EA007217B1 - Пептиды, полученные из казеина, и их применение в терапии - Google Patents

Пептиды, полученные из казеина, и их применение в терапии Download PDF

Info

Publication number
EA007217B1
EA007217B1 EA200401467A EA200401467A EA007217B1 EA 007217 B1 EA007217 B1 EA 007217B1 EA 200401467 A EA200401467 A EA 200401467A EA 200401467 A EA200401467 A EA 200401467A EA 007217 B1 EA007217 B1 EA 007217B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
casein
cells
peptides
derived
peptide
Prior art date
Application number
EA200401467A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200401467A1 (ru
Inventor
Зви Сидельман
Original Assignee
Чей 13 Медикал Рисерч Груп Н.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Чей 13 Медикал Рисерч Груп Н.В. filed Critical Чей 13 Медикал Рисерч Груп Н.В.
Publication of EA200401467A1 publication Critical patent/EA200401467A1/ru
Publication of EA007217B1 publication Critical patent/EA007217B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4732—Casein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к применению пептидного препарата казеицидина, полученного из природного казеина, для производства лекарственного препарата для индукции гемопоэза, способствования трансплантации аутологичного костного мозга или стволовых клеток костного мозга (ASCT) или трансплантации аллогенного костного мозга (ВМТ) миелоаблативному реципиенту и профилактики или лечения нарушений липидного метаболизма, диабета и вирусной инфекции.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к биологически активным пептидам, последовательности которых получены из 8ЕО Ν-конца αδ1 фракции молочного казеина, или идентичны данным последовательностям. Данные пептиды способны стимулировать и усиливать иммунную реакцию, защищать от вирусной инфекции, нормализовать уровни холестерина в сыворотке и стимулировать кроветворение. Полученные из казеина пептиды не токсичны, и их можно использовать для лечения и для профилактики иммунных патологий, гиперхолестеринэмии, гематологических нарушений и связанных с вирусами заболеваний.
Предпосылки изобретения
Биоактивные соединения из продуктов питания.
В дополнении к питательной ценности многих пищевых продуктов, некоторые их составляющие и продукты, образующиеся в пищеварительном тракте, обладают способностью влиять на физиологические процессы. Некоторые из таких обладающих дополнительной питательной ценностью (ехйатЦпЦопаГ) составляющих присутствуют в своей активной форме в цельном продукте питания, такие как иммуноглобулины в материнском молоке и молозиве, фитоэстрогены, обнаруженные в продуктах питания на основе сои, полифенольные антиоксиданты из фруктов и витамины. Другие же зашифрованы в молекулах питательных веществ, и выделяются в активной форме в процессе переваривания или в процессе приготовления пищи, например, противогипертензивные пептиды из лактоглобина [Κίίίδ, Ό.Ό. (1999), Сап. 1. РЬуяоЕ Рйагтаео1. 72:4; 423-434].
Биологическая активность молочных белков.
Казеин, основной молочный белок, традиционно определяли как состоящий из трех фракций α, β и γ, в соответствии с их электрофоретической подвижностью [Ν.1. Ηίρρ, с1 а1. (1952), Папу 8еЕ, 35:272]. В настоящее время их определяют в соответствии с последовательностями аминокислот каждой из подгрупп αδ1, αδ2, β и κ [ν.Ν. Епде1 е1 а1. (1984), 1. Папу δει. 67: 1599].
В процессе переваривания казеиновые белки подвергаются протеолитическому расщеплению под действием кислотных протеаз, таких как химозин (реннин), трипсин и пепсин, в результате чего образуются более короткие пептиды и вызывается свертывание и секвестрация кальция полученными белковыми фрагментами. Немногочисленные исследования соединений молока продемонстрировали связанную с казеином бактерицидную активность. В патенте США № 3764670 раскрыты протеолитические казеиновые гидролизаты, обладающие свойствами антибиотиков против микроорганизмов. В патенте Израиля № 42863 раскрыт полученный из казеина пептид, состоящий из 23 аминокислот Ν-конца казеина, обладающий противобактериальной активностью. Кроме того, другие физиологически активные свойства, такие как активности, подобные активностям опиоидов и факторов роста, были предположены для казеина или его производных [ΚίίΙδ, Ώ.Ώ., (1999), ΐ№ά.].
Для пептидов казеина также наблюдалась иммуномодулирующая активность. СоЧе е1 а1. (1992, 1ттип. Бей. 33: 41-46), наблюдали усиление пролиферации лимфоцитов у крыс после обработки их пептидом, полученным из С-конца β-казеина. Однако ни в одном из этих исследований не были определены специфические последовательности пептидов казеина, которые придают им их свойства дополнительной питательной ценности.
Кроветворение при терапии злокачественных опухолей.
После высоких доз химиотерапии, особенно после миелоаблативных доз химиорадиотерапии, поддержанной трансплантацией аутологичного костного мозга или периферических стволовых кроветворных клеток (А8СТ) или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), у пациентов возникает серьезный риск панцитопении. Гранулоцитопения может привести к развитию серьезных, иногда фатальных инфекционных осложнений, вызываемых обычными бактериальными, вирусными, грибковыми и паразитическими агентами непосредственно после момента трансплантации. Аналогичным образом, тромбоцитопения часто приводит к проявлению тенденции к кровотечениям и иногда к длительной тромбоцитной зависимости. Если развивается невосприимчивость к тромбоцитам, эпизоды кровотечений могут угрожать жизни, и осложнения при кровотечениях часто оказываются летальными. Риск, связанный с гранулоцитопенией, можно частично уменьшить поддерживающими средствами, и наиболее эффективно путем введения рекомбинантных цитокинов человека, которые могут усилить восстановление гранулоцитов, особенно гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (О-С8Р) и гранулоцитарномакрофагального колониестимулирующего фактора (ОМ-С8Р). Данные агенты чрезвычайно дороги (их стоимость примерно 200-400 долларов США/в день/для пациента) и иногда они вызывают побочные эффекты, связанные с гипертоническими реакциями, лихорадкой, болями в костях и иногда сопровождаются синдромами повышенной сосудистой проницаемости, включая перикардиты и плевриты. Некоторые из этих побочных эффектов могут быть связаны с другими цитокинами, которые могут естественным образом высвобождаться под действием этих кроветворных факторов роста. Более того, применение таких кроветворных факторов роста может быть противопоказано пациентам с опухолевыми клетками, содержащими О-С8Р или ОМ-С8Р рецепторы, в таких случаях, как острая и хроническая миелолейкоз и при миелодиспластических синдромах. Тогда как основной прогресс в лечении пациентов с риском пан
- 1 007217 цитопении был достигнут за счет использования кроветворных цитокинов, прогресса в лечении тромбоцитопении не было достигнуто. После высоких доз химиотерапии и особенно после ЛЭСТ. у пациентов возникает риск возникновения тромбоцитопении. которая может длиться в течение многих месяцев. даже вплоть до 3 лет. а некоторые пациенты с тромбоцитопенией могут никогда не выздороветь. Организмы многих пациентов. которых раньше лечили множеством препаратов на основе крови. становятся невосприимчивыми к тромбоцитам. и. следовательно. может оказаться невозможным преодолеть тромбоцитопению. даже на короткое время. несмотря на интенсивные и частые трансфузии тромбоцитов от одного донора. Невосприимчивость к тромбоцитам и длительная тромбоцитопения представляют собой распространенную причину смерти в центрах Л8СТ во всем мире.
В настоящее время проводятся исследования нескольких новых рекомбинантных цитокинов. таких как рекомбинантный интерлейкин-3 человека (тЫЬ3) и рекомбинантный интерлейкин-6 человека (тЫЬб). как потенциальных агентов для усиления мегакариоцитопоэза и восстановления тромбоцитов. К сожалению. предварительные клинические исследования показали. что хотя тЫЬ3 и тЫЬб могут усилить восстановление тромбоцитов. такие эффекты ни коим образом не являются эффектными. и могут потребовать значительного времени.
Очевидно. что длительная тромбоцитопения в настоящее время представляет основную проблему в клинических центрах трансплантации костного мозга. для которой до сих пор не найдено удовлетворительного решения.
Поэтому существует широко известная необходимость в создании безопасного. дешевого. быстродействующего и четко определенного стимулятора кроветворения. и особенно мегакариоцитопоэза. который был бы лишен вышеуказанных ограничений. и который было бы весьма выгодно иметь.
Фракция казеина αδ1.
Фракцию казеина αδ1 можно получить из молочных белков различными способами [Ό.Ο. 8ο1ιιηίά11ι апб Т. А. 1. Раупек (1963). ВюсЫт.. Вюрйук. Ас1а. 78:492; М.Р. Тйотркоп апб С.А. К1ббу (1964). 1. Папу δει.. 47:626; 1.С. Метает. е! а1. (1968). Ви11. 8ос. СЫт. ΒίοΙ. 50:521]. и полная аминокислотная последовательность фракции казеина αδ1 была определена 1.С. Метает е! а1. (1971) (Еиг. 1. Вюсйет. 23:41). Геномная и кодирующая последовательности αδ1 фракции казеина жвачных были также клонированы и секвенированы с применением технологий рекомбинантных ДНК [Ό. Косхап. е! а1. (1991). М.1с1. Аабк Кек. 19(20): 5591; МсКшдй!. К.А.. е! а1. (1989). 1. Папу δα. 72:2464-73]. Протеолитическое расщепление и идентификация Ν-концевых фрагментов αδ1 фракции казеина были опубликованы [1.С. Метает. е! а1. (1970). Еиг. 1. Вюсйет. 16:439; Р.Ь.Н. Мсδ\νееηеу е! а1. (1993). 1. Палу Кек.. 60:401]. также как и абсорбция в кишечнике и появление данного фрагмента в плазме млекопитающих после расщепления белков цельного молока [Иа!. А.М.. е! а1. (1998) ВюсЫт1е. 80 (2): 2155-65]. Ме1ке1. Н. апб Воске1тапп. [(1999). Ап!оше Уап Ьееитепйоек. 76:207-15] обнаружили аминокислотные последовательности иммунопептидов. казокининов и казоморфинов в пептидах. высвобожденных в результате гидролиза α- и βказеиновых фракций молочнокислыми бактериями. Особый интерес представляют антиаггрегационная и тромболитическая активности. демонстрируемые С-концевыми участками α- и κ-казеиновых фракций [СйаЬапсе. В. е! а1. (1997). Вюсйет. Мо1. Вю1. 1п!. 42(1) 77-84; Саеп 1. е! а1. (1993). 1. Папу δα. 76(1): 301310]. Предшествующие исследования задокументировали потенциальные биоактивные пептиды. закодированные в Ν-концевой αδ1 аминокислотной последовательности. но не было никаких упоминаний о применении данных белковых фрагментов. конкретных последовательностей или определенных синтетических пептидов для усиления кроветворения. профилактики вирусных инфекций или модулирования развития аутоиммунных заболеваний.
Сущность изобретения
В соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения аутоиммунного заболевания. причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида. полученного из Ν-концевой части казеина αδ1.
Далее. в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения вирусного заболевания. причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида. полученного из Ν-концевой части казеина αδ1.
Далее. в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики вирусной инфекции. причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида. полученного из Ν-концевой части казеина αδ1.
Далее. в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования кроветворения. причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида. полученного из Ν-концевой части.
Далее. в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток. причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида. полученного из Ν-концевой части казеина αδ1.
- 2 007217
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν’концевой части казеина «81.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования мегакариоцитопоэза, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования эритропоэза, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования лейкоцитопоэза, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования тромбоцитопоэза, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения тромбоцитопении, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения панцитопении, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения гранулоцитопении, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения гиперлипидемии, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения холестеринемии, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения глюкозурии, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения диабета, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения СПИД, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения инфекции, вызванной ВИЧ, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиорадиотерапии, поддерживаемой трансплантацией аутологичного костного мозга или периферических стволовых кроветворных клеток (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения вирусного заболевания, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики вирусной инфекции, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качест
- 3 007217 ве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования кроветворения, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Νконцевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования мегакариоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования эритропоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования лейкоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования тромбоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения тромбоцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения панцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения гранулоцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения гиперлипидемии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения холестеринемии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения глюкозурии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения диабета, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения СПИД, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве
- 4 007217 активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения инфекции, вызванной ВИЧ, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81. и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиорадиотерапии, поддержанными трансплантацией аутологичного костного мозга или периферических стволовых кроветворных клеток - (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Νконцевой части казеина α81. и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления колонизации донорных стволовых кроветворных клеток у миелоаблативного реципиента, причем способ включает лечение донора указанных донорных стволовых кроветворных клеток пептидом, полученным из Ν-концевой части казеина α81. перед передачей и имплантацией донорных стволовых кроветворных клеток реципиенту.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления колонизации донорных стволовых кроветворных клеток у миелоаблативного реципиента, причем способ включает обработку указанных донорных стволовых кроветворных клеток пептидом, полученным из Ν-концевой части казеина α81. перед имплантацией донорных стволовых кроветворных клеток реципиенту.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения вирусного заболевания.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики вирусной инфекции.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для индуцирования кроветворения.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для индуцирования мегакариоцитопоэза.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для индуцирования эритропоэза.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для индуцирования лейкоцитопоэза.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для индуцирования тромбоцитопоэза.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения тромбоцитопении.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения панцитопении.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения гранулоцитопении.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения гиперлипидемии.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения холестеринемии.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения глюкозурии.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения диабета.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения СПИД.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения инфекции, вызванной ВИЧ.
- 5 007217
Далее, в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиорадиотерапии, поддержанными трансплантацией аутологичного костного мозга или трансплантацией периферических стволовых кроветворных клеток (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ).
В соответствии с дальнейшими особенностями предпочтительных вариантов настоящего изобретения, раскрытых ниже, указанный пептид является фрагментом, полученным в результате фрагментации α81 казеина.
В соответствии с дальнейшими особенностями раскрытых предпочтительных вариантов настоящего изобретения указанный пептид является синтетическим пептидом.
В соответствии с дальнейшими особенностями раскрытых далее предпочтительных вариантов настоящего изобретения последовательность указанного пептида является одной из представленных далее 8Е0 ΙΌ N0:1-19.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением предложен очищенный пептид, последовательность аминокислот которого выбрана из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0:1-19.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция, включающая очищенный пептид, последовательность аминокислот которого выбрана из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение успешно преодолевает недостатки известных в настоящее время конфигураций тем, что предлагает пептиды для лечения заболеваний человека, причем эти пептиды получены из Ν-концевой части казеина α81 и, обладая высокой терапевтической эффективностью, не обладают определяемой токсичностью.
Краткое описание чертежей
Далее настоящее изобретение раскрыто только на основании примеров со ссылкой на прилагаемые чертежи. Специально указывается со ссылкой на чертежи, что примеры приведены только для иллюстрации обсуждений предпочтительных вариантов настоящего изобретения и представляют собой то, что можно считать наиболее полезным и легко понятным описанием принципов и концептуальных аспектов настоящего изобретения. В этой связи не предпринимаются попытки продемонстрировать детали настоящего изобретения более подробно, нежели это необходимо для фундаментального понимания изобретения, причем описание вместе с чертежами разъясняет специалистам, как некоторые варианты изобретения можно осуществить на практике. На приведенных чертежах фиг. 1а-Ь представляют стимуляцию активности натуральных киллерных (ΝΚ) клеток в культивируемых клетках мышиного костного мозга пептидами, полученными из нативного казеина. Лизис 358меченых УАС клеток-мишеней культивируемыми клетками мышиного костного мозга, инкубируемыми в присутствии (+) или в отсутствии (-) 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, выражен как доля полной радиоактивности, выделенной из УАС клеток в надосадочную жидкость культуры (% выделенного 358). Фиг. 1а представляет ΝΚ активность при отношении эффекторные клетки/клеткимишени 25:1. Фиг. 1Ь представляет ΝΚ активность при отношении эффекторные клетки/клетки-мишени 50:1.
Фиг. 2 представляет стимуляцию активности натуральных киллерных (ΝΚ) клеток в культивируемых стволовых клетках периферической крови (РВ8С) человека пептидами, полученными из нативного казеина. Лизис 358-меченых К562 клеток-мишеней культивируемыми РВ8С клетками человека от доноров, обработанных фактором, стимулирующим колонии гранулоцитов (0-С8Е), инкубируемыми в отсутствии (0 мкг) или в присутствии повышающихся концентраций (25-500 мкг/мл) пептидов, полученных из нативного казеина, выражен как доля полной радиоактивности, выделенной из К562 клеток в надосадочную жидкость культуры (% выделения 358). Квадратиками представлено отношения эффекторные клетки/клетки-мишени 100:1, треугольниками представлено отношения эффекторные клетки/клетки-мишени 50:1.
Фиг. 3а-3Ь представляют стимуляцию пролиферации натуральных киллерных (ΝΚ) и Тлимфоцитных (Т) клеток из культивируемых стволовых клеток периферической крови (РВ8С) человека пептидами, полученными из нативного казеина. Пролиферация ΝΚ и Т клеток в культивируемых РВ8С человека от доноров, обработанных фактором, стимулирующим колонии гранулоцитов, инкубируемых с пептидами, полученными из нативного казеина, или без них, выражена как процент (%) клеток, связывающих анти-СО3/Е1ТС флуоресцентные анти-Т клеточные антитела ИСНТ!, или анти-СО56/КРЕ флуоресцентные анти-ΝΚ клеточные антитела МОС-1 (ΌΑΚ0 А/8 Эспшагк). Контролями служат Е1ТС и КРЕ-конъюгированные анти-мышиный 1§С антитела. Фиг. 3 а представляет процент культивируемых человеческих РВ8С, связывающих флуоресцентные антитела СО56 (2 независимых образца) после 10 дней инкубирования с (СО56 + пептиды) или без (СО56) 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина. Фиг. 3Ь представляет процент культивируемых РВ8С клеток человека, связывающих флуоресцентные анти-СЭ3 (Т клетки) антитела, анти-СО56 (ΝΚ клетки) антитела и клетки, связывающие как СЭ3,
- 6 007217 так и ΟΌ56 (Т и ΝΚ-подобные клетки) антитела после 28 дней инкубирования с (+28) или без (-28) 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина.
Фиг. 4 представляет стимуляцию активности натуральных киллерных (ΝΚ) клеток в культивируемых стволовых клетках периферической крови (РВ8С) человека пептидами, полученными из синтетического казеина. Лизис 358-меченых К562 клеток-мишеней культивируемыми РВ8С клетками (от пациента с раком молочной железы), инкубируемыми в отсутствии (0 мкг) или в присутствии повышающихся концентраций (10-500 мкг/мл) синтетических пептидов, полученных из казеина, выражен как доля полной радиоактивности, выделенной из К562 клеток в надосадочную жидкость культуры (% выделенния 358). Пептиды представляют Ν-концевые последовательности из 1-8 (8), 1-12 (12), 1-22 (1), 1-24 (Ь), 1-25 (М) и 1-26 (Ν) первых аминокислот Ν-концевой части α81 казеина (см. табл. 3 далее для последовательности синтетических пептидов).
Фиг. 5а-с представляют стимуляцию пролиферации культивируемых клеток человека различного происхождения пептидами, полученными из нативного казеина. Пролиферацию культивируемых клеток человека после 14-21 дня инкубирования с возрастающими концентрациями пептидов, полученных из нативного казеина, выражают как количество [3Н]-тимидина, включенного в каждый образец. Фиг. 5а представляет включение метки в два образца (РВ8С 1, 15 дней инкубирования; и РВ8С 2, 20 дней инкубирования) стволовых клеток периферической крови человека, инкубируемых с 50-600 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, или без оных (контроль). Фиг. 5Ь представляет включение [3Н]тимидина, в культивируемые клетки костного мозга человека после 21 дня инкубирования с или без (контроль) 50-600 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина. Костный мозг получен от больных злокачественными опухолями на стадии ремиссии (ВМ авто, ВМ 1 и ВМ 2) или от здоровых добровольцев (ВМ нормален). Фиг. 5с представляет включение [3Н]-тимидина в культивируемые клетки пуповинной крови человека после 14 дней инкубирования с или без (контроль) 50-1000 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина. Пуповинная кровь получена от двух различных доноров (С.В. 1, С.В. 2).
Фиг. 6 представляет таблицу, отражающую пролиферацию предшественников кровяных клеток из костного мозга и пуповинной крови человека в результате инкубирования с пептидами, полученными из нативного казеина. Относительное число клеток х 104 на мл, отражающее пролиферацию культивируемых клеток, определяют, подсчитывая клетки, как это указано ниже в разделе Примеры. Костный мозг от здоровых добровольцев (костным мозг) и пуповинную кровь от нормально рожденных детей (пуповинная кровь) инкубируют в течение 13 (пуповинная кровь) или 14 (костный мозг) дней в присутствии факторов роста и АВ сыворотки, с добавлением или без добавления возрастающих концентраций пептидов, полученных из нативного казеина, (25-500 мкг).
Фиг. 7 представляет стимуляцию восстановления периферических белых кровяных клеток у миелоаблативных мышей с трансплантированным костным мозгом под действием обработки пептидами, полученными из нативного казеина. Количество клеток представляет число белых кровяных клеток (х 106 на мл, определенное с помощью гемоцитометра). Мыши (п=10 в группе) получают летальную дозу радиации и претерпевают трансплантацию сингеничного костного мозга (106 клеток на мышь) на 9 июня и внутривенно им вводят 1 мг на реципиента пептидов, полученных из нативного казеина, (тест: -+- ) или 1 мг на реципиента альбумина человека сыворотки (контроль: -).
Фиг. 8 представляет стимуляцию восстановления тромбоцитов у миелоаблативных мышей с трансплантированным костным мозгом за счет обработки пептидами, полученными из нативного казеина. Количество тромбоцитов (РЬТ) представляет число тромбоцитов (х 103 на мл, при измерении с помощью гемоцитометра). Мышей (п=60 в группе) облучают летальной дозой радиации, и они претерпевают трансплантацию сингеничного костного мозга (106 клеток на мышь) в первый день, и внутривенное введение 1 мг/реципиент пептидов, полученных из нативного казеина (пептиды: сплошные квадратики) или 1 мг/реципиент альбумина сыворотки человека (Н8А: незачерненные квадратики).
Фиг. 9а-Г представляют проникновение в клетки и захват ядрами НТС-конъюгированных пептидов, полученных из нативного казеина, в культивируемых Т-лимфоцитных клетках, по данным флуоресцентной микроскопии. Е1 и Е2 представляют идентичные фракции НТС-конъюгированных пептидов, полученных из нативного казеина. Клетки Зир-Ц инкубируют со 100 мкг/мл НТС-конъюгированных пептидов, полученных из нативного казеина, как описано ниже в разделе Примеры. В указанные моменты времени клетки промывают от свободных меток, фиксируют в формалине и подготавливают для наблюдения и регистрации с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Фиг. 9а-9Г представляют отобранные изображения клеток для соответствующих времен инкубирования, которые демонстрируют тот факт, что НТС-конъюгированные пептиды, полученные из нативного казеина, проникают через мембраны 8ир-Т1 клеток (фиг. 9а, 9Ь) и концентрируются в ядрах (фиг. 9с-9Г).
Фиг. 10 представляет таблицу стимуляции пролиферации 8ир-Т1 лимфоцитных клеток в результате инкубирования с пептидами, полученными из нативного казеина. 8ир-Т1 клетки (5000 на лунку) инкубируют с возрастающими концентрациями (50-1000 мкг/мл) пептидов, полученных из нативного казеина, подсчитывают их количество в лунках в указанные моменты времени культивирования и импульсно бомбардируют [3Н]-тимидином в течение 18 ч. Показателем пролиферации служит отношение среднего
- 7 007217 значения для трех образцов включенного [3Н]-тимидина, деленное на значения [3Н]-тимидина, включенного в клетки, которые культивируют без пептидов, полученных из нативного казеина (контроль).
Фиг. 11 представляет таблицу, отражающую результаты ингибирования НТУ-1 инфекции СЕМ лимфоцитов пептидами, полученными из нативного казеина. СЕМ клетки предварительно инкубируют с возрастающими концентрациями (50-1000 мкг/мл) пептидов, полученных из нативного казеина для указанного количества часов (3, 24 и 48 ч) перед осуществлением контактирования с ВИЧ-1 вирусом, как указано ниже в разделе примеры. На 15 день после инфицирования определяют количество клеток и анализируют степень инфицирования НТУ-1 с помощью анализа с применением Р34 антигена, как указано ниже в разделе Примеры. Контрольными культурами служат 1Е:СЕМ клетки, которые подвергали контактированию с ВИЧ-1 вирусом без предварительной обработки пептидами, полученными из нативного казеина, и и1Е:СЕМ клетки, которые культивировали в идентичных условиях без пептидов, полученных из нативного казеина, и без осуществления контакта с ВИЧ-1 вирусом.
Фиг. 12 представляет профилактику с помощью пептидов, полученных из нативного казеина, ювенильного (типа I, ГОИМ) диабета у самок диабетических (без ожирения) мышей. Степень глюкозурии контролируют с интервалами в течение 230 дней после обработки у самок ΝΟΌ мышей, которые получают один или два раза в неделю инъекции по 100 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, в течение 5 недель (всего 6 или 11 инъекций) (треугольники), и у необработанных контрольных животных (квадраты). У всех контрольных мышей развилась глюкозурия, которая привела впоследствии к их гибели.
Фиг. 13 представляет таблицу, отражающую стимуляцию кроветворения у больных злокачественными опухолями в результате инъекций пептидов, полученных из нативного казеина. В периферической крови, взятой у пяти женщин - больных злокачественными опухолями, получающих химиотерапию, либо получавших химиотерапию, как указано выше, определяли полное количество белых кровяных клеток (АВС, х 103), тромбоцитов (РЬТ, х 103), эритроцитов (ВВС, х 103) и гемоглобина (г/дл) до (п) и после (п +...) внутримышечных инъекций пептидов, полученных из нативного казеина, как указано выше. Пациентка 1 соответствует С.Т.; Пациентка 2 соответствует Е.С.; Пациентка 3 соответствует Е.8.; Пациентка 4 соответствует 1.К; Пациентка 5 соответствует И.М.
Фиг. 14 представляет стимуляцию тромбоцитопоэза пептидами, полученными из нативного казеина, у невосприимчивых к тромбоцитам больным острым лейкозом (М-1). Восстановление тромбоцитов выражают как изменение количества тромбоцитов в периферической крови (РЬЛ, х 106 на мл), определяемое как указано выше, с определенными интервалами после внутримышечной инъекции (как указано ниже в разделе Примеры) 100 мкг пептидов, полученных из нативного казеина.
Фиг. 15 представляет стимуляцию тромбоцитопоэза пептидами, полученными из нативного казеина, тромбоцито-невосприимчивых больным острым лейкозом (М-2). Восстановление тромбоцитов выражают как изменение количества тромбоцитов в периферической крови (РЬЛ, х 106 на мл), определенное указанным выше способом через указанные промежутки времени после внутримышечного введения (как это раскрыто ниже в разделе примеры) 100 мкг пептидов, полученных из нативного казеина.
Описание предпочтительных вариантов изобретения
Настоящее изобретение относится к биологически активным пептидам, последовательности которых получены из Ν-конца α81 фракции молочного казеина или аналогичны им, к композициям, содержащим данные пептиды, и к способам их применения, например для стимулирования и усиления иммунной реакции, для защиты против вирусной инфекции, для нормализации уровней холестерина в сыворотке и для стимулирования кроветворения. Полученные из казеина пептиды не токсичны, и их можно использовать для лечения и профилактики, например иммунопатологий, гиперхолестеринемии, гематологических нарушений и связанных с вирусами заболеваний.
Принципы и способы осуществления настоящего изобретения можно лучше понять со ссылкой на рисунки и сопровождающие их описания.
Перед детальным объяснением по крайней мере одного варианта изобретения, следует уяснить, что применение изобретения не ограничивается подробностями, изложенными ниже в описании или проиллюстрированными примерами. Возможны другие варианты изобретения, или его можно использовать на практике другими способами. Кроме того, следует уяснить, что используемая в данном описании терминология и фразеология служит целям описания, и ее не следует рассматривать как ограничивающую.
В том смысле, как использовано, термин лечение включает существенное ингибирование, замедление или обратное течение развития заболевания, существенное ослабление клинических симптомов заболевания.
В том смысле, как использовано, термин профилактика включает существенное предотвращение проявления клинических симптомов заболевания.
В том смысле, как использовано, термин пептид включает нативные пептиды (включая продукты разложения, пептиды, полученные синтетическим путем, или рекомбинантные пептиды) и имитаторы пептидов (обычно пептиды, полученные синтетическим путем), такие как пептоиды и полупептоиды, которые являются аналогами пептидов, и которые могут содержать, например, модификации, которые делают данные пептиды более стабильными в организме. Такие модификации включают, но не ограни
- 8 007217 чиваясь ими, циклизацию, модификацию Ν-конца, модификацию С-конца, модификацию пептидной связи, включая, но не ограничиваясь ими, -<7Η2-ΝΗ, СН2-8, СН2-8=О, ОС-ΝΗ, СН2-О, СН2-СН2, 8=ΟΝΗ, СН=СН или СЕ=СН, модификацию основной цепи и модификацию остатков. Способы получения соединений-имитаторов пептидов хорошо известны в данной области и раскрыты, например, в РиапШаПуе ϋπι§ Оезфп, С.А. Ватзбеп Об., СИар1ег 17.2, Т. СЬорНп Рег§атоп Ргезз (1992), которая включена в данное описание в качестве ссылки. Дальнейшая детализация данного аспекта изложена ниже.
Так, пептидом настоящего изобретения может быть циклический пептид. Циклизацию можно осуществить, например, за счет образования амидной связи, например, включением О1и, Азр, Ьуз, От, диаминомасляной (ОаЬ) кислоты, ди-аминопропионовой (Эар) кислоты в различные положения в цепи (-СО-ΝΗ или -ΝΗ-СО связи). Можно также осуществить циклизацию между двумя основными цепями за счет включения модифицированных аминокислот формул Η-Ν((ΟΗ2)η-ΟΟΟΗ)-Ο(Κ)Η-ΟΟΟΗ или НΝ((ΟΗ2)η-ΟΟΟΗ)-Ο(Κ)Η-ΝΗ2, где п=1-4, и, кроме того, где К представляет природную или не природную боковую цепь аминокислоты.
Возможна также циклизация через образование 8-8 связей за счет включения двух Суз остатков. Кроме того, циклизацию за счет присоединения одной боковой цепи к другой боковой цепи можно осуществить через образование интерактивной связи формулы -(-СН2)п-8-СН2-С-, где п=1 или 2, что возможно, например, за счет включения Суз или ЬошоСуз и взаимодействия ее свободной 8Н группы, например, с бромацетилированными Ьуз, От, ОаЬ или Оар.
Пептидные связи (-СО-ΝΗ-) внутри пептида могут быть замещены, например, Ν-метилированными связями (-Ν(ΟΗ3)-ΟΟ-), сложноэфирными связями (-Ο(Κ)Η-Ο-Ο-Ο-Ο(Κ)-Ν-), кетометиленовыми связями (-СО-СН2-), ос-аза связями (-ΝΗ-Ν(Κ)-ΟΟ-), где К представляет любой алкил, например, метил, карбасвязи (-ΟΗ2-ΝΗ-), гидроксиэтиленовые связи (-СН(ОН)-СН2-), тиоамидные связи (-Ο8-ΝΗ-), олефиновые двойные связи (-СН=СН-), ретроамидные связи (-ΝΗ-СО-), производные пептидов (-Ν(Κ)-ΟΗ2-ΟΟ-), где К представляет нормальную боковую цепь, естественно присутствующую у атома углерода.
Такие модификации могут быть осуществлены по любым связям вдоль пептидной цепи и даже по нескольким (2-3) одновременно.
Природные ароматические аминокислоты, Тгр, Туг и РЬе, могут быть замещены для синтеза неприродных кислот, таких как Т1С, нафтилеланин (Νοί), метилированное по кольцу производное РЬе, галогенированное производное РЬе или О-метил-Туг.
В приведенных ниже табл. 1-2 перечислены все природные аминокислоты (табл. 1) и необычные или модифицированные аминокислоты (табл. 2).
Таблица 1
Аминокислота Трехбуквенное сокращение Однобуквенный символ
Аланин А1а А
Аргинин Агд В
Аспарагин Азп N
Аспартиковая кислота Азр 0
Цистеин Суз С
Глутамин С1п 0
Глутамовая кислота С1и Е
Глицин С1у С
Гистидин ΗΪ3 Н
Изолейцин Не I
Лейцин Ьеи Ц
Лизин Ъуз К
Метионин Мер м
Фенилаланин РНе г
Пролин Рго Р
Серин Зег 3
Треонин ТНг т
Триптофан Тгр и
Тирозин Туг Υ
Валин Уа1 V
Любая кислота из вышеперечисленных Хаа X
-9007217
Таблица 2
Необычная аминокислота Код Необычная аминокислота Код
α-аминомасляная кислота АЬи Ь-Ц-метилаланин №па1а
а-амино-а-метилбутират МдаЬи Η-Ν-метиларгинин №пагд
аминоциклопропанкарбоксилат Срго Ь-Ы-метиласпарагин Ытазп
Ъ-И-метиласпарагиновая кислота Итазр
аминоизомасляная кислота А1Ь Ь-Ы-метилцистеин №псуз
аминонорборнил- карбоксилат ЫогЬ Ь-Ы-метилглутамин ЦтдФп
Ь-Ы-метилглутаминовая кислота №пд1и
Необычная аминокислота Код Необычная аминокислота Код
циклогексилаланин Спеха Ь-Ц-метилгистидин МпИФз
циклопентилаланин Среп Β-Ν-метилизолейцин Νιηίΐε
Б-аланин Ва1а Ь-Ы-метиллейцин №п1еи
ϋ-аргинин Вагд Ь-Ы-метиллизин ЦтФуз
В-аспарагиновая кислота Вазр Ь-Ц-метилметионин Ыттек
Ц-цистеин Всуз Ь-14-метилнорлейцин №пп1е
В-глутамин Вд1п Ь-И-метилнорвалин Итпуа
Б-глутаминовая кислота Вд1и Ь-Ы-метилорнитин Ытогп
В-ГИСТИДИН ΒΪ113 Ь-Ы-метилфенилаланин ИтрЬе
В-изолейцин В11е Ь-Ы-метилпролин Цтрго
В-лейцин В1еи Ь-Ы-метилсерин Цтзег
В-лизин В1уз Ь-Ы-метилтреонин ΝπΛΙιγ
В-метионин Втек Ь-Ы-метилтриптофан Ытбгр
Ц-орнитин Вот Ь-Ы-метилтирозин Ытбуг
В-фенилаланин ВрЪе Ь-Ы-метилвалин №туа1
В-пролин Врго Ь-Ы-метилэтилглицин Ытекд
В-серин Взег Ь-Ы-метил-трет-бутилглицин ИтРЬид
ϋ-треонин ВЬЬг Ь-норлейцин Νίβ
В-триптофан ВРгр Ь-норвалин Ννβ
ϋ-тирозин ВЬуг α-метиламиноизобутират МаФЬ
В-валин Вуа1 а-метил-γ-аминобутират МдаЬи
ϋ-α-метилаланин Ота1а α-метилциклогексилаланин МсЬеха
Б-α-ме тиларгинин Бтагд а-метилциклопентилаланин Мсреп
ϋ-α-метиласпарагин Отазп а-метил-а-нафтилаланин Мапар
Β-α-метиласпартат Бтазр а-метилпенициламин Мреп
Β-α-метилцистеин Бтсуз Ν-(4-аминобутил)глицин ИдФи
В-а-метилглутамин 0тд1п Ν-(2-аминоэтил)глицин Ыаед
В-а-метилгистидин БтЫз Ν-(3-аминопропил)глицин Νογπ
Б-а-метилизолейцин БтИе Ν-амино-а-метилбутират ЫтааЬи
Э-а-метиллейцин Вт1еи а-нафтилаланин Ап ар
В-а-метиллизин 0т1уз Ν-бензилглицин ЧрЬе
В-а-метилметионин Оттек Ν-(2-карбамилэтил)глицин ИдФп
В-а-метилорнитин Этот Ν-(карбамилметил)глицин Цазп
ϋ-α-метилфенилаланин БтрЬе Ν- (2-карбоксиэтил)глицин ИдФи
- 10007217
Необычная аминокислота Код Необычная аминокислота Код
ϋ-α-метилпролин Отрго Ν-(карбоксиметил)глицин Иазр
ϋ-α-метилсерин Отзег Ν-циклобутилглицин ЦсЬи!
Э-а-метилтреонин ЭпФИг Ν-циклогептилглицин ΝοΗβρ
Р-а-метилтриптофан бтбгр Ν-циклогексилглицин ЫсНех
ϋ-α-метилтирозин ОтЪуг Ν-циклодецилглицин Νοάεο
ϋ-α-метилвалин Г>пгуа1 Ν-циклододецилглицин Νοάοά
ϋ-α-метилаланин Опта1а Ν-циклооктилглицин ΝοοοΙ
ϋ-α-метиларгинин Оптагд Ν-циклопропилглицин Νορτο
О-а-метиласпарагин Оптазη Ν-циклоундецилглицин Ысипс!
б-а-метиласпартат Оптазр Ν- (2,2-дифенилэтил)глицин ЫЫтт
ϋ-α-метилцистеин Оптсуз Ν-(3,3-дифенилпропил)глицин ЫЬЬе
ϋ-Ν-метиллейцин 0пт1еи Ν-(3-индолилэтил)глицин ΝΙτύτρ
ϋ-Ν-ме тиллизин 0пт1уз Ν-метил-у-аминобутират №пдаЬи
Ν-ме тилциклоге ксилаланин №псЬеха ϋ-Ν-метилметионин Опттеб
ϋ-Ν-метилорнитин Оптогп Ν-метилциклопентилаланин Цтсреп
Ν-метиламиноизобутират ЫтаФЬ ϋ-Ν-метилфенилаланин ОптрЬе
Ν-(1-метилпропил)глицин ИНе Ο-Ν-метилпролин Оптрго
ϋ-Ν-метилсерин Оптзег
Ν-(2-метилпропил)глицин Ц1еи Ο-Ν-метилтреонин ОптЁЬг
ϋ-Ν-метилтриптофан Опт+гр Ν-(1-метилэтил)глицин Νν31
ϋ-Ν-метилтирозин Опт! у г Ν-метил-а-нафтилаланин Ытапар
ϋ-Ν-метилвалин Οπιτινθΐ Ν-метилпенициламин Ытреп
γ-аминомасляная кислота СаЬи Ν-(п-гидроксифенил)глицин ЫЬБуг
Ь-трет-бутилглицин ТЬид Ν-(тиометил)глицин Ысуз
Ь-э тилглицин ЕБд пенициламин Реп
Ь-гомофенилаланин НрНе Ь-а-метилаланин Ма1а
Ь-а-метиларгинин Магд Ь-а-метиласпарагин Мазп
Ь-а-метиласпартат Мазр Ъ-а-метил-трет-бутилглицин МбЬид
Ь-а-метилцистеин Мсуз Ь-метилэтилглицин Мебд
Ъ-а-метилглутамин Мд1п Ь-а-метилглутамат Мд1и
Необычная аминокислота Код Необычная аминокислота Код
Ь - α-ме ти л ги с тидин ΜΪ113 Ь-а-метилгомофенилаланин МНрНе
0-N-ме тилглутамин ϋηπιςίη Ν-(2-метилтиоэтил)глицин Νπίθϋ
ϋ-Ν-метилглутамат 0птд1и Ν-(3-гуанидинопропил)глицин Цагд
ϋ-Ν-метилгистидин ОптЫз Ν- (1-гидроксиэтил)глицин ЩЩг
ϋ-Ν-метилизолейцин ЦптИе Ν-(гидроксиэтил)глицин Цзег
Ь-а-метиллейцин М1еи Ν-(имидазолилэтил)глицин ИЫз
Ь-а-метилметионин Мтеб Ь-а-метиллизин М1уз
Ь-а-метилнорвалин Μην3 Ь-а-метилнорлейцин Мп1е
Ь-а-метилфенилаланин МрНе Ь-а-метилорнитин Моги
Ь-а-метилсерин Мзег Ь-а-метилпролин Мрго
Ь-а-метилвалин Μνβΐ Ь-а-метилтреонин МбЬг
Ь-а-метилтриптофан ΜΊ гр Ь-а-метилтирозин Мб у г
Ν-(Ν-(2,2-дифенилэтил)- карбамилметилглицин ЦпЬЬт Ь-Ы-метилгомофенилаланин МпЬрЬе
1-карбокси-1-(2,2дифенилэтиламино) циклопропан ЫтЬс Ν-(Ν-(3,3-дифенилпропил) карбамилметил(1)глицин ЫпЫте
Пептид настоящего изобретения можно использовать как таковой, или в форме части фрагментов, таких как белки и дисплей фрагменты, такие как дисплеи бактерий и фагов. Пептиды настоящего изобретения можно также модифицировать химически, получая активные димеры или полимеры в одной пептидной цепи или в ковалентно сшитых цепях. Кроме того, пептиды настоящего изобретения включают по крайней мере четыре, необязательно по крайней мере пять, необязательно по крайней мере шесть, необязательно по крайней мере семь, необязательно по крайней мере восемь, необязательно по крайней мере девять, необязательно по крайней мере десять, необязательно по крайней мере одиннадцать, необязательно по крайней мере двенадцать, необязательно по крайней мере тринадцать, необязательно по крайней мере четырнадцать, необязательно по крайней мере пятнадцать, необязательно по крайней мере шестнадцать, необязательно по крайней мере семнадцать, необязательно по крайней мере восемнадцать, необязательно по крайней мере девятнадцать, необязательно по крайней мере двадцать, необязательно по крайней мере двадцать один, необязательно по крайней мере двадцать два, по крайней мере двадцать три, по крайней мере двадцать четыре, по крайней мере двадцать пять, по крайней мере двадцать шесть, необязательно между двадцатью семью и шестьюдесятью или более аминокислотных остатков (которые в данном описании равнозначно называют аминокислотами).
Соответственно, в том смысле, как использовано, термин аминокислота или аминокислоты включает 20 природных аминокислот; такие аминокислоты часто оказываются модифицированными после трансляции ίη νίνο, включая, например, гидроксипролин, фосфосерин и фосфотреонин; и другие необычные аминокислоты, включая, но не ограничиваясь ими, 2-аминоадипиновую кислоту, гидроксилизин, изодесмозин, норвалин, норлейцин и орнитин. Кроме того, термин аминокислота включает как ϋ-, так и Ь-аминокислоты.
В том смысле как использовано, фраза полученный из Ν-концевой части казеина ос81 относится к пептидам в том смысле, как определено, например, продукты расщепления казеина ос81 (называемые пептидами, полученными из нативного казеина) , синтетические пептиды, синтезированные химическим путем таким образом, что их аминокислотные последовательности соответствуют аминокислотной последовательности Ν-концевой части казеина ос81 (называемые синтетическими пептидами, полученными из казеина), пептиды, аналогичные (гомологичные) Ν-концевой части казеина ос81, например, пептиды, отличающиеся одним или более из аминокислотных замещений, но не ограничиваясь ими, допустимыми заместителями, при условии, что сохраняется по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 80%, более предпочтительно по крайней мере 90% сходства, и их функциональные гомологи. Термины гомологи и функциональные гомологи, в том смысле, как использовано, относятся к пептидам с любыми вставками, делениями и замещениями, которые не влияют на биологическую активность пептида.
В том смысле, как использовано, термин казеин ос81 относится к казеину ос81 млекопитающих, включая, но не ограничиваясь ими, домашних млекопитающих (например, коров, овец, коз, лошадей, верблюдов, оленей и буйволов), людей и морских млекопитающих. Далее приводится список казеинов ос81, аминокислотные последовательности которых известны и идентифицированы по их регистрацион
- 12007217 ным номерам в СспВапк (ЯСВ1) и источникам: САА26982 (Ονίδ апс5 (овца)), САА51022 (Сарга Ытси5 (коза)), САА42516 (Во5 1аитц (корова)), САА55185 (Ното 5ар1еп8), САА38717 (8и§ 5 с го Га (свинья)), Р09115 (кролик) и 097943 (Сате1ц8 бготебштш (верблюд)).
В том смысле, как использовано, термин Ν-концевая часть относится к М аминокислотам α81 казеина, полученным из первых 60 аминокислот казеина α81. где М представляет любое целое число от 5 до 60 (включая целые числа 5 и 60). Предпочтительно данный термин относится к первым М аминокислотам казеина α81.
Пептиды настоящего изобретения можно получить путем экстракции из молока, как было указано выше, или с помощью твердофазного пептидного синтеза, который является стандартным способом, известным в данной области. Очистку пептидов настоящего изобретения осуществляют стандартными способами, известными специалистам, такими как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Фрагментацию молочного казеина для получения пептидов настоящего изобретения можно осуществить, используя различные ферментативные и/или химические способы.
Как будет подробно раскрыто ниже и подтверждено примерами в следующем ниже разделе Примеры, пептиды настоящего изобретения обладают различными терапевтическими эффектами. В разделе Примеры приведено множество анализов, с помощью которых специалист может тестировать конкретный пептид, полученный в соответствии с способами настоящего изобретения для конкретного терапевтического эффекта.
Любой из описываемых пептидов можно вводить как он есть или в составе фармацевтической композиции, которую можно использовать для лечения или профилактики заболевания. Такие композиции включают в качестве активного ингредиента любые из раскрываемых пептидов и фармацевтически приемлемый носитель.
В том смысле, как использовано, термин фармацевтическая композиция относится к препарату одного или более из описываемых пептидов с другими химическими компонентами, такими как фармацевтически приемлемые носители и наполнители. Целью создания фармацевтической композиции является облегчение введения соединения в организм.
Здесь и далее термин фармацевтически приемлемый носитель относится к носителю или разбавителю, который не вызывает заметного раздражения в организме и не разрушает биологическую активность и свойства вводимого соединения. Примерами носителей, но не ограничиваясь ими, являются: пропиленгликоль, солевой раствор, эмульсии и смеси органических растворителей с водой. Термин наполнитель относится к инертному веществу, которое добавляют в фармацевтическую композицию для дальнейшего облегчения введения соединения. Примеры наполнителей, но не ограничиваясь ими, включают карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и различного типа крахмалы, производные целлюлозы, желатин, растительные масла и полиэтиленгликоли.
Способы получения лекарственных форм и введения лекарств можно найти в ВеттЦопА Рйагтасеи11са1 8с1епсе§, Маск РиЬйкЫпд Со., Еа§1оп, РА, в последнем издании.
Подходящие способы введения могут, например, включать пероральное, ректальное, чресслизистое, чрескожное, энтеральное или парэнтеральное введение, включая внутримышечные, подкожные и интрамедуллярные инъекции, а также интратекальную, прямую интравентрикулярную, внутривенную, внутрибрюшинную, назальную или внутриглазную инъекции.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно приготовить способами, хорошо известными в данной области, например, с помощью обычного перемешивания, гранулирования, получения драже, растирания в порошок, эмульгирования, заключения в оболочку или в матрицу, или используя процесс лиофилизации.
Фармацевтические композиции для использования в соответствии со способом настоящего изобретения можно приготовить обычными способами, используя один или более из фармацевтически приемлемых носителей, включая наполнители и вспомогательные агенты, которые облегчают процесс включения активных пептидов в препараты, которые можно использовать фармацевтически. Подходящая форма зависит от выбранного способа введения.
Для инъекций пептиды настоящего изобретения можно приготовить в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенка, раствор Рингера или забуференный физиологический солевой раствор, с добавлением или без добавления органических растворителей, таких как пропиленгликоль и полиэтиленгликоль. Для введения через слизистую оболочку в формах используют агенты, способствующие проникновению через слизистую. Такие агенты хорошо известны в данной области.
Для перорального введения пептиды можно легко приготовить, комбинируя активные пептиды с фармацевтически приемлемыми носителями, которые хорошо известны в данной области. Такие носители позволяют получить пептиды настоящего изобретения в таких формах, как таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкости, гели, сиропы, взвеси, суспензии и т.п. для перорального приема пациентом. Фармакологические препараты для перорального введения можно приготовить, используя наполнители, необязательно измельчая полученную смесь и превращая смесь в гранулы, затем добавляя при желании под
- 13 007217 ходящие вспомогательные агенты, для получения таблеток или сердцевин драже. Подходящими наполнителями являются, в частности, наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, смола трагаканта, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза; и/или физиологически приемлемые полимеры, такие как поливинилпирролидон (РУР). При желании можно добавить разрыхляющие агенты, такие как сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота, или ее соль, такая как альгинат натрия.
На сердцевины драже наносят покрытия. Для этой цели можно использовать концентрированные растворы сахара, которые могут необязательно содержать гуммиарабик, тальк, полвинилпирролидон, гель карбопола, полиэтиленгликоль, диоксид титана, лакирующие растворы и подходящие органические растворители или смеси растворителей. В оболочки драже или таблеток можно добавить красители или пигменты для идентификации, или для того, чтобы охарактеризовать различные комбинации доз активных ингредиентов.
Фармацевтические композиции, которые предназначены для перорального введения, включают сборные капсулы, состоящие из желатина, а также мягкие герметичные капсулы, сделанные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Сборные капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителями, такими как лактоза, связующими, такими как крахмалы, смазывающими агентами, такими как стеарат магния, и необязательно стабилизаторы. В мягких капсулах активные пептиды могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как нелетучие масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы. Все формы для перорального введения должны быть в дозированных формах, подходящих для выбранного способа введения.
Для способа введения за щеку, композиции могут быть, как обычно, изготовлены в форме таблеток или пастилок.
Для введения путем ингаляции пептиды настоящего изобретения удобно вводить в форме аэрозольных спреев, распыляемых из баллончика со сжатым воздухом или распылителя с подходящим распыляющим агентом, например, дихлордифторметаном, трихлорфторметаном, дихлортетрафторэтаном или диоксидом углерода. В случае аэрозолей под давлением единичную дозу можно определить с помощью клапана, который пропускает отмеренное количество препарата. Капсулы и картриджи, например, желатина, для использования в ингаляторе или в устройстве для вдувания, можно выполнить таким образом, чтобы они содержали смесь порошка соединения и подходящую порошковую основу, такую как лактоза или крахмал.
Раскрываемые в данном описании пептиды можно приготовить в формах для парэнтерального введения, например, для болюсного введения или для непрерывного вливания. Формы для инъекций могут быть выполнены в виде разовых дозированных форм, например, в ампулах, или в контейнерах с многими дозами, в которые необязательно добавлен консервант. Композиции могут иметь вид суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных носителях, и могут содержать способствующие созданию формы агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.
Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активных препаратов в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных пептидов можно приготовить в виде масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают нелетучие масла, такие как кунжутное масло, или сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды или липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно суспензия может содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость пептидов, чтобы обеспечить получение высококонцентрированных растворов. В другом варианте активный ингредиент может быть в форме порошка для растворения перед применением в подходящем растворителе, например, в стерильной, не содержащей пирогенов воде.
Пептиды настоящего изобретения могут быть также приготовлены в виде композиций для ректального введения, в таком виде, как суппозитории или клизмы, используя, например, обычные основы для суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды.
Описываемые фармацевтические композиции могут также содержать подходящие твердые носители, носители в виде геля, или наполнители. Примеры таких носителей или наполнителей включают, но не ограничиваясь ими, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.
Специалисты могут легко определить оптимальные дозы и схемы приемов для каждого из пептидов настоящего изобретения.
Для любого из пептидов, используемых в соответствии со способом настоящего изобретения, терапевтически эффективное количество, называемое также терапевтически эффективной дозой, можно определить, вначале используя анализ клеточных культур или анализ ίη νίνο на животных. Так, например, дозу можно определить в модели на животных для достижения циркулирующей концентрации в интервале, который включает ИК50 или ИК100, определенные для культуры клеток. Такую информацию можно
- 14 007217 использовать для более точного определения необходимых для человека доз. Начальные дозы можно также определить из результатов исследований ίη νίνο. Используя эти начальные руководства, специалист может определить величину эффективной дозы для человека.
Более того, токсичность и терапевтическую эффективность описываемых пептидов можно определить с помощью стандартных фармацевтических процедур для культуры клеток или на экспериментальных животных, например, определяя ЛД50 и ЭД50. Отношение величин токсичной дозы и дозы терапевтически эффективной является терапевтическим показателем, и его можно выразить как отношение ЛД50 к ЭД50. Предпочтительны пептиды, которые демонстрируют высокие терапевтические показатели. Результаты анализов, полученные для клеточных культур и исследований на животных, можно использовать для определения дозового интервала, который не был бы токсичным для человека. Дозы для таких пептидов находятся предпочтительно в интервале циркулирующих концентраций, который включает ЭД50 с малой токсичностью или вовсе без токсичности. Дозы могут меняться в этом интервале значений в зависимости от используемой формы дозы и способа введения. Конкретную форму, способ введения и дозу должен выбрать врач с учетом состояния пациента (см., например, Ρίη§ί с1 а1., 1975, Ιη: Т11С Рйаттасо1одюа1 Ващ§ о£ Тйетареийск, сйарЮг 1, раде 1).
Количество доз и интервал между введениями можно установить индивидуально для достижения таких уровней активного ингредиента в плазме, которых достаточно для поддержания терапевтического эффекта. Обычные допустимые дозы для перорального введения находятся в интервале от около 50 до 2000 мг/кг/прием обычно от около 100 до 1000 мг/кг/прием, предпочтительно от около 150 до 700 мг/кг/прием и наиболее предпочтительно от около 250 до 500 мг/кг/прием. В некоторых случаях терапевтически эффективные уровни в сыворотке достигаются в результате введения нескольких доз каждый день. В случае локального введения или селективного поглощения эффективная локальная концентрация лекарства может не быть связана с концентрацией в плазме. Специалист сможет оптимизировать эффективную локальную дозировку без чрезмерных экспериментов.
В зависимости от серьезности состояния и реакции подлежащего лечению пациента, прием доз может быть однократным с применением композиции с замедленным выделением, при этом курс лечения длится от нескольких дней до нескольких недель, до излечения или до ослабления болезненного состояния.
Необходимое для введения количество композиции будет, естественно, зависеть от подлежащего лечению пациента и тяжести заболевания, способа введения, точки зрения врача и т.д. Композиции настоящего изобретения можно при желании представить в упаковке или в распределительном устройстве, таком как набор, одобренный ΡΌΆ, который может содержать одну или более из разовых дозированных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, содержать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистер. Упаковка или распределительное устройство может сопровождаться инструкцией для применения. Упаковка или распределительное устройство может также сопровождаться предупреждением, связанным с контейнером в форме предписания правительственного учреждения, регулирующего изготовление, применение или продажу лекарств, при этом такое предупреждение отражает утверждение учреждением формы композиции или введения человеку или животным. Такое предписание может быть, например, этикеткой, утвержденной администрацией США по пищевым и лекарственным продуктам для лекарств, отпускаемых по рецепту врача. Композиции, включающие пептид настоящего изобретения, приготовленные в совместимом фармацевтическом носителе, можно поместить в соответствующий контейнер и пометить для лечения или профилактики указанного состояния или для того, чтобы вызвать нужный результат. Соответствующие указания в примечании могут включать лечение и/или профилактику аутоиммунного заболевания, вирусного заболевания, вирусной инфекции, тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, гиперлипидемии, холестеринемии, гликозурии и диабета, или индуцирование кроветворения, пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, мегакариоцитопоэза, эритропоэза, лейкоцитопоэза и/или тромбоцитопоэза.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть полезны для поддержания и/или восстановления составляющих кровеносной системы, баланса количества кровяных клеток, для баланса уровней метаболитов в крови, включая уровни сахара, холестерина, кальция, мочевой кислоты, мочевины и ферментов, таких как щелочная фосфатаза. Далее фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть полезна для индуцирования пролиферации кровяных клеток, модулирования количества белых и/или красных кровяных клеток, особенно повышения количества белых и/или красных кровяных клеток, повышения уровня гемоглобина в крови и модулирования количества тромбоцитов.
Термин балансировка, используемый в связи с уровнями некоторых физиологических параметров, означает изменение уровней данных параметров и подведение их ближе к нормальным значениям.
Термин нормальные значения, в том смысле, как использовано в связи с физиологическими параметрами, означает значения, которые попадают в интервал значений для здоровых людей и животных.
В особо предпочтительных вариантах пептиды настоящего изобретения приводят к нормальным значениям количество красных кровяных клеток, белых кровяных клеток, тромбоцитов и уровень гемоглобина. Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно использовать для лечения и/или
- 15 007217 профилактики заболеваний гемопоэтических стволовых клеток, включая заболевания, опосредованные тромбоцитами, лимфоцитами, плазмоцитами и нейтрофилами, а также дефицита и неправильного функционирования при предлейкозных и лейкозных состояниях и при тромбоцитопении.
Далее фармацевтические композиции можно использовать для лечения и/или профилактики клеточно-пролиферативных заболеваний. В этой связи следует отметить, что фармацевтические композиции настоящего изобретения выгодно использовать для стимулирования иммунной реакции при химиотерапии или лучевой терапии, для ослабления негативных эффектов, уменьшения рвоты, вызываемой химиотерапией и облучением, чтобы способствовать быстрейшему выздоровлению.
Кроме того, фармацевтические композиции настоящего изобретения можно использовать для стимулирования иммунной реакции человека во время лечения заболеваний, связанных с иммунодефицитом, например, ВИЧ и аутоиммунных заболеваний.
Композиции настоящего изобретения могут быть также предназначены для использования в ветеринарии.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно использовать для лечения и/или профилактики, например, заболеваний, сопровождающихся аномальными уровнями кровяных клеток, заболеваний, сопровождающихся продуцированием и дифференцировкой гемопоэтических стволовых клеток, для лечения заболеваний, опосредованных тромбоцитами, лимфоцитами и/или нейтрофилами, для лечения предлейкозных или лейкозных состояний и для лечения тромбоцитопении. Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно использовать для лечения заболеваний, связанных с пролиферацией клеток, и заболеваний, связанных с иммунодефицитом, таких как ВИЧ и аутоиммунные заболевания. Далее фармацевтические композиции настоящего изобретения можно использовать для стимулирования иммунной реакции при химиотерапии или лучевой терапии, например, для уменьшения рвоты, связанной с химиотерапией.
Далее настоящее изобретение относится к антибактериальным фармацевтическим композициям, включающим в качестве активного ингредиента по крайней мере один пептид настоящего изобретения, и к использованию пептидов настоящего изобретения в качестве антибактериальных агентов.
Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ профилактики или лечения аутоиммунных заболеваний, причем способ этот осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения вирусного заболевания, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики вирусной инфекции, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования кроветворения, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования мегакариоцитопоэза, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования эритропоэза, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования лейкоцитопоэза, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования тромбоцитопоэза, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
- 16 007217
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения тромбоцитопении, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения панцитопении, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения гранулоцитопении, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения гиперлипидемии, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения холестеринемии, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения глюкозурии, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения диабета, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения СПИД, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения инфекции, вызванной ВИЧ, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиорадиотерапии, поддерживаемой трансплантацией аутологичного костного мозга или периферических стволовых кроветворных клеток (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Νконцевой части казеина «81.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения вирусного заболевания, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики вирусной инфекции, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования кроветворения, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Νконцевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования мегакариоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в каче
- 17 007217 стве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования эритропоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81. и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования лейкоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования кроветворения, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования тромбоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения тромбоцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения панцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения гранулоцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения гиперлипидемии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения холестеринемии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения глюкозурии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения диабета, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения СПИД, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения инфекции, вызванной ВИЧ, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиорадиотерапии, поддержанными трансплантацией аутологичного костного мозга или периферических стволовых кроветворных клеток (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
- 18 007217
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения вирусного заболевания.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики вирусной инфекции.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для индуцирования кроветворения.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для индуцирования мегакариоцитопоэза.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для индуцирования эритропоэза.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для индуцирования лейкоцитопоэза.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для индуцирования тромбоцитопоэза.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения тромбоцитопении.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения панцитопении.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения гранулоцитопении.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения гиперлипидемии.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения холестеринемии.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения глюкозурии.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения диабета.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения СПИД.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части казеина α81 для профилактики или лечения инфекции, вызванной ВИЧ.
Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиорадиотерапии, поддержанными трансплантацией аутологичного костного мозга или трансплантацией периферических стволовых кроветворных клеток (Л8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ).
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен очищенный пептид, последовательность аминокислот которого выбрана из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 1-19.
Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция, включающая очищенный пептид, последовательность аминокислот которого выбрана из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 1-19, и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение с успехом решает недостатки известных в настоящее время конфигураций, предоставляя пептиды для лечения заболеваний человека, причем указанные пептиды получены из Νконцевой части казеина α81, не обладают видимой токсичностью, зато отличаются высокой терапевтической эффективностью.
Дополнительные цели, преимущества и новые отличительные особенности настоящего изобретения станут очевидны специалистам после ознакомления со следующими примерами, которые не следует рассматривать как ограничивающие. Кроме того, каждый из различных вариантов и аспектов настоящего изобретения, как оно изложено выше и как заявлено в формуле изобретения, находит экспериментальное подтверждение в приведенных далее примерах.
- 19 007217
Примеры
Сделаны ссылки на следующие примеры, которые вместе с приведенным выше описанием иллюстрируют изобретение не лимитирующим образом.
Материалы и экспериментальные методы
Препараты пептидов, полученных из нативного казеина.
Фракцию казеина из коровьего молока выделяют по способу Ηΐρρ е! а1. (1952), ΐΒΐά. и подвергают исчерпывающему протеолитическому расщеплению химозином (известным также как реннин) (20 нг/мл) при 30°С. После завершения реакции, раствор нагревают для инактивирования фермента и гидролизат осаждают как параказеин, подкисляя органической кислотой, уксусной или трихлоруксусной кислотой. Параказеин выделяют центрифугированием и надосадочную фракцию, содержащую представляющие интерес пептидные фрагменты, диализуют и снова осаждают как казеицидин более высокими концентрациями кислоты. Полученный казеицидин после повторного суспендирования, диализа и нейтрализации, лиофилизируют. Анализируют биологическую активность полученного порошкообразного препарата, как указано ниже, и выделяют с помощью ВЭЖХ для пептидного анализа.
ВЭЖХ анализ пептидов, полученных из нативного казеина.
Пептиды, полученные из нативного казеина, как указано выше, анализируют с помощью ВЭЖХ в две стадии. Вначале лиофилизированный казеиновый гидролизат разделяют, используя С18 обращенную фазу и градиентное элюирование смесью 0,1% водная трифторуксусная кислота (вес/вес) - ацетонитрил. Детектирование осуществляют по УФ поглощению на 214 нм. После этого образцы анализируют с помощью ВЭЖХ-Масс-спектрометра (М8), снабженного источником распыления электронов. Рассчитанные массы представляют массы ионизированных пептидных образцов, полученных по времени удерживания. После разделения аминокислотный состав пептидов определяют с помощью газофазного микросеквенатора (Аррйеб В1О8у81еш8 470А).
Приведенные результаты являются репрезентативными: обычно наблюдают восемь пиков пептидов, из которых 3 основных пика имеют величину Κι = 17,79, 19,7, 23,02, и 5 более слабых пиков с величинами Κΐ = 12,68, 14,96, 16,50, 21,9 и 25,1, причем данные величины Κΐ соответствуют молекулярным массам 2764, 1697, 1880, 2616, 3217, 2333, 1677 и 1669 Да соответственно. Для Κΐ 17,79 (соответствующему 2764 Да) основной пик пептида, состоящего из 23 аминокислот, которые представляют аминокислоты 1-23 ос81 казеина, имеет последовательность ΚΡΚΗΡΙΚΗρΘΕΡρΕνΕΝΕΝΕΕΚΕ (8Е() Ш ΝΟ: 16, см. Мс8луеепу е! а1., 1993, ίΕίά., для пептидной последовательности ос81 казеина). Другие пептиды соответствуют положениям 208-224 β-казеина, положениям 16-37 казеина ос81 и положениям 197-222 ос82 подобного казеинового предшественника. Присутствуют также и другие пептиды.
Синтетические пептиды, полученные из казеина.
Пептиды, с возрастающей длиной цепочки, соответствующие Ν-концевым 8-26 аминокислотам ос81 казеина, были синтезированы МоУейбе ШсЕ, Найа, 1згае1, со степенью чистоты >95% (ВЭЖХ). Контроль качества включает ВЭЖХ, масс-спектрометрию (ΕΙ), анализ аминокислот и содержания пептидов. В представленной ниже табл. 3 приведены указанные пептиды.
Таблица 3
Обозначение Последовательность (Ν-конец-С-конец) № аминокислот Послед.Ю Νο:
X ΚΡΚΗΡΙΚΗ 8 1
Υ ΚΡΚΗΡΙΚΗζ) 9 2
1А ΡΡΚΗΡΙΚΗΟΟ 10 3
2А КРКНР1КН0ОЬ 11 4
ЗА ΚΡΚΗΡΙΚΗΰΟΤΡ 12 5
А ΗΡΚΗΡΙΚΗ0ΟΤΡ0 13 6
В КРКНР1КН0СЬР0Е 14 7
С ΚΡΚΗΡΙΚΗΟΟΠΡΟΕν 15 8
Ц КРКНРIкнось РОЕУЬ 16 9
Е ΕΡΚΗΡΙΚΗΟΟΙιΡΟΕνίιΝ 17 10
Г РРКНР1КН0СЬР0ЕУШЕ 18 11
С ΚΡΚΗΡΙΚΗΟΟΣΡΟΕνΕΝΕΝ 19 12
Н КРКНР1КН<2СЬР0Е7ШЕЦЬ 20 13
I ΚΡΚΗΡΙΚΗΟΟΙ,ΡαΕνί,ΝΕΝΙΦ 21 14
σ КРКНР1КН0СЬР0ЕУШЕЦЬЬК 22 15
к КРКНРТКНОСЬРОЕУЬЦЕЦЬШГ 23 16
-20007217
ь КРКНР1КНОСЬРОЕ7ЬЦЕЦШКЕЕ 24 17
и КРКНРГКНОСЬРОЕУЬЦЕЦЪЬКЕЕУ 25 18
N КРКНРТКНОСЬРОЕУЬЦЕЦШКГГУА 26 19
Ювенильный (тип I, ΙΌΌΜ) диабет у диабетических мышей без ожирения (ΝΟΌ).
ΝΟΌ мыши представляют обычно используемую модель для исследования аутоиммунных заболеваний и ювенильного диабета человека. Шестинедельные самки ΝΟΌ мышей получают либо одну, либо две инъекции в неделю по 100 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, всего в течение 5 или 11 раз. Контрольным мышам инъекции не проводят. Степень заболевания определяют по глюкозурии, которую измеряют, используя СотЫ ГезГ зйскз [Огозз, Ό.Ι. е! а1. (1994), 01аЬе1о1о§у, 37:1195]. Результаты выражают как процент мышей без глюкозурии для каждого из образцов в течение периода в 230 дней.
Стимулирование пролиферации натуральных киллерных (ΝΚ) клеток.
Из периферических стволовых кровяных клеток человека (РВ8С): РВ8С от О-С8Р-обработанных субъектов разделяют на градиенте фиколла, дважды промывают средой ΚΡΜΙ-1640 и высевают в 1,5 мл лунки без пептидов или с пептидами, полученными из нативного казеина, или пептидами, полученными из синтетического казеина, как указано (0-500 мкг/мл). После двух дней инкубирования клетки анализируют на природную киллерную активность, измеряя радиоактивность, выделенную из 358-меченых К562 клеток-мишеней (ΝΕΟ-709Α, 185,00 МБк, 2,00 мКи ΕΑ8ΥΤΑΟ111 метионин, Б-[358] 43,48 ΤΒς на ммоль, 1175,0 Кюри на ммоль, 0,488 мл, Воз1оп и$А). Две концентрации эффекторных клеток (2,5 х 104 и 5 х 104 клеток на лунку) инкубируют с 5 х 103 клеток-мишеней на лунку (отношения эффекторные клетки: клетки-мишени составляют 50:1 и 100:1 соответственно) в планшетах для культуры тканей с 11образными лунками. Клетки инкубируют в течение 5 ч при 37°С в смеси 5% СО2, 95% воздуха, и осаждают пятиминутным центрифугированием со скоростью 1000 об./мин. Выделение 358 измеряют в 50 мкл образцах надосадочной жидкости.
Из клеток мышиного костного мозга (ВМ).
Костный мозг отбирают у необработанных мышей ВАБВ/с и С57В1/6. Костный мозг отбирают из длинных костей передних и задних лап мышей, вводя среду, используя иглы 25 размера. Отсосанные клетки промывают ΚΡΜΙ 1640, подсчитывают в гемоцитометре и витально окрашивают (20 мкл клеток в 380 мкл уксусной кислоты-трплановый синий), затем высевают в культуральные склянки в концентрации 2-5 х 10б клеток/мл в среду ΚΡΜΙ-1640, содержащую 10% фетальной телячьей сыворотки, антибиотики и глутамин с добавлением или без добавления 100 мкг пептидов, полученных из нативного казеина. Культуры клеток инкубируют в смеси 5% СО2, 95% воздуха в течение 12-15 дней при 37°С, собирают десятиминутным центрифугированием при 1500 об./мин, подсчитывают и высевают в И-образные лунки с 51Сг (хром-51, 740 МБк, 2,00 мКи активность) или 35δ (ΝΕΟ-709Α, 185,00 МБк, 2,00 мКи ΕΑ8ΥΤΑΟ111 Метионин, Б-[358] 43,48 ΤΒς на ммоль, 1175,0 Кюри на ммоль, 0,488 мл, Βοδΐοη И8А) мечеными клетками мышиной лимфомы (ΥΑΟ) при отношении эффекторные клетки:клетки-мишени либо 25:1, либо 50:1. ΝΚ активность выражают как процент радиоактивности в не содержащих клеток надосадочных жидкостях.
Пролиферация человеческих клеток в культуре.
Периферическую кровь (РВ) отбирают у здоровых или больных пациентов. Больным пациентам не вводят ничего, кроме О-С8Р перед плазмофорезом. Клетки костного мозга (ВМ) отбирают у здоровых добровольцев или больных пациентов с ремиссией после химиотерапии путем инъекции в медуллярное пространство и отсасывания. Пуповинную кровь отбирают в процессе нормальных родов. Клетки человека, различного происхождения, выделяют с помощью градиента фиколла, дважды промывают средой ΚΡΜΙ-1640 и высевают в 0,2 мл плоскодонные культуральные планшеты, в указанных концентрациях с добавлением или без добавления пептидов, полученных из нативного казеина, или с добавлением или без добавления пептидов, полученных из синтетического казеина, как указано. Все обработки, включая контрольные, повторяют трижды. Клеточную пролиферацию определяют, добавляя радиоактивный тимидин [тимидин(метил-[3Н]). Удельная активность 6,7 Кюри на мл 37 МБк на мл, ΙΟΝ Согр.] после инкубирования в течение указанного количества дней. Клетки инкубируют в течение 16-20 ч с меткой, собирают и дважды промывают средой.
Включенную радиоактивность измеряют с помощью β сцинтилляционного счетчика.
Пролиферация клеточных линий лейкоза К562 и рака толстой кишки.
Клеточные линии рака толстой кишки и лейкоза К526 являются распространенными линиями злокачественных клеток, выращиваемых в культуре. Обе клеточные линии выращивают в культуральных флаконах в атмосфере, состоящей из 5% СО2, 95% воздуха, при 37°С, собирают и промывают средой перед посевом в лунки для культуры тканей в количестве 4 х 105 клеток (К562) или 3 х 103 клеток (раковые клетки толстой кишки) на лунку. Пептиды, полученные из нативного казеина, добавляют в лунки в указанных концентрациях, и после 9 (К562) или 3 (толстая кишка) дней инкубирования добавляют меченый тимидин, как указано выше. Сбор и измерения захваченной радиоактивности осуществляют указанным выше способом.
-21 007217
Определение ΝΚ и Т клеточной пролиферации стволовых кроветворных клеток в периферической крови (РВ8С) человека с помощью флуоресцентных антител:
Стволовые клетки периферической крови (РВ8С) от пациентов, которым вводили С-С8Е, собирают с помощью плазмофореза, разделяют, используя градиент фиколла, дважды промывают средой КРМ11640, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку, и инкубируют в культуральных бутылях при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02 и 95% воздуха, с добавлением или без добавления пептидов, полученных из нативного казеина в указанных концентрациях. После 10, 14 или 28 дней инкубирования с пептидами, полученными из нативного казеина, наличие Т клеток (ί.Ό3 поверхностный антиген) и ΝΚ клеток (СИ56 поверхностный антиген) определяют с помощью прямой иммунофлуоресценции, используя анти-СИ3 флуоресцентное антитело (СЭ3/Е1ТС клон ИНСТ1), анти-СИ56 флуоресцентное антитело (СИ56/КРЕ клон МОС-1) (0А1<0 А/8, Эсптагк) и мышиные 1дС1/КРЕ и 1дС1/Е1ТС антитела в качестве контроля. Детектирование флуоресцентно меченых клеток осуществляют, используя сортировку по флуоресцентно активированным клеткам (ЕАС8) и флуоресцентную микроскопию.
Стимулирование кроветворения в клетках костного мозга (ВМ) в культуре.
Пролиферация мегакариоцитов в мультипотенциальных колониях (СЕИ-СЕММ) из мышиных клеток костного мозга.
Первичные клетки костного мозга (1 х 105 на мл), полученные от 8-12 недельных С8Н/Не1 мышей, выращивают на не содержащей сыворотки среде метилцеллюлоза-ГМЭМ в течение 8-9 дней в атмосфере, содержащей 5% С02 и 95% воздуха, при 37°С. Среда, подходящая для выращивания мультипотентных колоний (СЕИ-СЕММ), содержит 1% В8А (81дта), 10-4 М тиоглицерина (81дта), 2,8 х 10-4 М трансферрина человека (ТЕ, Вю1одюа1 шйизйтев, Пгае1), 10% \УЕН1-СМ в качестве источника 1Ь-3, и 2 ед/мл эритропоэтина (г11ЕР0. К & И 8у§1ет8, М1пиеаро118). Колонии оценивают, спустя 8-9 дней, используя темнопольный микроскоп 01утри8. Их отбирают микропипеткой, цитоцентрифугируют и окрашивают МауСгиита1й-С1ет8а для дифференциального подсчета. Для каждого препарата подсчитывают по крайней мере 700 клеток.
Пролиферация клеток, образующих мегакариоциты и эритроиды из костного мозга и кровяных клеток спинного мозга человека.
Образец костного мозга, полученный от видимо здорового человека, разделяют, используя градиент плотности на Н|81орас.|ие-107 (81дта И1адио811С8), в результате чего получают очищенную популяцию мононуклеарных клеток (ΜNС). Анализ колоний осуществляют в среде для чашек Петри, содержащей конечную концентрацию 0,92% метилцеллюлозы (4000 сеиРтразе порошок, 8щта И1адио8рс), снова растворяют в среде Дюльбекко, модифицированной Исковым, содержащей 36 мМ бикарбоната натрия (С1Ьсо), 30% фетальной телячьей сыворотки (ЕВ8) (Нус1оие), 0,292 мг/мл глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 0,01 мл стрептомицина (Вю1ощса1 ШйизРтез, Вей Наетек). Кровь, взятую из пуповины здоровых новорожденных, собирают и обрабатывают указанным выше способом.
Среду для анализа колоний, содержащую 105 МКС в мл, высевают в 24-луночные культуральные планшеты (в трех экземплярах) (Сгетег), по 0,33 мл на лунку. Культуры инкубируют при 37°С, в атмосфере, содержащей 5% С02 и 95% воздуха, при 55% относительной влажности без пептидов или с пептидами, полученными из нативного казеина, или пептидами, полученными из синтетического казеина в указанных концентрациях. Планшеты анализируют спустя 14 дней, подсчитывая колонии, содержащие более 50 клеток. Мегакариоциты идентифицируют с помощью косвенной иммунофлуоресценции, используя высокоспецифичные кроличьи антитела, распознающие гликопротеины тромбоцитов человека, и Е1ТС-конъюгированный козий антикроличий 1§С. Добавленные факторы роста включают 15 нг/мл 1еисотах (СМ-С8Е) (8апйох Рйагта) и 5% (об./об.) индуцированную фитогемагглютинином-т человека (И1Есо ЬаЬ), кондиционированную среду (СМ) для индуцирования развития гранулоцит-моноцитных колоний (СЕи-СМ). Для индуцирования образования эритроидных колоний добавляют эритропоэтин (ЕРО) в количестве 2 ед/мл.
В другом варианте клетки костного мозга человека, полученные от добровольцев-доноров или пациентов, которые претерпели аутологичную трансплантацию костного мозга, предварительно культивируют в среде, содержащей 10-1000 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, культуру ведут на полутвердом агаре и подсчитывают гранулоцитарно-макрофагальные кроветворные колонии (СМСЕИ) на 7 или 14 день после обработки.
Мегакариоцитопоэз оценивают для нормальных клеток костного мозга, полученных от здоровых добровольцев-доноров, либо подсчитывая число мегакариоцитов в образцах жидких культур (КРМ1-1640 плюс 10% АВ сыворотка человека, глутамин и антибиотики) без добавления или с добавлением 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, или с помощью метилцеллюлозного анализа для оценки образования колоний. 2 х 105 клеток костного мозга высевают в присутствии стандартной комбинации факторов роста без добавления или с добавлением пептидов, полученных из нативного казеина. В метилцеллюлозном анализе мегакариоциты подсчитывают с помощью инвертированного микроскопа на 12-14 день после посева.
Клинические исследования с использованием пептидов, полученных из нативного казеина.
- 22 007217
В одной из серий исследований единичную дозу, содержащую 50 мг пептидов, полученных из нативного казеина, вводят внутримышечно пациенту 3 порциями в течение 2 ч. Клинические параметры контролируют с указанными интервалами. В других исследованиях пациенты с различными стадиями лечения и/или ремиссии по поводу раковых заболеваний и метастазов получают пептиды, полученные из нативного казеина, один или два раза, при этом осуществляется контроль за изменениями количества клеток в периферической крови.
Ιη νΐίτο ингибирование ВИЧ клеток лимфоцитами человека.
Пептиды. Пептиды (либо пептиды, полученные из нативного казеина, либо синтетические пептиды (состоящие из 8-26 аминокислот, см. табл. 3, полученные из казеина), поставляемые в виде лиофилизированного порошка, снова суспендируют в полной среде КРМ1 и добавляют в клеточные культуры в конечных концентрациях от 50 до 1000 мкг/мл.
Клетки. Известно, что несколько типов свежевыделенных клеток человека (первичные клетки) и клеточных линий восприимчивы ίη νΐίτο к ВИЧ-1 инфекции, хотя в основном любая клетка, даже с низким уровнем содержания на поверхности СИ4 молекул, может рассматриваться как потенциальная мишень для ВИЧ-1 инфекции. Были выбраны две обычно используемые клеточные линии человека, которые проявляют высокую чувствительность к ВИЧ-1 инфекции, СЕМ и 8ир-Т1.
СЕМ представляет Т4-лимфобластоидную клеточную линию человека, полученную вначале С.Е. Ео1еу с1 а1. [(1965), Сапсег 18:522] из периферической крови лейкоцитарной пленки 4-летней кавказской девочки с острым лимфобластным лейкозом. Данные клетки постоянно поддерживались в суспензии в среде и были использованы для анализов инфекционной способности, противовирусных агентов и нейтрализующих антител.
8ир-Т1 представляет Т-лимфобластоидную клеточную линию человека, полученную из плевральной жидкости 8-летнего мальчика с неходжкинской Т-клеточной лимфомой [8тйЬ, 8.Ό. е1 а1. (1984) Сапсег Векеагсй 44:5657]. Данные клетки экспрессируют высокие уровни поверхностных СИ4, и их удобно использовать при изучении слияния клеток, цитопатического эффекта и инфекционной способности ВИЧ1. Культуру 8ир-Т1 клеток ведут в суспензии в обогащенной среде.
Среда. Клетки выращивают в полной среде КРМ1-1640, обогащенной 10% фетальной телячьей сывороткой, 2 мМ глутамина и 2 мМ пенициллин-стрептомицина (С1ВСО).
Вирус. В качестве ВИЧ вирусного штамма используют ВИЧ-1111В, исходно обозначавшийся как НТЬУ-ШВ.
Концентрированные культуральные жидкости периферической крови, полученной от нескольких пациентов со СПИД или родственными заболеваниями, используют для установления постоянной продуктивной инфекции в Н-9 клетках. Данный подтип В вируса обладает высокой способностью реплицироваться в Т-клеточных линиях человека. Титр вируса составляет 5,38 нг/мл в исходном растворе.
Е1ТС-меченые пептиды.
Используют Е1ТС Е-1300 (Флуоресцеин изотиоцианат, изомер I, 81дта (Е25о-2) 81. Ьоищ, ΜΙ, И8А) с максимумами возбуждение/испускание при около 494/520 нм, соответственно. Аминореакционноспособное производное флуоресцеина является, вероятно, наиболее общим реагентом, обеспечивающим получение флуоресцирующего производного для ковалентно меченых белков. Конъюгированные с Е1ТС пептиды, полученные из нативного казеина, получают ковалентным связыванием Е1ТС с аминогруппами лизина.
Анализ захвата антигена ВИЧ-1 Р24.
Используют набор для анализа захвата ВИЧ-1 Р24 антигена, созданный для количественного определения ВИЧ-1 Р24 ядерного антигена, что прямо пропорционально степени продуцирования вируса в клетках. Данный набор поступает из программы вакцинации СПИД 8А1С-ЦС1-Еге<1епск Сапсег Векеагск [пьШШе, Р.О. Вох В, Егедепск, Μ.Ό 21702, И8А и включает 96-луночные планшеты, покрытые моноклональным антителом к ВИЧ-1 Р24, первичную антитело-кроличий анти-ВИЧ Р24 сыворотку, вторичное козий анти-кроличий-1дС (Н+Ь) конъюгированное с пероксидазой антитело, систему ТМВ пероксидазного субстрата и подвергнутый лизису ВИЧ-1 Р24 стандарт. Анализ захвата ВИЧ-1 Р24 антигена осуществляют с помощью считывающего на длине волны 450 нм устройства Огдапоп-Тесйшса ЕЫ8А геадег, используя сравнение на длине волны 650 нм.
ЕЫ8А захвата антигена ВИЧ-1 Р24.
ВИЧ инфицирование измеряют с помощью косвенного ферментного иммуноанализа, в котором определяют ВИЧ-1 Р24 ядерные антигены в среде для культуры тканей. Надосадочную жидкость культуры тканей подвергают взаимодействию с первичным кроличьим анти-ВИЧ-1 Р24 антигеном и визуализируют, используя конъюгированный с пероксидазой козий анти-кроличий 1дС, причем интенсивность возникающей окраски пропорциональна количеству ВИЧ-1 антигена, присутствующего в надосадочной жидкости культуры тканей.
Уровень биологической безопасности (ВЬ-3) лаборатории.
Все процессы получения и выделения вирусов, инфицирования вирусами, процесс культивирования ВИЧ-1 инфицированных клеток, сбор надосадочной жидкости, содержащей Р24 антиген, и ЕЫ8А захва
- 23 007217 та Р24 антигена, осуществляли в условиях ВЬ-3 НсЬгс\у υηίνβΓδίίγ, Набаккай Меб1са1 δοϊιοοί и проводились в соответствии с практикой биобезопасности, указанной в ΝΙΗ и СЭС (υδΑ).
Проточная цитометрия.
Сортировщик клеток РЛС8ой (ВесЮн & ΌκΚίηκοη. 8ап 1оке, СА. υδΑ) использовали для (1) определения процента 0Ό4 позитивных СЕМ и кир-Т1 клеток перед их инфицированием ВИЧ-1 для подтверждения существования одинаковых степеней инфицирования в каждом из экспериментов; и (ίί) определения Т клеток, которые содержат Р1ТС-конъюгированные пептиды, полученные из нативного казеина, в своей цитоплазме и ядрах.
Инкубатор с СО2.
Для получения клеток вирусных культур с ВИЧ-1, клетки и вирусы, предварительно обработанные пептидами, полученными из нативного казеина, и клетки, которые затем инкубируют с ВИЧ-1, все содержались во влажной атмосфере СО2 на протяжении всего эксперимента.
ВИЧ инфицирование культивируемых ΟΌ4. клеток человека.
Клетки (СЕМ, 8ир-Т1) предварительно инкубируют с несколькими возрастающими концентрациями пептидов, полученных из нативного казеина (50-1000 мкг/мл), или синтетических пептидов, полученных из казеина (10-500 мкг/мл), в течение 3, 24 (для синтетических и нативных пептидов) и 48 (только для нативных пептидов) ч, и после этого в каждую лунку добавляют ВИЧ-1ШВ (45 пг/мл конечная концентрация). ВИЧ-1ШВ предварительно инкубируют с пептидами в течение 3 ч, а затем добавляют к клеткам (5000 клеток/лунка) в планшеты для культуры тканей. В качестве контроля используют ΙΡ (инфицированные клетки, культивируемые с ВИЧ-1 и без пептидов), υΐΡ (не инфицированные клетки, культивируемые с ВИЧ-1 и без пептидов) и υΐΡ + 011 (неинфицированные клетки + пептиды, полученные из нативного казеина, причем, клетки культивируют в присутствии пептидов, полученных из нативного казеина, {50-1000 мкг/мл}) для проверки действия пептидов, полученных из нативного казеина, и синтетических пептидов, полученных из казеина, на жизнеспособность и рост клеток. Жизнеспособность и степень пролиферации клеток определяют на 7, 10 и 14 день после инфицирования (день сбора надосадочной жидкости с культуры Р24 антигена). Клетки и надосадочные жидкости культуры тканей (среду) собирают и немедленно подвергают лизису в 1/10 объема 10% Τήΐοη Х-100. Затем образцы инкубируют при 37°С в течение 1 ч и хранят при -80°С до момента тестирования на р24 антиген.
Конфокальная микроскопия.
Для определения проникновения Р1ТС-конъюгированных пептидов в клетки используют конфокальную лазерную сканирующую систему 2е1кк Ь8М 410, соединенную с инвертированным микроскопом ТА 2е155 АхюуеП 135М, в котором использована техника лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Т клетки инкубируют с Р1ТС-конъюгированными пептидами, полученными из нативного казеина, в инкубаторе с атмосферой, содержащей 5% СО2 и 95% воздуха, при 37°С, после чего клетки трижды промывают забуферированным фосфатом солевым раствором (ΡΒδ) для удаления не связанных Р1ТС-пептидов. Клетки фиксируют 3,8% формалином в течение 10 мин, дважды промывают ΡΒδ и снова суспендируют в 50-100 мкл ΡΒδ перед наблюдением клеток под микроскопом. Выбранные изображения клеток для различных времен инкубирования (15 мин, 30 мин, 1 ч, 1,5 ч и 3 ч), которые демонстрируют различные количества Р1ТС-пептидов, полученных из нативного казеина в их цитоплазме и ядрах, хранят на 3,5 дюймовых дискетах (230 МВ), и для получения изображений используют программное обеспечение ΡΗοΙοκΗορ.
Тест на включение [3Н]-тимидина.
Для того чтобы определить влияние пептидов, полученных из нативного казеина, на пролиферацию Т клеток несколько концентраций пептидов, полученных из нативного казеина, (исходная концентрация 1 мкг/мл в КРМ1) добавляют к διψ-Ή клеточным культурам в 96 микролуночном плоскодонном планшете (5000 клеток/лунка), как описано для ВИЧ-1 инфицирования в διψ-Ή клетки. Клетки подсчитывают и определяют их жизнеспособность с помощью исключения трипанового синего. Их импульсно метят [3Н]тимидином в определенные моменты времени (3, 7, 10 и 14 дней) в течение 18 ч (в течение ночи) и собирают на фильтры из стекловолокна для измерения радиоактивности (включение [3Н]-тимидина в клеточную ДНК пропорционально степени клеточной пролиферации).
Токсичность пептидов, полученных из нативного казеина, для нормальных, миелоаблативных и мышей, и морских свинок с трансплантатами.
Внутримышечными или внутривенными инъекциями нормальным животным вводят в одной дозе или в трех дозах, вплоть до 5000 мг пептидов, полученных из нативного казеина на кг веса животного. Используют различные штаммы, включая мышей ВАЬВ/с, С3Н/Не1 и не тучных диабетических (ΝΟΌ). Мышей наблюдали либо в течение 10 месяцев перед забоем и исследовали посмертно (анализ токсичности), либо наблюдают в течение 200 дней (степень выживания). Морским свинкам вводят однократно с помощью внутримышечной инъекции 20 мг пептидов каждому животному. Через 15 дней их забивают и исследуют на предмет патологических изменений.
Восстановление лейкоцитов и тромбоцитов у мышей с трансплантированным костным мозгом.
Мышей ВАЬВ/с облучают летальной дозой из источника, расположенного на расстоянии 70 см от кожи, дозой 50 сГй в минуту, всего до 600 сГй. Облученных животных восстанавливают сингеничным
- 24 007217 костным мозгом как указано выше и внутривенно вводят спустя 24 ч 1 мг/животное пептидов, полученных из нативного казеина, синтетических пептидов, полученных из казеина (13-26 аминокислот, см. табл. 3 выше), или альбумин сыворотки человека (контроли), с последующим двойным слепым исследованием. Восстановление лейкоцитов определяют в соответствии с количеством клеток в периферической крови, отобранной в указанные временные интервалы от 6 до 12 дней после обработки. Восстановление тромбоцитов определяют по количеству клеток в крови отобранной из ретроорбитального сплетения, в гепаринизированные капилляры, в указанные временные интервалы с 6 по 15 день после обработки.
В дополнительной серии экспериментов СВА мышей облучали летальной дозой (900 сГй), восстанавливали и обрабатывали пептидами, полученными из нативного казеина, или альбумином сыворотки человека, как указано выше. Восстановление тромбоцитов определяют, как указано выше.
Восстановление мышей с трансплантатами костного мозга.
Мышей С57/В1аск/6 облучают летальными дозами из источника, расположенного на расстоянии 70 см от кожи, дозой 50 сГй в минуту, всего 600 сГй. Облученных мышей восстанавливают сингеничным костным мозгом от мышей, которых либо обрабатывали за день до отбора костного мозга 1 мг/животное пептидов, полученных из нативного казеина, либо вовсе не обрабатывали, с последующим двойным слепым протоколом. В одном эксперименте за выживанием мышей следили 18 дней. В другом эксперименте мышей забивали через 10 дней и оценивали колонизацию селезенки.
Экспериментальные результаты.
Пептиды, полученные из нативного казеина. Исходя из наблюдения, что свернувшееся молоко часто тормозит рост бактерий, из молочного белка выделяют казеиновые фрагменты, обладающие бактерицидными свойствами (Ипйсб 81а1с5 Ра1сп1 Νο. 3764670 ίο 1<а1хйка1с11а15ку. с1 а1.).
Сырые пептиды, полученные в результате протеолиза нативного казеина, получают в результате кислотного осаждения растворимой фракции протеолитического гидролизата казеина, диализа и лиофилизации. При тестировании на биологическую активность после длительного хранения было отмечено, что такой сырой препарат, после лиофилизации и хранения при 4°С сохраняет активность (как ίη νίίΓο, так и ίη νίνο), по крайней мере, в течение 12 месяцев.
Для идентификации активных пептидов, содержащихся в пептидов, полученных из нативного казеина, лиофилизованный сырой препарат фракционируют, используя высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), как было указано выше. Все проанализированные лиофилизированные образцы продемонстрировали одинаковые профили времен удерживания, и содержание их соответствовало указанному выше.
Так, основным компонентом препарата сырых пептидов, пептидов, полученных из нативного казеина, является Ν-концевой фрагмент казеина «81.
Пептиды, полученные из нативного казеина, не токсичны для грызунов и людей.
Интенсивные исследования кратковременных и длительных эффектов высоких доз пептидов, полученных из нативного казеина, на мышей, морских свинок и людей-добровольцев подтвердили отсутствие токсичности, тератогенности или вредных побочных эффектов препарата. В одной серии тестов разовую дозу, представляющую 1750- и 12500-кратное превышение установленной эффективной дозы пептидов, полученных из нативного казеина, вводят внутримышечно облученным летальной дозой радиации мышам с сингеничными трансплантатами костного мозга. Стандартные посмертные исследования патологических изменений у данных мышей не выявили эффектов токсичности на внутренних органах или других аномалий. Аналогичные тесты на токсичность для морских свинок не выявили аномалий через две недели после введения разовой дозы 20 мг пептидов, полученных из нативного казеина, введенной внутримышечно. В другой серии экспериментов высокие дозы пептидов, полученных из нативного казеина, введенные здоровым мышам, не оказали влияния на ряд гематологических параметров, которые определяли спустя две недели, включая белые кровяные клетки (АВС), красные кровяные клетки (КВС), гемоглобин (НОВ), электролиты, глюкозу и другие. В третьей серии тестовых экспериментов повторяющиеся высокие дозы в 100 мг/кг веса, которые вводили мышам и крысам, в течение двух недель, не выявили аллергических, замедленных кожных или анафилактических реакций и никаких патологических эффектов при посмертных исследованиях. При тестировании пептидов, полученных из нативного казеина, в отношении их влияния на длительность выживания облученных, с восстановленным костным мозгом, мышей ВАЬВ/с и С3Н/Нс1, длительность выживания обработанных мышей (18 из 27 ВАЬВ/с и СЗН/НеР 66%) очевидно превышала длительность выживания обработанных альбумином контрольных животных (4 из 26 ВАЬВ/с и С3Н/Нс1; 15%). Стандартные тесты на тератогенность [для подробностей см., например, Эгид 8аГс1у ίη Ргсдпапсу, Ро1Ь апб Эаксх, р. 336, Е15с\зсг; Атйсгбаш, №νΥοΑ, ОхГогб (1990)] на мышах, обработанных пептидами, полученными из нативного казеина, не выявили влияния пептидов ни на какие параметры развития.
Аналогично отсутствию токсичности или побочных эффектов в тестах на грызунах, пептиды, полученные из нативного казеина, были также безопасны и при введении людям. Сравнение образцов крови и мочи у семи здоровых добровольцев до инъекции и через 7 дней после внутримышечной инъекции пептидов, полученных из нативного казеина, не выявило никаких изменений ни в каких клинических параметрах. Не наблюдалось также никаких негативных эффектов.
- 25 007217
Таким образом. высокие дозы и длительная обработка грызунов пептидами. полученными из нативного казеина. не выявили видимых токсичных. патологичных. гиперчувствительных. тератогенных. серологических или каких-либо других негативных эффектов. Более того. введение пептидов. полученных из нативного казеина. облученным мышам с риском кратковременных и длительных осложнений. подтвердили заметное пролонгирование выживания в течение 200-300 дней. Все это и отсутствие какихлибо нежелательных эффектов в тестах на здоровых добровольцах. которым вводили инъекции пептидов. полученных из нативного казеина. четко продемонстрировало безопасность данных пептидов при парэнтеральном введении.
Восстановление костного мозга трансплантатами у мышей-реципиентов.
Когда мышей С57/В1аск/6 облучили летальными дозами радиации и восстанавливали сингеничным костным мозгом от мышей. которых либо обрабатывали. либо не обрабатывали дозой 1 мг/животное пептидами. полученными из нативного казеина. за день до аспирации костного мозга. выживание облученных мышей. которым ввели костный мозг от обработанных мышей. значительно превосходило выживание облученных мышей. которым ввели костный мозг от необработанных мышей (выживание облученных мышей. которым ввели костный мозг от обработанных мышей составило 15 из 18 через 10 дней после облучения; тогда как выживание облученных мышей. которым ввели костный мозг от необработанных мышей. составило 4 из 17 через 10 дней после облучения). Селезенки облученных мышей. которым ввели костный мозг от обработанных мышей. содержали в два или три раза больше колоний на селезенку. нежели содержали селезенки облученных мышей. которым ввели костный мозг от необработанных мышей (1-5 колоний по сравнению с 0-3 колониями).
Пептиды. полученные из нативного казеина. стимулируют пролиферацию тромбоцитов.
Природные киллерные (ΝΚ) и цитотоксичные Т клетки являются критическими для способности иммунных систем защищать от вторжения как инфекционных патогенов. так и раковых клеток. как за счет активной цитотоксичности. так и за счет секреции иммунорегуляторых лимфокинов. Иммунный компромисс. такой как при СПИД или после химиотерапии. приводит к ненормальной. ослабленной активности Т или ΝΚ клеток. Если клетки нормального мышиного костного мозга от мышей ВАЕВ/с и С57В1/6 культивируют в присутствии 100 мкг/мл пептидов. полученных из нативного казеина. постоянно наблюдается более чем двукратное усиление лизиса клеток-мишеней (фиг. 1). Аналогичные эксперименты с стволовыми кровяными клетками человека от доноров. обработанных фактором стимулирования колоний гранулоцитов. продемонстрировали еще более значительную. зависящую от концентрации стимуляцию лизиса клеток-мишеней. даже под действием столь малого количества. как 10 мкг/мл пептидов. полученных из нативного казеина (фиг. 2).
В другой серии экспериментов с РΒδС. полученными от здоровых людей-доноров. пептиды. полученные из нативного казеина. стимулируют увеличение количества ΝΚ и Т клеток. которое развивается после 10 (фиг. 3а) и 14 (фиг. 3Ь) дней в культуре. достигая трехкратного и более через 28 дней. Иммуностимулирующий эффект пептидов. полученных из нативного казеина. в отношении РΒδС клеток наиболее заметен у доноров с исходно низкими уровнями Т и ΝΚ клеток (фиг. 3а-Ь). Таким образом. пептиды. полученные из нативного казеина. стимулируют пролиферацию как Т-лимфоцитов. так и натуральных киллерных клеток из предшественников нормальных клеток мышиной и крови человека.
Пептиды. полученные из синтетического казеина. стимулируют пролиферацию человеческих лимфоцитов ίη νίΙΐΌ.
Если пептиды. полученные из синтетического казеина. представляющие первые 1-16 остатков αδ1 казеина. инкубируют с РΒδС клетками человека. полученными от здоровых и больных злокачественными опухолями (см. ниже). наблюдается значительное усиление активности ΝΚ клеток. Наиболее интенсивный лизис наблюдается (от 3- до 5-кратного превышения значений для контроля) в РΒδС культурах клеток от пациентов с неходжкинской лимфомой и раком молочной железы после двух дней инкубирования для столь малой концентрации. как 10 мкг/мл пептидов. содержащих первые 10 или более остатков казеина αδ1 (фиг. 4). В идентичных условиях ни один из тестированных пептидов не продемонстрировал значительного влияния на активность ΝΚ в РΒδС культурах от здоровых людей-доноров. Таким образом. даже низкие концентрации пептидов. содержащих первые 10 остатков Ν-концевой последовательности казеина αδ1. способны селективно стимулировать ίη У1!го пролиферацию лимфоцитов в клетках. полученных от больных злокачественными опухолями.
Стимуляция кроветворения в предшественниках клеток человеческой крови.
Предшественники кровяных клеток дифференцируются в различные клетки крови: макрофаги. моноциты. гранулоциты. лимфоциты. эритроциты и мегакариоциты. Клетки предшественников находятся в изобилии в костном мозге. но также обнаружены в периферической крови после обработки гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (РΒδС клетки) в свежей пуповинной крови. Если возрастающие концентрации (50-600 пг/мл) пептидов. полученных из нативного казеина. добавляют к культурам костного мозга. РΒδС и пуповинной крови человека. отмечается усиление клеточной пролиферации по данным. полученным с включением [3Н]-тимидина (фиг. 5а-6с). Пролиферация РΒδС человека наиболее сильно вызывается концентрацией 300 мкг/мл (фиг. 5а) после 15 дней культивирования. Еще более за
- 26 007217 метный эффект отмечается для клеток пуповинной крови (3-4-кратное усиление по данным включения [3Н]-тимидина) после 14 дней инкубирования (но не после 7 дней) с пептидами, полученными из нативного казеина, (600 мкг/мл, фиг. 5Ь).
Культивируемые клетки костного мозга человека от трех из четырех доноров также сильно реагировали (3-5-кратное увеличение включения) на пептиды, полученные из нативного казеина (300 мкг/мл) после 21 дня инкубирования (фиг. 5с). Таким образом, пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют пролиферацию предшественников клеток крови из костного мозга человека, также как и из других источников. Интересно, что инкубирование культивируемых К562 (хронический миелолейкоз) клеточной линии и клеточной линии толстой кишки человека (рак толстой кишки) с высокими концентрациями (вплоть до 500 мкг/мл) пептидов, полученных из нативного казеина, в аналогичных условиях не оказывает влияния на включение [3Н]-тимидина. Таким образом, пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют пролиферацию предшественников кровяных клеток человека, но не рост раковых клеток.
Стимулирование мегакариоцитопоэза пептидами, полученными из казеина.
Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют пролиферацию предшественников мегакариоцитов в культивируемых клетках мышиного костного мозга.
Многоядерные мегакариоциты развиваются в костном мозге из примитивных стволовых клеток, созревают до гигантских клеток и служат источником для тысяч тромбоцитов из одного мегакариоцита. Тромбоциты являются критическим моментом для образования сгустков крови, и тромбоцитопения является основной причиной миелоаблативных состояний (после химиотерапии и радиотерапии).
Первичные культуры клеток костного мозга можно индуцировать для образования колоний СЕИСМ (гранулоцитов и мегакариоцитов), которые служат источниками мегакариоцитов, и колоний СЕИСЕММ (гранулоцитов, эритроидов, макрофагов и мегакариоцитов), содержащих дополнительные типы кровяных клеток. Количество колоний отражает экспансию специфических предшественников, число клеток отражает скорости пролиферации и дифференциальное число клеток отражает то, какие именно типы специфических клеток развиваются [Ра1епкш, Ό. е1 а1. (1990), Мо1. Се1. Вю1. 10, 6046-50]. В культивируемых клетках мышиного костного мозга, инкубируемых с эритропоэтином и ЕЬ-3, добавление пептидов, полученных из нативного казеина, в количестве 25 мкг/мл в течение 8 дней увеличивает количество СЕИ-СЕММ в два с половиной раза по сравнению с контролями, стимулируя трехкратное увеличение относительного числа клеток на колонию в СЕИ-СЕММ. В аналогичных сериях экспериментов добавление пептидов, полученных из нативного казеина, к клеткам костного мозга, инкубируемым с эритропоэтином и кондиционированной средой (см. раздел материалы и методы) стимулирует зависящее от концентрации увеличение процента ранних и поздних мегакариоцитов (15% мегакариоцитов без пептидов, до 50% при 500 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина). Так, восьмидневная обработка пептидами, полученными из нативного казеина, стимулирует значительное увеличение образования и развития мегакариоцитов в первичных культурах мышиного костного мозга.
Синтетические пептиды, полученные из казеина, стимулируют пролиферацию предшественников мегакариоцитов в культивируемых клетках мышиного костного мозга.
Аналогично указанному выше и в аналогичных условиях экспериментов показано, что пептиды, полученные из синтетического казеина, представляющие первые 10 и 11 аминокислот казеина α81. оказывают сильное (более десятикратного) стимулирующее действие на СЕИ-СЕММ пролиферацию в клетках мышиного костного мозга после 8 дней инкубирования. Несколько меньшая, но все-таки заметная стимуляция наблюдается при использовании пептидов, полученных из синтетического казеина, представляющих первые 12-26 аминокислот α81.
Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют мегакарицитопоэз в культивируемых клетках костного мозга человека.
Если 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, добавляют в аналогичных условиях к культурам клеток костного мозга человека от здоровых доноров, образование СЕИ-СМ колоний усиливается с добавлением или без добавления стимулирующих факторов (СМ-С8Е, СМ). Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют также образование колоний эритроидных клеток в присутствии эритропоэтина. Обработка клеток костного мозга человека тромбопоэтином (ТРО) стимулирует образование колоний мегакариоцитов (МК). Добавление 300 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, к клеткам, обработанным ТРО, стимулирует усиление более двукратного (16 колоний на 2 х 105 клеток без пептидов, и 35 колоний на 2 х 105 с пептидами, полученными из нативного казеина) пролиферации МК колоний.
В присутствии дополнительных кроветворных факторов, таких как эритропоэтин, 1Ь-3, 118СБ и АВ сыворотки человека, 14 дней инкубирования с пептидами, полученными из нативного казеина, стимулируют почти трехкратное увеличение СЕЫ-СЕММ колоний из клеток костного мозга человека (158 колоний с добавлением 500 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, 68 колоний с одними только факторами), но оказывает меньшее действие (полуторакратное увеличение) на образование СЕИ-СЕММ в культивируемых клетках пуповинной крови.
- 27 007217
Относительные количества клеток в культивируемых колониях костного мозга и пуповинной крови отражают пролиферацию мегакариоцитных клеток, как реакцию на добавление 25 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина (см. табл. на фиг. 6). Так, инкубирование культивируемых первичных клеток костного мозга и пуповинной крови человека с пептидами, полученными из нативного казеина, стимулирует развитие и пролиферацию как мегакариоцитных, так и эритроидных колоний клеток.
Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют рематопоэз ίη νίνο после облучения и трансплантации костного мозга.
Миелоаблативная терапия может привести к угрожающему жизни уменьшению количества тромбоцитов и лейкоцитов, что может произойти, несмотря на введение кровяных клеток и факторов роста. Нижеследующее демонстрирует действие пептидов, полученных из нативного казеина, после облучения и трансплантации костного мозга.
Пептиды, полученные из нативного казеина, усиливают восстановление лейкоцитов и тромбоцитов после трансплантации сингеничного костного мозга у мышей.
После облучения летальной дозой (600 сГй), с минимально восстановленным костным мозгом, мышам ВЛЬВ/с (η=60) внутривенной инъекцией вводят по 1 мг/мышь пептидов, полученных из нативного казеина, вместе с клетками костного мозга. Отмечается значительное увеличение количества периферических белых кровяных клеток в течение 7-14 дней по сравнению с контрольными мышами, которым вводили альбумин человеческой сыворотки (фиг. 7). Количество тромбоцитов в периферической крови как у обработанных, так и у контрольных облученных мышей, у мышей с трансплантированным костным мозгом было одинаково понижено вплоть до 8 дней после обработки. Однако к девятому дню отчетливое преимущество отмечалось для мышей, которым были введены пептиды, полученные из нативного казеина, а к 13 дню выявилось двукратное увеличение тромбоцитов по сравнению с контрольными мышами, которым вводили альбумин человеческой сыворотки (фиг.8). Таким образом, пептиды, полученные из нативного казеина, усиливают восстановление тромбоцитов и лейкоцитов после трансплантации с ограниченным числом клеток костного мозга. Можно ожидать, что этот эффект будет еще сильнее выражен в плане восстановления при оптимальном, а не ограниченном числе клеток костного мозга.
Синтетические пептиды, полученные из казеина, усиливают восстановление лейкоцитов после трансплантации мышам сингеничного костного мозга.
После облучения летальной дозой (600 сГй) с минимально восстановленным костным мозгом мышам ВЛЬВ/с (η=5 для синтетического пептида, η=10 для контрольной группы) с помощью внутрибрюшинной инъекции вводят 1 мг/мышь синтетических пептидов (13-26 аминокислот в длину, см. табл. 3), полученных из казеина, вместе с клетками костного мозга. Отмечается значительное увеличение количества периферических лейкоцитов в течение от 10 до 14 дней для пептидов с 13 аминокислотами (10 день: 17,2 х 106 кл/дл; 12 день: 65,4 х 106 кл/дл), с 17 аминокислотами (10 день: 27,4 х 106 кл/дл; 12 день: 52,0 х 106 кл/дл) (см. табл. 3) по сравнению с контрольными мышами, которым вводили альбумин человеческой сыворотки (10 день: 16,7 х 106 кл/дл; 12 день: 46,4 х 106 кл/дл). Таким образом, синтетические пептиды, полученные из казеина, усиливают восстановление лейкоцитов после трансплантации с ограниченным количеством клеток костного мозга.
Пептиды, полученные из нативного казеина, ингибируют ίη νίίτο инфицирование лимфоцитных Т клеточных линий ВИЧ-1 вирусом.
Для исследования механизмов иммунной стимуляции и противовирусного действия пептидов, полученных из нативного казеина, восприимчивые 8ир-Т1 и СЕМ культивируемые Т-клетки человека обрабатывают пептидами, полученными из нативного казеина, перед ίη νίίτο инфицированием ВИЧ-1 вирусом. С помощью флуоресцентной микроскопии было выявлено, что НТС-конъюгированные пептиды, полученные из нативного казеина, (100 мкг/мл) проникают в 8ир-Т1 клетки при инкубировании вместе с ними как указано выше (фиг. 9а-£). Небольшие количества меток наблюдаются в цитоплазме клеток через 15 мин (фиг. 9а-Ь). Через 30 мин (фиг. 9с-4) еще больше меток наблюдается в цитоплазме при ограниченном захвате ядер. Начиная с 1 часа после начала инкубирования и далее (фиг. 9е-£), НТС-меченые пептиды, полученные из нативного казеина, наблюдаются в цитоплазме, но большинство их сконцентрировано в ядрах клеток. Анализ 8ир-Т1 клеток с помощью цитометрии в потоке подтвердил усиление захвата меченых пептидов, полученных из нативного казеина, начиная с 5 мин после начала инкубирования.
Пептиды, полученные из нативного казеина, усиливают пролиферацию лимфоцитов.
Присутствие пептидов, полученных из нативного казеина, в культуральной среде, приводит к увеличению количества 8ир-Т1 клеток в течение 14 дней. Наибольшее увеличение количества клеток к 7 дню наблюдается для 50 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина (42%), для 1000 мкг на десятый день (30%) и для 600 мкг (32%) на 14 день инкубирования. Измерение включения [3Н]-тимидина культивируемыми клетками, что дает показатель пролиферации, отражает увеличение количества клеток, причем наиболее сильный эффект наблюдается для 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, на 10 день (фиг. 10). Снижение пролиферации на 14 день, вероятно, отражает избыточный рост клеток и израсходование питательных веществ.
- 28 007217
Синтетические пептиды, полученные из казеина, усиливают пролиферацию лимфоцитов человека.
Присутствие синтетических пептидов, полученных из казеина (все пептиды перечислены в табл. 3), в культуральной среде приводит к увеличению количества 8ир-Т1 клеток в течение 10 дней. Увеличение аналогично для всех синтетических пептидов. Наибольшее увеличение количества клеток в инфицированных клетках наблюдается для 250 мкг/мл пептидов (8 аминокислот - 80%). При 500 мкг/мл пептидов (8 аминокислот - 33%).
Пептиды, полученные из нативного казеина, ингибируют инфицирование ВИЧ-1 клеток лимфоцитов человека.
Восприимчивые СЕМ лимфоцитные клетки, предварительно обработанные пептидами, полученными из нативного казеина (50-1000 мкг/мл) за 3, 24 или 48 ч до инкубирования с ВИЧ-1, демонстрируют усиленную клеточную пролиферацию и пониженные уровни вирусной инфекции по сравнению с необработанными контрольными. Количества клеток и анализ ВИЧ-1 Р24 антигена на 15 день после инфицирования выявили 100% ингибирование вирусной инфекции после 3 ч инкубирования с 600-1000 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, и 98% и 99% ингибирования после 24 ч инкубирования с 50 и 600 мкг/мл пептидов соответственно.
Более длительное время ингибирования не оказалось более эффективным (фиг. 11). Хотя увеличение концентрации пептидов, полученных из нативного казеина, усиливает клеточную пролиферацию через 3 и 24 ч после инфицирования, вирусная инфекция наиболее заметно ингибируется в таких наиболее быстро растущих культурах. Еще более заметное усиление клеточной пролиферации и ингибирование ВИЧ-1 инфекции наблюдается в 8ир-Т1 клетках, предварительно обработанных пептидами, полученными из нативного казеина, перед инфицированием ВИЧ-1 (среднее ингибирование вирусной инфекции составляет 96,7%, 88,7% и 95,7% после 3 ч, 24 ч и 48 ч предварительной обработки соответственно). Таким образом, пептиды, полученные из нативного казеина, проникают в культивируемые клетки лимфоцитов человека и в их ядра, усиливают рост клеток и значительно снижают восприимчивость ί.Ό4+ клеток к ВИЧ-1 инфекции. Ожидается, что пептиды, полученные из нативного казеина, как таковые, могут быть полезны как для профилактики ВИЧ инфекции, так и для лечения после инфицирования ВИЧ инфицированных и СПИД пациентов.
Пептиды, полученные из нативного казеина, предотвращают развитие глюкозурии у диабетических без ожирения (ΝΟΌ) мышей.
У диабетических без ожирения (ΝΟΌ) мышей спонтанно развивается ювенильный (типа I, ΙΌΌΜ) диабет, аутоиммунное состояние, вызывающее воспаление β клеток поджелудочной железы, и заканчивающееся болезнью и смертью. Самки ΝΟΌ мышей крайне восприимчивы, демонстрируя доказательство инвазии макрофагов кусочка ткани поджелудочной железы уже у 5 недельных мышей. Инъекции по 100 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, один или два раза в неделю в течение 5 недель (всего 6 или 11 инъекций) оказались полностью эффективны для профилактики глюкозурии, связанной с началом и течением заболевания. К 200 дню 100% необработанных контрольных мышей (п=5) стали диабетическими, и затем погибли, тогда как обработанные мыши (п=5) остались на 100% эугликемическими, и все еще были живы на 230 день (фиг. 12). Таким образом, пептиды, полученные из нативного казеина, эффективно защитили генетически восприимчивых мышей от возникновения данного аутоиммунного воспалительного состояния.
Клинические исследования пептидов, полученных из нативного казеина.
Пациентам внутримышечными инъекциями вводили по 50 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, каждому, одной или тремя порциями, как указано.
Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют гематопоэз у больных злокачественными опухолями.
Гематологические профили шести больных злокачественными опухолями, которые получили или которые были в процессе получения химиотерапии, исследовали до и после введения пептидов, полученных из нативного казеина, как указано. Особое внимание обращали на изменения значений для тромбоцитов (РЬТ), лейкоцитов (АБС), эритроцитов (ВВС) и гемоглобина (НОВ), характеризующих тромбоцитопоэз, лейкоцитопоэз и эритроцитопоэз соответственно.
О.Т. (пациентка женщина): у пациентки был рак яичников, она подверглась гистерэктомии с последующей химиотерапией. Она получила две внутримышечные инъекции пептидов, полученных из нативного казеина, через два и через два с половиной месяца после операции. Между первым и вторым введением пептидов, полученных из нативного казеина, не проводили никакой химиотерапии. Тесты крови, взятые на 6 день после первой инъекции, на 1 и 13 день после второй инъекции продемонстрировали значительное увеличение содержания тромбоцитов и АВС компонентов, также как и повышение ВВС (фиг. 13).
4Е.С. (пациентка женщина): пациентка подверглась радикальной мастэктомии по поводу лобулярной карциномы в 1983 г, и шесть лет спустя страдала от метастазов в желудке. За три дня до начала химиотерапии она получила одну внутримышечную инъекцию пептидов, полученных из нативного казеина, и вторую через 10 дней после химиотерапии. Хотя показатели крови, взятой на 10 и 16 день после химиотерапии, не показали ослабления подавленного гематологического профиля, что обычно наблюда
- 29 007217 ется после химиотерапии, наиболее значительные эффекты пептидов, полученных из нативного казеина, были отмечены через 3 дня после первой инъекции до начала химиотерапии (фиг. 13).
Е.8. (пациентка женщина): пациентка страдала широко распространенными метастазами карциномы молочной железы, впервые обнаруженной в 1987 г. Два года спустя она получила первую внутримышечную инъекцию пептидов, полученных из нативного казеина, и вторую через 23 дня. На протяжении этого промежутка времени она не получала дополнительного лечения. Тесты крови показали сильное увеличение РЬТ через семь дней после первой инъекции, и значительное увеличение ВВС и АВС через семь дней после второй инъекции (фиг.13).
1.В. (пациентка женщина): у пациентки диагноз рак молочной железы с костными метастазами. Она получила одну внутримышечную инъекцию пептидов, полученных из нативного казеина, за 8 дней до начала химиотерапии и другую - через 14 дней после химиотерапии. Наиболее заметный эффект четко виден по быстрому возвращению АВС уровней после вызванного химиотерапией снижения (фиг.13).
Ό.Μ. (пациентка женщина): у пациентки рак печени, сопровождающийся широко распространенными метастазами. Она получила три внутримышечные инъекции пептидов, полученных из нативного казеина, на 10, 8 и 6 дни до начала химиотерапии. Вторую серию инъекций провели на 10, 12 и 14 дни после химиотерапии. Хотя значительный эффект воздействия на гематологический профиль отмечен после первой серии инъекций и до начала химиотерапии, наиболее резкое улучшение проявляется в быстром возвращении пониженных после химиотерапии значений к нормальным количествам клеток после второй серии инъекций пептидов, полученных из нативного казеина (фиг. 13).
Таким образом, введение пептидов, полученных из нативного казеина, больным злокачественными опухолями приводит к улучшению гематологических профилей, особенно к усилению эритропоэза, лейкоцитопоэза и тромбоцитопоэза, и способно уменьшить и сократить длительность вызванного химиотерапией подавления компонентов крови.
Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют тромбоцитопоэз у реципиентов трансплантатов с устойчивой тромбоцитопенией.
Пролонгированная, невосприимчивая к внутривенным вливаниям тромбоцитопения с эпизодами тяжелого кровотечения, может быть угрожающим жизни осложнением при трансфузии костного мозга, особенно если традиционная терапия оказывается не эффективной.
Двум пациентам с тяжелой резистентной тромбоцитопенией вводят пептиды, полученные из нативного казеина.
М-1 (пациентка женщина): 32-летняя пациентка, страдающая острым миелолейкозом в полной ремиссии, после трансфузии аутологичных стволовых клеток. У нее были два угрожающие жизни эпизода кровотечения, включающие легочное кровотечение и обширную обструктивную гематому мягкого неба. Более чем на 114 день после трансфузии количество тромбоцитов было рефрактивно К тЫЬ-3, тЫЬ-6, внутривенному гамма-глобулину и рекомбинантному эритропоэтину. После одной внутримышечной дозы 50 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, разделенной на три порции, ее состояние немедленно улучшилось. Наряду с быстрым возвращением к нормальному количеству тромбоцитов (фиг.14) прошли кровотечения и петехии нижних конечностей, она смогла начать ходить и вернуться домой заграницу без осложнений или побочных эффектов.
М-2 (пациент мужчина): 30-летний пациент, страдающий острым миелолейкозом, на стадии второй полной ремиссии после внутривенного вливания аутологичных стволовых клеток, демонстрирующий полностью резистентное количество тромбоцитов и обширные эпизоды желудочно-кишечного кровотечения. Ему требовались ежедневные внутривенные вливания порций клеток, у него была развита гипоальбуминемия, и ему не помогло интенсивное лечение тЫЬ-3, тЫЬ-6 и гаммаглобулином. После одной внутримышечной дозы 50 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, введенной тремя порциями, через 86 дней после вливания наблюдается быстрое восстановление тромбоцитов (фиг. 15) и постепенное прекращение кровотечений. Не потребовалось никакого дальнейшего лечения, и пациент в настоящее время полностью асимптоматичен, причем количество тромбоцитов соответствует норме.
Таким образом, один курс внутримышечного введения пептидов, полученных из нативного казеина, в количестве 1 мг/кг веса тела, разделенного на три порции, оказывается эффективным для быстрого восстановления количества тромбоцитов и ослабления сопутствующих клинических симптомов у пациентов с пролонгированной, невосприимчивой к переливаниям тромбоцитопенией с угрожающими жизни эпизодами кровотечениями.
Пептиды, полученные из нативного казеина, снижают содержание триглицеридов и ЬОЬхолестерина при наследственной гиперлипидемии.
Μ.8. (женщина пациентка): пациентка женщина 38 лет с наследственной историей гиперлипидемии. До обработки пептидами, полученными из нативного казеина, химический анализ крови выявил повышенный уровень холестерина (321 мк/дл), триглицеридов (213 мк/дл; при норме 45-185 мк/дл) и повышенный уровень ЬОЬ-холестерина (236,4 мк/дл; при норме 75-174 мк/дл). Через месяц после введения 50 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, в виде трех внутримышечных инъекций, гиперлипидемия стабилизировалась: полное содержание холестерина снизилось до 270 мк/дл, триглицеридов до 165 мк/дл и уровень ЬПЬ-холестерина составил 201 мк/дл, что было все еще выше нормальных значений, но
- 30 007217 ниже значений, которые были до введения пептидов. Не проводилось никакого дополнительного лечения. Таким образом, обработка пептидами, полученными из нативного казеина, оказывается эффективной для быстрого приведения почти к норме пациентов с гиперлипидемией, которая не поддается другому лечению.
Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют нормоглобинемию в случае скрытого кровотечения.
Ό. С. (пациент мужчина): пациент мужчина 75 лет страдает анемией и гипоглобинемией (подавленные КВС, НСВ, НСТ, МСН и МСНС), связанными с интенсивным внутренним кровотечением. Через месяц после внутримышечной инъекции 50 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, тремя порциями, наблюдается значительное уменьшение анемии. Через два месяца КВС достигает нормальных значений (4,32 вместо 3,44 М/мкл), НСВ увеличивается (11,3 вместо 8,9 г/дл) и НСТ, МСН и МСНС все восстанавливаются почти до нормальных значений, несмотря на продолжение внутренних кровотечений.
Таким образом, одна инъекция пептидов, полученных из нативного казеина, способна стимулировать эритропоэз и улучшение состояния у пациентов при анемии, связанной с внутренними кровотечениями.
Очевидно, что некоторые особенности настоящего изобретения, которые для ясности раскрыты в контексте отдельных вариантов, могут быть осуществлены в комбинации в одном варианте. Напротив, различные особенности настоящего изобретения, которые для краткости раскрыты в контексте одного варианта, можно осуществить по отдельности или в любых подходящих подкомбинациях.
Хотя настоящее изобретение было раскрыто в связи с его конкретными примерами, очевидно, что специалисту в данной области будут понятно множество его альтернатив и вариантов. Соответственно следует подчеркнуть, что все такие альтернативы, модификации и варианты, соответствуют сути и входят в объем прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты, патентные заявки и последовательности, определенные регистрационными номерами, упомянутые в настоящем описании, включены в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте, как если бы каждая отдельная публикация, патент, патентная заявка или последовательность были конкретно и индивидуально включены в данное описание в качестве ссылки. Кроме того, цитирование или обозначение любой ссылки в данном описании не следует толковать как допущение того, что такая ссылка отвечает требованию известный уровень техники для данного изобретения.
- 31 007217
Описание последовательностей <1Ю г1де1гоапг Ζνΐ
<12 0> СА5Е1Н ϋΕΚΤνΕϋ РЕРТЮЕЗ ΆΝΟ ОЗЕЗ ТНЕКБОЕ ΙΝ ΤΗΕΚΑΡΥ
<130 01/21676
<150> ТЬ 134,830
<151> 2000-03-01
<160 19
<170> РаЕепЫп уегзхоп 3.0
<210 1
<211> 8
<212> РКТ
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический пептид
<400> 1
Агд Рго Ъуз Нхз Рго Не Ьуз Нхз
1 5
<210 2
<211> 9
<212> РКТ
<213> Искусственная
<220
<223> синтетический пептид
<400> 2
Агд Рго Ъуз Нхз Рго 11е Ьуз Нхз С1п
1 5
<210 3
<211> 10
<212> РКТ
<213> Искусственная
<220
<223> синтетический пептид
<400> 3
Агд Рго Ьуз Нхз Рго Не Ьуа Нхз 61п &1у
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> РКТ
-32007217
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический пептид
<400> 4
Агд Рго Ъуз Н1з Рго Не Ъуз Нхз 61п 61у Ьеа
1 5 10
<210 5
<211> 12
<212> РКТ
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический пептид
<400> 5
Агд Рго Ьуз Щз Рго 11е Ьуз Нхз 61η 61у Беи Рго
1 5 10
<210> 6
<211> 13
<212> РКТ
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический пептид
<400> 6
Агд Рго Ьуз Нхз Рго 11е Ьуз Нхз С1п 61у Ьеа Рго С1п
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<212> РКТ
<213> Искусственная
<220
<223> синтетический пептид
<400> 7
Агд Рго Ъуз Нхз Рго 11е Ъуз Нхз С1п С1у Ъеи Рго С1п С1а
1 5 10
<210 8
<211> 15
<212> РКТ
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический пептид
- 33 007217
Агд Рго Ьуз Нхз Рго Не Ьуз Н1з С1п С1у Ьеи Рго 61η 61« Уа1
1 5 10 15
<210> 9
<211> 16
<212> РКТ
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический пептид
<400> 9
Агд Рго Ьуз ΗΪ5 Рго Не Ьуз ΗΪ5 61п 61у Ьеи Рго 61п 61и Уа1
1 5 10 15
<210> 10
<211> 17
<212> РКТ
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический пептид
<400> 10
Агд Рго Ьуз Нхз Рго Не Ьуз ΗΪ5 С1п 61у Ьеи Рго 61п 61и Уа1
1 5 10 15
Азп
<210> 11
<211> 18
<212> РКТ
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический пептид
<400> 11
Агд Рго Ьуз Н1з Рго Не Ьуз Н1з 1 5 61а 61у Ьеи 10 Рго С1п 61и ν»1 ьеи 15
Азп С1п
<210> 12
<211> 19
<212> РКТ
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический пептид
-34007217 <400>12
Агд Рго Ьуз ΗΪ5 Рго Не Ьуз Н1з С1п Е1у Ьеи Рго 61п 61и Уа1 Ьеи
1015
Азп С1и Азп
<210> 13
<211> 20
<212> РКТ
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический пептид
<400> 13
Агд Рго Ьуз Ηϊδ Рго 11е Ьуз Н1з С1п С1у Ьеи Рго С1п С1и Уа1 Ьеи
1 5 10 15
Азп С1и Азп Ьеи <210>14 <211> 21 <212> РКТ <213> Искусственная <220>
<223> синтетический пептид <400> 14
Агд Рго Ьуз ΗΪ5 Рго 11е Ьуз Н1з С1п Е1у Ьеи Рго С1п 15 10
С1и Уа1 Ьеи
Азп 61и Азп Ьеи Ьеи
<210> 15
<211> 22
<212> РКТ
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический пептид
<400> 15
Агд Рго Ьуз ΗΪ3 Рго 11е Ьуз ΗΪ3 С1п С1у Ьеи Рго С1л б1и Уа1 Ьеи
1 5 10 15
Азп 61и Азп Ьеи Ьеи Агд
-35 007217
<210 16
<211> 23
<212> РКТ
<213> Искусственная
<220> <223> синтетический пептид
<400> 16
Агд Рго Хуз Я1з Рго Т1е Хуз Н1з 61п 61у Хеи Рго С1п 61и Уа1 Ъеи
1 5 10 15
Азп С1и Азп Хеи Хеи Агд РЪе <210 17 <211> 24 <212> РКТ <213> Искусственная <220 <223> синтетический пептид <400>17
Агд Рго Хуз Ηχε Рго Не Хуз Нхз 61п С1у Хеи Рго С1п С1и Уа1 Хеи
1 5 10 15
Азп С1и Азп Хеи Хеи Агд РЪе РПе
20
<210 18
<211> 25
<212> РКТ
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический пептид
<400 18
Агд Рго Хуз Н1з Рго Не Хуз Н±з б1п 61у Хеи Рго сДп 61и Уа1 Хеи
1 5 10 15
Азп С1и Азп Хеи Хеи Агд РЬе РЬе Уа1
25
<210> <211> <212> <213> 19 26 РКТ Искусственная
<220
<223> синтетический
<400> 19
Агд Рго Ъуз Н1з Рго Не Ьуз Нхз С1п С1у Ъеи Рго <31п С1и Уа1 Хеи 15 1015
Азп С1и Азп Хеи Хеи Агд РЬе РЬе Уа1 А1а
2025

Claims (5)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Применение пептидного препарата казеицидина, полученного из природного казеина, для производства лекарственного препарата для индукции гемопоэза.
  2. 2. Применение пептидного препарата казеицидина, полученного из природного казеина, для производства лекарственного препарата для профилактики или лечения нарушений липидного метаболизма.
    -36007217
  3. 3. Применение пептидного препарата казеицидина, полученного из природного казеина, для производства лекарственного препарата для профилактики или лечения диабета.
  4. 4. Применение пептидного препарата казеицидина, полученного из природного казеина, для производства лекарственного препарата для профилактики или лечения вирусной инфекции.
  5. 5. Применение пептидного препарата казеицидина, полученного из природного казеина, для производства лекарственного препарата для способствования трансплантации аутологичного костного мозга или стволовых клеток костного мозга (А8СТ) или трансплантации аллогенного костного мозга (ВМТ) миелоаблативному реципиенту.
EA200401467A 2000-03-01 2001-03-01 Пептиды, полученные из казеина, и их применение в терапии EA007217B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL13483000A IL134830A0 (en) 2000-03-01 2000-03-01 Peptides and immunostimulatory and anti-bacterial pharmaceutical compositions containing them

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200401467A1 EA200401467A1 (ru) 2005-04-28
EA007217B1 true EA007217B1 (ru) 2006-08-25

Family

ID=11073892

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200200820A EA005579B1 (ru) 2000-03-01 2001-03-01 Пептиды, полученные из казеина, и их применение в терапии
EA200401467A EA007217B1 (ru) 2000-03-01 2001-03-01 Пептиды, полученные из казеина, и их применение в терапии
EA200400376A EA007814B1 (ru) 2000-03-01 2002-08-29 Пептиды, полученные из казеина, и их использование в терапии

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200200820A EA005579B1 (ru) 2000-03-01 2001-03-01 Пептиды, полученные из казеина, и их применение в терапии

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200400376A EA007814B1 (ru) 2000-03-01 2002-08-29 Пептиды, полученные из казеина, и их использование в терапии

Country Status (21)

Country Link
US (6) US20020147144A1 (ru)
EP (1) EP1261360B1 (ru)
JP (1) JP2003528827A (ru)
KR (1) KR20030025907A (ru)
CN (1) CN1427725A (ru)
AT (1) ATE451929T1 (ru)
AU (1) AU782662B2 (ru)
BR (1) BR0109027A (ru)
CA (1) CA2401550A1 (ru)
CZ (1) CZ20022915A3 (ru)
DE (1) DE60140794D1 (ru)
DK (1) DK1261360T3 (ru)
EA (3) EA005579B1 (ru)
HU (1) HUP0301003A3 (ru)
IL (2) IL134830A0 (ru)
MX (1) MXPA02008569A (ru)
NO (1) NO20024157L (ru)
NZ (1) NZ521016A (ru)
PL (1) PL361307A1 (ru)
WO (1) WO2001064234A1 (ru)
ZA (1) ZA200206842B (ru)

Families Citing this family (142)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR0212625A (pt) * 2001-08-30 2007-06-19 Chay 13 Medical Res Group N V peptìdeos derivados de caseìna e usos dos mesmos em terapia
WO2003067904A2 (en) * 2002-02-06 2003-08-14 University Of North Carolina At Chapel Hill High-throughput cell identification and isolation method and apparatus
EP1359157A1 (en) * 2002-04-29 2003-11-05 Société des Produits Nestlé S.A. Metallo-proteinase inhibitory agent
KR101188292B1 (ko) * 2002-11-27 2012-10-09 디엠아이 바이오사이언시스, 인크 인산화 증가로 인한 질병 및 증상의 치료방법
GB0313892D0 (en) * 2003-06-16 2003-07-23 Hannah Res Inst Control of lactation
CA2558155A1 (en) * 2004-03-01 2005-09-09 Zvi Sidelman Casein derived peptides and therapeutic uses thereof
BRPI0509541A (pt) 2004-03-30 2007-09-18 Monsanto Technology Llc métodos para controlar agentes patógenos de planta utilizando n-fosfonometilglicina
WO2005099724A2 (en) * 2004-04-13 2005-10-27 Parallel Solutions, Inc. Functionalized water-soluble polyphosphazene and uses thereof as modifiers of biological agents
US9000040B2 (en) 2004-09-28 2015-04-07 Atrium Medical Corporation Cross-linked fatty acid-based biomaterials
EP1811935B1 (en) 2004-09-28 2016-03-30 Atrium Medical Corporation Heat cured gel and method of making
US9012506B2 (en) 2004-09-28 2015-04-21 Atrium Medical Corporation Cross-linked fatty acid-based biomaterials
GB0423352D0 (en) * 2004-10-21 2004-11-24 Hannah Res Inst "Control of mammary cell number"
AU2006242842B2 (en) * 2005-05-02 2011-12-08 Mileutis Ltd. Pharmaceutical compositions comprising casein derived peptides and methods of use thereof
ES2319475B1 (es) * 2005-06-08 2010-02-16 Consejo Superior Investig. Cientificas Peptidos bioactivos identificados en hidrolizados enzimaticos de caseinas lacteas y procedimiento de obtencion.
US11266607B2 (en) * 2005-08-15 2022-03-08 AbbVie Pharmaceuticals GmbH Process for the manufacture and use of pancreatin micropellet cores
US9278161B2 (en) 2005-09-28 2016-03-08 Atrium Medical Corporation Tissue-separating fatty acid adhesion barrier
US9427423B2 (en) 2009-03-10 2016-08-30 Atrium Medical Corporation Fatty-acid based particles
CN101351554B (zh) 2005-10-04 2016-05-18 索利金尼克斯公司 包括通过调节先天免疫治疗和预防感染在内的治疗和预防免疫相关疾病的新型肽
US20070086958A1 (en) * 2005-10-14 2007-04-19 Medafor, Incorporated Formation of medically useful gels comprising microporous particles and methods of use
GB2436328A (en) * 2006-03-22 2007-09-26 Regen Therapeutics Plc Peptide derived from colostrinin
WO2007110296A1 (en) * 2006-03-24 2007-10-04 Unilever N.V. Healthy food product
EP1836906B1 (en) * 2006-03-24 2009-07-01 Unilever N.V. Healthy food product
BRPI0717500A2 (pt) * 2006-10-04 2014-03-25 Inimex Pharmaceuticals Inc Peptídeos para o tratamento e a prevenção de desordens relacionadas à imunidade, incluindo tratamento e prevenção de infecção por modulação da imunidade inata.
JP5592652B2 (ja) * 2007-02-05 2014-09-17 ナショナル ユニバーシティ オブ シンガポール 推定サイトカイニン受容体およびその使用方法
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
US20110004019A1 (en) * 2008-03-12 2011-01-06 Shiseido Company Ltd. Parakeratosis Inhibitor, Pore-Shrinking Agent, Or Rough Skin Inhibiting/Ameliorating Agent, And External Composition For Skin Containing The Same
KR101355695B1 (ko) * 2009-02-06 2014-01-27 더 프록터 앤드 갬블 캄파니 붕괴성 수분-함유 캡슐
US20130195983A1 (en) * 2009-04-10 2013-08-01 Neil P. Desai Nanoparticle formulations and uses thereof
CN105476951A (zh) 2009-05-04 2016-04-13 普西维达公司 多孔硅药物洗脱颗粒
WO2010135324A1 (en) * 2009-05-18 2010-11-25 Monsanto Technology Llc Use of glyphosate for disease suppression and yield enhancement in soybean
GB0912481D0 (en) 2009-07-17 2009-08-26 Reckitt Benckiser Healthcare I Skincare compositions
US20110038910A1 (en) 2009-08-11 2011-02-17 Atrium Medical Corporation Anti-infective antimicrobial-containing biomaterials
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
BR112012015653B1 (pt) * 2009-12-29 2023-09-26 W.R. Grace & Co. -Conn. Composição que compreende um material de sílica particulado poroso e película transparente que compreende a mesma
AU2011212859B2 (en) * 2010-02-04 2014-05-08 Isp Investments Inc. Self adapting polymers for anhydrous sunscreen formulations
MX2012009634A (es) * 2010-02-18 2012-09-28 Athenix Corp Genes delta-endotoxinicos axmi218, axmi219, axmi220, axmi226, axmi227, axmi228, axmi229, axmi230, y axmi231 y metodos para sus uso.
AR080200A1 (es) * 2010-02-18 2012-03-21 Athenix Corp Genes delta-endotoxinicos axmi221z, axmi222z, axmi223z, axmi224z, y axmi225z y metodos para su uso
HUE033056T2 (hu) 2010-03-08 2017-11-28 Monsanto Technology Llc Polinukleotid molekulák génszabályozáshoz növényekben
FR2958155B1 (fr) * 2010-04-02 2012-04-20 Oreal Composition de decoloration comprenant un sel peroxygene dans une base fortement riche en corps gras
WO2011137563A1 (en) * 2010-05-07 2011-11-10 Unilever Plc High solvent content emulsions
JP5957447B2 (ja) 2010-06-04 2016-07-27 モンサント テクノロジー エルエルシー 遺伝子組換えアブラナ事象ｍｏｎ８８３０２および同使用方法
WO2012009707A2 (en) 2010-07-16 2012-01-19 Atrium Medical Corporation Composition and methods for altering the rate of hydrolysis of cured oil-based materials
CN103201388A (zh) * 2010-08-19 2013-07-10 先锋国际良种公司 对鳞翅目昆虫具有活性的新苏云金杆菌基因
US9757374B2 (en) 2010-10-28 2017-09-12 Aequus Pharmaceuticals Inc. Aripiprazole compositions and methods for its transdermal delivery
CA2816203C (en) * 2010-10-28 2017-02-21 Transdermal Research Pharm Laboratories, Llc Aripiprazole compositions and methods for its transdermal delivery
CN104622790A (zh) 2010-11-01 2015-05-20 普西维达公司 用于递送治疗剂的可生物侵蚀的硅基装置
US20120311734A1 (en) * 2011-06-04 2012-12-06 The Texas A&M University System Potato transformation compositions, systems, methods, microorganisms, and plants
AU2012296987A1 (en) * 2011-08-12 2014-02-27 Bayer Cropscience Nv Guard cell-specific expression of transgenes in cotton
MX343071B (es) 2011-09-13 2016-10-21 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para el control de malezas.
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
CA2848689A1 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control targeting pds
WO2013040033A1 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
ES2645927T3 (es) 2011-09-13 2017-12-11 Monsanto Technology Llc Procedimientos y composiciones para el control de malezas
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
US9826763B2 (en) * 2011-10-05 2017-11-28 Fmc Corporation Stabilizer composition of microcrystalline cellulose and carboxymethylcellulose, method for making, and uses
US9492363B1 (en) * 2012-01-16 2016-11-15 American Spraytech, L.L.C. Aerosol sprayable color composition
MX2014008693A (es) * 2012-01-27 2014-08-27 Agile Therapeutics Inc Administracion transdermica de hormonas.
FR2988566B1 (fr) * 2012-03-28 2014-08-08 Yoplait France Compositions alimentaires pour stimuler la formation de tissu osseux
UY34822A (es) 2012-05-24 2013-12-31 Seeds Ltd Ab Composiciones y métodos para silenciar la expresión genética
EP4215213A1 (en) * 2012-08-03 2023-07-26 MSM Innovations, Inc. Method and kit for bowel preparation
US9567631B2 (en) 2012-12-14 2017-02-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CA2881685C (en) 2012-08-14 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Microcapsule compositions and methods
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10584381B2 (en) 2012-08-14 2020-03-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9617297B2 (en) * 2012-10-11 2017-04-11 The Regents Of The University Of California Apoplast wash fluid recovery for improved recombinant endoglucanase extraction in tabacco leaves
US10077451B2 (en) 2012-10-18 2018-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9206436B2 (en) * 2012-12-20 2015-12-08 Ut-Battelle, Llc Key gene regulating cell wall biosynthesis and recalcitrance in Populus, gene Y
EP2941488B1 (en) 2013-01-01 2023-03-22 Monsanto Technology LLC Methods of introducing dsrna to plant seeds for modulating gene expression
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
CA2900543C (en) 2013-02-08 2023-01-31 10X Genomics, Inc. Partitioning and processing of analytes and other species
US8961680B2 (en) * 2013-03-08 2015-02-24 Tbf Environmental Technology Inc. Solvent formulations
WO2014165108A1 (en) * 2013-03-12 2014-10-09 Psivida Us, Inc. Bioerodible silicon-based delivery vehicles for delivery of therapeutic agents
CN105263329B (zh) 2013-03-13 2020-09-18 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
US10609930B2 (en) 2013-03-13 2020-04-07 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
US9289461B2 (en) * 2013-03-15 2016-03-22 Mead Johnson Nutrition Company Reducing the risk of autoimmune disease
US8889633B2 (en) 2013-03-15 2014-11-18 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional compositions containing a peptide component with anti-inflammatory properties and uses thereof
US9345727B2 (en) 2013-03-15 2016-05-24 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional compositions containing a peptide component and uses thereof
CA2942000C (en) * 2013-03-15 2024-04-16 Maria Beug-Deeb Inc. Dba T&M Associates Methods and compositions for cleaning and disinfecting surfaces
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9345741B2 (en) 2013-03-15 2016-05-24 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional composition containing a peptide component with adiponectin simulating properties and uses thereof
WO2014151381A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Psivida Us, Inc. Bioerodible silicon-based compositions for delivery of therapeutic agents
US9352020B2 (en) 2013-03-15 2016-05-31 Mead Johnson Nutrition Company Reducing proinflammatory response
US9138455B2 (en) 2013-03-15 2015-09-22 Mead Johnson Nutrition Company Activating adiponectin by casein hydrolysate
CA2817728A1 (en) * 2013-05-31 2014-11-30 Pharmascience Inc. Abuse deterrent immediate release formulation
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
EP3608412A3 (en) 2013-07-19 2020-04-08 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for controlling leptinotarsa
ES2693580T3 (es) * 2013-10-07 2018-12-12 Bristol-Myers Squibb Holdings Ireland Formulación de tratamiento del VIH de atazanavir y cobicistat
CA2929533C (en) 2013-11-04 2023-06-06 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
CN105979770B (zh) 2014-01-15 2019-07-05 孟山都技术公司 用于使用epsps多核苷酸的杂草控制的方法和组合物
ES2544153B1 (es) * 2014-02-24 2016-06-06 Ntd Labs, S.L. Uso de un hidrolizado de caseína como agente antiviral
US11091770B2 (en) 2014-04-01 2021-08-17 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests
CN106413896B (zh) 2014-04-10 2019-07-05 10X基因组学有限公司 用于封装和分割试剂的流体装置、系统和方法及其应用
WO2015200223A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference
US11807857B2 (en) 2014-06-25 2023-11-07 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
JP6838969B2 (ja) 2014-06-26 2021-03-03 １０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド 個々の細胞または細胞集団由来の核酸の分析方法
JP6640826B2 (ja) 2014-07-08 2020-02-05 ミメディクス グループ インコーポレイテッド 微粒子化ワルトン膠質
US20160022604A1 (en) * 2014-07-23 2016-01-28 Cadila Healthcare Limited Directly compressed ospemifene compositions
RU2754955C2 (ru) 2014-07-29 2021-09-08 Монсанто Текнолоджи Ллс Композиции и способы борьбы с насекомыми-вредителями
WO2016037745A1 (en) * 2014-09-11 2016-03-17 Gelita Ag Gelatin/pectin particles
CA2961639A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Lonza, Inc. Activated disinfectant hydrogen peroxide compositions
US20160122817A1 (en) 2014-10-29 2016-05-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
US10471096B2 (en) * 2015-01-06 2019-11-12 Osamu Yamada Medicinal composition, blood treatment device, cosmetic, food and drink using combustion synthesis material
CN112126675B (zh) 2015-01-12 2022-09-09 10X基因组学有限公司 用于制备核酸测序文库的方法和系统以及用其制备的文库
MX2017009521A (es) 2015-01-22 2018-11-09 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para controlar leptinotarsa.
EP4286516A3 (en) 2015-02-24 2024-03-06 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
KR20170119710A (ko) 2015-02-24 2017-10-27 10엑스 제노믹스, 인크. 표적화된 핵산 서열 커버리지 방법
WO2016137804A1 (en) 2015-02-25 2016-09-01 The Procter & Gamble Company Fibrous structures comprising a surface softening composition
US20160303043A1 (en) * 2015-04-16 2016-10-20 Kate Somerville Skincare, LLC Self-foaming compositions and methods
US10883103B2 (en) 2015-06-02 2021-01-05 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
AU2016270913A1 (en) 2015-06-03 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants
JP6866343B2 (ja) 2015-07-10 2021-04-28 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニーＴｈｅ Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏｍｐａｎｙ メタセシス化不飽和ポリオールエステルを含む布地ケア組成物
SG11201804086VA (en) 2015-12-04 2018-06-28 10X Genomics Inc Methods and compositions for nucleic acid analysis
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
BR112019000371A2 (pt) 2016-07-08 2019-04-24 The Gillette Company Llc composições líquidas para dispositivos de remoção de pelos que compreendem ésteres de poliol insaturados metatetizados
DE102016223333A1 (de) * 2016-11-24 2018-05-24 Henkel Ag & Co. Kgaa Alkalische Mittel zum Aufhellen von Haaren enthaltend Oxidationsmittel und spezielle Carbonsäureester als Keratinvernetzer
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2018140966A1 (en) 2017-01-30 2018-08-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
MA47686A (fr) * 2017-03-01 2021-05-12 Arena Pharm Inc Compositions comprenant des agonistes du récepteur pgi2 et procédés de préparation associés
US10398670B2 (en) * 2017-04-24 2019-09-03 Knoze Jr. Corporation Oral microbiota promotion for oral and/or sinus infections
US10844372B2 (en) 2017-05-26 2020-11-24 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
EP4230746A3 (en) 2017-05-26 2023-11-01 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
US10471033B2 (en) * 2017-09-15 2019-11-12 Knoze Jr. Corporation Oral microbiota promotion for immune system associated inflammations
SG11201913654QA (en) 2017-11-15 2020-01-30 10X Genomics Inc Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
CN112262218A (zh) 2018-04-06 2021-01-22 10X基因组学有限公司 用于单细胞处理中的质量控制的系统和方法
AU2020348683A1 (en) * 2019-09-16 2022-04-28 Kiverdi, Inc. Microbial protein hydrolysate compositions and methods of making same

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3764670A (en) * 1970-10-28 1973-10-09 Ministry Of Agriculture Polypeptidic anti-biotic substances derived from casein
US3778426A (en) * 1970-12-16 1973-12-11 Research Corp Therapeutically useful polypeptides
US4636384A (en) * 1982-06-03 1987-01-13 Stolle Research & Development Corporation Method for treating disorders of the vascular and pulmonary systems
US4959455A (en) * 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
JP2631470B2 (ja) * 1987-05-15 1997-07-16 雪印乳業株式会社 感染防御剤
US5344820A (en) * 1987-05-15 1994-09-06 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Infection protectant
JP2805490B2 (ja) * 1989-02-07 1998-09-30 雪印乳業株式会社 細菌毒素中和剤
US5514646A (en) * 1989-02-09 1996-05-07 Chance; Ronald E. Insulin analogs modified at position 29 of the B chain
FR2686085B1 (fr) * 1992-01-10 1995-08-04 Agronomique Inst Nat Rech Peptides representant des fragments du cmp, anticorps diriges contre lesdits peptides, et leurs utilisations.
GB9310472D0 (en) * 1993-05-20 1993-07-07 Univ Warwick Phenylalanine-free protein and dna coding thereof
TW282398B (ru) * 1993-12-22 1996-08-01 Bristol Myers Squibb Co
US5707968A (en) * 1994-05-26 1998-01-13 Abbott Laboratories Inhibition of attachment of H.influenzae to human cells
US5538952A (en) * 1994-05-26 1996-07-23 Abbott Laboratories Inhibition of infection of mammalian cells by respiratory syncytial virus
US5506209A (en) * 1994-05-26 1996-04-09 Abbott Laboratories Product for inhibition of infection of mammalian cells by respiratory syncytial virus
US5712250A (en) * 1994-09-16 1998-01-27 Abbott Laboratories Product for inhibition of human rotavirus infection
KR0140248B1 (ko) * 1995-03-23 1998-06-15 한상기 신규한 카제인 포스포펩티드, 그것을 포함하는 카제인 및 그 제조방법
US5985275A (en) * 1995-04-12 1999-11-16 New York Blood Center β-Lactoglobulin modified with aromatic anhydride compound for preventing HIV infection
US6570060B2 (en) * 1995-05-16 2003-05-27 Mclachlan Corran Norman Stuart Milk lacking β-casein A1
KR100221124B1 (ko) * 1996-09-23 1999-10-01 한상기 신규한 카제인 및 그 제조방법
US5830434A (en) * 1997-02-26 1998-11-03 Medical University Of South Carolina Foundation For Research Development Methods of treating non-insulin dependent diabetes mellitus with pancreatic polypeptide
EP0922769A4 (en) * 1997-03-21 2000-07-12 Snow Brand Milk Products Co Ltd HYDROLYSATE OF THE IRON-CASE COMPLEX AND A METHOD FOR ITS PRODUCTION.
US6358508B1 (en) * 1997-06-11 2002-03-19 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human tumor necrosis factor receptor TR9
PT996726E (pt) * 1997-08-29 2004-04-30 Brigham & Womens Hospital Proteina de membrana de celulas t (tirc7) peptidos e anticorpos dela derivados e suas utilizacoes
AUPP051497A0 (en) * 1997-11-24 1997-12-18 University Of Melbourne, The Antimicrobial peptides
US5985575A (en) * 1998-05-20 1999-11-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Tethered function assay for protein function
US6570606B1 (en) * 1998-05-29 2003-05-27 3Com Corporation Method and apparatus for controlling transmission of media signals over a data network in response to triggering events at participating stations
WO2000029008A2 (en) * 1998-11-16 2000-05-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Hiv-specific t-cell induction
GB9927603D0 (en) * 1999-11-22 2000-01-19 Nestle Sa Use of a milk protein hydrolysate in the treatment of diabetes
IL138946A0 (en) * 2000-10-11 2001-11-25 Compugen Ltd Method for the identification of peptides and proteins
US20080293671A1 (en) * 2005-09-28 2008-11-27 Dnp Canada, Inc. Combination of Polychitosamine and Fibrate for the Prevention and Treatment of Hyperlipidemia
US8865876B2 (en) * 2008-06-02 2014-10-21 California Institute Of Technology Engineered lectin oligomers with antiviral activity

Also Published As

Publication number Publication date
AU782662B2 (en) 2005-08-18
JP2003528827A (ja) 2003-09-30
NO20024157L (no) 2002-10-30
EA007814B1 (ru) 2007-02-27
US20090192081A1 (en) 2009-07-30
EP1261360B1 (en) 2009-12-16
US20100317601A1 (en) 2010-12-16
US20020147144A1 (en) 2002-10-10
US20070161557A1 (en) 2007-07-12
CN1427725A (zh) 2003-07-02
EA200401467A1 (ru) 2005-04-28
US7741274B2 (en) 2010-06-22
HUP0301003A3 (en) 2007-08-28
DE60140794D1 (de) 2010-01-28
EA005579B1 (ru) 2005-04-28
EP1261360A1 (en) 2002-12-04
KR20030025907A (ko) 2003-03-29
CA2401550A1 (en) 2001-09-07
US8735348B2 (en) 2014-05-27
HUP0301003A2 (hu) 2003-07-28
EP1261360A4 (en) 2004-03-10
BR0109027A (pt) 2003-06-03
AU3596201A (en) 2001-09-12
NZ521016A (en) 2005-08-26
ATE451929T1 (de) 2010-01-15
IL134830A0 (en) 2001-05-20
NO20024157D0 (no) 2002-08-30
IL151351A (en) 2012-04-30
CZ20022915A3 (cs) 2003-03-12
PL361307A1 (en) 2004-10-04
WO2001064234A1 (en) 2001-09-07
ZA200206842B (en) 2003-07-28
EA200400376A1 (ru) 2005-06-30
MXPA02008569A (es) 2003-02-24
US20130096073A1 (en) 2013-04-18
US20100298216A1 (en) 2010-11-25
EA200200820A1 (ru) 2003-08-28
DK1261360T3 (da) 2010-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA007217B1 (ru) Пептиды, полученные из казеина, и их применение в терапии
JP2008509073A (ja) カゼイン由来ペプチドおよびその治療的使用
ES2381189T3 (es) Fármaco para terapia contra el cáncer
US7666996B2 (en) Casein derived peptides and uses thereof
EP1556074A2 (en) Casein derived peptides and uses thereof in therapy
RU2198178C2 (ru) Пептид-иммунорегулятор (варианты), лекарственное средство, включающее пептид-иммунорегулятор
JP4014330B2 (ja) ウイルス感染防御剤
Shafqat et al. Peptides, lipopeptides, and severe acute respiratory syndrome coronavirus-2
JP3677054B2 (ja) ヒトｔ細胞白血病ウィルス感染・増殖抑制剤
EA004879B1 (ru) Аллофероны-иммуномодулирующие пептиды

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU