的aSMA表达的升高(也参见图1)
该研究产生在纤维化过程期间存在αv整合素与TGF-β之间所假定的串扰的实质证据。使用肿瘤上皮细胞/成纤维细胞共同培养系统来仿真在经历纤维化的组织中的上皮细胞与成纤维细胞的潜在相互作用。共同培养7天后，肺成纤维细胞或真皮成纤维细胞单一培养中的aSMA的基础水平降低。NCI-H358及Calu-3诱导成纤维细胞层中的aSMA表达(图1)。将阿吐珠单抗添加至NHLF+NCI-H358；NHLF+Calu-3；NHDF+NCI-H358；NHDF+Calu-3共同培养抑制成纤维细胞中的aSMA表达的诱导。
阿吐珠单抗阻断在H358-成纤维细胞共同培养物中的FMT相关基因表达的升高(也参见图2)
NHLF+NCI-H358；NHDF+NCI-H358的共同培养诱导作为FMT标记的多种mRNA转录且也使IL-6产生增加。在此系统中，这些标记通过阿吐珠单抗处理而减少，这证实αv整合素在FMT中起实质作用。
文献目录
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实施例2
阿吐珠单抗在人类肺成纤维细胞中对TGF-β所诱导的FMT的作用
图示列表
图3：TGF-β增加人类肺成纤维细胞中的整合素的表达
图4：TGF-β增加肺成纤维细胞中的aSMA、IL-6及其他成肌纤维细胞标记基因的表达
图5：阿吐珠单抗处理成纤维细胞培养减少TGF-β诱导的aSMA及IL-6的增加
图6：阿吐珠单抗处理减少TGF-β诱导的胶原蛋白凝胶收缩
缩写列表
αSMA： α平滑肌肌动蛋白
BSA： 牛血清血蛋白
Cy5： 花青素5
DAPI： 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚
ECM： 细胞外基质
FGM： 成纤维细胞生长培养基
FMT： 成纤维细胞至成肌纤维细胞转变
FITC： 荧光异硫氰酸盐
IXM： Image Xpress Micro筛选系统
ug： 微克
mg： 毫克
mL： 毫升
ng： 毫微克
NHDF： 正常人类真皮成纤维细胞
NHLF： 正常人类肺成纤维细胞
PBS： 经磷酸盐缓冲的盐水
TGF-β1： 转变生长因子-β1
ELISA 酶联免疫吸附试验
FBS 胎牛血清
h 人类
IL 白介素
概述
本文显示TGF-β1是成纤维细胞至成肌纤维细胞转变(FMT)的高效介体，其造成细胞外基质沉积增加且是纤维化疾病的主要驱动因素。此外，这些过程期间存在证明aV整合素与TGF-β之间串扰的实质证据。TGF-β是以含有潜在型相关肽(LAP)区的潜伏形式分泌。TGF-β1的LAP含有与整合素avβ1、avβ3、avβ5、avβ6及avβ8相互作用使得TGF-β1活化的RGD基序。阿吐珠单抗是对aV具有特异性的人类抗体且因此抑制avβ1、avβ3、avβ5、avβ6及avβ8。此研究显示并测定TGF-β对aV整合素及纤维化基因表达的作用及阿吐珠单抗可在活体外阻断TGF-β诱导的基因表达。
整合素的表达是通过RT-PCR来分析且发现人类肺成纤维细胞表达ITGB1＞ITGB5＞ITGB8＞ITGB3。TGF-β诱导的FMT引起ITGB5表达增加且较少程度地增加ITGB1及ITGB3表达。TGF-β处理使肺成纤维细胞中的成肌纤维细胞标记基因增加且免疫荧光染色显示avβ5表达增加。阿吐珠单抗处理使所增加的aSMA表达、IL-6的产生及胶原蛋白凝胶收缩减少且因此证实阻断TGF-β诱导的FMT的能力。
介绍
纤维化疾病的特征为由于细胞外基质的产生、沉积及收缩所致的过度结疤且据信其由成肌纤维细胞的增殖及活化驱动。纤维化疾病代表最大的疾病组之一，其无有效疗法。纤维化过程经由在前纤维化及抗纤维化介体的网络中的一系列复杂的相互作用进行调节。据信TGF-β信号传导在成纤维细胞至成肌纤维细胞转变(FMT)中起重要作用，其造成细胞外基质沉积增加且是疾病的主要驱动因素。
将TGF-β异形体合成为与含有潜在型相关肽(LAP)区的潜伏TGF-β结合蛋白复合的潜伏前体。这些过程期间存在aV整合素与TGF-β之间串扰的实质证据。TGF-β1的LAP含有与整合素avβ1、avβ3、avβ5、avβ6及avβ8相互作用使得TGF-β1活化的RGD基序。阿吐珠单抗为泛-αv整合素抗体，其异位结合至结合配体的aV次单元且因此阻止配体结合至所有αvβ异二聚体且因此抑制潜伏TGF-β的αv整合素依赖性活化且因此阻断成纤维细胞及其他前体获取成肌纤维细胞表达型。本研究提供TGF-β对aV整合素及纤维化基因表达的作用及阿吐珠单抗在正常人类肺成纤维细胞(NHLF)中阻断TGF-β诱导的基因表达的强有力证据。
材料及方法
测试系统
测试系统为来自健康供体的经具有或无潜伏TGF-β的TGF-β1刺激的NHLF。原发性NHLF在TGF-β刺激后上调α平滑肌肌动蛋白(主要读出)。
描述 公司 目录号 批号 组织号
正常人类肺成纤维细胞 Lonza/clonetics CC-2512 0000374386 26789
正常人类肺成纤维细胞 Lonza/clonetics CC-2512 0000343490 25745
正常人类肺成纤维细胞 Lonza/clonetics CC-2512 0000369145 26646
测试材料及刺激
供应及仪器
设计
概述研究设计
NHLF培养基(含有2％FBS的FGM)：FGMTM-2 BulletKitTM(CC-3132)含有一瓶500ml的成纤维细胞基础培养基(CC-3131)及具有以下生长补充料的成纤维细胞子弹套组(CC-4126)：0.5ml hFGF-B(CC-4065J)；0.5ml胰岛素(CC-4021J)；10ml FBS(CC-4101J)；0.5mlGA-1000(CC-4081J)。
用于FMT试验的NHLF培养基(含有0.1％FBS的FGM)：FGMTM-2BulletKitTM(CC-3132)含有一瓶500ml的成纤维细胞基础培养基(CC-3131)及具有以下生长补充料的成纤维细胞子弹套组(CC-4126)：0.5ml hFGF-B(CC-4065J)；0.5ml胰岛素(CC-4021J)；0.5ml FBS(CC-4101J)；0.5ml GA-1000(CC-4081J)。
在试验当天，NHLF是在T150组织培养瓶中于含有2％FBS的FGM中生长，直到它们达到70至80％汇合。在室温下，用6ml经HEPES缓冲的盐水溶液(Lonza目录号CC-5022)淋洗该细胞，用6ml胰蛋白酶/EDTA(Lonza目录号CC-5012)进行胰蛋白酶化持续5分钟。使用6ml胰蛋白酶中和溶液(Lonza目录号CC-5002)灭活胰蛋白酶，在400g下离心沉降4分钟并用含有2％FBS的FGM清洗一次。对于成像研究而言，细胞是以7500个细胞/孔接种于胶原蛋白1Cellware 96孔黑色/透明板中。对于基因表达研究而言，细胞是以50,000个细胞/孔接种于24孔培养板中。在含有2％FBS的FGM中培养细胞8小时。吸出培养基并使细胞于含有0.1％FBS的FGM中饥饿过夜。
为了研究TGF-β对aV整合素、aSMA及基因表达的作用：吸出培养基并添加100ul的含有0.1％FBS的FGM，以含于100ul的含有0.1％FBS的FGM中的2X(20ng/ml)的所需浓度添加TGF-β。72小时后，收集培养基并在-80℃下储存以用于IL-6检测。
为了研究阿吐珠单抗对TGF-β所诱导的成纤维细胞成肌纤维细胞转变(FMT)中的作用，NHLF是以7500个细胞/孔接种于胶原蛋白1Cellware 96孔黑色/透明板中，在含有2％FBS的FGM中培养8小时。吸出培养基并使细胞于含有0.1％FBS的FGM中饥饿过夜。吸出培养基并添加100ul含有浓度为25ng/ml的阿吐珠单抗或抗-HEL IgG的含0.1％FBS的FGM并培养30分钟。以含于100ul的含有0.1％FBS的FGM中的2X(潜伏TGF-β1＝40ng/ml，TGF-β＝0.312ng/ml)的所需浓度添加TGF-β。72小时后，收集培养基并在-80℃下储存以用于IL-6检测。
对于使用免疫荧光的aV整合素、aSMA表达研究而言，固定细胞并根据α平滑肌肌动蛋白(αSMA)及aV整合素染色程序进行染色。对于FMT相关基因表达分析而言，在-80℃下储存细胞直到准备用于RNA单离及RT-PCR。
α平滑肌肌动蛋白及aV整合素免疫荧光染色：用PBS清洗细胞2次(200ul于96孔板中)，并随后使用固定/渗透溶液在室温下固定45分钟(50uL于96孔板中)。随后用1X BD渗透洗涤缓冲液(经蒸馏水以1:10的稀释度稀释)在5分钟的培育下清洗细胞3次。在室温下使用Odyssey阻断缓冲液(50ul于96孔板中)阻断细胞60分钟。用1X BD渗透洗涤缓冲液(200ul于96孔板中)清洗板2次，在各次清洗之间培育5分钟。在洗涤缓冲液中以1:100的稀释度添加抗-SMA抗体。以1ug/ml含于渗透缓冲液中作为最终浓度使用抗-整合素Ab并在室温下培育3小时。随后用1X BD渗透洗涤缓冲液(200ul于96孔板中)清洗板2次。以最终体积为100ul在渗透洗涤缓冲液中以1:200的稀释度使用与Alexa Fluor 488共轭的二级Ab山羊抗-小鼠IgG且以1:100的稀释度使用与Alexa Fluor 647共轭的二级Ab山羊抗-兔IgG并在室温下培育1小时。用200ul 1X BD渗透洗涤缓冲液清洗细胞2次，在各次清洗之间培育5分钟。将DAPI以1:1000的稀释度添加至洗涤缓冲液中并添加200ul至板，在室温下培育5分钟，吸出溶液并用200ul 1X BD渗透洗涤缓冲液更换。
对于基因表达分析而言。根据包括于RNeasy 96套组(Qiagen)中的“使用真空技术从动物细胞单离细胞质RNA的RNeasy 96程序”提取RNA。根据RT2分析工具PCR阵列手册(Qiagen)中所述的程序，在用于Applied Biosystems循环器的循环条件下使用RT2 FirstStrand套组及用于RT2分析工具PCR阵列的实时PCR，来完成cDNA合成。
对于凝胶收缩试验而言：使用HEPES淋洗在T150中生长的人类成纤维细胞一次并移除上清液，并将6ml胰蛋白酶添加至各烧瓶中(于室温下5分钟)，添加6ml胰蛋白酶中和溶液并通过在400g下的离心收集细胞。在含有2％FBS的FGM中且以2x 106个细胞/ml再悬浮细胞。用10ug/ml阿吐珠单抗或抗-HELIgG处理细胞15分钟。通过混合2份(120ul)的“经处理的”细胞悬浮液及8份(480ul)的有或没有TGF-β(10ng/ml)的冷胶原蛋白凝胶溶液来形成胶原蛋白晶格。将500ul细胞-胶原蛋白混合物转移至24孔板的各孔中，在37℃下培育1小时。胶原蛋白聚合后，将1ml的培养基添加至各胶原蛋白凝胶晶格的顶部。使用无菌抹刀轻柔地刮起胶原蛋白凝胶，让凝胶浮于培养基中。监测胶原蛋白凝胶尺寸持续5天并在第5天拍摄照片。
读出
用于成像的板读取程序
使用Image Xpress Micro(IXM)机器及MetaXpress软件程序进行图像采集及分析。对于3种颜色染色：DAPI、FITC及Cy5时，使用板采集成像程序：“2014-YW-SMA-Int-DAPI-647-10x”。对于2种颜色染色：DAPI及FITC染色时，使用板采集成像程序：“2014-YW-SMA488-DAPI-10x”。对于数据分析而言，使用多波长细胞得分分析参数程序“2014-5-7-YW-SMA488-DAPI-4x-2 para a”来定量由FMT所诱导的SMA纤维的量。以BMP档案下载各个孔的图像。
IL-6 ELISA
遵循制造商使用说明，使用市售IL-6 ELISA试验(Human Duoset IL-6，R&DSystems)测定人类IL-6的水平。使用Spectramax M5e读数器(Molecular Devices)进行在450nm下的光学密度读数(OD)并自使用来自IL-6内标的OD读数计算的四参数逻辑曲线拟合来外推出各样本的IL-6浓度。
基因表达分析
在RT-PCR完成在QuantStudio 12k flex Applied Biosystem循环器中的运行后，将所有孔的CT值下载至Excel电子表格用于计算相对表达。
所用的计算机程序
相对基因表达(基础水平)及倍数变化计算
CT阈值循环。CT是反应中生成的荧光与阈值线交叉的循环次数。CT值为对数且是直接用于定量分析。
对于相对基因表达(基础水平)而言：
计算ΔCT值。ΔCT＝CT目标–CT参照(GAPDH)
计算2–ΔCT作为基础水平的相对基因表达。
对于相对基因表达(处理后的倍数变化)而言：
计算ΔCT值。ΔCT＝CT目标–CT参照(GAPDH)
计算ΔΔCT值。ΔΔCT＝ΔCT测试样本(经处理)–ΔCT校准样本(未经处理)
标准化为内源参照基因(例如，GAPDH)且相对于校准基因(处理前或对照)的目标基因的量由2–ΔΔCT给定。
结果
TGF-β增加人类肺成纤维细胞中的整合素的表达(也参见图3)
通过RT-RCR分析NHLF中的整合素的表达并发现NHLF在稳态下表达整合素且表达水平的顺序为ITGB1＞ITGB5＞ITGAV＞ITGB8＞ITGB3。假定aV整合素与TGF-β之间存在串扰，因此，我们关注TGF-β在FMT试验的整合素表达中的作用。我们发现TGF-β所诱导的FMT引起ITGB5的表达增加且较少程度地增加ITGB1及ITGB3表达；免疫荧光染色显示avβ5表达增加(参见图3：TGF-β增加人类肺成纤维细胞中的整合素的表达)。
TGF-β增加肺成纤维细胞中的aSMA、IL-6及其他成肌纤维细胞标记基因的表达(也参见图4)
TGF-β处理使IL6产生及α平滑肌肌动蛋白表达增加，如通过免疫荧光及RT-PCR所检测。TGF-β处理使成肌纤维细胞标记基因(诸如α平滑肌、胶原蛋白、纤维连接蛋白、SERPINE1、SNAI1、骨膜蛋白、N-钙黏附素(N-Caherin))在肺成纤维细胞中的表达增加(参见图4：TGF-β增加肺成纤维细胞中的aSMA、IL-6及其他成肌纤维细胞标记基因的表达)。
阿吐珠单抗处理成纤维细胞培养物减少TGF-β所诱导的aSMA及IL-6的增加(也参见图5)
如图1所示，TGF-β增加整合素的表达，在此实验中我们以次优剂量的活性TGF-β结合高剂量的潜伏型TGF-β处理NHLF来增加整合素的表达。潜伏及活性TGF-β1的组合与单独潜伏型或活性型相比诱导更多数量的细胞表达aSMA。阿吐珠单抗处理减少由TGF-β活化引起之aSMA表达、IL-6产生及FMT基因表达(参见图5：阿吐珠单抗处理成纤维细胞培养物减少TGF-β所诱导的aSMA及IL-6的增加)。
阿吐珠单抗处理减少TGF-β所诱导的胶原蛋白凝胶收缩(也参见图6)
在成纤维细胞收缩研究中使用3维胶原蛋白凝胶分析。为了测定由TGF-β1及阻断aV整合素而非阿吐珠单抗引起的aSMA蛋白质中的改变是否具有功能性结果，进行胶原蛋白凝胶收缩分析。当将阿吐珠单抗添加至细胞时，其减少由添加TGF-β所引起的收缩度(参见图6：阿吐珠单抗处理减少TGF-β所诱导的胶原蛋白凝胶收缩)。
讨论
在此报告中，我们显示TGF-β使aV整合素、aSMA及其他FMT基因(诸如胶原蛋白、纤维连接蛋白、SERPINE1、SNAI1、骨膜蛋白、N-钙黏附素)在人类肺成纤维细胞中的表达增加。阿吐珠单抗处理成纤维细胞培养物减少TGF-β所诱导的aSMA、IL6、CTGF、SERPINE、PLOD的增加。
已证明阿吐珠单抗在细胞外基质过度产生的部位阻断αv整合素依赖性活化潜伏TGF-β。本文中我们证明，当在活体外培养系统中使用时，阿吐珠单抗阻断成纤维细胞成肌纤维细胞转变。TGF-β上调aV整合素，其阻断αv整合素依赖性活化潜伏TGF-β，阻断成肌纤维细胞膜上整合素的局部上调，且因此能够中断TGF-β活化与成肌纤维细胞累积的恶性循环。
文献
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附录
用于RT-PCR的基因列表
实施例3：
阿吐珠单抗对αvβ6结合至潜在型相关肽(LAP)的作用
缩写列表
αSMA： α平滑肌肌动蛋白
ECM： 细胞外基质
ug： 微克
mg： 毫克
mL： 毫升
LAP： 潜在型相关肽(LAP)
LTBP： 潜伏TGF-β结合蛋白质
ng： 毫微克
TGF-β1： 转变生长因子-β1
ELISA： 酶联免疫吸附试验
