EA005579B1 - Пептиды, полученные из казеина, и их применение в терапии - Google Patents

Пептиды, полученные из казеина, и их применение в терапии Download PDF

Info

Publication number
EA005579B1
EA005579B1 EA200200820A EA200200820A EA005579B1 EA 005579 B1 EA005579 B1 EA 005579B1 EA 200200820 A EA200200820 A EA 200200820A EA 200200820 A EA200200820 A EA 200200820A EA 005579 B1 EA005579 B1 EA 005579B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
casein
peptide
pharmaceutical composition
terminal portion
treatment
Prior art date
Application number
EA200200820A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200200820A1 (ru
Inventor
Зви Сидельман
Original Assignee
Чей 13 Медикал Рисерч Груп Н.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Чей 13 Медикал Рисерч Груп Н.В. filed Critical Чей 13 Медикал Рисерч Груп Н.В.
Publication of EA200200820A1 publication Critical patent/EA200200820A1/ru
Publication of EA005579B1 publication Critical patent/EA005579B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4732—Casein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)

Abstract

Биологически активные пептиды, которые получены из SEQ N-конца αS1 фракции молочного казеина или последовательности которых идентичны данным последовательностям. Данные пептиды способны стимулировать и усиливать иммунную реакцию, защищать от вирусной инфекции, нормализовать уровни холестерина в сыворотке и стимулировать кроветворение. Полученные из казеина пептиды не токсичны, и их можно применять для лечения и для профилактики иммунных патологий, гиперхолестеринемии, гематологических нарушений и связанных с вирусами заболеваний.

Description

Настоящее изобретение относится к биологически активным пептидам, последовательности которых получены из 8Еф Ν-конца α81 фракции молочного казеина, или идентичны данным последовательностям. Данные пептиды способны стимулировать и усиливать иммунную реакцию, защищать от вирусной инфекции, нормализовать уровни холестерина в сыворотке и стимулировать кроветворение. Полученные из казеина пептиды не токсичны, и их можно использовать для лечения и для профилактики иммунных патологий, гиперхолестеринэмии, гематологических нарушений и связанных с вирусами заболеваний.
Предпосылки изобретения
Биоактивные соединения из продуктов питания.
В дополнении к питательной ценности многих пищевых продуктов, некоторые их составляющие и продукты, образующиеся в пищеварительном тракте, обладают способностью влиять на физиологические процессы. Некоторые из таких обладающих дополнительной питательной ценностью (ех1гапи(пйоиа1) составляющих присутствуют в своей активной форме в цельном продукте питания, такие как иммуноглобулины в материнском молоке и молозиве, фитоэстрогены, обнаруженные в продуктах питания на основе сои, полифенольные антиоксиданты из фруктов и витамины. Другие же зашифрованы в молекулах питательных веществ и выделяются в активной форме в процессе переваривания или в процессе приготовления пищи, например, противогипертензивные пептиды из лактоглобина [Κίΐΐδ, Ό.Ό. (1999), Сап. 1. РЬу8ю1. Рйагшасо! 72:4; 423-434].
Биологическая активность молочных белков.
Казеин, основной молочный белок, традиционно определяли как состоящий из трех фракций α, β и γ, в соответствии с их электрофоретической подвижностью [Ν.Ε Ηίρρ, с1 а1. (1952), Валу 8с1, 35:272]. В настоящее время их определяют в соответствии с последовательностями аминокислот каждой из подгрупп α81, α82, β и κ [Α.Ν. Епде1 е1 а1. (1984), 1. Папу 8с! 67: 1599].
В процессе переваривания казеиновые белки подвергаются протеолитическому расщеплению под действием кислотных протеаз, таких как химозин (реннин), трипсин и пепсин, в результате чего образуются более короткие пептиды и вызывается свертывание и секвестрация кальция полученными белковыми фрагментами. Немногочисленные исследования соединений молока продемонстрировали связанную с казеином бактерицидную активность. В патенте США № 3764670 раскрыты протеолитические казеиновые гидролизаты, обладающие свойствами антибиотиков против микроорганизмов. В патенте Израиля № 42863 раскрыт полученный из казеина пептид, состоящий из 23 аминокислот Ν-конца казеина, обладающий противобактериальной активностью. Кроме того, другие физиологически активные свойства, такие как активности, подобные активностям опиоидов и факторов роста, были предположены для казеина или его производных [Κίΐΐδ, Ό.Ό., (1999), 1Ыб.].
Для пептидов казеина также наблюдалась иммуномодулирующая активность. Со8(е е1 а1. (1992, 1ттип. Бе11. 33: 41-46), наблюдали усиление пролиферации лимфоцитов у крыс после обработки их пептидом, полученным из С-конца β-казеина. Однако ни в одном из этих исследований не были определены специфические последовательности пептидов казеина, которые придают им их свойства дополнительной питательной ценности.
Кроветворение при терапии злокачественных опухолей.
После высоких доз химиотерапии, особенно после миелоаблативных доз химиорадиотерапии, поддержанной трансплантацией аутологичного костного мозга или периферических стволовых кроветворных клеток (А8СТ) или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), у пациентов возникает серьезный риск панцитопении. Гранулоцитопения может привести к развитию серьезных, иногда фатальных инфекционных осложнений, вызываемых обычными бактериальными, вирусными, грибковыми и паразитическими агентами непосредственно после момента трансплантации. Аналогичным образом, тромбоцитопения часто приводит к проявлению тенденции к кровотечениям и иногда к длительной тромбоцитной зависимости. Если развивается невосприимчивость к тромбоцитам, эпизоды кровотечений могут угрожать жизни, и осложнения при кровотечениях часто оказываются летальными. Риск, связанный с гранулоцитопенией, можно частично уменьшить поддерживающими средствами, и наиболее эффективно путем введения рекомбинантных цитокинов человека, которые могут усилить восстановление гранулоцитов, особенно гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (6-С8Е) и гранулоцитарномакрофагального колониестимулирующего фактора (6М-С8Е). Данные агенты чрезвычайно дороги (их стоимость примерно 200-400 долларов США/в день/для пациента) и иногда они вызывают побочные эффекты, связанные с гипертоническими реакциями, лихорадкой, болями в костях и иногда сопровождаются синдромами повышенной сосудистой проницаемости, включая перикардиты и плевриты. Некоторые из этих побочных эффектов могут быть связаны с другими цитокинами, которые могут естественным образом высвобождаться под действием этих кроветворных факторов роста. Более того, применение таких кроветворных факторов роста может быть противопоказано пациентам с опухолевыми клетками, содержащими С-С8Е или СМ-С8Е рецепторы, в таких случаях, как острый и хронический миелолейкоз и при миелодиспластических синдромах. Тогда как основной прогресс в лечении пациентов с риском пан
- 1 005579 цитопении был достигнут за счет использования кроветворных цитокинов, прогресса в лечении тромбоцитопении не было достигнуто. После высоких доз химиотерапии и особенно после АОСТ, у пациентов возникает риск возникновения тромбоцитопении, которая может длиться в течение многих месяцев, даже вплоть до 3 лет, а некоторые пациенты с тромбоцитопенией могут никогда не выздороветь. Организмы многих пациентов, которых раньше лечили множеством препаратов на основе крови, становятся невосприимчивыми к тромбоцитам, и, следовательно, может оказаться невозможным преодолеть тромбоцитопению даже на короткое время, несмотря на интенсивные и частые трансфузии тромбоцитов от одного донора. Невосприимчивость к тромбоцитам и длительная тромбоцитопения представляют собой распространенную причину смерти в центрах А8СТ во всем мире.
В настоящее время проводятся исследования нескольких новых рекомбинантных цитокинов, таких как рекомбинантный интерлейкин-3 человека (гЫЬЗ) и рекомбинантный интерлейкин-6 человека (гЫЬб), как потенциальных агентов для усиления мегакариоцитопоэза и восстановления тромбоцитов. К сожалению, предварительные клинические исследования показали, что хотя гЫЬЗ и гЫЬб могут усилить восстановление тромбоцитов, такие эффекты ни коим образом не являются эффектными и могут потребовать значительного времени.
Очевидно, что длительная тромбоцитопения в настоящее время представляет основную проблему в клинических центрах трансплантации костного мозга, для которой до сих пор не найдено удовлетворительного решения.
Поэтому существует широко известная необходимость в создании безопасного, дешевого, быстродействующего и четко определенного стимулятора кроветворения, и особенно мегакариоцитопоэза, который был бы лишен вышеуказанных ограничений и который было бы весьма выгодно иметь.
Фракция казеина α81.
Фракцию казеина α81 можно получить из молочных белков различными способами [Ό.Ο. 8сй1шб1й апб Т.Л.Ъ Раупек (1963), ВюсЫт., Вюрйук. Ас!а, 78:492; М.Р. Тйотркоп апб С.А. К1ббу (1964), I. Оаиу 8ск, 47:626; I. С. Мегсйег, е! а1. (1968), Ви11. 8ос. СЫш. Вю1. 50:521], и полная аминокислотная последовательность фракции казеина α81 была определена 10. Мегсйег е! а1. (1971) (Еиг. 1. Вюсйет. 23:41). Геномная и кодирующая последовательности </.81 фракции казеина жвачных были также клонированы и секвенированы с применением технологий рекомбинантных ДНК [Ό. Косхаи. е! а1. (1991), Ыис1. Асйбк Век. 19(20): 5591; МсКшдй!, В.А., е! а1. (1989), I. Оаиу 8съ 72:2464-73]. Протеолитическое расщепление и идентификация Ν-концевых фрагментов /81 фракции казеина были опубликованы Ц.С. Мегсйег, е! а1. (1970), Еиг. I. Вюсйет. 16:439; Р.Ь.Н. Мс8\геепеу е! а1. (1993), I. Оайу Век., 60:401], так же как и абсорбция в кишечнике и появление данного фрагмента в плазме млекопитающих после расщепления белков цельного молока [Иа!, А.М., е! а1. (1998) ВюсЫт1е, 80(2):2155-65]. Ме1ке1, Н. апб Воске1тапп, [(1999), Ап!оше Уап Ьееиетепйоек, 76:207-15] обнаружили аминокислотные последовательности иммунопептидов, казокининов и казоморфинов в пептидах, высвобожденных в результате гидролиза α- и βказеиновых фракций молочнокислыми бактериями. Особый интерес представляют антиаггрегационная и тромболитическая активности, демонстрируемые С-концевыми участками α- и κ-казеиновых фракций [Сйайапсе, В. е! а1. (1997), Вюсйет. Мо1. Вю1. 1п!. 42(1) 77-84; Саеп I. е! а1. (1993), I. Оаиу 8съ 76(1): 301310]. Предшествующие исследования задокументировали потенциальные биоактивные пептиды, закодированные в Ν-концевой α81 аминокислотной последовательности, но не было никаких упоминаний о применении данных белковых фрагментов, конкретных последовательностей или определенных синтетических пептидов для усиления кроветворения, профилактики вирусных инфекций или модулирования развития аутоиммунных заболеваний.
Сущность изобретения
В соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения аутоиммунного заболевания, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения вирусного заболевания, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики вирусной инфекции, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования кроветворения, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
- 2 005579
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν’концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования мегакариоцитопоэза, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования эритропоэза, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования лейкоцитопоэза, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования тромбоцитопоэза, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения тромбоцитопении, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α.81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения панцитопении, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения гранулоцитопении, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения гиперлипидемии, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения холестеринемии, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения глюкозурии, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения диабета, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения СПИД, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения инфекции, вызванной ВИЧ, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиорадиотерапии, поддерживаемой трансплантацией аутологичного костного мозга или периферических стволовых кроветворных клеток (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения вирусного заболевания, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики вирусной инфекции, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качест
- 3 005579 ве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования кроветворения, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина </.81. и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Νконцевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования мегакариоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования эритропоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования лейкоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования тромбоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения тромбоцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения панцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения гранулоцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения гиперлипидемии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения холестеринемии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения глюкозурии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения диабета, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения СПИД, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве
- 4 005579 активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения инфекции, вызванной ВИЧ, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиорадиотерапии, поддержанными трансплантацией аутологичного костного мозга или периферических стволовых кроветворных клеток - (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Νконцевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления колонизации донорных стволовых кроветворных клеток у миелоаблативного реципиента, причем способ включает лечение донора указанных донорных стволовых кроветворных клеток пептидом, полученным из Ν-концевой части казеина α81, перед передачей и имплантацией донорных стволовых кроветворных клеток реципиенту.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления колонизации донорных стволовых кроветворных клеток у миелоаблативного реципиента, причем способ включает обработку указанных донорных стволовых кроветворных клеток пептидом, полученным из Ν-концевой части казеина α81, перед имплантацией донорных стволовых кроветворных клеток реципиенту.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α.81, для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для профилактики или лечения вирусного заболевания.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для профилактики вирусной инфекции.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для индуцирования кроветворения.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для индуцирования мегакариоцитопоэза.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для индуцирования эритропоэза.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для индуцирования лейкоцитопоэза.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для индуцирования тромбоцитопоэза.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для профилактики или лечения тромбоцитопении.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для профилактики или лечения панцитопении.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для профилактики или лечения гранулоцитопении.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для профилактики или лечения гиперлипидемии.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для профилактики или лечения холестеринемии.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для профилактики или лечения глюкозурии.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для профилактики или лечения диабета.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для профилактики или лечения СПИД.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для профилактики или лечения инфекции, вызванной ВИЧ.
- 5 005579
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина </.81. для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиорадиотерапии, поддержанными трансплантацией аутологичного костного мозга или трансплантацией периферических стволовых кроветворных клеток (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ).
В соответствии с дальнейшими особенностями предпочтительных вариантов настоящего изобретения, раскрытых ниже, указанный пептид является фрагментом, полученным в результате фрагментации α81 казеина.
В соответствии с дальнейшими особенностями раскрытых предпочтительных вариантов настоящего изобретения указанный пептид является синтетическим пептидом.
В соответствии с дальнейшими особенностями раскрытых далее предпочтительных вариантов настоящего изобретения последовательность указанного пептида является одной из представленных далее 8ЕО ΙΌ N0:1-19.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен очищенный пептид, последовательность аминокислот которого выбрана из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0:1-19.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция, включающая очищенный пептид, последовательность аминокислот которого выбрана из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0:1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение успешно преодолевает недостатки известных в настоящее время конфигураций тем, что предлагает пептиды для лечения заболеваний человека, причем эти пептиды получены из Ν-концевой части казеина α81 и, обладая высокой терапевтической эффективностью, не обладают определяемой токсичностью.
Краткое описание чертежей
Далее настоящее изобретение раскрыто только на основании примеров со ссылкой на прилагаемые чертежи. Специально указывается со ссылкой на чертежи, что примеры приведены только для иллюстрации обсуждений предпочтительных вариантов настоящего изобретения и представляют собой то, что можно считать наиболее полезным и легко понятным описанием принципов и концептуальных аспектов настоящего изобретения. В этой связи не предпринимаются попытки продемонстрировать детали настоящего изобретения более подробно, нежели это необходимо для фундаментального понимания изобретения, причем описание вместе с чертежами разъясняет специалистам, как некоторые варианты изобретения можно осуществить на практике. На приведенных чертежах фиг. 1а-Ь представляют стимуляцию активности натуральных киллерных (ΝΚ) клеток в культивируемых клетках мышиного костного мозга пептидами, полученными из нативного казеина. Лизис 358меченых УАС клеток-мишеней культивируемыми клетками мышиного костного мозга, инкубируемыми в присутствии (+) или в отсутствии (-) 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, выражен как доля полной радиоактивности, выделенной из УАС клеток в надосадочную жидкость культуры (% выделенного 358). Фиг. 1а представляет ΝΚ активность при отношении эффекторные клетки/клеткимишени 25:1. Фиг. 1Ь представляет ΝΚ активность при отношении эффекторные клетки/клетки-мишени 50:1.
Фиг. 2 представляет стимуляцию активности натуральных киллерных (ΝΚ) клеток в культивируемых стволовых клетках периферической крови (РВ8С) человека пептидами, полученными из нативного казеина. Лизис 358-меченых К562 клеток-мишеней культивируемыми РВ8С клетками человека от доноров, обработанных фактором, стимулирующим колонии гранулоцитов (0-С8Е), инкубируемыми в отсутствии (0 мкг) или в присутствии повышающихся концентраций (25-500 мкг/мл) пептидов, полученных из нативного казеина, выражен как доля полной радиоактивности, выделенной из К562 клеток в надосадочную жидкость культуры (% выделения 358). Квадратиками представлено отношение эффекторные клетки/клетки-мишени 100:1, треугольниками представлено отношение эффекторные клетки/клетки-мишени 50:1.
Фиг. 3а-3Ь представляют стимуляцию пролиферации натуральных киллерных (ΝΚ) и Тлимфоцитных (Т) клеток из культивируемых стволовых клеток периферической крови (РВ8С) человека пептидами, полученными из нативного казеина. Пролиферация ΝΚ и Т клеток в культивируемых РВ8С человека от доноров, обработанных фактором, стимулирующим колонии гранулоцитов, инкубируемых с пептидами, полученными из нативного казеина, или без них, выражена как процент (%) клеток, связывающих анти-СЭ3/Е1ТС флуоресцентные анти-Т клеточные антитела иСНТь или анти-СО56/ВРЕ флуоресцентные анти-ΝΚ клеточные антитела МОС-1 (ΌΑΚ0 А/8 Эспшагк). Контролями служат МТС и ВРЕ-конъюгированные антимышиный 1дО антитела. Фиг. 3 а представляет процент культивируемых человеческих РВ8С, связывающих флуоресцентные антитела СО56 (2 независимых образца) после 10 дней инкубирования с (СО56 + пептиды) или без (СО56) 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина. Фиг. 3Ь представляет процент культивируемых РВ8С клеток человека, связывающих флуоресцентные анти-СЭ3 (Т клетки) антитела, анти-СО56 (ΝΚ клетки) антитела и клетки, связывающие как СЭ3, так
- 6 005579 и ί.Ό56 (Т и ΝΚ-подобные клетки) антитела после 28 дней инкубирования с (+28) или без (-28) 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина.
Фиг. 4 представляет стимуляцию активности натуральных киллерных (ΝΚ) клеток в культивируемых стволовых клетках периферической крови (РВ8С) человека пептидами, полученными из синтетического казеина. Лизис 358-меченых К562 клеток-мишеней культивируемыми РВ8С клетками (от пациента с раком молочной железы), инкубируемыми в отсутствие (0 мкг) или в присутствии повышающихся концентраций (10-500 мкг/мл) синтетических пептидов, полученных из казеина, выражен как доля полной радиоактивности, выделенной из К562 клеток в надосадочную жидкость культуры (% выделения 358). Пептиды представляют Ν-концевые последовательности из 1-8 (8), 1-12 (12), 1-22 (1), 1-24 (Ь), 1-25 (М) и 1-26 (Ν) первых аминокислот Ν-концевой части α81 казеина (см. табл. 3 далее для последовательности синтетических пептидов).
Фиг. 5а-с представляют стимуляцию пролиферации культивируемых клеток человека различного происхождения пептидами, полученными из нативного казеина. Пролиферацию культивируемых клеток человека после 14-21 дня инкубирования с возрастающими концентрациями пептидов, полученных из нативного казеина, выражают как количество [3Н]-тимидина, включенного в каждый образец. Фиг. 5а представляет включение метки в два образца (РВ8С 1, 15 дней инкубирования; и РВ8С 2, 20 дней инкубирования) стволовых клеток периферической крови человека, инкубируемых с 50-600 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, или без оных (контроль). Фиг. 5Ь представляет включение [3Н]тимидина, в культивируемые клетки костного мозга человека после 21 дня инкубирования с или без (контроль) 50-600 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина. Костный мозг получен от больных злокачественными опухолями на стадии ремиссии (ВМ авто, ВМ 1 и ВМ 2) или от здоровых добровольцев (ВМ нормален). Фиг. 5с представляет включение [3Н]-тимидина в культивируемые клетки пуповинной крови человека после 14 дней инкубирования с или без (контроль) 50-1000 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина. Пуповинная кровь получена от двух различных доноров (С.В. 1, С.В. 2).
Фиг. 6 представляет таблицу, отражающую пролиферацию предшественников кровяных клеток из костного мозга и пуповинной крови человека в результате инкубирования с пептидами, полученными из нативного казеина. Относительное число клеток х 104 на мл, отражающее пролиферацию культивируемых клеток, определяют, подсчитывая клетки, как это указано ниже в разделе Примеры. Костный мозг от здоровых добровольцев (костный мозг) и пуповинную кровь от нормально рожденных детей (пуповинная кровь) инкубируют в течение 13 (пуповинная кровь) или 14 (костный мозг) дней в присутствии факторов роста и АВ сыворотки, с добавлением или без добавления возрастающих концентраций пептидов, полученных из нативного казеина, (25-500 мкг/мл).
Фиг. 7 представляет стимуляцию восстановления периферических белых кровяных клеток у миелоаблативных мышей с трансплантированным костным мозгом под действием обработки пептидами, полученными из нативного казеина. Количество клеток представляет число белых кровяных клеток (х 106 на мл, определенное с помощью гемоцитометра). Мыши (п=10 в группе) получают сублетальную дозу радиации и претерпевают трансплантацию сингенного костного мозга (106 клеток на мышь) на следующий день и внутривенно им вводят 1 мг на реципиента пептидов, полученных из нативного казеина, (тест: - + - ) или 1 мг на реципиента альбумина человека сыворотки (контроль: - · -) одним днем позже.
Фиг. 8 представляет стимуляцию восстановления тромбоцитов у миелоаблативных мышей с трансплантированным костным мозгом за счет обработки пептидами, полученными из нативного казеина. Количество тромбоцитов (РЬТ) представляет число тромбоцитов (х 106 на мл, при измерении с помощью гемоцитометра). Мышей (п=60 в группе) облучают летальной дозой радиации, и они претерпевают трансплантацию сингеничного костного мозга (106 клеток на мышь) в первый день, и внутривенное введение 1 мг/реципиент пептидов, полученных из нативного казеина, (Пептиды: сплошные квадратики) или 1 мг/реципиент альбумина сыворотки человека (Н8А: незачерненные квадратики).
Фиг. 9а-£ представляют проникновение в клетки и захват ядрами НТС-конъюгированных пептидов, полученных из нативного казеина, в культивируемых Т-лимфоцитных клетках, по данным флуоресцентной микроскопии. Р1 и Р2 представляют идентичные фракции НТС-конъюгированных пептидов, полученных из нативного казеина. Клетки 8нр-Т1 инкубируют со 100 мкг/мл НТС-конъюгированных пептидов, полученных из нативного казеина, как описано ниже в разделе Примеры. В указанные моменты времени клетки промывают от свободных меток, фиксируют в формалине и подготавливают для наблюдения и регистрации с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Фиг. 9а - 9£ представляют отобранные изображения клеток для соответствующих времен инкубирования, которые демонстрируют тот факт, что НТС-конъюгированные пептиды, полученные из нативного казеина, проникают через мембраны 8нр-Т1 клеток (фиг. 9а, 9Ь) и концентрируются в ядрах (фиг. 9е-9£).
Фиг. 10 представляет таблицу стимуляции пролиферации 8нр-Т1 лимфоцитных клеток в результате инкубирования с пептидами, полученными из нативного казеина. 8ир-Т1 клетки (5000 на лунку) инкубируют с возрастающими концентрациями (50-1000 мкг/мл) пептидов, полученных из нативного казеина, подсчитывают их количество в лунках в указанные моменты времени культивирования и импульсно бомбардируют [3Н]-тимидином в течение 18 ч. Показателем пролиферации служит отношение среднего
- 7 005579 значения для трех образцов включенного [3Н]-тимидина, деленное на значения [3Н]-тимидина, включенного в клетки, которые культивируют без пептидов, полученных из нативного казеина (контроль).
Фиг. 11 представляет таблицу, отражающую результаты ингибирования НТУ-1 инфекции СЕМ лимфоцитов пептидами, полученными из нативного казеина. СЕМ клетки либо подвергают взаимодействию с вирусом Н1У-1, предварительно инкубированным в течение 3 ч с пептидами, полученными из нативного казеина, либо предварительно инкубируют с возрастающими концентрациями (50-1000 мкг/мл) пептидов, полученных из нативного казеина для указанного количества часов (24 и 48 ч) перед осуществлением контактирования с ВИЧ-1 вирусом, как указано ниже в разделе примеры. На 15 день после инфицирования определяют количество клеток и анализируют степень инфицирования НТУ-1 с помощью анализа с применением Р34 антигена, как указано ниже в разделе Примеры. Контрольными культурами служат 1Е:СЕМ клетки, которые подвергали контактированию с ВИЧ-1 вирусом без предварительной обработки пептидами, полученными из нативного казеина, и ЦТЕ:СЕМ клетки, которые культивировали в идентичных условиях без пептидов, полученных из нативного казеина, и без осуществления контакта с ВИЧ-1 вирусом.
Фиг. 12 представляет профилактику с помощью пептидов, полученных из нативного казеина, диабета типа I (ΙΌΌΜ) у самок диабетических (без ожирения) мышей. Степень глюкозурии контролируют с интервалами в течение 230 дней после обработки у самок ΝΘΌ мышей, которые получают один или два раза в неделю инъекции по 100 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, в течение 5 недель (всего 5 или 10 инъекций) (треугольники и квадраты) и у необработанных контрольных животных. У всех контрольных мышей развилась глюкозурия, которая привела впоследствии к их гибели.
Фиг. 13 представляет таблицу, отражающую стимуляцию кроветворения у больных злокачественными опухолями в результате инъекций пептидов, полученных из нативного казеина. В периферической крови, взятой у пяти женщин - больных злокачественными опухолями, получающих химиотерапию, либо получавших химиотерапию, как указано выше, определяли полное количество белых кровяных клеток (\УВС. х 103), тромбоцитов (РЬТ, х 103), эритроцитов (КБС, х 103) и гемоглобина (г/дл) до (п) и после (п + ...) внутримышечных инъекций пептидов, полученных из нативного казеина, как указано выше. Пациентка 1 соответствует С.Т.; Пациентка 2 соответствует Е.С.; Пациентка 3 соответствует Е.8.; Пациентка 4 соответствует РИ.; Пациентка 5 соответствует Ό.Μ.
Фиг. 14 представляет стимуляцию тромбоцитопоэза пептидами, полученными из нативного казеина, у невосприимчивых к тромбоцитам больным острым лейкозом (М-1). Восстановление тромбоцитов выражают как изменение количества тромбоцитов в периферической крови (РЬА, х 106 на мл), определяемое как указано выше, с определенными интервалами после внутримышечной инъекции (как указано ниже в разделе Примеры) 100 мг пептидов, полученных из нативного казеина.
Фиг. 15 представляет стимуляцию тромбоцитопоэза пептидами, полученными из нативного казеина, тромбоцито-невосприимчивых больным острым лейкозом (М-2). Восстановление тромбоцитов выражают как изменение количества тромбоцитов в периферической крови (РЬА, х 106 на мл), определенное указанным выше способом через указанные промежутки времени после внутримышечного введения (как это раскрыто ниже в разделе примеры) 100 мкг пептидов, полученных из нативного казеина.
Описание предпочтительных вариантов изобретения
Настоящее изобретение относится к биологически активным пептидам, последовательности которых получены из Ν-конца α81 фракции молочного казеина или аналогичны им, к композициям, содержащим данные пептиды, и к способам их применения, например, для стимулирования и усиления иммунной реакции, для защиты против вирусной инфекции, для нормализации уровней холестерина в сыворотке и для стимулирования кроветворения. Полученные из казеина пептиды не токсичны, и их можно использовать для лечения и профилактики, например иммунопатологий, гиперхолестеринемии, гематологических нарушений и связанных с вирусами заболеваний.
Принципы и способы осуществления настоящего изобретения можно лучше понять со ссылкой на чертежи и сопровождающие их описания.
Перед детальным объяснением по крайней мере одного варианта изобретения следует уяснить, что применение изобретения не ограничивается подробностями, изложенными ниже в описании или проиллюстрированными примерами. Возможны другие варианты изобретения, или его можно использовать на практике другими способами. Кроме того, следует уяснить, что используемая в данном описании терминология и фразеология служит целям описания, и ее не следует рассматривать как ограничивающую.
В том смысле, как использовано, термин лечение включает существенное ингибирование, замедление или обратное течение развития заболевания, существенное ослабление клинических симптомов заболевания.
В том смысле, как использовано, термин профилактика включает существенное предотвращение проявления клинических симптомов заболевания.
В том смысле, как использовано, термин пептид включает нативные пептиды (включая продукты разложения, пептиды, полученные синтетическим путем, или рекомбинантные пептиды) и имитаторы пептидов (обычно пептиды, полученные синтетическим путем), такие как пептоиды и полупептоиды,
- 8 005579 которые являются аналогами пептидов, и которые могут содержать, например, модификации, которые делают данные пептиды более стабильными в организме. Такие модификации включают, но не ограничиваются ими, циклизацию, модификацию Ν-конца, модификацию С-конца, модификацию пептидной связи, включая, но не ограничиваясь ими, -ΟΗ2-ΝΗ, СН2-8, СН2-8=О, Ο=ϋ-ΝΗ, СН2-О, СН2-СН2, 8=СΝΗ, СН=СН или СТ=СН, модификацию основной цепи и модификацию остатков. Способы получения соединений-имитаторов пептидов хорошо известны в данной области и раскрыты, например, в ОиапШаЦуе Эгид Эезхдп, С.А. Катзбеп Θά., СНар1ег 17.2, Е. СНорйп Регдатоп Ргезз (1992), которая включена в данное описание в качестве ссылки. Дальнейшая детализация данного аспекта изложена ниже.
Так, пептидом настоящего изобретения может быть циклический пептид. Циклизацию можно осуществить, например, за счет образования амидной связи, например, включением О1и, Азр, Буз, Огп, диаминомасляной (ЭаЬ) кислоты, диаминопропионовой (Пар) кислоты в различные положения в цепи (-СО-ΝΗ или -ΝΗ-СО связи). Можно также осуществить циклизацию между двумя основными цепями за счет включения модифицированных аминокислот формул Н-П((СН2)п-СООН)-С(К)Н-СООН или Н^(СН2)п-СООН)-С(К)Н-ПН2, где п=1-4 и, кроме того, где К представляет природную или не природную боковую цепь аминокислоты.
Возможна также циклизация через образование 8-8 связей за счет включения двух Суз остатков. Кроме того, циклизацию за счет присоединения одной боковой цепи к другой боковой цепи можно осуществить через образование интерактивной связи формулы -(-СН2)п-8-СН2-С-, где п=1 или 2, что возможно, например, за счет включения Суз или НотоСуз и взаимодействия ее свободной 8Н группы, например, с бромацетилированными Буз, Огп, ПаЬ или Пар.
Пептидные связи (-СО-ΝΗ-) внутри пептида могут быть замещены, например, Ν-метилированными связями (-П(СНз)-СО-), сложноэфирными связями (-С(К)Н-С-О-О-С(К)-П-), кетометиленовыми связями (-СО-СН2-), α-аза связями (-ПН-П(К)-СО-), где К представляет любой алкил, например, метил, карбасвязи (-СНг-ΝΗ-), гидроксиэтиленовые связи (-СН(ОН)-СН2-), тиоамидные связи (-С8-ПН-), олефиновые двойные связи (-СН=СН-), ретроамидные связи (-ΝΗ-СО-), производные пептидов (-П(К)-СН2-СО-), где К представляет нормальную боковую цепь, естественно присутствующую у атома углерода.
Такие модификации могут быть осуществлены по любым связям вдоль пептидной цепи и даже по нескольким (2-з) одновременно.
Природные ароматические аминокислоты, Тгр, Туг и РНе, могут быть замещены для синтеза неприродных кислот, таких как Т1С, нафтилеланин ^о1), метилированное по кольцу производное РНе, галогенированное производное РНе или О-метил-Туг.
В приведенных ниже табл. 1-2 перечислены все природные аминокислоты (табл. 1) и необычные или модифицированные аминокислоты (табл. 2).
Таблица 1
Аминокислота Трехбуквенное сокращение Однобуквенный символ
Аланин А1а А
Аргинин Агд К
Аспарагин Азп N
Аспартиковая кислота Азр ϋ
Цистеин Суз С
Глутамин С1п 0
Глутамовая кислота С1и Е
Глицин С1у С
Гистидин ΗΪ3 Н
Изолейцин Не I
Лейцин Ьеи ь
Лизин Ьуз к
Метионин МеЬ м
Фенилаланин РЬе Е
Пролин Рго Р
Серин Зег 3
Треонин ТЬг т
Триптофан Тгр и
Тирозин Туг Υ
Валин Уа1 V
Любая кислота из вышеперечисленных Хаа X
- 9 005579
Таблица 2
карбоксилат Ь-Ы-метиласпарагиновая кислота №пазр
аминоизомасляная кислота А1Ь Ь-Л-метилцистеин №псуз
аминонорборнилкарбоксилат ЫогЬ Ь-Ы-метилглутамин Ытд1п
Ь-И-метилглутаминовая кислота Ытд1и
циклогексилаланин СИеха Ь—Ν—метилгистидин ЫтМз
циклопентилаланин Среп Ь-Ы-метилизолейцин ЫтИе
ϋ-аланин Ва1а Ь-Ы-метиллейцин Мт1еи
β-аргинин Багд Ь-Ы-метиллизин Ыт1уз
β-аспарагиновая кислота Вазр Ь-Ы-метилметионин ЫттеР
β-цистеин Всуз Ь-Ы-метилнорлейцин Ытп1е
В-глутамин Вд1п Ь-Ы-метилнорвалин №пгпла
β-глутаминовая кислота Вд1и β-Ν-метилорнитин Ытогп
В-гистидин ВИ1з β-Ν-метилфенилаланин ЫтрНе
В-изолейцин ВИе Ь-Ы-метилпролин Ытрго
В-лейцин В1еи β-Ν-метилсерин №пзег
В-лизин В1уз Ь-Ы-метил треонин ЫтРЬг
В-метионин Втер Ь-Ы-метилтриптофан ЫтРгр
В-орнитин Во г η Ь-Ы-метилтирозин ЫтРуг
В-фенилаланин ВрЪе Σ-Ν-метилвалин Νπινβΐ
В-пролин Врго Σ-Ν-метилэтилглицин №пеРд
В-серин Взег Ь-Ы-метил-трет-бутилглицин ЫтРЬид
В-треонин ВЪЪг Ь-норлейцин Ы1е
В-триптофан ВРгр Ь-норвалин Ыуа
В-тирозин ВРуг а-метиламиноизобутират Ма1Ь
В-валин Βνβΐ ОС-метил-у-аминобутират МдаЬи
В-а-метилаланин Вта1а α-метилциклогексилаланин МсЬеха
В-(Х-метиларгинин Бтагд (Х-метилциклопентилаланин Мсреп
В-(Х-метиласпарагин Втазп СС-метил-(Х-нафтилаланин Мапар
В-ОС-метиласпартат Бтазр а-метилпенициламин Мреп
В-а-метилцистеин Втсуз Ν-(4-аминобутил)глицин Ыд1и
В-ОС-метилглутамин Втд1п Ν-(2-аминоэтил)глицин Ыаед
В-СС-метилгистидин ВтЫз Ν-(3-аминопропил)глицин ΝΟΓΠ
В-а-метилизолейцин ВтИе Ν-амино-ОС-метилбутират ЫтааЬи
В-СХ-метиллейцин Вт1еи α-нафтилаланин Апар
В-а-метиллизин Е>т1уз Ν-бензилглицин Νρίΐθ
В-а-метилметионин ВттеР Ν-(2-карбамилэтил)глицин Ыд1п
В-СС-метилорнитин Отогп Ν-(карбамилметил)глицин Ыазп
В-а-метилфенилаланин ВтрЬе Ν- (2-карбоксиэтил)глицин Ыд1и
В-СХ-метилпролин Втрго Ν-(карбоксиметил)глицин Ыазр
- 10 005579
Пептид настоящего изобретения можно использовать как таковой или в форме части фрагментов, таких как белки, и дисплей фрагменты, такие как дисплеи бактерий и фагов. Пептиды настоящего изобретения можно также модифицировать химически, получая активные димеры или полимеры в одной пептидной цепи или в ковалентно-сшитых цепях. Кроме того, пептиды настоящего изобретения включают по крайней мере четыре, необязательно по крайней мере пять, необязательно по крайней мере шесть, необязательно по крайней мере семь, необязательно по крайней мере восемь, необязательно по крайней
- 11 005579 мере девять, необязательно по крайней мере десять, необязательно по крайней мере одиннадцать, необязательно по крайней мере двенадцать, необязательно по крайней мере тринадцать, необязательно по крайней мере четырнадцать, необязательно по крайней мере пятнадцать, необязательно по крайней мере шестнадцать, необязательно по крайней мере семнадцать, необязательно по крайней мере восемнадцать, необязательно по крайней мере девятнадцать, необязательно по крайней мере двадцать, необязательно по крайней мере двадцать один, необязательно по крайней мере двадцать два, по крайней мере двадцать три, по крайней мере двадцать четыре, по крайней мере двадцать пять, по крайней мере двадцать шесть, необязательно между двадцатью семью и шестьюдесятью или более аминокислотных остатков (которые в данном описании равнозначно называют аминокислотами).
Соответственно, в том смысле, как использовано, термин аминокислота или аминокислоты включает 20 природных аминокислот; такие аминокислоты часто оказываются модифицированными после трансляции ίη νίνο, включая, например, гидроксипролин, фосфосерин и фосфотреонин; и другие необычные аминокислоты, включая, но не ограничиваясь ими, 2-аминоадипиновую кислоту, гидроксилизин, изодесмозин, норвалин, норлейцин и орнитин. Кроме того, термин аминокислота включает как Ό-, так и Ь-аминокислоты.
В том смысле как использовано, фраза полученный из Ν-концевой части казеина α81, относится к пептидам в том смысле, как определено, например, продукты расщепления казеина α81 (называемые пептидами, полученными из нативного казеина), синтетические пептиды, синтезированные химическим путем таким образом, что их аминокислотные последовательности соответствуют аминокислотной последовательности Ν-концевой части казеина α81 (называемые синтетическими пептидами, полученными из казеина), пептиды, аналогичные (гомологичные) Ν-концевой части казеина </.81. например, пептиды, отличающиеся одним или более из аминокислотных замещений, но не ограничиваясь ими, допустимыми заместителями, при условии, что сохраняется по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 80%, более предпочтительно по крайней мере 90% сходства, и их функциональные гомологи. Термины гомологи и функциональные гомологи, в том смысле, как использовано, относятся к пептидам с любыми вставками, делециями и замещениями, которые не влияют на биологическую активность пептида.
В том смысле, как использовано, термин казеин α81 относится к казеину α81 млекопитающих, включая, но не ограничиваясь ими, домашних млекопитающих (например, коров, овец, коз, лошадей, верблюдов, оленей и буйволов), людей и морских млекопитающих. Далее приводится список казеинов α81, аминокислотные последовательности которых известны и идентифицированы по их регистрационным номерам в СепБапк (Νί,'ΒΙ) и источникам:
САА26982 (Ονίδ апек (овца)), САА51022 (Сарга Ытсик (коза)), САА42516 (Вок !аиги (корова)), САА55185 (Ното кар1епк), САА38717 (§ик ксгоГа (свинья)), Р09115 (кролик) и Ο97943 (Сате1ик бготебитшк (верблюд)).
В том смысле, как использовано, термин Ν-концевая часть относится к М аминокислотам α81 казеина, полученным из первых 60 аминокислот казеина α81, где М представляет любое целое число от 5 до 60 (включая целые числа 5 и 60). Предпочтительно данный термин относится к первым М аминокислотам казеина α81.
Пептиды настоящего изобретения можно получить путем экстракции из молока, как было указано выше, или с помощью твердофазного пептидного синтеза, который является стандартным способом, известным в данной области. Очистку пептидов настоящего изобретения осуществляют стандартными способами, известными специалистам, такими как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Фрагментацию молочного казеина для получения пептидов настоящего изобретения можно осуществить, используя различные ферментативные и/или химические способы.
Как будет подробно раскрыто ниже и подтверждено примерами в следующем ниже разделе Примеры, пептиды настоящего изобретения обладают различными терапевтическими эффектами. В разделе Примеры приведено множество анализов, с помощью которых специалист может тестировать конкретный пептид, полученный в соответствии со способами настоящего изобретения для конкретного терапевтического эффекта.
Любой из описываемых пептидов можно вводить как он есть или в составе фармацевтической композиции, которую можно использовать для лечения или профилактики заболевания. Такие композиции включают в качестве активного ингредиента любые из раскрываемых пептидов и фармацевтически приемлемый носитель.
В том смысле, как использовано, термин фармацевтическая композиция, относится к препарату одного или более из описываемых пептидов с другими химическими компонентами, такими как фармацевтически приемлемые носители и наполнители. Целью создания фармацевтической композиции является облегчение введения соединения в организм.
Здесь и далее термин фармацевтически приемлемый носитель относится к носителю или разбавителю, который не вызывает заметного раздражения в организме и не разрушает биологическую активность и свойства вводимого соединения. Примерами носителей, но не ограничиваясь ими, являются пропиленгликоль, солевой раствор, эмульсии и смеси органических растворителей с водой.
- 12 005579
Термин наполнитель относится к инертному веществу, которое добавляют в фармацевтическую композицию для дальнейшего облегчения введения соединения. Примеры наполнителей, но не ограничиваясь ими, включают карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и различного типа крахмалы, производные целлюлозы, желатин, растительные масла и полиэтиленгликоли.
Способы получения лекарственных форм и введения лекарств можно найти в КетшдФп'к РНагтасеибса1 8с1епсе§, Маск РиЬШЫпд Со., ЕаМоп. РА, в последнем издании.
Подходящие способы введения могут, например, включать пероральное, ректальное, чресслизистое, чрескожное, энтеральное или парэнтеральное введение, включая внутримышечные, подкожные и интрамедуллярные инъекции, а также интратекальную, прямую интравентрикулярную, внутривенную, внутрибрюшинную, назальную или внутриглазную инъекции.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно приготовить способами, хорошо известными в данной области, например, с помощью обычного перемешивания, гранулирования, получения драже, растирания в порошок, эмульгирования, заключения в оболочку или в матрицу, или используя процесс лиофилизации.
Фармацевтические композиции для использования в соответствии со способом настоящего изобретения можно приготовить обычными способами, используя один или более из фармацевтически приемлемых носителей, включая наполнители и вспомогательные агенты, которые облегчают процесс включения активных пептидов в препараты, которые можно использовать фармацевтически. Подходящая форма зависит от выбранного способа введения.
Для инъекций пептиды настоящего изобретения можно приготовить в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенка, раствор Рингера или забуференный физиологический солевой раствор, с добавлением или без добавления органических растворителей, таких как пропиленгликоль и полиэтиленгликоль. Для введения через слизистую оболочку в формах используют агенты, способствующие проникновению через слизистую. Такие агенты хорошо известны в данной области.
Для перорального введения пептиды можно легко приготовить, комбинируя активные пептиды с фармацевтически приемлемыми носителями, которые хорошо известны в данной области. Такие носители позволяют получить пептиды настоящего изобретения в таких формах, как таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкости, гели, сиропы, взвеси, суспензии и т.п. для перорального приема пациентом. Фармакологические препараты для перорального введения можно приготовить, используя наполнители, необязательно измельчая полученную смесь и превращая смесь в гранулы, затем добавляя при желании подходящие вспомогательные агенты, для получения таблеток или сердцевин драже. Подходящими наполнителями являются, в частности, наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, смола трагаканта, метилцелюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза; и/или физиологически приемлемые полимеры, такие как поливинилпирролидон (РУР). При желании можно добавить разрыхляющие агенты, такие как сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота, или ее соль, такая как альгинат натрия.
На сердцевины драже наносят покрытия. Для этой цели можно использовать концентрированные растворы сахара, которые могут необязательно содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопола, полиэтиленгликоль, диоксид титана, лакирующие растворы и подходящие органические растворители или смеси растворителей. В оболочки драже или таблеток можно добавить красители или пигменты для идентификации, или для того, чтобы охарактеризовать различные комбинации доз активных ингредиентов.
Фармацевтические композиции, которые предназначены для перорального введения, включают сборные капсулы, состоящие из желатина, а также мягкие герметичные капсулы, сделанные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Сборные капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителями, такими как лактоза, связующими, такими как крахмалы, смазывающими агентами, такими как стеарат магния, и необязательно стабилизаторы. В мягких капсулах активные пептиды могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как нелетучие масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы. Все формы для перорального введения должны быть в дозированных формах, подходящих для выбранного способа введения.
Для способа введения за щеку, композиции могут быть, как обычно, изготовлены в форме таблеток или пастилок.
Для введения путем ингаляции пептиды настоящего изобретения удобно вводить в форме аэрозольных спреев, распыляемых из баллончика со сжатым воздухом или распылителя с подходящим распыляющим агентом, например, дихлордифторметаном, трихлорфторметаном, дихлортетрафторэтаном или диоксидом углерода. В случае аэрозолей под давлением единичную дозу можно определить с помощью клапана, который пропускает отмеренное количество препарата. Капсулы и картриджи, например, желатина, для использования в ингаляторе или в устройстве для вдувания, можно выполнить таким обра
- 13 005579 зом, чтобы они содержали смесь порошка соединения и подходящую порошковую основу, такую как лактоза или крахмал.
Раскрываемые в данном описании пептиды можно приготовить в формах для парэнтерального введения, например, для болюсного введения или для непрерывного вливания. Формы для инъекций могут быть выполнены в виде разовых дозированных форм, например, в ампулах, или в контейнерах с многими дозами, в которые необязательно добавлен консервант. Композиции могут иметь вид суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных носителях, и могут содержать способствующие созданию формы агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.
Фармацевтические композиции для парэнтерального введения включают водные растворы активных препаратов в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных пептидов можно приготовить в виде масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают нелетучие масла, такие как кунжутное масло, или сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды или липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно суспензия может содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость пептидов, чтобы обеспечить получение высококонцентрированных растворов. В другом варианте активный ингредиент может быть в форме порошка для растворения перед применением в подходящем растворителе, например, в стерильной, не содержащей пирогенов воде.
Пептиды настоящего изобретения могут быть также приготовлены в виде композиций для ректального введения в таком виде, как суппозитории или клизмы, используя, например, обычные основы для суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды.
Описываемые фармацевтические композиции могут также содержать подходящие твердые носители, носители в виде геля или наполнители. Примеры таких носителей или наполнителей включают, но не ограничиваясь ими, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.
Специалисты могут легко определить оптимальные дозы и схемы приемов для каждого из пептидов настоящего изобретения.
Для любого из пептидов, используемых в соответствии со способом настоящего изобретения, терапевтически эффективное количество, называемое также терапевтически эффективной дозой, можно определить, вначале используя анализ клеточных культур или анализ ш у1уо на животных. Так, например, дозу можно определить в модели на животных для достижения циркулирующей концентрации в интервале, который включает ИК50 или ИК100, определенные для культуры клеток. Такую информацию можно использовать для более точного определения необходимых для человека доз. Начальные дозы можно также определить из результатов исследований ш у1уо. Используя эти начальные руководства, специалист может определить величину эффективной дозы для человека.
Более того, токсичность и терапевтическую эффективность описываемых пептидов можно определить с помощью стандартных фармацевтических процедур для культуры клеток или на экспериментальных животных, например, определяя ЛД50 и ЭД50. Отношение величин токсичной дозы и дозы терапевтически эффективной является терапевтическим показателем, и его можно выразить как отношение ЛД50 к ЭД50. Предпочтительны пептиды, которые демонстрируют высокие терапевтические показатели. Результаты анализов, полученные для клеточных культур и исследований на животных, можно использовать для определения дозового интервала, который не был бы токсичным для человека. Дозы для таких пептидов находятся, предпочтительно, в интервале циркулирующих концентраций, который включает ЭД50 с малой токсичностью или вовсе без токсичности. Дозы могут меняться в этом интервале значений в зависимости от используемой формы дозы и способа введения. Конкретную форму, способ введения и дозу должен выбрать врач с учетом состояния пациента (см., например, Рт§1 е! а1., 1975, 1п: Тйе Рйагтасо1одка1 Вак1к о£ Тйегареийск, сйар!ег 1, раде 1).
Количество доз и интервал между введениями можно установить индивидуально для достижения таких уровней активного ингредиента в плазме, которых достаточно для поддержания терапевтического эффекта. Обычные допустимые дозы для перорального введения находятся в интервале от около 50 до 2000 мг/кг/прием, обычно от около 100 до 1000 мг/кг/прием, предпочтительно от около 150 до 700 мг/кг/прием и наиболее предпочтительно от около 250 до 500 мг/кг/прием. В некоторых случаях терапевтически эффективные уровни в сыворотке достигаются в результате введения нескольких доз каждый день. В случае локального введения или селективного поглощения эффективная локальная концентрация лекарства может не быть связана с концентрацией в плазме. Специалист сможет оптимизировать эффективную локальную дозировку без чрезмерных экспериментов.
В зависимости от серьезности состояния и реакции подлежащего лечению пациента прием доз может быть однократным с применением композиции с замедленным выделением, при этом курс лечения длится от нескольких дней до нескольких недель до излечения или до ослабления болезненного состояния.
Необходимое для введения количество композиции будет, естественно, зависеть от подлежащего лечению пациента и тяжести заболевания, способа введения, точки зрения врача и т. д. Композиции на
- 14 005579 стоящего изобретения можно при желании представить в упаковке или в распределительном устройстве, таком как набор, одобренный ΡΌΆ, который может содержать одну или более из разовых дозированных форм, содержащих активный ингредиент.
Упаковка может, например, содержать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистер. Упаковка или распределительное устройство может сопровождаться инструкцией для применения. Упаковка или распределительное устройство может также сопровождаться предупреждением, связанным с контейнером в форме предписания правительственного учреждения, регулирующего изготовление, применение или продажу лекарств, при этом такое предупреждение отражает утверждение учреждением формы композиции или введения человеку или животным. Такое предписание может быть, например, этикеткой, утвержденной администрацией США по пищевым и лекарственным продуктам для лекарств, отпускаемых по рецепту врача. Композиции, включающие пептид настоящего изобретения, приготовленные в совместимом фармацевтическом носителе, можно поместить в соответствующий контейнер и пометить для лечения или профилактики указанного состояния или для того, чтобы вызвать нужный результат. Соответствующие указания в примечании могут включать лечение и/или профилактику аутоиммунного заболевания, вирусного заболевания, вирусной инфекции, тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, гиперлипидемии, холестеринемии, гликозурии и диабета или индуцирование кроветворения, пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, мегакариоцитопоэза, эритропоэза, лейкоцитопоэза и/или тромбоцитопоэза.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть полезны для поддержания и/или восстановления составляющих кровеносной системы, баланса количества кровяных клеток, для баланса уровней метаболитов в крови, включая уровни сахара, холестерина, кальция, мочевой кислоты, мочевины и ферментов, таких как щелочная фосфатаза. Далее фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть полезна для индуцирования пролиферации кровяных клеток, модулирования количества белых и/или красных кровяных клеток, особенно повышения количества белых и/или красных кровяных клеток, повышения уровня гемоглобина в крови и модулирования количества тромбоцитов.
Термин балансировка, используемый в связи с уровнями некоторых физиологических параметров, означает изменение уровней данных параметров и подведение их ближе к нормальным значениям.
Термин нормальные значения в том смысле, как использовано в связи с физиологическими параметрами, означает значения, которые попадают в интервал значений для здоровых людей и животных.
В особо предпочтительных вариантах пептиды настоящего изобретения приводят к нормальным значениям количество красных кровяных клеток, белых кровяных клеток, тромбоцитов и уровень гемоглобина. Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно использовать для лечения и/или профилактики заболеваний гемопоэтических стволовых клеток, включая заболевания, опосредованные тромбоцитами, лимфоцитами, плазмоцитами и нейтрофилами, а также дефицита и неправильного функционирования при предлейкозных и лейкозных состояниях и при тромбоцитопении.
Далее фармацевтические композиции можно использовать для лечения и/или профилактики клеточно-пролиферативных заболеваний. В этой связи следует отметить, что фармацевтические композиции настоящего изобретения выгодно использовать для стимулирования иммунной реакции при химиотерапии или лучевой терапии, для ослабления негативных эффектов, уменьшения рвоты, вызываемой химиотерапией и облучением, чтобы способствовать быстрейшему выздоровлению.
Кроме того, фармацевтические композиции настоящего изобретения можно использовать для стимулирования иммунной реакции человека во время лечения заболеваний, связанных с иммунодефицитом, например, ВИЧ и аутоиммунных заболеваний.
Композиции настоящего изобретения могут быть также предназначены для использования в ветеринарии.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно использовать для лечения и/или профилактики, например, заболеваний, сопровождающихся аномальными уровнями кровяных клеток, заболеваний, сопровождающихся продуцированием и дифференцировкой гемопоэтических стволовых клеток, для лечения заболеваний, опосредованных тромбоцитами, лимфоцитами и/или нейтрофилами, для лечения предлейкозных или лейкозных состояний и для лечения тромбоцитопении. Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно использовать для лечения заболеваний, связанных с пролиферацией клеток и заболеваний, связанных с иммунодефицитом, таких как ВИЧ, и аутоиммунные заболевания. Далее фармацевтические композиции настоящего изобретения можно использовать для стимулирования иммунной реакции при химиотерапии или лучевой терапии, например, для уменьшения рвоты, связанной с химиотерапией.
Далее настоящее изобретение относится к антибактериальным фармацевтическим композициям, включающим в качестве активного ингредиента по крайней мере один пептид настоящего изобретения, и к использованию пептидов настоящего изобретения в качестве антибактериальных агентов.
Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ профилактики или лечения аутоиммунных заболеваний, причем способ этот осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
- 15 005579
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения вирусного заболевания, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики вирусной инфекции, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования кроветворения, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования мегакариоцитопоэза, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования эритропоэза, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования лейкоцитопоэза, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования тромбоцитопоэза, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения тромбоцитопении, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения панцитопении, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения гранулоцитопении, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения гиперлипидемии, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения холестеринемии, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения глюкозурии, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения диабета, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения СПИД, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения инфекции, вызванной ВИЧ, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиорадиотерапии, поддерживаемой трансплантацией
- 16 005579 аутологичного костного мозга, или периферических стволовых кроветворных клеток (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения вирусного заболевания, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики вирусной инфекции, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования кроветворения, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Νконцевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования мегакариоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования эритропоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования лейкоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования кроветворения, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования тромбоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения тромбоцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения панцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения гранулоцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
- 17 005579
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения гиперлипидемии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α§1, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения холестеринемии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α§1, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения глюкозурии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α§1, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения диабета, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α§1, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения СПИД, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α§1, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения инфекции, вызванной ВИЧ, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α§1, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиорадиотерапии, поддержанными трансплантацией аутологичного костного мозга или периферических стволовых кроветворных клеток (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α§1, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α§1, для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α§1, для профилактики или лечения вирусного заболевания.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α§1, для профилактики вирусной инфекции.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α§1, для индуцирования кроветворения.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α§1, для индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α§1, для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α§1, для индуцирования мегакариоцитопоэза.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α§1, для индуцирования эритропоэза.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α§1, для индуцирования лейкоцитопоэза.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α§1, для индуцирования тромбоцитопоэза.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α§1, для профилактики или лечения тромбоцитопении.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α§1, для профилактики или лечения панцитопении.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α§1, для профилактики или лечения гранулоцитопении.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α§1, для профилактики или лечения гиперлипидемии.
