EA007814B1 - Пептиды, полученные из казеина, и их использование в терапии - Google Patents

Abstract

Биологически активные пептиды, которые получены из или аналогичны последовательностям, идентичным последовательности N-концевой части αSl фракции молочного казеина. Эти пептиды способны стимулировать и усиливать иммунный ответ, защищая от вирусной инфекции, нормализуя уровни сывороточного холестерина и стимулируя кроветворение. Полученные из казеина пептиды не токсичны, и их можно использовать для лечения и профилактики иммунных патологий, гиперхолестеринемии, гематологических нарушений и связанных с вирусами заболеваний.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к биологически активным пептидам, которые получены из последовательностей Ν-концевой части α81 фракции молочного казеина или из последовательностей, которые идентичны этим последовательностям. Эти пептиды способны стимулировать и усиливать иммунную реакцию, защищать от вирусной инфекции, нормализовать уровни холестерина в сыворотке и стимулировать кроветворение. Полученные из казеина пептиды не токсичны, и их можно использовать для лечения и для профилактики иммунных патологий, гиперхолестеринемии, гематологических нарушений и связанных с вирусами заболеваний.

Предпосылки изобретения Биоактивные молекулы из продуктов питания

В дополнение к питательной ценности многих пищевых продуктов некоторые их составляющие и продукты, образующиеся в пищеварительном тракте, обладают способностью влиять на физиологические процессы. Некоторые из этих обладающих дополнительной питательной ценностью (ехйапийтйопа1) составляющих присутствуют в своей активной форме в целостном продукте питания, такие как иммуноглобулины в материнском молоке и молозиве, полиэстрогены, обнаруженные в продуктах питания на основе сои, полифенольные антиоксиданты из фруктов и витамины. Другие же закодированы в молекулах питательных веществ и выделяются в активной форме в процессе переваривания или в процессе приготовления пищи, например противогипертонические пептиды из лактоглобина |ΚίΠ5. Ό.Ό. (1999), Сап. 1. РЬу8ю1. Рйагтасо1. 72:4; 423-434].

Биологическая активность молочных белков

Казеин, основной молочный белок, традиционно определяли как состоящий из трех фракций α, β и γ, в соответствии с их электрофоретической подвижностью [Ν.Ι.Ηίρρ, с1 а1. (1952), Папу 8с1., 35:272]. В настоящее время их определяют в соответствии с последовательностями аминокислот каждой из подгрупп α81, α82, β и κ [+.Ν. Епде1 е1 а1. (1984), 1. Папу 8сг, 67: 1599].

В процессе переваривания казеиновые белки подвергаются протеолитическому расщеплению под действием кислотных протеаз, таких как химозин (реннин), трипсин и пепсин, в результате чего образуются более короткие пептиды и вызывается свертывание и секвестрация кальция полученными белковыми фрагментами. Немногочисленные исследования соединений молока продемонстрировали связанную с казеином бактерицидную активность. В патенте США № 3764670 раскрыты протеолитические казеиновые гидролизаты, обладающие свойствами антибиотиков против микроорганизмов. В патенте Израиля № 42863 раскрыт полученный из казеина пептид, состоящий из 23 аминокислот Ν-концевой части казеина, обладающий противобактериальной активностью. Кроме того, другие физиологически активные свойства, такие как активности, подобные активностям опиоидов и факторов роста, были предложены для казеина или его производных [Κίΐΐ5, Ό. Ό.,(1999), 1Ый.].

Для пептидов казеина также наблюдалась иммуномодулирующая активность. Со51е е1 а1. [(1992, 1ттип. Ьей. 33: 41-46)] наблюдали усиление пролиферации лимфоцитов у крыс после обработки их пептидом, полученным из С-конца β-казеина. Однако ни в одном из этих исследований не были определены специфические последовательности пептидов казеина, которые придают им их свойства дополнительной питательной ценности.

Кроветворение при терапии злокачественных опухолей

После высоких доз химиотерапии, особенно после миелоаблативных доз химиолучевой терапии, поддержанной трансплантацией аутологичного костного мозга или периферических стволовых кроветворных клеток (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), у пациентов возникает серьезный риск панцитопении. Гранулоцитопения может привести к развитию серьезных, иногда фатальных инфекционных осложнений, вызываемых обычными бактериальными, вирусными, грибковыми и паразитическими агентами непосредственно после момента трансплантации. Аналогичным образом, тромбоцитопения часто приводит к проявлению тенденции к кровотечениям и иногда к длительной тромбоцитной зависимости. Если развивается невосприимчивость к тромбоцитам, эпизоды кровотечений могут угрожать жизни, и осложнения при кровотечениях часто оказываются летальными. Риск, связанный с гранулоцитопенией, можно частично уменьшить поддерживающими средствами и наиболее эффективно путем введения рекомбинантных цитокинов человека, которые могут усилить восстановление гранулоцитов, особенно гранулоцитарного колониевосстанавливающего фактора (С-С8) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (СМ-С8Е). Эти агенты чрезвычайно дороги (их стоимость примерно 200-400 долларов США/в день/для пациента), и иногда они вызывают побочные эффекты, связанные с гипертоническими реакциями, лихорадкой, болями в костях и иногда сопровождаются синдромами повышенной сосудистой проницаемости, включая перикардиты и плевриты. Некоторые из этих побочных эффектов могут быть связаны с другими цитокинами, которые могут естественным образом высвобождаться под действием этих кроветворных факторов. Более того, использование таких кроветворных факторов роста может быть противопоказано пациентам с опухолевыми клетками, содержащими С-С8Е или СМ-С8Е рецепторы, в таких случаях, как острый и хронический миелолейкоз и при миелодиспластических синдромах. Тогда как основной прогресс в лечении пациентов с риском пан

- 1 007814 цитопении был достигнут за счет использования кроветворных цитокинов, никакого прогресса в лечении тромбоцитопении достигнуто не было. После высоких доз химиотерапии и особенно после Л8СТ, у пациентов возникает риск возникновения тромбоцитопении, которая может длиться в течение многих месяцев, даже вплоть до 3 лет, а некоторые пациенты с тромбоцитопенией могут никогда не выздороветь. Организмы многих пациентов, которых раньше лечили множеством препаратов на основе крови, становятся невосприимчивыми к тромбоцитам, и, следовательно, может оказаться невозможным преодолеть тромбоцитопению даже на короткое время, несмотря на интенсивные и частые трансфузии тромбоцитов от одного донора. Невосприимчивость к тромбоцитам и длительная тромбоцитопения представляют собой распространенную причину смертности в Л8СТ центрах во всем мире.

В настоящее время проводятся исследования нескольких новых рекомбинантных цитокинов, таких как рекомбинантный интерлейкин-3 человека (тЫЬ3) и рекомбинантный интерлейкин-6 человека (тЫЬб), в качестве потенциальных агентов для усиления мегакариоцитопоэза и восстановления тромбоцитов. К сожалению, предварительные клинические исследования показали, что хотя тЫЬ3 и тЫЬб могут усиливать восстановление тромбоцитов, такие эффекты никоим образом не являются эффективными и могут потребовать значительного промежутка времени.

Очевидно, что в настоящее время длительная тромбоцитопения представляет основную проблему в клинических центрах трансплантации костного мозга, для которой до сих пор не найдено удовлетворительного решения.

Поэтому существует широко известная необходимость в создании безопасного, дешевого, быстродействующего и четко определенного стимулятора кроветворения и особенно мегакариоцитопоэза, который был бы лишен указанных выше ограничений и иметь который было бы весьма выгодно.

Тромбопоэтин (ТРО) в регуляции кроветворения и функций тромбоцитов

ТРО, по-видимому, является основным регулятором продуцирования тромбоцитов ίη νινο, хотя увеличение продуцируемых почками и печенью факторов роста в дефиците тромбоцитов не вызывается адаптацией ТРО биосинтеза в этих органах. Скорее, по-видимому, существует управление с обратной связью, при котором количество циркулирующих тромбоцитов определяет, как много из циркулирующих ТРО доступно костному мозгу для продуцирования тромбоцитов. Кроме того, было показано, что ТРО является ранодействующим цитокином с важными многосторонними эффектами: одни только ТРО или в комбинации с другими рано действующими цитокинами могут (ί) промотировать жизнеспособность и подавлять апоптоз в клетках-предшественниках; (ίί) регулировать продуцирование и функции кроветворных стволовых клеток; (ίίί) запускать процесс деления спящих мультилинейных клеток; (ίν) индуцировать мультилинейную дифференциацию и (ν) усиливать образование мультилинейных колоний, содержащих гранулоциты, эритроциты, макрофаги и мегакарициты (МК, СРИ-ОЕММ). Более того, ТРО стимулируют продуцирование более ограниченных предшественников для гранулоцит/моноцитарных, мегакариоцитарных и эритроидных колоний и стимулируют адгезию примитивных клеток костного мозга человека и мегакариоцитарных клеток к фибронектину и фибриногену. Так, ТРО являются важными цитокинами для клинических специалистов в области гематологии/трансплантологии: для мобилизации, амплификации и ех νινο экспансии стволовых клеток и соответствующих клеток-предшественников для аутологичной и аллогенной трансплантации [νοη бет Воте, Л.Е.О.Кг., е! а1. (1998) Т11готЬоро1еШ1: ίΐ'δ го1е ίη р1а(е1е( бкотбет апб а§ а пе\у бгид ίη сБшса1 тебкте. Ιη Ва1Шег8 С1т. Нета!о1. Ете: 11(2), 427-45].

Помимо эффектов ТРО в кроветворении, этот эффективный фактор роста стимулирует тромбоциты против различных агонистов и модулирует тромбоцит-внеклеточные матричные взаимодействия. Хотя сам по себе он не вызывает агрегацию тромбоцитов, ТРО усиливает ΑΌΡ-индуцированную агрегацию, особенно на второй волне агрегации, усиливает выделение гранул (ΑΌΡ, АТР, серотонина и т.д.) и продуцирование тромбоксана В2, усиливает прикрепление тромбоцитов к коллагену и потенциирует индуцируемую сдвигом агрегацию тромбоцитов. ТРО также стимулирует активацию ΡΜΝ, индуцируя выделение 1Ь-8 и премируя продуцирование кислородных метаболитов, подобно усилению противомикробной защиты.

Клинические исследования позволяют предположить ценность ТРО в понимании и лечении различных гематологических состояний. У пациентов с идиопатической апластической анемией (АА), наблюдаются повышенные уровни ТРО даже при ремиссии после иммуноподавляющей терапии, что указывает на дефект кроветворения. ТРО повышены также в других формах апластической тромбоцитопении, но не в условиях повышенной деструкции тромбоцитов. По-видимому, реактивное усиление продуцирования ТРО недостаточно в случае деструктивной тромбоцитопении. Так, ТРО является не только терапевтическим выбором для апластической, но также и для деструктивной тромбоцитопении.

Тромбопоэтические агенты представляют большой клинический интерес для профилактики и/или лечения патологической или лечением-индуцированной тромбоцитопении и как замена для трансфузии тромбоцитов. Из подвергнутых оценке цитокинов все, кроме маргинально эффективных 1Б-11, как предполагали, были неприемлемы для клинического использования. Считают, что ТРО становится цитокином, выбранным для лечения тромбоцитопении. Недавно стали доступны рекомбинантные ТРО человека (Ое^тесЬ), что позволило провести тщательные фармакокинетические определения и клинические ис

- 2 007814 пытания. Так, потенциальные применения ТРО охватывают область поддерживающей терапии (пост химио/радиотерапия, трансплантация костного мозга и стволовых клеток), гематологические заболевания (АА, миелодисплазия, конгенитальная и приобретенная тромбоциопения), заболевания печени, трансфузии (экспансия, сбор, мобилизация и хранение тромбоцитов) и хирургию (включая трансплантацию печени). Особый интерес представляет потенциальное использование ТРО/ЕРО/О-С8Е коктейля для миелодисплазии, О-С8Р и ТРО комбинации для мобилизации периферических стволовых клеток и ТРО при сборе СО 34+ клеток и ех νίνο экспансии мегакариоцитов для лучшего восстановления тромбоцитов. Однако аналогично другим кроветворным агентам, рассматриваемым с точки зрения клинического использования, ТРО стоят дорого и потенциально антигенны в терапевтически эффективных количествах. Таким образом, было бы выгодно иметь безопасный, недорогой и легко доступный стимулятор тромбопоэза, способный усилить активность ТРО.

фракция казеина αδ1 фракцию казеина можно получить из молочных белков различными способами [Ό.Ο. 8ο1ιιηίά11ι и Т.АЭ. Раупек (1963), ВюсЫш., Вюрйук. Ас!а, 78:492; М.Р. Тйотркоп и С.А. Κίάάν (1964), 1. Палу δα., 47:626; ^.С. Метс1ет, е! а1. (1968), Ви11. 8ос. СЫш. ΒίοΙ. 50:521] и полная аминокислотная последовательность αδ1 фракции казеина была определена 1.С. Метает е! а1. (1971) (Еиг. 1. Вюсйеш. 23:41). Геномная и кодирующая последовательности αδ1 фракции бычьего казеина были также клонированы и секвенированы с использованием технологий рекомбинантных ДНК [Ό. Косхап. е! а1. (1991), Ыис1. Лабк Век. 19(20): 5591; МсКшдй!, В.А., е! а1. (1989), 1. Папу δα. 72:2464-73]. Результаты, полученные при протеолитическом расщеплении и идентификации Ν-концевых фрагментов αδ1 фракции казеина, опубликованы Ц.С. Метает, е! а1. (1970), Еиг. 1. Вюсйеш. 16:439; Р.Ь.Н. Мсδ\νееηеу е! а1. (1993), 1. Пану Век., 60:401], также как и всасывание в кишечнике и появление этого фрагмента в плазме млекопитающих после расщепления белков цельного молока [Р1а! А.М., е! а1. (1998) ВюсЫш1е, 80(2):2155-65]. Ме1ке1 Н. и Воске1тапп [(1999), Ап!оше Уаи Ьееитепйоек, 76:207-15] обнаружили аминокислотные последовательности иммунопептидов, казокининов и казоморфинов в пептидах, высвобождаемых в результате гидролиза αи β-казеиновых фракций молочнокислыми бактериями. Особый интерес представляют противоаггрегационная и тромболитическая активности, демонстрируемые для С-концевых участков α- и к-казеиновых фракций [СйаЬапсе В. е! а1. (1997), Вюсйет. Мо1. Вю1. 1п!. 42(1) 77-84; Р1а! А.М. е! а1. (1993), 1. Пану δα. 76(1): 301-310].

Предшествующие исследования задокументировали потенциальные биоактивные пептиды, кодируемые Ν-концевой αδ1 аминокислотной последовательностью, но не было никаких упоминаний об использовании таких белковых фрагментов, специфических последовательностей или определенных синтетических пептидов для усиления кроветворения, профилактики вирусных инфекций и модулирования развития аутоиммунных заболеваний.

Сущность изобретения

В соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения аутоиммунного заболевания, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδ1 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения вирусного заболевания, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδ1 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики вирусной инфекции, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδ1 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования кроветворения, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδ1 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδ1 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδ1 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования мегакариоцитопоэза, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδ1 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования эритропоэза,

- 3 007814 причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδί казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования лейкоцитопоэза, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδί казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования тромбоцитопоэза, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδί казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования пролиферации плазмоцитов, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδί казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования пролиферации дендритных клеток, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδί казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования пролиферации макрофагов, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδί казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения тромбоцитопении, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδί казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения панцитопении, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδί казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения гранулоцитопении, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδί казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения гиперлипидемии, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδί казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения холестеринемии, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδί казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения глюкозурии, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδί казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения диабета, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδί казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения СПИД, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδί казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения инфекции, вызванной ВИЧ, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδί казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиорадиотерапии, поддерживаемой трансплантацией аутологичного костного мозга или стволовых клеток периферической крови (ΑδСΤ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Νконцевой части αδί казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ лечения состояния, поддающегося лечению эритропоэтином, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδί казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления действия эритропоэтина, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части αδί казеина.

- 4 007814

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ лечения состояния, поддающегося лечению тромбопоэтином, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления действия тромбопоэтина, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления мобилизации периферических стволовых клеток, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения вирусного заболевания, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция, для профилактики вирусной инфекции, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования кроветворения, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Νконцевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования мегакариоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования эритропоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования лейкоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования тромбоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации плазмоцитов, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации дендритных клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации макрофагов, причем указанная фармацевтическая композиция включает в

- 5 007814 качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения тромбоцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения панцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения гранулоцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения гиперлипидемии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения холестеринемии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения глюкозурии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения диабета, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения СПИД, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения ВИЧ-инфекции, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиолучевой терапии, поддержанной трансплантацией аутологичного костного мозга или стволовых клеток периферической крови (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения состояний, поддающихся лечению тромбопоэтином, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Νконцевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для усиления действия тромбопоэтина, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для усиления мобилизации периферических стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования кроветворения, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопозтин и пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для

- 6 007814 индуцирования пролиферации стволовых кроветворных клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопозтин и пептид, полученный из Νконцевой части αδί казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопозтин и пептид, полученный из Ν-концевой части αδί казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования мегакариоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части αδί казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования эритропоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части αδί казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования лейкоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части αδί казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования тромбоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части αδί казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения тромбоцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части αδί казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения панцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части αδί казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения гранулоцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части αδί казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для лечения или профилактики показаний, выбранных из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания или состояния, вирусного заболевания, вирусной инфекции, гематологического заболевания, гематологического дефицита, тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, гиперлипидемии, гиперхолестеринемии, глюкозурии, гипергликемии, диабета, СПИД, ВИЧ-ί, нарушений в хелперных Т-клетках, дефицита дендритных клеток, дефицита макрофагов, нарушений в кроветворных стволовых клетках, включая нарушения в тромбоцитах, лимфоцитах, плазмоцитах и нейтрофилах, предлейкозных состояний, лейкозных состояний, нарушений иммунной системы, вызванных химиотерапией или лучевой терапией, нарушений иммунной системы человека, вызванных лечением заболеваний иммунодефицита и бактериальных инфекций, причем фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части αδί казеина и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для лечения или профилактики показаний, выбранных из группы, состоящей из гематологического заболевания, гематологического дефицита, тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, дефицита дендритных клеток, дефицита макрофагов, нарушений в кроветворных стволовых клетках, включая нарушения в тромбоцитах, лимфоцитах, плазмоцитах и нейтрофилах, предлейкозных состояний, лейкозных состояний, миелодипластического синдрома, апластической анемии и недостаточности костного мозга, причем фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части αδί казеина и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления колонизации стволовых клеток донорской крови у миелоаблативного реципиента, причем указанный способ осуществляют путем обработки донора указанных стволовых клеток донорской крови пептидом, полученным из Νконцевой части αδί казеина, до отбора и последующей имплантации реципиенту стволовых клеток донорской крови.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления колонизации стволовых клеток донорской крови у миелоаблативного реципиента, причем указанный способ осуществляют

- 7 007814 путем обработки указанных стволовых клеток донорской крови пептидом, полученным из Ν-концевой части казеина, до имплантации реципиенту стволовых клеток донорской крови.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления колонизации стволовых клеток крови у миелоаблативного реципиента, причем указанный способ осуществляют путем обработки указанных стволовых клеток крови пептидом, полученным из Ν-концевой части α§1 казеина, до имплантации реципиенту стволовых клеток крови.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления колонизации стволовых клеток донорской крови у миелоаблативного реципиента, причем указанный способ осуществляют путем обработки донора указанных стволовых клеток донорской крови пептидом, полученным из Νконцевой части α§1 казеина, и тромбопоэтином, до отбора и последующей имплантации реципиенту стволовых клеток донорской крови.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления колонизации стволовых клеток донорской крови у миелоаблативного реципиента, причем указанный способ осуществляют путем обработки указанных стволовых клеток донорской крови пептидом, полученным из Ν-концевой части α§1 казеина, и тромбопоэтином, до имплантации реципиенту стволовых клеток донорской крови.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления колонизации стволовых клеток крови у миелоаблативного реципиента, причем указанный способ осуществляют путем обработки указанных стволовых клеток крови пептидом, полученным из Ν-концевой части α§1 казеина и тромбопоэтином, до имплантации реципиенту стволовых клеток крови.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α§1 казеина, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α§1 казеина, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения вирусного заболевания.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α§1 казеина, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения вирусной инфекции.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α§1 казеина для получения лекарственного средства для индуцирования кроветворения.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α§1 казеина для получения лекарственного средства для индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α§1 казеина, для получения лекарственного средства для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α§1 казеина, для получения лекарственного средства для индуцирования мегакариоцитопоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α§1 казеина, для получения лекарственного средства для индуцирования эритропоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α§1 казеина, для получения лекарственного средства для индуцирования лейкоцитопоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α§1 казеина, для получения лекарственного средства для индуцирования тромбоцитопоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α§1 казеина, для получения лекарственного средства для индуцирования пролиферации плазмоцитов.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α§1 казеина, для получения лекарственного средства для индуцирования пролиферации дендритных клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α§1 казеина, для получения лекарственного средства для индуцирования пролиферации макрофагов.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α§1 казеина, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения тромбоцитопении.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Ν

- 8 007814 концевой части α81 казеина, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения панцитопении.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения гранулоцитопении.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения гиперлипидемии.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения холестеринемии.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения глюкозурии.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения диабета.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения СПИД.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения ВИЧ инфекции.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиолучевой терапии, поддержанной трансплантацией аутологичного костного мозга или стволовых клеток периферической крови (А8СТ) или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ).

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для получения лекарственного средства для лечения состояния, поддающегося лечению тромбопоэтином.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для получения лекарственного средства для усиления действия тромбопоэтина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для получения лекарственного средства для усиления мобилизации периферических стволовых клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для получения лекарственного средства для усиления колонизации стволовых клеток донорской крови у миелоаблативного реципиента.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для получения лекарственного средства для усиления колонизации стволовых клеток крови у миелоаблативного реципиента.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения вирусного заболевания.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения вирусной инфекции.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для индуцирования кроветворения.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для индуцирования пролиферации кроветворных

- 9 007814 стволовых клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для индуцирования мегакариоцитопоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для индуцирования эритропоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для индуцирования лейкоцитопоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для индуцирования тромбоцитопоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для индуцирования пролиферации плазмоцитов.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для индуцирования пролиферации дендритных клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для индуцирования пролиферации макрофагов.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения тромбоцитопении.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения панцитопении.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения гранулоцитопении.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения гиперлипидемии.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения холестеринемии.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения глюкозурии.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения диабета.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения СПИД.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения ВИЧ инфекции.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиорадиотерапии, поддержанной трансплантацией аутологичного костного мозга или стволовых клеток периферической крови (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ).

- 10 007814

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части «81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для лечения состояния, которое поддается лечению тромбопоэтином.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для усиления действия тромбопоэтина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для усиления колонизации стволовых клеток донорской крови у миелоаблативного реципиента.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для усиления колонизации стволовых клеток крови у миелоаблативного реципиента.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для усиления мобилизации периферических стволовых клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для индуцирования кроветворения.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для индуцирования мегакариоцитопоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для индуцирования эритропоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для индуцирования лейкоцитопоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для индуцирования тромбоцитопоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения тромбоцитопении.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения панцитопении.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения гранулоцитопении.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения

- 11 007814 показаний, выбранных из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания или состояния, вирусного заболевания, вирусной инфекции, гематологического заболевания, гематологического дефицита, тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, гиперлипидемии, гиперхолестеринемии, глюкозурии, гипергликемии, диабета, СПИД, ВИЧ-1, нарушений в хелперных Т-клетках, дефицита дендритных клеток, дефицита макрофагов, нарушений в кроветворных стволовых клетках, включая нарушения в тромбоцитах, лимфоцитах, плазмоцитах и нейтрофилах, предлейкозных состояний, лейкозных состояний, нарушений иммунной системы, вызванных химиотерапией или лучевой терапией, нарушений иммунной системы человека, вызванных лечением заболеваний иммунодефицита и бактериальных инфекций.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части αδ1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения показаний, выбранных из группы, состоящей из гематологического заболевания, гематологического дефицита, тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, дефицита дендритных клеток, дефицита макрофагов, нарушений в кроветворных стволовых клетках, включая нарушения в тромбоцитах, лимфоцитах, плазмоцитах и нейтрофилах, предлейкозных состояний, лейкозных состояний, миелодипластического синдрома, апластической анемии и недостаточности костного мозга.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов пептид, полученный из Ν-концевой части αδ1 казеина, и тромбопоэтин, и фармацевтически приемлемый носитель для усиления колонизации стволовых клеток донорской крови у миелоаблативного реципиента.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов пептид, полученный из Ν-концевой части αδ1 казеина, и тромбопоэтин, и фармацевтически приемлемый носитель для усиления колонизации стволовых клеток крови у миелоаблативного реципиента.