h： 人类
IL： 白介素
概述αvβ3、αvβ3、αvβ6及αvβ8可控制TGF-β的活化
TGF-β1为在多种器官的组织纤维化的发展中起重要作用的主要前纤维化细胞因子。TGF-β1经由促进组织成纤维细胞分化成成肌纤维细胞从而促成纤维化。成肌纤维细胞可产生细胞外基质(ECM)蛋白质，且是在纤维化期间ECM扩张及收缩的主要驱动因素。TGF-β1是以潜伏复合物(complex)分泌，除了TGF-β1还包含潜在型相关肽(LAP)及潜伏TGF-β结合蛋白(LTBP)。当LTBP锚定至ECM且LAP在αv次单元上结合αv整合素(即，αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6及αvβ8)的一者时，该复合物可采用开放构型以释放活性TGF-β1。
阿吐珠单抗是对αv整合素的配体结合αv次单元具有特异性的人类抗体。一旦结合至αv次单元，阿吐珠单抗可阻止αv整合素结合至其配体诸如LAP。此研究的目标为评估阿吐珠单抗阻断LAP结合至αvβ6的能力。
通过使用基于抗-αvβ6的ELISA试验，我们证实阿吐珠单抗能够以剂量依赖性方式阻断αvβ6结合至预涂覆至ELISA板的LAP。该发现结果清楚地证实阿吐珠单抗阻断αv整合素结合至LAP(TGF-β活化中的关键步骤)的能力。此形成开发阿吐珠单抗用于治疗纤维化疾病的科学依据的一部分。
介绍
TGF-β1(主要前纤维化细胞因子)在多种器官的组织纤维化的发展中起重要作用。TGF-β1经由促进组织成纤维细胞分化成成肌纤维细胞从而促成纤维化。成肌纤维细胞可产生细胞外基质(ECM)蛋白质并收缩。它们是在纤维化期间ECM扩张及收缩的主要驱动因素。TGF-β1是以潜伏复合物分泌，除了TGF-β1，还包含潜在型相关肽(LAP)及潜伏TGF-β结合蛋白质(LTBP)。当LTBP锚定至ECM且LAP在αv次单元上结合αv整合素(即，αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6及αvβ8)的一者时，该复合物可采用开放构型以释放活性TGF-β1。
本研究的目的为评估阿吐珠单抗阻断LAP结合至αvβ6的能力。
材料及方法
材料
测试系统
测试系统为竞争性结合分析，其中使用重组型人类LAP涂覆板且随后在存在或不存在阿吐珠单抗(也称为DI17E6)下用重组型人类αvβ6培育。通过ELISA，使用兔抗αvβ6抗体(捕获抗体)及与辣根过氧化酶(HRP)共轭的山羊抗-兔IgG(检测抗体)来检测结合至LAP的αvβ6的量。
材料及仪器
关键材料
关键设备
对于其他材料及设备而言，参见报告SWE00174。
涂覆缓冲液(含于双蒸馏水中)：
200mM Tris
150mM NaCl
用HCl调节pH值至7.4
+1mM CaCl2；1mM MgCl2；0.01mM MnCl2
阻断缓冲液(含于双蒸馏水中)：
50mM Tris
100mM NaCl
用HCl调节pH值至7.4
+5mg/ml BSA
洗涤及稀释缓冲液(含于双蒸馏水中)：
200mM Tris
150mM NaCl
用HCl调节pH值至7.4
+1mM CaCl2；1mM MgCl2；0.01mM MnCl2
+0.1mg/kg BSA
实验设计
概述研究设计
用LAP涂覆板。将重组型人类LAP以0.1μg/ml的最终浓度添加至板并在4℃下培育过夜使板经LAP涂覆。随后排干板并在37℃下用100μl的阻断缓冲液培育2小时以阻断αvβ6非特异性结合至板。
将αvβ6与阿吐珠单抗或对照抗体添加至经LAP涂覆的板。将50μl的预稀释阿吐珠单抗或对照抗体以从高到低的连续稀释的浓度添加至各孔。随后将50μl的αvβ6溶液添加至各孔。抗体的最终浓度为2.5μg/ml至0.16ng/ml，且αvβ6的最终浓度为0.25μg/ml。
将阿吐珠单抗的作用与其他两种抗-αvβ6抗体：MSB0011521H-1及10D5比较。使用IgG2a作为阿吐珠单抗的同型对照IgG。抗-HEL(MSB0011523H-1)是对非哺乳动物蛋白质(芥菜属(Arabidopsis)的Hevein-样前原蛋白)具有特异性的抗体，且是作为MSB0011521H-1的阴性对照抗体使用。17E6是原始非脱免疫小鼠泛抗-αv抗体，阿吐珠单抗或DI17E6是从其衍生而来。以与阿吐珠单抗或DI17E6相同的浓度添加这些抗体。
在37℃下用αvβ6与阿吐珠单抗或其对照抗体培育板60分钟。随后清洗板用于添加二级抗体。
添加经HRP共轭的山羊抗-兔IgG至板，显色并读数。添加经HRP共轭的山羊抗-兔IgG至板并在37℃下培育90分钟。随后添加R&D底物试剂(Pack DY999)至板并在添加R&D停止溶液DY994使反应停止前培育20分钟以显色。随后在Tecan ELISA读取器InfiniteM200上以450nm读板。
读出
通过使用ELISA测量αvβ6至LAP的结合。结合至LAP的αvβ6的量是通过使用上文研究设计中所描述的程序来测定。
结果
阿吐珠单抗抑制αvβ6结合至LAP(也参见图7)
通过基于特异性抗αvβ6抗体的ELISA来检测αvβ6至预涂覆LAP的结合。当DI17E6与αvβ6在经LAP预涂覆的板中共同培育时，DI17E6以浓度依赖性方式阻断该结合。抗-αvβ6抗体MSB0011521H-1及10D5也抑制该结合。相反地，同型对照IgG2或阴性对照抗体(抗-HEL、MSB0011523H-1)均不显示任何抑制作用。αvβ3整合素特异性抑制抗体LM609也不抑制αvβ6结合至LAP。该发现结果指示DI17E6特异性抑制αvβ6结合至LAP。
通过使用ELISA测量αvβ6至LAP的结合。结合至LAP的αvβ6的量是通过使用上文研究设计中所描述的程序来测定。
结果
阿吐珠单抗抑制αvβ6结合至LAP
通过基于特异性抗αvβ6抗体的ELISA来检测αvβ6至预涂覆LAP的结合。当DI17E6与αvβ6在经LAP预涂覆的板中共同培育时，DI17E6以浓度依赖性方式阻断该结合。抗-αvβ6抗体MSB0011521H-1及10D5也抑制该结合。相反地，同型对照IgG2或阴性对照抗体(抗-HEL、MSB0011523H-1)均不显示任何抑制作用。αvβ3整合素特异性抑制抗体LM609也不抑制αvβ6结合至LAP。该发现结果指示DI17E6特异性抑制αvβ6结合至LAP。
研究报告表
讨论
在此研究中，我们证明阿吐珠单抗(DI17E6)特异性且浓度依赖性地抑制αvβ6结合至LAP。该发现结果清楚地证实阿吐珠单抗阻断αv整合素结合至LAP(一个TGF-β活化中的关键步骤)的能力。此证据形成将阿吐珠单抗用于治疗纤维化和/或纤维化疾病的科学依据的重要部分(也参见图7：图7显示阿吐珠单抗对αvβ6结合至LAP的抑制作用)。以含有αvβ6(未经处理)的孔相比空白孔(不含αvβ6的缓冲液)在光学密度上增加来检测αvβ6至经涂覆的LAP的结合。将数值标准化，其中前者为100％且后者为0％。两个批次的DI17E6(批号40350及13245)均以浓度依赖性方式减少αvβ6至LAP的结合，与抗-αvβ6抗体MSB0011521H-1相似，但比抗-αvβ6抗体10D5更好。相反地，同型对照IgG(IgG2)或阴性对照抗体(抗-HEL、MSB0011523H-1，数据未显示)在相同浓度范围内均不影响该结合。同样，αvβ3特异性抑制抗体LM609不抑制αvβ6结合至LAP。
实施例4：
纤维化/系统性硬化症基因特征
概述
·此研究的目标为寻找用于诊断及监测患有系统性硬化症(SSc)的患者中纤维化的状态的稳健的基因特征。
·使用以下双重策略识别特征基因：
ο预定义基于文献的基因的列表并测试在所公开的基于微阵列的基因表达的数据中在SSc皮肤中的上调。
ο在所有基因的无偏性分析中，使用三个公开SSc数据组来寻找在SSc皮肤中上调的候选基因。
·另外，在两个公开的基因组规模的基因表达的数据组中针对它们与肺纤维化的关联过滤预最终候选基因列表。
·最后，针对免疫相关组织相比实体组织上调来过滤候选基因列表。
·总之，我们能够通过分析五个适当数据组找到在SSc及肺纤维化组织中上调的19个非免疫相关基因的稳健特征。
·在由TGF-β补充或与来自人类上皮H358肺细胞系的细胞共同培养的人类成纤维细胞实验中，包括于TGF-β-上升/阿吐珠单抗-下降特征(下文称为TUAD特征)中的基因在施用TGF-β后显示上调(中值倍数变化，在3次重复实验中)。
·另外，使9个基因的最终TUAD特征经历正常人类肺成纤维细胞(NHFL)实验，其与人类H358细胞共同培养并经两次剂量的抗-HEL(鸡蛋溶菌酶)或阿吐珠单抗处理。接受TUAD作为可通过阿吐珠单抗下调的与TGF-β关联的纤维化特征，因为a)9-基因特征中的所有基因在阿吐珠单抗处理后下调，及b)因为TUAD 9-基因特征净得分下调。
介绍
此研究旨在使用双层处理程序寻找用于监测患有系统性硬化症(SSc)的患者的纤维化的稳健的基因特征。据报导在SSc及经TGF刺激的成纤维细胞中上调的基于文献的基因以及具有在公开数据组中患有SSc/纤维化的患者中上调的强有力证据的基因经历进一步分析以最终获得用于SSc及IPF中的纤维化的稳健基因特征。
此外，我们进行nanostring表达图谱分析实验来识别通过TGF-β上调的基因的另一特征(称为TUAD特征)，因此其代表19基因特征的TGF-β依赖性基因子群。最后，我们使此TUAD特征经历另一实验以测试阿吐珠单抗是否可下调TUAD特征。
材料
我们使用以下数据组来评定在SSc/纤维化中上调的基因。可在Gene ExpressionOmnibus(GEO)数据库中获取数据组。
通过计算每个基因的探针设定强度的平均值来获得基因表达。
系统性硬化症数据组
GSE9285(Milano等人，2008)总共包括75个样本。从17位患有弥漫性SSc(dSSc)的患者、7位患有局限性SSc(lSSc)的患者、3位患有硬斑病的患者及6位健康对照的前臂及背采取皮肤活组织检查。
数据组GSE32413(Pendergrass等人，2012)由总共89份皮肤活组织检查样本组成。对22位患有SSc的患者及9位健康对照测量基因表达。SSc患者中的13位用利妥昔单抗(rituximab)处理，其他9位未经处理。我们将基线/处理前样本用于评定SSc皮肤与正常皮肤之间的差异表达并排除在处理后6个月及36个月所采的活组织检查。
GSE45485(Hincliff等人，2013)总共包括来自12位经霉酚酸吗啉乙酯(MMF)处理的SSc患者及10位健康对照的83份皮肤活组织检查。在该分析中仅包括来自SSc患者的基线(处理前)样本，排除在MMF处理后6个月及12个月所采的样本。
肺纤维化数据组
GSE24206(Meltzer等人，2011)17份来自11位患有早期/晚期特发性肺纤维化(IPF)的患者的肺样本。6位患者提供一对来自上肺叶及下肺叶的样本，5位患者捐献单件样本。从健康供体肺在肺移植时的常规肺容积减少获得6份对照样本。
数据组GSE48149(未公开)总共包括53份肺样本。包括8位患有特发性肺动脉性高血压(IPAH)的患者、13位患有IPF的患者、10位患有由SSc引起的肺动脉性高血压(SSc-PAH)的患者及13位患有由SSc引起的肺纤维化(SSc-PF)的患者以及9位健康对照。GSE21369包括来自23个受试者的29份肺组织样本。使用11位经诊断患有常见间质肺炎/特发性肺纤维化(UIP/IPF)的患者及6位对照的数据，排除患有非特异性间质肺炎的患者的样本。
免疫相关数据组
此研究使用包括于数据组GSE1133(Su等人，2004)中的28个免疫相关组织及118个非免疫/非癌症组织的基因表达。
验证数据组
数据组GSE22459(Park等人，2010)包括65位在1年程序活组织检查中伴有纤维化及发炎征兆的肾移植接受者。
数据组GSE61260(Hovarth等人，2014)包括134份Nash(非酒精性脂肪性肝炎)、PSC(原发性硬化性胆管炎)、PBC(原发性胆汁性胆管炎)、NAFLD(非酒精性脂肪肝病)、健康肥胖及正常肝样本。
数据组GSE48452(Ahrens等人，2013)包括73份来自Nash(非酒精性脂肪性肝炎)、脂肪变性、健康肥胖及正常肝的样本。
数据组GSE49541(Moylan等人，2014)包括72位患有NAFLD的患者(40位患有轻度NAFLD，纤维化阶段0-1及32位患有晚期NAFLD，纤维化阶段3-4)。
数据组GSE39491(Hyland等人，2014)包括120份来自43位BE患者的鳞状食道(NE)及胃贲门(NC)的巴雷特化生及匹配正常黏膜样本。
数据组GSE26886(Wang等人，2013)包括20份巴雷特食道患者的样本、21份腺癌患者的样本及19份来自患有正常食道鳞状上皮组织的患者的活组织检查、9份鳞状细胞癌的样本。
数据组GSE37200(Silvers等人，2010)包括31份巴特雷食道及15份腺癌样本。
数据组GSE47460(未公开)总共包括582位受试者，其中254位患有间质性肺病、220位患有COPD及108位为对照。
数据组GSE24988(Mura等人，2012)包括116份来自经历肺移植的PF患者的接受者器官的样本。
数据组GSE17978(Emblom-Callahan等人，2010)包括来自患有末期特发性肺纤维化的患者的12个肺及6位供体的正常肺(对照)的58份样本。
数据组GSE53845(DePianto等人，2015)包括来自40位IPF患者及8位健康对照的样本。
数据组GSE44426(Desterke等人，2015)包括6份来自原发性骨髓纤维化的骨髓样本及6份对照样本。
经TGF-β或阿吐珠单抗处理的正常人类成纤维细胞的两个数据组
数据组包括19个纤维化特征基因中的17个的表达数据。该17个基因中的三个的表达是低于量化下限(LLOQ)。第一数据组(AB001)因此包括14个基因的表达水平，在9份样本中测量。该九份样本可分成三个样本组：仅NHLF、NHLF+TGF-β、NHLF+H358。第二数据组(AB002)包括十一份样本：经40ng/ml抗-HEL处理的NHLF(重复3次)、经40ng/ml阿吐珠单抗处理的NHLF(重复2次)、经10μg/ml抗-HEL处理的NHLF(重复3次)、经10μg/ml阿吐珠单抗处理的NHLF(重复3次)。
特征得分
我们发现我们的19-基因及9-基因特征可以多种方式进行评分以获得支持我们的权利要求的结果。
表达原强度可进行对数换算或不进行换算。
Z-标准化：在多样本(＞＝9)数据组中，各基因表达载体可以平均值或中位数为中心并进行标准化以获得表达Z得分。
使用处理前强度作为参考的标准化：比率可由处理前的表达强度与处理后的表达强度计算。这些比率可任选地进行对数标度化。
每个样本的特征总分经计算为跨基因的总和、平均值或加权平均值。
基于文献的基因列表
Daigen Xu(TIP免疫学)已经提出在SSc及经TGF刺激的成纤维细胞中与上调相关联的143个基因，其包括四个来自预示患有弥漫性SSc的患者的皮肤疾病的“Lafyatis特征”的基因(Farina等人，2010)。135个是于三个SSc数据组的至少一个中进行测量。该135个基因的列表可参见表9。
所用的计算机程序
识别所需纤维化/SSc特征的策略
在图中概述识别所需纤维化/SSc特征的策略。我们区分文献衍生及非文献衍生基因之间的差异。两个基因组均在三个SSc数据组中进行测试，在肺纤维化数据组中过滤并最终再次于肺纤维化数据组中验证。在下一部分中详细描述单一步骤。
步骤1：获得预最终基因列表
为了获得纤维化/SSc相关基因的候选列表，我们对每个基因在各SSc数据组中进行差异表达分析的中等t-检验，如R bioconductor软件包limma(Smyth，2004)中所实施。以对比“SSc-正常”样本对每个基因的线性模型进行拟合。考虑到线性模型拟合，通过标准误差至通用值的经验贝氏(Bayes)改良法计算中等t-统计。通过控制错误发现率(FDR)的Benjamini Hochberg程序(Benjamini及Hochberg，1995)调整多项测试的p值。
基于文献分析的基因的分析
在如上所述的三个SSc数据组中，测试所有基因于SSc与正常皮肤之间的差异表达。若来自文献的经预定义的基因满足以下准则，则它们是包括于纤维化基因的预最终列表中：
·基因必须在三个公开SSc数据组的至少一个中显著上调(经调整的p值＜0.05)及
