CN101466389A - 包含乳清蛋白及水解产物的用于改善肌肉恢复的制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含乳清蛋白或乳清蛋白水解产物的制剂，该制剂能够在体外抑制经脂多糖刺激的巨噬细胞中的TNFα表达。还提供了所述制剂用于缓解由肌肉损伤所致的肌肉功能下降和/或用于促进肌肉损伤恢复和/或用于增强肌肉生力能力的用途，以及制备该制剂的方法。

Description

包含乳清蛋白及水解产物的用于改善肌肉恢复的制剂
技术领域
本发明涉及用于改善肌肉恢复(尤其在运动后)的制剂。更特别地，本发明涉及包含乳清蛋白(whey protein)及水解产物的上述制剂。
背景技术
骨骼肌在剧烈运动(特别是离心运动)期间所经受的高强度机械力可诱发机械损伤，继而发生急性炎症反应、发生疼痛和丧失生力能力(force-generating capacity)。
能够减少肌肉损伤和/或炎症或者加快组织修复的介入具有加速恢复运动后肌肉生力的潜力。它们还有可能辅助疾病后的肌肉恢复。
发明概述
在一个方面中，提供了包含乳清蛋白或乳清蛋白水解产物的制剂，其中该制剂能够在体外抑制经脂多糖刺激的巨噬细胞中的TNFα表达。
在另一个方面中，提供了包含乳清蛋白水解产物的制剂，其中该制剂能够在体外抑制经脂多糖刺激的巨噬细胞的TNFα表达。
在一个实施方案中，所述制剂是营养保健品制剂。
在前述这些方面的一些具体实施方案中，所述水解产物是酶水解产物。在一些具体实施方案中，所述酶为细菌或真菌来源，优选为金属蛋白酶。在一些实施方案中，所述酶选自国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)酶命名分类EC 3.4.24.28中的酶(包括
Figure A200780021776D00041
蛋白酶N“Amano”和Colorase N)以及IUBMB酶命名分类EC 3.4.21.62中的酶(包括枯草杆菌蛋白酶A(VIII型)和Optimase)。
在又一方面中提供了包含乳清蛋白水解产物的制剂用于缓解由肌肉损伤所致的肌肉功能下降和/或用于促进肌肉损伤恢复和/或用于增强肌肉生力能力的用途。
在任一前述方面的某些实施方案中，所述制剂主要由乳清蛋白水解产物组成。
另一方面中提供了乳清蛋白水解产物在制备用于缓解由肌肉损伤所致的肌肉功能下降和/或用于促进肌肉损伤恢复的营养保健药物中的用途，以及乳清蛋白水解产物在制备用于增强肌肉生力能力的营养保健药物中的用途。
还提供了制备用于缓解由肌肉损伤所致的肌肉功能下降和/或用于促进肌肉损伤恢复和/或用于增强肌肉生力能力的制剂的方法，该方法包括水解乳清蛋白以产生包含乳清蛋白水解产物的制剂。
附图简述
下文的实施例将参考以下附图：
图1是显示实施例4中所述实验的时间线的示意图。该时间线显示了从每位受试者取出样品并且相对于运动诱导的肌肉损伤而对肌肉功能进行评估的时间。该时间线还显示了向每位受试者施用补充剂的时间。
图2以图形形式提供了实施例4中所述的肌肉峰值等长力矩测试结果。“A”代表安慰剂补充剂，“B”代表乳清蛋白分离物(Whey ProteinIsolate，WPI)水解产物补充剂，“C”代表WPI补充剂，“D”代表含有酪蛋白的补充剂。该结果表明，与进行任何其它治疗的受试者相比，施加水解WPI补充剂的受试者产生显著更高的峰值等长力，并且在向受试者施加水解WPI补充剂24小时时产生了显著高于基线值的峰值等长力。在基线(0小时)、在100次最大离心收缩刚刚结束时以及其后1、2、6和24小时评估峰值等长力矩。
＊与基线(P＝0.03)和所有其它治疗(P<0.001)存在显著差异。
Figure A200780021776D0005131601QIETU
与补充剂A和C的基线存在显著差异(P<0.05)。
图3以图形形式提供了实施例4中所述的肌肉峰值离心力矩测试结果。“A”代表安慰剂补充剂，“B”代表WPI水解产物补充剂，“C”代表WPI补充剂，“D”代表含有酪蛋白的补充剂。在基线(0小时)、在100次最大离心收缩刚刚结束时以及其后1、2、6和24小时评估峰值离心力矩。
＊与基线存在显著差异(P<0.001)。
图4以图形形式提供了待测样品在LPS刺激的巨噬细胞系中影响促炎细胞因子TNFα表达之能力的体外测试结果。
图5以图形形式提供了待测样品影响成纤维细胞增殖之能力的体外测试结果。“FBS”代表胎牛血清。
图6以图形形式提供了样品在LPS刺激的巨噬细胞系中影响促炎细胞因子TNFα表达之能力的体外测试结果，其中A为1mg/ml(重量/体积)，B为0.2mg/ml(重量/体积)。
图7以图形形式提供了浓度为1、2、4和8mg/ml(重量/体积)的样品在LPS刺激的巨噬细胞系中影响促炎细胞因子TNFα表达之能力的体外测试结果。
发明详述
本发明人已对多种乳级分的生物活性进行了研究。
本发明人已通过TNFα表达抑制的体外测定鉴定到，乳清蛋白分离物(WPI)具有抗炎活性，所述WPI是包含乳清蛋白并可从多种来源(包括干酪乳清(cheese whey)和酸化/酪蛋白乳清(acid/casein whey))获得的乳级分。他们还鉴定出，WPI的特定水解产物出人意料地具有提高的这种抗炎活性。与WPI相比，WPI的某些水解产物还具有提高的体外刺激成纤维细胞生长的能力。
本发明人还鉴定出，施用WPI和WPI的某些酶水解产物能够在进行损伤肌肉的运动之后的受试者中缓解肌肉损伤症状并促进肌肉功能恢复。这使得运动员可以在运动后更快地恢复比赛或训练。水解产物的活性高于相应未水解形式WPI所具有的活性。某些WPI水解产物还能够在进行损伤肌肉的运动的受试者中增强肌肉生力能力。
在一个实施方案中，所述WPI包含：
水份                  5.0％
脂肪                  0.5％
pH(5％溶液)           6.3
灰份                  3.7％
乳糖                  0.5％
蛋白质(TN×6.38)      90.0％
磷                    0.3％
钙                    0.15％
在一个具体的实施方案中，包含WPI或WPI水解产物的制剂不同时包含谷氨酰胺。在另一实施方案中，该制剂不同时包含任何另外的支链氨基酸(branched chain amino acid，BCAA)如异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸。在另一实施方案中，该制剂不同时包含额外的游离或经富集的氨基酸(如肉碱、精氨酸、酪氨酸或组氨酸)来源。在另一实施方案中，该制剂不同时包含额外的非乳清脂质来源。在另一实施方案中，该制剂不同时包含额外的非乳来源的蛋白质来源，如大豆蛋白、水稻蛋白、豌豆蛋白、角豆蛋白、燕麦蛋白、其水解产物和/或其混合物。在另一实施方案中，该制剂不同时包含任何一种或多种额外的蛋白质来源。
乳是复杂的分子混合物，其包含大量的多肽、脂质和脂肪以及碳水化合物。多肽组分尽管主要为酪蛋白，但也包括具有不同功能的许多其它蛋白质，如α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、免疫球蛋白和酪蛋白糖巨肽(caseinoglycomacropeptide，CGMP)。
本说明书的术语“乳级分”是指最终来源于乳并且至少富集了全乳中的一种或多种成分的制剂。在本说明书的上下文中，“乳级分”包含乳中的非酪蛋白蛋白质。乳清或“乳浆”是在“乳凝结”过程已从全乳或脱脂乳去除大部分酪蛋白和乳脂组分之后保留的常见乳级分。
“乳级分”包括富集了乳中特定组分或组分组合的级分。例如，与全乳相比，乳级分“乳清蛋白分离物(WPI)”中富集了乳中的非酪蛋白蛋白质组分。
“乳清蛋白”包括可见于乳清中并在水解时具有本文所述的所需生物活性的一种或多种蛋白质。不同来源的乳清蛋白均在考虑范围内。特别地，源自甜乳清或酸化乳清的乳清蛋白均被证实具有相似的活性。例如，存在大量用于生产乳清的方法，例如作为不同形式的乳酪生产过程中产生的副产品或者作为酪蛋白制造过程中的副产品，每种上述方法都产生具有某些差别的乳清制剂。
可见于乳清中的主要蛋白质是α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和酪蛋白糖巨肽(CGMP)，后者形成乳酪乳清WPI中存在的约25％蛋白质。包含一种或多种这些蛋白质的乳级分均考虑用作本文所述水解方法的原料，然而不明确排除将不包含这些蛋白质的级分作为可能的原料来源。
尽管本文提供的示例性方法使用WPI作为水解的起始原料，然而应当理解，也包含乳清或WPI中存在的乳组分的其它乳级分或全乳也可以代替WPI，而不显著地改变终产物具有的所需生物特性。例如，全乳或乳蛋白浓缩物会包含同样的组分(包括可见于乳清中的蛋白质)，尽管是更稀的形式。可见于乳清中的组分也可见于非乳清乳级分中，尽管可能是更稀的形式。
去除或减少乳或乳蛋白浓缩物的特定组分可能证明是理想的，例如用于提高生物活性组分的比活性。减少乳品的水、脂肪、乳糖和“灰份”(包含乳的矿物质组分)含量的技术是本领域公知的，预期这些技术将增强所需生物活性组分的比活性。
在某些实施方案中，减少乳蛋白级分中存在的酪蛋白含量可能证明是理想的。酪蛋白(如果存在的话)有可能稀释源自乳清的生物活性，并且如果在水解期间存在酶失活步骤的话则可能形成凝乳。用于从乳品中去除酪蛋白的技术(例如用酸进行等电沉淀或使用酶(如粗制凝乳酶)来进行乳凝结)是本领域公知的。
类似地，乳清蛋白可以利用不仅限于WPI制备的多种方法来浓缩，如用于制备市售的乳清蛋白浓缩物(whey protein concentrate，WPC)的方法。尽管比例不同，但WPC也包含可见于WPI中的许多组分，因此预期WPC也将具有WPI所显示的活性。WPI的任何前体(包括生产WPI方法的中间产物)均可用作水解的起始材料，尽管所述前体的比活性低于WPI的比活性，并且所得水解产物可能需要后续的纯化步骤。
在一些具体的实施方案中，用作水解起始材料的乳级分包含乳中存在的酪蛋白糖巨肽组分、乳中存在的
Figure A200780021776D0009131713QIETU
蛋白栋、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白级分中的一种或多种。WPI中还有许多少量存在和尚未明确鉴定或定量的其它蛋白质。
包含一定比例的乳清中蛋白质的其它乳级分也可能具有本文所述的期望生物活性。通过使用实施例中所述的体外和体内方法，本领域技术人员能够容易地测定任何特定乳级分在水解后是否具有期望的活性。
水解WPI中所显示的生物活性能够经受WPI生产中所涉及的条件，如阴离子交换、渗滤和喷雾干燥。
此外，水解WPI中所显示的生物活性能够经受水解过程中特异性酶消化和酶失活所涉及的条件。因此，任何或全部这些步骤也可以用于制备乳级分，并且预计保留期望的生物活性。WPI中存在的生物活性还能够经受巴氏消毒过程，因为WPI中存在的物质在WPI生产期间已作为乳以及作为乳清进行了巴氏消毒。
尽管本文中的实施例使用了来自牛乳的乳清蛋白，然而，由于家畜的乳具有相对类似的组成，因此预计来自其它动物(包括绵羊、山羊、马和水牛)的乳也将提供合适的起始材料来源。使用人源乳清蛋白也可能具有优势，例如在施用于新生儿的制剂制备中有优势。
本文使用的术语“水解”是指蛋白质或多肽分解为更短的多肽、寡肽以及在很小程度上可能为氨基酸组分。
可以通过化学方法(例如使用酸)或者通过酶处理来进行水解。通过化学处理进行的水解(如酸水解)可以是生产水解产物的方法，只要保留了期望的生物活性即可。
可以控制水解条件从而使所得水解产物与水解前的起始材料相比在抑制TNFα表达(使用以下实施例中所述的体外方法)和/或提高肌肉生力能力(使用以下实施例中所述的体内方法)方面具有增强的活性。
可能影响水解产物与起始材料相比的相对活性的条件包括孵育和酶失活的温度、反应和失活的pH、水解的时长和所使用酶的类型。
在一个具体实施方案中，所述水解为酶水解。优选的酶是微生物来源(特别是细菌来源或真菌来源)的蛋白酶。金属蛋白酶从底物特异性以及通过控制必需金属离子的可用性能够使酶失活这两方面来看都是优选的。
使用在接近中性pH(特别是pH5.3～8.5)下具有蛋白酶活性的蛋白酶可能是有利的。
本说明书中示例的WPI水解是可见于商品化制剂
Figure A200780021776D00101
(Novozymes)中的蛋白酶活性来进行的。该产品包含通过深层发酵选定的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株产生的中性蛋白酶组分。该蛋白酶是能够以中度到充分程度将大多数蛋白质分解为较小肽的金属(Zn)内切蛋白酶。
