JP2022040051A - 筋損傷回復促進用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】食品素材であり、予防の観点から日常的に継続して用いることができる筋損傷回復促進用組成物を提供する。【解決手段】コラーゲンペプチド及びホエイタンパク質を筋損傷回復促進用組成物の有効成分として用いる。この組成物は、有効成分たるコラーゲンペプチドとホエイタンパク質とが共同して筋肉マイクロダメージの回復に寄与するので、これにより筋損傷の回復を促進することができる。この組成物は、飲食品、食品添加物、医薬品、サプリメント、動物飼料等の形態で好適に用いられる。【選択図】 なし

Description

本発明は、運動等により損傷した筋肉の回復を促進するための組成物に関する。

一般的に骨格筋は、外傷や高強度の運動によって損傷される。筋損傷（骨格筋損傷）は運動能力の低下だけでなく、日常生活の動作にも影響がある。この筋損傷には、衝突などの外部的原因によって生じる外的損傷と、外部的原因によらずに筋肉内部で生じる内的損傷があり、後者が筋断裂や肉離れと呼ばれる現象であり、様々な年齢層およびスポーツで幅広く起こるといわれている。特にスポーツ選手の場合は競技からの長期離脱を強いられていることも多いため、この筋損傷からの回復を促進させ早期復帰させることは重要な課題である。この筋肉の内的傷害の原因の一つとして近年考えられているのが、筋肉の微視的損傷（マイクロダメージ）である。これは、主に、筋肉を構成している線維（筋線維）や周りの結合組織に微細な傷がつく現象を指し、筋肉のマイクロダメージが蓄積することによって肉離れが発生しやすくなると考えられている。

また、高強度や高頻度の運動を行うと時間をおいて筋肉痛（遅発性筋痛）が発生することはよく知られているが、この現象も筋肉のマイクロダメージが関係していると考えられている。すなわち、傷ついた筋線維を修復する過程で炎症が起き、生成された刺激物質が筋膜を刺激して起こるものと考えられている。

損傷した筋肉の回復を促進するための技術に関しては、例えば、神経毒であるボツリヌス毒素を使用するもの（特許文献１：特表２００４－５１８６３２）がある。これはボツリヌス菌の毒素を筋肉へ注射することで一時的に麻痺を起こし筋肉を不動化することによって回復を早めるものである。また、アンドロゲン受容体に結合性を有する新規アミノ置換ベンゾニトリル誘導体を使用するもの（特許文献２：特表２００７－５３７２３６）があるが、骨折又は骨粗鬆症骨折治療を主な効果とする医薬品であり、筋損傷は付随的な効果として示されている。さらに気管支喘息等に適応がある医薬品として知られるＮ－（３，４－ジメトキシシンナモイル）アントラニル酸（一般名：トラニスト)を使用するもの（特許文献３：特許４４４８４４７）が報告されているが、損傷部の筋線維化を抑制することで筋細胞増殖と筋線維芽細胞増殖のバランスを調整し、元の筋肉組織へ回復させる効果が示されている医薬品である。一方、食品素材においては、ＢＣＡＡ（分岐アミノ酸）を含むアミノ酸混合組成物を使用するもの（特許文献４：特許６４３１６７０）が報告されている。

特表２００４－５１８６３２号公報 特表２００７－５３７２３６号公報 特許４４４８４４７号公報 特許６４３１６７０号公報

しかしながら、特許文献１に記載のボツリヌス毒素や、特許文献２、３に記載の医薬的化合物の使用は、日々日常的に使用することは現実的ではない。また、特許文献４のアミノ酸は摂取にあたり苦みが課題であり、特にＢＣＡＡ（分岐アミノ酸）には独特の苦味や収斂味があり、需要者の嗜好性の観点から問題があった。

そこで本発明の目的は、食品素材であり、予防の観点から日常的に継続して用いることができる筋損傷回復促進用組成物を提供することにある。

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究し、コラーゲンペプチドとホエイタンパク質とが共同して筋肉マイクロダメージの回復に寄与することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、その第１の観点から、コラーゲンペプチド及びホエイタンパク質を有効成分とする筋損傷回復促進用組成物を提供するものである。

本発明にかかる上記筋損傷回復促進用組成物においては、該組成物は、飲食品、食品添加物、医薬品、サプリメント、又は動物飼料の形態であることが好ましい。

一方、本発明は、その第２の観点から、コラーゲンペプチド及びホエイタンパク質の、筋損傷回復促進用組成物の製造のための使用を提供するものである。

本発明にかかる上記使用においては、前記筋損傷回復促進用組成物は、飲食品、食品添加物、医薬品、サプリメント、又は動物飼料の形態であることが好ましい。

本発明によれば、コラーゲンペプチド及びホエイタンパク質を利用することにより、筋損傷回復促進に優れ、飲食品等の形態としても利用可能な、新規な機能性組成物を提供することができる。

図１は、試験例１において、試験期間中のマウス体重の変化を調べた結果を示す図表である。 図２（ａ）は、試験例１において、摘出した腓腹筋の湿重量を調べた結果を示す図表であり、図２（ｂ）は、試験例１において、摘出した腓腹筋のホモジナイズ上清中のタンパク質濃度を、湿重量当たりに規格化した量（比重量）で表した結果を示す図表である。 図３は、試験例１におけるＤＮＡマイクロアレイの結果を示す図表であり、ＣＴＸ誘導性筋損傷関連遺伝子の発現亢進が被験物質の投与により緩和された２３個の遺伝子についてのＤＮＡマイクロアレイの結果を示す図表である。 図４は、試験例１におけるＤＮＡマイクロアレイの結果を示す図表であり、ＣＴＸ誘導性筋損傷関連遺伝子の発現亢進がホエイタンパク質の投与により更に亢進された１７個の遺伝子についてのＤＮＡマイクロアレイの結果を示す図表である。 図５は、試験例２において、摘出した腓腹筋の湿重量を調べた結果を示す図表である。 図６は、試験例２において、摘出した腓腹筋のホモジナイズ上清中のタンパク質濃度を、湿重量当たりに規格化した量（比重量）で表した結果を示す図表である。 図７は、試験例２において、血漿中の炎症マーカーであるＬＤＨ活性を調べた結果を示す図表である。 図８は、試験例２におけるＤＮＡマイクロアレイの結果を示す図表であり、ＣＴＸ投与１日後の遺伝子の発現亢進について、炎症応答・マクロファージ、ＥＣＭ（細胞外マトリックス）、及び血管新生阻害に関わる遺伝子について、被験物質の投与による影響を調べた結果を示す図表である。

本発明にかかる筋損傷回復促進用組成物においては、その有効成分の１つとしてコラーゲンペプチドを用いる。

本発明に用いるコラーゲンペプチドとしては、豚、鶏、牛等の動物や魚類の真皮、皮、骨等に含まれるコラーゲンの加水分解物を用いることができる。例えば、豚皮等のコラーゲン含有原料に水又は水性溶媒を加えて加熱抽出又は加圧加熱抽出することにより、原料由来のコラーゲンを抽出することができる。そのコラーゲンを含む抽出物を、タンパク質加水分解酵素で処理してコラーゲンをペプチド化することができる。タンパク質加水分解酵素は、中性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、あるいはそれらを含有する酵素製剤などを用いることができる。コラーゲンの加水分解は、酵素による方法以外にも、酸、アルカリ、加熱、加圧等の処理による方法あるいはそれを伴う方法で行ってもよい。

上記のようにしてコラーゲン原料から調製された加水分解物は、本発明にそのまま用いてもよいが、珪藻土濾過処理、逆浸透膜処理、イオン交換樹脂処理、ＨＰＬＣ処理等の公知の方法により、更にコラーゲンペプチドを濃縮、分画、精製等してから用いてもよい。得られた調製物は、溶液状のまま用いてもよく、適宜乾燥して粉末化してから用いてもよい。

本発明に用いるコラーゲンペプチドは、その分子量構成に特に制限ないが、典型的に、例えば、平均分子量１００～２００００の範囲内であってよく、より典型的には平均分子量２００～１００００の範囲内であってよく、更により典型的には平均分子量１０００～８０００の範囲内であってよい。なお、コラーゲンペプチドの平均分子量とは、食用コラーゲンペプチド規格として通常知られているとおり、「重量平均分子量値」で示すことができ、具体的には、例えば、「写真用ゼラチン試験法（ＰＡＧI法）第１０版」（写真用ゼラチン試験法合同審議会、２００６年版）に依拠した方法などで測定することができる。

コラーゲンペプチドの由来となるコラーゲンの種類としては、従来２９種類程度報告されているが、いずれのものを用いてもよい。例えば、I型コラーゲンは、すべての臓器に存在し、多細胞動物の細胞外マトリックスの主成分となっている線維性コラーゲンであることが知られている。また、例えば、関節軟骨に多いＩＩ型コラーゲンは、筋肉は腱や骨だけではなく関節との関係性も深いことが知られている。

ただし、本発明にかかる筋損傷回復促進用組成物の有効成分として、その有効量を確保するには、コラーゲンペプチドとして使用する素材中の乾燥分あたりのコラーゲンペプチドの含有量（純度）としては、典型的に、例えば、５０～１００質量％の範囲であることが好ましく、より典型的には８０～１００質量％の範囲であることが好ましく、更により典型的には９０～１００質量％の範囲であることが好ましい。コラーゲンペプチド素材としては、例えば、市販品として、「ＰｅｐｔａｎＰ５０００ＨＤ」（商品名、Ｒｏｕｓｓｅｌｏｔ社製）、「ＰｅｐｔａｎＰ２０００ＨＤ」（商品名、Ｒｏｕｓｓｅｌｏｔ社製）、「ニッピペプタイド（商品名、新田ゼラチン社製）、「Ｗｅｌｌｎｅｘ」（商品名、新田ゼラチン社製）、「ＨＡＣＰ」（商品名、ゼライス社製）、Ｎａｔｉｃｏｌ（商品名、ヴァイスハルト）、「バイオアクティブコラーゲンペプチド」（商品名、ジェリータ社製）、「ＳＯＬＵＧＥＬ」（商品名、ＰＢゼラチン社製）、「Ｉｔａｌｙ ＰＦ」（商品名、ＰＢゼラチン社製）、「ＬＡＰＩ ＰＦ」（商品名、ＰＢゼラチン社製）、「マリンコラーゲンオリゴ」（商品名、日祥社製）、「マトリックスネオ」（商品名、焼津水産化学工業社製）、「ＵＣ-ＩＩ」（商品名、アリスコーポレーション社製）、「Ｉｔａｌｇｅｌ」（商品名、イタルゼラチン社製）等があるので、そのような市販品を用いてもよい。

なお、コラーゲンペプチドは、単独で１種類のものを用いてもよく、２種類以上のものを組み合わせて用いてもよい。

本発明にかかる筋損傷回復促進用組成物においては、その有効成分のもう１つとしてホエイタンパク質を用いる。

ホエイは、牛乳等の乳から脂肪を除去した脱脂乳に酸またはレンネットを添加して、乳の主蛋白質であるカゼインを除いて得られる透明な淡黄色の水溶液で、乳清ともいう。また、牛乳に酸またはレンネットを直接作用させて、脂肪とカゼインとからなるカードを除去して得られる水溶液もホエイという。ホエイには、例えば、牛乳等の乳からチーズを調製する際に生じるチーズホエイや、牛乳等の乳からカゼインを調製する際に生じるカゼインホエイや、牛乳等の乳からヨーグルト等の乳酸発酵物を調製する際に生じる乳酸発酵ホエイ等、乳原料から目的物を調製する工程で生じる廃液としても得られる場合がある。また、これらから加熱処理や限外濾過等により、乳清蛋白質を回収した廃液もホエイという。

本発明に用いるホエイタンパク質としては、上記ホエイに含まれるタンパク質であればよく、ホエイ原料に特に制限はない。例えば、特開昭４８－３５０６１号公報には、チーズやカゼインの製造する際に副生してくるホエイを、珪藻土炉過器に通し、限外炉過にかけた後、強酸性陽イオン交換樹脂と接触させ、２．７～３．６の範囲のｐＨを有するホエイタンパク質を回収する方法が開示されているので、そのような公知の方法で、任意のホエイ原料から調製することが可能である。

ただし、本発明にかかる筋損傷回復促進用組成物の有効成分として、その有効量を確保するには、ホエイタンパク質として使用する素材中の乾燥分あたりのホエイタンパク質の含有量（純度）としては、典型的に、例えば、６０～１００質量％の範囲であることが好ましく、より典型的には７０～１００質量％の範囲であることが好ましく、更により典型的には９０～１００質量％の範囲であることが好ましい。一般に、ホエイタンパク質素材としては、例えば、ホエイプロテインコンセートレート（ＷＰＣ）とホエイプロテインアイソレート（ＷＰＩ）がある。ＷＰＣはタンパク質含有量が７０～８０％程度であり、乳糖やビタミン、ミネラル等の栄養素が豊富で、安価なことが特徴である。一方、ＷＰＩは８０～９５％程度であり、価格も高くなる。本発明に用いるホエイタンパク質としては、ＷＰＣとＷＰＩのどちらでもよい。また、市販品として、「ＳｕｒｅＰｒｏｔｅｉｎ」（商品名、フォンテラ社製）、「ラクトクリスタルｐｌｕｓ」（商品名、日本新薬社製）、「Ｗｈｅｙｃｏ Ｗ８０」（商品名、日本新薬社製）、「ＰＲＯＧＥＬ８００」（商品名、日本新薬社製）、「ＷＷＰ９０１０」（商品名、日本新社製薬）等があるので、そのような市販品を用いてもよい。

なお、ホエイタンパク質は、単独で１種類のものを用いてもよく、２種類以上のものを組み合わせて用いてもよい。

本発明にかかる組成物は、筋損傷の回復促進用の用途に用いられる。

ここで、本発明にかかる筋損傷回復促進用組成物において「筋損傷」とは、具体的には、衝突などの外部的要因によって生じる外的傷害であってもよく、肉離れなどに代表されるように外部的要因なく起こる、筋肉内部で生じる内的傷害でであってもよい。また、「回復促進用」とは、現状をより良好にすることを含み、現状を維持したり、より悪くならないようにしたりする目的を含む意味である。より具体的には、筋肉の微視的損傷（マイクロダメージ）であってもよい。また、高強度や高頻度の運動を行うと時間をおいて筋肉痛（遅発性筋痛）が発生することはよく知られているが、この現象も筋肉のマイクロダメージが関係しており、すなわち、傷ついた筋線維を修復する過程で炎症が起き、生成された刺激物質が筋膜を刺激して起こるものと考えられている。よって、そのような筋肉痛（遅発性筋痛）などの症状を回復する用途にも、本発明にかかる組成物が用いられ得る。

より詳細には、本発明にかかる筋損傷回復促進用組成物は、例えば、スポーツ選手、部活動などで定期的な運動をする者、スポーツをする健常者、日ごろ運動量の少ない者やスポーツ等を始めた者、生活習慣病の改善のために運動を必要とする者、高齢者などの健康増進のために運動を必要とする者、リハビリとして体を動かす訓練をしている者等に好適に用いられ得る。特に、運動量の少ない者にとって、スポーツや筋力トレーニング等といった運動は日常生活での身体運動（軽い運動）よりも強度の運動となり、筋肉の障害を引き起こし易いため、より好適に用いられ得る。より具体的には積極的にスポーツをするヒトに、より好適に用いられ得る。本発明にかかる組成物を摂取することに得られる効果として考えられることには、肉離れや筋肉痛を防いだり、それらを早期に回復させたりすることである。これにより、アスリートはトレーニングに充てる時間を十分に確保、高齢者は寝たきりや筋量低下を防ぎ日常生活を継続することができるようになる。最終的には筋量増加、筋量減少防止、運動パフォーマンス上昇、高負荷に耐えうる筋力増加、運動量の増加などの効果が期待される。また、ヒトに限らず、イヌ、ネコ等の動物にも適用され得る。

本発明においては、上記したような筋損傷の回復促進用の用途のため、第１の有効成分であるコラーゲンペプチドと、第２の有効成分であるホエイタンパク質とを、併用してヒト又は動物に投与するようにすればよい。その際、第１の有効成分としてコラーゲンペプチドと、第２の有効成分としてホエイタンパク質とを、それぞれが別体の組成物中に含まれるように構成して、使用時に併用して投与するようにしてもよく、第１の有効成分としてコラーゲンペプチドと、第２の有効成分としてホエイタンパク質とを、それぞれが混合された単一の組成物中に含まれるように構成してもよい。投与方法に特に制限はないが、経口投与が使用者に負担が少ないので好ましい。ヒト又は動物への投与用の組成物中のコラーゲンペプチドの含有量としては、所望する投与量の確保の観点から適宜に調整すればよく、特に制限はない。例えば、コラーゲンペプチドとホエイタンパク質とを、それぞれが別体の組成物中に含まれるように構成する場合に、その組成物中のコラーゲンペプチド及びホエイタンパク質のそれぞれの含有量は、１～９９．９９質量％の範囲内の含有量であってよく、２０～９９．９質量％の範囲内の含有量であってよく、４０～９９．９９質量％の範囲内の含有量であってよく、６０～９９．９９質量％の範囲内の含有量であってよく、８０～９９．９９質量％の範囲内の含有量であってよい。一方、例えば、コラーゲンペプチドとホエイタンパク質とを、それぞれが混合された単一の組成物中に含まれるように構成する場合のコラーゲンペプチドの含有量は、１～９５質量％の範囲内の含有量であってよく、１～７０質量％の範囲内の含有量であってよく、１０～６０質量％の範囲内の含有量であってよく、１５～５５質量％の範囲内の含有量であってよく、２０～５０質量％の範囲内の含有量であってよい。また、その場合のホエイタンパク質の含有量は、例えば、１～９５質量％の範囲内の含有量であってよく、１０～９０質量％の範囲内の含有量であってよく、２０～８５質量％の範囲内の含有量であってよく、３０～８０質量％の範囲内の含有量であってよく、４５～８０質量％の範囲内の含有量であってよい。また、その場合のコラーゲンペプチドとホエイタンパク質の含有量の質量比としては、実際に投与する際の投与量比に揃えることが好ましく、例えば、１０：９０～９０：１０の範囲内であってよく、２０：８０～７０：３０の範囲内であってよく、２０：８０～５０：５０の範囲内であってよい。

本発明にかかる筋損傷回復促進用組成物（コラーゲンペプチドを含有する組成物とホエイタンパク質を含有する組成物とが別体の場合も同様）においては、運動能力に対してプラス効果を有する１つ以上の追加の成分と組み合わせることができる。この種の成分は、例えばビタミンＣ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｋのビタミン類、クレアチン、Ｌ-カルニチン、Ｌ-シトルリン、Ｌ-アルギニン、例えばアントシアニン、カロチノイド、フラボノイド、レスベラトロール、グルタチオン、スーパーオキシドジスムターゼの抗酸化剤、例えば鉄、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、セレン、リンのミネラル類、クレアチン、食物繊維、乳酸菌、例えば大豆、小麦、エンドウ豆タンパク質等のコラーゲン及び／又はホエイタンパク質以外のタンパク質又はその加水分解物ないしペプチド等が挙げられる。

本発明にかかる筋損傷回復促進用組成物（コラーゲンペプチドを含有する組成物とホエイタンパク質を含有する組成物とが別体の場合も同様）は、適当な添加物や製剤的素材等ととともに、例えば、飲食品、食品添加物、医薬品、サプリメント、動物飼料の等の形態に調製してもよい。

典型的に、飲食品の形態としては、例えば、ゼリー、プリン、グミ、ガム、チョコレート、クッキー、キャンデー、バー菓子等の菓子類、パン類、食用油類、マヨネーズ、ドレッシング、バター、クリーム、マーガリン等の油脂食品類、ケチャップ、ソース等の調味料類、牛乳、ヨーグルト、チーズ等の乳製品類、うどん、そば、ラーメン、パスタ、やきそば、きしめん、そーめん、ひやむぎ、ビーフン等の麺類、味噌汁、コーンスープ、コンソメスープ等のスープ類、お茶、炭酸飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料等の飲料類、流動食、ふりかけ等の形態が挙げられる。

また、典型的に、サプリメントや医薬品の形態としては、例えば、散剤、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等の形態が挙げられる。

本発明にかかる筋損傷回復促進用組成物の好ましい投与量としては、被投与者又は被投与動物の年齢や健康状態、投与継続期間、投与頻度などによって、適宜決定することができる。一般的な投与量を例示すれば、例えば、コラーゲンペプチドにして３０～４００ｍｇ／ｋｇ（体重）／１日の量、より好ましくは５０～３００ｍｇ／ｋｇ（体重）／１日の量、更に好ましくは８０～２００ｍｇ／ｋｇ（体重）／１日の量で投与することができる。また、ホエイタンパク質にして５０～１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）／１日の量、より好ましくは１５０～６５０ｍｇ／ｋｇ（体重）／１日の量、更に好ましくは２５０～５００ｍｇ／ｋｇ（体重）／１日の量で投与することができる。その際、コラーゲンペプチドとホエイタンパク質との投与量比としては、質量比にして１０：９０～９０：１０の範囲内であってよく、２０：８０～７０：３０の範囲内であってよく、２０：８０～５０：５０の範囲内であってよい。

一般に、コラーゲンペプチドやホエイタンパク質は、従来から汎用されている食品素材であり、安全性は高いものである。このため、本発明にかかる筋損傷回復促進用組成物は、所定期間にわたって継続的に摂取するように用いられてもよく、例えば１ヶ月以上にわたって継続的に摂取するように用いられることも可能である。一方、一般的に運動習慣があるヒトにおいて、タンパク質の摂取量は１．０～２．０ｇ／ｋｇ／１日とされている。すなわち、体重６０ｋｇのヒトであれば６０～１２０ｇ／１日の摂取が必要である。その場合、例えば、通常の食事から６０ｇ程度摂取可能であるとすると、本発明にかかる組成物は、更に不足したタンパク質を摂取する場合にも好適に用いられる。

なお、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で、各種の変形実施形態が可能であり、そのような実施形態も本発明の範囲に含まれる。また、本発明は、筋損傷の回復を促進するための組成物を提供するものであるが、別の観点からは、コラーゲンペプチド及びホエイタンパク質を筋損傷の回復を促進するための有効量でヒト等に投与する処置方法、治療方法、患部状態の改善方法等を提供するものであるということもできる。

以下実施例を挙げて更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

［試験例１］
〔１．試験材料〕
（１－１．被験物質）
・コラーゲンペプチド：「ＰｅｐｔａｎＰ５０００ＨＤ」（商品名、Ｒｏｕｓｓｅｌｏｔ社製）、豚皮由来、平均分子量５０００、高比重タイプ（比重：０．４０－０．５５／ｃｍ^３）（コラーゲンペプチドの純度：１００％）
・ホエイタンパク質：「ＬＡＣＴＯＭＩＮ８０－Ｓ」（商品名、Ｌａｃｔｏｐｒｏｔ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ社製）、８０％乳清タンパク濃縮物

（１－２．筋損傷誘導剤）
・カルディオトキシン（Ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ）： １５μＭ Ｌａｔｏｘａｎ社製

（１－３．動物）
・マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ Ｊｍｓ Ｓｌｃ、ＳＰＦ、雄）：７週齢マウスを入荷して下記飼育環境下に１週間訓化飼育し、体重が均等となるように５匹ずつ５群に群分けして試験に供した。試験期間中の飼育環境は訓化期間中と同様とした。

＜飼育環境＞
・温度：１８～２８℃
・相対湿度：３０～８０％
・照明時間：１２時間（７：００～１９：００）
・餌：固形飼料ＭＦ（オリエンタル酵母工業株式会社製）、自由摂取
・飲料水：自由摂取

〔２．試験方法〕
（２－１．動物試験）
マウスの腓腹筋中腹に、カルディオトキシン（Ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ）（以下、「ＣＴＸ」という場合がある。）を筋肉内投与して、ＣＴＸ誘導筋肉損傷モデルを作製した。その際、ＣＴＸ処置の７日前から処置１４日後まで、被験物質としてコラーゲンペプチド、ホエイタンパク質、又はコラーゲンペプチド及びホエイタンパク質を、ゾンデを用いて２１日間経口投与した。

表１には、各試験群について、被験物質、投与用量、投与容量、ＣＴＸ処置の有無、ＣＴＸ処置容量、及び例数をまとめて示す。

（２－２．剖検）
投与最終日の翌日に、マウスを麻酔し、腹部大動脈より採血を行って、放血致死させた後、腓腹筋を摘出した。タンパク質量測定用に一部分を取り分けて湿重量を測定し、残りをＤＮＡマイクロアレイ用にＲＮＡ安定化剤（商品名「ＲＮＡｌａｔｅｒ」、ＱＩＡＧＥＮ製）の溶液に浸漬して、冷蔵室で一晩置いた後、溶液から取り出して－８０℃以下で凍結保存した。

（２－３．タンパク質量測定）
湿重量を測定した腓腹筋をビーズ式試料破砕機用チューブに入れ、更にジルコニウムビーズと所定量（１ｍＬ）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えて、ドライアイスによる冷却下、ビーズ式試料破砕機で３分間ホモジナイズした。１２，０００×ｇ、４０℃で１５分間遠心し、上清を分取して、測定キット「ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」（商品名、ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を用いてタンパク質濃度を測定した。測定キットのマイクロプレートプロトコールに従い、その際のスタンダードはＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）のＰＢＳ溶解希釈系列０．０７８ｍｇ～５ｍｇ／ｍＬとした。マイクロプレートリーダー「ｉＭａｒｋ」（商品名、ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を用いて６３０ｎｍにおける吸光度を測定した。

ＢＳＡスタンダード曲線より、サンプルのＢＳＡ相当タンパク質濃度を算出した。結果は、湿重量当たりに規格化し、各測定値は平均値±標準誤差で表した。また、下記統計学的方法により有意差を検定した。

＜統計学的方法＞
Ａ１群及びＡ２群について２群の検定を行い、Ｆ検定により分散に一様性が認められる場合にはＳｔｕｄｅｎｔのt検定を、分散に一様性が認められない場合にはＡｓｐｉｎ ｗｅｌｃｈのt検定を行った。また、Ａ２群～Ａ５群については、それぞれ多重比較検定を行った。多重比較検定は、Ｂａｒｔｌｅｔｔ検定により分散に一様性が認められる場合にはパラメトリックのＤｕｎｎｅｔｔ ｔｅｓｔを、分散に一様性が認められない場合にはノンパラメトリックのＳｔｅｅｌ ｔｅｓｔを行った。有意水準は５％未満とした。

（２－４．ＤＮＡマイクロアレイ）
凍結保存していた腓腹筋サンプルを素早く解凍し、各個体に「ＲＮＡｉｓｏ ｐｌｕｓ」（商品名、タカラバイオ株式会社製）を用いて核酸抽出を行い、さらに液相でＤＮａｓｅ処理して、精製キット（商品名「ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ」、ＱＩＡＧＥＮ製）によりｔｏｔａｌＲＮＡを精製した。

得られたｔｏｔａｌＲＮＡの品質管理は、ＲＮＡ純度として、Ａ２６０／２３０比が１．５以上ならびにＡ２６０/２８０比が１．８以上を基準とした。更に、ＲＮＡの電気泳動像から分解度ＲＩＮ（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ）（商品名、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を導出し、ＲＩＮ値として、１０点満点中７．０以上のＲＮＡのみ使用した。基準適合ＲＮＡは次のステップまで冷凍（－７０℃以下）保管した。

各試験群にＲＮＡサンプルをプールして、Ｃｙ３ラベル化ｃＲＮＡ合成用キット「Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｑｕｉｃｋ Ａｍｐ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ」（商品名、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、Ｃｙ３ラベル化ｃＲＮＡの合成と精製を行った。得られたラベル化ｃＤＮＡの濃度、Ｃｙ３－ＣＴＰ導入率を、２６０ｎｍ、２８０ｎｍ、５５０ｎｍ、及び３２０ｎｍでの吸光度より算出し、基準値（Ｃｙ３－ＣＴＰ導入率＞６ｐｍｏｌ／μｇ）を満たしていることを確認した。

各試験群のラベル化ｃＲＮＡを、マイクロアレイハイブリダイゼーション用キット「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（商品名、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてフラグメンテーションし、マウス遺伝子発現解析用アレイ「Ｗｈｏｌｅ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｖｅｒ２．０」（商品名、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に供して、６５℃で１７時間ハイブリダイゼーションした。その後、アレイ洗浄液「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ」（商品名、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてアレイスライドを洗浄し、マイクロアレイスキャナーでスキャンしたアレイ画像を、アレイ解析ソフトウェア「ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ」（商品名、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）で数値化した。蛍光強度値を規格化し、Ａ１群（媒体群；ＣＴＸ投与なし）に対するＡ２群（媒体群；ＣＴＸ投与有り）、Ａ３群（コラーゲンペプチドの単独投与群）、Ａ４群（ホエイタンパク質の単独投与群）、又はＡ５群（コラーゲンペプチドとホエイタンパク質との併用投与群）の蛍光強度の比を算出した。

〔３．試験結果〕
（３－１．体重）
図１には、試験期間中のマウス体重の変化を示す。

図１に示されるように、いずれの試験群も投与期間を通じて順調な体重の増加を示し、各試験群間で有意な差異は認められなかった。このことから投与物質はいずれもマウスに対して大きな身体的影響を与えるものではなく、量、質ともに安全であることが示された。

（３－２．腓腹筋重量及びタンパク質量）
図２には、摘出した腓腹筋の湿重量と、摘出した腓腹筋のホモジナイズ上清中のタンパク質濃度を、湿重量当たりに規格化した量（比重量）で示す。

図２（ａ）に示されるように、摘出した腓腹筋の湿重量は、Ａ１群（媒体群；ＣＴＸ投与なし）で１６１．５ｍｇであり、Ａ２群（媒体群；ＣＴＸ投与有り）で１６５．５ｍｇであり、Ａ３群（コラーゲンペプチドの単独投与群）で１６５．０ｍｇであり、Ａ４群（ホエイタンパク質の単独投与群）で１４８．９ｍｇであり、Ａ５群（コラーゲンペプチドとホエイタンパク質との併用投与群）で１５３．２ｍｇであり、有意水準は５％未満とする有意差検定では、各試験群間で有意な差異は認められなかった。

図２（ｂ）に示されるように、摘出した腓腹筋のタンパク質量（比重量）は、Ａ１群（媒体群；ＣＴＸ投与なし）で１２．５６ｍｇ／ｍＬであり、Ａ２群（媒体群；ＣＴＸ投与有り）で１２．３８ｍｇ／ｍＬであり、Ａ３群（コラーゲンペプチドの単独投与群）で１２．５０ｍｇ／ｍＬであり、Ａ４群（ホエイタンパク質の単独投与群）で１１．９９ｍｇ／ｍＬであり、Ａ５群（コラーゲンペプチドとホエイタンパク質との併用投与群）で１３．０７ｇｍｇ／ｍＬであり、有意水準５％未満とする有意差検定では、各試験群間で差異は認められなかった。以上の結果から、本筋肉損傷モデルは筋肉全体に対して大きな損傷を与えておらず、マイクロダメージという観点でふさわしい試験系であることが示された。

（３－３．ＤＮＡマイクロアレイ）
（３－３－１．ＣＴＸ誘導性筋損傷関連遺伝子の発現亢進の緩和 その１）
筋損傷誘導剤であるＣＴＸを投与した媒体投与群では、ＣＴＸを投与しなかった媒体投与群と比較して、４１４個の遺伝子が発現亢進を示した。それらの発現亢進遺伝子のうち、被験物質の投与により、２倍の発現亢進率が１．１４倍未満に緩和される遺伝子を抽出したところ、以下の２３個の遺伝子が抽出された。

・Ｓｐｐ１：ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ １
・Ｉｇｔａｘ：ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ Ｘ
・Ｇｐｎｍｂ：ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）ｎｍｂ
・Ｃｌｅｃ７ａ：Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｙ ７、ｍｅｍｂｅｒ ａ
・Ｔｒｅｍ２：ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ２
・Ｌｇａｌｓ３：ｇａｌｅｃｔｉｎ－３
・Ｃ１ｑｂ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏａｘｎｅｎｔ １、ｑ ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ、ｂｅｔａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ
・Ｃｔｓｓ：ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｓ
・Ｈ２－Ａａ：ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ２、ｃｌａｓｓＩＩ ａｎｔｉｇｅｎ Ａ、ａｌｐｈａ
・Ｃｄ８３：ＣＤ８３ ａｎｔｉｇｅｎ
・Ｉｓｇ１５：ＩＳＧ１５ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ
・Ｏａｓｌ１：２’－５’ Ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ－ｌｉｋｅ １
・Ｌａｐｔｍ５：ｌｙｓｏｓｏｍａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ５
・Ｇｍ７３２５：ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ７３２５
・Ｋｒｔ１８：ｋｅｒａｔｉｎ １８
・Ｉｇｆ２：ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２
・Ｍｙｏｇ：ｍｙｏｇｅｎｉｎ
・Ｔｐｍ３：ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ ３、ｇａｍａ
・Ａｂｌｉｍ１：ａｃｔｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ＬＩＭ ｐｒｏｔｅｉｎ １
・Ｃｌｅｃ３ｂ：Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｙ ３、ｍｅｍｂｅｒ ｂ
・Ｍｅｓｔ：ｍｅｓｏｄｅｒｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
・Ｋｃｎｅ１Ｌ：ｐｏｔａｓｓｉｕｍｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ ｃｈａｎｎｅｌ、Ｉｓｋ－ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｍｉｌｙ、ｍｅｍｂｅｒ Ｌ－ｌｉｋｅ
・ＢＣ０２８５２８：ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＢＣ０２８５２８

結果を、表２及び図３に示す。

表２及び図３に示されるとおり、筋損傷誘導剤であるＣＴＸ投与による発現亢進を緩和した遺伝子数は、コラーゲンペプチドの単独投与群（Ａ３群）では４個であり、ホエイタンパク質の単独投与群（Ａ４群）では０個であったが、コラーゲンペプチドとホエイタンパク質とを併用投与した試験群（Ａ５群）では２３個であった。

（３－３－２．ＣＴＸ誘導性筋損傷関連遺伝子の発現亢進の緩和 その２）
筋損傷誘導剤であるＣＴＸを投与した媒体投与群で発現亢進がみられた４１４個の遺伝子のうち、ホエイタンパク質の単独投与群（Ａ４群）では、以下の１７個の遺伝子について、発現が更に亢進していた。一方、コラーゲンペプチドの単独投与群（Ａ３群）やコラーゲンペプチドとホエイタンパク質とを併用投与した試験群（Ａ５群）では、そのような発現の更なる亢進はみられなかった。

・Ｌｓｔ１：ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ １
・Ｅｍｒ１：ＥＧＦ－ｌｉｋｅ ｍｏｄｕｌｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ、ｍｕｃｉｎ－ｌｉｋｅ、ｈｏｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ １
・Ａｉｆ１：ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ １
・Ｃｌｅｃ４ａ１：Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｙ ４、ｍｅｍｂｅｒ ａ１
・Ｓｌａｍｆ９：ＳＬＡＭ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ９
・Ｆｃｅｒ１ｇ：Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＩｇＥ、ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ １、ｇａｍｍａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ
・Ｌｃｐ１：ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ １
・Ｕｎｃ９３ｂ１：ｕｎｃ－９３ ｈｏｍｏｌｏｇ Ｂ１
・Ｃｄ１４：ＣＤ１４ ａｎｔｉｇｅｎ
・Ｌｙ８６：ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ８６
・Ｌｉｌｒｂ３：ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｂ（ｗｉｔｈ ＴＭ ａｎｄ ＩＴＩＭ ｄｏｍａｉｎｓ）、ｍｅｍｂｅｒ ３
・Ｓｉｒｐａ：ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｐｈａ
・Ｍｐｅｇ１：ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅ １
・Ｓｐｐ１：ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ １
・Ｔｙｒｏｂｐ：ＴＹＲＯ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ
・Ｃｙｔｈ４：ｃｙｔｏｈｅｓｉｎ ４
・Ｓｌｃ１１ａ１：ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ １１（ｐｒｏｔｏｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｉｖａｌｅｎｔ ｍｅｔａｌ ｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ）、ｍｅｍｂｅｒ １

結果を、表３及び図４に示す。

表３及び図４に示されるとおり、ホエイタンパク質の投与によるＣＴＸ誘導性遺伝子の更なる発現亢進は、コラーゲンペプチドとの併用により、媒体投与のレベルかそれ以下にまで、発現亢進が緩和した。

［試験例２］
表４に示す各試験群について、ＣＴＸ投与から１日後又は７日後にマウスを剖検に処した以外は試験例１と同様にして試験を行って、マウスの体重変化、腓腹筋の湿重量・タンパク質量、及びＤＮＡマイクロアレイの各測定項目について結果を得た。また、血漿中の炎症マーカーであるＬＤＨ活性（乳酸脱水素酵素活性）を、日立自動分析装置（3500，株式会社日立ハイテク）を使用して測定した。

その結果、試験期間中のマウス体重の変化を測定したところ、いずれの試験群も投与期間を通じて順調な体重の増加を示し、各試験群間で有意な差異は認められなかった。

また、図５に示されるように、摘出した腓腹筋の湿重量は、ＣＴＸ投与１日後で増加傾向、ＣＴＸ投与７日後で減少傾向を示した。ＣＴＸ投与１日後でＢ２群（媒体群；ＣＴＸ投与有り）では増加が緩やかであり、反対にＢ３群（ホエイタンパク質群；ＣＴＸ投与有り）はＢ２群（媒体群；ＣＴＸ投与有り）と比較して有意な増加を示した。ただし、いずれも体重当たりの重量で比較すると有意な変化とは言えなかった。

また、図６に示されるように、摘出した腓腹筋のタンパク質量（比重量）は、いずれの群においてもＣＴＸ投与１日後で減少、ＣＴＸ投与７日後で回復傾向を示した。なお、Ｂ１群（媒体群；ＣＴＸ投与なし）に比べてＢ２群（媒体群；ＣＴＸ投与有り）では有意な減少が認められた。

図５、図６の結果より、ＣＴＸ投与１日後ではいずれの群においても腓腹筋の湿重量が増加するものの、タンパク質量（比重量）は減少しており、炎症の初期症状である浮腫の状態であることが予想される。また、ＣＴＸ投与７日後ではタンパク質量（比重量）はＢ１群（媒体群；ＣＴＸ投与なし）と同程度まで回復するものの、腓腹筋の湿重量が減少したままであることから、回復の途中段階であると考えられる。Ｂ３～Ｂ６の被験物質投与群での大きな違いはなかったものの、本試験では筋肉が損傷を受けてから炎症、再生を行うという事象を観察するのに適したモデルとタイムポイントであると考えられる。

また、図７に示されるように、血漿中の炎症マーカーである乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性は、ＣＴＸ投与１日後において、Ｂ１群（媒体群；ＣＴＸ投与なし）と比べて媒体群では約４倍の有意な増加が認められた。Ｂ２群（媒体群；ＣＴＸ投与有り）で認められたＬＤＨ活性の上昇に対して、Ｂ３～Ｂ６の被験物質投与群はいずれも減少傾向を示した。Ｂ３群（ホエイタンパク質群；ＣＴＸ投与有り）についてはＢ２群（媒体群；ＣＴＸ投与有り）に比べて統計学的に有意な減少が認められたが、他の被験物質投与群のＬＤＨ活性の平均値と比べて大きな違いは見られなかったことから、考慮する必要はないと考える。また、ＣＴＸ投与７日後ではいずれも有意な変化は見られなかった。

ＣＴＸによる筋損傷モデルマウスは一般的に用いられており、筋組織の約７５～９０％が破壊される。ＣＴＸはヘビの毒液から分離され、筋線維膜の脂質を透過または加水分解することにより、Ｃａ^２＋流入の増加を引き起こし、線維脱分極により筋線維の過収縮と壊死を起こす。筋肉内で容易に拡散し、全体にわたって均一な筋線維の損傷を引き起こすことが特徴である。以上の機序および図７から考察するに、今回のモデルにおいて、薬品でなく食品の摂取では損傷の程度を緩和するような予防効果は期待できないと考えられる。つまり、図７でＢ３～Ｂ６の被験物質投与群がＢ２群（媒体群；ＣＴＸ投与有り）と比較してＬＤＨ活性が低下した理由として、炎症の早期収束によるものであると推察できる。

また、図８に示されるように、ＣＴＸ投与１日後のコラーゲンペプチド及びホエイタンパク質の併用投与群において、下記に示す炎症応答・マクロファージ、ＥＣＭ（細胞外マトリックス）、血管新生阻害に関わる遺伝子の発現亢進の緩和が認められた。

・Ｉｒｇ１：ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅ １
・Ｏａｓｌ１：２’－５’－ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １
・Ｃｃｌ２：Ｃ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ２
・Ｉｌ１ｒｎ：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ
・Ｉｌ１０ｒｂ：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ ｂｅｔａ
・Ｌｉｔａｆ：ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｎｆ ｆａｃｔｏｒ
・Ｔｎｆｒｓｆ１ｂ：ｔｎｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ １ｂ
・Ｍｍｐ９：ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ９
・Ｔｈｂｓ１：ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ １

たとえば、Ｉｒｇ１はＭ１マクロファージ（炎症誘発性マクロファージ）で高度に発現しており、イタコン酸を生成する。イタコン酸はＭ１マクロファージ自身に作用し、Ｍ２マクロファージ（炎症抑制性マクロファージ）への変化を誘導する。Ｍ２マクロファージへの誘導は骨格筋再生などの修復反応に不可欠のステップと考えられている。よって、コラーゲンペプチドとホエイタンパク質の併用により筋肉の炎症が早期に収束し、すみやかに修復過程へ移行したと考えられた。

また、Ｍｍｐ９は分泌型メタロプロテアーゼの一つであり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の再構成を伴うため、ＥＣＭを分解するプロテアーゼが必須となる。筋損傷ではないが、褥瘡の炎症期ではコラーゲンペプチドの摂取によりＭｍｐ９の発現量が増加するという報告がある。また、本試験と同様のＣＴＸによる筋損傷モデルマウスにおいて、ＣＴＸ投与１日後にＭｍｐ９遺伝子発現のピークを示すという報告がされている。よって、本試験のＢ４～Ｂ６群ではコラーゲンペプチドを摂取しているため、Ｍｍｐ９の遺伝子発現が最初から低いとは考えにくく、ＣＴＸ投与１日後より前に一度高発現してから低下したと考えるのが妥当である。このことからも、コラーゲンペプチドとホエイタンパク質の併用により、炎症が早期に収束したといえる。

試験例１や試験例２のＤＮＡマイクロアレイの結果、コラーゲンペプチドやホエイタンパク質のいずれかの単独投与では起こらない効果が、併用投与群において起こっていると考えられた。

ＣＴＸ誘導性遺伝子の発現亢進の緩和という現象は、筋肉損傷の修復が早まった結果ととらえることができる。

一般に、筋損傷からの回復は以下のような段階を踏む。
・第１段階：損傷直後から好中球やマクロファージなどの炎症性細胞の浸潤が生じる。同時期にこれらの細胞から放出されるサイトカインや増殖因子によって筋衛星細胞は活性化される。
・第２段階：損傷数時間後から数日の間で、活性化した筋衛星細胞は増殖し筋芽細胞へと分化する。
・第３段階：それと並行して１週間程度の間に筋芽細胞は互いに融合し、多核の筋管細胞となる。
・第４段階：筋管細胞は肥大して成熟した筋線維へと変化する。

具体的には、試験例１のコラーゲンペプチドの単独投与群では、炎症応答に関わる遺伝子において、ＣＴＸ誘導性遺伝子の発現亢進が緩和されていたが、コラーゲンペプチドにおいては変形性膝関節症に伴う炎症反応の抑制に効果があることが報告されていることから、コラーゲンペプチドの単独投与群の結果としては妥当な結果であると考えられた。

一方、コラーゲンペプチドとホエイタンパク質との併用投与群においては、試験例１でコラーゲンペプチドの単独投与群で観察された炎症応答に関わる遺伝子において亢進緩和効果が同じく認められていることに加えて、試験例１および２でコラーゲンペプチドやホエイタンパク質の単独投与群では変化が認められなかった筋損傷・修復・再生・分化に関する報告がある遺伝子群において、ＣＴＸ誘導性遺伝子の発現亢進緩和が認められた。試験例１のＣＴＸ投与１４日後は上記の筋損傷回復の第４段階、試験例２のＣＴＸ投与１日後は第１～２段階、試験例２のＣＴＸ投与７日後は第２～３段階であると考えられる。よって、本試験は第１～２段階の時点から筋損傷早期回復に効果があると考えられ、その結果第４段階においても回復効果をもたらしているといえる。しかも、その併用投与群における効果は、単独投与群における被験物質の投与量の半量ずつを組み合わせた投与量で顕著に認められただけでなく、総量併用でも同様の効果が得られた。

本試験の結果、コラーゲンペプチドとホエイタンパク質とを併用して摂取することにより、筋損傷時における炎症反応の早期収束と筋修復・再生・分化を促進させることができたことから、特に上記第１段階から第２段階への移行を早めて筋損傷回復に効果をもたらしたと考えられる。

ヒト等価用量（ＨＥＤ）は、以下の式を使用して推定することができる：
ＨＥＤ＝動物用量（ｍｇ／ｋｇ）×（動物のＫｍ／ヒトのＫｍ）
（マウスのＫｍは３であり、ヒトのＫｍは３７である。）

したがって、マウスにおける１ｇ／Ｋｇ、２ｇ／Ｋｇ、４ｇ／Ｋｇの用量はおよそ６０Ｋｇのヒトに対して、それぞれ約５ｇ、約１０ｇ、約２０ｇとなる。

よって、試験例１および２のコラーゲンペプチドとホエイタンパク質の併用群における投与量は、ヒトに換算するとコラーゲンペプチド＋ホエイタンパク質＝５ｇ＋１０ｇ～１０ｇ＋２０ｇであるといえる。

以下に、本発明の筋損傷回復促進用組成物を構成する処方例を挙げる。

（処方例１）粉末飲料組成物
ホエイタンパク質 ＷＷＰ８０１０（商品名、日本新薬） ６５質量％
コラーゲンペプチド ＰｅｐｔａｎＰ５０００ＨＤ（商品名、Ｒｏｕｓｓｅｌｏｔ） ２０質量％
グラニュー糖 ７質量％
ココアパウダー ７質量％
スクラロース ０．４質量％
チョコレート香料 ０．３質量％
乳化剤 ０．３質量％

この粉末飲料組成物を２０ｇ程度量りとり、水、豆乳、牛乳等２００～３００ｍＬで溶解して飲料を調製することができた。得られた飲料は、運動前後の摂取用飲料、おやつ、就寝前の摂取用飲料などとして、摂取量は５０～６００ｍＬ／１日で、日常的に摂取可能な飲料であった。

（処方例２）バー菓子
大豆パフ ４３．３質量％
グラニュー糖 １４．４質量％
ショートニング １３．１質量％
コラーゲンペプチド ＰｅｐｔａｎＰ５０００ＨＤ（商品名、Ｒｏｕｓｓｅｌｏｔ） １３．１質量％
ホエイタンパク質 ＷＷＰ９０１０（商品名、日本新薬） ８質量％
ココアパウダー ３質量％
アーモンド ３質量％
カカオマス １質量％
チョコレート香料 ０．７質量％
乳化剤 ０．３質量％
スクラロース ０．１質量％

このバー菓子は、朝ごはんの代用食品、運動前後の摂取用食品、おやつなどとして、１本あたり２５～６０ｇ／１日で、日常的に摂取可能なバー菓子であった。

（処方例３）ドリンク
グラニュー糖 １５質量％
コラーゲンペプチド ＰｅｐｔａｎＰ５０００ＨＤ（商品名、Ｒｏｕｓｓｅｌｏｔ） ３．２質量％
ホエイタンパク質 ラクトクリスタルｐｌｕｓ（商品名、日本新薬） ３．２質量％
クエン酸 ０．７質量％
寒天 ０．２質量％
香料 ０．２質量％
水 ７７．５質量％

このドリンクは、運動前後の摂取用ドリンク、おやつなどとして、摂取量は５０～２００ｍＬ／１日で、日常的に摂取可能なドリンクであった。

Claims (4)

1. コラーゲンペプチド及びホエイタンパク質を有効成分とする筋損傷回復促進用組成物。
2. 飲食品、食品添加物、医薬品、サプリメント、又は動物飼料の形態である、請求項１記載の筋損傷回復促進用組成物。
3. コラーゲンペプチド及びホエイタンパク質の、筋損傷回復促進用組成物の製造のための使用。
4. 前記筋損傷回復促進用組成物は、飲食品、食品添加物、医薬品、サプリメント、又は動物飼料の形態である、請求項３記載の使用。
   

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