·基因必须在三个数据组的任一个中未显著下调。
没有基因因在数据组中同时显著上调或下调而排除。135个来自文献的经预定义的基因中的40个满足这些准则。
基于公开数据采集的其他纤维化/SSc基因
对于非由文献所预定义的所有其他基因而言，收紧准则。若满足以下准则，则基因是包括于上调纤维化/SSc基因的预最终列表中：
·基因必须在三个公开SSc数据组的(至少)两个中显著上调(经调整的p值＜0.05)及
·基因必须在三个数据组的任一个中未显著下调。
发现62个非衍生自文献的基因与健康皮肤相比在SSc中上调。虽然由于在一个SSc数据组中明显下调而排除62个基因中的两个，但是产生60个基因考虑用于进一步分析。
总共有100个基因包括于上调纤维化/SSc基因的预最终列表中。
步骤2：针对在肺纤维化中的差异表达过滤预最终基因列表
两个数据组(GSE24206及GSE48149)是用于评定在SSc中发现上调的基因是否在肺纤维化(PF)中同样上调。100个基因中的96个存在于至少两个PF数据组中。我们使用中等t-检验以四种比较测试该96个基因在纤维化肺组织中的上调：
1.GSE24206：正常对早期IPF
2.GSE24206：正常对晚期IPF
3.GSE48149：正常对IPF
4.GSE48149：正常对SSc-PF
为了通过此过滤步骤，基因需要在至少两个比较中显著上调(经BenjaminiHochberg调整的p值＜0.05)且在任何比较中未显著下调。
步骤2后留下20个候选基因。
步骤3：针对在免疫相关组织中的上调过滤预最终基因列表
对于来自纤维化/SSc相关基因的候选列表的剩余基因，我们对每个基因在正常组织数据组GSE1133中进行差异表达分析的中等t-检验，如R bioconductor软件包limma中所实施。以对比“免疫-其他”样本对每个基因的线性模型进行拟合。考虑到线性模型拟合，通过标准误差至通用值的经验贝氏改良法计算中等t-统计。通过控制错误发现率(FDR)的Benjamini Hochberg程序调整多项测试的p值。由于在免疫相关对比其他正常(非癌症)组织样本中上调而排除一个基因(BIRC3)。
纤维化/SSc 19-基因特征
通过文献的先现有知识及公开可得数据组的基因表达信息，我们组成由19个在SSc及肺纤维化中上调的非免疫相关基因所组成的真实纤维化/SSc特征。表9显示基因的完整列表。
19个基因的表达数据是经标准化(按照数据组)，即以平均值为中心并对样本标准化。使用19个基因中的平均值作为每个样本的特征得分。
纤维化/SSc TGF-β上升/阿吐珠单抗下降(TUAD)9-基因特征
我们旨在选择TGF-β上升/阿吐珠单抗下降特征的基因作为19基因特征的子集基因。因此，我们进行了以下实验。由TGF-β补充正常人类肺成纤维细胞(NHLF)且与来自人类上皮H358肺细胞系的细胞共同培养。对于纤维化特征的19个基因中的14个而言，我们能够得到表达信号。对于包括于TGF-β-上升/阿吐珠单抗-下降特征(下文称为TUAD特征)中的基因而言，其在施用TGF-β后显示上调(中值倍数变化，在3次重复实验中)。使用此准则，我们选出9个基因。这些9个基因构成我们的9-基因TUAD特征(参见表9，由*表示)。
另外，使9个基因的最终TUAD特征经历正常人类肺成纤维细胞(NHFL)实验，其与人类H358细胞共同培养并经40ng/ml及10μg/ml的抗-HEL(鸡蛋溶菌酶)或阿吐珠单抗处理(参见上文数据组的描述)。
我们发现当与抗-HEL对照组比较时，9个基因(其先前发现由TGF-β上调)中的每个可通过阿吐珠单抗下调。因此，TUAD 9-基因特征代表可通过阿吐珠单抗下调的TGF-β可诱导纤维化特征，由以下证实：a)与抗-HEL相比，9-基因特征中的所有基因在阿吐珠单抗处理后下调；及b)与抗-HEL相比，TUAD 9-基因特征净得分在阿吐珠单抗处理后下调。
包括在纤维化/SSc特征中的19个基因的差异表达分析结果示于表10、表11及表12中，以比较SSc与正常皮肤，示于表13中以比较SSc-PF与正常肺，示于表14中以比较UIP/IPF与正常肺，示于表15中以比较早期IPF与正常肺，及示于表16中以比较晚期IPF与正常肺。
所有19个纤维化/SSc特征基因均不在免疫相关对非免疫相关组织中上调(表17)。
19-基因纤维化/SSc及9-基因TUAD特征的性能
虽然在不同数据组中单一基因如RGS5在SSc中与正常皮肤比较(图9)及例如COL15A1、COL1A1、COMP、IGFBP2a及SSP1在IPF及SSc-PF中与正常肺比较(图10至图14a)显示上调表达，但是衍生自19-基因纤维化/SSc特征及9-基因TUAD特征的特征得分提供更稳健的用于监测皮肤(图14b、图15a、图15b、图16a及图16b)、肺(图17a、图17b、图18a及图18b)、肝(图19a、图19b、图20a、图20b、图21a及图21b)及骨髓(图22a及图22b)中的纤维化的信号。
对于无对照组织表达数据的食道及肾纤维化而言，包括于19-基因纤维化/SSc及9-基因TUAD特征中的基因是经协调表达，由高于通过1000次重复获得的随机期望相干性得分(Staub，2012)表示(表18)。
在肝样本(GSE61260)中，19-基因纤维化/SSc及9-基因TUAD特征的特征得分与纤维化得分良好地相关(如在Hovarth等人，2014中所述)，其中Spearman相关系数各自为0.505及0.523(表19)。
结论
因为我们的TUAD多基因表达特征可通过经阿吐珠单抗处理而下调，且因为其与多种纤维化疾病中的疾病严重程度和/或纤维化度相关(如前述段落中所提及)，所以TUAD特征可视为纤维化疾病中的高临床需要的指标。TUAD特征可用于阿吐珠单抗疗法的患者选择：TUAD特征的高基线/处理前水平可用于选择患者，对该患者而言阿吐珠单抗具有实现治疗成功的最高可能性，因为我们不仅证实高TUAD特征状态与纤维化疾病状态相关，而且证实阿吐珠单抗可有效下调TUAD特征。此外，TUAD特征可用于监测纤维化，因为我们已经证实与疾病严重程度相关，且因为已经证实的阿吐珠单抗使TUAD特征下调的能力，因此其也可用于监测阿吐珠单抗有效性。因为所提及的TUAD特征充当预测疗法反应的标记的能力，及因为与多种纤维化疾病中的疾病严重程度或纤维化的存在相关，我们认为阿吐珠单抗是可用于对抗一般所有纤维化疾病的药剂。
表格
表8在三个SSc数据组的至少一个中存在的在SSc及经TGF刺激的成纤维细胞中上调的基于文献的基因列表
表9 19-基因SSc/纤维化特征及9-基因TUAD特征(由*标记的基因)
表10 GSE45485中比较SSc与正常皮肤样本的19纤维化/SSc特征基因的中等t-检验的结果
logFC＝log倍数变化(从正常皮肤至SSc)
表11 GSE32413中比较SSc与正常皮肤样本的19纤维化/SSc特征基因的中等t-检验的结果
logFC＝log倍数变化(从正常皮肤至SSc)
表12 GSE9285中比较SSc与正常皮肤样本的19纤维化/SSc特征基因的中等t-检验的结果
logFC＝log倍数变化(从正常皮肤至SSc)，NA＝不可用(GSE9285中未测量ADRA2A)
表13 GSE48149中比较SSc-PF与正常肺样本的19纤维化/SSc特征基因的中等t-检验的结果
logFC＝log倍数变化(从正常肺至SSc-PF)
表14 GSE48149中比较UIP/IPF与正常肺样本的19纤维化/SSc特征基因的中等t-检验的结果
logFC＝log倍数变化(从正常肺至UIP/IPF)
表15 GSE24206中比较早期IPF与正常肺样本的19纤维化/SSc特征基因的中等t-检验的结果
logFC＝log倍数变化(从正常肺至早期IPF)
表16 GSE24206中比较晚期IPF与正常肺样本的19纤维化/SSc特征基因的中等t-检验的结果
logFC＝log倍数变化(从正常肺至晚期IPF)
表17 GSE1133中比较免疫相关与非免疫/非癌症样本的19纤维化/SSc特征基因的中等t-检验的结果
logFC＝log倍数变化(从非免疫相关至免疫相关样本)
表19 GSE61260中19-基因SSc/纤维化特征及9-基因TUAD特征的特征得分与发炎、NAS(NADLF活性得分)及纤维化得分之间的Spearman相关性
文献目录
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实施例5：
I期研究临床研究
启动I期试验来测定经DI17E6处理的CRPC患者的安全性、药物动力学(及抗肿瘤活性)，包括对前列腺特异性抗原、循环肿瘤细胞(CTC)及软组织及骨转移的作用。所有患者在化学疗法后均罹患进展性疾病。经由历时1小时提供的250、500、1000或1500mg DI17E6的iv-输注来处理患者。
合格患者为18岁或更大且患有组织学或细胞学上所证明的前列腺癌，其证据为在现有化学疗法后骨转移。患者曾经历双侧睾丸切除术或接受使用促性腺激素释放激素促效剂或拮抗剂的持续雄激素剥夺疗法且在登记前已经停止抗雄激素疗法至少4周。要求患者处于稳定(即，至少3个月)持续双膦酸酯疗法或不经任何双膦酸酯疗法，其总血清睾酮水平低于50ng/dL。所有患者具有进行性疾病的证据，该进行性疾病定义为至少两种前列腺特异性抗原(PSA)值以10％的最小增加高于各个最低点水平，各值在筛选前至少两周进行测定；结节或内脏进展针对与PSA无关包含是足够的。此外，患者必须具有0至2的东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)得分、至少3个月的预期寿命及充足的血液、肾及肝功能。各研究中心的人体试验委员会核准该研究程序，且所有患者均提供书面知情同意书。
在此1期，多中心开放标签剂量递增研究中，在第6周结束时的反应评定之前，对mCRPC患者以每两周历时1小时提供的250、500、1000或1500mg的剂量施用三次静脉输注的EMD 525797。无进行性疾病证据的患者有资格接受进一步双周剂量直到疾病进展或不可接受的毒性。在首个六周期间评估剂量限制性毒性(DLT)并在最后一次施用EMD 525797之后出于安全性对患者进行为期四周的随访。在四个循序剂量群组中招募患者；在剂量群组内的6位患者中最后一位达到第6周结束时，安全性监测委员会测定后续剂量递增。
招募二十六位年龄在43岁与80岁之间(中值年龄，66岁)的男性患者并使它们接受至少一次静脉输注的EMD 525797，它们构成安全性群体。所有患者均为高加索人起源。一般而言，人口特征在四个剂量群组中是可相比较的(表1a)，其中从首次诊断的中值时间为5.2年(范围，2至18年)及从诊断至首次转移性疾病的中值时间为0.1年(范围，0至16年)。两位患者在DLT周期结束之前退出且随后由在处理6周期间接受三剂量EMD 525797的24位患者取代。
表1a.患者基线人口统计(安全性群体)。
BMI，体重指数；
总结(表1b)：
来自此I期临床试验的临床结果是在德国的3个地点及比利时的1个地点进行。
治疗持续时间
在第6周结束时的反应评定之前，24位患者(43至80岁)接受3次剂量(第1、3及5周)。在首个6周期间评估剂量限制性毒性(DLT)并在最后一次施用DI17E6之后出于安全性对患者进行为期4周的随访。
表2a总结在各群组中的每个患者的药物曝露。患者具有117.5天的平均EMD525797曝露持续时间(中值，74.5天；范围，14至534天)。24位患者中的十三位具有比预期更长的曝露时间(＞84天)，其中在500mg群组中的两位患者持续治疗达297天及534天，及在1000mg群组中的一位患者接受治疗持续310天。在6周的DLT周期内未报导DLT。所有患者经历至少一种TEAE且在TEAE中未观察到剂量依赖性关系。
表2a：在各剂量群组中的每个患者的DI17E6曝露
Pt 250mg 500mg 1000mg 1500mg
1 42 297 113 91
2 42 380+ 121 84+
3 42 85 198+ 72+
4 42 142 41 64+
5 56 140 56 77+
6 98 56 43 57+
7 14*
8 28*
+＝持续治疗；*退出患者(仅1次及2次输注)
研究程序规定，受试者将每隔一周接受至少3次剂量(250、500、1000mg/每2周)的DI17E6。
表2b：此表显示治疗持续时间的值(状态：2010年8月)。剂量水平1：250mg DI17E6；剂量水平2：500mg DI17E6；剂量水平3：1000mg DI17E6；及剂量水平4：1500mg DI17E6。
安全性/副作用
表3总结药物相关的TEAE。十一位患者(42.3％)经历药物相关的TEAE，其最常报告于系统器官分类“皮肤及皮下组织病症”(总共4位患者；全身搔痒、红斑、疹)、“一般病症与施用部位病状”(总共3位患者；疲劳、黏膜发炎、外周水肿)、“胃肠病症”(总共2位患者；口干、舌肿胀、上胃肠道出血)及“感染与传染”(总共2位患者；鼻炎、败血病)中。仅有两位患者(7.7％)患有药物相关等级3或4的TEAE：一位500mg群组中的患者经历等级3的γ-谷氨酰转移酶(GGT)的增加及一位1000mg群组中的患者经历等级3的败血病。
两位患者经历视为与治疗相关的严重TEAE。这些TEAE为在一位250mg群组中的患者的等级1的上胃肠道出血及一位1000mg群组中的患者的等级3的败血病。筛选时，后者患者具有持续诊断的尿路感染及败血病的复发事件，其中最后一次事件视为与DI17E6(EMD525797)相关。四位患者死亡且研究者评估所有死亡不合理地与EMD 525797相关。
六位患者(23.1％)由于TEAE永久性中断治疗，包括4位250mg群组中的患者(在第12天上胃肠道出血，在第53天肌无力，在第46天截瘫及在第30天输尿管梗阻)，及500mg群组(在第534天等级3GGT增加)及1500mg群组(在第85天转移至中枢神经系统)中各1位的患者。未报告施用部位皮肤反应。在8位患者中发生后基线血液学及生物化学毒性转变至等级3或4。然而，在实验室发现结果、生命征兆或ECG记录中不存在明显倾向。总而言之，65.4％的患者与基线相比较在治疗时具有相同最差的ECOG性能状态。
表3.药物相关的治疗突发不良事件*(TEAE)。
*MedDRA主要系统器官分类。MedDRA优选的Term 13.0版本。
发生在首个6周(剂量限制性毒性期间)后的等级3。
所观察到的副作用的实施例：
(i)一位62岁男性在第一次且仅输注DI17E6(250mg)后13天经历等级1的上胃肠道出血。该受试者存在非严重吐血且住院。胃镜检查显示食道末端病灶。排除主动出血，使用奥美拉唑(omeprazole)处理受试者，且该事件解决。
(ii)一位79岁患者在DI17E6(EMD 525797)(1000mg)的最近一次输注1天后及第一次输注9周后由于粪肠球菌(e.faecalis)而发展出败血病(等级2)。患者住院且治愈后出院。一个月后，该患者在最近一次输注4天后及第一次输注2.5个月后再次由于粪肠球菌发展出第二次败血病发作(等级3)。患者住院且治愈后出院。又一个月后，该患者在最近一次输注4天后及第一次输注3.5个月后发展出第三次败血病发作(等级3)，这归因于EMD525797。
总结：
■已经在所有4个SMC中评审累积安全性数据。
■整体上未观察到DLT：将DLT定义为直到第6周结束时发生的由研究者和/或担保人(sponsor)怀疑与研究产品合理相关的任何等级3或4的血液学或非血液学毒性，除了在7天内可逆的无临床相关的过敏/过敏性(allergic/hypersensitivity)反应及任何范围外实验室值。
■至今未达成MTD。
■总而言之，仅观察到2例SAE与研究药物相关。
药物动力学及药物效应动力学
在单剂量及多剂量后，EMD 525797显示剂量依赖性非线性PK曲线。第一次1小时静脉输注后，DI17E6(EMD 525797)的Cmax通常在给药开始后1至2小时内达到。由于EMD 525797清除率随剂量而增加，所以消除半衰期随剂量而增加，而平均分布体积在剂量范围内保持恒定(表4)。
如下表4中所给出，施用群组2的CRPC患者500mg/每2周达到IC95的血清水平，而施用250mg/每2周的群组1的患者失败。群组2(500mg/每2周)中的EMD 525797的血清低谷浓度高于IC95且达到非线性CL路径的IC99(250mg/每2周失败)。