预计能够水解WPI或其它乳级分的其它蛋白酶也将获得提高的本发明人所鉴定之生物活性。
应理解，来自IUBMB酶命名分类EC 3.4.24.28的金属蛋白酶(也叫作芽孢杆菌溶素(bacillolysin)、芽孢杆菌金属内切蛋白酶、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶、anilozyme P 10、芽孢杆菌金属蛋白酶、芽孢杆菌中性蛋白酶、巨大芽孢杆菌肽酶(megateriopeptidase))具有与
Figure A200780021776D00102
相似的蛋白水解活性，并且其中任意一种或多种均考虑用于水解中。例如，同为该酶类别成员的细菌来源中性金属蛋白酶“蛋白酶N‘Amano’”(Amano Enzyme，Inc.)和“Colorase N”(AB Enzymes)已由本发明人证实会产生与使用相似的更高体外抗炎作用，因此，预计使用这些酶产生的水解产物也具有提高的由
Figure A200780021776D00104
所得水解产物表现出的体内生物活性。
类似地，来自IUBMB酶命名分类EC 3.4.21.62的酶(也叫作枯草杆菌蛋白酶、alcalase 0.6L、alcalase 2.5L、colorase N、ALK-酶、芽孢杆菌蛋白酶A、芽孢杆菌蛋白酶B、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶bioprase、bioprase AL 15、bioprase APL 30、粘菌素、枯草杆菌蛋白酶J、枯草杆菌蛋白酶S41、仙台枯草杆菌蛋白酶(subtilisin Sendai)、枯草杆菌蛋白酶GX、枯草杆菌蛋白酶E、枯草杆菌蛋白酶BL、枯草杆菌蛋白酶A(VIII型)、genenae I、esperase、maxatase、thermoase PC 10、蛋白酶XXVII、thermoase、superase、枯草杆菌蛋白酶DY、枯草杆菌肽酶、SP 266、洒维奈斯(savinase)8.0L、洒维奈斯4.0T、kazusase、蛋白酶VIII、optimase、opticlean、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶、protin A3L、洒维奈斯、洒维奈斯16.0L、洒维奈斯32.0 L EX、orientase 10B、蛋白酶S)和类似的丝氨酸内切肽酶是可能适用于水解的候选酶。使用来自该分类的
Figure A200780021776D00111
已由本发明人证实会产生与使用
Figure A200780021776D00112
相似的体外抗炎作用，因此，预计使用一种或多种该类的酶所产生的水解产物也具有由
Figure A200780021776D00113
所得水解产物表现出的体内生物活性。
来自IUBMB酶命名分类EC 3.4.24.28或EC 3.4.21.62的特定酶是否能够产生提高的所需生物活性可以使用本文实施例3所述的体外方法和/或实施例4中所述的体内方法容易地确定。
似乎并非乳清蛋白的所有酶水解形式均获得本发明人鉴定的提高的生物活性，因为在用胰酶、胰酶和Debitrase DBP20以及胰酶和Colorase LAP水解WPI后在体外并不表现出所述提高的生物活性。因此，在一个实施方案中，水解产物不通过胰酶消化而产生。在另一些实施方案中，水解产物不通过以下任意一种或多种产生：Multifect P3000、S Amano、P Amano 6、Savorase MFF、Debitrase HWY 20、A Amano 2、Flavourzyme 500L、Protamex、
Figure A200780021776D00114
 LAP、Debitrase DBP20、Bioprotease N100L、M Amano、肽酶R、P Amano6和Debitrase DBP20、P Amano 6和Colorase LAP、A Amano 2和Debitrase DBP20、A Amano2和Colorase LAP、S Amano和Debitrase DBP20、S Amano和ColoraseLAP、Multifect P3000和Debitrase DBP20或者Multifect P3000和Colorase LAP。
待使用的酶可能具有许多理想的特性。期望用于水解的蛋白酶在很宽的浓度范围内无毒。优选地，所述酶在被受试者摄取时是耐受的。可能有利的是，该酶可以容易地通过不使水解产物中所存在的所需生物活性失活的条件使其失活(例如通过轻微加热)和/或可以容易地将其从水解产物中分离，例如通过将酶固定于固体支持物上，或通过超滤来保留酶，同时使水解产物的活性组分通过并进行收集。若能够以高比活性向起始材料酶，则对于生产水解产物可能是有利的。如果酶不被物理条件(例如乳或乳级分的pH和离子组成)或者可见于乳级分或全乳中的组分失活，则可能是有利的。在一些具体的实施方案中，所述酶在接近中性的pH下具有蛋白酶活性，在一些具体的实施方案中，最佳的酶活性在pH5.5～8.5范围内，更优选在pH6.3～8.0范围内。
酶水解乳清蛋白的方法以及控制这些反应的技术详细描述于例如美国专利申请11/083,662(美国专利申请公布2005/0164340)中，其全部内容通过交叉引用并入本文。起始材料的水解程度也可能有助于所产生水解产物的活性。起始材料和水解材料的水解程度都可以通过OPA法(Lee K S，Drescher D G.，Fluorometric amino-acid analysis witho-phthaldialdehyde(OPA)，Int.J.Biochem.1978；9(7)：457-467))来确定，该文献的全部内容通过交叉引用并入本文。
本文示例的水解条件相对温和，因而预计起始材料的完全水解不是提高生物活性所必需的。因此，术语“水解”意在包括乳清蛋白的至少部分水解。水解程度为约0.5％至约20％的乳清蛋白水解产物包含少于约5％的游离氨基酸、约15％至约55％的分子量小于1000Da的肽、约20％至约55％的分子量为1000Da至5000Da的肽以及约15％至约35％的分子量大于5000Da的肽。在一个实施方案中，净水解程度(％)为0.5％至10％，更优选为0.5％至4％。
术语“水解产物”是指水解产生的完整蛋白质或多肽、较短的多肽以及寡肽和氨基酸组分的混合物。
众所周知，离心运动可诱发肌肉损伤和炎症。这种肌肉损伤可以通过比较受伤肌肉与受伤前肌肉的生力能力(力矩)而容易地进行鉴定。使用以下实施例中所述的方法，肌肉力矩通常在受伤后多达7天内不能恢复至受伤前的水平。本发明人已证实，口服施用乳清蛋白产生的水解产物显著缓解了在重复性最大用力导致的肌肉损伤后的肌肉力矩丧失，使之明显更快地恢复至正常峰值等长力矩水平，在本文实施例中为在肌肉损伤后24小时内。此外，所施用的水解产物提高了肌肉组织的生力能力，使之在运动后24小时内超过受伤前的基线水平。在施用安慰剂或未水解WPI的受试者中不显示这种肌肉力矩的提高。
由于多种致损刺激可以诱发肌肉功能丧失，因此还考虑所述水解产物也可以缓解由各种肌肉损伤来源(如瘀伤和/或外伤)所导致的肌肉生力能力的丧失。
这种活性可能与WPI以及WPI水解产物(更大程度上)能够在体外下调TNFα产生有关，如下述在巨噬细胞培养物中所证实。基于本发明人先前针对乳级分的研究，体外结果可能预示着水解产物在下调运动损伤后在肌肉中产生的一种或多种炎症标记物方面的活性。因此，预计WPI和WPI水解产物可具有缓解肌肉损伤所导致炎症(如上调受损肌肉组织中jun-B和c-fos基因表达)的活性。
此外，在巨噬细胞中对TNFα基因表达进行体外测定可方便地用于监测水解产物的产生，以使其生物活性最大化。
因此，本文使用的术语“期望的生物活性”是指以下任何一种或多种：减弱受试者肌肉损伤后肌肉生力能力的丧失，提高肌肉生力能力超过基线水平，在本文所述的体外测定中下调巨噬细胞中TNFα的表达，以及减少肌肉损伤(如运动诱导的肌肉损伤)后肌肉中炎症标记物的表达。减弱肌肉生力能力的丧失可包括降低损伤后表现出的力矩丧失和/或加快力矩恢复至受损前水平。
不希望受任何所提出机理的限制，初步体外结果提示，WPI和WPI水解产物(如使用
Figure A200780021776D0013131923QIETU
或
Figure A200780021776D0013131928QIETU
产生的水解产物)可刺激成纤维细胞的生长，这提示该水解产物可以刺激肌肉生长或修复，并提示该水解产物可具有超出未水解WPI的肌肉修复或建立应用。
已证实，当在诱导肌肉损伤的运动后立即施用于受试者时，水解产物有效缓解肌肉功能丧失并提高肌肉生力能力。峰值等长力矩和离心力矩结果也提示，在运动诱发的肌肉损伤后6小时和22小时再次施用水解产物可以使肌肉损伤后肌肉生力能力的提高维持至少24小时。因此，可以预计，所述水解产物不仅如本文所述可以在运动后施用或者在运动后超过24小时施用，它们也可能额外地或可替代地在运动前施用。因此，所述水解产物可进行预防性(例如在预计剧烈运动可导致肌肉损伤的情形中)或治疗性(在运动后施用以减弱损伤产生的肌肉应答)使用。
本发明人证实，与未水解WPI不同，口服施用水解产物能够在运动后24小时诱导肌肉生力能力提高超过基线(受伤前)水平。因此，所述水解产物可以采用定期或间歇方式长期施用，优选地配合有规律的或间歇的运动，从而刺激肌肉生力能力提高。还考虑将这样的用途用于希望加强肌肉力量的受试者中或者易感于肌肉萎缩或有这种风险的受试者(如老年人或体弱者)。
由于乳清蛋白和水解产物来源于已充分表征的乳品(例如已知适宜作为膳食补充剂的乳清)，因此将它们作为营养保健品制剂来施用可能是有利的。本发明人已证实，当与甜味剂混合并以液体形式施用于受试者时，WPI水解产物形式的乳清蛋白水解产物可良好耐受并且口味宜人。
预计所述水解产物可作为营养保健品制剂来施用。本文定义的“营养保健品”代表分离或纯化自食品(在本文的情形中来自乳)的可食用产品，该产品已证实在口服时具有生理益处或者提供对急性或慢性疾病或损伤的保护或使其缓解。因此，营养保健品可以以膳食补充剂的形式提供，单独或与可食用食品或饮料混合均可。
所述营养保健品制剂可以采用任何适当的形式。例如，该营养保健品制剂可以采用可溶粉剂、液体或即饮制剂的形式。或者，所述营养保健品制剂可以采用固体形式，例如采用即食棒或早餐麦片的形式。还可以存在各种调味剂、纤维(fibre)、甜味剂和其它添加剂。
所述制剂可以经由鼻饲管、空肠管喂给患者，或者由患者饮用或食用。
所述营养保健品制剂可以常规方式生产，例如，该制剂可通过将乳清蛋白或水解产物及其它添加剂混合在一起而进行制备。如果使用乳化剂的话，可将其包含在混合物中。此时可添加额外的维生素和矿物质，但通常在稍后添加以避免热降解。
如果期望生产粉末状的营养保健品制剂，则可以将乳清蛋白或水解产物与粉末状形式的其他组分进行混合。所述粉剂的含水量应当低于约5％(以重量计)。然后，可以将水(优选已进行反渗透的水)混入以形成液体混合物。
如果所述营养保健品制剂以即饮液体的形式提供，则可以对其加热以降低细菌荷载。如果期望生产液体营养保健品制剂，则优选将该液体混合物无菌灌入合适的容器中。可使用本领域常见的可用技术进行容器的无菌灌装。用于进行无菌灌装的适当设备是市售的。
应该理解，所施用的乳清蛋白或水解产物的最佳剂量取决于受试者和所期望的应用。预计以足以递送至少以下量水解产物的量对受试者施用制剂：每千克体重每天50～1500mg的水解产物蛋白质；在一些实施方案中为每千克体重每天50～1100mg的水解产物蛋白质；在一些具体的实施方案中为每千克体重每天50～600mg的水解产物蛋白质。所述制剂可以在一天内多次给药以将上述剂量递送至受试者。
在一个具体的实施方案中，所述剂量提供50～1500mg/kg WPI或水解产物。在一个具体的实施方案中，对于平均70kg的个体来说，向成年男性提供每千克体重每天大约50、350、570、1100或1500mg水解产物蛋白质的剂量，优选以日剂量给药。这样的剂量可以通过4、25、40、75或100g的WPI或水解产物粉剂来提供。
所述制剂可以单次剂量或以2-3次分次剂量来施用。在一个优选的实施方案中，所述制剂在运动后随即施用或者在运动20分钟至2小时内施用。
应当清楚地理解，尽管本文提供的范例限于向人受试者施用营养保健品，但是也可以将相同或相似的制剂施用给需要类似的有益生理反应的非人哺乳动物。例如，明显很理想的是使针对肌肉损伤的不良反应最小并提高需要速度或最佳肌肉力量的哺乳动物(例如赛马或灵缇犬)的肌肉生力能力，或者优化产肉牲畜(如牛、猪和绵羊)中的肌肉量。
在本说明书中，除非上下文需要或者由于表达习惯或必要暗示，措辞“包含”或变换形式如“包括”或“含有”以开放式含义使用，即说明存在所述特征但不排除在本发明的各实施方案中存在或增加另外的特征。
除非由于明确的表述或必要的暗示而在上下文需要并不如此，否则本说明书中使用的术语“基本由......组成”意指可以加入另外的组分，但是这些另外的组分不会实质性影响所指特征的基本和新特性。不会实质性影响WPI或WPI水解产物的基本及新特性的另外组分的实例包括但不仅限于调味剂、甜味剂、防腐剂、溶剂和稀释剂。
除非上下文明显指明另外的情形，否则本说明书中使用的无量词修饰的名词均无数量限制。因此，例如，“乳清蛋白”包括一种或多种乳清蛋白。
本发明将通过以下非限制性实施例进行描述。
实施例1.制备乳清蛋白分离物
WPI工艺的目的是：通过去除其它乳清组分如水、乳糖、脂肪和灰份(其包含乳中的矿物质组分如磷、钠、钾、钙、镁及其它金属)来富集乳清蛋白，直至剩余物质中包含超过90％的乳清蛋白(基于样品)。商业上常用的WPI生产工艺包括阴离子交换层析分离、超滤(UF)和喷雾干燥等步骤。
WPI工艺基于阴离子交换层析原理进行，其中使用使粘性材料具有高流速的大直径树脂。起始材料可以是凝乳产生的甜乳清或者通过添加酸来去除酪蛋白而得到的酸化乳清。预计由其它方法(如超滤、微孔过滤或乙醇沉淀)获得的乳清也是合适的。用于生产WPI的优选起始材料是WPC35(35％(蛋白质重量/固体重量)的乳清蛋白浓缩物)，它是通过对粗制乳清进行超滤以去除灰份和乳糖而得到的一般产物。该工艺为乳品业技术人员所熟知。使用脱脂乳代替乳清也得到非常相似的产物。
将起始材料引入阴离子交换柱(GibcoCel CR201)上，以使树脂载荷主要带负电(在乳清pH值6.5下)的乳清组分。用水洗涤该柱以去除未结合的材料，对结合的乳清组分进行洗脱并用包含0.75M氯化钠和0.75M氯化钾的混合物使柱再生，之后洗涤该柱以去除残余的氯。
通过以低温、低分子量、螺旋卷式超滤膜(spiral ultrafiltrationmembrane)进行渗滤而使从CSEP洗脱的乳清组分脱盐和浓缩。该步骤保留了蛋白质，去除了盐、灰份组分和乳糖。通过这一步骤，总固体从4％升至25％，蛋白质浓度从总固体的50％升至超过总固体的90％。
干燥器的目的是去除产物中大部分残余水，直至最多残余5％的水。干燥器通过将WPI浓缩物在充满热气的室中进行雾化来工作。由于所得的WPI粉剂随后在其准备用于水解时在水中重建，因此从本方法中删除干燥步骤是可能的。
本发明人已对从干酪乳清以及酸化乳清获得的WPI水解产物进行了研究。二者对酶消化均具有相似的生物活性，所以预计WPI的类型不会实质性改变WPI水解产物所产生的生物活性。
使用来自甜乳清和酸化乳清中每一种的WPI来制备体外测试的水解产物，然而只有甜乳清WPI水解产物用于体内测试。产自甜乳清WPI和酸化乳清WPI的水解产物在体外测定中被证实几乎没有差别，因此预计甜乳清WPI水解产物的体内结果可扩展至酸化乳清水解产物。
实施例2.WPI水解
该实施例中使用的蛋白酶溶液是市售产品
Figure A200780021776D00171
(Novozymes)。
水解反应的目标pH值为pH6.5。水解过程中的pH变化是有限的，所以实践中在pH6.6时开始水解并且在反应期间不再调整pH。最终pH约为6.4。
将根据实施例1制备的三千克WPI在27L水中重建，得到30L 10％(重量/体积)的固体溶液。在加热至50℃前，用4M NaOH将pH调至6.6。
一旦开始加热，即持续搅拌该溶液。
将4.5g  1.5MG(Novozyme)溶解在45ml水中，制备10％溶液，然后将其加至WPI溶液中。持续监测pH，只要pH低于6.4即进行调整。可以通过pH的降低来实时监测水解过程。之后可以通过使用基于邻苯二甲醛法(例如Lee等，1978；如上)测量“水解程度”来测定发生水解的实际量。在上述条件下发生水解的实际量不是非常高，所观察到的净水解程度(％)为0.3～3.0。
水解60分钟后，用4M HCl将溶液调整至pH4.0，在50℃维持30分钟以使
Figure A200780021776D00173
失活。将所得水解产物冷却至25℃，将pH再调整至≥pH6.5，理想情况下调至pH7.0。
然后对该水解产物进行干燥，优选地通过在35℃冷冻干燥来实现。
使用其它蛋白酶来生产WPI或包含乳清蛋白的其它乳级分的水解产物，使用实施例3所述的体外方法对其抑制巨噬细胞中TNFα表达或者刺激成纤维细胞生长的活性进行筛选。还使用下述方法对这些水解产物在受试者中缓解肌肉损伤症状以及提高肌肉收缩力方面的活性进行筛选。
实施例3.在体外调节巨噬细胞中的TNFα表达以及刺激成纤维细胞分裂。
TNFα释放
将RAW264.7巨噬细胞以2×104个细胞/孔的密度接种于96孔板中含有10％热灭活胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中。然后在37℃培养细胞48小时。到达最佳细胞密度后，去除含有血清的培养基，在载体对照(0.9％盐水)或测试乳样品(2mg/ml)存在下，用50ng/ml细菌脂多糖(大肠杆菌055：B5)在无血清条件以37℃刺激细胞6小时。所有样品均含有甜味剂和调味剂；安慰剂样品不包含其它化合物；WPI样品含有根据实施例1所述方法获得的WPI；水解WPI样品取自根据实施例2所述方法生产的两个不同的
Figure A200780021776D00181
水解批次；酪蛋白样品含有市售的酪蛋白(酸性酪蛋白，Murray Goulburn Co-Operative)。
在6小时刺激期后，使用高度特异性的TNFα夹心ELISA来测量存在于细胞条件化培养基中的TNFα水平，将数据表示为TNFα释放抑制百分比(相对于只用载体进行预处理的细胞)。通过Alamar Blue染色来评估细胞生存力。
成纤维细胞生长
将BalbC3T3成纤维细胞以0.8×104个细胞/孔的密度接种于96孔板中含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，并37℃培养过夜。在过夜培养后，去除含有血清的培养基，在含有载体对照(0.9％盐水)或测试样品(2mg/ml)的无血清DMEM培养基中刺激细胞。所有测试样品均含有甜味剂和调味剂；安慰剂样品不包含其它化合物；WPI样品含有根据实施例1的方法获得的WPI；水解WPI样品取自根据实施例2所述方法生产的两个不同的
Figure A200780021776D00191
水解批次。
将细胞再培养48小时，之后吸出培养基，通过Alamar Blue染色对细胞生长进行定量。数据表示为(高于用载体对照处理的细胞的)生长百分比。
这些实验的结果示于图4和图5中。
在所有测试样品中，经
Figure A200780021776D00192
水解的WPI在抑制LPS刺激的巨噬细胞中TNFα表达以及刺激成纤维细胞生长方面均具有最高的活性。
实施例4.调节运动诱发的肌肉损伤。
下述研究使用了以安慰剂作对照的随机双盲平行设计。在通过进行最大离心运动诱发肌肉损伤之前、诱发肌肉损伤刚刚结束后以及其后1、2、6和24小时对右腿四头肌的强度、力量和局部肌肉耐力以及肌肉疼痛和炎症血液标记物进行评估。
在诱发肌肉损伤后，立即随机指派受试者服用250ml经调味和加糖的水(对照)或250ml含有25g经处理的WPI(根据实施例2制备)、25g WPI(根据实施例1制备)或25g酪蛋白(酸性酪蛋白，Murray Goulburn Co-operative Ltd)的经调味和加糖的水。在诱发肌肉损伤后立即进行的评估肌肉功能和炎症刚刚结束时服用这些测试样品，并在第6小时及之后在第22小时的评估后(即在最终评估前2小时)再次服用。
使用饮食日志来评估在测试前24小时中和介入期24小时中的食物摄入。图1标明了实验设计。排除满足以下条件的受试者：
·为了改善或保持身体健康而有规律地参加体育锻炼(每周超过一次)。
·在预计参与本研究之前的3个月中进行过四头肌抗阻力训练。
·有膝、四头肌或者其它肌骨骼或身体方面的问题，这些问题可能已影响到其进行所需运动的能力并诱发肌肉疼痛。
·在预计参与本研究之前的3个月中，其四头肌有过明显的迟发性肌肉酸痛(delayed onset muscle soreness，DOMS)。
·先前对乳蛋白有任何变应性或敏感性反应。
告知受试者在本研究之前至少7天不要进行“感冒和流感”治疗，不要服用非处方药、止痛剂、阿司匹林或其它抗炎制剂，并且在本研究前48小时或研究期间戒酒。
通过利用Kin-Com等速测力仪(Chattecx，TN，USA)对右腿四头肌进行100次最大主动离心等速收缩，以诱发肌肉损伤。为了诱发DOMS，每位受试者在低抗阻力下进行10次热身重复动作，然后对膝伸肌进行100次最大主动离心肌肉收缩(以40°/秒的角速度跨越80°的运动范围)。受试者在每次离心收缩开始前相对于测力仪杆臂的最大等长收缩约1秒，并且用持续的最大努力来抵抗被迫伸长的膝伸肌。在离心收缩结束时放松膝伸肌，并且在恢复期期间，实验者将放松的腿放回到起始位置。身体位置、膝关节旋转的近似轴以及测力仪杆臂的长度对于每位受试者来说是一致的，并在所有收缩期间给与口头鼓励。
在即将诱发肌肉损伤之前、运动刚刚完成之后以及运动后1、2、6和24小时，使用已公开的技术(Huskinsson，E.，Visual analogue scales，in Pain measurement and assessment，R.Melzack，Editor.1983，RavenPress：New York.p.33-37)以100mm视觉类比评分法(visual analoguescale，VAS)来评估肌肉疼痛程度。
VAS由100mm末端封闭的水平线组成，定位点由左侧的“无疼痛”和右侧的“最大可能疼痛”组成。受试者坐下并被要求伸膝(因此腿是水平的)，使用从其踝部悬垂的5kg重物来评估疼痛。受试者在VAS上对应于他们感觉该腿四头肌疼痛的点放置标记物。肌肉疼痛程度定量表示为从线段(continuum)左端至受试者所做标记之间的测量距离(以毫米为单位)。
所得到的VAS数据表明，在离心收缩后所有组中的肌肉疼痛均增加，并且在整个研究期间保持升高，各组之间没有统计学显著差异。
使用等速测力仪(Kin-Com 125AP，Chattecx Corporation，Tennessee，USA)来评估右腿四头肌的肌肉强度、离心及向心肌肉力量以及肌肉耐力。根据膝弯曲90°时3次最大等长收缩获得的峰值力矩来测定等长肌肉强度。根据在膝伸肌3次最大离心肌肉收缩(以40°/秒的角速度跨越80°的运动范围)期间获得的峰值力矩来测定离心肌肉力矩。根据15次连续最大等速膝伸展运动(以40°/秒的角速度跨越80°的运动范围)来评估向心肌肉力量和肌肉耐力。
评估了作为对运动的反应而产生的肌肉损伤和炎症应答。在基线、刚刚完成100次离心肌肉收缩之后以及运动后1、2、6和24小时收集血液样品，用于评估血清肌酸激酶活性和炎症标记物。将运动前和运动后的血液样品置于血清管(用于肌酸激酶测定)或EDTA管(用于测定炎症标记物)中。然后，将样品在离心机中离心，并将血清和血浆储存于-80℃直至分析。
在进行离心运动后24至48小时显示肌酸激酶活性提高，这通常用作离心运动后的肌肉损伤标记物。
对作为对离心运动的响应而提高的多种促炎细胞因子血浆浓度进行测量。肿瘤坏死因子α(TNFα)在运动结束时显示到达峰值，白介素(IL)-1β(IL-1β)和IL-6在运动后多达24小时仍提高。
使用商业试剂盒针对这些细胞因子中的每一种来分析血液样品。
在双盲研究中，将受试者随机分配至上述4组中的任一组。在整个研究中，每一组服用同样的测试样品。以包含补充剂和甜味剂的预称重小袋提供补充剂，在服用前加水并充分混合。将补充剂小袋标记为A、B、C和D，研究人员在研究和后续的结果分析期间对该编码不知情。补充剂A是安慰剂，B是WPI水解产物补充剂，C是WPI补充剂，D是含酪蛋白的补充剂。
在使用离心运动诱发肌肉损伤之后进行的肌肉功能测试和血液取样刚刚结束之后服用所述测试样品，然后在6小时再次服用，在22小时(即在最终评估前2小时)再次服用。
将在测试前24小时中以及在介入期24小时中的所吃的食物记录在饮食日志中，用于随后使用Foodworks(Xyris software，Brisbane)和澳大利亚营养成分数据库(Australian Nutrient database，NUTTAB)进行的分析。
使用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)对4个补充剂组的基线参数进行比较。不同治疗对峰值等长力矩和峰值离心力矩随时间的影响使用重复测量ANOVA(repeated measuresANOVA)进行比较。当ANOVA显示显著的主效果时，完成事后分析以使用最小显著性差异确定测试方法间的差异。统计学显著性设置为P<0.05的α-水平。所有数据表示为平均值±标准差(SEM)。
结果-峰值等长力矩
图2显示峰值等长力矩的结果。在基线水平上，各组之间的峰值等长力矩没有差异。ANOVA表明，测量时间(P<0.001)以及处理与时间的相互作用(P<0.01)具有显著效果，但处理没有显著效果(P＝0.06)。事后分析表明，这种相互作用是由服用WPI水解产物测试样品的受试者中力矩显著提高所致，这使得力矩在24小时内显著高于基线(P＝0.03)，服用酪蛋白测试样品的受试者中力矩没有变化(P>0.12)，服用安慰剂和WPI测试样品的受试者中力矩显著减小(P<0.05)。然而，尽管服用酪蛋白测试样品的受试者中力矩没有显著减小，但是这一反应与服用安慰剂或WPI的受试者中的反应没有显著差异。服用WPI水解产物的受试者中力矩的提高(24小时之内)表示为从基线提高14.4±8.9％，这与以下形成对比：服用酪蛋白测试样品的受试者减小4.3±7.6％(并非显著减小)，服用安慰剂和WPI的受试者中分别减小31.0±3.0％和21.3±8.8％。
结果-峰值离心力矩
图3显示峰值离心力矩的结果。在基线水平上，各组之间的峰值离心力矩没有差异。ANOVA表明没有显著的处理效果(P＝0.26)或相互作用(P＝0.79)效果，但是由于在所有治疗组中力矩在刚刚运动后整体减小而存在显著的时间效应，并且在24小时的研究期间力矩保持低于基线水平(P<0.001)。
服用WPI水解产物测试样品的受试者中的受试者间峰值离心力矩变异大约是其它组的两倍，因此为了减小这种变异，将数据表示为相对于基线的峰值离心力变化百分比。使用这种分析，ANOVA表明没有显著的相互作用效应(治疗×时间，P＝0.97)，但是存在统计学显著的时间效应(P＝0.001)，这是由于在完成100次四头肌最大离心收缩(P<0.001)后第一小时力矩降低，然后在24小时研究期间保持被抑制。然而，重要的是，由于服用WPI水解产物的受试者中的力矩减少较少，因此存在力矩百分数减少(P＝0.17)的治疗效果趋势。
该数据分析表明，与其它3种测试样品相比，WPI水解产物不仅对重复进行最大离心肌肉收缩之后发生的峰值等长力矩及离心力矩减小提供保护，而且显著提高四头肌的等长力生成能力。
所有组中的肌肉疼痛均有所增加，并且各组间的肌肉疼痛没有统计学差异。尽管目前尚未获得肌肉损伤及炎症标记物的数据，然而认为离心运动诱发肌肉损伤和炎症，导致肌肉组织的生力能力丧失。服用水解WPI的受试者中生力能力丧失的缓解以及峰值等长力超过基线～14％的提高表明，该测试样品不仅减小了任何针对肌肉收缩功能的损伤影响，而且改善了肌肉组织的生力能力。
尽管这些受试者中提高生力能力的确切机制尚不清楚，但是已知肌肉生力的能力通过调节运动单元募集的神经系统机制和收缩蛋白含量来介导。来自先前研究的数据可能提示，本研究中观察到的肌肉功能改善更可能是通过收缩蛋白含量提高以及炎症降低来介导，而不是通过任何神经效应来介导。
实施例5.调节肌肉炎症标记物的表达。
受试者以未进食状态到达实验室，对股外侧肌进行休止肌活检(resting muscle biopsy)。
在休止肌活检后，受试者完成一系列高强度抗阻力运动，其由重复12次最大腿伸展运动的3组组成。在刚刚运动后，受试者被随机分配服用如实施例4中所述的测试样品。受试者和测试者均对所服用的补充剂不知情。
在运动后2和4小时再收集肌肉样品。在第三次活检后，受试者再次摄入与先前相同的补充剂。
运动后24小时，受试者再次以未进食状态回到实验室进行第四次(最后一次)肌肉活检。
从收集的肌肉活检中提取RNA，并分析肌肉增生肥大标记物和肌肉炎症标记物的表达变化。
研究了肌肉恢复的两个方面：(1)运动后肌肉中的炎症程度；(2)肌肉通过增加体积(增生肥大)来适应的能力。
c-Fos和JunB共同组成转录因子复合物AP-1。AP-1复合物对于高强度和损伤运动后炎症相关基因的调节而言是非常重要的。c-Fos和JunB基因的表达在高强度运动后被迅速诱导，其提供了肌肉内早期炎症反应的有用标记物。使用市售试剂盒来测定肌肉活检中c-Fos和JunB的表达。
骨骼肌增生肥大部分受控于碱性-环-螺旋家族的生肌调节因子(myogenic regulatory factor，MRF)的活性。先前已将MRF成员MyoD和成肌蛋白(Myogenin)鉴定为在骨骼肌针对抗阻力运动的适应性反应中具有重要性。肌肉生长的另一重要调节因子是肌肉生长抑制素。已知高水平的肌肉生长抑制素抑制肌肉生长，并且在高强度抗阻力运动后肌肉生长抑制素基因的表达明显受到抑制。因此，选择MyoD、成肌蛋白和肌肉生长抑制素基因表达作为肌肉增生肥大的标记物。使用已公开的方法(例如Megeney等(1996).Genes Dev.10：1173-1183；Ohkawa等，The EMBO Journal(2006)25，490-501；以及Roth等，ExperimentalBiology and Medicine 228：706-709(2003))来测定这些基因的表达。
实施例6.生产进一步的WPI水解产物。
使用两个EC分类的各3个实例对根据实施例1生产的WPI进行酶水解，以证实生物活性不是根据实施例2的
Figure A200780021776D00241
消化所特有的。
EC 3.4.24.28的实例：
Figure A200780021776D00242
-蛋白酶N“Amano”
-Colorase N
EC 3.4.21.62的实例：
Figure A200780021776D00251
-枯草杆菌蛋白酶A(类型VIII)
-Optimase
生产流程(实验室规模)
在1600h，将根据实施例1生产的WPI溶于水中，得到1L10％(重量/重量)WPI溶液。将WPI储存于4℃过夜。第二天，在1400h将含有WPI的1L瓶温和加热至50℃，并通过小心加入2M NaOH将pH调至pH6.6。将该1L WPI溶液分成6瓶，每瓶含有100mL10％(重量/重量)WPI溶液。
将大约50mg的酶(蛋白酶N“Amano”、Colorase N、
Figure A200780021776D00253
枯草杆菌蛋白酶A(VIII型)或Optimase)加至WPI中，然后将WPI溶液在50℃孵育1小时。
定期测量pH，但是在1小时孵育期间不进行调整。通过加入2MHCl将水解WPI溶液的pH调至4.0然后在50℃孵育30分钟，从而使剩余的酶失活。
然后通过加入2M NaOH来中和(pH5.5)溶液。将所述样品在45℃加热，在1mBar的真空下冻干48小时。
将粉末送至TGR Biosciences进行生物活性测定，测定如实施例3先前所述进行，只是样品以0.2mg/ml和1mg/ml进行测定。
结果显示于图6中。1mg/ml枯草杆菌蛋白酶A(VIII型)是目前经LPS刺激的巨噬细胞中TNFα表达的最好抑制剂，但是所有其它水解产物在0.2mg/ml和1.0mg/ml下都比未水解的WPI具有更好的抑制活性。
结果证实了图4的发现。
实施例7.调节经LPS刺激的巨噬细胞中的TNFα表达-竞争物对照
用市售的乳级分产品作为对照重复进行实施例3中的实验，以显示本发明水解产物在TNFα表达方面的作用不同于本领域已知的制剂。
进行测试的样品为：
A    “iso100”             可得自Dymatize(89％蛋白质)
B    “黄金标准品”         可得自Optimum(81.63蛋白质)
C    “HP100”              可得自ASN(89％蛋白质)
D    “VP2”                可得自AST(85.7％蛋白质)
E    “Hydroxyphase”       可得自Max(90％蛋白质)
F    WPI                    参见实施例1(89％蛋白质)
G    根据实施例2制备的经Neutrase消化的WPI(88％蛋白质)
nWGFE乳清生长因子提取物根据PCT/AU2006/001323来制备。
图7中显示的结果说明，与其它样品(大多刺激TNFα表达)相比，本发明的水解产物能够抑制经LPS刺激的巨噬细胞的TNFα表达。
很显然，尽管本文提到了许多现有技术公开文献，但是这种引用不构成承认任何这些文献构成任何国家中本领域公知常识的一部分。
在不脱离本发明宽泛描述的精神或范围的前提下，本领域技术人员可以对如具体实施方案所示的本发明进行多种变形和/或改变。因此，本文的实施方案是示例性的而非限制性的。

Claims (27)

1.包含乳清蛋白或乳清蛋白水解产物的制剂，其中该制剂不包含谷氨酰胺、支链氨基酸、维生素E或维生素C中的一种，并且该制剂能够在体外抑制经脂多糖刺激的巨噬细胞的TNFα表达。
2.根据权利要求1的制剂，所述制剂是乳清蛋白的水解产物。
3.根据权利要求2的制剂，其中所述水解产物是酶水解产物。
4.根据权利要求3的制剂，其中所述酶是细菌来源的。
5.根据权利要求3的制剂，其中所述酶是真菌来源的。
6.根据权利要求3至5中任一项的制剂，其中所述酶是金属蛋白酶。
7.根据权利要求3至5的制剂，其中所述酶是来自IUBMB酶命名分类EC 3.4.24.28的酶或来自IUBMB酶命名分类EC 3.4.21.62的酶。
8.根据权利要求7的制剂，其中所述酶是
Figure A200780021776C0002135509QIETU
、
Figure A200780021776C0002135557QIETU
、枯草杆菌蛋白酶A(VIII型)、Colorase N、Optimase或蛋白酶N“Amano”。
9.包含乳清蛋白水解产物的制剂，所述水解产物是通过用来自IUBMB酶命名分类EC 3.4.24.28的酶或者IUBMB酶命名分类EC3.4.21.62的酶进行酶处理而获得的，其中所述酶不是Alcalase或Neutrase，该制剂能够在体外抑制经脂多糖刺激的巨噬细胞中的TNFα表达。
10.根据权利要求9的制剂，其中所述酶是枯草杆菌蛋白酶A(VIII型)、Colorase N、Optimase或蛋白酶N“Amano”。
11.根据前述权利要求任一项的制剂，其中所述乳清蛋白是乳清蛋分离物或乳清蛋白浓缩物。
12.包含根据前述权利要求任一项所述制剂的营养保健品制剂。
13.根据权利要求12的营养保健品制剂，其用于缓解由肌肉损伤所致的肌肉功能下降和/或用于促进肌肉损伤恢复和/或用于增强肌肉的生力能力。
14.根据前述权利要求任一项所述制剂用于缓解由肌肉损伤所致的肌肉功能下降和/或用于促进肌肉损伤恢复和/或用于增强肌肉生力能力的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述肌肉损伤是由运动诱发的肌肉损伤。
16.用于缓解由肌肉损伤所致的肌肉功能下降和/或用于促进肌肉损伤恢复和/或用于增强肌肉生力能力的方法，该方法包括向受试者施用权利要求1至12中任一项的制剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述肌肉损伤是由运动诱发的肌肉损伤。
18.根据权利要求14所述的用途或者根据权利要求16的方法，其中施用所述制剂以提供至少50mg/kg体重至1500mg/kg体重的乳清蛋白或水解产物。
19.根据权利要求14所述的用途或者根据权利要求16的方法，其中所述制剂在运动后立即施用。
20.根据权利要求14所述的用途或者根据权利要求16的方法，其中所述制剂在运动后20分钟至2小时施用。
21.根据权利要求14所述的用途或者根据权利要求16的方法，其中所述制剂用于口服施用。
22.包含权利要求1至13任一项所述的制剂的食物、饮料、片剂或胶囊，其用于权利要求14所述的用途或者权利要求16的方法。
23.制备用于缓解由肌肉损伤所致的肌肉功能下降和/或用于促进肌肉损伤恢复和/或用于增强肌肉生力能力之制剂的方法，该方法包括水解乳清蛋白以生产包含乳清蛋白水解产物的制剂。
24.根据权利要求23的方法，其中所述乳清蛋白水解产物通过乳清蛋白的酶水解来生产。
25.根据权利要求23的方法，其中所述制剂是权利要求2至9任一项所述的制剂。
26.根据权利要求23的方法或者根据权利要求2的制剂，其中所述水解产物具有0.5％～10％的净水解程度。
27.根据权利要求23的方法或者根据权利要求2的制剂，其中所述水解产物具有0.5％～4％的净水解程度。
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