В соответствии с дальнейшими отличительными особенностями в раскрытых ниже предпочтительных вариантах настоящего изобретения, пептидом является фрагмент, полученный в результате фрагментации αδ1 казеина.

В соответствии с дальнейшими отличительными особенностями в раскрытых предпочтительных вариантах, пептидом является синтетический пептид.

В соответствии с дальнейшими отличительными особенностями в раскрытых предпочтительных вариантах, пептид имеет последовательность как представлено ниже в одной из δΕΟ Ш ΝΟ:1-25.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен очищенный пептид, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из δΕΟ Ш ΝΟ:1-25.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция, включающая очищенный пептид, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из δΕΟ Ш ΝΟ:1-25, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция, включающая тромбопоэтин и очищенный пептид, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из δΕΟ Ш ΝΟ:1-25, и фармацевтически приемлемый носитель.

В настоящем изобретении успешно преодолены недостатки известных к настоящему времени конфигураций, за счет того, что предложены пептиды для лечения болезней человека, причем указанные пептиды получены из Ν-концевой части αδ1 казеина и не обладают заметной токсичностью, но зато обладают высокой терапевтической эффективностью.

Краткое описание фигур

Далее настоящее изобретение раскрыто только на основании примеров со ссылкой на прилагаемые фигуры. Специально указывается со ссылкой на фигуры, что примеры приведены только для иллюстрации обсуждений предпочтительных вариантов настоящего изобретения и представляют собой то, что можно считать наиболее полезным и легко понятным описанием принципов и концептуальных аспектов настоящего изобретения. В этой связи не предпринимаются попытки продемонстрировать детали настоящего изобретения более подробно, нежели это необходимо для фундаментального понимания изобретения, причем описание вместе с фигурами разъясняет специалистам, как некоторые варианты изобретения можно осуществить на практике.

На приведенных фигурах:

фиг. 1 представляет стимуляцию активности натуральных киллерных (ΝΚ) клеток в культивируемых клетках мышиного костного мозга пептидами, полученными из нативного казеина. Лизис ³⁵δмеченых УАС клеток-мишеней культивируемыми клетками мышиного костного мозга, инкубируемыми в присутствии (+) или в отсутствии (-) 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, выражен как доля полной радиоактивности, выделенной из УАС клеток в надосадочную жидкость культуры (% выделенного ³⁵δ). Фиг. 1 представляет ΝΚ активность при соотношении эффекторные клетки/клеткимишени 25:1 и 50:1.

Фиг. 2а и 2Ь представляют стимуляцию активности натуральных киллерных (ΝΚ) клеток в культи

- 12 007814 вируемых стволовых клетках человека периферической крови (РВ8С) пептидами, полученными из нативного казеина. Лизис ³⁵8-меченых К562 клеток-мишеней, культивируемыми РВ8С клетками от доноров, обработанных фактором, стимулирующим колонии гранулоцитов (С-С8Е). инкубируемыми в отсутствии (0 мкг) или в присутствии возрастающих концентраций (5-500 мкг/мл) пептидов, полученных из нативного казеина, выражен как доля полной радиоактивности, выделенной из К562 клеток в надосадочную жидкость культуры (% выделенной ³⁵8). Фиг. 2а представляет активность ΝΚ двух образцов крови, полученных от того же пациента, инкубированных при различных соотношениях эффекторные клетки/клетки-мишени (1:25 и 1:50). Фиг. 2Ь представляет активность ΝΚ образцов крови от здорового и больного доноров, инкубированных при одном и том же соотношении эффекторные клетки/клеткимишени. Квадратами представлено соотношение эффекторные клетки/клетки-мишени 100:1, ромбами соотношение эффекторные клетки/клетки-мишени 50:1.

Фиг. 3а-с представляют стимуляцию пролиферации натуральных киллерных (ΝΚ) и Тлимфоцитных (Т) клеток из культивируемых стволовых клеток периферической крови человека (РВ8С) пептидами, полученными из нативного казеина. Пролиферация ΝΚ и Т клеток в культивируемых РВ8С от доноров, обработанных фактором, стимулирующим колонии гранулоцитов, инкубируемых с пептидами, полученными из нативного казеина, или без них, выражена как процент (%) клеток, связывающих анти-С.'О₃/Е1ТС флуоресцентные анти-Т клеточные антитела ИСНТ1, или анти-СО_5бЖРЕ флуоресцентные анти-ΝΚ клеточные антитела МОС-1 (ΌΑΚΘ Α/8 Оешпагк). Контролями служат Р1ТС и КРЕконъюгированные анти-мышиный 1дС антитела. Фиг. 3а представляет процент культивируемых РВ8С человека, связывающих флуоресцентные антитела СЭ₃₆ (5 независимых образцов) после 10 дней инкубирования с (пептиды) или без (контроль) 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина. Фиг. 3Ь представляет процент культивируемых РВ8С клеток человека, связывающих флуоресцентные анти-СИ₃ (Т клетки) антитела, после 14 дней инкубирования с (пептиды) или без (контроль) 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина. Фиг. 3с представляет процент культивируемых РВ8С клеток человека, связывающих флуоресцентные. анти-СО₃ (Т- клетки) антитела, и клетки, связывающие как СЭ₃ так и ί.Ό₃₆ (Т и ΝΚ-подобные клетки) антитела после 28 дней инкубирования с (пептидами) или без (контроль) 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина.

Фиг. 4 представляет стимуляцию активности натуральных киллерных (ΝΚ) клеток в культивируемых стволовых клетках периферической крови человека (РВ8С) синтетическими пептидами, полученными из казеина. Лизис ³⁵8-меченых К562 клеток-мишеней культивируемыми РВ8С клетками (от больной злокачественным заболеванием молочной железы), инкубируемыми в отсутствии (0 мкг) или в присутствии возрастающих концентраций (10-500 мкг/мл) синтетических пептидов, полученных из казеина, выражен как доля полной радиоактивности, выделенной из К562 клеток в надосадочную жидкость культуры (% выделенного). Пептиды представляют Ν-концевые последовательности из 1-10 (фиг. 1а, ромбы), 1-11 (фиг. 2а, квадраты) и 1-12 (фиг. 3а, треугольники) первых аминокислот Ν-концевой части α81 казеина (см. табл. 3 для последовательностей синтетических пептидов).

Фиг. 5а-5с представляют стимуляцию пролиферации культивируемых клеток человека различного происхождения пептидами, полученными из нативного казеина. Пролиферацию культивируемых клеток человека после 14-21 дня инкубирования с возрастающими концентрациями пептидов, полученных из нативного казеина, выражают как количество [³Н]-тимидина, включенного в каждый образец. Фиг. 5а представляет включение метки в два образца (РВ8С 1, квадраты, 15 дней инкубирования; и РВ8С 2, ромбы, 20 дней инкубирования) стволовых клеток периферической крови человека, инкубируемых с 50-600 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, или без оных (контроль). Фиг. 5Ь представляет включение [³Н]-тимидина в культивируемые клетки костного мозга человека после 21 дня инкубирования с или без (контроль) 50-600 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина. Костный мозг получен от больных злокачественными опухолями на стадии ремиссии (ВМ ауто, заштрихованные квадраты, ВМ 1, треугольники и ВМ 2, квадраты) или от здоровых добровольцев (ВМ нормальные, ромбы). Фиг. 5с представляет включение [³Н]-тимидина в культивируемые клетки пуповинной крови человека после 14 дней инкубирования с или без (контроль) 50-1000 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина. Клетки пуповинной крови получены от двух различных доноров (С.В. 1, треугольники, С.В. 2, квадраты).

Фиг. 6 представляет таблицу, отражающую пролиферацию предшественников клеток крови из костного мозга человека и пуповинной крови в результате инкубирования с пептидами, полученными из нативного казеина. Относительное число клеток х10⁴ на мл, отражающее пролиферацию культивируемых клеток, определяют, подсчитывая клетки, как это указано ниже в разделе Примеры. Костный мозг от здоровых добровольцев (костный мозг) и пуповинную кровь от нормально рожденных детей (пуповинная кровь) инкубируют в течение 13 (пуповинная кровь) или 14 (костный мозг) дней в присутствии факторов роста и АВ сыворотки, с добавлением или без добавления возрастающих концентраций пептидов, полученных из нативного казеина (25-500 мкг/мл).

Фиг. 7 представляет таблицу, демонстрирующую эффект ίη νίΙΐΌ инкубирования с синтетическими пептидами, полученными из казеина, на относительное распределение мегакариоцитов, эритроидов, плазмоцитов и дендритных клеток (дифференциальный счет) в СРИ-СЕММ колониях клетокпредшественников мышиного костного мозга. Клетки подсчитывают в макроскопических колониях, вы

- 13 007814 ращенных из клеток мышиного костного мозга, приготовленных аналогично СЕИ-СЕММ колониям, как описано выше. Клетки инкубируют с кроветворными факторами и 25 мкг или более синтетических пептидов, полученных из казеина, в течение 14 дней. Дифференциальный счет выражают как процент от общего числа клеток, представленных индивидуальными типами клеток.

Фиг. 8 представляет стимуляцию восстановления периферических лейкоцитов у миелоаблативных мышей с трансплантированным костным мозгом в результате обработки пептидами, полученными из нативного казеина. Подсчет клеток представляет количество лейкоцитов (х10⁴ на мл, при подсчете в гемоцитометре). Мышей (п=6 в группе) облучают сублетальными дозами, на следующий день осуществляют трансплантацию сингеничного костного мозга (10⁶ клеток/мышь) и, спустя один день, вводят внутривенно 1 мг/реципиент пептидов, полученных из нативного казеина (пептиды: квадраты) или 1 мг/реципиент альбумина сыворотки человека (контроль: ромбы).

Фиг. 7 (из 1Ь01 00198) утрачена.

Фиг. 9 представляет стимуляцию восстановления тромбоцитов у миелоаблативных мышей с трансплантированным костным мозгом под действием обработки пептидами, полученными из нативного казеина. Отсчет тромбоцитов (РЬТ) представляет число тромбоцитов (х10⁶ на мл, определенное с помощью гемоцитометра). Мышей (п=60 в группе) облучают летальной дозой радиации, осуществляют трансплантацию сингеничного костного мозга (10⁶ клеток/мышь) на 1 день и внутривенно вводят 1 мг/реципиент пептидов, полученных из нативного казеина (пептиды, ромбы), или 1 мг/реципиент альбумина сыворотки человека (контроль, квадраты).

Фиг. 10а-Г представляют проникновение в клетки и захват ядрами Е1ТС-конъюгированных пептидов, полученных из нативного казеина, в культивируемых Т-лимфоцитных клетках человека, по данным флуоресцентной микроскопии. Е1 и Е2 представляют идентичные фракции Е1ТС-конъюгированных пептидов, полученных из нативного казеина. Клетки 8ир-Т₁ инкубируют со 100 мкг/мл Е1ТСконъюгированных пептидов, полученных из нативного казеина, как описано ниже в разделе примеры. В указанные моменты времени клетки промывают от свободных меток, фиксируют в формалине и подготавливают для наблюдения и регистрации с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Фиг. 10а-Г представляют отобранные изображения клеток для соответствующих времен инкубирования, которые демонстрируют тот факт, что ЕГЫС-конъюгированные пептиды, полученные из нативного казеина, проникают через мембраны 8ир-Т₁ клеток (фиг. 10а, Ь) и концентрируются в ядрах (фиг. 10с-Г).

Фиг. 11 представляет таблицу стимуляции пролиферации 8ир-Т₁ лимфоцитных клеток в результате инкубирования с пептидами, полученными из нативного казеина. 8ир-Т1 клетки (по 5000 в лунке) инкубируют с возрастающими концентрациями (50-1000 мкг/мл) пептидов, полученных из нативного казеина, подсчитывают их количество в лунках в указанные моменты времени культивирования и импульсно бомбардируют [³Н]-тимидином в течение 18 ч. Показателем пролиферации служит отношение среднего значения включений [³Н]-тимидина в клетки, культивируемые с пептидами, полученными из нативного казеина (три образца), деленное на значения включений в клетки, которые культивируют без пептидов, полученных из нативного казеина (контроль).

Фиг. 12 представляет таблицу, отражающую результаты ингибирования ВИЧ-1 инфекции СЕМ лимфоцитов пептидами, полученными из нативного казеина. СЕМ клетки либо контактируют с ВИЧ-1 вирусом, предварительно инкубированным в течение 3 ч с пептидами, полученными из нативного казеина (3 ч), либо сами эти клетки предварительно инкубируют с возрастающими концентрациями (50-100 мкг/мл) пептидов, полученных из нативного казеина. Для указанного количества ч (24 и 48 ч) перед осуществлением контактирования с ВИЧ-1 вирусом, как указано ниже в разделе примеры. На 15 день после инфицирования подсчитывают количество клеток и анализируют степень инфицирования ВИЧ-1 с помощью анализа с использованием Р²⁴ антигена, как указано ниже в разделе примеры. Контрольными культурами служат 1Е:СЕМ клетки, которые подвергли контактированию с ВИЧ-1 вирусом без предварительной обработки пептидами, полученными из нативного казеина, и И1Е:СЕМ клетки, которые культивировали в идентичных условиях без пептидов, полученных из нативного казеина, и без контактирования с ВИЧ-1 вирусом.

Фиг. 13 представляет таблицу, отражающую результаты ингибирования ВИЧ-1 инфекции СЕМ лимфоцитов синтетическими пептидами, полученными из казеина. СЕМ клетки либо контактируют с ВИЧ-1 вирусом, который был предварительно инкубирован с различными концентрациями (10-500 мкг/мл) синтетических пептидов, полученных из нативного казеина (1Р, 3Р и 4Р) в течение 3 ч (в присутствии пептидов), как раскрыто ниже в разделе примеры. На 7 день после инфицирования подсчитывают количество клеток и анализируют степень инфицирования ВИЧ-1 с помощью анализа с использованием Р²⁴ антигена, как указано ниже в разделе примеры. Контрольными культурами служат (1Е), в которых СЕМ клетки подвергали контактированию с ВИЧ-1 вирусом без предварительной обработки пептидами, полученными из нативного казеина.

Фиг. 14 представляет профилактику с помощью пептидов, полученных из нативного казеина, диабета Типа I (ΙΌΌΜ) у самок диабетических (без ожирения) мышей. Степень глюкозурии контролируют с интервалами в течение 365 дней после обработки у самок ΝΘΌ мышей, которым один (треугольники и

- 14 007814 квадраты) или два раза в неделю вводят инъекции по 100 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, в течение 5 недель (всего 5 или 10 инъекций) и у необработанных контрольных животных. У всех контрольных мышей развилась глюкозурия, которая привела впоследствии к их гибели.

Фиг. 15 представляет восстановление синтетическими пептидами, полученными из казеина, индуцируемой кормом гиперхолестерин/гиперлипидемии у самок мышей С57 В1/6. Полный холестерин (ТС), липопротеины высокой плотности (НОЬ) и низкой плотности (ЬОЬ) анализируют в собранной крови от двух (2) мышей на образец, отобранной у гиперхолестерин/гиперлипидемичных мышей, которым вводили (ΙΡ) полученные из казеина пептиды В, С, 2а или 3Р, или у необработанных (контроль). Нормальные образцы представляют контрольных мышей, не получавших атерогенного корма.

Фиг. 16 представляет таблицу, отражающую результаты стимулирования кроветворения у больных злокачественными опухолями в результате инъекций пептидов, полученных из нативного казеина. В образцах периферической крови пяти женщин, больных злокачественными опухолями, которые либо подвергались химиотерапии, либо подвергаются в настоящее время, как указано выше, подсчитывают полное количество лейкоцитов (\УВО. х10³), тромбоцитов (РЬТ, х10³), эритроцитов (ВВС, х10³) и гемоглобина (г/дл) до (п) и после (п+...) введения внутримышечными инъекциями пептидов, полученных из нативного казеина, как указано выше. Пациент 1 соответствует С.Т.; Пациент 2 соответствует Е.С.; Пациент 3 соответствует Е.8.; Пациент 4 соответствует ЕВ и Пациент 5 соответствует Ό.Μ.

Фиг. 17 представляет стимуляцию тромбоцитопоэза пептидами, полученными из нативного казеина, у тромбоцит-невосприимчивого больного острым миелолейкозом (М-1). Восстановление тромбоцитов выражают как измерение количества тромбоцитов в периферической крови (РЬТ, х10⁶ на мл), подсчитывают как указано выше с указанными интервалами времени после внутримышечной инъекции (как раскрыто ниже в разделе примеры) 100 мкг пептидов, полученных из нативного казеина.

Фиг. 18 представляет стимуляцию тромбоцитопоэза пептидами, полученными из нативного казеина, у тромбоцит-невосприимчивого больного острым миелолейкозом (М-2). Восстановление тромбоцитов выражают как измерение количества тромбоцитов в периферической крови (РЬТ, х10⁶ на мл), подсчитывают как указано выше с указанными интервалами времени после внутримышечной инъекции (как раскрыто ниже в разделе примеры) 100 мг пептидов, полученных из нативного казеина.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к биологически активным пептидам, последовательности которых получены из Ν-концевой части α81 фракции молочного казеина или аналогичны им, к композициям, содержащим указанные пептиды, и к способам их использования, например, для стимулирования и усиления иммунного ответа, для защиты против вирусной инфекции, для нормализации уровней холестерина в сыворотке и для стимулирования кроветворения. Полученные из казеина пептиды нетоксичны и их можно использовать для лечения и профилактики, например, иммунопатологии, гиперхолестеринемии, гематологических нарушений и связанных с вирусами заболеваний.

Принципы и способы осуществления настоящего изобретения можно лучше понять со ссылкой на фигуры и сопровождающие их описания.

Перед детальным объяснением по крайней мере одного варианта изобретения следует уяснить, что применение изобретения не ограничивается подробностями, изложенными ниже в описании или проиллюстрированными примерами. Возможны другие варианты изобретения или его можно использовать на практике другими способами. Кроме того, следует иметь в виду, что используемая в данном описании терминология и фразеология служат целям описания, и их не следует рассматривать как ограничивающие.

В том смысле, как использовано, термин лечение включает существенное ингибирование, замедление или обратное течение развития заболевания, существенное ослабление клинических симптомов заболевания.

В том смысле, как использовано, термин профилактика включает существенное предотвращение проявления клинических симптомов заболевания.

В том смысле, как использовано, термин пептид включает нативные пептиды (включая продукты разложения, пептиды, полученные синтетическим путем, или рекомбинантные пептиды) и пептидымиметики (обычно пептиды, полученные синтетическим путем), такие как пептоиды и полупептоиды, которые являются аналогами пептидов, и которые могут содержать, например, модификации, которые делают эти пептиды более стабильными в организме. Такие модификации включают (но ими не ограничиваются) циклизацию, модификации Ν-концевой части, модификации С-конца, модификации пептидной связи, включая (но ими не ограничиваясь) СН₂-ЫН, СН₂-8, СН₂-8=О, О=С-№Н, СН₂-О, СН₂-СН₂, 8=С-№Н, СН=СН или СЕ=СН модификации основной цепи и модификации остатков. Способы получения соединений пептидов-миметиков хорошо известны в данной области и раскрыты, например, в ОиапШабте Эгид Пекщп, С.А. Ваткбеп Об., Сбар!ет 17.2, Е. С1юр1ш Регдатоп Ргекк (1992), которая включена в данное описание в качестве ссылки. Дальнейшая детализация этого аспекта изложена ниже.

Так, пептидом настоящего изобретения может быть циклический пептид. Циклизацию можно осуществить, например, за счет образования амидной связи, например, включая О1и, Акр, Ьук, Огп, диаминомасляную (ЭаЬ) кислоту, диаминопропионовую (Бар) кислоту в различные положения в цепи (-СО

- 15 007814

ΝΗ или -ΝΗ-СО связи). Можно также осуществить циклизацию между двумя основными цепями за счет включения модифицированных аминокислот формул Н^((СН₂)_п-СООН)-С(К)Н-СООН или Н-ХрСН;),,СОО11 )-С(К)11-ΝΙ1₂, где п=1-4, и, кроме того, где К представляет любую природную или не природную боковую цепь аминокислоты.

Возможна также циклизация через образование 8-8 связей за счет включения двух Суз остатков. Кроме того, циклизацию за счет присоединения одной боковой цепи к другой боковой цепи можно осуществить через образование интерактивной связи формулы -(-СН₂)_п-8-СН₂-С-, где п=1 или 2, что возможно, например, за счет включения Суз или йотоСуз и взаимодействия ее свободной 8Н группы, например, с бромацетилированными Ьуз, От, 1)аЬ или Пар.

Пептидные связи (-СО-ХН-) внутри пептида могут быть замещенными, например Νметилированные связи (-Х(С11₃)-СО-), сложноэфирные связи (-С(К)Н-С-О-О-С(К)^-), кетометиленовые связи (-СО-СН₂-), α-аза связи (^Н^(К)-СО-), где К представляет любой алкил, например метил, карбасвязи (-СН₂-КН-), гидроксиэтиленовые связи (-СН(ОН)-СН₂-), тиоамидные связи (-С8-ЫН-), олефиновые двойные связи (-СН=СН-), ретроамидные связи (-ΝΙ1-СО-), производные пептидов (-№(К)-СН₂-СО-), где К представляет нормальную боковую цепь, естественно присутствующую у атома углерода.

Такие модификации могут быть осуществлены по любым связям вдоль пептидной цепи и даже по нескольким связям (2-3) одновременно.

Природные ароматические аминокислоты, Тгр, Туг и Рйе, могут быть замещены для синтетических не природных кислот, таких как Т1С, нафтилаланин (Νοί), метилированных по кольцу производных Рйе, галогенированных производных Рйе или о-метил-Туг.

В табл. 1, 2 перечислены все природные аминокислоты (табл. 1) и необычные или модифицированные аминокислоты (табл. 2).

Таблица 1

Аминокислота	Трехбуквенное сокращение	Однобуквенный символ
Аланин	А1а	А
Аргинин	Агд	В
Аспарагин	Азп	N
Аспартиковая кислота	Азр	ϋ
Цистеин	Суз	С
Глутамин	С1п	0
Глутамовая кислота	С1и	Е
Глицин	С1у	С
Гистидин	ΗΪ3	Н
Изолейцин	Не	I
лейцин	Ъеи	ъ
Лизин	Ьуз	к
Метионин	Мер	м
Фенилаланин	РЬе	г
Пролин	Рго	Р
Серии	Зег	3
Треонин	ТЬг	т
Триптофан	Тгр	и
Тирозин	Туг	Υ
Валин	Уа1	V
Любая аминокислота из вышеперечисленных	Хаа	X

- 16 007814

Таблица 2

Необычная аминокислота	Код
α-аминомасляная кислота	АЬи
а-амино-аметилбутират	МдаЬи
аминоциклопропан-	Срго
карбоксилат
Аминоизомасляная кислота	А1Ь
аминонорборнил-	НогЬ
карбоксилат
циклогексилаланин	СЬеха
циклопентилаланин	Среп
Б-аланин	Ба1
Б-аргинин	Багд
Б-аспарагиновая кислота	Базр
Б-цистеин	Бсуз
Б-глутамин	Бд1п
Б-глутамовая кислота	Бд1и
Б-гистидин	БЫз
Б-изолейцин	Б11е
Б-лейцин	Ыеи
Б-лизин	В1уз
Б-метионин	Втек
Б-орнитин	Вот
Б-фенилаланин	ВрЬе
Б-пролин	Брго
Б-серин	Взег
Б-треонин	ВЬЬг
Б-триптофан	БЬгр
Б-тирозин	Вбуг
Б-валин	Βν31
Б-а-метилаланин	Вта1а
Б-а-метиларгинин	Втагд
Б-а-метиласпарагин	Бтазп
Б-а-метиласпартат	Бтазр
Б-а-метилцистеин	Бтсуз
Б-а-метилглутамин	Бтд1п

Необычная аминокислота	Код
Ь-И-метилаланин	Ита1а
Ь-Н-метиларгинин	Итагд
Ь-И-метиласпарагин	Итазп
Ь-И-метиласпарагиновая кислота	Итазр
Ь-И-метилцистеин	Итсуз
Ь-И-метилглутамин	Итдт
Ь-Ν-метилглутамовая кислота	ИтдЬи
Ь-И-метилгистидин	ИтЫз
Ь-И-метилизолейцин	ИтИе
Ь-П-метиллейцин	Ит1еи
Ь-И-метиллизин	ИтЬуз
Ь-И-метилметионин	ИттеЬ
Ь-И-метилнорлейцин	Нтп1е
Ь-И-метилнорвалин	Итпуа
Ь-И-метилорнитин	Итоги
Ь-И-метилфенилаланин	ИтрЬе
Ь-И-метилпролин	Итрго
Ь-И-метилсерин	Итзег
Ь-И-метилтреонин	ИтЬЬг
Ь-И-метилтриптофан	ИтЬгр
Ь-И-метилтирозин	ИтЬуг
Ь-И-метилвалин	ИпгуаЬ
Ь-И-метилэтилглицин	Итебд
Ь-И-метил-тертутилглицин	ИтЬЬид
Ь-норлейдин	И1е
Ь-норвалин	ΗνΒ
α-метиламиноизобутират	МаЬЬ
а-метил-у-аминобутират	МдаЬи
а- метилциклогексилаланин	МсЬеха
а- метилциклопентилаланин	Мсреп
а-метил-а-нафтилаланин	Мапар
а-метилпеницилламин	Мреп
И-(4-аминобутил)глицин	Ид1и
И-(2-аминоэтил)глицин	Иаед

- ί7 007814

ϋ-α-метилгистидин	Μ1ί5	Ν- (3- аминопропил)глицин	Νογπ
ϋ-α-метилизолейцин	ОтИе	Ν-амино—а-метилбутират	МпааЬи
Ο-α-метиллейцин	0т1еи	α-нафтилаланин	Апар
ϋ-οί-метиллизин	0т1уз	Ν-бензилглицин	ЦрНе
ϋ-οί-метилметионин	ОттеБ	Ν- (2- хг а а кят/т тто гптх тт \ τί тттлт ттхи	Νςΐη
Ο-α-метилорнитин	Отогп	Ν-карбамилметил)глицин	Цазп
Ο-α-метилфенилаланин	ЭтрЬе	Ν- (2карбоксиэтил)глицин	Ид1и
ϋ-α-метилпролин	Бтрго	Ν- (карбоксиметил)глицин	Цазр
ϋ-οί-метилсерин	Отзег	Ν-циклобутилглицин	ЫсЬий
ϋ-α-метилтреонин	ОтЪЬг	Ν-циклогептилглицин	ИсЬер
ϋ-α-метилтриптофан	Отбгр	Ν-циклогексилглицин	ЦсЬех
ϋ-α-метилтирозин	Отбу	Ν-циклодецилглицин	Цсбес
О-α-метилвалин	Опгуа1	Ν-циклододецилглицин	Цсйос!
ϋ-α-метилаланин	Опта1а	Ν-циклооктилглицин ’	ΝοοοΙ
ϋ-α-метиларгинин	Эптагд	Ν-циклопропилглицин	Ысрго
О-сс-ме тил аспарагин	Опта 5 п	1Ν — и у ндецкиц'лицин	Ысипд
Ο-α-метиласпартат	Эптазр	N-(2,2- дифенилэтил)глицин	ΝΜιπι
ϋ-а-метилцистеин	Оптеуз	N-(3,3дифенилпропил)глицин	ЦЬНе
ϋ-Ν-метиллейцин	0пт1еи	Ν- (3- индолилэтил)глицин	МЬггр
ϋ-Ν-метиллизин	0пт1уз	Ν-метил-у-аминобутират	МпдаЬи
N-метилциклогексил аланин	ЦтсЬеха	ϋ-Ν-метилметионин	ЭпштеБ
ϋ-Ν-метилорнитин	Оптогη	Ν- метилциклопентилаланин	№псреп
N-ме тилглицин	Ца1а	ϋ-Ν-метилфенилаланин	ОтпрЬе
Ν- метиламиноизобутират	ЦтаФЬ	ϋ-Ν-метилпролин	Оптрго
Ν- (1- метилпропил)глицин	Νίΐθ	ϋ-Ν-метилсерин	Оптзег
Ν- (2метилпропил)глицин	Νίΐε	ϋ-Ν-метилсерин	Отпзег
Ν- (2- метилпропил)глицин	И1еи	ϋ-Ν-метилтреонин	ОптШг
Ο-Ν-метилтриптофан	Опт!гр	Ν-(1-метилэтил)глицин	Цуа
ϋ-Ν-метилтирозин	Опт! у г	Ν-метил-а-нафтилаланин	№папар

- 18 007814

ϋ-Ν-метилвалин	Вппгуа1	Ν-метилпеницилламин	Итреп
γ-аминомасляная кислота	СаЬи	Ν-(р- гидроксифенил)глицин	ИЬЬуг
Ь-трет-бутилглицин	ТЬид	Ν-(тиометил)глицин	Исуз
Ь-этилглицин	ЕЬд	пеницилламин	Реп
Ь-гомофенилаланин	НрЬе	Ь-а-метилаланин	Ма1а
Ь-а-метиларгинин	Магд	Ь-а-метиласпарагин	Мазп
Ь-а-метиласпартат	Мазр	Ь-а-метил-третбутилглицин	МЕИид
Ь-а-метилцистеин	Мсуз	Е-метилэтилглицин	МеЕд
Ь-а-метилглутамин	Мд1п	Б-а-метилглутамат	Мд1и
Ъ-а-метилгистидин	МЫз	Ь-а- метилгомофенилаланин	МНрЬе
Ь-а-метилизолейцин	МНе	Ν- (2метилтиоэтил)глицин	ИтеЬ
ϋ-Ν-метилглутамин	Вптд1п	Ν- (3гуанидинопропил)глицин	Иагд
Б-Ы-метилглутамат	Вптд1и	Ν-1- гидроксиэтил)глицин	ЫЬЬг
Б-Ы-метилгистидин	ВптЫз	Ν-(гидроксиэтил)глицин	Изег
Б-И-метилизолейцин	ВптИе	Ν- (имидазолилэтил)глицин	ΝΗΪ3
ϋ-Ν-метиллейцин	Впт1еи	Ν- (3- индолилэтил)глицин	ЫЪЕгр
ϋ-Ν-метиллизин	Бпт1уз	Ν-метил-у-аминобутират	№пдаЬи
Ν-метилциклогексил аланин	Мпсйеха	Β-Ν-метилметионин	ВпттеЕ
ϋ-Ν-метилорнитин	Вптогп	Ν-метилциклопентил аланин	Итсреп
N-метилглицин	На1а	О-Ν-метилфенилаланин	иптрпе
Ν- метиламиноизобутират	ЫтаФЬ	Β-Ν-метилпролин	Вптрго
Ν- (1- метилпропил)глицин	Νϊΐθ	Β-Ν-метилсерин	Вптзег
Ν- (2метилпропил)глицин	Ы1еи	Β-Ν-метилтреонин	ВптЕИг
ϋ-Ν-метилтриптофан	0пт1: гр	Ν-(1-метилэтил)глицин	Νν31
ϋ-Ν-метилтирозин	ОгшгЬуг	Ν-метил-а-нафтилаланин	Мпапар
ϋ-Ν-метилвалин	Вптуа1	Ν-метилпеницилламин	Итреп
γ-аминомасляная кислота	СаЬи	Ν- (п- гидроксифенил)глицин	ИЬЬуг
Ъ-трет-бутилглицин	ТЬид	Ν-(тиометил)глицин	Исуз
Ъ-этилглицин	ЕЬд	пеницилламин	Реп

- 19 007814

Ь-гомофенилаланин	НрЬе	Ь-а-метилаланин	Ма1а
Ь-а-метиларгинин	Магд	Ь-а-метиласпарагин	Мазп
Ь-а-метиласпартат	Мазр	Ь-а-метил-третбутилглицин	МЬЬид
Ь-а-метилцистеин	Мсуз	Ь-метилэтилглицин	Мебд
Ь-а-ме тилглутамин	Μζχΐ 1-1^ -ц XX	Са-МбТМЛГЛуТ ^.χνχα,Τ	Мд1 тд
Ь-а-метилгистидин	МЫ 8	Ь-а-метилгомофенил аланин	МЬрЬе
Ь-а-метилизолейцин	МЫе	Ν- (2метилтиоэтил)глицин	Цтеб
Ь-а-метиллейцин	М1еи	Ь-а-метиллизин	М1у
Ь-а-метилметионин	Мшеб	Ь-а-метилнорлейцин	Мп1е
Ь-а-метилнорвалин	Μηνθ	Ь-а-метилорнитин	Могп
Ь-а-метилфенилаланин	МрЬе	Ь-а-метилпролин	Мрго
Ь-а-метилсерин	тзег	Ь-а-метилтреонин	МЬЬг
Ь-а-метилвалин	Мб гр	Ь-а-метилтирозин	Мбуг
Ь-а-метиллейцин	ΜνΒΐ	Ь-Ц-метилгомофенил аланин	ЦтйрЬе
Ν- (N-(2,2дифенилэтил)карбамилм етилглицин	ЦпЬЬт	Ν- (Ν-(3,3дифенилпропил)карбамил метил(1)глицин	ЫпЬЬе
1-карбокси-1-(2,2дифенилэтиламино)цикл опропан	ЫтЬс

Пептид настоящего изобретения можно использовать как таковой или в форме части фрагментов, таких как белки и дисплей фрагменты, такие как дисплеи бактерий и фагов. Пептиды настоящего изобретения можно также химически модифицировать, получая активные димеры или полимеры в одной пептидной цепи или в ковалентно-сшитых цепях.

Кроме того, пептиды настоящего изобретения включают по крайней мере четыре, необязательно по крайней мере пять, необязательно по крайней мере шесть, необязательно по крайней мере семь, необязательно по крайней мере восемь, необязательно по крайней мере девять, необязательно по крайней мере десять, необязательно по крайней мере одиннадцать, необязательно по крайней мере двенадцать, необязательно по крайней мере тринадцать, необязательно по крайней мере четырнадцать, необязательно по крайней мере пятнадцать, необязательно по крайней мере шестнадцать, необязательно по крайней мере семнадцать, необязательно по крайней мере восемнадцать, необязательно по крайней мере девятнадцать, необязательно по крайней мере двадцать, необязательно по крайней мере двадцать один, необязательно по крайней мере двадцать два, по крайней мере двадцать три, по крайней мере двадцать четыре, по крайней мере двадцать пять, по крайней мере двадцать шесть, необязательно между двадцатью семью и шестьюдесятью или более аминокислотных остатков (которые в данном описании равноправно называют аминокислотами).

Соответственно, в том смысле, как использовано, термин аминокислота или аминокислоты включает 20 природных аминокислот; такие аминокислоты часто оказываются модифицированными после трансляции ΐη νίνο, включая, например, гидроксипролин, фосфосерин и фосфотреонин; и другие необычные аминокислоты, включая, (но ими не ограничиваясь) 2-аминоадипиновую кислоту, гидроксилизин, изодесмозин, норвалин, норлейцин и орнитин. Кроме того, термин аминокислота включает как Ώ-, так и Ь-аминокислоты.

В том смысле, как использовано, фраза полученный из Ν-концевой части «81 казеина относится к пептидам, например продуктам расщепления «81 казеина (называемые пептидами, полученными из нативного казеина), синтетическим пептидам, синтезированным химическим путем таким образом, что их аминокислотные последовательности соответствуют аминокислотной последовательности Ν-концевой части «81 казеина (называемые синтетическими пептидами, полученными из казеина), пептидам, аналогичным (гомологичным) Ν-концевой части «81 казеина, например пептидам, отличающимся одним или более из аминокислотных замещений (но ими не ограничиваясь) допустимыми заместителями, при условии, что сохраняется по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 80%, более предпочтительно по крайней мере 90% сходства, и их функциональные гомологи. Термины гомологи и функциональные гомологи, в том смысле, как использовано, относятся к пептидам с любыми вставками, делециями и замещениями, которые не влияют на биологическую активность пептида.

- 20 007814

В том смысле, как использовано, термин αδ1 казеин относится к αδ1 казеину млекопитающих, включая (но ими не ограничиваясь) домашних млекопитающих (например, коров, овец, коз, лошадей, верблюдов, оленей и буйволов), людей и морских млекопитающих. Ниже приводится список αδ1 казеинов, аминокислотные последовательности которых известны и идентифицированы по их регистрационным номерам в СепВапк (ΝΟΕΙ) и источникам: САА26982 (Ονίκ апек (овца)), САА51022 (Сарга Ыгсик (коза)), САА42516 (Вок !аигик (корова)), САА55185 (Ното кар1епк), САА38717 (δυκ ксгоГа (свинья)), Р09115 (кролик) и 097943 (Сате1ик бготебигшк (верблюд)).

В том смысле, как использовано, термин Ν-концевая часть относится к М аминокислотам αδ1 казеина, полученным из первых 60 аминокислот αδ1 казеина, где М представляет любое целое число от 2 до 60 (включая целые числа 2 и 60). Предпочтительно этот термин относится к первым М аминокислотам αδ1 казеина.

Пептиды настоящего изобретения можно получить путем экстракции из молока, как было указано выше, или с помощью твердофазного пептидного синтеза, который является стандартным способом, известным специалистам. Очистку пептидов настоящего изобретения осуществляют стандартными способами, известными специалистам, такими как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Фрагментацию молочного казеина для получения пептидов настоящего изобретения можно осуществить, используя различные ферментативные и/или химические способы.

Как будет подробно раскрыто ниже и подтверждено примерами в следующем ниже разделе Примеры, пептиды настоящего изобретения обладают различными терапевтическими эффектами. В разделе Примеры приведено множество анализов, с помощью которых специалист может тестировать конкретный пептид, полученный в соответствии с указаниями настоящего изобретения для конкретного терапевтического эффекта.

Любой из описываемых пептидов можно вводить как таковой или в составе фармацевтической композиции, которую можно использовать для лечения или профилактики заболевания. Такие композиции включают в качестве активного ингредиента любые из раскрытых в данном описании пептидов и фармацевтически приемлемый носитель.

В том смысле, как использовано, термин фармацевтическая композиция относится к препарату, содержащему один или более из описываемых пептидов вместе с другими химическими компонентами, такими как фармацевтически приемлемые носители и наполнители. Целью создания фармацевтической композиции является облегчение введения соединения в организм.

Здесь и далее термин фармацевтически приемлемый носитель относится к носителю или разбавителю, который не вызывает заметного раздражения в организме и не разрушает биологическую активность и свойства вводимого соединения. Примерами (без ограничений) носителей являются пропиленгликоль, солевой раствор, эмульсии и смеси органических растворителей с водой. Термин наполнитель относится к инертному веществу, которое добавляют в фармацевтическую композицию для дальнейшего облегчения введения соединения. Примеры (без ограничения) наполнителей включают карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и различного типа крахмалы, производные целлюлозы, желатин, растительные масла и полиэтиленгликоли.

Способы получения лекарственных форм и введения лекарств можно найти в Ветшд!ои'к Рйагтасеи!юа1 δс^еисеκ, Маск РиЬ1^κЫид Со., Еак!оп, РА, в последнем издании.

Подходящие способы введения могут, например, включать пероральное, ректальное, чресслизистое, чрескожное, энтеральное или парентеральное введение, включая внутримышечные, подкожные и интрамедуллярные инъекции, а также интратекальные, интравентрикулярные, внутривенные, внутрибрюшинные, назальные или внутриглазные инъекции.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно приготовить способами, хорошо известными специалистам, например, с помощью обычного перемешивания, гранулирования, получения драже, растирания в порошок, эмульгирования, заключения в оболочку или в матрицу, или используя процесс лиофилизации.

Фармацевтические композиции для использования в соответствии со способом настоящего изобретения можно приготовить обычными способами, используя один или более из фармацевтически приемлемых носителей, включая наполнители и вспомогательные агенты, которые облегчают процесс включения активных пептидов в препараты, которые можно использовать фармацевтически. Подходящая форма зависит от выбранного способа введения.

Для инъекций пептиды настоящего изобретения можно приготовить в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенка, раствор Рингера или забуференный физиологический солевой раствор, с добавлением или без добавления органических растворителей, таких как пропиленгликоль и полиэтиленгликоль. Для введения через слизистую оболочку в формах используют агенты, способствующие проникновению через слизистую. Такие агенты хорошо известны в данной области.

Для перорального введения пептиды можно легко приготовить, комбинируя активные пептиды с фармацевтически приемлемыми носителями, которые хорошо известны в данной области. Такие носите

- 21 007814 ли позволяют получить пептиды настоящего изобретения в таких формах как таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкости, желе, сиропы, взвеси, суспензии и т.п. для перорального приема пациентом. Фармакологические препараты для перорального введения можно приготовить, используя наполнители, необязательно измельчая полученную смесь и превращая смесь в гранулы, затем добавляя при желании подходящие вспомогательные агенты, для получения таблеток или сердцевин драже. Подходящими наполнителями являются, в частности, наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, например, такие как кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, смола трагаканта, метилцеллюлоза гидроксипропилметилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза; и/или физиологически приемлемые полимеры, такие как поливинилпирролидон (РУР). При желании можно добавить разрыхляющие агенты, такие как сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота, или ее соль, такая как альгинат натрия.

На сердцевины драже наносят покрытия. Для этой цели можно использовать концентрированные растворы сахара, которые могут необязательно содержать гуммиарабик, тальк, полвинилпирролидон, гель карбопола, полиэтиленгликоль, диоксид титана, лакирующие растворы и подходящие органические растворители или смеси растворителей. В оболочки драже или таблеток можно добавить красители или пигменты для идентификации, или для того, чтобы охарактеризовать различные комбинации доз активных ингредиентов.

Фармацевтические композиции, которые предназначены для перорального введения, включают сборные капсулы, состоящие из желатина, а также мягкие герметичные капсулы, сделанные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Сборные капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителями, такими как лактоза, связующими, такими как крахмалы, смазывающими агентами, такими как стеарат магния, и необязательно стабилизаторы. В мягких капсулах активные пептиды могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как нелетучие масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы. Все формы для перорального введения должны быть в дозированных формах, подходящих для выбранного способа введения.

Для способа введения за щеку, композиции могут быть, как обычно, изготовлены в форме таблеток или пастилок.

Для введения путем ингаляции пептиды настоящего изобретения удобно вводить в форме аэрозольных спреев, распыляемых из баллончика со сжатым воздухом или распылителя с подходящим распыляющим агентом, например дихлордифторметаном, трихлорфторметаном, дихлортетрафторэтаном или диоксидом углерода. В случае аэрозолей под давлением разовую дозу можно определить с помощью клапана, который пропускает отмеренное количество препарата. Капсулы и картриджи, например, желатина, для использования в ингаляторе или в устройстве для вдувания, можно выполнить таким образом, чтобы они содержали смесь порошка соединения и подходящую порошковую основу, такую как лактоза или крахмал.

Раскрываемые в данном описании пептиды можно приготовить в формах для парентерального введения, например для болюсного введения или для непрерывного вливания. Формы для инъекций могут быть выполнены в виде разовых дозированных форм, например в ампулах или в контейнерах со многими дозами, в которые необязательно добавлен консервант. Композиции могут иметь вид суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных носителях и могут содержать способствующие созданию формы агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.

Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активных препаратов в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных пептидов можно приготовить в виде масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают нелетучие масла, такие как кунжутное масло, или сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды или липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран.

Необязательно суспензия может содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость пептидов, чтобы обеспечить получение высококонцентрированных растворов.

Альтернативно, активный ингредиент может быть в форме порошка для растворения в подходящем растворителе перед использованием, например, в стерильной, не содержащей пирогенов воде.

Пептиды настоящего изобретения могут быть также приготовлены в виде композиций для ректального введения, таких как суппозитории или клизмы, используя, например, обычные основы для суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды.

Описываемые в данном описании фармацевтические композиции могут также содержать подходящие твердые носители, носители в виде геля или наполнители. Примеры таких носителей или наполнителей включают (но ими не ограничиваются) карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.

Специалисты могут легко определить оптимальные дозы и схемы приемов для каждого из пептидов настоящего изобретения.

Для любого из пептидов, используемых в соответствии со способом настоящего изобретения, тера

- 22 007814 певтически эффективное количество, называемое также терапевтически эффективной дозой, можно определить, используя сначала анализ клеточных культур или анализ ίη νίνο на животных. Так, например, дозу можно определить на модели животных для достижения циркулирующей концентрации в интервале, который включает ИК₅₀ или ИК₁₀₀, определенные для культуры клеток. Такую информацию можно использовать для более точного определения необходимых для человека доз. Начальные дозы можно также определить из результатов исследований ίη νίνο. Используя эти начальные руководства, специалист может определить величину эффективной дозы для человека.

Более того, токсичность и терапевтическую эффективность описываемых пептидов можно определить с помощью стандартных фармацевтических методик на культурах клеток или экспериментальных животных, например определяя ЛД₅₀ и ЭД₅₀. Соотношение величин токсичной дозы и дозы терапевтически эффективной является терапевтическим показателем, и его можно выразить как отношение ЛД50 к ЭД₅₀. Предпочтительны пептиды, которые демонстрируют высокие терапевтические показатели. Результаты анализов, полученные для клеточных культур и исследований на животных, можно использовать для определения дозового интервала, который не был бы токсичным для человека. Дозы для таких пептидов находятся, предпочтительно, в интервале циркулирующих концентраций, который включает ЭД₅₀ с малой токсичностью или вообще без токсичности. Дозы могут меняться в этом интервале значений в зависимости от используемой дозированной формы и способа введения. Конкретную форму, способ введения и дозу должен выбрать врач с учетом состояния пациента (см. например, Еш§1 с1 а1., 1975, Ιη: ТНс Р11агтасо1офса1 Ва818 оГ ТБегареиБсз, сНар1сг 1, раде 1).

Количество доз и интервал между введениями можно установить индивидуально для достижения таких уровней активного ингредиента в плазме, которых достаточно для поддержания терапевтического эффекта. Обычные допустимые дозы для пероральнрго введения находятся в интервале от около 1 до 1000 мг/кг/введение обычно от около 10 до 500 мг/кг/введение, предпочтительно от около 200 до 300 мг/кг/введение, и наиболее предпочтительно от около 50 до 200 мг/кг/введение. В некоторых случаях терапевтически эффективные уровни в сыворотке достигаются в результате введения нескольких доз каждый день. В случае локального введения или селективного поглощения эффективная локальная концентрация лекарственного средства может не быть связана с его концентрацией в плазме. Специалист сможет оптимизировать терапевтически эффективные локальные дозировки без чрезмерных экспериментов.

В зависимости от серьезности состояния и реакции подлежащего лечению пациента, введение доз может быть однократным с использованием композиции с замедленным высвобождением, при этом курс лечения длится от нескольких дней до нескольких недель, до излечения или до ослабления болезненного состояния.

Необходимое для введения количество композиции будет, естественно, зависеть от подлежащего лечению пациента, тяжести заболевания, способа введения, точки зрения лечащего врача и т.д.

Композиции настоящего изобретения можно при желании представить в упаковке или в распределительном устройстве, таком как набор, одобренный ΕΌΛ, который может содержать одну или более из разовых дозированных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, содержать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистер. Упаковка или распределительное устройство может сопровождаться инструкцией для применения. Упаковка или распределительное устройство может также сопровождаться предупреждением, связанным с контейнером в форме предписания правительственного учреждения, регулирующего изготовление, использование или продажу лекарств, при этом такое предупреждение отражает утверждение учреждением формы композиции или введения человеку или животным. Такое предписание может быть, например, этикеткой, утвержденной администрацией США по пищевым и лекарственным продуктам для лекарств, отпускаемых по рецепту врача. Композиции, включающие пептид настоящего изобретения, приготовленные в совместимом фармацевтическом носителе, можно поместить в соответствующий контейнер и снабдить этикеткой для лечения или профилактики указанного состояния, или для того, чтобы вызвать нужный результат.

Подходящие показания на этикетке могут включать лечение и/или профилактику аутоиммунного заболевания или состояния, вирусного заболевания, вирусной инфекции, бактериальной инфекции, гематологического заболевания, гематологического дефицита, тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, гиперлипидемии, гиперхолестеринемии, глюкозурии, гипергликемии, диабета, СПИД, ВИЧ-1 инфекции, нарушения в хелперных Т-клетках, дефицита дендритных клеток, дефицита макрофагов, нарушения в кроветворных стволовых клетках, включая нарушения в тромбоцитах, лимфоцитах, плазмоцитах и нейтрофилах, пролиферации кроветворных стволовых клеток, пролиферации и дифференцирования кроветворных стволовых клеток, предлейкозных состояний, лейкозных состояний, нарушения иммунной системы в результате химиотерапии или лучевой терапии и нарушения иммунной системы человека в результате лечения заболеваний иммунодефицита.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть полезны для поддержания и/или восстановления составляющих кровеносной системы, для баланса количества клеток крови, для баланса уровней метаболитов в крови, включая уровни сахара, холестерина, кальция, мочевой кислоты, мочевины и ферментов, таких как щелочная фосфатаза. Далее фармацевтическая композиция настоящего

- 23 007814 изобретения может быть полезна для индуцирования пролиферации клеток крови, модулирования количества белых и/или красных клеток крови, особенно для повышения количества белых и/или красных клеток крови, повышения уровня гемоглобина в крови и модулирования количества тромбоцитов.

Термин балансировка, используемый в данном описании в связи с уровнями некоторых физиологических параметров, означает изменение уровней этих параметров и подведение их ближе к нормальным значениям.

Термин нормальные значения, в том смысле, как использовано в связи с физиологическими параметрами, означает значения, которые попадают в интервал значений для здоровых людей и животных.

В особо предпочтительных вариантах пептиды настоящего изобретения приводят к нормальным значениям количество красных клеток крови, белых клеток крови, тромбоцитов и уровень гемоглобина. Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно использовать для активации пролиферации клеток крови.

Кроме того, фармацевтические композиции настоящего изобретения можно использовать для лечения и/или профилактики заболеваний кроветворных стволовых клеток, включая заболевания, опосредствованные тромбоцитами, лимфоцитами, плазмоцитами и нейтрофилами, а также дефицита и неправильного функционирования при предлейкозном и лейкозном состояниях и при тромбоцитопении.

Далее фармацевтические композиции можно использовать для лечения и/или профилактики клеточно-пролиферативных заболеваний. В этой связи следует отметить, что фармацевтические композиции настоящего изобретения выгодно использовать для стимулирования иммунного ответа при химиотерапии или при лучевой терапии, для ослабления отрицательных эффектов, уменьшения рвоты, вызываемой химиотерапией и облучением, чтобы способствовать быстрейшему выздоровлению.

Кроме того, фармацевтические композиции настоящего изобретения можно использовать для стимулирования иммунного ответа человека во время лечения заболеваний, связанных с иммунодефицитом, например, ВИЧ и аутоиммуннных заболеваний.

Композиции настоящего изобретения могут быть также предназначены для использования в ветеринарии.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно использовать для лечения и/или профилактики, например, заболеваний, сопровождающихся аномальными уровнями клеток крови, заболеваний, сопровождающихся продуцированием и дифференцированием кроветворных стволовых клеток, для лечения нарушений, опосредованных тромбоцитами, лимфоцитами и/или нейтрофилами, для лечения предлейкозных или лейкозных состояний и для лечения тромбоцитопении. Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно также использовать для лечения заболеваний, связанных с пролиферацией клеток, и заболеваний, связанных с иммунодефицитом, таких как ВИЧ, и аутоиммунных заболеваний. Далее фармацевтические композиции настоящего изобретения можно использовать для модулирования иммунного ответа во время химиотерапии или лучевой терапии, например, для уменьшения рвоты, связанной с химиотерапией.

В результате применения настоящего изобретения на практике было неожиданно обнаружено, что пептиды настоящего изобретения вызывают эффект синергизма в отношении пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток человека с добавлением других кроветворных факторов роста. Заметным является потенциирование опосредствованной эритропоэтином стимуляции образования эритроидных колоний и дозозависимое усиление тромбопоэтинового (ТРО) индуцирования пролиферации мегакариоцитов под действием пептидов настоящего изобретения. Рекомбинантные (гЬ)ЕРО человека в настоящее время являются принятой терапией при таких показаниях, как почечная анемия, анемия раннего развития, анемия, связанная с раковыми заболеваниями и со СПИД, и для предоперационного лечения (8о\\'абе В. е! а1. Ιηΐ I. Мо1. Меб. 1998; 1:305).

Так, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ лечения поддающихся лечению эритропоэтином состояний, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α§1 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления действия эритропоэтина, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α§1 казеина.

Тромбопоэтин является рано действующим цитокином с важными многосторонними эффектами: ТРО как таковой или в комбинации с другими рано действующими цитокинами может (1) промотировать жизнеспособность и подавлять апоптоз в клетках-предшественниках; (ίί) регулировать продуцирование и функции кроветворных стволовых клеток; (ίίί) запускать процесс деления клеток для спящих мультипотенциальных клеток; (ίν) индуцировать полилинейное дифференцирование и (ν) усиливать образование полилинейных колоний, содержащих гранулоциты, эритроциты, макрофаги и мегакариоциты (МК, СРИСЕММ). Более того, ТРО стимулируют продуцирование более ограниченных предшественников для гранулоцит/моноцитных, мегакариоцитных и эритроидных колоний, стимулируют адгезию примитивных клеток костного мозга человека и мегакариоцитных клеток к фибронектину и фибриногену. Таким обра

- 24 007814 зом, ТРО является важным цитокином для клинических специалистов в гематологии/трансплантологии: для мобилизации, амплификации и ех νίνο экспансии стволовых клеток и соответствующих клетокпредшественников для аутологичной и аллогенной трансплантации. Кроме того, введение ТРО здоровым донорам тромбоцитов использовали для увеличения выходов очищенной крови доноров. Однако клинические применения ТРО терапии осложняются, наряду с другими соображениями, относительно высокой стоимостью рекомбинантных цитокинов человека гЬТРО и потенциальной антигенностью ТРО при повторном введении.

Комбинированная обработка ТРО и пептидом настоящего изобретения, либо вместе в фармацевтической композиции, содержащей оба компонента, либо по отдельности, может обеспечить неожиданное, как доказано, нетоксичное усиление эффектов ТРО на пролиферацию и функции клеток-мишеней. В такой комбинации пептид настоящего изобретения можно использовать для лечения, в дополнении к уже указанным выше состояниям, нарушений, таких как миелодиспластический синдром (ΜΌ8), апластическая анемия и осложнения при отказе печени. Предварительная обработка доноров тромбоцитов пептидом настоящего изобретения, отдельно или в комбинации с ТРО, может даже еще больше увеличить эффективность выходов очищенной донорской крови.

Так, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ лечения поддающихся лечению тромбопоэтином состояний, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α§1 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления действия тромбопоэтина, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α§1 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления мобилизации периферических стволовых клеток, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, включающей эффективные количества тромбопоэтина и пептида, полученного из Ν-концевой части α§1 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для лечения поддающегося лечению тромбопоэтином состояния, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для усиления действия тромбопоэтина, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для усиления мобилизации стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования кроветворения, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования мегакариоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования эритропоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования лейкоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фарма

- 25 007814 цевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования тромбоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеин, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения тромбоцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения панцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения гранулоцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для лечения или профилактики показаний, выбранных из группы, состоящей из гематологического заболевания, гематологического дефицита, тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, дефицита дендритных клеток, дефицита макрофагов, нарушений в кроветворных стволовых клетках, включая тромбоциты, лимфоциты, плазмоциты и нейтрофилы, предлейкозные состояния, лейкозные состояния, миелодиспластический синдром, апластическую анемию и недостаточность костного мозга, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция, включающая тромбопоэтин и очищенный пептид, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 1-25, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления колонизации стволовых клеток донорской крови у миелоаблативного реципиента, причем указанный способ осуществляют путем обработки донора стволовых клеток донорской крови пептидом, полученным из Ν-концевой части α81 казеина, и тромбопоэтином до введения и имплантации стволовых клеток донорской крови реципиенту.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления колонизации стволовых клеток донорской крови у миелоаблативного реципиента, причем указанный способ осуществляют путем обработки стволовых клеток донорской крови пептидом, полученным из Ν-концевой части α81 казеина, и тромбопоэтином до имплантации стволовых клеток донорской крови реципиенту.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ усиления колонизации стволовых клеток донорской крови у миелоаблативного реципиента, причем указанный способ включает обработку стволовых клеток крови пептидом, полученным из Ν-концевой части α81 казеина, и тромбопоэтином до имплантации стволовых клеток крови реципиенту.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для лечения поддающегося лечению тромбопоэтином состояния.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для усиления действия тромбопоэтина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для усиления колонизации стволовых клеток донорской крови у миелоаблативного реципиента.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для усиления колонизации стволовых клеток крови у миелоаблативного реципиента.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для усиления мобилизации стволовых клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической компо

- 26 007814 зиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части αδ1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для индуцирования кроветворения.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части αδ1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части αδ1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части αδ1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для индуцирования мегакариоцитопоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части αδ1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для индуцирования эритропоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части αδ1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для индуцирования лейкоцитопоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части αδ1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для индуцирования тромбоцитопоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов, тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части αδ1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения тромбоцитопении.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части αδ1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения панцитопении.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части αδ1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения гранулоцитопении.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части αδ1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения показаний, выбранных из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания или состояния, вирусного заболевания, вирусной инфекции, гематологического заболевания, гематологического дефицита, тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, гиперлипидемии, гиперхолестеринемии, глюкозурии, гипергликемии, диабета, СПИД, ВИЧ-1, нарушений в хелперных Т-клетках, дефицита дендритных клеток, дефицита макрофагов, нарушений в кроветворных стволовых клетках, включая нарушения в тромбоцитах, лимфоцитах, плазмоцитах и нейтрофилах, предлейкозных состояний, лейкозных состояний, нарушений иммунной системы, возникших в результате химиотерапии или лучевой терапии, нарушений иммунной системы, возникших в результате лечения заболеваний иммунодефицита и бактериальных инфекций.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Νконцевой части αδ1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения показаний, выбранных из группы, состоящей из гематологического заболевания, гематологического дефицита, тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, дефицита дендритных клеток, дефицита макрофагов, нарушений в кроветворных стволовых клетках, включая нарушения в тромбоцитах, лимфоцитах, плазмоцитах и нейтрофилах, предлейкозных состояний, лейкозных состояний, миелодиспластического синдрома, апластической анемии и недостаточности костного мозга.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов пептид, полученный из Ν-концевой части αδ1 казеина и тромбопоэтин, и фармацевтически приемлемый носитель, для усиления колонизации стволовых клеток донорской крови у миелоаблативного реципиента.

- 27 007814

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и тромбопоэтин, и фармацевтически приемлемый носитель, для усиления колонизации стволовых клеток крови у миелоаблативного реципиента.

Далее настоящее изобретение относится к противобактериальным фармацевтическим композициям, включающим в качестве активного ингредиента по крайней мере один пептид настоящего изобретения, и к применению пептидов настоящего изобретения в качестве противобактериальных агентов.

Как подробно раскрыто в разделе Примеры ниже, пептиды настоящего изобретения и фармацевтические композиции, включающие в качестве активного ингредиента пептид настоящего изобретения, можно использовать для лечения и профилактики заболеваний клеток крови, нарушений клеточной пролиферации, заболеваний, включающих иммунодефицит и аутоиммунные заболевания.

Так, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения аутоиммунного заболевания, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения вирусного заболевания, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики вирусной инфекции, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования кроветворения, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования мегакариоцитопоэза, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования эритропоэза, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования лейкоцитопоэза, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования тромбоцитопоэза, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования пролиферации плазмоцитов, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования пролиферации дендритных клеток, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ индуцирования пролиферации клеток макрофагов, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения тромбоцитопении, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения панцитопении, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту

- 28 007814 терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения гранулоцитопении, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения гиперлипидемии, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеин.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения гиперхолестеринемии, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения глюкозурии, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α81 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения диабета, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения СПИД, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α§1 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения ВИЧ инфекции, причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части α§1 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен способ профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиолучевой терапии, поддержанной трансплантацией клеток аутологичного костного мозга или стволовых клеток периферической крови (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), причем указанный способ осуществляют путем введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Νконцевой части α§1 казеина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения вирусного заболевания, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики вирусной инфекции, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования кроветворения, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Νконцевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования мегакариоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования эритропоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически прием

- 29 007814 лемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования лейкоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования тромбоцитопоэза, причем указанная фармацевтическая композиция включает, в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации плазмоцитов, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации дендритных клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для индуцирования пролиферации макрофагов, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения тромбоцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения панцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения гранулоцитопении, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения гиперлипидемии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения гиперхолестеринемии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения глюкозурии, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения диабета, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения СПИД, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения ВИЧ инфекции, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиолучевой терапии, поддержанной трансплантацией клеток аутологичного костного мозга или стволовых клеток периферической крови (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), причем указанная фар

- 30 007814 мацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Νконцевой части α81 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для профилактики или лечения вирусного заболевания.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для профилактики вирусной инфекции.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для индуцирования кроветворения.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для индуцирования мегакариоцитопоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для индуцирования эритропоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для индуцирования лейкоцитопоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для индуцирования тромбоцитопоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для индуцирования пролиферации плазмоцитов.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для индуцирования пролиферации дендритных клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для индуцирования пролиферации макрофагов.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для профилактики или лечения тромбоцитопении.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для профилактики или лечения панцитопении.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеин для профилактики или лечения гранулоцитопении.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для профилактики или лечения гиперлипидемии.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для профилактики или лечения холестеринемии.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для профилактики или лечения глюкозурии.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для профилактики или лечения диабета.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для профилактики или лечения СПИД.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для профилактики или лечения ВИЧ инфекции.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиолучевой терапии, поддержанной трансплантацией клеток аутологичного костного мозга или стволовых клеток периферической крови (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ).

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для лечения поддающегося лечению тромбопоэтином состояния.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для усиления действия тромбопоэтина.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для усиления мобилизации стволовых клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α81 казеина, для усиления колонизации стволовых клеток донорской крови у миелоабла

- 31 007814 тивного реципиента.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение пептида, полученного из Νконцевой части α§1 казеина, для усиления колонизации стволовых клеток крови у миелоаблативного реципиента.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения вирусного заболевания.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения вирусной инфекции.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для индуцирования кроветворения.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиент, пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для индуцирования мегакариоцитопоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для индуцирования эритропоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиент, пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для индуцирования лейкоцитопоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для индуцирования тромбоцитопоэза.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для индуцирования пролиферации плазмоцитов.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для индуцирования пролиферации дендритных клеток.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для индуцирования пролиферации макрофагов.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения тромбоцитопении.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения панцитопении.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения гранулоцитопении.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения гиперлипидемии.

- 32 007814

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения холестеринемии.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения глюкозурии.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения диабета.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения СПИД.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиент, пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель для профилактики или лечения ВИЧ инфекции.

Далее в соответствии с настоящим изобретением раскрыто применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части α§1 казеина, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиолучевой терапии, поддержанной трансплантацией клеток аутологичного костного мозга или стволовых клеток периферической крови (А8СТ), или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ).

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложен очищенный пептид, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ Ν0:1-25.

Далее в соответствии с настоящим изобретением предложена фармацевтическая композиция, включающая очищенный пептид, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ Ν0:1-25, и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение с успехом преодолевает недостатки известных в настоящее время конфигураций, предоставляя пептиды для лечения заболеваний человека, причем указанные пептиды, полученные из Ν-концевой части α§1 казеина, не обладают заметной токсичностью, зато отличаются высокой терапевтической эффективностью.

Дополнительные цели, преимущества и новые отличительные особенности настоящего изобретения будут очевидны специалистам после ознакомления со следующими примерами, которые не следует рассматривать как ограничивающие. Кроме того, каждый из различных вариантов и аспектов настоящего изобретения, как оно изложено выше и как заявлено в формуле изобретения, находит экспериментальное подтверждение в приведенных ниже примерах.

Примеры

Сделаны ссылки на следующие примеры, которые вместе с приведенным выше описанием, иллюстрируют изобретение не лимитирующим образом.

Материалы и экспериментальные методы

Препараты пептидов, полученных из нативного казеина Фракцию казеина из коровьего молока выделяют по способу Н1рр е! а1. (1952), 1Ь1б. и подвергают исчерпывающему протеолитическому расщеплению химозином (известным также как реннин) (20 нг/мл) при 30°С. После завершения реакции раствор нагревают для инактивирования фермента и гидролизат осаждают как параказеин, подкисляя органической кислотой, уксусной или трихлоруксусной кислотой. Параказеин выделяют центрифугированием и надосадочную фракцию, содержащую представляющие интерес пептидные фрагменты, диализуют и снова осаждают как казеицидин более высокими концентрациями кислоты. Полученный казеицидин после повторного суспендирования, диализа и нейтрализации лиофилизируют. Анализируют биологическую активность полученного порошкового препарата, как указано ниже, и выделяют с помощью ВЭЖХ для пептидного анализа.

ВЭЖХ анализ пептидов, полученных из нативного казеина

Пептиды, полученные из нативного казеина, как указано выше, анализируют с помощью ВЭЖХ в две стадии. Сначала лиофилизированный казеиновый гидролизат разделяют, используя С18 обращенную фазу и градиентное элюирование смесью: 0,1% водная трифторуксусная кислота (мас./мас.)-ацетонитрил.

Детектирование осуществляют по УФ поглощению при 214 нм. После этого образцы анализируют с помощью ВЭЖХ-масс-спектрометра (М8), снабженного источником распыления электронов.

Рассчитанные массы представляют массы ионизированных пептидных образцов, как получено из времен удерживания. После разделения аминокислотный состав пептидов определяют с помощью газофазного микросеквенатора (АррНеб ВюкуЩетк 470А).

Приведенные результаты являются репрезентативными: обычно наблюдают восемь пиков пептидов, из которых 3 основные пика имеют К! значения 17,79, 19,7 и 23,02 и 5 более слабых пиков с величинами К! 12,68, 14,96, 16,50, 21,9 и 25,1, при этом величины К! соответствуют молекулярным массам 2764,

- 33 007814

1697, 1880, 2616, 3217, 2333, 1677 и 1669 Да соответственно. Для В! 17,79 (соответствующему 2764 Да) основной пик пептида, состоящего из 23 аминокислот, которые представляют аминокислоты 1-23 αδ1 казеина, имеет последовательность ВРКНРIКН^Ο^Р^ΕV^NΕN^^ВΓ ^Ер ΙΩ ΝΟ: 22, см. МсЗиеепу е! а1., 1993, 1Ь1б., для полной последовательности αδ1 казеина). Другие пептиды соответствуют положениям 208-224 β казеина, положениям 16-37 αδ1 казеина и положениям 197-222 αδ2-подобного казеинового предшественника. Присутствуют также и другие пептиды.

Синтетические пептиды, полученные из казеина

Пептиды, с возрастающими длинами цепочек, соответствующие Ν-концевым 2-26 аминокислотам αδ1 казеина, были синтезированы ХоУейбе Иб., НаГа, 1кгае1, со степенью чистоты >95% (ВЭЖХ). Контроль качества включает: ВЭЖХ, Масс-спектрометрию (Е1), анализ аминокислот и содержания пептидов. В табл. 3 приведены указанные пептиды.

Таблица 3

Идентификация	Последовательность (Ν-конец - С-конец)	№ аминокислот	5ΕΟ Ю ΝΟ:
74	КР	2	1
1Р	КРК	3	2
2Р	ЯРКИ	4	3
ЗР	КРКНР	5	4
4Р	ΚΡΚΗΡΙ	6	5
5Р	ЯРКНР1К	7	6
¥	КРКНР1КН	8	7
X	КРКИР1КНО	9	8
1а	К.РКИР1КНОС	10	9
2а	КРКНРГКНСЮЬ	11	10
За	КРКНР1КНЦСЕР	12	11
А	КРКНР1КНОСЕРО	13	12
В	КРКНР1КН06ЕР0Е	14	13
С	ЯРКНРПСНЦСЬРОЕУ	15	14
О	ΚΡΚΙΙΡΙΚΗςΟΕΡρΕνΕ	16	15
Е	ΚΡΚΗΡΙΚΗφαΕΡΟΕνί,Ν .	17	16
Е	ΚΡΚ.ΗΡ1ΚΗφ6Ι..Ρ0Ενΐ..ΝΕ	18	17
С	ΚΡΚΗΡΙΚΙ-ΐρθΙ.ΡφΕνΕΝΕΝ	19	18
Н	ΚΡΚΗΡΙΚΗΟΟΕΡφΕνί.ΝΕΝΕ	20	19
1	ΚΡΚΗΡΙΚ.ΗΟΟΕΡφΕν[,ΝΕΝ1,Ε	21	20
1	ΚΡΚΗΡΙΚΗφΟΕΡΡΕνί-ΝΕΝΕΕΚ	22	21
к	ΚΡΚΙ]ΡΙΚΗφαΐ.ΡςΕν[,ΝΕΝΙ.ΧΚΓ	23	22
I,	ЙРКНР1КНЦО1 ,ΡφΕνΐ..ΝΕΝ1.ΕΚΕΡ	24	23
N4	ΚΡΚ}ΙΡΙΚΙ10α..ΡρΕνΕΝΕΝ1,ΕΚΕΓν	25	24
N	ΚΡΚΗΡ1ΚΗφ6Ι.ΡΡΕνΕΝΕΝΕΕΚ.ΕΕνΑ	26	25

Ювенильный диабет (Тип I, ΙϋϋΜ) у диабетических мышей без ожирения (ΝΟΏ) Пептиды, полученные из нативного казеина

Мыши ΝΟΩ представляют собой обычно используемую модель для исследования аутоиммунных заболеваний и ювенильного диабета человека. Шестинедельным самкам ΝΟΩ мышей вводят либо одну, либо две инъекции в неделю по 100 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, всего за 5 или 10 обработок. Контрольных мышей не обрабатывают. Степень заболевания определяют по глюкозурии, которую измеряют, используя СотЫ !ек! кИскк [Огокк, ΩΤ. е! а1. (1994), ^^аЬе!ο1οду, 37:1195]. Результаты выражают как процент мышей без глюкозурии для каждого из образцов в течение периода в 365 дней.

Синтетические пептиды, полученные из казеина

В другом эксперименте шестинедельным самкам ΝΟΩ мышей вводят по одной инъекции в неделю по 100 мкг синтетических пептидов, полученных из казеина; всего пять обработок. Контрольных мышей не обрабатывают. Результаты выражают как число здоровых мышей в различных тестируемых группах.

Тест на переносимость глюкозы при внутрибрюшинном введении: (1РСТТ)

Тест на переносимость глюкозы является принятым методом для исследования метаболизма глюкозы и диабетических тенденций у млекопитающих. Через двадцать пять (25) недель после введения синтетических пептидов, полученных из казеина, оценивают реакцию на введение глюкозы, используя тест на переносимость глюкозы при внутрибрюшинном введении. Количество вводимой с помощью инъекции

- 34 007814 глюкозы составляет 1 г/кг массы тела. Гликемические показатели определяют по анализам крови, которую отбирают до начала теста (0 мин) и через 60 мин после введения. Уровни содержания глюкозы в плазме определяют, используя С1исозе Апа1ухег 2 (Весктап 1пз1гитеп1з. Еи11ег1оп. СА) , и выражают в единицах ммоль/л. Нормальные значения не превышают 140 ммоль/л.

Стимулирование пролиферации натуральных киллерных (ΝΚ) клеток из стволовых клеток периферической крови человека (РВ8С)

РВ8С от С-С8Г-обработанных субъектов разделяют, используя градиент Фиколла, дважды промывают средой КРМ1-1640 и высевают в 1,5 мл лунки с пептидами, полученными из нативного казеина, или пептидами, полученными из синтетического казеина, или без пептидов, как указано (0-500 мкг/мл). После двух дней инкубирования клетки анализируют на активность натуральных киллерных клеток, измеряя радиоактивность, выделенную из ³⁵8-меченных К562 клеток-мишеней (ΝΕΟ-709Α, 185,00 МБк%, 2,00 мКи ΕΑ8ΥΤΑ6Φ метионин, Ь-[³⁵8] 43,48 ТБк на ммоль, 1175,0 Ки на ммоль, 0,488 мл, Воз1оп И8А). Две концентрации эффекторных клеток (2,5х10⁵ и 5х10⁴ клеток на лунку) инкубируют с 5х10³ клетокмишеней на лунку (соотношения эффекторные клетки: клетки-мишени составляют 50:1 и 100:1 соответственно) в планшетах для культуры тканей с И-образными лунками. Клетки инкубируют в течение 5 ч при 37°С в смеси 5% СО₂, 95% воздуха, и осаждают пятиминутным центрифугированием со скоростью 1000 об./мин. Выделение ³⁵8 измеряют в 50 мкл образцах надосадочной жидкости.

Из клеток мышиного костного мозга (ВМ)

Костный мозг отбирают у необработанных мышей ВАЬВ/с и С57В1/6. Костный мозг отбирают из длинных костей передних и задних лап мышей, вводя среду, используя иглы 25 размера. Отсосанные клетки промывают КРМ1 1640, подсчитывают в гемоцитометре и витально окрашивают (20 мкл клеток в 380 мкл смеси уксусная кислота-трипановый синий), затем высевают в культуральные склянки в концентрации 2-5х10⁶ клеток/мл в среду КРМ1-1640, содержащую 10% фетальной телячьей сыворотки, антибиотики и глутамин с добавлением или без добавления 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина. Культуры клеток инкубируют в смеси 5% СО₂, 95% воздуха в течение 12-15 дней при 37°С, собирают десятиминутным центрифугированием при 1500 об./мин, подсчитывают и высевают в Иобразные лунки с ⁵¹Сг (хром-51, 740 МБк, 2,00 мКи активность) или ³⁵8 (ΝΕΟ-709Α, 185,00 МБк, 2,00 мКи ΕΑ8ΥΤΑ6Φ Метионин, Ь-[³⁵8] 43,48 ТБк на ммоль, 1175,0 Кюри на ммоль, 0,488 мл, Воз1оп И8А) мечеными клетками мышиной лимфомы ААС') при соотношении эффекторные клетки:клетки-мишени либо 25:1 либо 50:1. ΝΚ активность выражают как процент радиоактивности в не содержащих клеток надосадочных жидкостях.

Пролиферация клеток человека в культуре

Периферическую кровь (РВ) отбирают у здоровых или больных пациентов. Вольным пациентам не вводят ничего, кроме С-С8Г перед плазмофорезом. Клетки костного мозга (ВМ) отбирают у здоровых добровольцев или больных пациентов с ремиссией после химиотерапии путем отсасывания. Пуповинную кровь отбирают в процессе нормальных родов. Клетки человека различного происхождения выделяют, используя градиент Фиколла, дважды промывают средой КРМ1-1640 и высевают в 0,2 мл плоскодонные культуральные планшеты, в указанных концентрациях с добавлением или без добавления пептидов, полученных из нативного казеина, или с добавлением или без добавления пептидов, полученных из синтетического казеина, как указано. Все обработки, включая контрольные, повторяют трижды. Клеточную пролиферацию определяют по включению ³НТ: добавляя радиоактивный тимидин [тимидин (метил[³Н] ) Удельная активность 5 Ки на мл, 37 МБк на мл, ΙΟΝ Согр.] после инкубирования в течение указанного количества дней. Клетки затем инкубируют в течение 16-20 ч с меткой, собирают и промывают средой. Включенную радиоактивность измеряют с помощью β сцинтилляционного счетчика.

Пролиферация клеточных линий лейкоза Κ562 и рака толстой кишки

Клеточные линии рака толстой кишки и лейкоза К526 являются распространенными линиями злокачественных клеток, выращиваемых в культуре. Обе клеточные линии выращивают в культуральных флаконах в атмосфере, состоящей из 5% СО₂, 95% воздуха, при 37°С, собирают и промывают средой перед посевом в лунки для культуры тканей в количестве 4х10⁵ клеток (К562) или 3х10³ клеток (раковые клетки толстой кишки) на лунку. Пептиды, полученные из нативного казеина, добавляют в лунки в указанных концентрациях и после 9 (К562) или 3 (клетки толстой кишки) дней инкубирования добавляют меченый тимидин, как указано выше. Сбор и измерения захвата радиоактивности осуществляют указанным выше способом.

Определение ΝΚ- и Т-клеточной пролиферации в стволовых клетках периферической крови человека (РВ8С) с помощью флуоресцентных антител

Стволовые клетки периферической крови (РВ8С) от пациентов, которым вводили С-С8Г, собирают с помощью плазмофореза, разделяют, используя градиент Фиколла, дважды промывают средой КРМ11640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, и инкубируют в культуральных флаконах при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО₂ и 95% воздуха, с добавлением или без добавления указанных концентраций пептидов, полученных из нативного казеина. После 10, 14 или 28 дней инкубирования с пептидами, полученными из нативного казеина, наличие Т-клеток (СЭ₃ поверхностный антиген) и ΝΚ клеток (СО₅₆ поверхностный антиген) определяют с помощью прямой иммунофлуоресценции, используя

- 35 007814 анти-СИз флуоресцентное антитело (СИ₃/Е1ТС клон ИНСТ1), анти-СИ₅₆ флуоресцентное антитело (СИ₅₆/КРЕ клон МОС-1) (И АКО А/8, Иептатк) и мышиные 1дС1/КРЕ и 1дС1/Е1ТС антитела в качестве контроля. Детектирование флуоресцентно меченых клеток осуществляют, используя сортировку по флуоресцентно активированным клеткам (ЕАС8).

Стимулирование кроветворения с использованием клеток костного мозга (ВМ) в культуре Пролиферация мегакариоцитов в мультипотетнтных колониях (СЕИ-СЕММ) из клеток мышиного костного мозга

Первичные клетки костного мозга (1х10⁵ на мл) полученные от 8-12 недельных мышей С3Н/Не1, выращивают в не содержащей сыворотки метилцеллюлоза-ΙΜΌΜ среде в течение 8-9 дней в атмосфере 5% СО₂, 95% воздуха, при 37°С. Среда, подходящая для роста мультипотентных колоний (СЕИ-СЕММ), содержит 1% В8А (81дта), 10^-4М тиоглицерина (81дта), 2,8х10^-4М трансферрина человека (ТЕ, Вю1ощса1 1пби51пе5. 1ктае1), 10% ЭДЕН1-СМ в качестве источника 1Ь-3 и 2 ед/мл эритропоэтина (тйЕРО, К&И 8ук1ет5. М1ппеаро11к). Колонии оценивают через 8-9 дней, используя темнопольный микроскоп О1утрик. Колонии отбирают микропипеткой, цитоцентрифугируют и окрашивают Мау-Сгиита1б-С1ет5а для дифференцированного подсчета. Подсчитывают, по крайней мере, 700 клеток для каждого препарата.

Пролиферация дендритных клеток в СЕи-СЕММ

Мультипотентные (СЕИ-СЕММ) колонии, выращенные из первичных клеток костного мозга, как раскрыто выше для анализа пролиферации мегакариоцитов, собирают, окрашивают и подсчитывают для определения количества дендритных клеток. Подсчитывают по крайней мере 700 клеток для каждого препарата.

Пролиферация плазмацитов в СЕИ-СЕММ

Мультипотентные (СЕИ-СЕММ) колонии, выращенные из первичных клеток костного мозга, как раскрыто выше для анализа пролиферации мегакариоцитов, собирают, окрашивают и подсчитывают для определения количества плазмацитов. Подсчитывают по крайней мере 700 клеток для каждого препарата.

Пролиферация клеток макрофагов в СЕИ-СЕММ

Мультипотентные (СЕИ-СЕММ) колонии, выращенные из первичных клеток костного мозга, как раскрыто выше для анализа пролиферации мегакариоцитов, собирают, окрашивают и подсчитывают для определения количества клеток макрофагов. Подсчитывают по крайней мере 700 клеток для каждого препарата.

Пролиферация тромбоцитов в СЕИ-СЕММ

Мультипотентные (СЕИ-СЕММ) колонии, выращенные из первичных клеток костного мозга, как раскрыто выше для анализа пролиферации мегакариоцитов, собирают, окрашивают и подсчитывают для определения количества тромбоцитов. Подсчитывают по крайней мере 700 клеток для каждого препарата.

Пролиферация полиморфоядерных клеток (РМХ) в СЕИ-СЕММ

Мультипотентные (СЕИ-СЕММ) колонии, выращенные из первичных клеток костного мозга, как раскрыто выше для анализа пролиферации мегакариоцитов, собирают, окрашивают и подсчитывают для определения количества полиморфонуклеарных клеток. Подсчитывают по крайней мере 700 клеток для каждого препарата.

Пролиферация клеток, образующих мегакариоциты и эритроиды, из костного мозга и из клеток крови спинного мозга человека

Образец костного мозга, полученный от видимо здорового человека, разделяют, используя градиент плотности на Н|51орас.|ие-107 (81дта И1адпо5ЙС5), в результате чего получают очищенную популяцию мононуклеарных клеток (МИС). Анализ колоний осуществляют в среде для чашек Петри, содержащей конечную концентрацию 0,92% метилцеллюлозы (порошок 4000 сепйтраке, 81дта И1адпо5Йс), снова растворяют в модифицированной Исковым среде Дюльбекко, содержащей з6 мМ бикарбоната натрия (С1Ьсо), 30% фетальной телячьей сыворотки (ЕВ8) (Нус1опе), 0,292 мг/мл глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 0,01 мг/мл стрептомицина (Вю1одюа1 Шбикйтек, Вей Наетек). Кровь, взятую из пуповины здоровых новорожденных, собирают и обрабатывают указанным выше способом.

Среду для анализа колоний, содержащую 10⁵ М^С на мл, высевают в 24 луночные культуральные планшеты (в трех экземплярах) (Стешет), по 0,33 мл на лунку. Культуры инкубируют при 37°С, в атмосфере, содержащей 5% СО₂ и 95% воздуха, при 55% относительной влажности с пептидами (или без них), полученными из нативного казеина, или пептидами, полученными из синтетического казеина, в указанных концентрациях. Планшеты анализируют спустя 14 дней, подсчитывая колонии, содержащие более 50 клеток. Мегакариоциты идентифицируют с помощью косвенной иммунофлуоресценции, используя высокоспецифичные кроличьи антитела, распознающие гликопротеины тромбоцитов человека, и Е1ТС-конъюгированный козий антикроличий 1дС. Добавленные факторы роста, включают 15 нг/мл 1еисотах (СМ-С8Е) (8апбох Рйатта) и 5% (об./об.) индуцированную фито-гемагглютинином-т человека (Ийсо ЬаЬ) кондиционированную среду (СМ) для индуцирования развития гранулоцит-моноцитных колоний (СЕИ-СМ).

Для индуцирования образования эритроидных колоний добавляют эритропоэтин (ЕРО) в количест

- 36 007814 ве 2 ед/мл (быстро развивающиеся (ЬигаМогттд) единичные-эритроидные-ВЕИ-Е).

Альтернативно, клетки костного мозга человека, полученные от добровольцев-доноров или пациентов, которые претерпели аутологичную трансплантацию костного мозга, предварительно культивируют в среде, содержащей 10-1000 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, культуру ведут на полутвердом агаре и подсчитывают гранулоцитарно-макрофагальные кроветворные колонии (СМ-СЕИ) на 7 или 14 день после обработки.

Мегакариоцитопоэз оценивают для нормальных клеток костного мозга, полученных от здоровых добровольцев-доноров, либо подсчитывая число мегакариоцитов в образцах жидких культур (ВРМ1-1640 плюс 10% АВ сыворотка человека, глутамин и антибиотики) с добавлением или без добавления 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, или с помощью метилцеллюлозного анализа для оценки образования колоний. 2х10⁵ клеток костного мозга высевают в присутствии стандартной комбинации факторов роста с добавлением или без добавления пептидов, полученных из нативного казеина. В метилцеллюлозном анализе мегакариоциты подсчитывают с помощью обращенного микроскопа на 12-14 день после посева.

Клинические исследования с использованием пептидов, полученных из нативного казеина

В одной из серий исследований разовую дозу, содержащую 50 мг пептидов, полученных из нативного казеина, вводят внутримышечно пациенту 3 порциями, в течение 2 ч. Клинические параметры контролируют с указанными интервалами. В других исследованиях пациенты с различными стадиями лечения и/или ремиссии по поводу раковых заболеваний и метастазов получают пептиды, полученные из нативного казеина, один или два раза, при этом осуществляется контроль над изменениями количества клеток в периферической крови.

1п уйго ингибирование ВИЧ инфекции лимфоцитных клеток человека

Пептиды

Пептиды (либо пептиды, полученные из нативного казеина, либо синтетические пептиды, полученные из казеина, (состоящие из 2-26 аминокислот, см. табл. 3), поставляемые в виде лиофилизованного порошка, снова суспендируют в полной среде ВРМ1 и добавляют в клеточные культуры в конечных концентрациях от 50 до 1000 мкг/мл.

Клетки

Известно, что несколько типов свежевыделенных клеток человека (первичные клетки) и клеточных линий восприимчивы к ΐπ νίίτο ВИЧ-1 инфекции, хотя в основном любая клетка, даже с низким уровнем содержания на поверхности СЭ4 молекул, может рассматриваться как потенциальная мишень для ВИЧ-1 инфекции. Были выбраны две обычно используемые клеточные линии человека, которые проявляют высокую чувствительность к ВИЧ-1 инфекции, СЕМ и 8ир-Т1.

СЕМ представляет собой Т4-лимфобластоидную клеточную линию человека, полученную вначале С.Е. Ео1еу еί а1. [(1965), Сапсег 18:522] из периферической крови лейкоцитарной пленки 4-летней кавказской девочки с острым лимфобластоидным лейкозом. Эти клетки постоянно поддерживали в суспензии в среде и широко использовали для анализов инфекционной способности, противовирусных агентов и нейтрализующих антител.

8ир-Т1 представляет собой Т-лимфобластоидную клеточную линию человека, полученную из плевральной жидкости 8-летнего мальчика с неходжкинской Т-клеточной лимфомой |8ιηί11ι 8.Ό. еί а1. (1984) Сапсег ВекеагсЬ 44:5657]. Эти клетки экспрессируют высокие уровни поверхностных СЭ4, и их удобно использовать при изучении слияния клеток, цитопатического эффекта и инфекционной способности ВИЧ-1. Культуру 8ир-Т₁ клеток ведут в суспензии в обогащенной среде.

Среда

Клетки выращивают в полной среде ВРМ1-1640, обогащенной 10% фетальной телячьей сывороткой, 2 мМ глутамина и 2 мМ пенициллин-стрептомицина (С1ВСО).

Вирус

В качестве ВИЧ вирусного штамма используют ВИЧ-1ШВ, исходно обозначаемый как НТЬУ-ШВ. Концентрированные культуральные жидкости периферической крови, полученной от нескольких пациентов с ΑΙΌ8 или родственными заболеваниями, используют для установления постоянной продуктивной инфекции в Н-9 клетках. Этот подтип В вируса обладает высокой способностью реплицироваться в Т-клеточных линиях человека. Титр вируса составляет 5,38 нг/мл в исходном растворе.

Е1ТС-меченые пептиды

Используют Е1ТС Е-1300 (Флуоресцинизотиоцианат, изомер I, 81дта (Е25о-2) 8ί. Ьошк, ΜΙ, И8А) с максимумами возбуждение/испускание около 494/520 нм, соответственно. Производное флуоресцина реакционноспособное в отношении амина является, вероятно, наиболее общепринятым реагентом для получения флуоресцентных производных для ковалентного введения меток в белки. Е1ТСконъюгированные пептиды, полученные из нативного казеина, приготавливают путем ковалентного связывания

НТС с аминогруппами лизина

Анализ захвата антигена ВИЧ-1 Р²⁴

Используют набор для анализа захвата антигена ВИЧ-1 Р²⁴, созданный для количественного опре

- 37 007814 деления ядерного антигена ВИЧ-1 Р²⁴, что прямо пропорционально степени продуцирования вируса в клетках. Этот набор поступает из программы вакцинации АГО8 8А1С-МС1-Егейепск Сапсег Рс5саге11 Ιηδΐί1и1с. Р.О. Вох В, Ргебепск, Μ.Ό 21702, И8А и включает 96 луночные планшеты, покрытые моноклональным антителом к ВИЧ-1 Р²⁴, первичную антитело-кроличий анти-ВИЧ Р²⁴ сыворотку, вторичное козий анти-кроличий-1дС (Н+Ь) конъюгированное с пероксидазой антитело, систему ТМВ пероксидазного субстрата и подвергнутый лизису стандарт ВИЧ-1 Р²⁴. Анализ захвата ВИЧ-1 Р²⁴ антигена осуществляют с помощью считывающего при длине волны 450 нм устройства Огдапоп-ТесЬшса ЕЫ8А геабег, используя сравнение при длине волны 650 нм.

ЕЫ8А захвата антигена ВИЧ-1 Р²⁴

ВИЧ инфекцию определяют с помощью косвенного ферментного иммуноанализа, в котором определяют ВИЧ-1 Р²⁴ ядерные антигены в среде для культуры тканей. Надосадочную жидкость культуры тканей подвергают взаимодействию с первичным кроличьим анти-ВИЧ-1 Р²⁴ антигеном и визуализируют, используя конъюгированный с пероксидазой козий антикроличий 1дС. Реакцию заканчивают, добавляя 4н Н₂8О₄, причем интенсивность возникающей окраски пропорциональна количеству ВИЧ-1 антигена, присутствующего в надосадочной жидкости культуры тканей.

Уровень биологической безопасности 3 (ВЬ-3) лаборатории

Все способы получения и выделения вирусов, инфицирования вирусами, процесс культивирования ВИЧ-1 инфицированных клеток, сбор надосадочной жидкости, содержащей Р²⁴ антиген, и ЕЬ18А захвата Р²⁴ антигена, осуществляли в условиях ВЬ-3 НеЬгете ишуег811у, Найа88аЬ'Мей1са1 8с1юо1 и проводили в соответствии с практикой биобезопасности, указанной в ΝΙ4 и СЭС (И8А).

Проточная цитометрия

Сортировщик клеток РАС8ог1 (ВесЮп & Эккткоп, 8ап 1о5е, СА. И8А) использовали для (1) определения процента СЭ4 положительных СЕМ и 5ир-Т1 клеток перед их инфицированием ВИЧ-1 для уверенности в существовании одинаковых степеней инфицирования в каждом из экспериментов; и (и) определения Т-клеток, которые содержат в своей цитоплазме и ядрах Е1ТС-конъюгированные пептиды, полученные из нативного казеина.

Инкубатор с СО₂

Для получения клеток вирусных культур с ВИЧ-1, клетки и вирусы, предварительно обработанные пептидами, полученными из нативного казеина, и все клетки, которые были дополнительно инкубированы с ВИЧ-1, содержали во влажной атмосфере СО₂ на протяжении всего эксперимента.

ВИЧ инфицирование культивированных СИ4 клеток человека

Для более длительного инкубирования клетки (СЕМ, 8ир-Т1) предварительно инкубируют с несколькими возрастающими концентрациями пептидов, полученных из нативного казеина (50-1000 мкг/мл) или синтетических пептидов, полученных из казеина (10-500 мкг/мл) в течение 24 (для синтетических и природных пептидов) и 48 (только для природных пептидов) ч, и после этого в каждую лунку добавляют ВИЧ-1ШВ (45 пкг/мл конечная концентрация). Для более короткого срока инкубирования (3 ч) ВИЧ-1ШВ предварительно инкубируют с пептидами в течение 3 ч, а затем добавляют к клеткам (5000 клеток/лунка) в планшеты для культуры тканей. Контролями служат ΙΕ (инфицированные клетки, культивированные с ВИЧ-1 и без пептидов), ϋΙΕ (Неинфицированные клетки, культивированные без ВИЧ-1 и без пептидов) и ϋΙΕ + С1 (неинфицированные + пептиды, полученные из нативного казеина) клетки, культивированные в присутствии пептидов, полученных из нативного казеина (50-1000 мкг/мл) для тестирования действия, которое оказывают пептиды, полученные из нативного казеина и синтетические пептиды, полученные из казеина, на жизнеспособность и рост Т-клеток. Жизнеспособность и степень пролиферации клеток определяют на 7, 10 и 14 день после инфицирования (день сбора надосадочной жидкости с культуры Р²⁴ антигена). Клетки и надосадочные жидкости культуры тканей (среду) собирают и немедленно подвергают лизису в 1/10 объема 10% ТгПоп Х-100. Затем эти образцы инкубируют при 37°С в течение 1 ч и хранят при -80°С до момента тестирования на Р²⁴ антиген.

Конфокальная микроскопия

Для определения проникновения Е1ТС-конъюгированных пептидов в клетки используют конфокальную лазерную сканирующую систему 2е155 Ь8М 410, соединенную с обращенным микроскопом Т\У 2е155 Ахюуей 13 5М, в котором использована техника лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Т-клетки инкубируют с Е1ТС-конъюгированными пептидами, полученными из нативного казеина, в инкубаторе с атмосферой, содержащей 5% СО₂ и 95% воздуха, при 37°С, после чего клетки трижды промывают забуференным фосфатом солевым раствором (РВ8) для удаления не связанных Е1ТС-пептидов. Клетки фиксируют 3,8% формалином в течение 10 мин, дважды промывают РВ8 и снова суспендируют в 50-100 мкл РВ8 перед наблюдением клеток под микроскопом. Выбранные изображения клеток для различных времен инкубирования (15, 30 мин, 1, 1,5 и 3 ч), которые демонстрируют различные количества Е1ТС-пептидов, полученных из нативного казеина, в их цитоплазме и ядрах, хранят на 3,5 дюймовых дискетах (230 МВ) и для получения изображений используют программное обеспечение Р1ю1о51юр.

Тест на включение [³Н] -тимидина

Для того чтобы протестировать действие пептидов, полученных из нативного казеина, на пролиферацию Т-клеток несколько концентраций пептидов, полученных из нативного казеина (исходная концен

- 38 007814 трация 10 мг/мл в ΚΡΜΙ), добавляют к §ир-Т1 клеточным культурам в 96 микролуночном плоскодонном планшете (5000 клеток/лунка), как это описано для ВИЧ-1 инфицирования в 8ир-Т1 клетки. Клетки подсчитывают и их жизнеспособность определяют с помощью исключения трипанового синего. Их импульсно метят [³Н]-тимидином в определенные моменты времени (3, 7, 10 и 14 дней) в течение 18 ч (в течение ночи) и собирают на фильтры из стекловолокна для измерения радиоактивности (включение [³Н]-тимидина в клеточную ДНК пропорционально степени клеточной пролиферации).

Токсичность пептидов, полученных из нативного казеина, для нормальных, миелоаблативных и мышей и морских свинок с трансплантатами Внутримышечными или внутривенными инъекциями нормальным животным вводят в одной дозе или в трех дозах, вплоть до 5000 мг пептидов, полученных из нативного казеина, на кг массы животного. Используют различные штаммы, включая ВАЬВ/с, С3Н/Не1 и нетучных диабетических (ΝΘΌ) мышей. Мышей наблюдают либо в течение 10 месяцев перед забоем и исследуют посмертно (анализ токсичности), либо наблюдают в течение 200 дней (степень выживания). Морским свинкам вводят однократно с помощью внутримышечной инъекции по 20 мг пептидов каждому животному. Через 15 дней их забивают и исследуют на предмет патологических изменений.

Восстановление лейкоцитов и тромбоцитов у мышей с трансплантированным костным мозгом

Мышей ВАЬВ/с.) облучают сублетальной дозой из источника, расположенного на расстоянии 70 см от кожи, дозой 50 сГй в минуту, всего до 600 сГй. Облученных животных восстанавливают сингеничным костным мозгом, как указано выше, и спустя 24 ч внутривенно вводят 1 мг/животное пептидов, полученных из нативного казеина, синтетических пептидов, полученных из казеина (13-26 аминокислот, см. табл. 3) или альбумина сыворотки человека (контроли), с последующим двойным слепым исследованием. Восстановление лейкоцитов определяют в соответствии с количеством клеток в периферической крови, отобранной в указанные временные интервалы от 6 до 12 дней после обработки. Восстановление тромбоцитов определяют по количеству клеток в крови, отобранной из ретроорбитального сплетения, в содержащие ΕΌΤΑ ампулы, в указанные временные интервалы с 6 по 15 день после обработки.

В дополнительных сериях экспериментов СВА мышей облучали летальной дозой (900 сГй), восстанавливали ВМ клетками и обрабатывали пептидами, полученными из нативного казеина, или альбумином сыворотки человека, как указано выше. Восстановление тромбоцитов определяют, как указано выше.

В третьей серии экспериментов мышей облучали (800 сГй), восстанавливали и вводили внутрибрюшинной инъекцией 100 мкг синтетических пептидов, полученных из казеина (пептиды 3 а и 4Р, представляющие первые 6 и 12 аминокислот Ν-концевой части α§1 казеина, соответственно - см. табл. 3), ежедневно, на 4, 5, 6 и 7 день после трансплантации. Восстановление тромбоцитов определяют на 10 и 12 день после трансплантации.

Восстановление мышей с трансплантатами костного мозга

Мышей С57В1/6 облучают летальными дозами из источника, расположенного на расстоянии 70 см от кожи, дозой 50 сГй в минуту, всего 900 сГй. Облученных мышей восстанавливают сингеничным костным мозгом от мышей, которых либо обрабатывали за день до отбора костного мозга 1 мг/животное пептидов, полученных из нативного казеина, либо физиологическим раствором (контроли), с последующим двойным слепым исследованием. В одном эксперименте за выживанием мышей наблюдали 18 дней. В другом эксперименте мышей забивали через 8 дней, и оценивали колонизацию селезенки.

Синтетические пептиды, полученные из казеина, заметно снижают уровни холестерина

Способность пептидов, полученных из синтетического казеина, снижать уровни холестерина у семинедельных самок мышей С57В1/61 оценивают после содержания их на атерогенной диете. Мышей подразделяют на 8 групп. Одна контрольная группа получает нормальный корм. Вторая контрольная группа получает модифицированный корм Ткотак Найтой, содержащий шоколад (#ΤΌ 88051: Тек1ай, МаШкои, XVI) [СетЬет Ό. V. е) а1., 4оитпа1 оГ ЫрШ Кекеагск. 42, 2001]. Все остальные экспериментальные группы получают модифицированный корм Ткотак НайгоЙ Через неделю такого питания показатели сывороточного холестерина заметно возрастают, и синтетические пептиды, полученные из казеина, вводят внутрибрюшинной инъекцией в дозе 1 мг/мышь, с последующей второй инъекцией в дозе 0,1 мг спустя одну неделю.

Уровни содержания холестерина в крови определяют в соответствии с анализом Коске Ско1ек1его1 Аккау, основанном на ферментативном методе Коекск1ои & АШи (Коске, 1пс., Сегтапу).

Экспериментальные результаты Пептиды, полученные из нативного казеина

Исходя из наблюдения того факта, что свернувшееся молоко часто тормозит рост бактерий, из молочного белка выделяют казеиновые фрагменты, обладающие бактерицидными свойствами (патент США № 3764670 1<а1/йка1ска1кку. е) а1.). Неочищенные пептиды, полученные в результате протеолиза нативного казеина, получают в результате кислотного осаждения растворимой фракции протеолитического гидролизата казеина, диализа и лиофилизации. При тестировании на биологическую активность после длительного хранения было отмечено, что указанный неочищенный препарат, после лиофилизации и хранения при 4°С сохраняет активность (как ίη уйто, так и ίη У1уо), по крайней мере, в течение 24 месяцев.

- 39 007814

Для идентификации активных пептидов, содержащихся в пептидах, полученных из нативного казеина, лиофилизованный неочищенный препарат фракционируют, используя высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), как было указано выше. Все проанализированные лиофилизированные образцы продемонстрировали одинаковые профили времен удерживания, и содержание их соответствовало указанному выше.

Так, основным компонентом препарата неочищенных пептидов, полученных из нативного казеина, является Ν-концевой фрагмент α81 казеина.

Пептиды, полученные из нативного казеина, не токсичны для грызунов и людей

Интенсивные исследования кратковременных и длительных воздействий на мышей, морских свинок и людей-добровольцев подтвердили отсутствие токсичности, тератогенности или вредных побочных эффектов препарата. В одной серии тестов разовую дозу, представляющую 7000 кратное превышение установленной эффективной дозы пептидов, полученных из нативного казеина, вводят мышам внутримышечно. Стандартные посмертные исследования патологических изменений у мышей на 14 день после обработки не выявили токсических воздействий на внутренние органы или каких-либо анормальностей. Аналогичные тесты на токсичность для морских свинок не выявили никаких анормальностей через 2 недели после введения разовой дозы в 20 мг пептидов, полученных из нативного казеина, введенной внутримышечно. В другой серии экспериментов высокие дозы пептидов, полученных из нативного казеина, введенные здоровым мышам, не оказали влияния на ряд гематологических параметров, которые определяли спустя две недели, включая белые кровяные клетки (\УВС). красные кровяные клетки (КБС), гемоглобин (НОВ), электролиты, глюкозу и другие. В третьей серии тестовых экспериментов повторяющиеся высокие дозы в 100 мг/кг массы, которые вводили мышам и крысам в течение двух недель, не выявили и никаких патологических эффектов при посмертных исследованиях. При тестировании пептидов, полученных из нативного казеина, в отношении их влияния на длительность выживания облученных, восстановленных костным мозгом мышей ВЛЬВ/с и С3Н/Не1, длительность выживания обработанных мышей (18 из 27 ВЛЬВ/е и С3Н/Не1; 66%) отчетливо превышала длительность выживания обработанных альбумином контрольных животных (4 из 26 ВЛЬВ/е и С3Н/Не1; 15%). Стандартные тесты на тератогенность [для подробностей см., например, Эгид 8а.Ге(у ίη Ргедпапсу, Ео1Ь апб Эакез, р.336, Е1зеу1ет; ЛтУегбаш, №\ν Уогк, ОхГогб (1990)] на мышах, обработанных пептидами, полученными из нативного казеина, не выявили влияния пептидов ни на какие параметры развития.

Аналогично отсутствию токсичности или побочных эффектов в тестах на грызунах, пептиды, полученные из нативного казеина, были также безопасны и при введении людям. Сравнение образцов крови и мочи у семи здоровых добровольцев до инъекции и в течение 7 дней после внутримышечной инъекции пептидов, полученных из нативного казеина, не выявило никаких изменений ни каких клинических параметров. Не наблюдалось также никаких отрицательных эффектов.

Таким образом, высокие дозы и длительная обработка грызунов пептидами, полученными из нативного казеина, не выявили видимых токсических, патологических, гиперчувствительных, тератогенных, серологических или каких либо других отрицательных эффектов. Более того, введение пептидов, полученных из нативного казеина, облученным мышам с риском кратковременных и длительных осложнений, подтвердило заметное пролонгирование выживания в течение 200-300 дней. Все это и отсутствие каких-либо нежелательных эффектов у здоровых добровольцев, которым вводили инъекции пептидов, полученных из нативного казеина, четко продемонстрировало безопасность этих пептидов при парентеральном введении.

Восстановление костного мозга трансплантатами у мышей-реципиентов

Когда мышей С57/В1/6 облучили летальными дозами радиации и восстанавливали сингеничным костным мозгом от мышей, которых либо обрабатывали, либо не обрабатывали дозой 1 мг/животное пептидами, полученными из нативного казеина, за день до отбора костного мозга, выживание облученных мышей, которым ввели костный мозг от обработанных мышей, значительно превосходило выживание облученных мышей, которым ввели костный мозг от необработанных мышей (выживание облученных мышей, которым ввели костный мозг от обработанных мышей составило 15 из 18 через 10 дней после облучения; тогда как выживание облученных мышей, которым ввели костный мозг от необработанных мышей, составило 4 из 17 через 10 дней после облучения). Селезенки облученных мышей, которым ввели костный мозг от обработанных мышей, содержали в два или три раза больше колоний на селезенку, нежели содержали селезенки облученных мышей, которым ввели костный мозг от необработанных мышей (1-5 колоний по сравнению с 0-3 колониями).

Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют пролиферацию тромбоцитов

Природные киллерные (ΝΚ) и цитотоксичные Т-клетки являются критическими для способности иммунных систем защищать от вторжения как инфекционных патогенов, так и раковых клеток; как за счет активной цитотоксичности, так и за счет секреции иммунорегуляторных лимфокинов. Иммунный компромисс, такой как при СПИД или после химиотерапии, приводит к ненормальной, ослабленной активности Т- или ΝΚ-клеток. Если клетки нормального мышиного костного мозга мышей ВЛЬВ/с и С57В1/6 культивируют в присутствии 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, наблюдается отчетливое повышение ΝΚ активности в обеих группах соотношений эффекторные клетки:клетки

- 40 007814 мишени. Более того, сравнение этих двух групп выявило четкое дозозависимое соотношение. При соотношении эффекторные клетки:клетки-мишени 1:25 среднее значение ΝΚ активности увеличивается с 13,93 до 30,77% и при соотношении эффекторные клетки:клетки-мишени 1:50 средняя активность ΝΚ возрастает с 13,68 до 44,05% (фиг. 1). Аналогичные эксперименты с использованием стволовых клеток периферической крови человека, полученных от доноров, обработанных фактором стимуляции образования колоний гранулоцитов, демонстрируют еще более значительную, зависящую от концентрации стимуляцию лизиса клеток-мишеней под действием пептидов, полученных из нативного казеина.

В первой группе экспериментов (фиг. 2а) ΝΚ активность определяют в образцах крови, полученных от одного пациента, и инкубируют при двух соотношениях эффекторные клетки: клетки-мишени с возрастающими концентрациями пептидов, полученных из нативного казеина. Всего 4% выделения ³⁵8 зарегистрировано для контроля не обработанной РВ8С культуры. Почти тот же самый процент радиоактивности (4%) был обнаружен для самой низкой концентрации пептидов (5 мкг/мл). Однако при более высоких концентрациях пептидов, в интервале от 10 мкг/мл вплоть до 100 мкг/мл, было зарегистрировано 10,8-14,9% выделение ³⁵8 для соотношений эффекторные клетки:клетки-мишени 100:1 и 8,3-14,5% выделение ³⁵8 50:1 (фиг. 2а).

Если РВ8 клетки от здорового (пациент 1) и больных (пациенты 2-6) людей-доноров инкубируют с возрастающими концентрациями пептидов, полученных из нативного казеина, можно зарегистрировать значительное усиление активности ΝΚ клеток больных пациентов. Таким образом, хотя пептиды, полученные из нативного казеина, оказывают минимальное воздействие на активность ΝΚ здорового пациента (увеличение выделения ³⁵8 с 13-15%, пациент 1), РВ8 клетки, полученные как от больных злокачественными опухолями молочной железы, так и с неходжкинской лимфомой (пациенты 3 и 4, например), демонстрируют резкое, зависящее от дозы увеличение ΝΚ активности (3,5-10,8% ³⁵8; 12,2-19,1% ³⁵8 соответственно) (фиг. 2Ь).

Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют пролиферацию положительных (ΝΚ) клеток СБ5б поверхностного антигена

В другой группе экспериментов стволовые клетки периферической крови (РВ8С) от 5 доноровлюдей, обработанных ОС8Е, инкубируют с пептидами, полученными из нативного казеина, в течение 10, 14 или 28 дней, затем исследуют на присутствие ί.Ό56 антигена. Иногда резкое увеличение содержания СЭ56 антигена наблюдается для обработанных пептидами клеток от всех доноров кроме одного (пациент 1). Представительная реакция представлена на фиг. 3а. После 10 дней инкубирования с добавлением или без добавления пептидов, полученных из нативного казеина, присутствие СЭ56 поверхностный антигенположительных (ΝΚ) клеток детектируется с помощью прямого иммунофлуоресцентного окрашивания. В общем, инкубирование с пептидами, полученными из нативного казеина, увеличивает средний процент Т-клеток, положительно окрашенных для СИ56, с 0,64% в контрольной группе до 2,0% после обработки (фиг. 3 а).

Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют пролиферацию СБ3 поверхностный антиген-положительных (Т) клеток

Воздействие пептидов, полученных из нативного казеина, на пролиферацию СЭ3 поверхностный антиген-положительных (Т) клеток в РВ8 клетках, полученных от 5 субъектов, анализируют, используя прямую иммунофлуоресценцию. У всех, кроме одного, пациентов (пациент 4), инкубирование в течение 14 дней с пептидами, полученными из нативного казеина, значительно увеличивает пролиферацию Тклеток, в некоторых случаях вплоть до пятикратного. Учитывая все результаты, средний процент Тклеток, позитивно окрашенных для СЭ3. увеличивается с 19,45% в контрольной группе, до 35,54% в обработанной группе (фиг. 3Ь).

Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют пролиферацию СБ5б и СБ3 (ΝΚ/Τклетки) положительных клеток

В дополнительном эксперименте РВ8С от 7 пациентов инкубировали с пептидами, полученными из нативного казеина, в течение 28 дней, и воздействие на пролиферацию ΝΚ/Τ-клеток (СИ56 и СИ3 поверхностный антиген-положительные) определяли, используя метод прямой иммунофлуоресценции. Инкубирование с пептидами, полученными из нативного казеина, стимулирует пролиферацию Т-клеток более чем пятикратно в некоторых случаях (пациент 6), тогда как средний процент СИз-положительных (Т-) клеток возрастает с 2,08% в контрольной группе до 6,49% в обработанной группе. Количество как СИ₅₆, так и СЭ₃ поверхностный антиген-положительных (ΝΚ/Τ) клеток возрастает с 1,1% в контрольной группе до 4,3% в обработанной группе (фиг. 3с). Так, пептиды полученные из нативного казеина, стимулируют пролиферацию как Т-лимфоцитов, так и натуральных киллерных клеток, полученных из здоровых мышиных и клеток крови человека. Важно, что наибольший иммуностимулирующий эффект пептидов, полученных из нативного казеина, наблюдался для доноров-людей, у которых были первоначально низкие уровни Т- и ΝΚ-клеток (фиг. 3а-с).

Пептиды, полученные из синтетического казеина, стимулируют пролиферацию лимфоцитов человека ΐη уйго

Если пептиды, полученные из синтетического казеина, представляющие первые 3-26 остатков «81 казеина, инкубируют с РВ8С клетками человека, полученными от здоровых пациентов и больных злока

- 41 007814 чественными опухолями (см. ниже), наблюдается значительное усиление активности ΝΚ-клеток. Наиболее интенсивный лизис наблюдается (от 3 до более чем 5 кратного превышения значений для контроля) в РВ8С культурах клеток, полученных от пациентов с неходжкинской лимфомой и злокачественной опухолью молочной железы, после двух дней инкубирования для столь малой концентрации, как 10 мкг/мл пептидов, содержащих первые 9 или более остатков α81 казеина (фиг 4). В идентичных условиях ни один из тестированных пептидов не продемонстрировал значительного влияния на ΝΚ активность в РВ8С культурах от здоровых людей-доноров. Таким образом, даже низкие концентрации пептидов, содержащих первые 10 остатков Ν-концевой последовательности α81 казеина, способны селективно стимулировать ίη νίίτο пролиферацию лимфоцитов в клетках, полученных от пациентов больных злокачественными опухолями.

Аналогичная стимуляция активности ΝΚ-клеток наблюдается в том случае, когда РВ8 клетки, полученные от людей-доноров с кроветворными заболеваниями, инкубируют с синтетическими пептидами, полученными из казеина, представляющими первые 3 аминокислотных остатка α81 казеина. Инкубирование РВ8 клеток с пептидами усиливает лизис клеток-мишеней с двукратного до восьмикратного по отношению к необработанным контролям. Из 5 тестированных пациентов трое (3) реагировали на концентрацию пептида 25 мкг/мл, один (1) - на концентрацию пептида до 100 мкг/мл и один (1) - до 250 мкг/мл. Трое из пяти пациентов реагировали на концентрацию 25 мкг/мл. Не наблюдалось никакого заметного влияния на ΝΚ активность в РВ8С культурах от здорового донора, обработанного синтетическими пептидами, представляющими первые 3 аминокислоты α81 казеина, что подтверждает селективный характер свойств стимуляции лимфоцитов человека пептидами, полученными из казеина.

Стимулирование кроветворения в предшественниках крови клеток человека

Предшественники клеток крови дифференцируются на различные клетки крови: макрофаги, моноциты, гранулоциты, лимфоциты, эритроциты и мегакариоциты. Клетки предшественников находятся в изобилии в костном мозге, но также обнаружены в периферической крови после обработки гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (РВ8С клетки) и в свежей пуповинной крови. Если возрастающие концентрации (50-600 мкг/мл) пептидов, полученных из нативного казеина, добавляют к культурам костного мозга человека, РВ8С и пуповинной крови, отмечается усиление клеточной пролиферации по данным, полученным с включением [³Н]-тимидина (фиг. 5а-6с). Пролиферация РВ8С человека наиболее сильно вызывается концентрацией 300 мкг/мл (фиг. 5а) после 15 дней культивирования. Еще более заметный эффект отмечается для клеток пуповинной крови (3-4 кратное усиление по данным включения [³Н]-тимидина) после 14 дней инкубирования (но не после 7 дней) с пептидами, полученными из нативного казеина (600 мкг/мл, фиг. 5с). Культивируемые клетки костного мозга человека от трех из четырех доноров также сильно реагировали (3-5 кратное увеличение включения) на пептиды, полученные из нативного казеина (300 мкг/мл), после 21 дня инкубирования (фиг. 5Ь). Таким образом, пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют пролиферацию предшественников клеток крови человека, полученных из костного мозга, также как и из других источников. Интересно, что инкубирование культивируемой Κ562 человека (хронический миелолейкоз) клеточной линии и клеточной линии толстой кишки (злокачественная опухоль толстой кишки) с высокими концентрациями (вплоть до 500 мкг/мл) пептидов, полученных из нативного казеина, в аналогичных условиях не оказывает влияния на включение [³Н]тимидина. Таким образом, пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют пролиферацию предшественников клеток крови человека, но не рост раковых клеток ίη νίίτο.

Стимулирование мегакариоцитопоэза пептидами, полученными из казеина Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют пролиферацию предшественников мегакариоцитов в культивируемых клетках мышиного костного мозга

Многоядерные мегакариоциты развиваются в костном мозге из примитивных стволовых клеток, созревают до гигантских клеток и служат источником для тысяч тромбоцитов из одного мегакариоцита. Тромбоциты являются критическим моментом для образования сгустков крови, и тромбоцитопения является основной причиной миелоаблативных состояний (после химиотерапии и радиотерапии).

Первичные культуры клеток костного мозга можно индуцировать для образования колоний СЕИСМ (гранулоцитов и моноцитов) и колоний СЕИ-СЕММ (гранулоцитов, эритроидов, макрофагов и мегакариоцитов), содержащих дополнительные типы клеток крови. Количество колоний отражает экспансию специфических предшественников, число клеток отражает скорости пролиферации и дифференциальное число клеток отражает то, какие именно типы специфических клеточных линий развиваются [₽αί£η&η Ό. е1 а1. (1990), Μο1. Се1. Вю1. 10, 6046-50]. В культивируемых клетках мышиного костного мозга, инкубируемых с эритропоэтином и 1Ь-3, добавление 25 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, в течение 8 дней увеличивает количество СЕИ-СЕММ в два с половиной раза по сравнению с контролями, стимулируя трехкратное увеличение относительного числа клеток на колонию в СЕИ-СЕММ. В аналогичных сериях экспериментов добавление пептидов, полученных из нативного казеина, к клеткам костного мозга, инкубируемым с эритропоэтином и кондиционной средой (см. раздел Материалы и методы) стимулирует зависящее от концентрации увеличение процента ранних и поздних мегакариоцитов (15% мегакариоцитов без пептидов, до 50% при 500 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина). Так,

- 42 007814 восьмидневная обработка пептидами, полученными из нативного казеина, стимулирует значительное увеличение образования и развития мегакариоцитов в первичных культурах мышиного костного мозга.

Синтетические пептиды, полученные из казеина, стимулируют пролиферацию предшественников мегакариоцитов в культивируемых клетках мышиного костного мозга

Аналогично указанному выше и в аналогичных экспериментальных условиях синтетические пептиды, полученные из казеина, представляющие первые 5-24 аминокислоты α81 казеина, увеличивают процент ранних и поздних мегакариоцитов с 15% без синтетических пептидов до более 40% с 25 мкг/мл синтетических пептидов (фиг. 7). Так, 8-дневная обработка синтетическими пептидами, полученными из синтетического казеина, представляющими первые 5, 6, 11, 12, 17, 18, 19, 20, 21 и 24 аминокислоты, стимулирует значительное увеличение образования и развития мегакариоцитов в первичных культурах мышиного костного мозга. Несколько более умеренную, но все еще заметную стимуляцию наблюдают для других синтетических пептидов, полученных из казеина.

Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют мегакариоцитопоэз в культивируемых клетках костного мозга человека

Если 100 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, добавляют в аналогичных условиях к культурам клеток костного мозга человека от здоровых доноров, образование СЕИ-СМ колоний усиливается с добавлением или без добавления стимулирующих факторов (СМ-С8Е, СМ). Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют также образование колоний эритроидных клеток в присутствии эритропоэтина. Обработка клеток костного мозга человека тромбопоэтином (ТРО) стимулирует образование колоний мегакариоцитов (МК). Добавление 300 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, к обработанным ТРО клеткам, стимулирует более чем двукратное (16 колоний на 2х10⁵ клеток без пептидов и 35 колоний на 2х10⁵ с пептидами, полученными из нативного казеина) увеличение пролиферации МК колоний.

В присутствии дополнительных кроветворных факторов, таких как эритропоэтин, 1Ь-3, 118СЕ и АВ сыворотка человека, 14 дней инкубирования с пептидами, полученными из нативного казеина, стимулируют почти трехкратное увеличение СЕИ-СЕММ колоний из клеток костного мозга человека (158 колоний с добавлением 500 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, 68 колоний с одними только факторами), но оказывает меньшее воздействие (полуторакратное увеличение) на образование СЕИСЕММ.

Относительные количества клеток в культивируемых колониях костного мозга и пуповинной крови отражают пролиферацию мегакариоцитных клеток, как реакцию на добавление 25 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина (см. таблицу на фиг. 6). Так, инкубирование культивируемых первичных клеток костного мозга человека и пуповинной крови с пептидами, полученными из нативного казеина, стимулирует развитие и пролиферацию как мегакариоцитных, так и эритроидных клеточных колоний. Важно, что наблюдается синергизм действия ТРО и пептидов, полученных из нативного казеина, в отношении стимуляции мегакариоцитопоэза, указывая на вероятную роль этих кроветворных факторов роста в механизме стимулирующих свойств пептидов, полученных из казеинов, и далее дает возможность предположить сходство аналогичных усилений широкого круга ТРО-опосредствованных воздействий пептидов, полученных из нативного казеина.

Пептиды, полученные из нативного казеина, и синтетические пептиды, полученные из нативного казеина, потенцируют действие эритропоэтина (ЕРО) в культивируемых клетках костного мозга человека

Воздействие природных и синтетических пептидов, полученных из казеина, на пролиферацию эритроидных клеток в культивируемых клетках костного мозга человека оценивают в тех же самых условиях, что были указаны для мегакариоцитопоэза. Добавление в присутствии ЕРО, 50-300 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, или 100 мкг/мл синтетических пептидов, полученных из казеина, (Е, табл. 3, 8ЕО ГО ΝΟ: 18) стимулирует однократное и полуторакратное (синтетический пептид) до четырехкратного усиление пролиферации предшественников эритроидных клеток (вид ВЕИ-Е колоний) по сравнению с клетками костного мозга, обработанными только ЕРО. Так, пептиды, полученные из нативного казеина, и их синтетические производные действуют так, чтобы потенцировать эритропоэзстимулирующие эффекты ЕРО, и, как таковые, их можно использовать для усиления широкого круга клинически важных ЕРО-опосредствованных эффектов.

Синтетические пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют пролиферацию дендритных клеток в мышиных СЕи-СЕММ

Воздействие синтетических пептидов, полученных из нативного казеина, на пролиферацию дендритных клеток в первичных клетках мышиного костного мозга оценивают в таких же условиях, которые указаны для стимуляции мегакариоцитов. Синтетические пептиды, полученные из нативного казеина, представляющие первые 2, 3, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 16, 23, 24 и 26 аминокислоты α81 казеина, стимулируют пролиферацию дендритных клеток с 2,2 и вплоть до 23% от общего числа клеток, по сравнению с 0,10,2% дендритных клеток в образцах клеток, которые инкубировали без синтетических пептидов, полученных из казеина (фиг. 7).

- 43 007814

Синтетические пептиды, полученные из казеина, стимулируют пролиферацию плазмоцитов в мышиных СРи-СЕММ

Воздействие синтетических пептидов, полученных из нативного казеина, на пролиферацию плазмоцитов в первичных клетках мышиного костного мозга демонстрируют в тех же самых условиях, которые были указаны для стимуляции мегакариоцитов. Синтетические пептиды, полученные из казеина, представляющие первые 2, 3, 5, 7, 11, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и 26 аминокислоты «81 казеина, заметно стимулируют пролиферацию плазмоцитов с 1,5 и вплоть до 12,3% от общего числа клеток, по сравнению с 0,3% от общего числа клеток, инкубированных без синтетических пептидов, полученных из казеина (фиг. 7).

Синтетические пептиды, полученные из казеина, стимулируют пролиферацию макрофагов в мышиных СРи-СЕММ

Воздействие синтетических пептидов, полученных из казеина, на пролиферацию макрофагов в первичных клетках мышиного костного мозга демонстрируют в тех же самых условиях, которые были указаны для стимуляции мегакариоцитов. Инкубирование клеток с синтетическими пептидами, полученными из казеина, представляющими первые 7, 9, 16, и 23 аминокислот «81 казеина, значительно стимулирует пролиферацию макрофагов с примерно 17% от общего числа клеток в контролях до почти 30% от общего числа клеток, инкубированных с синтетическими пептидами, полученными из казеина (фиг. 7).

Синтетические пептиды, полученные из казеина, стимулируют пролиферацию тромбоцитов в сги-СЕММ

Воздействие синтетических пептидов, полученных из казеина, на пролиферацию тромбоцитов в первичных клетках мышиного костного мозга демонстрируют в тех же самых условиях, которые были указаны для стимуляции мегакариоцитов. Инкубирование клеток с синтетическими пептидами, полученными из казеина, представляющими первые 4 аминокислоты Ν-концевого «81 казеина, значительно стимулирует пролиферацию тромбоцитов с 53% от общего числа клеток в контролях до 71% от общего числа клеток, инкубированных с синтетическими пептидами, полученными из казеина (фиг. 7).

Синтетические пептиды, полученные из казеина, стимулируют пролиферацию полиморфонуклеарных (РМХ) клеток в СРи-СЕММ

Воздействие синтетических пептидов, полученных из казеина, на пролиферацию полиморфонуклеарных (РМ% клеток в первичных клетках мышиного костного мозга демонстрируют в тех же самых условиях, которые были указаны для стимуляции мегакариоцитов. Инкубирование клеток с синтетическими пептидами, полученными из казеина, представляющими первые 3, 6, 7, 9, 16 и более, вплоть до и включая 26 аминокислот «81 казеина, значительно стимулирует пролиферацию РМ^ клеток с 1,6% от общего числа клеток в инкубированных контролях до 2,9-14,9% от общего числа клеток, инкубированных с синтетическими пептидами, полученными из казеина (фиг. 7).

Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют кроветворение ΐη νινο после облучения и трансплантации костного мозга

Миелоаблативная терапия может привести к угрожающему жизни уменьшению количества тромбоцитов и лейкоцитов, что может произойти, несмотря на введение клеток крови и факторов роста. Нижеследующее демонстрирует действие пептидов, полученных из нативного казеина, после облучения и трансплантации костного мозга.

Пептиды, полученные из нативного казеина, усиливают восстановление лейкоцитов и тромбоцитов после трансплантации сингеничного костного мозга у мышей

После облучения сублетальной дозой (600 сГй), с минимально восстановленным костным мозгом мышам ВАЬВ/с (η=12) внутривенной инъекцией вводят по 1 мг/мышь пептидов, полученных из нативного казеина. Через 1 день после восстановления клеток костного мозга отмечается значительное увеличение количества периферических белых кровяных клеток в дни 4, 6 и 15 после обработки, по сравнению с контрольными мышами, которым вводили альбумин сыворотки человека (фиг. 8). Количество тромбоцитов в периферической крови как у обработанных, так и у контрольных облученных мышей и у мышей с трансплантированным костным мозгом было одинаково понижено вплоть до 8 дней после обработки. Однако к тринадцатому дню отмечалось отчетливое преимущество для мышей, которым были введены пептиды, полученные из нативного казеина, что демонстрирует значительное увеличение по сравнению с контролями, обработанными альбумином сыворотки человека, что проявилось еще больше ко дню 15 (фиг. 9). Таким образом, пептиды, полученные из нативного казеина, усиливают восстановление тромбоцитов и лейкоцитов после трансплантации с ограниченным числом клеток костного мозга. Можно ожидать, что этот эффект будет еще сильнее выражен в плане восстановления при оптимальном, а не ограниченном числе клеток костного мозга.

Синтетические пептиды, полученные из казеина, усиливают восстановление лейкоцитов после трансплантации мышам сингеничного костного мозга

После облучения сублетальной дозой (600 сГй), с минимально восстановленным костным мозгом мышам ВАЬВ/с (η=5 на синтетического пептида, η=10 в контрольной группе) с помощью внутрибрюшинной инъекции вводят 1 мг/мышь синтетические пептиды (13-26 аминокислот в длину, см. табл. 3),

- 44 007814 полученные из казеина, через день после трансплантации клеток костного мозга. Наблюдается отчетливое восстановление лейкоцитов. Значительное увеличение количества лейкоцитов в периферической крови в течение 10-14 дней отмечалось для пептидов, содержащих ί5 (день ί0: 1,72х10⁶ клеток/мл; день ί2: 6,54х10⁶ клеток/мл) и 17 (день 10: 2,74х10⁶ клеток/мл; день 12: 5,20х10⁶ клеток/мл) аминокислот (см. табл. 3) по сравнению с контролями, которым вводили альбумин сыворотки человека (день 10: 1,67х10⁶ клеток/мл; день 12: 4,64х10⁶ клеток/мл). Таким образом, синтетические пептиды, полученные из казеина, усиливают восстановление лейкоцитов после трансплантации с ограниченными количествами клеток костного мозга.

Синтетические пептиды, полученные из казеина, усиливают восстановление тромбоцитов после трансплантации сингеничного костного мозга у мышей

Для подтверждения наблюдаемой способности синтетических пептидов, полученных из казеина, усиливать пролиферацию мегакариоцитов в культурах кроветворных стволовых клеток (см. фиг. 6 и 7), исследовали воздействие пептидов на восстановление тромбоцитов ίη νΐνο. После облучения летальной дозой (800 сГй), у мышей с минимально восстановленным костным мозгом (η=5 на группу), которым ввели четырехдневными внутрибрюшинными инъекциями 100 мкг/мышь синтетические пептиды 4Р и 3 а (длиной 6 и 12 аминокислот, соответственно, см. табл. 3) (на 4-7 дни после трансплантации), наблюдалось отчетливое усиление восстановления тромбоцитов по сравнению с необработанными контролями. Для обоих пептидов наблюдалось значительное увеличение количества тромбоцитов на 10 и 12 дни после трансплантации. Обработка пептидом 4Р увеличивает количество тромбоцитов на 29% (872х10³/мл по сравнению с 676х10³/мл в контрольной группе) на 12 день после трансплантации, тогда как обработка пептидом 3а увеличивает количество тромбоцитов вплоть до 35,5% (229х10³/мл по сравнению с 169х10³/мл в контрольной группе) на 10 день и вплоть до 13,5% (622х10³/мл по сравнению с 461х10³/мл в контрольной группе) на 12 день после трансплантации. Таким образом, одни и те же синтетические пептиды, полученные из казеина, усиливают пролиферацию мегакариоцитов ίη νίΐτο и восстановление тромбоцитов после трансплантации костного мозга ίη νΐνο.

Пептиды, полученные из нативного казеина, ингибируют ΐη νϊίΐΌ инфицирование лимфоцитных Тклеточных линий ВИЧ-1 вирусом

Проникновение пептидов, полученных из нативного казеина, в лимфоцитные Т-клетки

Для исследования механизмов иммуностимуляторного и противовирусного действия пептидов, полученных из нативного казеина, восприимчивые δυρ-Τί и СЕМ культивируемые Т-клетки человека обрабатывают пептидами, полученными из нативного казеина, перед их инфицированием ίη νίΐτο вирусом ВИЧ-ί. С помощью флуоресцентной микроскопии выявлено, что ИТС-конъюгированные пептиды, полученные из нативного казеина, (100 мкг/мл), проникают в δυρ-Τί клетки при совместном с ними инкубировании, как указано выше (фиг. 10а-Г). Небольшое количество меток наблюдается в цитоплазме клеток через 15 мин (фиг. 10а,Ь). Через 30 мин в цитоплазме наблюдается больше меток (фиг. 10с-б) при ограниченном захвате ядрами. Начиная с 1 ч инкубирования и далее (фиг. 10е-Г), ПТС-меченые пептиды, полученные из нативного казеина, наблюдаются в цитоплазме, но большинство их концентрируется в ядрах клеток. Анализ δυρ-Τί клеток с помощью проточной цитометрии подтверждает увеличение захвата меченых пептидов, полученных из нативного казеина, начиная с 5 мин после начала инкубирования.

Пептиды, полученные из нативного казеина, усиливают пролиферацию лимфоцитов человека

Присутствие пептидов, полученных из нативного казеина, в культуральной среде приводит к увеличению количества δυρ-Τί клеток в течение ί4 дней. Наибольшее увеличение количества клеток к 7 дню наблюдается для 50 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина (42%), для 1000 мкг на 10 день (30%) и для 600 мкг (32%) на 14 день инкубирования (результаты не показаны). Измерение включения [³Н]-тимидина культивируемыми клетками, что дает показатель пролиферации, отражает увеличение количества клеток, причем наиболее значительный эффект наблюдается для 600 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, на 10 день и для 50 мкг/мл на ί4 день (фиг ίί). Снижение пролиферации на ί4 день, вероятно, отражает избыточный рост клеток и истощение питательных веществ.

Синтетические пептиды, полученные из казеина, усиливают пролиферацию лимфоцитов человека

Присутствие синтетических пептидов, полученных из казеина, (все пептиды перечислены в табл. 3), в культуральной среде приводит к увеличению количества δυρ-Τί клеток в течение 10 дней. Увеличение аналогично для всех синтетических пептидов. Наибольшее увеличение количества клеток лимфоцитов в инфицированных клетках наблюдается для 250 мкг и 500 мкг/мл пептидов, представляющих первые 9 аминокислот (80 и 33% соответственно) (результаты не показаны).

Пептиды, полученные из нативного казеина, ингибируют инфицирование ВИЧ-1 клеток лимфоцитов человека

Восприимчивые СЕМ лимфоцитные клетки, предварительно обработанные пептидами, полученными из нативного казеина, (50-1000 мкг/мл) за 24 или 48 ч до инкубирования с ВИЧ-1 или экспонированные ВИЧ-1 предварительно обработанным в течение 3 ч пептидами, полученными из нативного казеина, демонстрируют усиленную клеточную пролиферацию и пониженные уровни вирусной инфекции по сравнению с необработанными контрольными. Количества клеток и анализ ВИЧ-1 Р²⁴ антигена на 15 день после инфицирования выявили 100% ингибирование вирусной инфекции после 3 ч инкубирования

- 45 007814 вирусов с 600-1000 мкг/мл пептидов, полученных из нативного казеина, и 98 и 99% ингибирования после 24 ч инкубирования клеток с 50 и 600 мкг/мл пептидов, соответственно (сравнение количества клеток с неинфицированными контролями ИГЕ). Более длительное время ингибирования не оказалось более эффективным (фиг. 12). Хотя увеличение концентраций пептидов, полученных из нативного казеина, усиливает клеточную пролиферацию через 3 и 24 ч после инфицирования, вирусная инфекция наиболее заметно ингибируется в этих наиболее быстро растущих культурах. Еще более заметное усиление клеточной пролиферации и ингибирования ВИЧ-1 инфекции наблюдается в 8ир-Т1 клетках, предварительно обработанных пептидами, полученными из нативного казеина, перед инфицированием ВИЧ-1 (среднее ингибирование вирусной инфекции составляет 96,7, 88,7 и 95,7% после 3 ч предварительной обработки вируса и 24 и 48 ч предварительной обработки клеток соответственно) (не показано). Таким образом, пептиды, полученные из нативного казеина, проникают в человеческие культивируемые клетки лимфоцитов и в их ядра, ускоряют рост клеток, и значительно снижают восприимчивость СИ₄ клеток к ВИЧ-1 инфекции. Ожидается, что пептиды как таковые, полученные из нативного казеина, могут быть полезны как для профилактики ВИЧ инфекции, так и для лечения после инфицирования ВИЧ инфицированных и СПИД пациентов.

Синтетические пептиды, полученные из казеина, ингибируют ВИЧ-1 инфекцию в клетках лимфоцитов человека

Способность синтетических пептидов, полученных из казеина, ингибировать ВИЧ-1 инфекцию в клетках лимфоцитов человека, демонстрируют, используя СЕМ-лимфоцитные клетки в тех же условиях, что указаны выше. 3 ч предварительной обработки СЕМ лимфоцитов синтетическими пептидами, полученными из казеина, представляющими первые 3 аминокислоты α81 казеина, подтверждают значительную степень устойчивости к инфекции после инкубирования с ВИЧ-1. Количество клеток лимфоцитов составляет 1,29х10⁶ (100 мкг/мл) и 2,01х10⁶ (500 мкг/мл) в обработанных клетках по сравнению с инфицированными ВИЧ-1 контрольными: 1,06х10⁶ (фиг. 13). Уровни инфицирования ВИЧ-1 в тех же клетках, измеренные с помощью ВИЧ-Р²⁴ антигенного анализа на 7 день после инфицирования, оказались значительно снижены в обработанных пептидами клетках (0,17 и 0,14 нг Р²⁴ антиген/мл со 100 и 500 мкг/мл соответственно), по сравнению с необработанными контролями (0,52 нг Р²⁴ антиген/мл).

Аналогично, наблюдалось значительное ингибирование ВИЧ-1 инфекции в СЕМ клетках, экспонированных вирусам, предварительно обработанным (3 ч) синтетическими пептидами, полученными из казеина, представляющими первые 5 аминокислот α81 казеина.

Количество клеток в культурах, инкубированных с 10 и 25 мкг/мл пептидов 3Р, составляет 1,17х10⁶ и 1,26х10⁶ соответственно, по сравнению с инфицированным ВИЧ-1 контролем 1,06х10⁶.

Анализ ВИЧ-Р²⁴ антигена на 7 день после инфицирования выявил значительное уменьшение уровней ВИЧ-1 инфекции в обработанных культурах (0,26 и 0,18 нг Р²⁴ антиген/мл для 10 и 25 мкг/мл соответственно, по сравнению с контролем 0,52 нг Р²⁴ антиген/мл).

Аналогично, 3-часовое предварительное инкубирование вируса с синтетическим пептидом, полученным из казеина 4Р, представляющим первые 6 аминокислот α81 казеина, существенно влияет на восприимчивость СЕМ клеток лимфоцитов в отношении инфицирования ВИЧ-1.

Более всего на количество клеток воздействуют концентрации 25 и 250 мкг/мл (1,26х10⁶ и 1,59х10⁶ соответственно, по сравнению со значениями для инфицированного контроля 1,06х10⁶).

Анализ ВИЧ-Р²⁴ антигена на 7 день после инфицирования выявил зависящее от дозы уменьшение вирусных частиц по сравнению с необработанными, инфицированными контрольными культурами (фиг. 13). Таким образом, защита от ВИЧ-1 инфекции, обеспечиваемая клеткам лимфоцитов пептидами, полученными из нативного казеина, сохраняется в синтетических пептидах, полученных из казеина, состоящих из столь малого числа аминокислот, как первые пять Ν-концевых аминокислот α81 казеина.

Пептиды, полученные из нативного казеина, предотвращают развитие глюкозурии у диабетических, без ожирения мышей (ΝΟϋ)

У диабетических без ожирения мышей АОЭ) спонтанно развивается ювенильный диабет (типа I, ШИМ), аутоиммунное состояние, вызывающее воспаление β клеток поджелудочной железы, и заканчивающееся болезнью и смертью. Самки НОЭ мышей крайне восприимчивы, демонстрируя доказательство инвазии макрофагов кусочка ткани поджелудочной железы уже у 5 недельных мышей. Инъекции по 100 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, один или два раза в неделю в течение 5 недель (всего 5 или 10 инъекций) оказались полностью эффективными для профилактики глюкозурии, связанной с началом и течением заболевания. К 200 дню 100% необработанных контрольных мышей (п=5) стали диабетическими и затем погибли, тогда как обработанные мыши (п=5) остались на 100% эугликемичными и все еще были живы на 365 день (фиг. 14). Таким образом, пептиды, полученные из нативного казеина, эффективно защитили генетически восприимчивых мышей от возникновения этого аутоиммунного воспалительного состояния.

Синтетические пептиды, полученные из казеина, предотвращают развитие глюкозурии у диабетических без ожирения мышей (ΝΟϋ)

Профилактический эффект синтетических пептидов, полученных из казеина, в отношении развития

- 46 007814 глюкозурии у мышей ΝΌΌ был продемонстрирован в указанных выше условиях, за исключением того, что мышам вводили инъекцию только один раз в неделю в течение пяти (5) недель по 100 мкг синтетических пептидов, полученных из казеина. Результаты этих экспериментов представлены в табл. 4.

Таблица 4. Воздействие синтетических пептидов на ΙΌΌΜ у ΝΌΌ мышей

Пептид, код производного	Здоровые/ всего*	' моча сахар	тест	ΙΡ3Τ
0 мин. введен	(до ,ия)	6 0 мин. После введения
Υ	1/5	отрицательно	121	138
X	3/5	отрицательно	94	114
		отрицательно	104	119
		отрицательно	141	114
1а	1/5	отрицательно	88	106
2а	4/5	отрицательно	215	183
		отрицательно	112	119
		отрицательно	95	107 .
		отрицательно	159	204
За	3/5	отрицательно	135	137
		отрицательно	205	197
		отрицательно	201	211
А	2/5	отрицательно	134	164
		отрицательно	105	107
В	2/5	отрицательно	130	117
		отрицательно	130	97
ϋ	2/5	отрицательно	99	108
		отрицательно	130	136
I	2/5	отрицательно	324	не тестировали
		отрицательно	124	138
И	3/5	отрицательно	166	не тестировали
		отрицательно	193	не тестировали

		отрицательно	186	не тестировали
К	2/5	отрицательно	116	143
		отрицательно	443	не тестировали
СЬау-13	2/5	отрицательно	123	130
		отрицательно	111	111
СЬау-13	2/5	отрицательно	128	116
		отрицательно	113	125
Контроль	0/5

Кровь отбирали из параорбитального сплетения в моменты 0 и 60 мин после внутрибрюшинной инъекции глюкозы в дозе 1 г/кг массы тела. Уровни глюкозы в плазме определяли, используя СИисоке А11а1у/ег 2 (Весктап ИЫпппеШк, ЕиНеПоп, СА) и выражая как ммоль/л.

* здоровые = сахар в моче не обнаружен.

Глюкозурия > 1000 мг/дл.

1РОТТ осуществляли для 6 здоровых самок контрольных мышей:

мин - 110 ммоль/л; 60 мин - 106 ммоль/л глюкозы в крови.

Синтетические пептиды, полученные из казеина, представляющие первые 9 (X), 11 (2а) и 12 (3 а) аминокислот и более длинные цепи (У.В1 казеина, оказались высокоэффективными в профилактике глю

- 47 007814 козурии, связанной с началом и течением болезни.

Эффект обработки синтетическими пептидами, полученными из казеина, оценивали через 25 недель. К этому времени все 5 мышей в необработанной контрольной группе (п=5) оказались больны диабетом, о чем свидетельствует наличие очевидной (>1000 мг/дл) глюкозурии (табл. 4).

Глюкозурии не было обнаружено у трех из пяти (3/5) ΝΟΌ мышей, обработанных синтетическими пептидами, представляющими первые девять (9) аминокислот из Ν-концевой части α§1 казеина. Из группы, которой вводили инъекциями синтетические пептиды, состоящие из одиннадцати (11) аминокислот Ν-концевой части α§1 казеина, глюкозурии не было обнаружено у четырех из пяти (4/5) мышей ΝΘΌ.

В группе мышей, обработанных пептидами, у которых была обнаружена глюкозурия, ее начало обычно значительно задерживалось (на 3-5 недель) по сравнению с началом глюкозурии у необработанных контролей (данные не показаны), что указывает на отчетливый защитный эффект пептидов, даже если они неполные.

Защитные эффекты более коротких синтетических пептидов, полученных из казеина, также были исследованы у мышей ΝΘΌ. В дополнительной серии экспериментов, аналогично указанным выше, введение пептидов, представляющих первые 3 (1Р) и 4 (2Р) Ν-концевые аминокислоты α§1 казеина, эффективно защищает от наступления глюкозурии обработанных мышей (анализ на 16 неделе), тогда как все необработанные контрольные мыши заболели диабетом (100% глюкозурии) (результаты не показаны).

Тест на невосприимчивость к глюкозе (1РСТ), который проводили спустя 25 недель для здоровых ΝΘΌ мышей, из группы, которой вводили синтетические пептиды, полученные из казеина, представляющие первые 9 аминокислот, не продемонстрировал каких либо доказательств анормальности метаболизма глюкозы (нормальные гликемические показатели доведения и через 60 мин после введения глюкозы).

В группе, обработанной синтетическими пептидами, полученными из казеина, представленными первыми 11 аминокислотами Ν-концевой части α§1 казеина (2а), остаточные уровни глюкозы в крови оказались несколько повышенными у двух из пяти мышей (215 и 159 ммоль/л), и остальные немного повышенными (183 и 204 ммоль/л) через 60 мин после введения, что указывает на умеренные диабетические тенденции. Показатели у остальных двух мышей оставались в интервале нормальных гликемических показателей на протяжении тестирования (табл. 4). Вообще, нормальные результаты 1РСТТ свидетельствуют об отсутствии глюкозурии у здоровых, перенесших обработку пептидами мышей (табл. 4). Так, синтетические пептиды, представляющие только несколько аминокислот из Ν-концевой части α§1 казеина, также как и пептиды, полученные их нативного казеина, резко снижают восприимчивость генетически предрасположенных мышей ΝΘΌ к возникновению аутоиммунного диабетического заболевания.

Синтетические пептиды, полученные из казеина, заметно снижают уровни полного холестерина в крови (ТС), липопротеинов низкой плотности (ББЬ) и липопротеинов высокой плотности (НОБ)

Внутрибрюшинное введение синтетических пептидов, полученных из казеина, вызывает значительное уменьшение содержания уровней липидов в крови (НББ, БББ и ТС) у экспериментально гиперхолестеринемичных мышей. После одной недели атерогенной диеты Тйошак НаНгоП уровни холестерина в крови у мышей повысились до уровней 318 мг/дл.

Через неделю после обработки по 1 мг/мышь синтетических пептидов, полученных из казеина, у группы, обработанной синтетическими пептидами, полученными из казеина, представляющими первые 5 (3Р) и 11 (2а) аминокислот α§1 казеина, оказались значительно понижены величины ТС, НББ и БББ, по сравнению с аналогичными значениями для контрольной группы [ТС: 308 и 279 мг/дл соответственно; НББ: 42,5 и 41 мг/дл соответственно и БББ: 247 и 221 мг/дл соответственно, по сравнению с 393 мг/дл (ТС), 54,5 мг/дл (НББ) и 326 мг/дл (БОБ) у вызванной диетой гиперхолестерин/гиперлипидемичной контрольной группы] (фиг. 15).

Таким образом, синтетические пептиды, представляющие первые несколько Ν-концевых аминокислот α§1 казеина, эффективно снижают экспериментально индуцированную гиперлипидемию и гиперхолестеринемию через неделю после однократного внутрибрюшинного их введения.

Клинические исследования пептидов, полученных из нативного казеина

Каждому из пациентов внутримышечными инъекциями вводили по 50 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, одной или тремя порциями, как указано.

Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют кроветворение у больных злокачественными опухолями

Гематологические профили шести больных злокачественными опухолями, которые уже подверглись или которые проходили курс химиотерапии, исследовали до и после введения пептидов, полученных из нативного казеина, как указано. Особое внимание обращали на изменения значений для тромбоцитов (РБТ), лейкоцитов (^ВС), эритроцитов (КВС) и гемоглобина (НОВ), характеризующих тромбоцитопоэз, лейкоцитопоэз и эритроцитопоэз, соответственно.

- 48 007814

С.Т. (Пациентка женщина, пациент 1)

У пациентки была злокачественная опухоль яичников, она подверглась гистерэктомии с последующей химиотерапией. Она получила две внутримышечные инъекции пептидов, полученных из нативного казеина, через два и затем через два с половиной месяца после операции. Между первым и вторым введением пептидов, полученных из нативного казеина, не проводили никакой химиотерапии. Тесты крови, полученные на 6 день после первой инъекции, на 7 и 13 день после второй инъекции продемонстрировали значительное увеличение содержания тромбоцитов и ЭДВС компонентов, а также увеличение КВС (фиг. 16).

Е. С. (Пациентка женщина, пациент 2)

Пациентка подверглась радикальной мастэктомии по поводу лобулярной карциномы в 1983 г, и шесть лет спустя страдала от метастазов в желудке. За 3 дня до начала химиотерапии она получила одну внутримышечную инъекцию пептидов, полученных из нативного казеина, и вторую через 10 дней после химиотерапии. Хотя показатели крови, взятой на 10 и 16 день после химиотерапии, показали ослабление подавленного гематологического профиля, что обычно наблюдается после химиотерапии, наиболее значительные эффекты пептидов, полученных из нативного казеина, были отмечены через 3 дня после первой инъекции до начала химиотерапии (фиг. 16).

Е.8. (Пациентка женщина, пациент 3)

Пациентка страдала широко распространенными метастазами карциномы молочной железы, впервые обнаруженной в 1987 г. Два года спустя она получила первую внутримышечную инъекцию пептидов, полученных из нативного казеина, и вторую - через 23 дня. На протяжении этого промежутка времени она не получала дополнительного лечения.

Тесты крови показали сильное увеличение РЬТ через семь дней после первой инъекции, и значительное увеличение КВС и ЭДВС через семь дней после второй инъекции (фиг. 16).

ЬК. (Пациентка женщина, пациент 4)

У пациентки диагноз злокачественная опухоль молочной железы с костными метастазами. Она получила одну внутримышечную инъекцию пептидов, полученных из нативного казеина, за 8 дней до начала химиотерапии, и другую - через 14 дней после химиотерапии. Наиболее заметный эффект четко виден по быстрому возвращению ЭДВС уровней после вызванного химиотерапией снижения (фиг. 16).

И.М. (Пациентка женщина, пациент 5)

У пациентки злокачественная опухоль печени, сопровождающаяся широко распространенными метастазами. Она получила три внутримышечные инъекции пептидов, полученных из нативного казеина, на 10, 8 и 6 дни до начала химиотерапии. Вторую серию инъекций провели на 10, 12 и 14 дни после химиотерапии. Хотя значительный эффект воздействия на гематологический профиль отмечен после первой серии инъекций и до начала химиотерапии, наиболее резкое улучшение проявляется в быстром возвращении пониженных после химиотерапии значений к нормальным количествам клеток после второй серии инъекций пептидов, полученных из нативного казеина (фиг. 16).

Таким образом, введение пептидов, полученных из нативного казеина, больным злокачественными заболеваниями приводит к улучшению гематологических профилей, особенно к усилению эритропоэза, лейкоцитопоэза и тромбоцитопоэза, и способно уменьшить и сократить длительность вызванного химиотерапией подавления компонентов крови.

Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют тромбоцитопоэз у реципиентов трансплантатов с устойчивой тромбоцитопенией

Пролонгированная, невосприимчивая к внутривенным вливаниям тромбоцитопения с эпизодами тяжелого кровотечения, может оказаться угрожающим жизни осложнением при трансплантации костного мозга, особенно если традиционные способы терапии оказываются неэффективными. Двум пациентам с тяжелой резистентной тромбоцитопенией вводили пептиды, полученные из нативного казеина.

М-1 (Пациентка женщина)

32-летняя пациентка, страдающая острым миелолейкозом в полной ремиссии, после трансплантации аутологичных стволовых клеток. У нее были два угрожающие жизни эпизода кровотечения, включающие легочное кровотечение и обширную обструктивную гематому мягкого неба. Более чем на 114 день после трансплантации количество тромбоцитов было рефрактивно к гЫЬ-3, гЫЬ-6, внутривенному гамма глобулину и рекомбинантному эритропоэтину. После двух внутримышечных обработок дозами по 50 мкг пептидов, полученных из нативного казеина, (каждая доза вводилась разделенной на 3 порции), ее состояние немедленно улучшилось. Наряду с быстрым возвращением к нормальному количеству тромбоцитов (фиг. 17), прошли кровотечения и петехии нижних конечностей, она смогла начать ходить и вернуться домой в страну проживания без осложнений или побочных эффектов.

М-2 (Пациент мужчина)

30-летний пациент, страдающий острым миелолейкозом, на стадии второй полной ремиссии после внутривенного вливания аутологичных стволовых клеток, демонстрирующий полностью резистентное количество тромбоцитов и обширные эпизоды желудочно-кишечного кровотечения. Ему требовались ежедневные внутривенные вливания порций клеток, у него была развита гипоальбуминемия, и ему не помогло интенсивное лечение гЫЬ-3, гЫЬ-6 и гаммаглобулином. После двух внутримышечных инъекций

- 49 007814 дозами пептидов, полученных из нативного казеина, по 50 мкг каждая, введенными тремя порциями, через 86 дней после трансплантации, наблюдается быстрое восстановление тромбоцитов (фиг. 18) и постепенное прекращение кровотечений. Не потребовалось никакого дальнейшего лечения, и пациент в настоящее время полностью асимптоматичен, причем количество тромбоцитов соответствует норме.

Таким образом, один курс из двух внутримышечных инъекций пептидов, полученных из нативного казеина, в количестве 0,7-1,0 мг/кг массы тела (каждая доза разделена на три порции), оказывается эффективным для быстрого восстановления количества тромбоцитов и ослабления сопутствующих клинических симптомов у пациентов с пролонгированной, невосприимчивой к переливаниям тромбоцитопенией с угрожающими жизни эпизодами кровотечениями.

Пептиды, полученные из нативного казеина, снижают содержание триглицеридов и общего холестерина при наследственной гиперлипидемии

М.8. ( Пациентка женщина)

Пациентка женщина 38 лет с наследственной историей гиперлипидемии. До обработки пептидами, полученными из нативного казеина, химический анализ крови выявил повышенный уровень общего холестерина (321 мк/дл), триглицеридов (213 мк/дл; при норме 45-185 мк/дл) и повышенный уровень ЬОЬхолестерина (236,4 мк/дл; при норме 75-174 мк/дл). Через месяц после однократного введения 50 мкг пептидов, полученных из нативного казеина (в виде трех внутримышечных инъекций), гиперлипидемия стабилизировалась: полное содержание холестерина снизилось до 270 мк/дл, триглицеридов до 165 мк/дл и уровень ЬПЬ-холестерина составил 201 мк/дл, что было все еще выше нормальных значений, но ниже значений, которые были до введения пептидов. Не проводилось никакого дополнительного лечения. Таким образом, обработка пептидами, полученными из нативного казеина, оказывается эффективной для быстрого приведения почти к норме пациентов с гиперлипидемией, которая не поддается другому лечению.

Пептиды, полученные из нативного казеина, стимулируют нормоглобинемию в случае скрытого кровотечения

Ό.Ο. (Пациент мужчина)

Пациент мужчина 75 лет страдает анемией и гипоглобинемией (подавленные КВ С, НОВ, НСТ, МСН и МСНС), связанными с интенсивным внутренним кровотечением. Через месяц после внутримышечной инъекции 50 мкг пептидов, полученных из нативного казеина (вводят тремя порциями), наблюдается значительное уменьшение анемии. Через два месяца КВС достигает нормальных значений (4,32 вместо 3,44 М/мкл), НОВ увеличивается (11,3 вместо 8,9 г/дл) и НСТ, МСН и МСНС все восстанавливаются почти до нормальных значений, несмотря на продолжение внутренних кровотечений.

Таким образом, одна инъекция пептидов, полученных из нативного казеина, по-видимому, способна стимулировать эритропоэз и улучшение состояния при анемии, связанной с потерей крови у пациентов.

Очевидно, что некоторые отличительные особенности настоящего изобретения, которые для ясности раскрыты в контексте отдельных вариантов, могут быть осуществлены в комбинации в одном варианте. Напротив, различные особенности настоящего изобретения, которые для краткости раскрыты в контексте одного варианта, можно осуществить в отдельности или в любых подходящих подкомбинациях.

Хотя настоящее изобретение было раскрыто в связи с его конкретными воплощениями, очевидно, что специалисту в данной области будет очевидно множество его альтернатив, модификаций и вариантов. Соответственно, следует подчеркнуть, что все такие альтернативы, модификации и варианты соответствуют сути и входят в объем прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты, патентные заявки и последовательности, определенные регистрационными номерами, приведенные в настоящем описании, включены в качестве ссылки во всей своей полноте, как если бы каждая отдельная публикация, патент, патентная заявка или последовательность были специально и индивидуально включены в данное описание в качестве ссылки. Кроме того, цитаты или указания на любые ссылки в данном описании не следует рассматривать как признание того, что такие ссылки доступны как известный уровень техники.

Claims (85)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ профилактики или лечения аутоиммунного или инфекционного заболевания или состояния, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
2. 2. Способ по п.1, где указанное аутоиммунное или инфекционное заболевание или состояние выбирают из группы, состоящей из вирусного заболевания, вирусной инфекции, СПИД и ВИЧ-инфекции.
3. 3. Способ профилактики или лечения заболевания или состояния крови, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
4. 4. Способ по п.3, где указанное заболевание или состояние крови выбирают из группы, состоящей

   - 50 007814 из тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, поддающегося лечению эритропоэтином состояния и поддающегося лечению тромбопоэтином состояния.
5. 5. Способ модулирования образования клеток крови, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Νконцевой части казеина «81.
6. 6. Способ по п.5, где указанное модулирование образования клеток крови выбирают из группы, состоящей из индуцирования кроветворения, индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток, индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, индуцирования мегакариоцитопоэза, индуцирования эритропоэза, индуцирования лейкоцитопоэза, индуцирования тромбоцитопоэза, индуцирования пролиферации плазмоцитов, индуцирования пролиферации дендритных клеток и индуцирования пролиферации макрофагов.
7. 7. Способ по п.5, включающий дополнительное введение указанному нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества тромбопоэтина.
8. 8. Способ профилактики или лечения диабетического заболевания или состояния, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
9. 9. Способ по п.8, где указанное метаболическое заболевание или состояние выбирают из группы, состоящей из ΝΙΌΌΜ, ΙΌΌΜ, глюкозурии, гипергликемии, гиперлипидемии и гиперхолестеринемии.
10. 10. Способ профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиолучевой терапии, поддержанной трансплантацией аутологичного костного мозга или стволовых клеток периферической крови (А8СТ) или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81.
11. 11. Способ по п.10, включающий дополнительное введение указанному нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества тромбопоэтина.
12. 12. Способ усиления действия эритропоэтина, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Νконцевой части казеина «81.
13. 13. Способ по п.12, включающий дополнительное введение указанному нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества тромбопоэтина.
14. 14. Способ усиления действия тромбопоэтина, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Νконцевой части казеина «81.
15. 15. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения аутоиммунного или инфекционного заболевания или состояния, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
16. 16. Фармацевтическая композиция по п.15, где указанное аутоиммунное или инфекционное заболевание или состояние выбирают из группы, состоящей из вирусного заболевания, вирусной инфекции, СПИД и ВИЧ-инфекции.
17. 17. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания или состояния крови, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
18. 18. Фармацевтическая композиция по п.17, где указанное заболевание или состояние крови выбирают из группы, состоящей из тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, поддающегося лечению эритропоэтином состояния и поддающегося лечению тромбопоэтином состояния.
19. 19. Фармацевтическая композиция по п.17, включающая дополнительно в качестве активного ингредиента тромбопоэтин.
20. 20. Фармацевтическая композиция для модулирования образования клеток крови, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Νконцевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель.
21. 21. Фармацевтическая композиция по п.20, где указанное модулирование образования клеток крови выбирают из группы, состоящей из индуцирования кроветворения, индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток, индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, индуцирования мегакариоцитопоэза, индуцирования эритропоэза, индуцирования лейкоцитопоэза, индуцирования тромбоцитопозза, индуцирования пролиферации плазмоцитов, индуцирования пролиферации дендритных клеток и индуцирования пролиферации макрофагов.
22. 22. Фармацевтическая композиция по п.20, включающая дополнительно в качестве активного ингредиента тромбопоэтин.
23. 23. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения диабетического заболевания или состояния, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента

    - 51 007814 пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
24. 24. Фармацевтическая композиция по п.23, где указанное метаболическое заболевание или состояние выбирают из группы, состоящей из ΝΙΌΌΜ, ΙΌΌΜ, глюкозурии, гипергликемии, гиперлипидемии и гиперхолестеринемии.
25. 25. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиолучевой терапии, поддержанной трансплантацией аутологичного костного мозга или стволовых клеток периферической крови (А8СТ) или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ), причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
26. 26. Фармацевтическая композиция по п.25, включающая дополнительно в качестве активного ингредиента тромбопоэтин.
27. 27. Фармацевтическая композиция для усиления действия эритропоэтина, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
28. 28. Фармацевтическая композиция по п.27, включающая дополнительно в качестве активного ингредиента тромбопоэтин.
29. 29. Фармацевтическая композиция для усиления действия тромбопоэтина, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Νконцевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
30. 30. Фармацевтическая композиция по п.29, включающая дополнительно в качестве активного ингредиента тромбопоэтин.
31. 31. Фармацевтическая композиция для усиления мобилизации периферических стволовых клеток, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
32. 32. Фармацевтическая композиция по п.31, включающая дополнительно в качестве активного ингредиента тромбопоэтин.
33. 33. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики показаний, выбранных из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания или состояния, вирусного заболевания, вирусной инфекции, гематологического заболевания, гематологического дефицита, тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, гиперлипидемии, гиперхолестеринемии, глюкозурии, гипергликемии, диабета, СПИД, ВИЧ-1, нарушений в хелперных Т-клетках, дефицита дендритных клеток, дефицита макрофагов, нарушений в кроветворных стволовых клетках, включая нарушения в тромбоцитах, лимфоцитах, плазмоцитах и нейтрофилах, предлейкозные состояния, лейкозные состояния, расстройства иммунной системы, возникшие в результате химиотерапии или лучевой терапии, расстройства иммунной системы человека, возникшие в результате лечения заболеваний иммунодефицита и бактериальных инфекций, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
34. 34. Фармацевтическая композиция по п.33, включающая дополнительно в качестве активного ингредиента тромбопоэтин.
35. 35. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики показаний, выбранных из группы, состоящей из гематологического заболевания, гематологического дефицита, тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, дефицита дендритных клеток, дефицита макрофагов, нарушений в кроветворных стволовых клетках, включая нарушения в тромбоцитах, лимфоцитах, плазмоцитах и нейтрофилах, предлейкозные состояния, лейкозные состояния, миелодиспластический синдром, апластическую анемию и недостаточность костного мозга, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель.
36. 36. Фармацевтическая композиция по п.35, включающая дополнительно в качестве активного ингредиента тромбопоэтин.
37. 37. Очищенный пептид, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1-25.
38. 38. Фармацевтическая композиция, включающая очищенный пептид, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1-25, и фармацевтически приемлемый носитель.
39. 39. Фармацевтическая композиция, включающая тромбопоэтин и очищенный пептид, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1-25, и фармацевтически приемлемый носитель.
40. 40. Способ усиления колонизации стволовых клеток донорской крови у миелоаблативного реципиента, причем указанный способ включает лечение донора указанных стволовых клеток донорской крови пептидом, полученным из Ν-концевой части казеина α81, до отбора и имплантации стволовых клеток донорской крови реципиенту.

    - 52 007814
41. 41. Способ по п.40, включающий дополнительно в качестве активного ингредиента тромбопоэтин.
42. 42. Способ усиления колонизации стволовых клеток донорской крови у миелоаблативного реципиента, причем указанный способ включает обработку указанных стволовых клеток донорской крови пептидом, полученным из Ν-концевой части казеина αδ1, до имплантации реципиенту стволовых клеток донорской крови.
43. 43. Способ усиления колонизации стволовых клеток крови у миелоаблативного реципиента, причем указанный способ включает обработку указанных стволовых клеток крови пептидом, полученным из Νконцевой части казеина α81, до имплантации реципиенту стволовых клеток крови.
44. 44. Способ по п.43, включающий дополнительную обработку указанных стволовых клеток крови тромбопоэтином до имплантации реципиенту указанных стволовых клеток крови.
45. 45. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения состояний, связанных с 8АК.8 инфекционным агентом, причем указанная фармацевтическая композиция включает в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина αδ1, и фармацевтически приемлемый носитель.
46. 46. Фармацевтическая композиция по п.45, где указанным δΑΚ,δ инфекционным агентом является коронавирус.
47. 47. Фармацевтическая композиция по п.46, где указанным коронавирусом является δΑΒδ-СоУ.
48. 48. Способ профилактики или лечения состояний, связанных с δΑΚ,δ инфекционным агентом, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части казеина αδ1.
49. 49. Способ по п.48, где указанным δΑΚ,δ инфекционным агентом является коронавирус.
50. 50. Способ по п.48, где указанным коронавирусом является δΑΚδ-СоУ.
51. 51. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина αδ1, для профилактики или лечения аутоиммунного или инфекционного заболевания или состояния.
52. 52. Применение по п.51, где указанное аутоиммунное или инфекционное заболевание или состояние выбирают из группы, состоящей из вирусного заболевания, вирусной инфекции, СПИД и ВИЧинфекции.
53. 53. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина αδ1, для профилактики или лечения заболевания или состояния крови.
54. 54. Применение по п.53, где указанное заболевание или состояние крови выбирают из группы, состоящей из тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, поддающегося лечению эритропоэтином состояния и поддающегося лечению тромбопоэтином состояния.
55. 55. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина αδ1, для модулирования образования клеток крови.
56. 56. Применение по п.55, где указанное модулирование образования клеток крови выбирают из группы, состоящей из индуцирования кроветворения, индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток, индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, индуцирования мегакариоцитопоэза, индуцирования эритропоэза, индуцирования лейкоцитопоэза, индуцирования тромбоцитопоэза, индуцирования пролиферации плазмоцитов, индуцирования пролиферации дендритных клеток и индуцирования пролиферации макрофагов.
57. 57. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина αδ1, для профилактики или лечения диабетического заболевания или состояния.
58. 58. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина αδ1, для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиолучевой терапии, поддержанной трансплантацией аутологичного костного мозга или стволовых клеток периферической крови (ΑδСТ) или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ).
59. 59. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина αδ1, для усиления действия эритропоэтина.
60. 60. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина αδ1, для усиления действия тромбопоэтина.
61. 61. Применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина αδ1, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения аутоиммунного или инфекционного заболевания или состояния.
62. 62. Применение по п.61, где указанное аутоиммунное или инфекционное заболевание или состояние выбирают из группы, состоящей из вирусного заболевания, вирусной инфекции, СПИД и ВИЧинфекции.
63. 63. Применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина αδ1, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения заболевания или состояния крови.
64. 64. Применение по п.63, где указанное заболевание или состояние крови выбирают из группы, состоящей из тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, состояния, поддающегося лечению

    - 53 007814 эритропоэтином, и состояния, поддающегося лечению тромбопоэтином.
65. 65. Применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения для модулирования образования клеток крови.
66. 66. Применение по п.65, где указанное модулирование образования клеток крови выбирают из группы, состоящей из индуцирования кроветворения, индуцирования пролиферации кроветворных стволовых клеток, индуцирования пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток, индуцирования мегакариоцитопоэза, индуцирования эритропоэза, индуцирования лейкоцитопоэза, индуцирования тромбоцитопоэза, индуцирования пролиферации плазмоцитов, индуцирования пролиферации дендритных клеток и индуцирования пролиферации макрофагов.
67. 67. Применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения диабетического заболевания или состояния.
68. 68. Применение по п.67, где указанное метаболическое заболевание или состояние выбирают из группы, состоящей из №ГООМ, ГОЭМ, глюкозурии, гипергликемии, гиперлипидемии и гиперхолестеринемии.
69. 69. Применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения состояний, связанных с миелоаблативными дозами химиолучевой терапии, поддержанной трансплантацией аутологичного костного мозга или стволовых клеток периферической крови (Л8СТ) или трансплантацией аллогенного костного мозга (ВМТ).
70. 70. Применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель, для усиления действия эритропоэтина.
71. 71. Применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель, для усиления действия тромбопоэтина.
72. 72. Применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель, для усиления мобилизации периферических стволовых клеток.
73. 73. Применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения показаний, выбранных из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания или состояния, вирусного заболевания, вирусной инфекции, гематологического заболевания, гематологического дефицита, тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, гиперлипидемии, гиперхолестеринемии, глюкозурии, гипергликемии, диабета, СПИД, ВИЧ-1, нарушения в хелперных Т-клетках, дефицита дендритных клеток, дефицита макрофагов, нарушений в кроветворных стволовых клетках, включая нарушения в тромбоцитах, лимфоцитах, плазмоцитах и нейтрофилах, предлейкозные состояния, лейкозные состояния, нарушения в иммунной системе, вызванные химиотерапией или лучевой терапией, нарушения в иммунной системе человека, вызванные лечением заболеваний иммунодефицита и бактериальных инфекций.
74. 74. Применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина α81, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения показаний, выбранных из группы, состоящей из гематологического заболевания, гематологического дефицита, тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, дефицита дендритных клеток, дефицита макрофагов, нарушений в кроветворных стволовых клетках, включая нарушения в тромбоцитах, лимфоцитах, плазмоцитах и нейтрофилах, предлейкозные состояния, лейкозные состояния, миелодиспластический синдром, апластическую анемию и недостаточность костного мозга.
75. 75. Применение очищенного пептида, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из 8Еф ΙΌ ΝΟ: 1-25, для профилактики или лечения показаний, выбранных из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания или состояния, вирусного заболевания, вирусной инфекции, гематологического заболевания, гематологического дефицита, тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, гиперлипидемии, гиперхолестеринемии, глюкозурии, гипергликемии, диабета, СПИД, ВИЧ-1, нарушений в хелперных Т-клетках, дефицита дендритных клеток, дефицита макрофагов, нарушений в кроветворных стволовых клетках, включая нарушения в тромбоцитах, лимфоцитах, плазмоцитах и нейтрофилах, предлейкозные состояния, лейкозные состояния, расстройства иммунной системы, возникшие в результате химиотерапии или лучевой терапии, расстройства иммунной системы человека, возникшие в результате лечения заболеваний иммунодефицита и бактериальных инфекций.
76. 76. Применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента очищенный пептид, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из 8Еф ΙΌ ΝΟ: 1-25, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения показаний,

    - 54 007814 выбранных из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания или состояния, вирусного заболевания, вирусной инфекции, гематологического заболевания, гематологического дефицита, тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, гиперлипидемии, гиперхолестеринемии, глюкозурии, гипергликемии, диабета, СПИД, ВИЧ-1, нарушений в хелперных Т-клетках, дефицита дендритных клеток, дефицита макрофагов, нарушений в кроветворных стволовых клетках, включая нарушения в тромбоцитах, лимфоцитах, плазмоцитах и нейтрофилах, предлейкозные состояния, лейкозные состояния, расстройства иммунной системы, возникшие в результате химиотерапии или лучевой терапии, расстройства иммунной системы человека, возникшие в результате лечения заболеваний иммунодефицита и бактериальных инфекций.
77. 77. Применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активных ингредиентов тромбопоэтин и очищенный пептид, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из 8Е0 Ш ΝΟ: 1-25, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения показаний, выбранных из группы, состоящей из гематологического заболевания, гематологического дефицита, тромбоцитопении, панцитопении, гранулоцитопении, дефицитов дендритных клеток, дефицитов макрофагов, нарушений в кроветворных стволовых клетках, включая нарушения в тромбоцитах, лимфоцитах, плазмоцитах и нейтрофилах, предлейкозные состояния, лейкозные состояния, миелодиспластический синдром, апластическую анемию и недостаточность костного мозга.
78. 78. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81, для усиления колонизации стволовых клеток донорской крови у миелоаблативного реципиента.
79. 79. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81, для усиления колонизации стволовых клеток крови у миелоаблативного реципиента.
80. 80. Применение пептида, полученного из Ν-концевой части казеина «81, для профилактики или лечения условий, связанных с 8ЛК8 инфекционным агентом.
81. 81. Применение по п.80, где указанным 8ЛК8 инфекционным агентом является коронавирус.
82. 82. Применение по п.81, где указанным коронавирусом является 8ЛК8-СоУ.
83. 83. Применение фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента пептид, полученный из Ν-концевой части казеина «81, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения состояния, связанного с 8ЛК8 инфекционным агентом, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептида, полученного из Ν-концевой части «81 казеина.
84. 84. Применение по п.83, где указанным 8ЛК8 инфекционным агентом является коронавирус.
85. 85. Применение по п.84, где указанным коронавирусом является 8ЛК8-СоУ.