表4：
AUCT’，在一次完整给药间隔内的浓度-时间曲线下面积；Cmax’最大血清浓度，Cmin’低谷血清浓度；比率_AUC，曲线下相对面积[AUCT(剂量周期(dose period)3)/AUCT(剂量周期1)]；比率_Cmax’，相对最大血清浓度[Cmax(剂量周期3)/Cmax(剂量周期1)]；tmax’，达到Cmax’的时间；Vss’，在稳定阶段的表观分布体积。
在多次给药后，在1500mg下，DI17E6(EMD 525797)最大血清浓度及剂量依赖性累积的曝露各自高至1.33及1.70的最大值(给药周期(dosing period)3/给药周期1)。
在大多数患者中，CTC浓度在基线值附近保持稳定(数据未显示)。在两位患者中，在开始治疗后约14天及42天时观察到CTC浓度相当大地降低。
在25位可评估患者中有4位(16.0％)检测到抗-EMD 525797抗体。所有四位患者是在250mg群组中；两位患者在两周后复原至血清阴性状态，一位患者未随访，及一位患者在整个研究期间保持血清阳性。

Claims (46)

1.抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其用于治疗罹患纤维化和/或纤维化病症的患者。
2.根据权利要求1所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中所述纤维化和/或纤维化病症所影响的器官选自由肺、肝、肾、心血管系统或皮肤组成的组。
3.根据权利要求1和/或2所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中所述纤维化病症影响一个或多个选自由肺、肝、肾、心脏及皮肤组成的组的器官。
4.根据权利要求1、2和/或3所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中所述纤维化病症包括系统性硬化症(SSc)或是系统性硬化症(SSc)。
5.抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其用于治疗罹患系统性硬化症(SSc)的患者。
6.根据权利要求4和/或5所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中该系统性硬化症包括肺、肝、肾、心血管系统或皮肤的系统性硬化症。
7.根据权利要求4、5和/或6所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中该系统性硬化症影响一个或多个选自由肺、肝、肾、心脏及皮肤组成的组的器官。
8.根据权利要求4所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中该系统性硬化症影响心血管系统、血管和/或血液。
9.根据权利要求1至8中任一项所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中该纤维化病症和/或该系统性硬化症包括一种或多种选自由以下组成的组的适应症：特发性肺纤维化、原发性硬化性胆管炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、原发性局灶性肾小球硬化、原发性节段性肾小球硬化、糖尿病性肾病、舒张功能障碍及骨髓纤维化。
10.根据权利要求1至5中任一项所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中所述纤维化病症和/或系统性硬化症包括肺纤维化和/或肺泡炎(间质性肺病，ILD)。
11.根据权利要求1所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中待治疗的疾病为肺和/或皮肤的系统性硬化症。
12.根据权利要求11所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中该皮肤的系统性硬化症为弥漫性皮肤系统性硬化症(dcSSc)或局限性皮肤系统性硬化症(lcSSc)。
13.抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其用于治疗肺纤维化、肺泡炎(间质性肺病，ILD)和/或硬皮病性间质性肺病(SSc-ILD)。
14.根据权利要求1至13中任一项所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中所述治疗包括施用一定剂量，优选为有效剂量的所述抗体或其生物活性变体或修饰体，施用量为500mg至3000mg/月。
15.根据权利要求1至14中任一项所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中所述治疗包括施用一定剂量，优选为有效剂量的所述抗体或其生物活性变体或修饰体，施用量为1000mg至2000mg/月。
16.根据权利要求14和/或15所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中该剂量，优选有效剂量是以单次剂量进行施用。
17.根据权利要求1至15中任一项所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中所述治疗包括施用所述抗体或其生物活性变体或修饰体，施用量为约500mg/月、约1000mg/月、约1500mg/月、约2000mg/月或约2500mg/月。
18.根据权利要求17所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中所述量是以单次剂量进行施用。
19.根据权利要求1至18中任一项所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中所述抗体或所述其生物活性变体或修饰体是作为单一疗法进行施用。
20.根据权利要求1至19中任一项所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中所述生物活性变体或修饰体包括DI17E6的CDR区及重链及轻链可变区，该可变区与DI17E6的可变区相比较，在氨基酸序列上有至少80％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少98％相同或至少99％相同。
21.根据权利要求20所使用的DI17E6抗体，其包括在重链框架区内的一种或多种修饰
FR1:QVQLQQSGAELAEPGASVKMSCKASGYTFS(SEQ ID No.16)
FR2:WVKQRPGQGLEWIG(SEQ ID No.17)
FR3:KATMTADTSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYYCAS(SEQ ID No.18)
FR4:WGQGTSVTVSS(SEQ ID No.19),
其中加粗及下划线位置中的一个或多个经突变且与原始各自序列相比较是不同的。
22.根据权利要求1至21中任一项所使用的DI17E6抗体，其中该生物活性变体或修饰体包括恒定区，该恒定区与DI17E6的恒定区相比较，在氨基酸序列上有至少80％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同、至少99.5％相同或至少99.9％相同。
23.根据权利要求22所使用的DI17E6抗体，其包括人类IgG1恒定区，而不是人类IgG2，或包括人类IgG2铰链区，而不是人类IgG1铰链。
24.根据权利要求1至23中任一项所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中该抗体以与MMF(霉酚酸酯)组合的组合疗法设定进行施用。
25.根据权利要求24所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体，其中该病症为系统性硬化症(SSc)或硬皮病-ILD(SSc-ILD)。
26.纤维化基因特征，其包括选自由以下组成的组的两种或更多种基因：COL15A1(NM_001855)、COL1A1(NM_000088)、COMP(NM_000095)、RGS5(NM_003617)、COL10A1(NM_000493)、COL5A1(NM_000093)、IGFBP2(NM_000597)、NM_005576、MOXD1(NM_015529)、ADRA2A(NM_000681)、COL5A2(NM_000393)、MMP10(NM_002425)、TNFRSF21(NM_014452)、ITGA7(NM_002206)、TGF-β3(NM_003239)、MMP11(NM_005940)、SPP1(NM_000582)、CCL2(NM_002982)及TNC(NM_002160)。
27.纤维化基因特征，其包括基因COL15A1(NM_001855)、COL1A1(NM_000088)、COMP(NM_000095)、RGS5(NM_003617)、COL10A1(NM_000493)、COL5A1(NM_000093)、IGFBP2(NM_000597)、NM_005576、MOXD1(NM_015529)、ADRA2A(NM_000681)、COL5A2(NM_000393)、MMP10(NM_002425)、TNFRSF21(NM_014452)、ITGA7(NM_002206)、TGF-β3(NM_003239)、MMP11(NM_005940)、SPP1(NM_000582)、CCL2(NM_002982)及TNC(NM_002160)。
28.通过施用抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体来治疗受试者的纤维化和/或纤维化疾病的方法，其中所述受试者的特征在于根据权利要求26和/或27的基因特征。
29.通过施用抗-αv整合素抗体DI17E6或其生物活性变体或修饰体来治疗受试者的纤维化和/或纤维化疾病的方法，其中所述受试者的特征在于由包括2个或更多个，优选5个或更多个，更优选9个或更多个，甚至更优选15个或更多个且尤其16、17、18或19个选自以下基因所组成的组中的基因的多基因特征所计算的高于阈值的得分：COL15A1(NM_001855)、COL1A1(NM_000088)、COMP(NM_000095)、RGS5(NM_003617)、COL10A1(NM_000493)、COL5A1(NM_000093)、IGFBP2(NM_000597)、NM_005576、MOXD1(NM_015529)、ADRA2A(NM_000681)、COL5A2(NM_000393)、MMP10(NM_002425)、TNFRSF21(NM_014452)、ITGA7(NM_002206)、TGF-β3(NM_003239)、MMP11(NM_005940)、SPP1(NM_000582)、CCL2(NM_002982)及TNC(NM_002160)，特别是基于基因COL15A1(NM_001855)、COL1A1(NM_000088)、COMP(NM_000095)、COL10A1(NM_000493)、COL5A1(NM_000093)、COL5A2(NM_000393)、ITGA7(NM_002206)、MMP11(NM_005940)及TNC(NM_002160)的9-基因特征，以下也称为TUAD特征。
30.通过追踪由包括2个或更多个，优选5个或更多个，更优选9个或更多个，甚至更优选15个或更多个且尤其16、17、18或19个选自以下基因所组成的组中的基因的多基因特征所计算的得分的改变来监测受试者的纤维化疾病中纤维化的严重程度和/或在可能发展出纤维化的疾病中纤维化的出现的方法：COL15A1(NM_001855)、COL1A1(NM_000088)、COMP(NM_000095)、RGS5(NM_003617)、COL10A1(NM_000493)、COL5A1(NM_000093)、IGFBP2(NM_000597)、NM_005576、MOXD1(NM_015529)、ADRA2A(NM_000681)、COL5A2(NM_000393)、MMP10(NM_002425)、TNFRSF21(NM_014452)、ITGA7(NM_002206)、TGF-β3(NM_003239)、MMP11(NM_005940)、SPP1(NM_000582)、CCL2(NM_002982)及TNC(NM_002160)，特别是基于基因COL15A1(NM_001855)、COL1A1(NM_000088)、COMP(NM_000095)、COL10A1(NM_000493)、COL5A1(NM_000093)、COL5A2(NM_000393)、ITGA7(NM_002206)、MMP11(NM_005940)及TNC(NM_002160)的9-基因特征，以下也称为TUAD特征。
31.根据权利要求26、27、28、29和/或30中一项或多项的方法，其中该纤维化和/或纤维化病症是如权利要求1至13中的一项或多项中所定义。
32.根据权利要求26至31中一项或多项的方法，其中该患者也接受霉酚酸酯。
33.根据权利要求26至32中一项或多项的方法，其中该抗-αv整合素抗体DI17E6为阿吐珠单抗。
34.根据前述权利要求中一项或多项所使用的DI17E6抗体，其中该患者也接受霉酚酸酯。
35.根据前述权利要求中一项或多项所使用的DI17E6抗体，其中该病症为SSc-ILD和/或该患者也接受霉酚酸酯。
36.根据前述权利要求中一项或多项所使用的DI17E6抗体，其中所述抗体为阿吐珠单抗。
37.根据权利要求20至23中一项或多项的DI17E6或其生物活性变体或修饰体，优选为其生物活性变体或修饰体的用途，其用于制造用于预防和/或治疗纤维化和/或纤维化病症的药剂。
38.根据权利要求37的用途，其中该药剂是用于治疗根据权利要求1至36中一项或多项的纤维化和/或纤维化病症。
39.根据权利要求36、37和/或38的用途，其中该DI17E6抗体或其生物活性变体或修饰体为阿吐珠单抗。
40.根据权利要求36、37、38和/或39的用途，其中该DI17E6抗体为阿吐珠单抗且其中该纤维化病症和/或该系统性硬化症包括一种或多种选自由以下组成的组的适应症：特发性肺纤维化、原发性硬化性胆管炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、原发性局灶性肾小球硬化、原发性节段性肾小球硬化、糖尿病性肾病、舒张功能障碍及骨髓纤维化。
41.根据权利要求36、37、38、39和/或40的用途，其中该DI17E6抗体为阿吐珠单抗且其中该纤维化病症和/或该系统性硬化症包括肺纤维化、肺泡炎(间质性肺病，ILD)和/或硬皮病性间质性肺病(SSc-ILD)。
42.根据权利要求36、37、38、39、40和/或41的用途，其中该DI17E6抗体为阿吐珠单抗且其中该纤维化病症和/或该系统性硬化症包括局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)。
43.根据权利要求36、37、38、39、40、41和/或42的用途，其中该治疗另外包括施用一种或多种选自由霉酚酸、霉酚酸酯、霉酚酸吗啉乙酯、霉酚酸钠、甲氨喋呤、氨甲喋呤及泼尼松组成的组的活性成分。
44.根据前述权利要求中一项或多项的用途，其中该抗-αv整合素抗体DI17E6、或其生物活性变体或修饰体是具有注册的国际非专利名称(INN)阿吐珠单抗的抗体。
45.根据前述权利要求中任一项所使用的抗-αv整合素抗体DI17E6、或其生物活性变体或修饰体，其中该抗体是具有注册的国际非专利名称(INN)阿吐珠单抗的抗体。
46.根据前述权利要求中一项或多项的方法，其中该抗-αv整合素抗体DI17E6、或其生物活性变体或修饰体是具有注册的国际非专利名称(INN)阿吐珠单抗的抗体。
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