- 18 005579
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина </.81. для профилактики или лечения холестеринемии.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для профилактики или лечения глюкозурии.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для профилактики или лечения диабета.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для профилактики или лечения СПИД.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для профилактики или лечения инфекции, вызванной ВИЧ.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81, для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиорадиотерапии, поддержанными трансплантацией аутологичного костного мозга, или трансплантацией периферических стволовых кроветворных клеток (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ).
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен очищенный пептид, последовательность аминокислот которого выбрана из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0:1-19.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция, включающая очищенный пептид, последовательность аминокислот которого выбрана из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0:1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение с успехом решает недостатки известных в настоящее время конфигураций, предоставляя пептиды для лечения заболеваний человека, причем указанные пептиды получены из Νконцевой части казеина α81, не обладают видимой токсичностью, зато отличаются высокой терапевтической эффективностью.
Дополнительные цели, преимущества и новые отличительные особенности настоящего изобретения станут очевидны специалистам после ознакомления со следующими примерами, которые не следует рассматривать как ограничивающие. Кроме того, каждый из различных вариантов и аспектов настоящего изобретения, как оно изложено выше и как заявлено в формуле изобретения, находит экспериментальное подтверждение в приведенных далее примерах.
Примеры
Сделаны ссылки на следующие примеры, которые вместе с приведенным выше описанием иллюстрируют изобретение не лимитирующим образом.
Материалы и экспериментальные методы
Препараты пептидов, полученных из нативного казеина.
Фракцию казеина из коровьего молока выделяют по способу Ηίρρ е! а1. (1952), 1Ыб. и подвергают исчерпывающему протеолитическому расщеплению химозином (известным также как реннин) (20 нг/мл) при 30°С. После завершения реакции, раствор нагревают для инактивирования фермента и гидролизат осаждают как параказеин, подкисляя органической кислотой, уксусной или трихлоруксусной кислотой. Параказеин выделяют центрифугированием и надосадочную фракцию, содержащую представляющие интерес пептидные фрагменты, снова осаждают как казеицидин более высокими концентрациями кислоты. Полученный казеицидин после повторного суспендирования, диализа и нейтрализации лиофилизируют. Анализируют биологическую активность полученного порошкообразного препарата, как указано ниже, и выделяют с помощью ВЭЖХ для пептидного анализа.
ВЭЖХ анализ пептидов, полученных из нативного казеина.
Пептиды, полученные из нативного казеина, как указано выше, анализируют с помощью ВЭЖХ в две стадии. Вначале лиофилизированный казеиновый гидролизат разделяют, используя С18 обращенную фазу и градиентное элюирование смесью 0,1% водная трифторуксусная кислота (вес./вес.) - ацетонитрил. Детектирование осуществляют по УФ-поглощению на 214 нм. После этого образцы анализируют с помощью ВЭЖХ-масс-спектрометра (М8), снабженного источником распыления электронов. Рассчитанные массы представляют массы ионизированных пептидных образцов, полученных по времени удерживания. После разделения аминокислотный состав пептидов определяют с помощью газофазного микросеквенатора (АррНеб ВюкуШешк 470А).
Приведенные результаты являются репрезентативными: обычно наблюдают восемь пиков пептидов, из которых 3 основных пика имеют величину К! = 17,79, 19,7, 23,02, и 5 более слабых пиков с величинами К! = 12,68, 14,96, 16,50, 21,9 и 25,1, причем данные величины К! соответствуют молекулярным массам 2764, 1697, 1880, 2616, 3217, 2333, 1677 и 1669 Да соответственно. Для К! 17,79 (соответствующему 2764 Да) основной пик пептида, состоящего из 23 аминокислот, которые представляют аминокислоты 1-23 α81 казеина, имеет последовательность ΚΡΚΗΡΙΚΗΟΟΕΡΟΕνΕΝΕΝΕΕΚΕ (8Е0 ΙΌ N0:16, см. Мс8\\'еепу е! а1., 1993, 1Ыб., для пептидной последовательности α81 казеина). Другие пептиды соответствуют положениям 208-224 β-казеина, положениям 16-37 казеина α81 и положениям 197-222 α82 подобного казеинового предшественника. Присутствуют также и другие пептиды.
- 19 005579
Синтетические пептиды, полученные из казеина.
Пептиды, с возрастающей длиной цепочки, соответствующие Ν-концевым 8-26 аминокислотам α81 казеина, были синтезированы ХоХе'Щ'к 1,1с1., Иа1£а, 1§гае1, со степенью чистоты >95% (ВЭЖХ). Контроль качества включает ВЭЖХ, масс-спектрометрию (Е1), анализ аминокислот и содержания пептидов. В представленной ниже табл. 3 приведены указанные пептиды.
Таблица 3
Обозначение Последовательность (Ν-конец-С-конец) № аминокислот Послед.Ю Νο:
Υ ΚΡΚΗΡΙΚΗ 8 1
X ΚΡΚΗΡΙΚΗΟ 9 2
1А ΚΡΚΗΡΙΚΗ0Ο 10 3
2А КРКНР1КНООЬ 11 4
ЗА КРКНР1КНООБР 12 5
А ΚΡΚΗΡΙΚΗΟΟΣΡΟ 13 6
В ΚΡΚΗΡΙΚΗΟΟΣΡΟΕ 14 7
С ΚΡΚΗΡΙΚΗΟΟΣΡΟΕν 15 8
ϋ ΚΡΚΗ РIКНООЪРОЕУЬ 16 9
Е КРКНРIКНООЬРОЕУШ 17 10
Г КРКНРIКНООЬРОЕ УШЕ 18 11
С ΚΡΚΗ РIКНООЬРОЕ νΐιΝΕΝ 19 12
Н КРКНРIКНОСЪРОЕУЬЫЕЫЬ 20 13
I КРКНР1КН0СЪР0ЕУШЕЦЬЪ 21 14
Ц КРКНР1КН0ОЪР0ЕУШЕЫЬЬК 22 15
К КРКНР1КНОСЪРОЕУЬЫЕЛЬЪКГ 23 16
Ь КРКНР1КНОСЬРОЕУЬЫЕЦЬЬКГГ 24 17
М КРКНР1КН06ЬР0ЕУЬЫЕЦЬЬКЕГУ 25 18
N КРКНР IКНООЬРОЕУШЕЦЬЬКЕЕУА 26 19
Ювенильный (Тип I, ЮЭМ) диабет у диабетических мышей без ожирения (ΝΘΌ).
ΝΘΌ мыши представляют обычно используемую модель для исследования аутоиммунных заболеваний и ювенильного диабета человека. Шестинедельные самки ΝΘΌ мышей получают либо одну, либо две инъекции в неделю по 100 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, всего в течение 5 или 10 раз. Контрольным мышам инъекции не проводят. Степень заболевания определяют по глюкозурии, которую измеряют, используя СотЬ1 1е§1 зйскз [Ого88, Ό.Ι. е! а1. (1994), Э1аЬеЮ1оду, 37:1195]. Результаты выражают как процент мышей без глюкозурии для каждого из образцов в течение периода в 230 дней.
Стимулирование пролиферации натуральных киллерных (ΝΚ) клеток.
Из периферических стволовых кровяных клеток человека (РВ8С): РВ8С от О-С8Е-обработанных субъектов разделяют на градиенте фиколла, дважды промывают средой КРМ1-1640 и высевают в 1,5 мл лунки без пептидов или с пептидами, полученными из нативного казеина, или пептидами, полученными из синтетического казеина, как указано (0-500 мкг/мл). После двух дней инкубирования клетки анализируют на природную киллерную активность, измеряя радиоактивность, выделенную из 358-меченых К562 клеток-мишеней (ΝΕΟ-709α, 185,00 МБк, 2,00 мКи ЕА8УТАО1й метионин, Ь-[358] 43,48 ТВц на ммоль, 1175,0 Кюри на ммоль, 0,488 мл, ВозЮп ϋ8Α). Две концентрации эффекторных клеток (2,5 х 105 и 5 х 105 клеток на лунку) инкубируют с 5 х 103 клеток-мишеней на лунку (отношения эффекторные клетки:клетки-мишени составляют 50:1 и 100:1 соответственно) в планшетах для культуры тканей с ϋобразными лунками. Клетки инкубируют в течение 5 ч при 37°С в смеси 5% СО2, 95% воздуха и осаждают пятиминутным центрифугированием со скоростью 1000 об./мин. Выделение 358 измеряют в 50 мкл образцах надосадочной жидкости.
Из клеток мышиного костного мозга (ВМ).
Костный мозг отбирают у необработанных мышей ВАЬВ/с и С57В1/6. Костный мозг отбирают из длинных костей передних и задних лап мышей, вводя среду, используя иглы 25 размера. Отсосанные клетки промывают КРМ1 1640, подсчитывают в гемоцитометре и витально окрашивают (20 мкл клеток в 380 мкл уксусной кислоты/трипановый синий), затем высевают в культуральные склянки в концентрации 2-5 х 106 клеток/мл в среду КРМ1-1640, содержащую 10% фетальной телячьей сыворотки, антибиотики и глутамин с добавлением или без добавления 100 мкг пептидов, полученных из нативного казеина. Культуры клеток инкубируют в смеси 5% СО2, 95% воздуха в течение 12-15 дней при 37°С, собирают десяти
- 20 005579 минутным центрифугированием при 1500 об./мин, подсчитывают и высевают в И-образные лунки с 51 Сг (хром-51, 740 МБк, 2,00 мКи активность) или 358 (ΝΕΟ-709Λ, 185,00 МБк, 2,00 мКи ЕА8УТАС!й Метионин, Ь-[358] 43,48 ТВс.| на ммоль, 1175,0 Кюри на ммоль, 0,488 мл, Вок!оп И8А) мечеными клетками мышиной лимфомы (УАС) при отношении эффекторные клетки:клетки-мишени либо 25:1, либо 50:1. ΝΚ активность выражают как процент радиоактивности в не содержащих клеток надосадочных жидкостях.
Пролиферация человеческих клеток в культуре.
Периферическую кровь (РВ) отбирают у здоровых или больных пациентов. Больным пациентам не вводят ничего, кроме С-С8Е перед плазмофорезом. Клетки костного мозга (ВМ) отбирают у здоровых добровольцев или больных пациентов с ремиссией после химиотерапии путем отсасывания. Пуповинную кровь отбирают в процессе нормальных родов. Клетки человека, различного происхождения, выделяют с помощью градиента фиколла, дважды промывают средой ВРМ1-1640 и высевают в 0,2 мл плоскодонные культуральные планшеты, в указанных концентрациях с добавлением или без добавления пептидов, полученных из нативного казеина, или с добавлением или без добавления пептидов, полученных из синтетического казеина, как указано. Все обработки, включая контрольные, повторяют трижды. Клеточную пролиферацию определяют путем включения 3НТ: добавляют радиоактивный тимидин [тимидин (метил-[3Н]). Удельная активность 65 Кюри на мл 37 МБк на мл, ΙΟΝ Согр.] после инкубирования в течение указанного количества дней. Клетки инкубируют в течение 16-20 ч с меткой, собирают и промывают средой. Включенную радиоактивность измеряют с помощью β сцинтилляционного счетчика.
Пролиферация клеточных линий лейкоза К562 и рака толстой кишки.
Клеточные линии рака толстой кишки и лейкоза К562 являются распространенными линиями злокачественных клеток, выращиваемых в культуре. Обе клеточные линии выращивают в культуральных флаконах в атмосфере, состоящей из 5% СО2, 95% воздуха, при 37°С, собирают и промывают средой перед посевом в лунки для культуры тканей в количестве 4 х 105 клеток (К562) или 3 х 103 клеток (раковые клетки толстой кишки) на лунку. Пептиды, полученные из нативного казеина, добавляют в лунки в указанных концентрациях, и после 9 (К562) или 3 (толстая кишка) дней инкубирования добавляют меченый тимидин, как указано выше. Сбор и измерения захваченной радиоактивности осуществляют указанным выше способом.
Определение ΝΚ и Т-клеточной пролиферации стволовых кроветворных клеток в периферической крови (РВ8С) человека с помощью флуоресцентных антител.
Стволовые клетки периферической крови (РВ8С) от пациентов, которым вводили С-С8Е, собирают с помощью плазмофореза, разделяют, используя градиент фиколла, дважды промывают средой ВРМ11640, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку, и инкубируют в культуральных бутылях при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2 и 95% воздуха, с добавлением или без добавления пептидов, полученных из нативного казеина в указанных концентрациях. После 10, 14 или 28 дней инкубирования с пептидами, полученными из нативного казеина, наличие Т клеток (СЭ3 поверхностный антиген) и ΝΚ клеток (СО,6 поверхностный антиген) определяют с помощью прямой иммунофлуоресценции, используя анти-СЩ флуоресцентное антитело (СО3/Р1ТС клон ИНСТ1), анти-СП56 флуоресцентное антитело (СЩ/ВРЕ клон МОС-1) (ЭАКО А/8, Эептагк) и мышиные 1дС1/ВРЕ и 1дС1/Р1ТС антитела в качестве контроля. Детектирование флуоресцентно меченых клеток осуществляют, используя сортировку по флуоресцентно активированным клеткам (РАС8).
Стимулирование кроветворения в клетках костного мозга (ВМ) в культуре.
Пролиферация мегакариоцитов в мультипотенциальных колониях (СРИ-СЕММ) из мышиных клеток костного мозга.
Первичные клетки костного мозга (1 х 105 на мл), полученные от 8-12 недельных С8Н/Не1 мышей, выращивают на не содержащей сыворотки среде метилцеллюлоза-ГМЭМ в течение 8-9 дней в атмосфере, содержащей 5% СО2 и 95% воздуха, при 37°С. Среда, подходящая для выращивания мультипотентных колоний (СРИ-СЕММ), содержит 1% В8А (81дта), 10-4 М тиоглицерина (81дта), 2,8 х 10-4 М трансферрина человека (ТР, Вю1одюа1 1пбик1г1ек, 1кгае1), 10% ^ЕН1-СМ в качестве источника 1И-3, и 2 ед/мл эритропоэтина (гйЕРО, В & Ό 8ук!етк, М1ппеаро11к). Колонии оценивают спустя 8-9 дней, используя темнопольный микроскоп О1утрик. Их отбирают микропипеткой, цитоцентрифугируют и окрашивают МауСгинта1б-С1етка для дифференциального подсчета. Для каждого препарата подсчитывают по крайней мере 700 клеток.
Пролиферация клеток, образующих мегакариоциты и эритроиды из костного мозга и кровяных клеток спинного мозга человека.
Образец костного мозга, полученный от видимо здорового человека, разделяют, используя градиент плотности на Н|к1орас.|ие-107 (81дта И1адпокйск), в результате чего получают очищенную популяцию мононуклеарных клеток (МКС). Анализ колоний осуществляют в среде для чашек Петри, содержащей конечную концентрацию 0,92% метилцеллюлозы (4000 сепРграке порошок, 81дта И1адпок!1с), снова растворяют в среде Дюльбекко, модифицированной Исковым, содержащей 36 мМ бикарбоната натрия (С1Ьсо), 30% фетальной телячьей сыворотки (РВ8) (Нус1опе), 0,292 мг/мл глутамина, 100 ед/мл пеницил
- 21 005579 лина и 0,01 мл стрептомицина (Вю1одка1 1пби51пс5, Вей Наетек). Кровь, взятую из пуповины здоровых новорожденных, собирают и обрабатывают указанным выше способом.
Среду для анализа колоний, содержащую 105 ΜΝ0 в мл, высевают в 24 луночные культуральные планшеты (в трех экземплярах) (Сгетег), по 0,33 мл на лунку. Культуры инкубируют при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2 и 95% воздуха, при 55% относительной влажности без пептидов или с пептидами, полученными из нативного казеина, или пептидами, полученными из синтетического казеина в указанных концентрациях. Планшеты анализируют спустя 14 дней, подсчитывая колонии, содержащие более 50 клеток. Мегакариоциты идентифицируют с помощью косвенной иммунофлуоресценции, используя высокоспецифичные кроличьи антитела, распознающие гликопротеины тромбоцитов человека, и Р1ТС-конъюгированный козий антикроличий 1дС. Добавленные факторы роста включают 15 нг/мл 1еисотах (СМ-С8Р) (8апбох Рйагта) и 5% (об./об.) индуцированную фитогемагглютинином-т человека (Эйсо Ьай), кондиционированную среду (СМ) для индуцирования развития гранулоцит-моноцитных колоний (СРИ-СМ). Для индуцирования образования эритроидных колоний добавляют эритропоэтин (ЕРО) в количестве 2 ед/мл.
В другом варианте клетки костного мозга человека, полученные от добровольцев-доноров или пациентов, которые претерпели аутологичную трансплантацию костного мозга, предварительно культивируют в среде, содержащей 10-1000 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, культуру ведут на полутвердом агаре и подсчитывают гранулоцитарно-макрофагальные кроветворные колонии (СМСРИ) на 7 или 14 день после обработки.
Мегакариоцитопоэз оценивают для нормальных клеток костного мозга, полученных от здоровых добровольцев-доноров, либо подсчитывая число мегакариоцитов в образцах жидких культур (КРМ1-1640 плюс 10% АВ сыворотка человека, глутамин и антибиотики) без добавления или с добавлением 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, или с помощью метилцеллюлозного анализа для оценки образования колоний. 2 х 105 клеток костного мозга высевают в присутствии стандартной комбинации факторов роста без добавления или с добавлением пептидов, полученных из нативного казеина. В метилцеллюлозном анализе мегакариоциты подсчитывают с помощью инвертированного микроскопа на 12-14 день после посева.
Клинические исследования с использованием пептидов, полученных из нативного казеина.
В одной из серий исследований единичную дозу, содержащую 50 мг пептидов, полученных из нативного казеина, вводят внутримышечно пациенту 3 порциями в течение 2 ч. Клинические параметры контролируют с указанными интервалами. В других исследованиях пациенты с различными стадиями лечения и/или ремиссии по поводу раковых заболеваний и метастазов получают пептиды, полученные из нативного казеина, один или два раза, при этом осуществляется контроль за изменениями количества клеток в периферической крови.
1п νίίΐΌ ингибирование ВИЧ клеток лимфоцитами человека.
Пептиды. Пептиды (либо пептиды, полученные из нативного казеина, либо синтетические пептиды (состоящие из 8-26 аминокислот, см. табл. 3, полученные из казеина)), поставляемые в виде лиофилизированного порошка, снова суспендируют в полной среде КРМ1 и добавляют в клеточные культуры в конечных концентрациях от 50 до 1000 мкг/мл.
Клетки. Известно, что несколько типов свежевыделенных клеток человека (первичные клетки) и клеточных линий восприимчивы ίη уйго к ВИЧ-1 инфекции, хотя в основном любая клетка, даже с низким уровнем содержания на поверхности ί.Ό4 молекул, может рассматриваться как потенциальная мишень для ВИЧ-1 инфекции. Были выбраны две обычно используемые клеточные линии человека, которые проявляют высокую чувствительность к ВИЧ-1 инфекции, СЕМ и 8ир-Т1.
СЕМ представляет Т4-лимфобластоидную клеточную линию человека, полученную вначале С.Е. Ро1еу е1 а1. [(1965), Сапсег 18:522] из периферической крови лейкоцитарной пленки 4-летней кавказской девочки с острым лимфобластным лейкозом. Данные клетки постоянно поддерживались в суспензии в среде и были использованы для анализов инфекционной способности, противовирусных агентов и нейтрализующих антител.
8ир-Т1 представляет Т-лимфобластоидную клеточную линию человека, полученную из плевральной жидкости 8 летнего мальчика с неходжкинской Т-клеточной лимфомой |8ιηί11ι, 8.Ό. е1 а1. (1984) Сапсег Еекеагсй 44:5657]. Данные клетки экспрессируют высокие уровни поверхностных СО4, и их удобно использовать при изучении слияния клеток, цитопатического эффекта и инфекционной способности ВИЧ-1. Культуру 8ир-Т1 клеток ведут в суспензии в обогащенной среде.
Среда. Клетки выращивают в полной среде КРМ1-1640, обогащенной 10% фетальной телячьей сывороткой, 2 мМ глутамина и 2 мМ пенициллин-стрептомицина (С1ВСО).
Вирус. В качестве ВИЧ вирусного штамма используют ВИЧ-1ШВ, исходно обозначавшийся как НТЬУ-ШВ. Концентрированные культуральные жидкости периферической крови, полученной от нескольких пациентов со СПИД или родственными заболеваниями, используют для установления постоянной продуктивной инфекции в Н-9 клетках. Данный подтип В вируса обладает высокой способностью реплицироваться в Т-клеточных линиях человека. Титр вируса составляет 5,38 нг/мл в исходном растворе.
- 22 005579
Е1ТС-меченые пептиды.
Используют МТС Е-1300 (Флуоресцеин изотиоцианат, изомер I, 81дта (Е25о-2) 81. Ьошк, ΜΙ, И8Л) с максимумами возбуждение/испускание при около 494/520 нм соответственно. Аминореакционноспособное производное флуоресцеина является, вероятно, наиболее общим реагентом, обеспечивающим получение флуоресцирующего производного для ковалентно меченых белков. Конъюгированные с МТС пептиды, полученные из нативного казеина, получают ковалентным связыванием МТС с аминогруппами лизина.
Анализ захвата антигена ВИЧ-1 Р24.
Используют набор для анализа захвата ВИЧ-1 Р24 антигена, созданный для количественного определения ВИЧ-1 Р24 ядерного антигена, что прямо пропорционально степени продуцирования вируса в клетках. Данный набор поступает из программы вакцинации СПИД 8А1С-Ж.ТЕгебепск Сапсег йекеагсй ΙηδΙίΙιιΙο. Р.О. Вох В, Егебепск Μ.Ό 21702, И8А и включает 96 луночные планшеты, покрытые моноклональным антителом к ВИЧ-1 Р24, первичную антитело-кроличий анти-ВИЧ Р24 сыворотку, вторичное козий анти-кроличий-1дС (Н+Ь) конъюгированное с пероксидазой антитело, систему ТМВ пероксидазного субстрата и подвергнутый лизису ВИЧ-1 Р24 стандарт. Анализ захвата ВИЧ-1 Р24 антигена осуществляют с помощью считывающего на длине волны 450 нм устройства Огдапоп-Тесйшса ЕЬ18А геабег, используя сравнение на длине волны 650 нм.
ЕЬ18А захвата антигена ВИЧ-1 Р24.
ВИЧ инфицирование измеряют с помощью косвенного ферментного иммуноанализа, в котором определяют ВИЧ-1 Р24 ядерные антигены в среде для культуры тканей. Надосадочную жидкость культуры тканей подвергают взаимодействию с первичным кроличьим анти-ВИЧ-1 Р24 антигеном и визуализируют, используя конъюгированный с пероксидазой козий антикроличий 1дС, причем интенсивность возникающей окраски пропорциональна количеству ВИЧ-1 антигена, присутствующего в надосадочной жидкости культуры тканей.
Уровень биологической безопасности (ВЬ-3) лаборатории.
Все процессы получения и выделения вирусов, инфицирования вирусами, процесс культивирования ВИЧ-1 инфицированных клеток, сбор надосадочной жидкости, содержащей Р24 антиген, и ЕЫ8А захвата Р24 антигена, осуществляли в условиях ВЬ-3 НеЬгеч Ищуегкйу, Набаккай Меб1са1 8сйоо1 и проводились в соответствии с практикой биобезопасности, указанной в ΝΙΗ и СИС (И8А).
Проточная цитометрия.
Сортировщик клеток ЕАС8ой (ВесЮп & И1скшкоп, 8ап .Токе, СА. И8А) использовали для (ί) определения процента СИ4 позитивных СЕМ и кир-Т1 клеток перед их инфицированием ВИЧ-1 для подтверждения существования одинаковых степеней инфицирования в каждом из экспериментов; и (ίί) определения Т клеток, которые содержат Е1ТС-конъюгированные пептиды, полученные из нативного казеина, в своей цитоплазме и ядрах.
Инкубатор с СО2.
Для получения клеток вирусных культур с ВИЧ-1 клетки и вирусы, предварительно обработанные пептидами, полученными из нативного казеина, и клетки, которые затем инкубируют с ВИЧ-1, все содержались во влажной атмосфере СО2 на протяжении всего эксперимента.
ВИЧ-инфицирование культивируемых СИ4 клеток человека.
Клетки (СЕМ, 8ир-Т1) предварительно инкубируют с несколькими возрастающими концентрациями пептидов, полученных из нативного казеина (50-1000 мкг/мл), или синтетических пептидов, полученных из казеина (10-500 мкг/мл), в течение 3, 24 (для синтетических и нативных пептидов) и 48 (только для нативных пептидов) ч, и после этого в каждую лунку добавляют ВИЧ-1ШВ (45 пг/мл конечная концентрация). ВИЧ-1ШВ предварительно инкубируют с пептидами в течение 3 ч, а затем добавляют к клеткам (5000 клеток/лунка) в планшеты для культуры тканей. В качестве контроля используют ΙΕ (инфицированные клетки, культивируемые с ВИЧ-1 и без пептидов), И1Е (не инфицированные клетки, культивируемые с ВИЧ-1 и без пептидов) и И1Е + Сй (неинфицированные клетки + пептиды, полученные из нативного казеина, причем клетки культивируют в присутствии пептидов, полученных из нативного казеина, {50-1000 мкг/мл}) для проверки действия пептидов, полученных из нативного казеина, и синтетических пептидов, полученных из казеина, на жизнеспособность и рост клеток. Жизнеспособность и степень пролиферации клеток определяют на 7, 10 и 14 день после инфицирования (день сбора надосадочной жидкости с культуры Р24 антигена). Клетки и надосадочные жидкости культуры тканей (среду) собирают и немедленно подвергают лизису в 1/10 объема 10% Тгйоп Х-100. Затем образцы инкубируют при 37°С в течение 1 ч и хранят при -80°С до момента тестирования на р24 антиген.
Конфокальная микроскопия.
Для определения проникновения Е1ТС-конъюгированных пептидов в клетки используют конфокальную лазерную сканирующую систему 2ейк Ь8М 410, соединенную с инвертированным микроскопом ТА 2ейк Ахюуей 135М, в котором использована техника лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Т клетки инкубируют с Е1ТС-конъюгированными пептидами, полученными из нативного казеина, в инкубаторе с атмосферой, содержащей 5% СО2 и 95% воздуха, при 37°С, после чего клетки трижды промывают забуферированным фосфатом солевым раствором (РВ8) для удаления не связанных
- 23 005579
НТС-пептидов. Клетки фиксируют 3,8% формалином в течение 10 мин, дважды промывают РВ8 и снова суспендируют в 50-100 мкл РВ8 перед наблюдением клеток под микроскопом. Выбранные изображения клеток для различных времен инкубирования (15 мин, 30 мин, 1 ч, 1,5 ч и 3 ч), которые демонстрируют различные количества НТС-пептидов, полученных из нативного казеина в их цитоплазме и ядрах, хранят на 3,5 дюймовых дискетах (230 МВ), и для получения изображений используют программное обеспечение Ρΐιοίοδίιορ.
Тест на включение [3Н]-тимидина.
Для того чтобы определить влияние пептидов, полученных из нативного казеина, на пролиферацию Т клеток несколько концентраций пептидов, полученных из нативного казеина, (исходная концентрация 10 мг/мл в ВРМ1) добавляют к 8ир-Т1 клеточным культурам в 96 микролуночном плоскодонном планшете (5000 клеток/лунка), как описано для ВИЧ-1 инфицирования в 8ир-Т1 клетки. Клетки подсчитывают и определяют их жизнеспособность с помощью исключения трипанового синего. Их импульсно метят [3Н]тимидином в определенные моменты времени (3, 7, 10 и 14 дней) в течение 18 ч (в течение ночи) и собирают на фильтры из стекловолокна для измерения радиоактивности (Включение [3Н]-тимидина в клеточную ДНК пропорционально степени клеточной пролиферации).
Токсичность пептидов, полученных из нативного казеина, для нормальных, миелоаблативных и мышей и морских свинок с трансплантатами.
Внутримышечными или внутривенными инъекциями нормальным животным вводят в одной дозе или в трех дозах, вплоть до 5000 мг пептидов, полученных из нативного казеина, на кг веса животного. Используют различные штаммы, включая мышей ВЛЬВ/е, С3Н/Не1 и не тучных диабетических (ΝΟΌ). Мышей наблюдали либо в течение 10 месяцев перед забоем и исследовали посмертно (анализ токсичности), либо наблюдали в течение 200 дней (степень выживания). Морским свинкам вводят однократно с помощью внутримышечной инъекции 20 мг пептидов каждому животному. Через 15 дней их забивают и исследуют на предмет патологических изменений.
Восстановление лейкоцитов и тромбоцитов у мышей с трансплантированным костным мозгом.
Мышей ВЛЬВ/е облучают сублетальной дозой из источника, расположенного на расстоянии 70 см от кожи, дозой 50 сГй в минуту, всего до 600 сГй. Облученных животных восстанавливают сингеничным костным мозгом, как указано выше, и внутривенно вводят спустя 24 ч 1 мг/животное пептидов, полученных из нативного казеина, синтетических пептидов, полученных из казеина (13-26 аминокислот, см. табл. 3 выше), или альбумин сыворотки человека (контроль), с последующим двойным слепым исследованием. Восстановление лейкоцитов определяют в соответствии с количеством клеток в периферической крови, отобранной в указанные временные интервалы от 6 до 12 дней после обработки. Восстановление тромбоцитов определяют по количеству клеток в крови отобранной из ретроорбитального сплетения, в гепаринизированные капилляры, в указанные временные интервалы с 6 по 15 день после обработки.
В дополнительной серии экспериментов СВА мышей облучали летальной дозой (900 сГй), восстанавливали и обрабатывали пептидами, полученными из нативного казеина, или альбумином сыворотки человека, как указано выше. Восстановление тромбоцитов определяют, как указано выше.
Восстановление мышей с трансплантатами костного мозга.
Мышей С57/В1/6 облучают летальными дозами из источника, расположенного на расстоянии 70 см от кожи, дозой 50 сГй в минуту, всего 900 сГй. Облученных мышей восстанавливают сингенным костным мозгом от мышей, которых либо обрабатывали за день до отбора костного мозга 1 мг/животное пептидов, полученных из нативного казеина, либо обрабатывали физиологическим раствором с последующим двойным слепым протоколом. В одном эксперименте за выживанием мышей следили 18 дней. В другом эксперименте мышей забивали через 10 дней и оценивали колонизацию селезенки.
Экспериментальные результаты
Пептиды, полученные из нативного казеина.
Исходя из наблюдения, что свернувшееся молоко часто тормозит рост бактерий, из молочного белка выделяют казеиновые фрагменты, обладающие бактерицидными свойствами (Ьпйеб §!а!е§ Ра1еп1 Νο. 3764670 ίο Ка1/1гка1е11а15ку. е! а1.).
Сырые пептиды, полученные в результате протеолиза нативного казеина, получают в результате кислотного осаждения растворимой фракции протеолитического гидролизата казеина, диализа и лиофилизации. При тестировании на биологическую активность после длительного хранения было отмечено, что такой сырой препарат после лиофилизации и хранения при 4°С сохраняет актвность (как ίη νίίτο, так и ίη νΐνο), по крайней мере, в течение 12 месяцев.
Для идентификации активных пептидов, содержащихся в пептидах, полученных из нативного казеина, лиофилизованный сырой препарат фракционируют, используя высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), как было указано выше. Все проанализированные лиофилизированные образцы продемонстрировали одинаковые профили времен удерживания, и содержание их соответствовало указанному выше.
Так, основным компонентом препарата сырых пептидов, пептидов, полученных из нативного казеина, является Ν-концевой фрагмент казеина α§1.
Пептиды, полученные из нативного казеина, не токсичны для грызунов и людей.
- 24 005579
Интенсивные исследования кратковременных и длительных эффектов высоких доз пептидов, полученных из нативного казеина, на мышей, морских свинок и людей-добровольцев подтвердили отсутствие токсичности, тератогенности или вредных побочных эффектов препарата. В одной серии тестов разовую дозу, представляющую 1750- и 12500-кратное превышение установленной эффективной дозы пептидов, полученных из нативного казеина, вводят внутримышечно облученным летальной дозой радиации мышам с сингеничными трансплантатами костного мозга. Стандартные посмертные исследования патологических изменений у данных мышей не выявили эффектов токсичности на внутренних органах или других аномалий. Аналогичные тесты на токсичность для морских свинок не выявили аномалий через две недели после введения разовой дозы 20 мг пептидов, полученных из нативного казеина, введенной внутримышечно. В другой серии экспериментов высокие дозы пептидов, полученных из нативного казеина, введенные здоровым мышам, не оказали влияния на ряд гематологических параметров, которые определяли спустя две недели, включая белые кровяные клетки (^ВС), красные кровяные клетки (ВВС), гемоглобин (НОВ), электролиты, глюкозу и другие. В третьей серии тестовых экспериментов повторяющиеся высокие дозы в 100 мг/кг веса, которые вводили мышам и крысам, в течение двух недель, не выявили аллергических, замедленных кожных или анафилактических реакций и никаких патологических эффектов при посмертных исследованиях. При тестировании пептидов, полученных из нативного казеина, в отношении их влияния на длительность выживания облученных, с восстановленным костным мозгом, мышей ВАЬВ/с и С3Н/НеЬ длительность выживания обработанных мышей (18 из 27 ВАЬВ/с и С3Н/НеЬ 66%) очевидно превышала длительность выживания обработанных альбумином контрольных животных (4 из 26 ВАЬВ/с и С3Н/Не1; 15%). Стандартные тесты на тератогенность [для подробностей см., например, Эгид 8аГе1у ίη Ргедпапсу, Ро1Ь апб Иакек, р. 336, Екеу1ег; Атйегбат, №^Уогк, 0хГогб (1990)] на мышах, обработанных пептидами, полученными из нативного казеина, не выявили влияния пептидов ни на какие параметры развития.
Аналогично отсутствию токсичности или побочных эффектов в тестах на грызунах, пептиды, полученные из нативного казеина, были также безопасны и при введении людям. Сравнение образцов крови и мочи у семи здоровых добровольцев до инъекции и через 7 дней после внутримышечной инъекции пептидов, полученных из нативного казеина, не выявило никаких изменений ни в каких клинических параметрах. Не наблюдалось также никаких негативных эффектов.
Таким образом, высокие дозы и длительная обработка грызунов пептидами, полученными из нативного казеина, не выявили видимых токсичных, патологичных, гиперчувствительных, тератогенных, серологических или каких-либо других негативных эффектов. Более того, введение пептидов, полученных из нативного казеина, облученным мышам с риском кратковременных и длительных осложнений, подтвердили заметное пролонгирование выживания в течение 200-300 дней. Все это и отсутствие какихлибо нежелательных эффектов в тестах на здоровых добровольцах, которым вводили инъекции пептидов, полученных из нативного казеина, четко продемонстрировало безопасность данных пептидов при парэнтеральном введении.
Восстановление костного мозга трансплантатами у мышей-реципиентов.
Когда мышей С57/В1/6 облучили летальными дозами радиации и восстанавливали сингенным костным мозгом от мышей, которых либо обрабатывали, либо не обрабатывали дозой 1 мг/животное пептидами, полученными из нативного казеина, за день до аспирации костного мозга, выживание облученных мышей, которым ввели костный мозг от обработанных мышей, значительно превосходило выживание облученных мышей, которым ввели костный мозг от необработанных мышей (выживание облученных мышей, которым ввели костный мозг от обработанных мышей, составило 15 из 18 через 10 дней после облучения; тогда как выживание облученных мышей, которым ввели костный мозг от необработанных мышей, составило 4 из 17 через 10 дней после облучения). Селезенки облученных мышей, которым ввели костный мозг от обработанных мышей, содержали от двух до трех раз больше колоний на селезенку, нежели содержали селезенки облученных мышей, которым ввели костный мозг от необработанных мышей (1-5 колоний по сравнению с 0-3 колониями).
Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют пролиферацию тромбоцитов.
Природные киллерные (ΝΚ) и цитотоксичные Т клетки являются критическими для способности иммунных систем защищать от вторжения как инфекционных патогенов, так и раковых клеток, как за счет активной цитотоксичности, так и за счет секреции иммунорегуляторых лимфокинов. Иммунный компромисс, такой как при СПИД или после химиотерапии, приводит к ненормальной, ослабленной активности Т или ΝΚ клеток. Если клетки нормального мышиного костного мозга от мышей ВАЬВ/с и С57В1/6 культивируют в присутствии 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, постоянно наблюдается более чем двукратное усиление лизиса клеток-мишеней (фиг. 1). Аналогичные эксперименты со стволовыми кровяными клетками человека от доноров, обработанных фактором стимулирования колоний гранулоцитов, продемонстрировали еще более значительную, зависящую от концентрации стимуляцию лизиса клеток-мишеней, даже под действием столь малого количества, как 10 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина (фиг. 2).
В другой серии экспериментов с РВ8С, полученными от здоровых людей-доноров, пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют увеличение количества ΝΚ и Т клеток, которое развивается
- 25 005579 после 10 (фиг. 3а) и 14 (фиг. 3Ь) дней в культуре, достигая трехкратного и более через 28 дней. Иммуностимулирующий эффект пептидов, полученных из нативного казеина, в отношении РВ8С клеток наиболее заметен у доноров с исходно низкими уровнями Т и ΝΚ клеток (фиг. 3а-Ь). Таким образом, пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют пролиферацию как Т-лимфоцитов, так и натуральных киллерных клеток из предшественников нормальных клеток мышиной и крови человека.
Пептиды, полученные из синтетического казеина, стимулируют пролиферацию человеческих лимфоцитов ίη νίίτο.
Если пептиды, полученные из синтетического казеина, представляющие первые 1-16 остатков /81 казеина, инкубируют с РВ8С клетками человека, полученными от здоровых и больных злокачественными опухолями (см. ниже), наблюдается значительное усиление активности ΝΚ клеток. Наиболее интенсивный лизис наблюдается (от 3- до 5-кратного превышения значений для контроля) в РВ8С культурах клеток от пациентов с неходжкинской лимфомой и раком молочной железы после двух дней инкубирования для столь малой концентрации, как 10 мкг/мл пептидов, содержащих первые 10 или более остатков казеина /81 (фиг. 4). В идентичных условиях ни один из тестированных пептидов не продемонстрировал значительного влияния на активность ΝΚ в РВ8С культурах от здоровых людей-доноров. Таким образом, даже низкие концентрации пептидов, содержащих первые 10 остатков Ν-концевой последовательности казеина /81, способны селективно стимулировать ίη νίίτο пролиферацию лимфоцитов в клетках, полученных от больных злокачественными опухолями.
Стимуляция кроветворения в предшественниках клеток человеческой крови.
Предшественники кровяных клеток дифференцируются в различные клетки крови: макрофаги, моноциты, гранулоциты, лимфоциты, эритроциты и мегакариоциты. Клетки предшественников находятся в изобилии в костном мозге, но также обнаружены в периферической крови после обработки гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (РВ8С клетки) и в свежей пуповинной крови. Если возрастающие концентрации (50-600 пг/мл) пептидов, полученных из нативного казеина, добавляют к культурам костного мозга, РВ8С и пуповинной крови человека, отмечается усиление клеточной пролиферации по данным, полученным с включением [3Н]-тимидина (фиг. 5а-5с). Пролиферация РВ8С человека наиболее сильно вызывается концентрацией 300 мкг/мл (фиг. 5а) после 15 дней культивирования. Еще более заметный эффект отмечается для клеток пуповинной крови (3-4-кратное усиление по данным включения [3Н]-тимидина) после 14 дней инкубирования (но не после 7 дней) с пептидами, полученными из нативного казеина, (600 мкг/мл, фиг. 5с). Культивируемые клетки костного мозга человека от трех из четырех доноров также сильно реагировали (3-5-кратное увеличение включения) на пептиды, полученные из нативного казеина (300 мкг/мл) после 21 дня инкубирования (фиг. 5Ь). Таким образом, пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют пролиферацию предшественников клеток крови из костного мозга человека, также как и из других источников. Интересно, что инкубирование культивируемых К562 (хронический миелолейкоз) клеточной линии и клеточной линии толстой кишки человека (рак толстой кишки) с высокими концентрациями (вплоть до 500 мкг/мл) пептидов, полученных из нативного казеина, в аналогичных условиях не оказывает влияния на включение [3Н]-тимидина. Таким образом, пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют пролиферацию предшественников кровяных клеток человека, но не рост раковых клеток.
Стимулирование мегакариоцитопоэза пептидами, полученными из казеина.
Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют пролиферацию предшественников мегакариоцитов в культивируемых клетках мышиного костного мозга.
Многоядерные мегакариоциты развиваются в костном мозге из примитивных стволовых клеток, созревают до гигантских клеток, и служат источником для тысяч тромбоцитов из одного мегакариоцита. Тромбоциты являются критическим моментом для образования сгустков крови, и тромбоцитопения является основной причиной миелоаблативных состояний (после химиотерапии и радиотерапии).
Первичные культуры клеток костного мозга можно индуцировать для образования колоний СЕИСМ (гранулоцитов и моноцитов) и колоний СЕИ-СЕММ (гранулоцитов, эритроидов, макрофагов и мегакариоцитов), содержащих дополнительные типы кровяных клеток. Количество колоний отражает экспансию специфических предшественников, число клеток отражает скорости пролиферации и дифференциальное число клеток отражает то, какие именно типы специфических клеток развиваются |Ра1епкт, И. е! а1. (1990), Мо1. Се1. Вю1. 10, 6046-50]. В культивируемых клетках мышиного костного мозга, инкубируемых с эритропоэтином и ЕЬ-3, добавление пептидов, полученных из нативного казеина, в количестве 25 мкг/мл в течение 8 дней увеличивает количество СЕИ-СЕММ в два с половиной раза по сравнению с контролями, стимулируя трехкратное увеличение относительного числа клеток на колонию в СЕИСЕММ. В аналогичных сериях экспериментов добавление пептидов, полученных из нативного казеина, к клеткам костного мозга, инкубируемым с эритропоэтином и кондиционированной средой (см. раздел Материалы и методы), стимулирует зависящее от концентрации увеличение процента ранних и поздних мегакариоцитов (15% мегакариоцитов без пептидов, до 50% при 500 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина). Так, восьмидневная обработка пептидами, полученными из нативного казеина, сти
- 26 005579 мулирует значительное увеличение образования и развития мегакариоцитов в первичных культурах мышиного костного мозга.
Синтетические пептиды, полученные из казеина, стимулируют пролиферацию предшественников мегакариоцитов в культивируемых клетках мышиного костного мозга.
Аналогично указанному выше и в аналогичных условиях экспериментов, показано, что пептиды, полученные из синтетического казеина, представляющие первые 10 и 11 аминокислот казеина α81, оказывают сильное (более десятикратного) стимулирующее действие на СЕИ-СЕММ пролиферацию в клетках мышиного костного мозга после 8 дней инкубирования. Несколько меньшая, но все-таки заметная стимуляция наблюдается при использовании пептидов, полученных из синтетического казеина, представляющих первые 12-26 аминокислот α81.
Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют мегакарицитопоэз в культивируемых клетках костного мозга человека.
Если 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, добавляют в аналогичных условиях к культурам клеток костного мозга человека от здоровых доноров, образование СЕИ-СМ колоний усиливается с добавлением или без добавления стимулирующих факторов (СМ-С8Е, СМ). Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют также образование колоний эритроидных клеток в присутствии эритропоэтина. Обработка клеток костного мозга человека тромбопоэтином (ТРО) стимулирует образование колоний мегакариоцитов (МК). Добавление 300 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, к клеткам, обработанным ТРО, стимулирует усиление более двукратного (16 колоний на 2 χ 105 клеток без пептидов, и 35 колоний на 2 χ 105 с пептидами, полученными из нативного казеина) пролиферации МК колоний.
В присутствии дополнительных кроветворных факторов, таких как эритропоэтин, 1Ь-3, Н8СЕ и АВ сыворотки человека, 14 дней инкубирования с пептидами, полученными из нативного казеина, стимулируют почти трехкратное увеличение СЕЫ-СЕММ колоний из клеток костного мозга человека (158 колоний с добавлением 500 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, 68 колоний с одними только факторами), но оказывает меньшее действие (полуторакратное увеличение) на образование СЕИ-СЕММ в культивируемых клетках пуповинной крови.
Относительные количества клеток в культивируемых колониях костного мозга и пуповинной крови отражают пролиферацию мегакариоцитных клеток, как реакцию на добавление 25 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина (см. табл. на фиг. 6). Так, инкубирование культивируемых первичных клеток костного мозга и пуповинной крови человека с пептидами, полученными из нативного казеина, стимулирует развитие и пролиферацию как мегакариоцитных, так и эритроидных колоний клеток.
Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют гематопоэз ΐπ у1уо после облучения и трансплантации костного мозга.
Миелоаблативная терапия может привести к угрожающему жизни уменьшению количества тромбоцитов и лейкоцитов, что может произойти, несмотря на введение кровяных клеток и факторов роста. Нижеследующее демонстрирует действие пептидов, полученных из нативного казеина, после облучения и трансплантации костного мозга.
Пептиды, полученные из нативного казеина, усиливают восстановление лейкоцитов и тромбоцитов после трансплантации сингеничного костного мозга у мышей.
После облучения сублетальной дозой (600 сГй), с минимально восстановленным костным мозгом, мышам ВАЬВ/с (п=60) внутривенной инъекцией вводят по 1 мг/мышь пептидов, полученных из нативного казеина, одним днем позже трансплантации костного мозга. Отмечается значительное увеличение количества периферических белых кровяных клеток в течение 7-14 дней по сравнению с контрольными мышами, которым вводили альбумин человеческой сыворотки (фиг. 7). Количество тромбоцитов в периферической крови как у обработанных, так и у контрольных облученных мышей, у мышей с трансплантированным костным мозгом было одинаково понижено вплоть до 8 дней после обработки. Однако к девятому дню отчетливое преимущество отмечалось для мышей, которым были введены пептиды, полученные из нативного казеина, а к 13 дню выявилось двукратное увеличение тромбоцитов по сравнению с контрольными мышами, которым вводили альбумин человеческой сыворотки (фиг. 8). Таким образом, пептиды, полученные из нативного казеина, усиливают восстановление тромбоцитов и лейкоцитов после трансплантации с ограниченным числом клеток костного мозга. Можно ожидать, что этот эффект будет еще сильнее выражен в плане восстановления при оптимальном, а не ограниченном числе клеток костного мозга.
Синтетические пептиды, полученные из казеина, усиливают восстановление лейкоцитов после трансплантации мышам сингеничного костного мозга.
После облучения сублетальной дозой (600 сГй) с минимально восстановленным костным мозгом мышам ВАЕВ/с (п=5 для синтетического пептида, п=10 для контрольной группы) с помощью внутрибрюшинной инъекции вводят 1 мг/мышь синтетических пептидов (13-26 аминокислот в длину, см. табл.
3), полученных из казеина, одним днем позже трансплантации костного мозга. Отмечается значительное увеличение количества периферических лейкоцитов в течение от 10 до 14 дней для пептидов из 15 ами
- 27 005579 нокислот (10 день: 17,2 х 106 кл/мл; 12 день: 65,4 х 106 кл/мл) и из 17 аминокислот (10 день: 27,4 х 106 кл/мл; 12 день: 52,0 х 106 кл/мл) (см. табл. 3), по сравнению с контрольными мышами, которым вводили альбумин человеческой сыворотки (10 день: 16,7 х 106 кл/мл; 12 день: 46,4 х 106 кл/мл). Таким образом, синтетические пептиды, полученные из казеина, усиливают восстановление лейкоцитов после трансплантации с ограниченным количеством клеток костного мозга.
Пептиды, полученные из нативного казеина, ингибируют ίη νίίΓΟ инфицирование линий Тлимфоцитов вирусом ВИЧ-1.
Проникновение пептидов, полученных из нативного казеина, в Т-лимфоциты.
Для исследования механизмов иммунной стимуляции и противовирусного действия пептидов, полученных из нативного казеина, восприимчивые 8ир-Т1 и СЕМ культивируемые Т-клетки человека обрабатывают пептидами, полученными из нативного казеина, перед ίη νίΐτο инфицированием ВИЧ-1 вирусом. С помощью флуоресцентной микроскопии было выявлено, что НТС-конъюгированные пептиды, полученные из нативного казеина (100 мкг/мл), проникают в 8ир-Т1 клетки при инкубировании вместе с ними как указано выше (фиг. 9а-£). Небольшие количества меток наблюдаются в цитоплазме клеток через 15 мин (фиг. 9а-Ь). Через 30 мин (фиг. 9с-й) еще больше меток наблюдается в цитоплазме при ограниченном захвате ядер. Начиная с 1 ч после начала инкубирования и далее (фиг. 9е-£), НТС-меченые пептиды, полученные из нативного казеина, наблюдаются в цитоплазме, но большинство их сконцентрировано в ядрах клеток. Анализ 8ир-Т1 клеток с помощью цитометрии в потоке подтвердил усиление захвата меченых пептидов, полученных из нативного казеина, начиная с 5 мин после начала инкубирования.
Пептиды, полученные из нативного казеина, усиливают пролиферацию лимфоцитов.
Присутствие пептидов, полученных из нативного казеина, в культуральной среде приводит к увеличению количества 8ир-Т1 клеток в течение 14 дней. Наибольшее увеличение количества клеток к 7 дню наблюдается для 50 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина (42%), для 1000 мкг на десятый день (30%) и для 600 мкг (32%) на 14 день инкубирования. Измерение включения [3Н]-тимидина культивируемыми клетками, что дает показатель пролиферации, отражает увеличение количества клеток, причем наиболее сильный эффект наблюдается для 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, на 10 день (фиг. 10). Снижение пролиферации на 14 день, вероятно, отражает избыточный рост клеток и израсходование питательных веществ.
Синтетические пептиды, полученные из казеина, усиливают пролиферацию лимфоцитов человека.
Присутствие синтетических пептидов, полученных из казеина (все пептиды перечислены в табл. 3), в культуральной среде приводит к увеличению количества 8ир-Т1 клеток в течение 10 дней. Увеличение аналогично для всех синтетических пептидов. Наибольшее увеличение количества клеток в инфицированных клетках наблюдается для 250 мкг/мл пептидов (8 аминокислот - 80%). При 500 мкг/мл пептидов (9 аминокислот - 33%).
Пептиды, полученные из нативного казеина, ингибируют инфицирование ВИЧ-1 клеток лимфоцитов человека.
Восприимчивые СЕМ лимфоцитные клетки, предварительно обработанные пептидами, полученными из нативного казеина, (50-1000 мкг/мл) за 24 или 48 ч до инкубирования с ВИЧ-1 или подвергнутые взаимодействию с Н1У-1, предварительно обработанным в течение 3 ч пептидами нативного казеина, демонстрируют усиленную клеточную пролиферацию и пониженные уровни вирусной инфекции по сравнению с необработанными контрольными. Количества клеток и анализ ВИЧ-1 Р24 антигена на 15 день после инфицирования выявили 100% ингибирование вирусной инфекции после 3 ч инкубирования с 600-1000 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, и 98% и 99% ингибирования после 24 ч инкубирования с 50 и 600 мкг/мл пептидов соответственно. Более длительное время ингибирования не оказалось более эффективным (фиг. 11). Хотя увеличение концентрации пептидов, полученных из нативного казеина, усиливает клеточную пролиферацию через 3 и 24 ч после инфицирования, вирусная инфекция наиболее заметно ингибируется в таких наиболее быстро растущих культурах. Еще более заметное усиление клеточной пролиферации и ингибирование ВИЧ-1 инфекции наблюдается в 8ир-Т1 клетках, предварительно обработанных пептидами, полученными из нативного казеина, перед инфицированием ВИЧ-1 (среднее ингибирование вирусной инфекции составляет 96,7%, 88,7% и 95,7% после 3 ч предварительной обработки вируса, 24 и 48 ч предварительной обработки соответственно). Таким образом, пептиды, полученные из нативного казеина, проникают в культивируемые клетки лимфоцитов человека и в их ядра, усиливают рост клеток и значительно снижают восприимчивость ί.Ό4 клеток к ВИЧ-1 инфекции. Ожидается, что пептиды, полученные из нативного казеина, как таковые могут быть полезны как для профилактики ВИЧ инфекции, так и для лечения после инфицирования ВИЧ-инфицированных и СПИД пациентов.
Пептиды, полученные из нативного казеина, предотвращают развитие глюкозурии у диабетических без ожирения (ΝΘΌ) мышей.
У диабетических без ожирения (ΝΘΌ) мышей спонтанно развивается диабет типа I (ΙΌΌΜ), аутоиммунное состояние, вызывающее воспаление β клеток поджелудочной железы и заканчивающееся бо
- 28 005579 лезнью и смертью. Самки ΝΟΌ мышей крайне восприимчивы, демонстрируя доказательство инвазии макрофагов кусочка ткани поджелудочной железы уже у 5 недельных мышей. Инъекции по 100 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, один или два раза в неделю в течение 5 недель (всего 5 или 10 инъекций) оказались полностью эффективны для профилактики глюкозурии, связанной с началом и течением заболевания. К 200 дню 100% необработанных контрольных мышей (п=5) стали диабетическими, и затем погибли, тогда как обработанные мыши (п=5) остались на 100% эугликемическими и все еще были живы на 230 день (фиг. 12). Таким образом, пептиды, полученные из нативного казеина, эффективно защитили генетически восприимчивых мышей от возникновения данного аутоиммунного воспалительного состояния.
Клинические исследования пептидов, полученных из нативного казеина.
Пациентам внутримышечными инъекциями вводили по 50 мг пептидов, полученных из нативного казеина, каждому, одной или тремя порциями, как указано.
Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют гематопоэз у больных злокачественными опухолями.
Гематологические профили шести больных злокачественными опухолями, которые получили или которые были в процессе получения химиотерапии, исследовали до и после введения пептидов, полученных из нативного казеина, как указано. Особое внимание обращали на изменения значений для тромбоцитов (РЬТ), лейкоцитов (АВС), эритроцитов (ВВС) и гемоглобина (НОВ), характеризующих тромбоцитопоэз, лейкоцитопоэз и эритроцитопоэз соответственно.
О.Т. (Пациентка-женщина, Пациент I). У пациентки был рак яичников, она подверглась гистерэктомии с последующей химиотерапией. Она получила две внутримышечные инъекции пептидов, полученных из нативного казеина, через два и через два с половиной месяца после операции. Между первым и вторым введением пептидов, полученных из нативного казеина, не проводили никакой химиотерапии. Тесты крови, взятые на 6 день после первой инъекции, на 7 и 13 день после второй инъекции, продемонстрировали значительное увеличение содержания тромбоцитов и АВС компонентов, также как и повышение ВВС (фиг. 13).
Е.С. (Пациентка-женщина, Пациент 2). Пациентка подверглась радикальной мастэктомии по поводу лобулярной карциномы в 1983 г. и шесть лет спустя страдала от метастазов в желудке. За три дня до начала химиотерапии она получила одну внутримышечную инъекцию пептидов, полученных из нативного казеина, и вторую через 10 дней после химиотерапии. Хотя показатели крови, взятой на 10 и 16 день после химиотерапии, не показали ослабления подавленного гематологического профиля, что обычно наблюдается после химиотерапии, наиболее значительные эффекты пептидов, полученных из нативного казеина были отмечены через 3 дня после первой инъекции до начала химиотерапии (фиг. 13).
Е.8. (Пациентка-женщина, Пациент 3). Пациентка страдала широко распространенными метастазами карциномы молочной железы, впервые обнаруженной в 1987 г. Два года спустя она получила первую внутримышечную инъекцию пептидов, полученных из нативного казеина, и вторую - через 23 дня. На протяжении этого промежутка времени она не получала дополнительного лечения. Тесты крови показали сильное увеличение РЬТ через семь дней после первой инъекции и значительное увеличение ВВС и АВС через семь дней после второй инъекции (фиг. 13).
ТВ. (Пациентка-женщина, Пациент 4). У пациентки диагноз рак молочной железы с костными метастазами. Она получила одну внутримышечную инъекцию пептидов, полученных из нативного казеина, за 8 дней до начала химиотерапии, и другую - через 14 дней после химиотерапии. Наиболее заметный эффект четко виден по быстрому возвращению АВС уровней после вызванного химиотерапией снижения (фиг. 13).
И.М. (Пациентка-женщина, Пациент 5). У пациентки рак печени, сопровождающийся широко распространенными метастазами. Она получила три внутримышечные инъекции пептидов, полученных из нативного казеина, на 10, 8 и 6 дни до начала химиотерапии. Вторую серию инъекций провели на 10, 12 и 14 дни после химиотерапии. Хотя значительный эффект воздействия на гематологический профиль отмечен после первой серии инъекций и до начала химиотерапии, наиболее резкое улучшение проявляется в быстром возвращении пониженных после химиотерапии значений к нормальным количествам клеток после второй серии инъекций пептидов, полученных из нативного казеина (фиг. 13).
Таким образом, введение пептидов, полученных из нативного казеина, больным злокачественными опухолями приводит к улучшению гематологических профилей, особенно к усилению эритропоэза, лейкоцитопоэза и тромбоцитопоэза, и способно уменьшить и сократить длительность вызванного химиотерапией подавления компонентов крови.
Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют тромбоцитопоэз у реципиентов трансплантатов с устойчивой тромбоцитопенией.
Пролонгированная, невосприимчивая к внутривенным вливаниям тромбоцитопения с эпизодами тяжелого кровотечения, может быть угрожающим жизни осложнением при трансплантации костного мозга, особенно если традиционная терапия оказывается не эффективной.
Двум пациентам с тяжелой резистентной тромбоцитопенией вводят пептиды, полученные из нативного казеина.
- 29 005579
М-1 (пациентка-женщина). 32-летняя пациентка, страдающая острым миелолейкозом в полной ремиссии, после трансплантации аутологичных стволовых клеток. У нее были два угрожающие жизни эпизода кровотечения, включающие легочное кровотечение и обширную обструктивную гематому мягкого неба. Более чем на 114 день после трансфузии количество тромбоцитов было рефрактивно К гЫЬ-3, гЫЬ6, внутривенному гаммаглобулину и рекомбинантному эритропоэтину. После двух внутримышечных введений 50 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, разделенной на три порции, ее состояние немедленно улучшилось. Наряду с быстрым возвращением к нормальному количеству тромбоцитов (фиг. 14), прошли кровотечения и петехии нижних конечностей, она смогла начать ходить и вернуться домой заграницу без осложнений или побочных эффектов.
М-2 (Пациент-мужчина). 30-летний пациент, страдающий острым миелолейкозом, на стадии второй полной ремиссии после внутривенной трансплантации аутологичных стволовых клеток, демонстрирующий полностью резистентное количество тромбоцитов и обширные эпизоды желудочно-кишечного кровотечения. Ему требовались ежедневные внутривенные вливания порций клеток, у него была развита гипоальбуминемия, и ему не помогло интенсивное лечение гЫЬ-3, гЫЬ-6 и гаммаглобулином. После двух внутримышечных введений по 50 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, введенной тремя порциями, через 86 дней после вливания наблюдается быстрое восстановление тромбоцитов (фиг. 15) и постепенное прекращение кровотечений. Не потребовалось никакого дальнейшего лечения, и пациент в настоящее время полностью асимптоматичен, причем количество тромбоцитов соответствует норме.
Таким образом, один курс двух внутримышечных введений пептидов, полученных из нативного казеина, в количестве 0,7-1,0 мг/кг веса тела, разделенного на три порции, оказывается эффективным для быстрого восстановления количества тромбоцитов и ослабления сопутствующих клинических симптомов у пациентов с пролонгированной, невосприимчивой к переливаниям тромбоцитопенией с угрожающими жизни эпизодами кровотечениями.
Пептиды, полученные из нативного казеина, снижают содержание триглицеридов и БОБхолестерина при наследственной гиперлипидемии.
М.8. (Женщина-пациентка). Пациентка женщина 38 лет с наследственной историей гиперлипидемии. До обработки пептидами, полученными из нативного казеина, химический анализ крови выявил повышенный уровень холестерина (321 мк/дл), триглицеридов (213 мк/дл при норме 45-185 мк/дл) и повышенный уровень БЭБ-холестерина (236,4 мк/дл при норме 75-174 мк/дл). Через месяц после однократного введения 50 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, в виде трех внутримышечных инъекций, гиперлипидемия стабилизировалась: полное содержание холестерина снизилось до 270 мк/дл, триглицеридов до 165 мк/дл и уровень БЭБ-холестерина составил 201 мк/дл, что было все еще выше нормальных значений, но ниже значений, которые были до введения пептидов. Не проводилось никакого дополнительного лечения. Таким образом, обработка пептидами, полученными из нативного казеина, оказывается эффективной для быстрого приведения почти к норме пациентов с гиперлипидемией, которая не поддается другому лечению.
Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют нормоглобинемию в случае скрытого кровотечения.
Э.С. (Пациент-мужчина). Пациент мужчина 75 лет страдает анемией и гипоглобинемией (подавленные КВС, НОВ, НСТ, МСН и МСНС), связанными с интенсивным внутренним кровотечением. Через месяц после двух внутримышечных введений 50 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, тремя порциями наблюдается значительное уменьшение анемии. Через два месяца КВС достигает нормальных значений (4,32 вместо 3,44 М/мкл), НОВ увеличивается (11,3 вместо 8,9 г/дл) и НСТ, МСН и МСНС все восстанавливаются почти до нормальных значений, несмотря на продолжение внутренних кровотечений. Таким образом, одна серия инъекций пептидов, полученных из нативного казеина, способна стимулировать эритропоэз и улучшение состояния у пациентов при анемии, связанной с внутренними кровотечениями.
Очевидно, что некоторые особенности настоящего изобретения, которые для ясности раскрыты в контексте отдельных вариантов, могут быть осуществлены в комбинации в одном варианте. Напротив, различные особенности настоящего изобретения, которые для краткости раскрыты в контексте одного варианта, можно осуществить по отдельности или в любых подходящих подкомбинациях.
Хотя настоящее изобретение было раскрыто в связи с его конкретными примерами, очевидно, что специалисту в данной области будут очевидны множество его альтернатив и вариантов. Соответственно, следует подчеркнуть, что все такие альтернативы, модификации и варианты соответствуют сути и входят в объем прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты, патентные заявки и последовательности, определенные регистрационными номерами, упомянутые в настоящем описании, включены в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте, как если бы каждая отдельная публикация, патент, патентная заявка или последовательность были конкретно и индивидуально включены в данное описание в качестве ссылки. Кроме того, цитирование или обозначение любой ссылки в данном описании не следует толковать как допущение того, что такая ссылка отвечает требованию известный уровень техники для данного изобретения.

Claims (74)

1. Способ профилактики или лечения аутоиммунного заболевания, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
2. Способ профилактики или лечения вирусного заболевания, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
3. Способ профилактики вирусной инфекции, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Νконцевой части казеина /81.
4. Способ индуцирования кроветворения, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина /81.
5. Способ индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
6. Способ индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
7. Способ индуцирования мегакариоцитопоэза, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Νконцевой части казеина /81.
8. Способ индуцирования эритропоэза, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
9. Способ индуцирования лейкоцитопоэза, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина /81.
10. Способ индуцирования тромбоцитопоэза, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Νконцевой части казеина /81.
11. Способ профилактики или лечения тромбоцитопении, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
12. Способ профилактики или лечения панцитопении, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Νконцевой части казеина /81.
13. Способ профилактики или лечения гранулоцитопении, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
14. Способ профилактики или лечения гиперлипидемии, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
15. Способ профилактики или лечения холестеринемии, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
16. Способ профилактики или лечения глюкозурии, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Νконцевой части казеина /81.
17. Способ профилактики или лечения диабета, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Νконцевой части казеина /81.
18. Способ профилактики или лечения СПИД, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Νконцевой части казеина /81.
19. Способ профилактики или лечения ВИЧ инфекции, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
20. Способ профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиорадиотерапии, поддерживаемой трансплантацией аутологичного костного мозга или периферических ство
- 31 005579 ловых кроветворных клеток (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81.
21. Способ по любому из пп.1-20, где указанный пептид является фрагментом, полученным в результате фрагментации казеина α81.
22. Способ по любому из пп.1-20, где указанный пептид является синтетическим пептидом.
23. Способ по любому из пп.1-22, где последовательность указанного пептида соответствует одной из представленных далее 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 1-19.
24. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
25. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения вирусного заболевания, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
26. Фармацевтическая композиция для профилактики вирусной инфекции, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента полученный из казеина пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
27. Фармацевтическая композиция для индуцирования кроветворения, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
28. Фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
29. Фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента полученный из казеина пептид, приведенный в любой из 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
30. Фармацевтическая композиция для индуцирования мегакариоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
31. Фармацевтическая композиция для индуцирования эритропоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
32. Фармацевтическая композиция для индуцирования лейкоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
33. Фармацевтическая композиция для индуцирования тромбоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
34. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения тромбоцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
35. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения панцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
36. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения гранулоцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
- 32 005579
37. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения гиперлипидемии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕР ΙΌ NΟ: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
38. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения холестеринемии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕР ΙΌ NΟ: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
39. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения глюкозурии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8 Ер ΙΌ NΟ: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
40. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения диабета, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕР ΙΌ NΟ: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
41. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения СПИД, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕР ΙΌ NΟ: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
42. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения ВИЧ-инфекции, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕР ΙΌ NΟ: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
43. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиорадиотерапии, поддержанными трансплантацией аутологичного костного мозга или периферических кроветворных стволовых клеток (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из 8ЕР ΙΌ NΟ: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
44. Фармацевтическая композиция по любому из пп.24-43, где указанный пептид является фрагментом, полученным в результате фрагментации казеина α81.
45. Фармацевтическая композиция по любому из пп.24-43, где указанный пептид является синтетическим пептидом.
46. Фармацевтическая композиция по любому из пп.24-45, где последовательность указанного пептида соответствует одной из представленных далее 8ЕР ΙΌ NΟ 1-19.
47. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81, для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания.
48. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81, для профилактики или лечения вирусного заболевания.
49. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81, для профилактики вирусной инфекции.
50. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81, для индуцирования кроветворения.
51. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81, для индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток.
52. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81, для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток.
53. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81, для индуцирования мегакариоцитопоэза.
54. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81, для индуцирования эритропоэза.
55. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81, для индуцирования лейкоцитопоэза.
56. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81, для индуцирования тромбоцитопоэза.
57. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81, для профилактики или лечения тромбоцитопении.
58. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина α81, для профилактики или лечения панцитопении.
- 33 005579
59. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина /81, для профилактики или лечения гранулоцитопении.
60. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина /81, для профилактики или лечения гиперлипидемии.
61. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина /81, для профилактики или лечения холестеринемии.
62. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина /81, для профилактики или лечения глюкозурии.
63. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина /81, для профилактики или лечения диабета.
64. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина /81, для профилактики или лечения СПИД.
65. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина /81, для профилактики или лечения инфекции, вызванной ВИЧ.
66. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина /81, для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиорадиотерапии, поддержанными трансплантацией аутологичного костного мозга, или трансплантацией периферических кроветворных стволовых клеток (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ).
67. Применение по любому из пп.47-66, где указанный пептид является фрагментом, полученным в результате фрагментации казеина /81.
68. Применение по любому из пп.47-66, где указанный пептид является синтетическим пептидом.
69. Применение по любому из пп.47-68, где последовательность указанного пептида является одной из представленных далее 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1-19.
70. Очищенный пептид, последовательность аминокислот которого выбрана из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1-19.
71. Фармацевтическая композиция, включающая очищенный пептид, последовательность аминокислот которого выбрана из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
72. Способ усиления колонизации донорных стволовых кроветворных клеток у миелоаблативного реципиента, причем способ включает обработку донора указанных донорных стволовых кроветворных клеток пептидом, полученным из Ν-концевой части казеина α81, перед отбором и имплантацией донорных стволовых кроветворных клеток реципиенту.
73. Способ усиления колонизации донорных стволовых кроветворных клеток у миелоаблативного реципиента, причем способ включает обработку указанных донорных стволовых кроветворных клеток пептидом, полученным из Ν-концевой части казеина α81, перед имплантацией донорных стволовых кроветворных клеток реципиенту.
74. Способ усиления колонизации стволовых кроветворных клеток у миелоаблативного реципиента, причем способ включает обработку указанных стволовых кроветворных клеток пептидом, полученным из Ν-концевой части казеина α81, перед имплантацией стволовых кроветворных клеток реципиенту.
EA200200820A 2000-03-01 2001-03-01 Пептиды, полученные из казеина, и их применение в терапии EA005579B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL13483000A IL134830A0 (en) 2000-03-01 2000-03-01 Peptides and immunostimulatory and anti-bacterial pharmaceutical compositions containing them
PCT/IL2001/000198 WO2001064234A1 (en) 2000-03-01 2001-03-01 Casein derived peptides and uses thereof in therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200200820A1 EA200200820A1 (ru) 2003-08-28
EA005579B1 true EA005579B1 (ru) 2005-04-28

Family

ID=11073892

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200200820A EA005579B1 (ru) 2000-03-01 2001-03-01 Пептиды, полученные из казеина, и их применение в терапии
EA200401467A EA007217B1 (ru) 2000-03-01 2001-03-01 Пептиды, полученные из казеина, и их применение в терапии
EA200400376A EA007814B1 (ru) 2000-03-01 2002-08-29 Пептиды, полученные из казеина, и их использование в терапии

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200401467A EA007217B1 (ru) 2000-03-01 2001-03-01 Пептиды, полученные из казеина, и их применение в терапии
EA200400376A EA007814B1 (ru) 2000-03-01 2002-08-29 Пептиды, полученные из казеина, и их использование в терапии

Country Status (21)

Country Link
US (6) US20020147144A1 (ru)
EP (1) EP1261360B1 (ru)
JP (1) JP2003528827A (ru)
KR (1) KR20030025907A (ru)
CN (1) CN1427725A (ru)
AT (1) ATE451929T1 (ru)
AU (1) AU782662B2 (ru)
BR (1) BR0109027A (ru)
CA (1) CA2401550A1 (ru)
CZ (1) CZ20022915A3 (ru)
DE (1) DE60140794D1 (ru)
DK (1) DK1261360T3 (ru)
EA (3) EA005579B1 (ru)
HU (1) HUP0301003A3 (ru)
IL (2) IL134830A0 (ru)
MX (1) MXPA02008569A (ru)
NO (1) NO20024157L (ru)
NZ (1) NZ521016A (ru)
PL (1) PL361307A1 (ru)
WO (1) WO2001064234A1 (ru)
ZA (1) ZA200206842B (ru)

Families Citing this family (142)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL375113A1 (en) * 2001-08-30 2005-11-28 Chay 13 Medical Research Group N.V. Casein derived peptides and uses thereof in therapy
US20030179916A1 (en) * 2002-02-06 2003-09-25 Magnuson Terry R. High-throughput cell identification and isolation method and apparatus
EP1359157A1 (en) * 2002-04-29 2003-11-05 Société des Produits Nestlé S.A. Metallo-proteinase inhibitory agent
NZ574520A (en) * 2002-11-27 2011-02-25 Dmi Biosciences Inc Use of casein which is at least 10% dephosphorylated for the treatment of diseases and conditions mediated by increased phosphorylation
GB0313892D0 (en) * 2003-06-16 2003-07-23 Hannah Res Inst Control of lactation
EP1751179A4 (en) * 2004-03-01 2009-03-25 Peptera Pharmaceuticals Ltd PEPTIDES DERIVED FROM THE CASEIN AND THEIR THERAPEUTIC USES
AU2005235111B2 (en) 2004-03-30 2010-10-28 Monsanto Technology Llc Methods for controlling plant pathogens using N-phosphonomethylglycine
WO2005099724A2 (en) * 2004-04-13 2005-10-27 Parallel Solutions, Inc. Functionalized water-soluble polyphosphazene and uses thereof as modifiers of biological agents
US9000040B2 (en) 2004-09-28 2015-04-07 Atrium Medical Corporation Cross-linked fatty acid-based biomaterials
EP1811935B1 (en) 2004-09-28 2016-03-30 Atrium Medical Corporation Heat cured gel and method of making
US9012506B2 (en) 2004-09-28 2015-04-21 Atrium Medical Corporation Cross-linked fatty acid-based biomaterials
GB0423352D0 (en) * 2004-10-21 2004-11-24 Hannah Res Inst "Control of mammary cell number"
EP1890720B1 (en) * 2005-05-02 2013-01-09 Mileutis Ltd. Pharmaceutical compositions comprising casein derived peptides and methods of use thereof
ES2319475B1 (es) * 2005-06-08 2010-02-16 Consejo Superior Investig. Cientificas Peptidos bioactivos identificados en hidrolizados enzimaticos de caseinas lacteas y procedimiento de obtencion.
US11266607B2 (en) * 2005-08-15 2022-03-08 AbbVie Pharmaceuticals GmbH Process for the manufacture and use of pancreatin micropellet cores
US9427423B2 (en) 2009-03-10 2016-08-30 Atrium Medical Corporation Fatty-acid based particles
US9278161B2 (en) 2005-09-28 2016-03-08 Atrium Medical Corporation Tissue-separating fatty acid adhesion barrier
HUE031989T2 (en) 2005-10-04 2017-08-28 Soligenix Inc New peptides for the treatment and prevention of immune-related disorders, including treatment and prevention of infection by modulation of natural immunity
US20070086958A1 (en) * 2005-10-14 2007-04-19 Medafor, Incorporated Formation of medically useful gels comprising microporous particles and methods of use
GB2436328A (en) * 2006-03-22 2007-09-26 Regen Therapeutics Plc Peptide derived from colostrinin
EP1836906B1 (en) * 2006-03-24 2009-07-01 Unilever N.V. Healthy food product
AU2007229603A1 (en) * 2006-03-24 2007-10-04 Unilever Plc Healthy food product
BRPI0717500A2 (pt) * 2006-10-04 2014-03-25 Inimex Pharmaceuticals Inc Peptídeos para o tratamento e a prevenção de desordens relacionadas à imunidade, incluindo tratamento e prevenção de infecção por modulação da imunidade inata.
AU2008212127B2 (en) * 2007-02-05 2013-03-28 National University Of Singapore Putative cytokinin receptor and methods for use thereof
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
KR101624754B1 (ko) * 2008-03-12 2016-05-26 가부시키가이샤 시세이도 부전각화 억제제, 모공 축소제 또는 피부 거칠음 방지·개선제 및 이를 배합한 피부 외용 조성물
CA2750462C (en) * 2009-02-06 2014-08-19 The Procter & Gamble Company Collapsible water-containing capsules
JP2012523433A (ja) * 2009-04-10 2012-10-04 アブラクシス バイオサイエンス， エルエルシー ナノ粒子処方物およびその使用
WO2010129545A2 (en) 2009-05-04 2010-11-11 Psivida Us, Inc. Porous silicon drug-eluting particles
US10555527B2 (en) * 2009-05-18 2020-02-11 Monsanto Technology Llc Use of glyphosate for disease suppression and yield enhancement in soybean
GB0912481D0 (en) 2009-07-17 2009-08-26 Reckitt Benckiser Healthcare I Skincare compositions
US20110038910A1 (en) 2009-08-11 2011-02-17 Atrium Medical Corporation Anti-infective antimicrobial-containing biomaterials
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
BR112012015653B1 (pt) * 2009-12-29 2023-09-26 W.R. Grace & Co. -Conn. Composição que compreende um material de sílica particulado poroso e película transparente que compreende a mesma
CN102781404B (zh) * 2010-02-04 2014-08-27 Isp投资公司 用于无水遮光剂配制物的自适应聚合物
EP2536266A2 (en) * 2010-02-18 2012-12-26 Athenix Corp. Axmi218, axmi219, axmi220, axmi226, axmi227, axmi228, axmi229, axmi230, and axmi231 delta-endotoxin genes and methods for their use
WO2011103248A2 (en) 2010-02-18 2011-08-25 Athenix Corp. AXMI221z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z, AND AXMI225z DELTA-ENDOTOXIN GENES AND METHODS FOR THEIR USE
MX2012010479A (es) 2010-03-08 2012-10-09 Monsanto Technology Llc Moleculas polinucleotidicas para regulacion genetica en plantas.
FR2958155B1 (fr) * 2010-04-02 2012-04-20 Oreal Composition de decoloration comprenant un sel peroxygene dans une base fortement riche en corps gras
WO2011137563A1 (en) * 2010-05-07 2011-11-10 Unilever Plc High solvent content emulsions
KR101941297B1 (ko) 2010-06-04 2019-01-22 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 유전자 이식 브라씨카의 사건 mon 88302 및 이것의 사용방법
EP2593141B1 (en) 2010-07-16 2018-07-04 Atrium Medical Corporation Composition and methods for altering the rate of hydrolysis of cured oil-based materials
CN103201388A (zh) * 2010-08-19 2013-07-10 先锋国际良种公司 对鳞翅目昆虫具有活性的新苏云金杆菌基因
US9757374B2 (en) 2010-10-28 2017-09-12 Aequus Pharmaceuticals Inc. Aripiprazole compositions and methods for its transdermal delivery
WO2012058091A2 (en) * 2010-10-28 2012-05-03 Alpha To Omega Pharmaceutical Consultants, Inc. Aripiprazole compositions and methods for its transdermal delivery
CN104622790A (zh) 2010-11-01 2015-05-20 普西维达公司 用于递送治疗剂的可生物侵蚀的硅基装置
CA2836911A1 (en) * 2011-06-04 2012-12-13 Ian S. CURTIS Potato transformation compositions, systems, methods, microorganisms, and plants
EP2742059A1 (en) * 2011-08-12 2014-06-18 Bayer CropScience NV Guard cell-specific expression of transgenes in cotton
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
EP2755466A4 (en) 2011-09-13 2015-04-15 Monsanto Technology Llc METHODS AND COMPOSITIONS FOR CONTROLLING WEEDS
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
EP3296402B1 (en) 2011-09-13 2020-04-15 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
CA2848680C (en) 2011-09-13 2020-05-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
EP2755988B1 (en) 2011-09-13 2018-08-22 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
US9826763B2 (en) * 2011-10-05 2017-11-28 Fmc Corporation Stabilizer composition of microcrystalline cellulose and carboxymethylcellulose, method for making, and uses
US9492363B1 (en) * 2012-01-16 2016-11-15 American Spraytech, L.L.C. Aerosol sprayable color composition
US20130195956A1 (en) * 2012-01-27 2013-08-01 Agile Therapeutics, Inc. Transdermal Hormone Delivery
FR2988566B1 (fr) * 2012-03-28 2014-08-08 Yoplait France Compositions alimentaires pour stimuler la formation de tissu osseux
US10240161B2 (en) 2012-05-24 2019-03-26 A.B. Seeds Ltd. Compositions and methods for silencing gene expression
CN104736177A (zh) * 2012-08-03 2015-06-24 Msm创新有限公司 用于肠道准备的方法和试剂盒
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
KR102090851B1 (ko) 2012-08-14 2020-03-19 10엑스 제노믹스, 인크. 마이크로캡슐 조성물 및 방법
US9567631B2 (en) 2012-12-14 2017-02-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10400280B2 (en) 2012-08-14 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9617297B2 (en) * 2012-10-11 2017-04-11 The Regents Of The University Of California Apoplast wash fluid recovery for improved recombinant endoglucanase extraction in tabacco leaves
CA2888264A1 (en) 2012-10-18 2014-04-24 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9206436B2 (en) * 2012-12-20 2015-12-08 Ut-Battelle, Llc Key gene regulating cell wall biosynthesis and recalcitrance in Populus, gene Y
MX2015008611A (es) 2013-01-01 2016-02-03 Seeds Ltd Ab Metodos para introducir dsrna en semillas de plantas para modular la expresion genetica.
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
CN108753766A (zh) 2013-02-08 2018-11-06 10X基因组学有限公司 多核苷酸条形码生成
US8961680B2 (en) * 2013-03-08 2015-02-24 Tbf Environmental Technology Inc. Solvent formulations
WO2014165108A1 (en) * 2013-03-12 2014-10-09 Psivida Us, Inc. Bioerodible silicon-based delivery vehicles for delivery of therapeutic agents
EP2967082A4 (en) 2013-03-13 2016-11-02 Monsanto Technology Llc METHOD AND COMPOSITIONS FOR WEED CONTROL
BR112015023051A2 (pt) 2013-03-13 2017-11-14 Monsanto Technology Llc método para controle de ervas daninhas, composição herbicida, cassete de expressão microbiano e método de produção de polinucleotídeo
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
US8889633B2 (en) 2013-03-15 2014-11-18 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional compositions containing a peptide component with anti-inflammatory properties and uses thereof
US9345727B2 (en) 2013-03-15 2016-05-24 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional compositions containing a peptide component and uses thereof
US9138455B2 (en) 2013-03-15 2015-09-22 Mead Johnson Nutrition Company Activating adiponectin by casein hydrolysate
WO2014151381A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Psivida Us, Inc. Bioerodible silicon-based compositions for delivery of therapeutic agents
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9352020B2 (en) 2013-03-15 2016-05-31 Mead Johnson Nutrition Company Reducing proinflammatory response
US9345741B2 (en) 2013-03-15 2016-05-24 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional composition containing a peptide component with adiponectin simulating properties and uses thereof
EP2968099B1 (en) * 2013-03-15 2020-05-06 Maria Beug-Deeb Inc. DBA T&M Associates Methods and compositions for cleaning and disinfecting surfaces
US9289461B2 (en) * 2013-03-15 2016-03-22 Mead Johnson Nutrition Company Reducing the risk of autoimmune disease
CA2817728A1 (en) * 2013-05-31 2014-11-30 Pharmascience Inc. Abuse deterrent immediate release formulation
JP6668236B2 (ja) 2013-07-19 2020-03-18 モンサント テクノロジー エルエルシー Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ防除用組成物及びその方法
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
PT3421033T (pt) * 2013-10-07 2022-09-23 Bristol Myers Squibb Holdings Ireland Formulação de atazanavir e cobicistat para tratamento de vih
MX2016005778A (es) 2013-11-04 2016-12-20 Monsanto Technology Llc Composiciones y metodos para controlar infestaciones de plagas y parasitos de los artropodos.
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
AR099092A1 (es) 2014-01-15 2016-06-29 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para el control de malezas utilizando polinucleótidos epsps
ES2544153B1 (es) * 2014-02-24 2016-06-06 Ntd Labs, S.L. Uso de un hidrolizado de caseína como agente antiviral
EP3125676A4 (en) 2014-04-01 2018-02-14 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for controlling insect pests
CN106413896B (zh) 2014-04-10 2019-07-05 10X基因组学有限公司 用于封装和分割试剂的流体装置、系统和方法及其应用
CA2953347A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference
US11807857B2 (en) 2014-06-25 2023-11-07 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
EP3889325A1 (en) 2014-06-26 2021-10-06 10X Genomics, Inc. Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations
JP6640826B2 (ja) 2014-07-08 2020-02-05 ミメディクス グループ インコーポレイテッド 微粒子化ワルトン膠質
US20160022604A1 (en) * 2014-07-23 2016-01-28 Cadila Healthcare Limited Directly compressed ospemifene compositions
CN114009454A (zh) 2014-07-29 2022-02-08 孟山都技术公司 用于控制昆虫害虫的组合物和方法
DK3191083T3 (da) * 2014-09-11 2021-04-19 Gelita Ag Gelatine-/pektinpartikler
BR112017005505B1 (pt) * 2014-09-17 2022-09-06 Arxada, LLC Composição de peróxido de hidrogênio de solução desinfetante pronta para uso
MX2017005267A (es) 2014-10-29 2017-07-26 10X Genomics Inc Metodos y composiciones para la secuenciacion de acidos nucleicos seleccionados como diana.
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
EP3243517A4 (en) * 2015-01-06 2018-08-29 Yamada, Osamu Medicinal composition, blood treatment device, cosmetic, food and drink using combustion synthesis material
AU2016207023B2 (en) 2015-01-12 2019-12-05 10X Genomics, Inc. Processes and systems for preparing nucleic acid sequencing libraries and libraries prepared using same
CN108064288B (zh) 2015-01-22 2021-11-26 孟山都技术公司 用于控制叶甲属的组合物和方法
WO2016137973A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 10X Genomics Inc Partition processing methods and systems
EP3262188B1 (en) 2015-02-24 2021-05-05 10X Genomics, Inc. Methods for targeted nucleic acid sequence coverage
EP3262233A1 (en) 2015-02-25 2018-01-03 The Procter and Gamble Company Fibrous structures comprising a surface softening composition
US20160303043A1 (en) * 2015-04-16 2016-10-20 Kate Somerville Skincare, LLC Self-foaming compositions and methods
EP3302053B1 (en) 2015-06-02 2021-03-17 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
US10655136B2 (en) 2015-06-03 2020-05-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants
EP3623527A1 (en) 2015-07-10 2020-03-18 The Procter & Gamble Company Fabric care composition comprising metathesized unsaturated polyol esters
JP6954899B2 (ja) 2015-12-04 2021-10-27 １０エックス ゲノミクス，インコーポレイテッド 核酸の解析のための方法及び組成物
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
CN109328056A (zh) 2016-07-08 2019-02-12 吉列有限责任公司 用于毛发移除装置的包含复分解不饱和多元醇酯的液体组合物
DE102016223333A1 (de) * 2016-11-24 2018-05-24 Henkel Ag & Co. Kgaa Alkalische Mittel zum Aufhellen von Haaren enthaltend Oxidationsmittel und spezielle Carbonsäureester als Keratinvernetzer
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2018140966A1 (en) 2017-01-30 2018-08-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
MA47686A (fr) * 2017-03-01 2021-05-12 Arena Pharm Inc Compositions comprenant des agonistes du récepteur pgi2 et procédés de préparation associés
US10398670B2 (en) * 2017-04-24 2019-09-03 Knoze Jr. Corporation Oral microbiota promotion for oral and/or sinus infections
US20180340169A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
CN109526228B (zh) 2017-05-26 2022-11-25 10X基因组学有限公司 转座酶可接近性染色质的单细胞分析
US10471033B2 (en) * 2017-09-15 2019-11-12 Knoze Jr. Corporation Oral microbiota promotion for immune system associated inflammations
SG11201913654QA (en) 2017-11-15 2020-01-30 10X Genomics Inc Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
EP3775271A1 (en) 2018-04-06 2021-02-17 10X Genomics, Inc. Systems and methods for quality control in single cell processing
BR112022004757A2 (pt) * 2019-09-16 2022-06-21 Kiverdi Inc Composições de hidrolizado de proteína microbiana e métodos para fazer as mesmas

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3764670A (en) * 1970-10-28 1973-10-09 Ministry Of Agriculture Polypeptidic anti-biotic substances derived from casein
US3778426A (en) * 1970-12-16 1973-12-11 Research Corp Therapeutically useful polypeptides
US4636384A (en) * 1982-06-03 1987-01-13 Stolle Research & Development Corporation Method for treating disorders of the vascular and pulmonary systems
US4959455A (en) * 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US5344820A (en) * 1987-05-15 1994-09-06 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Infection protectant
JP2631470B2 (ja) * 1987-05-15 1997-07-16 雪印乳業株式会社 感染防御剤
JP2805490B2 (ja) * 1989-02-07 1998-09-30 雪印乳業株式会社 細菌毒素中和剤
US5514646A (en) * 1989-02-09 1996-05-07 Chance; Ronald E. Insulin analogs modified at position 29 of the B chain
FR2686085B1 (fr) * 1992-01-10 1995-08-04 Agronomique Inst Nat Rech Peptides representant des fragments du cmp, anticorps diriges contre lesdits peptides, et leurs utilisations.
GB9310472D0 (en) * 1993-05-20 1993-07-07 Univ Warwick Phenylalanine-free protein and dna coding thereof
TW282398B (ru) * 1993-12-22 1996-08-01 Bristol Myers Squibb Co
US5506209A (en) * 1994-05-26 1996-04-09 Abbott Laboratories Product for inhibition of infection of mammalian cells by respiratory syncytial virus
US5538952A (en) * 1994-05-26 1996-07-23 Abbott Laboratories Inhibition of infection of mammalian cells by respiratory syncytial virus
US5707968A (en) * 1994-05-26 1998-01-13 Abbott Laboratories Inhibition of attachment of H.influenzae to human cells
US5712250A (en) * 1994-09-16 1998-01-27 Abbott Laboratories Product for inhibition of human rotavirus infection
KR0140248B1 (ko) * 1995-03-23 1998-06-15 한상기 신규한 카제인 포스포펩티드, 그것을 포함하는 카제인 및 그 제조방법
US5985275A (en) * 1995-04-12 1999-11-16 New York Blood Center β-Lactoglobulin modified with aromatic anhydride compound for preventing HIV infection
US6570060B2 (en) * 1995-05-16 2003-05-27 Mclachlan Corran Norman Stuart Milk lacking β-casein A1
KR100221124B1 (ko) * 1996-09-23 1999-10-01 한상기 신규한 카제인 및 그 제조방법
US5830434A (en) * 1997-02-26 1998-11-03 Medical University Of South Carolina Foundation For Research Development Methods of treating non-insulin dependent diabetes mellitus with pancreatic polypeptide
AU729978B2 (en) * 1997-03-21 2001-02-22 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Iron-partial hydrolyzates of casein complexes and processes for preparation thereof
US6358508B1 (en) * 1997-06-11 2002-03-19 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human tumor necrosis factor receptor TR9
CA2301499C (en) * 1997-08-29 2010-01-26 Brigham And Women's Hospital, Inc. T-cell membrane protein (tirc7), peptides and antibodies derived therefrom and uses thereof
AUPP051497A0 (en) * 1997-11-24 1997-12-18 University Of Melbourne, The Antimicrobial peptides
US5985575A (en) * 1998-05-20 1999-11-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Tethered function assay for protein function
US6570606B1 (en) * 1998-05-29 2003-05-27 3Com Corporation Method and apparatus for controlling transmission of media signals over a data network in response to triggering events at participating stations
WO2000029008A2 (en) * 1998-11-16 2000-05-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Hiv-specific t-cell induction
GB9927603D0 (en) * 1999-11-22 2000-01-19 Nestle Sa Use of a milk protein hydrolysate in the treatment of diabetes
IL138946A0 (en) * 2000-10-11 2001-11-25 Compugen Ltd Method for the identification of peptides and proteins
WO2007036044A1 (en) * 2005-09-28 2007-04-05 Dnp Canada Inc. Combination of polychitosamine and fibrate for the prevention and treatment of hyperlipidemia
US8865876B2 (en) * 2008-06-02 2014-10-21 California Institute Of Technology Engineered lectin oligomers with antiviral activity

Also Published As

Publication number Publication date
US8735348B2 (en) 2014-05-27
NZ521016A (en) 2005-08-26
US20070161557A1 (en) 2007-07-12
EA007217B1 (ru) 2006-08-25
AU3596201A (en) 2001-09-12
NO20024157L (no) 2002-10-30
IL151351A (en) 2012-04-30
WO2001064234A1 (en) 2001-09-07
EA200200820A1 (ru) 2003-08-28
JP2003528827A (ja) 2003-09-30
PL361307A1 (en) 2004-10-04
US20130096073A1 (en) 2013-04-18
CN1427725A (zh) 2003-07-02
HUP0301003A3 (en) 2007-08-28
IL134830A0 (en) 2001-05-20
US7741274B2 (en) 2010-06-22
HUP0301003A2 (hu) 2003-07-28
EP1261360A4 (en) 2004-03-10
CZ20022915A3 (cs) 2003-03-12
AU782662B2 (en) 2005-08-18
ZA200206842B (en) 2003-07-28
ATE451929T1 (de) 2010-01-15
EA200400376A1 (ru) 2005-06-30
US20100298216A1 (en) 2010-11-25
NO20024157D0 (no) 2002-08-30
MXPA02008569A (es) 2003-02-24
DK1261360T3 (da) 2010-05-03
KR20030025907A (ko) 2003-03-29
US20090192081A1 (en) 2009-07-30
DE60140794D1 (de) 2010-01-28
EA200401467A1 (ru) 2005-04-28
BR0109027A (pt) 2003-06-03
EP1261360A1 (en) 2002-12-04
EP1261360B1 (en) 2009-12-16
US20100317601A1 (en) 2010-12-16
CA2401550A1 (en) 2001-09-07
EA007814B1 (ru) 2007-02-27
US20020147144A1 (en) 2002-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA005579B1 (ru) Пептиды, полученные из казеина, и их применение в терапии
KR20070007128A (ko) 카제인 파생 펩타이드들과 그의 치료적 사용들
CA2266859C (en) Colostrinin, and uses thereof
EP0584558A2 (en) A composition for suppressing infection and growth of human immunodeficiency virus using an iron-binding protein
US7666996B2 (en) Casein derived peptides and uses thereof
WO2003018606A2 (en) Casein derived peptides and uses thereof in therapy
RU2198178C2 (ru) Пептид-иммунорегулятор (варианты), лекарственное средство, включающее пептид-иммунорегулятор
JPH0474197A (ja) 新規な免疫調整生理活性ペプチド
JP2004508412A (ja) 抗新生物薬および免疫刺激薬としてのチオニン
JP3677054B2 (ja) ヒトｔ細胞白血病ウィルス感染・増殖抑制剤

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU