CZ20022915A3 - Čištěný peptid a farmaceutický prostředek s jeho obsahem - Google Patents

Čištěný peptid a farmaceutický prostředek s jeho obsahem Download PDF

Info

Publication number
CZ20022915A3
CZ20022915A3 CZ20022915A CZ20022915A CZ20022915A3 CZ 20022915 A3 CZ20022915 A3 CZ 20022915A3 CZ 20022915 A CZ20022915 A CZ 20022915A CZ 20022915 A CZ20022915 A CZ 20022915A CZ 20022915 A3 CZ20022915 A3 CZ 20022915A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
casein
peptide
terminal portion
treatment
derived
Prior art date
Application number
CZ20022915A
Other languages
English (en)
Inventor
Zvi Sidelman
Original Assignee
Chay 13 Medical Research Group N. V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chay 13 Medical Research Group N. V. filed Critical Chay 13 Medical Research Group N. V.
Publication of CZ20022915A3 publication Critical patent/CZ20022915A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4732—Casein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Description

Čištěný peptid a farmaceutický prostředek s jeho obsahem
Oblast techniky
Popisuji se biologicky aktivní peptidy odvozené ze sekvencí nebo podobné sekvencím, které jsou identické s N-koncem frakce aSl mléčného kaseinu. Tyto peptidy jsou schopné stimulovat a zesilovat imunitní odpověď, ochranu proti virové infekci, upravovat množství cholesterolu v séru a podporovat krvetvorbu. Peptidy odvozené od kaseinu nejsou toxické a mohou se použít pří léčbě a prevenci poruch imunity, hypercholesteremii, hematologických poruch a onemocnění spojených s viry.
Dosavadní stav techniky
7/ - Mť
Biologicky aktivní molekuly pocházející z potravy:
Vedle nutriční hodnoty řady potravin jisté frakce a produkty v trávící soustavě mají schopnost ovlivnit fyziologické děje. Některé z těchto částí, které nemají jen nutriční charakter, jsou v potravě přítomny ve svých aktivních formách. Jsou to například imunoglobuliny v mateřském mléku a v mlezivu, fytoestrogeny, které se nacházejí v potravě založené na sóje, polyfenolické antioxidanty pocházející z ovoce a vitaminů. Jiné části jsou obsažené v nutričních molekulách a uvolňují se v aktivní formě během trávení nebo zpracování potravin. Jsou to například antihypertenzní peptidy pocházející z laktoglobinu (popisuje se v publikaci Kitts, D.D. (1999), Can. J. Physiol. Pharmacol. 72:4, 423-434).
Biologická aktivita mléčných proteinů:
Kasein, který je převládajícím mléčným proteinem, se podle tradiční definice skládá ze tří frakcí. Jsou to frakce α, β a γ v závislosti na jejich elektroforetické pohyblivosti (popisuje • · ·· · ··· ·· ·» ---2 se v publikaci N. J. Hipp, et al. (1952), Dairy Sci., 35:272).
V současné době se kasein definuje podle aminokyselinových sekvenci každé podskupiny aSl, aS2, β a κ (popisuje se v publikaci W.N. Engel et al., (1984), J. Dairy Sci. 67: 1599).
Během tráveni jsou kaseinové proteiny vystaveny proteolytickému štěpeni kyselými proteázami, jako je chymosin (renin), trypsin a pepsin, přičemž vznikají kratší peptidy a dochází ke srážení mléka a výsledné proteinové fragmenty váží vápník. V několika studiích mléčných sloučenin se prokázala bakteriocidní aktivita spojená s kaseinem. V patentovém dokumentu USA č. 3 764 670 se popisují proteolytická štěpení kaseinu poskytující antibiotické vlastnosti proti mikroorganizmům. V izraelském patentu č. 42 863 se popisuje peptid získaný z kaseinu, který obsahuje 23 aminokyselin N-konce kaseinu a vykazuje antibakteriální aktivitu. Navíc se v případě kaseinu a jeho derivátů zvažují další fyziologicky aktivní vlastnosti, jako jsou opiátová aktivita a aktivita podobná aktivitě růstového faktoru (popisuje se v publikaci Kitts, D.D., (1999), ibidem) .
Aktivita upravující imunitu se také pozorovala u kaseinových peptidů. V publikaci Coste et al. (1992, Immun. Lett. 33: 41-46) se pozorovalo zesílení množení krysích lymfocytů, které následovalo po léčbě peptidem získaným z C-konce kaseinu β. Avšak v žádné této studii se nezjistily u těchto kaseinových peptidů specifické sekvence, které jim propůjčují vlastnosti jiné než nutriční.
Krvetvorba při léčbě zhoubného bujení:
Po chemoterapii aplikované ve vysokých dávkách, zvláště po myeloablačních dávkách chemoradioaktivity podporované transplantací vlastní kostní dřeně nebo kmenových buněk periferní krve (ASCT) nebo cizorodé kostní dřeně (BMT), jsou pacienti silně ohroženi pancytopenií. Granulocytopenie může vést v období bezprostředně po transplantaci ke vzniku vážných, někdy ·· · ··· ·· ·’ - — smrtelných, infekčních komplikací způsobených běžnými bakteriálními, virovými, plísňovými a parazitickými činidly. Podobně trombocytopenie často vede ke krvácení a někdy k dlouhodobé závislosti na krevních destičkách. Jakmile se vyvine rezistence vůči krevním destičkám, krvácení může ohrozit život a hemoragické komplikace jsou často smrtelné. Ohrožení způsobené granulocytopenií se může částečně předejít podpůrnými opatřeními a účinněji aplikací rekombinantních lidských cytokinů, které mohou zesílit obnovu granulocytů, zvláště aplikací faktoru podporujícího kolonie granulocytů (G-CSF) a faktoru podporujícího granulocytové makrofágové kolonie (GM-CSF). Tato činidla jsou velmi nákladná (přibližně 200 až 400 dolarů na den a pacienta) a často mají vedlejší účinky způsobující hypersenzitivní reakce, zvýšenou teplotu, bolesti kostí a vaskulární úbytkový syndrom zahrnující zánět osrdečníku a pohrudnice. Některé z těchto vedlejších účinků mohou být způsobeny jinými cytokiny, které se mohou uvolnit těmito krvetvornými růstovými faktory. Avšak u pacientů s nádorovými buňkami nesoucími receptory G-CSF nebo GM-CSF, což je u akutní a chronická myelodní leukemie a u myelodisplastických syndromů, je použití těchto krvetvorných růstových faktorů zakázáno. Zatímco hlavní zlepšení u léčených pacientů, kterým hrozí pancytopenie, se dosáhlo použitím cytokinů podporujících krvetvorbu, žádného zlepšení se nedosáhlo při léčbě trombocytopenie. Po chemoterapii ve vysokých dávkách a zvláště po ASCT jsou pacienti ohroženi trombocytopenií, která může trvat řadu měsíců, dokonce až tři roky, a někteří pacienti trpící trombocytopenií se nemusí nikdy vyléčit. Řada pacientů, která se dříve léčila četnými krevními produkty, se stává rezistentní vůči krevním destičkám a proto trombocytopenií není možné nikdy překonat, dokonce ani navzdory intenzivním a častým transfúzím krevních destiček od jednoho dárce. Rezistence vůči krevním destičkám a dlouhotrvající trombocytopenií představuje běžný způsob úmrtí v centrech ASCT po celém světě.
., · ··· ·· ---4
V současné době se několik nových rekombinantních cytokinu, jako je rekombinantní lidský interleukin 3 (rhIL3) a rekombinantní lidský interleukin 6 (rhIL6) , zkoumá jako potencionální činidlo pro zesílení megakaryocytopoézy a obnovu krevních destiček. Naneštěstí předchozí klinické studie ukázaly, že ačkoli rhIL3 a rhIL6 mohou zesílit obnovu krevních destiček, takové účinky nejsou v žádném případě dramatické a mohou trvat značně dlouho.
Je zřejmé, že dlouho trvající trombocytopenie představuje v současné době hlavní problém v klinických centrech transplantace kostní dřeně, pro který se nenašlo uspokojivé řešení.
Je proto nutné a velmi výhodné získat bezpečný, laciný, rychle účinný a dobře definovaný stimulátor krvetvorby a zvláště megakaryocytopoézy, zbavených shora uvedených omezení.
Frakce aSl kaseinu:
Frakce aSl kaseinu se může získat z mléčných proteinů použitím různých metod (popisuje se v publikacích D. G. Schmidth and T. A. J. Paynes (1963), Biochim., Biophys. Acta, 78: 492, M. P. Thompson and C. A. Kiddy (1964), J. Dairy Sci., 47: 626, J.
C. Mercier, et al. (1968), Bull. Soc. Chim. Biol. 50: 521) a úplná aminokyselinová sekvence frakce aSl kaseinu se popisuje v publikaci J. C. Mercier et al. (1971) Eur. J. Biochem. 23:
41). Genomové a kódující sekvence frakce aSl telecího kaseinu se také musely klonovat a sekvenovat použitím metod rekombinace DNA (popisuje se v publikaci D. Koczan, et al. (1991), Nucl. Acids
Res. 19(20): 5591, McKnight, R. A., et al (1989), J. Dairy Sci. 72: 2464-73). V publikaci J. C. Mercier, et al. (1970), Eur. J.
Biochem. 16: 439, P. L. H. McSweeney et al. (1993), J. Dairy
Res., 60: 401) se dokumentovalo, ačkoli po požití celých mléčných proteinů dochází k absorpci ve střevech, proteolytické štěpení a identifikace fragmentů N-konce z frakce aSl kaseinu a ··· ♦· · · · λ» · *··<> ·· ·*·* výskyt tohoto fragmentu v plazmě savců (Fiat, A. M., et al. (1998) Biochimie, 80(2):2155-65). V publikaci Meisel, H. and Bockelmann, W. (1999), Antonie Van Leeuwenhoek, 76:207-15) se popisuje detekce aminokyselinových sekvencí imunologických peptidů, kasokininů a kasomorfinů, v peptidech uvolněných štěpením frakcí a a β kaseinu bakteriemi, které štěpí mléčné kyseliny. Zajímavá je anti-agregační a trombolytická aktivita, kterou vykazují C-terminální části frakcí a-kaseinu a k-kaseinu (popisuje se v publikaci Chabance, B. et al. (1997), Biochem.
Mol. Biol. Int. 42(1) 77-84, Caen J. et al. (1993), J. Dairy Sci. 76(1):301-310). Předchozí studie zaznamenaly bioaktivní peptidy uschované v aminokyselinové sekvenci N-konce aSl, ale nezmiňuje se použití těchto proteinových fragmentů, specifických sekvencí nebo definovaných syntetických peptidů při zesílení krvetvorby, prevenci virové infekce nebo regulaci vzniku autoimunitního onemocnění.
Podstata vynálezu
Vynález popisuje čištěný peptid, jehož aminokyselinová sekvence se vybrala ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO: 1 až 19.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení autoimunitního onemocnění, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení virového onemocnění, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci virové infekce, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro vyvolání krvetvorby, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z
N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro vyvolání megakaryocytopoézy, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro vyvolání erytropoézy, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek vyvolávající leukocytopoézu, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro vyvolání trombocytopoézu, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení trombocytopenie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení pancytopenie, který obsahuje jako aktivní složku peptid • 9 • · 9 9 999 9 · *9 • ·· · · 9 9 9 • •99 · *999 9 • · · · 9 999 • · · ·· 99999·· 9 · 9 9 9 9 získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevencí a léčení granulocytopenie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení hyperlipemie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení cholesteremie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení glukosurie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení cukrovky, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení AIDS, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení infekce HIV, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení stavů spojených s myeloblačními dávkami chemoradioterapie, které jsou podpořeny transplantací vlastní kostní dřeně (ASCT) nebo cizorodé kostní dřeně (BMT), přičemž ··· · · · · · · ·· • · · · · · · · farmaceuticky prostředek obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení autoimunitního onemocnění.
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení virového onemocnění.
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci virové infekce.
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro vyvolání krvetvorby.
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk.
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk.
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro vyvolání megakaryocytopoézy.
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro vyvolání erytropoézy.
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro vyvolání leukocytopoézy.
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro vyvolání trombocytopoézy.
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení trombocytopenie.
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení pancytopenie.
• · · · ·· ·· · 0 ··· 0 0 0 · « · ··
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-termínální částí kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení granulocytopenie.
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení hyperlipemie.
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení cholesteremie.
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení glukosurie.
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení cukrovky.
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení AIDS.
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení infekce HIV.
Vynález dále popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení stavů spojených myeloblačními dávkami chemoradioterapie podpořené transplantací vlastní kostní dřeně (ASCT) nebo cizorodé kostní dřeně (BMT).
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení autoimunitního onemocnění.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení virového onemocnění.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení virové infekce.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání krvetvorby.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání množení krvetvorných kmenových buněk.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání množení a diferenciace krvetvorných kmenových buněk.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání megakaryocytopoézy.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání erytropoézy.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání leukocytopoézy.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání trombocytopoézy.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení trombocytopenie.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení pancytopenie.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení granulocytopenie.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení hyperlipemie.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení cholesteremie.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení glukosurie.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení cukrovky.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení AIDS.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení infekce HIV.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení stavů spojených s myeloblačními dávkami chemoradioterapie podporovanými transplantací autologní kostní dřeně nebo kmenových buněk periferní krve (ASCT) nebo transplantací alogenní kostní dřeně (BMT). Dále vynález popisuje použití peptidu pro výrobu léčiva, kde uvedený peptid je fragment získaný štěpením kaseinu aSl.
Dále vynález popisuje použití peptidu pro výrobu léčiva, kde uvedený peptid je syntetický peptid. Dále vynález popisuje použití peptidu pro výrobu léčiva, kde tento peptid má sekvenci odpovídající jedné ze sekvencí SEQ ID NO: 1 až 19.
Podle dalších rysů výhodných provedeních vynálezu popsaných dále v textu je peptid fragment získaný štěpením kaseinu aSl.
Podle dalších rysů popsaných výhodných provedeních vynálezu peptid je syntetický peptid.
Podle dalších rysů popsaných výhodných provedeních vynálezu peptid má sekvenci uvedenou v jedné ze sekvencí SEQ ID NO: 1 až 19.
Vynález dále popisuje farmaceutický prostředek obsahující čištěný peptid, jehož aminokyselinová sekvence se vybrala ze • · ·· · *· • · · · · · · ·« · · · • · · · 9 9 9 skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO: 1 až 19 a farmaceuticky přijatelný nosič.
Vynález se úspěšně zabývá nedostatky v současně známém uspořádání tím, že popisuje peptidy, které jsou vhodné pro léčení lidského onemocnění a které se získaly z N-terminální části kaseinu aSl a nevykazují stanovitelnou toxicitu a mají vysokou terapeutickou účinnost.
Vynález popisuje biologicky aktivní peptidy, které se získaly ze sekvencí nebo jsou těmto sekvencím podobné, přičemž uvedené sekvence jsou stejné jako N-konec části aSl mléčného kaseinu. Dále vynález popisuje prostředky obsahující uvedené peptidy a způsoby jejich využití například při stimulaci a zesílení imunitní odezvy, ochrany proti virové infekci, upravení množství cholesterolu v krvi a stimulaci krvetvorby. Peptidy získané z kaseinu nejsou toxické a mohou se použít při léčení a prevenci například poruch imunity, hypercholesteremie, hematologických poruch a onemocnění spojených s viry.
Principy a postupy podle vynálezu jsou srozumitelnější s odkazy na obrázky a doprovodnými popisy.
Dříve než se vysvětlí detailněji alespoň jedno provedení vynálezu, je nutné porozumět, že vynález není omezen svým využitím na detaily uvedené v následujícím popisu nebo v části příkladů. Vynález je schopen jiných provedeních nebo se zavádí do praxe nebo se provádí různými způsoby. Také je nutné porozumět, že zde uvedené fráze a termíny se používají pro účely popisu a nepovažují se za limitující.
Zde používaný termín „léčení zahrnuje podstatnou inhibici, zpomalení nebo zvrácení postupu onemocnění, podstatné zlepšení klinických symptomů onemocnění.
Termín „peptid zahrnuje přirozené peptidy (buď degradační produkty, uměle syntetizované peptidy nebo rekombinantní peptidy) a napodobeniny peptidů (typicky, uměle syntetizované peptidy), jako jsou peptoidy a semipeptoidy, které jsou analogy peptidů. Tyto analogy mohou například vykazovat úpravy, které
činí peptidy v těle stabilnější. Takové úpravy zahrnují, ale nejsou omezeny na cyklizaci, úpravy N-konce, úpravy C-konce, úpravy peptidové vazby, které zahrnují, ale neomezují se na CH2NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH nebo CF=CH, úpravy základního řetězce a úpravy zbytku. Způsoby přípravy sloučenin, které napodobují peptidy jsou dobře známy v oboru a popisují se například v publikaci Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992). Další související detaily jsou uvedeny dále v textu.
Pak peptid podle vynálezu může být cyklický peptid. Cyklizace je možné dosáhnout například pomocí vytvoření amidových vazeb, například začleněním Glu, Asp, Lys, Orn, kyseliny diaminobutanové (Dab), diaminopropionové (Dap) do různých poloh v řetězci (vazby -CO-NH nebo -NH-CO). Hlavní řetězec pro cyklizaci hlavního řetězce se může také získat začleněním upravených aminokyselin do vzorců H-N( (CH2) n-COOH)C(R)H-COOH nebo H-N ( (CH2)n-COOH) -C (R) H-NH2, kde symbol a je 1 až 4 a dále symbol R je libovolný přirozený nebo nepřirozený vedlejší řetězec aminokyseliny.
Také je možná cyklizace prostřednictvím vytvoření vazeb S-S pomocí začlenění dvou zbytků Cys. Další postranní řetězec pro cyklizaci postranního řetězce je možné získat prostřednictvím vytvoření interakční vazby vzorce -(~CH2~) n-S-CH2-C-, kde symbol n je 1 nebo 2, což je například možné prostřednictvím začlenění Cys nebo homoCys a reakce jejich volné skupiny SH s například bromoacetylovaným Lys, Orn, Dab nebo Dap.
Peptidové vazby (-CO-NH-) v peptidu se mohou substituovat například N-methylovanými vazbami (-N (CH3)-C0-), esterovými vazbami (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-), ketomethylenovými vazbami (-C0CH2-) , vazby α-aza (-NH-N(R)-CO-), kde symbol R je libovolný alkyl, například methyl, karbaovými vazbami (-CH2-NH-), hydroxyethylenovými vazbami (-CH(OH)-CH2-) , thioamidovými vazbami (-CS-NH-), nenasycenými dvojnými vazbami (-CH-CH-), retroamidovými vazbami (-NH-CO-), peptidovými deriváty (-N(R)-
CH2-C0-), kde symbol R je „normální” postranní řetězec, který se přirozeně vyskytuje na atomu uhlíku.
Tyto úpravy se mohou vyskytovat v libovolné z vazeb v peptidovém řetězci a dokonce několikrát (2 až 3 krát) ve stejnou dobu.
Přirozené aromatické aminokyseliny Trp, Tyr a Phe mohou být substituovány umělou nepřirozenou aminokyselinou, jako je TIC, naftylelanin (Nol), což jsou kruhové methylované deriváty Phe, halogenované deriváty Phe nebo o-methyl-Tyr.
Tabulky 1 až 2 uvedené dále v textu obsahují seznam přirozeně se vyskytujících aminokyselin (tabulka 1) a upravené aminokyselině a aminokyseliny, které nejsou běžné (uvádí se v tabulce č. 2) .
Tabulka č. 1
aminokyselina třípísmenná zkratka jednopísmenná zkratka
alanin Ala A
arginin Arg R
asparagin Asn N
asparágová kyselina Asp D
cystein Cys C
glutamin Gin Q
glutamová kyselina Glu E
glycin Gly G
histidin His H
izoleucin Iie I
leucin Leu L
lysin Lys K
metionin Met M
fenylalanin Phe F
prolin Pro P
serin Ser S
threonin Thr T
• fc fc · • · · • ♦· fcfc fcfc fc · · · · fcfc • · fc · fc • fcfc·· fc fcfc fc · · fcfcfcfc··· fcfc fcfcfcfc
tryptofan Trp W
tyrosin Tyr Y
valin Val V
libovolná shora uvedená aminokyselina Xaa X
Tabulka č. 2
nekonvenční aminokyselina kód nekonvenční aminokyselina kód
α-aminobutanová kyselina Abu L-N-methylalanin Nmala
a-amino-a-methylbutyrát Mgabu L-N-methylarginin Nmarg
aminocyklopropankarbo- xylát Cpro L-N-methylasparagin Nmasn
aminoisobutanová kyselina Aib L-N-methylasparagová kyselina Nmasp
aminonorbornylkarboxylát Norb L-N-methylcystein Nmcys
cyklohexylalanin Chexa L-N-methylglutamin Nmgin
cyklopentylalanin Cpen L-N-methylglutamová kyselina Nmglu
D-alanin Dal L-N-methylhistidin Nmhis
D-arginin Darg L-N-methylizoleucin Nmile
D-asparágová kyselina Dasp L-N-methylleucin Nmleu
D-cystein Dcys L-N-methyllysin Nmlys
D-glutamin Dgln L-N-methylmetionin Nmmet
D-glutamová kyselina Dglu L-N-methylnorleucin Nmnle
D-histidin Dhis L-N-methylnorvalin Nmnva
D-izoleucin Dile L-N-methylornithin Nmorn
D-leucin Dleu L-N-methylfenylalanin Nmphe
D-lysin Dlys L-N-methylprolin Nmpro
D-metionin Dmet L-N-methylserin Nmser
D-ornithin Dorn L-N-methylthreonin Nmthr
D-fenylalanin Dphe L-N-methyltryptofan Nmtrp
D-prolin Dpro L-N-methyltyrosin Nmtyr
• ·> · <· ·· ·« • · · · ··* · · ·· • · · · · · · · r · · · ♦ · · · · · ··· * · ··· mí ·· ··· ···· ·» ···$
D-serin Dser L-N-methylmethylvalin Nmval
D-threonin Dthr L-N-methylethylglycin Nmetg
D-tryptofan Dtrp L-N-methyl-t-butylglycin Nmtbug
D-tyrosin Dtyr L-norleucin Nle
D-valin Dval L-norvalin Nva
D-a-methylalanin Dmala a-methyl-aminoizobutyrát Maib
D-a-methylarginin Dmarg a-methyl-y-aminobutarát Mgabu
D-a-methylasparagin Dmasn α-methylcyklohexylalanin Mchexa
D-a-methylaspartát Dmasp a-methylcyklopentylala- nin Mcpen
D-a-methylcystein Dmcys a-methyl-a-naftylalanin Manap
D-a-methylglutamin Dmgln a-methylpenicilamin Mpen
D-a-methylhistidin Dmhis N-(4-aminobutyl) glycin Nglu
D-a-methylizoleucin Dmile N-(2-aminoethyl)glycin Naeg
D-a-methylleucin Dmleu N- (3-aminopropyl)glycin Norm
D-a-methyllysin Dmlys N-amino-a-methylbutyrát Nmaabu
D-a-methylmetionin Dmmet a-naftylalanin Anap
D-a-methylornithin Dmorn N-benzylglycin Nphe
D-a-methylfenylalanin Dmphe N-(2-karbamylethyl)glycin Ngln
D-a-methylprolin Dmpro N-(karbamylmethyl)glycin Nasn
D-a-methylserin Dmser N-(2-karboxyethyl)glycin Nglu
D-a-methylthreonin Dmthr N- (karboxymethyl)glycin Násp
D-a-methyltryptofan Dmtrp N-cyklobutylglycin Ncbut
D-a-methyltyrosin Dmty N-cykloheptylglycin Nchep
D-a-methylvalin Dmval N-cyklohexylglycin Nchex
D-a-methylalanin Dnmala N-cyklodecylglycin Ncdec
D-a-methylarginin Dnmarg N-cyklododeclglycin Ncdod
D-a-methylasparagin Dnmasn N-cyklooktylglycin Ncoct
D-a-methylaspartát Dnmasp N-cyklopropylglycin Ncpro
D-a-methylcystein Dnmcys N-cykloundecylglycin Ncund
r« ««
I 9 4 ' · ··
9949
D-N-methylleucin Dnmleu N-(2,2-difenylethyl)glycin Nbhm
D-N-methyllysin Dnmlys N-(3,3-difenylpro- pyl)glycin Nbhe
N-methylcyklohexylalanin Nmchex a N-(3-indolylethyl)glycin Nhtrp
D-N-methylornithin Dnmorn N-methyl-y-aminobutyrát Nmgabu
N-methylglycin Nala D-N-methylmetionin Dnmmet
N-methylaminoizobutyrát Nmaib N-methylcyklopentylala- nin Nmcpan
N-(1-methylpropyl)glycin Nile D-N-methylfenylalanin Dnmphe
N-(2-methylpropyl)glycin Nile D-N-methylprolin Dnmpro
D-N-methyltryptofan Dnmtrp D-N-methylserin Dnmser
D-N-methyltyrosin Dnmtyr D-N-methylserin Dnmser
D-N-methylvalin Dnmval N-(1-methylethyl)glycin Nva
γ-aminobutanová kyselina Gábu N-methyla-naftylialanin Nmanap
L-t-butylglycin Tbug N-methylpenicilinamin Nmpen
L-ethylglycin Etg N-(p-hydroxyfenyl)glycin Nhtyr
L-homofenylalanin Hphe N-(thiomethyl)glycin Ncys
L-a-methylarginin Marg penicilamin Pen
L-a-methýlaspařtát Masp L-a-methylalanin Mala
L-a-methylcystein Mcys L-a-methylasparagin Masn
L-a-methylglutamin Mgln L-a-methyl-t-butylglycin Mtbug
L-a-methylhistidin Mhis L-methylethylglycin Metg
L-a-methylizoleucin Mile L-a-methylglutamát Mglu
D-N-methylglutamin Dnmgln L-a-methylhomofenylalanin Mhphe
D-N-methylglutamát Dnmglu N-(2-methylthio- ethyl)glycin Nmet
D-N-methylhistidin Dnmhis N-(3-guanidopropyl)glycin Narg
D-N-methylizoleucin Dnmile N-(1-hydroxyethyl)glycin Nthr
D-N-methylleucin Dnmleu N-(hydroxyethyl)glycin Nser
·· • 9 9 * · • 9 · *
9 9 «·< 9 * ®Λ • · · Φ •
• Φ · ’ • · ·
999 99
9 9 ·
9
9
9
9 9 99 9 9
D-N-methyllysin Dnmlys N-(imidazolylethyl)gly- cin Nhis
N-methylcyklohexylalanin Nmchex a N-(3-idolylyethyl)glycin Nhtrp
D-N-methylornithin Dnmorn N-methyl-y-aminobutyrát Nmgabu
N-methylglycin Nala D-N-methylmetionin Dnmmet
N-methylaminoizobutyrát Nmaib N-methylcyklopentylala- nin Nmcpen
N-(1-methylpropyl)glycin Nile D-N-methylfenylalanin Dnmphe
N-(2-methylpropyl)glycin Nleu D-N-methylprolin Dnmpro
D-N-methyltryprofan Dnmtrp D-N-methylserin Dnmser
D-N-methyltyrosin Dnmtyr D-N-methylthreonin Dnmthr
D-N-methylvalin Dnmval N-(1-methylethyl)glycin Nval
γ-aminobutanová kyselina Gábu N-methyla-naftylalanin Nmanap
L-t-butylglycin Tbug N-methylpěnicilinamin Nmpen
L-ethylglycin Etg N-(p-hydroxyfenyl)glycin Nhtyr
L-homofenylalanin Hphe N-(thiomethyl)glycin Ncys
L-a-methylarginin Marg penicilamin Pen
L-a-methylaspartát Masp L-a-methylalanin Mala
L-a-methylcystein Mcys L-a-methylasparagin Masn
L-a-methylglutamin Mgln L-a-methyl-t-butylglycin Mtbug
L-a-methylhistidin Mhis L-a-methylethylglycin Metg
L-a-methylizoleucin Mile L-a-methylglutamát Mglu
L-a-methylleucin Mleu L-a-methylhomofenylalanin Mhphe
L-a-methylmetionin ^4met N-(2-methylthio- ethyl)glycin Nmet
L-a-methylnorvalin Mnva L-a-methyllysin Mlys
L-a-methylfenylalanin Mphe L-a-methylnorleucin Mnle
L-a-methylserin Mser L-a-methylornithin Morn
L-a-methylvalin Mtrp L-a-methylprolin Mpro
L-a-methylleucin Mval L-a-methylthreonin Mthr
• · ··♦<
Ν- (N- (2,2-difeny1- ethyl)karbamylmethylgly- cin Nnbhm L-a-methyltyrosin Mtyr
1-karboxy-1-(2,2-dife- nylethylamino)cyklopro- pan Nmbc L-N-methylhomofenyl- alanin Nmhphe
Ν- (N-(3,3-difenylpro- pyl)karbamylme- thyl-l-glycin Nnbhe
Peptid podle vynálezu se může použít ve své stávající formě nebo může být součástí složek, jako jsou proteiny, a zobrazuje složky, jako jsou bakterie a fágy. Peptidy podle vynálezu se mohou také chemicky upravovat za vzniku aktivních dimérů nebo multimérů v jednom polypeptidovém řetězci nebo kovalentně zesíťovaných řetězcích.
Peptid podle vynálezu navíc zahrnuje alespoň čtyři, podle volby alespoň pět, podle volby alespoň šest, podle volby alespoň sedm, podle volby alespoň osm, podle volby alespoň devět, podle volby alespoň deset, podle volby alespoň jedenáct, podle volby alespoň dvanáct, podle volby alespoň třináct, podle volby alespoň čtrnáct, podle volby alespoň patnáct, podle volby alespoň šestnáct, podle volby alespoň sedmnáct, podle volby alespoň osmnáct, podle volby alespoň devatenáct, podle volby alespoň dvacet, podle volby alespoň dvacet jedna, podle volby alespoň dvacet dva, podle volby alespoň dvacet tři, podle volby alespoň dvacet čtyři, podle volby alespoň dvacet pět, podle volby alespoň dvacet šest, podle volby dvacet sedm až šedesát nebo více aminokyselinových zbytků (v tomto dokumentu se používá zaměnitelný výraz aminokyseliny).
Termín „aminokyselina nebo „aminokyseliny zahrnuje 20 přirozeně se vyskytujících aminokyselin. Tyto aminokyseliny často upravené po translaci in vivo zahrnuji například hydroxyprolín, fosfoserin a fosfothreonin a jiné neobvyklé
aminokyseliny mezi něž patří 2-aminoadipová kyselina, hydroxylysin, izodesmosin, norvalin, norleucin a ornithin. Dále termín „aminokyselina zahrnuje jak D-aminokyseliny tak L-aminokyseliny.
Termín „získaný z N-terminální části kaseinu aSl znamená peptidy podle zde uvedené definice. Jsou to například produkty štěpení kaseinu aSl (peptidy získané z přirozeného kaseinu), syntetické peptidy chemicky syntetizované v souladu s aminokyselinovou sekvencí N-terminální části kaseinu aSl (syntetický peptid získaný z kaseinu), peptidy podobné (homologní) N-terminální částí kaseinu aSl, což jsou například peptidy charakterizované jednou nebo více substitucí aminokyselin, jako jsou například bez omezení povolené substituce, což umožňuje, zachování alespoň 70 %, s výhodou alespoň 80 %, výhodněji alespoň 90 % podobnosti, a jejich funkční homoiogy. Zde používané termíny „homoiogy a „funkční homoiogy znamenají peptidy s libovolnými inzerty, delecemi a substitucemi, které neovlivňují biologickou aktivitu peptidu.
Termín „kasein znamená kasein aSl savců, mezi než patří bez omezení dobytek (například kráva, ovce, koza, klisna, velbloud, jelen a buvol), člověk a mořští savci. Dále v textu se uvádí seznam kaseinů aSl, které mají známou aminokyselinovou sekvenci a jsou charakterizovány číslem uložení v genové bance GenBank (NCBI) a zdrojem: CAA26982 (Ovis aries (ovce)), CAA51022 (Capra hircus} (koza)), CAA42516 (Bos taurus (dobytek)),
CAA55185 (Homo sapiens}, CAA38717 (Sus scrofa} (prase)), P09115 (králík) a 097943 (Camelus dromedurius) (velbloud)).
Termín „N-terminální část znamená M aminokyselin kaseinu aSl získaný z prvních 60 aminokyselin kaseinu aSl, kde symbol M znamená libovolné celé číslo mezi 5 a 60 (zahrnující celé číslo 5 a 60). Je výhodné, když termín zahrnuje prvních M aminokyselin kaseinu aSl.
Peptidy podle vynálezu mohou být získány extrakcí z mléka, jak se popisuje dříve v textu, nebo syntézou peptidu na pevné fázi, což jsou standardní metody známé v oboru. Čištění peptidu podle vynálezu se provádí standardními postupy, které jsou dobře známy v oboru, jako je vysoce výkonná kapalinová chromatografie (HPLC). Aby se získaly peptidy podle vynálezu, fragmentace mléčného kaseinu může být provedena použitím různých enzymatických a/nebo chemických postupů.
Jak se detailněji popisuje dále v textu a v části příkladů, peptidy podle vynálezu mají různé terapeutické účinky. V části příkladů se popisuje řada testů použitím, kterých může odborník testovat specifický terapeutický účinek specifického peptidu vytvořeného v souladu s vynálezem.
Libovolné zde popsané peptidy se mohou aplikovat samostatně nebo se mohou začlenit do farmaceutického prostředku, který se může použít při léčení nebo prevenci onemocnění. Takový prostředek zahrnuje jako aktivní složku libovolný ze zde popsaných peptidu a farmaceuticky přijatelný nosič.
Termín „farmaceutický prostředek znamená přípravek obsahující jeden nebo více zde popsaných peptidů a jiné chemické složky, jako jsou farmaceuticky přijatelné nosiče a pomocné látky. Úkolem farmaceutického prostředku je umožnit aplikaci sloučeniny do organizmu.
Termín „farmaceuticky přijatelný nosič znamená nosič nebo ředidlo, které nezpůsobuje podstatné dráždění organizmu a neporušuje biologickou aktivitu a vlastnosti aplikované látky. Příklady nosičů bez omezení jsou: propylenglykol, fyziologický roztok, emulze a směsi organických rozpouštědel s vodou. Termín „pomocná látka znamená inertní látku přidanou do farmaceutického prostředku, která dále usnadňuje aplikaci látky. Příklady pomocných látek bez omezení zahrnují uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé cukry a typy škrobu, deriváty celulózy, želatinu, rostlinné oleje a polyethylenglykoly.
Metody výroby a aplikace léků se také popisují v publikaci „Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.,
Easton, PA, poslední vydání.
• «· · · · ♦ *
2·· · ♦ ··· *·· ·· ··· ···· ·* ····
Vhodné aplikace mohou například zahrnovat orální, rektální, transdermální, intestinální nebo parenterální zavedení zahrnující intramuskulární, subkutánní a intramedulární injekce stejně jako intratekální, přímé intravenozní, intraperitoneální, intranasální nebo intraokulární injekce.
Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou vyrábět postupem, který je dobře znám v oboru. Je to například běžné míšení, rozpouštění, granulace, příprava dražé, rozmělnění, příprava emulze a kapsulí, uzavírací nebo lyofilizační postupy.
Farmaceutické prostředky pro použití podle vynálezu se mohou tvořit běžným postupem za použití jednoho nebo více farmaceuticky přijatelných nosičů, které obsahují pomocné látky a pomocné prostředky, které usnadňují zpracování aktivních peptidů do prostředku, který se může použít jako farmaceutický prostředek. Vhodné složení závisí na způsobu zvolené aplikace.
V případě injekce peptidy podle vynálezu se mohou tvořit ve vodných roztocích, přednostně ve fyziologicky kompatibilních pufrech, jako je Hankův, Ringerův roztok, fyziologický roztok s organickými rozpouštědly samotný fyziologický roztok. Mezi organická rozpouštědla patří propylenglykol, polyethylenglykol. Jestliže je nutné, aby prostředek prošel po aplikaci sliznicí, přidávají se penetrační činidla. Taková penetrační činidla jsou obecně známa v oboru.
V případě orální aplikace se mohou peptidy často připravovat kombinováním aktivních peptidů s farmaceuticky přijatelnými nosiči, který jsou dobře známy v oboru. Takové nosiče umožňují peptidům podle vynálezu tvořit tablety, pilulky, dražé, kapsula, roztoky, gely, sirupy, kaše, suspenze a podobně, které jsou vhodné pro orální požití. Farmakologické prostředky vhodné pro orální aplikaci se mohou připravit použitím pevných pomocných prostředků, mletím výsledné směsi a zpracováním směsi granulí po přidání vhodných pomocných prostředků, jestliže je to nutné, přičemž vznikají tablety nebo dražé. Vhodnými pomocnými látkami jsou zvláště plnidla, jako jsou cukry zahrnující laktózu, sacharózu, manitol nebo sorbitol, celulózové přípravky, jako je ♦ fcfc • fcfc · fc fcfc fcfc · například kukuřičný, pšeničný, rýžový, bramborový škrob, želatina, tragant, methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, natrium karbomethylcelulóza, a/nebo fyziologicky přijatelné polymery, jako je polyvinylpyrrolidon (PVP). Jestliže je to nutné mohou se přidat činidla zajišťující rozpad, jako jsou síťovaný polyvinylpyrrolidon, agar nebo kyseliny alginová nebo její sůl, jako je aiginát sodný.
Dražé obsahují vhodné potahy. Pro tyto účely se používají koncentrované roztoky cukru, které mohou obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidon, karbopolový gel, polyethylenglykol, oxid títaničitý, ředěné roztoky a vhodná organická rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel. Za účelem identifikace nebo charakterizace různých kombinací dávek aktivních látek se mohou do tablet a dražé přidávat barviva a pigmenty.
Farmaceutické prostředky, které se mohou použít orálně, zahrnují zásuvné kapsle připravené z želatiny stejně jako měkké uzavřené kapsle připravené z želatiny a změkčovadla, kterým je glycerol nebo sorbitol. Zásuvné kapsle mohou obsahovat aktivní složky ve směsi s plnidlem, jako je laktóza, pojidlo, jako jsou škroby, lubrikant, jako je talek nebo stearát hořečnatý a také je možné přidat stabilizátor. V měkkých kapslích se aktivní peptidy mohou rozpustit nebo suspendovat ve vhodných kapalinách, jako jsou oleje, kapalný parafin nebo kapalné polyethylenglykoly. Navíc se mohou přidat stabilizátory. Všechny prostředky vhodné pro orální aplikaci by se měly podávat v dávkách vhodných pro zvolený způsob aplikace.
Pro bukální aplikaci může být prostředek ve formě tablet nebo pastilek, které se připravily běžným způsobem.
V případě aplikace inhalací se peptidy podle vynálezu běžně aplikují ve rozprašováním aerosolu z balení se zvýšeným tlakem nebo z atomizéru za použití vhodné hnací látky, jako je například dichlordifluormethan, trichlorfluormethan, dichlortetrafluorethan nebo oxid uhličitý. V případě aerosolu pod uměle zvýšeným tlakem se může jednotková dávka regulovat • · · w · ··· ··· ·· «·· ···· ·» ···« ventilem, který umožní zavedení měřeného množství. Kapsle a patrony například želatinové, které je možné použít v inhalátoru nebo v zařízení pro zavádění plynu nebo prášku do tělních dutin nebo otvorů, se mohou připravit tak, že obsahují směs látky ve formě prášku a vhodné práškové báze, jako je laktóza nebo škrob.
Zde popsané peptidy se mohou připravit tak, aby byly vhodné pro parenterální podání, například jednorázovou injekcí nebo kontinuální infúzí. Prostředky určené pro aplikaci injekcí se mohou vyskytovat ve formě jednotkové dávky, například v ampulích nebo v nádobkách obsahujících více dávek, které mohou také obsahovat konzervační činidlo. Prostředky mohou být suspenze, roztoky nebo emulze v oleji nebo ve vodě a mohou obsahovat další přísady jako je suspendační, stabilizační a/nebo dispergační činidlo.
Farmaceutické prostředky pro parenterální aplikaci zahrnují vodní roztoky aktivního přípravku ve formě, která je ve vodě rozpustná. Navíc suspenze aktivních peptidů se mohou připravit jako vhodné olejové suspenze vhodné pro aplikaci injekcí. Vhodná lipofilní rozpouštědla nebo pojidla zahrnují mastné oleje, jako je sezamový olej nebo syntetické estery mastných kyselin, jako je ethyloleát, triglyceridy nebo liposomy. Vodné suspenze vhodné pro aplikaci injekcí mohou obsahovat látky, které zvyšují viskozitu suspenze, jako je natrium karboxylmethylcelulóza, sorbitol nebo dextran. Suspenze mohou také obsahovat vhodné stabilizátory nebo činidla, která zvyšují rozpustnost peptidů, což umožňuje připravit vysoce koncentrované roztoky.
V jiném případě může být aktivní složka ve formě prášku a před použitím se smíchá s .vhodným nosičem, kterým je například sterilní bezvodý pyrogen.
Peptidy podle vynálezu se mohou také použít pro vytvoření prostředků ch pro aplikaci do rekta, jako jsou čípky nebo retenční klystýr, přičemž se používá například běžný čípkový základ, jako je kakaový olej nebo jiné glyceridy.
Zde popsané farmaceutické prostředky mohou také obsahovat vhodnou pevnou složku gelových nosičů nebo pomocné látky.
Příklady takových nosičů nebo pomocných látek zahrnují bez omezení uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé cukry, škroby, deriváty celulózy, želatinu a polymery, jako jsou polyethylenglykoly.
Pro odborníka je jednoduché stanovit optimální dávky a způsob dávkování libovolného z peptidů podle vynálezu.
V případě libovolného peptidů používaného v souladu s vynálezem je možné terapeuticky účinné množství, což se také definuje jaké terapeuticky účinná dávka, stanovit na začátku na základě testů provedených na buněčných kulturách nebo in vivo na zvířatech. Dávky se mohou například stanovit ve zvířecích modelech tak, aby se dosáhlo rozmezí koncentrace v oběhu, která zahrnuje hodnoty IC50 nebo IC1Oo, jak se určilo v buněčné kultuře. Taková informace se může použít při přesném stanovení dávek použitelných u lidí. Počáteční dávky se mohou také odhadnout z dat získaných in vivo. Podle tohoto počátečního vodítka by odborník mohl stanovit dávku účinnou pro člověka.
Mimo to toxicita a terapeutická účinnost zde popsaných peptidů se může stanovit standardními farmaceutickými postupy v buněčných kulturách nebo na experimentálních zvířatech. Je to možné například provést stanovením hodnoty LD50 a ED50. Poměr dávek způsobující toxický respektive terapeutický účinek je terapeutický index a může se vyjádřit jako poměr mezi LD50 a ED50. Výhodné jsou peptidy, které vykazují vysoké terapeutické indexy. Data získaná z těchto testů na buněčných kulturách a ze studií provedených na zvířatech se mohou použít při vytvoření dávkového rozmezí, které pro člověka není toxické. Dávka takových peptidů se pohybuje s výhodou v rozmezí koncentrací v oběhu, které zahrnují hodnotu ED50 a nevykazují toxicitu nebo jsou pouze slabě toxické. Dávka může kolísat v tomto rozmezí v závislosti na použité dávkové formě a použitém způsobu aplikace. Praktický lékař může zvolit skutečné složení, způsob aplikace a dávku v závislosti na stavu pacienta (popisuje se například v publikaci Fingl et al., 1975, The Pharmacological Basis of Therapeutics, chapter 1, page 1).
• *· φ ·· ·· « » φ ·· φ φ · « · φφφφ φ φφφφ « φφφ I φ φφφ «φφ φφ φφφ φφφφ φφ φφφφ
Dávkové množství a interval aplikace dávky se může stanovit individuálně, aby se zajistilo množství aktivní složky v plazmě, které je dostatečné pro udržení terapeutického účinku. Obvyklé dávky při orální aplikaci jsou v rozmezí přibližně 50 až 2 000 mg/kg při jedné aplikaci, běžně se pohybují přibližně mezi 100 až 1 000 mg/kg při jedné aplikaci, s výhodou jsou přibližně 150 až 700 mg/kg při jedné aplikaci a nejvýhodnější je rozmezí přibližně 250 až 500 mg/kg při jedné aplikaci. V některých případech terapeuticky účinného množství v seru se dosáhne aplikací několika dávek každý den. V případech lokální aplikace nebo selektivního pohlcení účinná lokální koncentrace léku nemusí být vztažena na koncentraci plazmy. Odborník bude schopen optimalizovat terapeuticky účinné lokální dávky bez experimentů.
V závislosti na vážnosti stavu pacienta a jeho odpovědi na léčení se může také provést jediná aplikace prostředku, který pomalu uvolňuje aktivní látku. Průběh léčby pak trvá od několika dní do několika týdnů nebo dokud je léčení účinná nebo se dosahuje zmírnění stádia onemocnění.
Množství aplikovaného prostředku bude samozřejmě záviset na léčeném subjektu, vážnosti strádání, způsobu aplikace, odhadu praktického lékaře atd.. Prostředky podle vynálezu, je-li to nutné, se mohou vyskytovat v balení nebo v dávkovacím zařízení, jako je sada schválená FDA, která může obsahovat jednu nebo více jednotkových dávkových forem, jenž zahrnují aktivní složku.
Balení může například obsahovat kovovou nebo plastovou folii, jako je měkké průhledné balení. Balení nebo dávkovači zařízení může být doprovázeno instrukcemi pro aplikaci. Balení nebo dávkovači zařízení může být doprovázeno poznámkou vládní instituce řídící výrobu, použití nebo prodej léků. Tato poznámka obsahuje povolení formy prostředku nebo použití prostředku při léčení člověka nebo veterinární použití udělené uvedenou agenturou. Taková poznámka může být například označení předepisovaných léků schválených Úřadem pro kontrolu potravin a léků v USA nebo příbalový leták. Prostředky obsahující peptid podle vynálezu spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem může • *· *«· ··«· • · · · · » · ♦ * *4 • ·· · « · · ··· · · » · · 9·· ·· ··· ··»· ·· ···· také být umístěn do vhodné nádoby a je označen jako vhodný pro léčení nebo prevenci daného stavu nebo vyvolání požadovaného účinku. Vhodná poznámka na obalu může zahrnovat léčení a/nebo prevenci autoimunitního onemocnění, virového onemocnění, virové infekce, nedostatku krevních destiček, pancytopenie, nadbytku tuku v krvi, nadbytku cholesterolu v krvi, glukosurie a cukrovky nebo vyvolání krvetvorby, proliferace krvetvorných kmenových buněk, proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk, megakaryocytopoézy, tvorby červených krvinek, tvorby leukocytů a/nebo trombocytopoézy.
Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou použít při udržení a/nebo obnově složek v krevním systému, při uvedení do rovnovážného stavu počtu krevních buněk, při uvedení do rovnovážného stavu množství metabolitů v krvi, které zahrnují cukr, cholesterol, vápník, kyselinu močovou, močovinu a enzymy, jako je alkalická fosfatáza. Dále se farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou použít při vyvolání proliferace krevních buněk, úpravy počtu bílých a/nebo červených krvinek, zvláště při zvýšení počtu bílých a/nebo červených krvinek, zvýšení obsahu hemoglobinu v krvi a úpravě počtu krevních destiček.
Termín „úprava zde použitý ve vztahu k hladině jistých fyziologických parametrů znamená změny hladin uvedených parametrů, přičemž se tyto hladiny přibližují normálním hodnotám.
Termín „normální hodnota zde použitý ve vztahu k jistým fyzioterapeutickým parametrům znamená hodnoty, které jsou v rozmezí hodnot zdravých lidí nebo zvířat.
Ve specificky preferovaných provedeních vynálezu peptidy podle vynálezu uvádějí do rovnováhy počty červených krvinek, bílých krvinek, krevních destiček a množství hemoglobinu. Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou použít při aktivaci proliferace krevních buněk.
Navíc farmaceutické prostředky se mohou použít při léčení a/nebo prevenci poruch krvetvorných kmenových buněk, které zahrnují poruchy krevních destiček, lymfocytů, plazmatických
buněk a neutrofilní poruchy, stejně jako deficienci a funkční poruchu při pre-leukemických nebo leukemických stavech a trombocytopenii.
Dále farmaceutické prostředky se mohou použít při léčení a/nebo prevenci buněčných proliferativních onemocnění. V této souvislosti je nutné poznamenat, že farmaceutické prostředky podle vynálezu jsou výhodné při stimulaci imunitní odezvy během léčby chemoterapií nebo ozářením, při zmírnění negativních účinků, při redukci zvracení vyvolané chemoterapií a radiací a podporují rychlé uzdravení.
Stále další farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou použít při stimulaci lidské imunitní odezvy během léčby onemocnění spojených s imunitní nedostatečností, jako je například HIV a autoimunitní onemocnění.
Prostředky podle vynálezu se mohou použít ve veterinární medicíně.
Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou použít při léčení a/nebo prevenci například poruch zahrnujících abnormální množství krevních buněk, poruch zahrnujících produkci a diferenciaci krvetvorných kmenových buněk, léčení poruch krevních destiček, poruchy lymfocytů a/nebo neutrofilní poruchy, při léčení pre-leukemických a leukemických stavů a při léčení trombocytopenie. Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou také použít při léčení buněčném proliferačním onemocnění a onemocnění zahrnujícím imunitní nedostatečnost, jako je HIV a autoimunitní onemocnění. Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou dále použít při stimulaci imunitní odezvy během léčby chemoterapií nebo ozářením, omezují například zvracení vyvolané chemoterapií.
Vynález dále popisuje anti-bakteriální farmaceutické prostředky obsahující jako aktivní složku alespoň jeden peptid podle vynálezu a použití peptidů podle vynálezu jako antibakteriálních činidel.
Dále vynález popisuje čištěný peptid, který má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvenci SEQ ID NO: 1 až 19.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení autoimunitního onemocnění, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení virového onemocnění, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci virového onemocnění, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro vyvolání krvetvorby, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z
N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro vyvolání megakaryocytopoézy, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro vyvolání erytropoézy, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný • 4-· 9 · · ·♦ » 4 · « 4·· · » · • « · 9 99 9 • 4 · · 4 * · · »· ··· *··» ·· z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro vyvolání leukocytopoézy, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro vyvolání trombocytopoézy, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení trombocytopenie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení pancytopenie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení granulocytopenie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení hyperlipemie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení cholesteremie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení glukosurie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení AIDS, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení infekce HIV, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení stavů spojených s myeloblačními dávkami chemoradioterapie podporované transplantací autologní kostní dřeně nebo transplantací kmenových buněk periferní krve (ASCT) nebo transplantací alogenní kostní dřeně (BMT), který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevence nebo léčby autoimunitního onemocnění.
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevence nebo léčby virového onemocnění.
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevence nebo léčby virové infekce.
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro vyvolání krvetvorby.
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk.
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk.
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro vyvolání megakaryocytopoézy.
• 4
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro erytropoézy.
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro leukocytopoézy.
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro vyvolání trombocytopoézy.
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení trombocytopenie.
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení pancytopenie.
Dále vynález peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení granulocytopenie.
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení hyperlipemie.
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení cholesteremie.
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení glukosurie.
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení cukrovky.
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení AIDS.
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení infekce HIV.
Dále vynález popisuje peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení stavů spojených s myeloblačními dávkami chemoradioterapie podporované transplantací autologní kostní dřeně nebo transplantací kmenových buněk periferní krve (ASCT) nebo transplantací alogenní kostní dřeně (BMT).
• 9 *9 > « • 9
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení autoimunitního onemocnění.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení virového onemocnění.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení virové infekce.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu ctSl pro výrobu léčiva pro vyvolání krvetvorby.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání množení krvetvorných kmenových buněk.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání množení a diferenciace krvetvorných kmenových buněk.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání megakaryocytopoézy.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání erytropoézy.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání leukocytopoézy.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání trombocytopoézy.
Dále vynález popisuje použití peptidu získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení trombocytopenie.
Dále vynález popisuje použití peptidů získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení pancytopenie.
Dále vynález popisuje použití peptidů získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení granulocytopenie.
Dále vynález popisuje použití peptidů získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení hyperlipemie.
Dále vynález popisuje použití peptidů získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení cholesteremie.
Dále vynález popisuje použití peptidů získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení glukosurie.
Dále vynález popisuje použití peptidů získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení cukrovky.
Dále vynález popisuje použití peptidů získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení AIDS.
Dále vynález popisuje použití peptidů získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení infekce HIV.
Dále vynález popisuje použití peptidů získaného z Nterminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení stavů spojených s myeloblačními dávkami chemoradioterapie podporovanými transplantací autologní kostní dřeně nebo kmenových buněk periferní krve (ASCT) nebo transplantací alogenní kostní dřeně (BMT). Dále vynález popisuje použití peptidů pro výrobu léčiva, kde uvedený peptid je fragment získaný štěpením kaseinu aSl.
Dále vynález popisuje použití peptidů pro výrobu léčiva, kde uvedený peptid je syntetický peptid. Dále vynález popisuje * ·
použití peptidu pro výrobu léčiva, kde tento peptid má sekvenci odpovídající jedné ze sekvencí SEQ ID NO: 1 až 19.
Dále vynález popisuje farmaceutický prostředek obsahující čištěný peptid, který má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO: 1 až 19 a farmaceuticky přijatelný nosič.
Tento vynález se úspěšně zaměřuje na problémy v současné době známých provedení tím, že popisuje peptidy vhodné pro léčení lidského onemocnění, které se získaly z N-terminální části kaseinu aSl a které nevykazují detekovatelnou toxicitu, ale vykazují vysokou terapeutickou účinnost.
Další cíle, výhody a nové rysy vynálezu se stanou pro odborníka zřejmé po uvedení následujících příkladů provedení, které nejsou limitující. Navíc každé z různých provedení a hledisek tohoto vynálezu, jak se uvádí shora v textu a jak se nárokuje v části patentové nároky dále v textu, je experimentálně podloženo následujícími příklady.
• »· t ·* ·· • · · φ · · · » · 9 9
99 « · · · · • · · ♦ « · · Φ · · • · · 9 9 9 9 9
999 99 999 9999 99 9999
Přehled obrázků na výkrese
Vynález je zde popsán pouze cestou příkladů vynálezu s odkazem na přiložené obrázky. Specifické odkazy na detaily na obrázcích zdůrazňují, že podrobnosti jsou zobrazeny způsobem příkladu a pouze pro účely názorné diskuse výhodných provedení vynálezu a jsou předkládány způsobem, který se považuje za nejlépe použitelný a snadno srozumitelný popis principů a pojmových hledisek vynálezu. Vzhledem k tomu se neusilovalo o hlubší zobrazení strukturních detailů vynálezu, než je nutné pro základní pochopení vynálezu. Odborníkovi je z popisu podpořeného obrázky zřejmé, jak je možné několik forem vynálezu využít v praxi.
Obrázky č. la až lb zobrazují stimulaci aktivitu přirozených buněk K (NK) v kultivovaných buňkách myší kostní dřeně peptidy získanými z přirozeného kaseinu. Lýze cílových buněk YAC • · • · fcfc · • fc fc o e značených S pomocí kultivovaných buněk myši kostní dřeně inkubovaných v přítomnosti (+) nebo v nepřítomnosti (-)
100 pg/ml peptidů získaných z přirozeného kaseinu se vyjádřila jako část celkové radioaktivity uvolněné z buněk YAC do supernatuntu kultury (procento uvolněného 35S) . Obrázek č. la představuje aktivitu NK v poměru efektor : cílová buňka rovná se 25 : 1.Obrázek č. Ib představuje aktivitu NK v poměru efektor : cílová buňka rovná se 50 : 1.
Obrázek č. 2 znázorňuje stimulaci aktivity přirozených buněk K (NK) v kultivovaných lidských kmenových buňkách periferní krve (PBSC) peptidy získanými z přirozeného kaseinu. Lýze cílových buněk K562 značených 35S pomocí kultivovaných lidských PBSC pocházejících z dárců ošetřených stimulačním faktorem kolonie granulocytů (G-CSF) inkubovaných bez peptidů (0 pg) nebo s rostoucí koncentrací peptidů (25 až 500 pg/ml) získaných z přirozeného kaseinu se vyjádřila jako část celkové aktivity uvolněné z buněk K562 do supernatantu kultury (procento uvolněného 35S). Čtverce znázorňují poměr efektor : cílová buňka rovná se 100 : 1. Trojúhelníky znázorňují poměr efektor : cílová buňky rovná se 50 : 1.
Obrázky 3a až 3b znázorňují stimulaci proliferace přirozených buněk K (NK) a T-lymfocytů (T) z kultivovaných lidských kmenových buněk periferní krve (PBSC) peptidy získanými z přirozeného kaseinu. Proliferace buněk NK a T v kultivovaných PBSC, které pocházejí z dárce ošetřeného faktorem stimulujícím kolonie granulocytů a které se inkubovaly s peptidy nebo bez nich, jenž se získaly z přirozeného kaseinu, se vyjádřila jako procento (%) buněk vázajících se na anti-CD3/FITC fluorescenční protilátku UCHTi proti T buňkám nebo anti-CD56/RPE fluorescenční protilátku MOC-1 proti buňkám NK (DAKO A/S, Dánsko). Jako kontroly slouží FITC a protilátka proti myšímu IgG konjugovaná s RPE. Obrázek č. 3A znázorňuje procento kultivovaných lidských PBSC, které se váží na protilátku CD56 (2 nezávislé vzorky), po 10 dnech inkubace s peptidy v koncentraci 100 μg/ml (CD56 plus a ·· • · · • ·
peptidy) nebo bez peptidů (CD56) . Uvedené peptidy se získaly z kaseinu. Obrázek č. 3b znázorňuje procento kultivovaných buněk PBSC, které se vážou na fluoresecnční anti-CD3 protilátku (buňka T) , anti-CD56 protilátku (buňka NK) a buňky vázající jak CD3 tak CD56 (buňka T a buňky podobné NK) po 28 dnech inkubace s peptidy v koncentraci 100 pg/ml nebo bez nich. Uvedené peptidy se získaly z kaseinu.
Obrázek č. 4 znázorňuje stimulaci aktivity přirozené buňky K (NK) v kultivovaných lidských kmenových buňkách periferní krve (PBSC) peptidy, které se získaly ze syntetického kaseinu. Lýze cílových buněk K562 značených 35S kultivovaným lidským PBSC (pochází z pacientů s karcinomem prsu) inkubované syntetických peptidů získaných z kaseinu (0 pg) nebo se vzrůstající koncentrací uvedených syntetických peptidů (10 až 500 pg/ml) se vyjadřuje jako část celkové radioaktivity uvolněné z buněk K562 do supernatantu kultury (procento uvolnění). Peptidy reprezentují sekvence N-konce 1-8 (8), 1-12(12), 1-22(J),
1-24(L), 1-25(M) a 1-26 (N) prvních aminokyselin N-terminální části kaseinu aSl (sekvence syntetických peptidů se popisují v tabulce č. 3 dále v textu).
Obrázek č. 5a až c znázorňuje stimulaci proliferace kultivovaných lidských buněk odlišného původu peptidy získanými z přirozeného kaseinu. Proliferace kultivovaných lidských buněk po 14 až 21 dnech inkubace se vzrůstajícími koncentracemi peptidů získanými z přirozeného kaseinu se vyjadřuje jako množství [3H]-thymidinu začleněného do vzorku. Obrázek č. 5a znázorňuje začlenění radioaktivního značení do dvou vzorků (PBSC 1, 15 dní inkubace a PBSC 2, 20 dní inkubace) lidských kmenových buněk z periferní krve inkubovaných s peptidy získanými z přirozeného kaseinu v koncentraci 50 až 600 μg/ml (kontrola) nebo bez uvedených peptidů. Obrázek č. 5b znázorňuje začlenění [3H]-thymidinu do kultivovaných buněk lidské kostní dřeně po 21 dnech inkubace s peptidy získanými z přirozeného kaseinu v koncentraci 50 až 600 pg/ml (kontrola) nebo bez uvedených • ·
peptidů. Dárci kostní dřeně byli pacienti s dočasným vymizením projevů zhoubného bujení (BM Auto, BM 1 a BM 2) nebo zdraví dobrovolníci (normální BM). Obrázek č. 5C znázorňuje začlenění [3H]-thymidinu do kultivovaných buněk lidské pupečníkové krve po 14 dnech inkubace s peptidy získanými z přirozeného kaseinu v koncentraci 50 až 1 000 gg/ml (kontrola) nebo bez uvedených peptidů. Buňky pupečníkové krve se získaly od dvou nezávislých dárců (C.B. 1, C.B. 2).
Obrázek č. 6 znázorňuje proliferaci předchůdců krevních buněk z lidské kostní dřeně a pupeční krve jako odezvu na inkubaci peptidů odvozených z přirozeného kaseinu. Relativní počet buněk (x 104) v jednom mililitru odpovídající na proliferaci kultivovaných buněk se stanovil počítáním buněk, jak se popisuje v části příkladů dále v textu. Kostní dřeň ze zdravých dobrovolníků (kostní dřeň) a pupečníkové krev odebraná při normálních porodech (pupečníkové krev) se inkubovaly po dobu 13 dní (pupečníkové krev) nebo 14 dní (kostní dřeň) v přítomnosti růstových faktorů a AB séra s peptidy získanými z přirozeného kaseinu ve vzrůstajících koncentracích 25 až 500 pg/ml nebo bez uvedených peptidů.
Obrázek č. 7 znázorňuje stimulaci obnovy periferních bílých krevních buněk u myeloblačních myší po transplantaci kostní dřeně jako odezvou na aplikaci peptidů získaných z přirozeného kaseinu. Počty buněk znázorňují počet bílých krevních buněk (x 106 v jednom mililitru, k počítání se použil hemocytometr). Myši (skupina obsahovala 10 jedinců) se vystavily subletální dávce radiace a následující den se podrobily transplantaci syngenní kostní dřeně (jedné myši se aplikovalo 106 buněk) a intravenózně se každé myši aplikoval 1 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu (Test: -+-) nebo o den později 1 mg lidského sérového albuminu (Kontrola: -.-).
Obrázek č. 8 znázorňuje stimulaci obnovu krevních destiček u myeloblačních myší po transplantaci kostní dřeně jako odezvu na léčbu peptidy odvozenými z přirozeného kaseinu. Počet krevních
• ·
destiček (PLT) reprezentuje počet trombocytů (x 10b v jednom mililitru/ jak se stanovilo použitím hemocytometru). Myši (skupina obsahovala 60 jedinců) se vystavily letální dávce radiace a v den 1 se podrobily transplantaci syngenní kostní dřeně (jedné myši se aplikovalo 106 buněk) a intravenózně se každé myši aplikoval 1 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu (peptidy: plné čtverce) nebo 1 mg lidského sérového albuminu (HSA: prázdné čtverce).
Obrázek č. 9a až f znázorňuje průchod a pohlcení peptidů získaných z přirozeného kaseinu konjugovaných s FITC do jádra kultivovaných lidských T-lymfocytů, jak se zaznamenalo fluorescenční mikroskopií. Fl a F2 jsou stejné frakce peptidů získaných z přirozeného kaseinu konjugovaných s FITC. Buňky SupΤχ se inkubovaly se 100 gg v jednom mililitru peptidů získaných z přirozeného kaseinu konjugovaných s FITC, jak se popisuje v části příkladů dále v textu. Ve stanoveném čase se z buněk promytím odstranilo volné radioaktivní značení. Buňky se fixovaly ve formalinu a připravily se pro pozorování a záznam laserovým snímáním konfokální mikroskopií. Obrázek č. 9a až 9f zobrazuje vybraná zobrazení buněk z postupných inkubačních časů znázorňující peptidy získané z přirozeného kaseinu konjugované s FITC, jak procházejí membránou buněk Sup-Ti (obrázek č. 9a, 9b) a hromadí se v jádru (Obrázky 9c až 9f) .
Obrázek č. 10 znázorňuje tabulku zobrazující stimulaci proliferace buněk Sup-Τι lymfocytů při odezvě na inkubaci s peptidy získanými z přirozeného kaseinu. Buňky Sup-Ti (5 000 v jedné prohlubni) se inkubovaly se vzrůstajícími koncentracemi peptidů získanými z přirozeného kaseinu (50 až 1 000 gg/ml).
V určitém čase po kultivaci se stanovil jejich počet v prohlubních a vystavily se pulsům s [3H]-thymidinem po dobu 18 hodin. Index proliferace je poměr průměru začlenění [3H]-thymidinu trojice vzorků rozdělených začleněním do buněk kultivovaných bez peptidů získaných z přirozeného kaseinu (kontrola).
• · • to • ·
··· • to · « · · *· ♦♦ • «
Obrázek č. 11 zobrazuje tabulku znázorňující inhibici infekce HIV-1 lymfocytů OEM peptidy získanými z přirozeného kaseinu. Buňky CEM buď přišly do kontaktu s virem HIV-1, který se předem inkuboval po dobu 3 hodin s peptidy odvozenými z přirozeného kaseinu (3 hod), nebo se předem inkubovaly po stanovený počet hodin (24 a 48 hodin) se vzrůstající koncentrací peptidů získaných z přirozeného kaseinu (50 až 1 000 pg/ml) a pak přišly do kontaktu s virem HIV-1, jak se popisuje v sekci příkladů, která následuje dále v textu. Patnáctý den po infekci se stanovil počet buněk a testovala se vážnost infekce HIV-1 testem za použití antigenu P34, jak se popisuje v sekci příkladů dále v textu. Jako kontroly sloužila kultura IF, což jsou buňky CEM, které přišly do kontaktu s virem HIV-1, aniž se předem ošetřily peptidy získanými z přirozeného kaseinu, a UIF, což jsou buňky CEM kultivované za stejných podmínek bez peptidů získaných z přirozeného kaseinu a aniž byly v kontaktu s virem
HIV-1.
Obrázek č. 12 znázorňuje prevenci peptidy získanými z přirozeného kaseinu před diabetes (typ I (IDDM) u samic neobézních diabetických myší. Po dobu pěti týdnů se u myší NOD, kterým se aplikovala jednou nebo dvakrát týdně injekce 100 pg peptidů získaných z přirozeného kaseinu (celkem 5 nebo 10 injekcí) (trojúhelník a čtverec) (neléčené kontroly), sledovala glukosurie v intervalu 230 dní po léčbě. U všech kontrol došlo ke glukosurii a zvířata následně zemřela.
Obrázek č. 13 znázorňuje tabulku zobrazující stimulaci krvetvorby u pacientů trpících karcinomem jako odezvu na injekce peptidů získaných z přirozeného kaseinu. V periferní krvi z pěti pacientů ženského pohlaví trpících karcinomem, kterým se aplikuje nebo se aplikovala chemoterapie, jak se popisuje shora v textu se stanovil celkový počet bílých krvinek (WBC, χ 103) , krevních destiček (PLT, χ 103) , erytrocytů (RBC, x 103) hemoglobinu (vyjádřeno v gramech na decilitr) před (n) a po (n+.....) injekcích s peptidy získanými z přirozeného kaseinu aplikovaných do svalu, jak se popisuje shora v textu. Pacient 1
* ·· * 99 99 99
·· · • • 9 9 9 9 ♦ 9
• • 9 • 9 9 9 9
• 9 9 9 • • 9 • « 9
• 9 • 9 • • 9 9
9 9 9 • 9 • 9 9 9 9 9
41a je ve vztahu s G.T., pacient 2 je ve vztahu s E.C., pacient 3 je ve vztahu s E.S., pacient 4 je ve vztahu s J.R. a pacient 5 je ve vztahu s D.M..
• 4 · •· · 4 ·· • * 4 ·· · • 4 · · · · « 44444 4 · · • · · · · • 4 · «44··
Obrázek č. 14 znázorňuje stimulaci trombocytopoézy pomocí peptidů získaných z přirozeného kaseinu u pacienta trpícího rezistencí na krevní destičky při akutní myeloidní leukémii (M -1). Obnova trombocytů se vyjádřila jako změna obsahu krevních destiček v periferní krvi (PLA, χ 106 v jednom mililitru). Výpočet se provedl stejným způsobem uvedeným shora v textu v označených intervalech po injekci obsahující 100 μς peptidů získaných z kaseinu zavedené do svalu (jak se popisuje v části příkladů dále v textu).
Obrázek č. 15 znázorňuje stimulaci trombocytopoézy pomocí peptidů získaných z přirozeného kaseinu u pacienta trpícího rezistencí na krevní destičky při akutní myeloidní leukémii (M -2). Obnova trombocytů se vyjádřila jako změna obsahu krevních destiček v periferní krvi (PLA, χ 106 v jednom mililitru). Výpočet se provedl stejným způsobem uvedeným shora v textu v označených intervalech po injekci obsahující 100 pg peptidů získaných z kaseinu zavedené do svalu (jak se popisuje v části příkladů dále v textu).
Příklady provedení vynálezu
Nyní se provede odvolání na následující příklady, které spolu s popisem uvedeným shora v textu bez omezení objasňují vynález.
Příklad 1: Materiály a experimentální metody
Příprava peptidů získaných z přirozeného kaseinu
Frakce kaseinu z kravského mléka se izolovala způsobem popsaným v publikaci N. J. Hipp, et al. (1952), Dairy Sci., 35:272 a podrobila se vyčerpávajícímu proteolytickému štěpení chymosinem (také znám jako renin) v koncentraci 20 ng v jednom mililitru a při teplotě 30 °C. Po dokončení reakce se roztok zahřál, aby se deaktivoval enzym, a produkt štěpení se srážel jako parakaseinát okyselením organickou kyselinou, V tomto « ·· ·» ·· ·· ·· » · ·· * · ··· « ·« · · · · » ···· · ···· · • · · 9 9 9 9 9
999 99 999 9999 99 t»M případě se může použít kyselina octová nebo trichloroctová. Parakaseinát se oddělil centrifugací a frakce supernatantu obsahující peptidové fragmenty se znovu srážela jako kaseicidin vyššími koncentracemi kyselin. Výsledný kaseicidin po opětném vytvoření suspenze, dialýze a neutralizaci se lyofilizoval. U výsledného prášku se testovala jeho biologická aktivita, jak se popisuje dále v textu, a oddělila se pomocí HPLC a provedla se analýza peptidů.
Analýza HPLC peptidů získaných z přirozeného kaseinu
Peptidy získané z přirozeného kaseinu, jak se popisuje shora v textu, se analyzovaly pomocí HPLC ve dvou stádiích. Nejdříve se lyofilizované produkty štěpení kaseinu oddělily na koloně C18 s reverzní fází s gradientem 0,1% (hmotnost/hmotnost) vodná kyselina trifluoroctová-acetonitril. K detekci došlo podle absorpce UV záření při vlnové délce 214 nm. Pak se vzorky analyzovaly pomocí HPLC-hmotnostní spektroskopie (MS), přičemž uvedené zařízení obsahuje elektrický vstřikovací zdroj. Výpočty hmotností reprezentují hmotnost ionizovaných vzorků peptidů, jak se odvodilo z retenčních časů. Po oddělení se pomocí mikrosekvenátoru s plynou fází (Applied Biosystems 470A) stanovilo složení aminokyselin peptidů.
Následující data jsou charakteristická: V typickém případě se pozorovalo osm peptidových píků, z nichž tři byly hlavní píky, které mají hodnoty Rt 17,79, 19,7, 23,02 a pět jich bylo minoritních s hodnotami Rt 12,68, 14,96, 16,50, 21,9 a 25,1. Hodnoty Rt reprezentují molekulovou hmotnost 2 764, 1697, 1 880,
616, 3 217, 2 333, 1 677 a 1 669 daltonů. Při hodnotě Rt 17,79 (odpovídající molekulové hmotnosti 2 764 daltonů ) hlavní pík peptidu obsahující 23 aminokyselin reprezentující aminokyseliny 1 až 23 kaseinu aSl má sekvenci RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRF (SEQ ID NO: 16, úplná sekvence kaseinu aSl se popisuje v publikaci McSweeny et al., 1993, ibidem) Jiné peptidy byly peptidy kaseinu β v polohách 208 až 224, kaseinu aSl v polohách 16 až 37 a peptid kaseinového prekurzoru podobnému kaseinu aS2 v polohách
197 až 222. Přítomny byly také jiné peptidy.
Peptidy získané ze syntetického kaseinu
Firma NoVetide Ltd., (Haifa, Izrael) syntetizovala peptidy s prodlouženou délkou odpovídající aminokyselinám 8 až 26 Nkonce kaseinu aSl. Čistota peptidů stanovená HPLC byla vyšší než 95 %. Kontrola kvality zahrnovala HPLC, hmotovou spektrometrii (El), analýzu aminokyselin a obsah peptidů. Tabulka č. 3 zahrnuje sekvence uvedených peptidů.
Tabulka č. 3
identifikace sekvence (N konec-C konec) číslo aminokyselin SEQ ID NO
Y RPKHPKH 8 1
X RPKHPIKHQ 9 2
1A RPKHPIKHQG 10 3
2A RPKHPKHQGL 11 4
3A RPKHPIKHQGLP 12 5
A RPKHPKHQGLPQ 13 6
B RPKHPKH QGI.PQE 14 7
C RPKHPEKHQGLPQEV 15 8
D RPKHPIKHQGLPQEVL 16 9
E RPKHPIKHOGLPQEVLN 17 10
F RPKHPKHQGLPQEVLNE 18 11
G RPKHPKHQGLPQEVLNEN 19 12
H RPKHPIKHQGLPQEVLNENL 20 13
I RPKHPIKHQGLPQEVLNENLL 21 14
J RPKHPKHQGLPQEVLNENLLR 22 15
K RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRF 23 16
L RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFF 24 17
M RPKHPKHQGLPQEVLNENLLREFV 25 18
N rpkhpikhqglpqevlnenllrffva 26 19
Juvenilní diabtes (typ I, IDDM) u neobezních diabetických myší (NOD)
Myši NOD jsou běžně používaný model pro výzkum autoimunitního onemocnění a juvenilní diabetes u člověka. Šest týdnů starým samicím myší NOD se aplikovala jednou týdně jedna nebo dvě injekce obsahující 100 μg peptidů získaných z přirozeného kaseinu do doby, kdy se dosáhlo 5 nebo 10 ošetření. Kontrolním myším se neaplikovala žádná léčba. Vážnost onemocnění se stanovila vzhledem k glukosurii, která se měřila použitím testovacích papírků Combi (popisuje se v publikaci Gross, D.J. et al. (1994), Diabetology, 37: 1195). Výsledky se vyjádřily jako procento myší v každém vzorku, které netrpí glukosurii, po dobu 230 dní.
Příklad 2: Stimulace proliferace přirozených buněk K (NK)
Z lidských kmenových buněk periferní krve (PBSC)
PBSC pocházející ze subjektů léčených G-CSF se oddělily na gradientu sloučeniny FICOLL, dvakrát se promyly kultivačním médiem RPMI-1640 a nanesly se do prohlubní o objemu 1,5 ml spolu s peptidy, které se získaly z přirozeného nebo syntetického kaseinu (koncentrace peptidů je 0 až 500 pg/ml), nebo se peptidy nepřidávaly. Po dvou dnech inkubace se u buněk testovala přirozená smrtící aktivita měřením radioaktivity uvolněné z cílových buněk K562 značených 35S (NEG-709A, 185,00 MBq, 2,00 mCi EASYTAGth metionin, L-[35S] 43, 48 Tbq/mmol, 1 175,0 Ci/mmol, 0,488 ml, Boston USA). Dvě koncentrace efektorových buněk (2,5 x 105 a 5 χ 105 buněk v prohlubni) se inkubovalo s 5 χ 103 cílových buněk v jedné prohlubni (poměry efektor:cílové buňky je 50:1 respektive 100:1) na tkáňových kultivačních destičkách s 96 prohlubněmi s dnem ve tvaru U. Buňky se inkubovaly po dobu 5 hodin při teplotě 37 °C v atmosféře 5% CO2, 95% vzduchu po dobu 5. Sraženina se separovala centrifugací při 1 000 ot./min. po • ·· · · · · · . . . . · ···· · • · · ·· ··· ··· ·· ··· ···· ·· ···· dobu 5 minut. V kapalném supernatantu vzorku o objemu 50 μΐ se měřilo uvolněné 35S.
Z buněk myší kostní dřeně (BM)
Kostní dřeň se získala z dlouhých kostí přední a zadní končetiny neošetřených myší BALB/c a C57B1/6 pomocí injekce média za použití jehly 25 gauge. Odsáté buňky se promyly kultivačním médiem RPMI 1640, hemocytometrem se určil jejich počet a barvením se určil počet živých buněk (20 μΐ buněk do 380 μΐ kyselina octová/trypanová modř) , buňky se vnesly do kultivačních lahví v koncentraci 2 až 5 χ 106 buněk v jednom mililitru kultivačního média RPMI-1640, které obsahuje 10% fetální telecí sérum, antibiotika a glutamin s peptidy získanými z přirozeného kaseinu v koncentraci 100 pg/ml nebo peptidy nejsou obsaženy. Buněčná kultura se inkubovala v atmosféře 5%
CO2, 95% vzduchu po dobu 12 až 15 dní při teplotě 37 °C. Buňky se shromáždily centrifugací při 1 500 ot./min. po dobu 10 minut, stanovil se jejich počet a buňky se vnesly do prohlubní se dnem ve tvaru U, které obsahují buňky myšího lymfomu (YAC) značené 51Cr (chrom-51, 740 MBq, 2,00 mCi) nebo 35S ( (NEG-709A, 185,00 MBq, 2,00 mCi EASYTAGth metionin, L-[35S] 43, 48 Tbq/mmol, 1 175,0 Ci/mmol, 0,488 ml, Boston USA) v poměru efektor:cílová buňky 25:1 nebo 50:1. Aktivita NK se exprimovala jako procento radioaktivity v supematantech bez buněk.
Proliferace lidských buněk v kultuře
Periferní krev se získala ze zdravých nebo nemocí postižených pacientů. Postižení pacienti se neléčily před plazmaferézou jiným způsobem než aplikací G-CSF. Buňky kostní dřeně (BM) se získaly ze zdravých dobrovolníků nebo od nemocných pacientů ve stádiu remise, která následuje po chemoterapii, odsátím. Pupečníková krev se shromáždila během normálního porodu. Lidské buňky různého původu se oddělily pomocí gradientu sloučeniny • 44 4 4 4 ·« ···· 4 ···· ·
4»· 44 · · · •44 ·· 444 4444 ·* 4444
FICOLL, dvakrát se promyty kultivačním médiem RPMI-1640 a vnesly se do prohlubních s rovným dnem na destičky určené pro tkáňové kultury v udaných koncentracích spolu s peptidy získanými z přirozeného nebo syntetického kaseinu nebo bez nich. Vše, včetně kontrol, se provedlo ve třech provedeních. Proliferace buněk se stanovila začleněním 3HT: přidal se radioaktivní thymidin (thymidin (methyl-[3H]) , specifická aktivita 65 Ci/ml, 37 MBq/ml, ICN Corp.), pak následovala inkubace po uvedený počet dní. Buňky se inkubovaly se značením 16 až 20 hodin, shromáždily se a promyly se kultivačním médiem. Začleněná radioaktivita se měřila β-scintilačním počítačem.
Proliferace leukémie K562 a buněčná linie karcinomu tlustého střeva
Buňky Colon a K562 jsou zavedené buněčné linie rakovinových buněk, které rostou v kultuře. Obě buněčné linie se kultivovaly v kultivačních nádobách v atmosféře 5% CO2, 95% vzduchu při teplotě 37 °C, shromáždily se a promyly se kultivačním médiem, pak se vnesly do prohlubní vhodných pro tkáňové kultury v koncentraci 4 χ 105 buněk (K562) nebo 3 χ 103 buněk (Colon) do jedné prohlubně. Do prohlubní se přidaly peptidy získané z přirozeného kaseinu v uvedených koncentracích po 9 (buňky K562) nebo 3 (buňky Colon) dnech inkubace se přidal značený thymidin, jak se popisuje shora v textu. Shromáždění buněk a měření začleněné radioaktivity se provedlo způsobem popsaným shora v textu.
Fluorescenční protilátková detekce proliferece přirozených buněk K a T v lidských kmenových buňkách periferní krve (PBSC)
Kmenové buňky periferní krve (PBSC) pocházející z lidských subjektů, kterým se aplikovala léčba G-CSF, se shromáždily plazmaferézou, separovaly se gradientem sloučeniny FICOLL, dvakrát se promyly kultivačním médiem RPMI-1640, které obsahuje 10% fekální telecí sérum a vše se inkubovalo při teplotě 37 °C v atmosféře 5% CO2, 95% vzduch s peptidy získanými z přirozeného
* ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · kaseinu v uvedených koncentracích nebo bez nich. Po 10, 14 nebo 28 dnech inkubace s peptidy získanými z přirozeného kaseinu se přítomnost buněk T (povrchový antigen CD3) a přirozených buněk K (povrchový antigen CD56) stanovila přímou imunofluorescencí za použití fluorescenčních protilátek proti antigenu CD3 (CD3/FITC klon UHCTi) , fluorescenční protilátky proti CD56 (CD56/RPE klon MOC-1) (DAKO A/S, Dánsko) a jako kontrola sloužily myší protilátky IgGl/RPE a IgGl/FITC. Detekce fluorescenčně značených buněk se provedla selekcí fluorescenčně aktivních buněk (FACS).
Příklad 3: Stimulace krvetvorby z buněk kostní dřeně (BM) v kultuře
Proliferace megakaryocytů za vzniku multipotencionálních kolonií (CFU-GEMM) z myších buněk kostní dřeně
Primární buňky kostní dřeně(v koncentraci 1 x 105 buněk/ml) pocházející z 8 až 12 týdnů starých myší C3H/HeJ se kultivovaly v kultivačním médiu IMDM s methylcelulózou bez séra v atmosféře 5% C02, 95% vzduchu při teplotě 37 °C po dobu 8 až 9 dní. Kultivační médium vhodné pro kultivaci multipotencionálních kolonií (CFU-GEMM) obsahovalo 1% BSA (Sigma), 104 M thioglycerol (Sigma), 2,8 x 10“4 M transferin (TF, Biological Industries, Izrael), 10% WEHI-CM jako zdroj IL-3 a 2 U/ml erytropoetinu (rhEPO, R &D Systems, Minneapolis). Kolonie se hodnotily po 8 až 9 dnech za použití mikroskopu s tmavým polem Olympus. Kolonie se izolovaly mikropipetou, centrifugovaly se na cytocentrifuze a obarvily se metodou podle May-Grunwald-Giemsa za účelem stanovení počtu diferenciovaných buněk. V každém přípravku se stanovilo nejméně 700 buněk.
Proliferace buněk tvořících megakaryocyty a erytroidy z buněk lidské kostní dřeně a pupečníkové krve
Vzorek kostní dřeně pocházející ze zjevně zdravého člověka se oddělil hustotním gradientem použitím Histopaque-107 (Sigma • · · • · * « · α · • ·9999
9 9
9
Diagnostice), přičemž se získala čistá populace jednojaderných buněk (MNC). Testy kolonií se provedly v kultivačním mediu naneseném na plotny obsahujícím methylcelulózu v konečné koncentraci 0,92 % (4 000 centripase prášek, Sigma Diagnostic), opětně se hydratovaly v Dulbeccově médiu upraveném podle Iscova obsahujícím 36 mM uhličitan sodný (Gibco), 30% fetální telecí sérum (FBS) (Hyclone), 0,292 mg/ml glutaminu, 100 U/ml penicilinu a 0,01 mg/ml streptomycinu (Biological Industries, Beit Haemek). Při normálním porodu se shromáždila pupečníková krev a upravila se způsobem popsaným shora v textu.
Kultivační médium obsahující 10s MNC v jednom mililitru o objemu 0,33 ml se naneslo do prohlubní v trojnásobném provedení na tkáňové kultivační destičky s 24 prohlubněmi (Greiner). Kultury se inkubovaly při teplotě 37 °C v atmosféře 5% CO2, 95% vzduchu a 55% relativní vlhkosti s peptidy získanými z přirozeného kaseinu nebo syntetického kaseinu v uvedené koncentraci nebo bez nich. Na destičkách se po 14-ti dnech odečetly kolonie obsahující více než 50 buněk. Megakaryocyty se identifikovaly přímou imunofluorescencí za použití vysoce specifických králičích protilátek, které rozeznávají glykoproteiny lidských krevních destiček a kozí anti-králičí IgG konjugované s FITC. Přidané růstové faktory zahrnovaly 15 ng/ml leukomaxu (GM-CSF) (Sandoz Pharma) a 5% (objem/objem) médium (CM) upravené lidským fytohemaglutininem-m (Difco Lab), aby se vyvolal vývoj kolonií granulocyty-monocyty (CFU-GM).
Erytropoetin (EPO) 2 U/ml se použily k vyvolání tvorby erytroidových kolonií.
V jiném případě buňky lidské kostní dřeně pocházející z dobrovolných dárců nebo pacientů, kteří prodělali transplantaci autologní kostní dřeně se předem kultivovaly v kultivačním médiu obsahujícím 10 až 1 000 pg/ml peptidů získaných z přirozeného kaseinu. Buňky se kultivovaly na semipevném agaru a stanovil se počet granulocytových makrofágových krvetvorných koloní (GM-CFU) 7 nebo 14 dní po léčbě.
44
4 4
44
4 • 9
Megakaryocytopoéza se stanovovila u normálních buněk kostní dřeně, které pocházejí z dobrovolných lidských dárců, stanovením počtu megakaryocytů ve vzorcích kapalné kultury (RPMI-1640 plus 10 % lidské sérum AB, glutamin a antibiotika) s peptidy získanými s přirozeného kaseinu v koncentraci 100 pg/ml nebo se odhadla tvorba kolonií v methylcelulózovém testu. Inokulovalo se 2 x 105 buněk kostní dřeně v přítomnosti standardního růstového faktoru s peptidy získanými z přirozeného kaseinu nebo bez těchto peptidů. Megakaryocyty v methylcelulózovém testu se počítaly použitím inverzního mikroskopu 10 až 14 dní po inokulaci.
Klinické studie použití peptidů získaných z přirozeného kaseinu
V jedné sérii studií se jediná dávka obsahující 50 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu se aplikovala do svalu lidských subjektů ve 3 uloženích v období 2 hodin. Klinické parametry se zaznamenávaly v uvedených intervalech. Při jiných studiích se pacientům v různých fázích léčby a/nebo ve stádiu remise onemocnění zhoubným bujením a metastatickým onemocněním jednou nebo dvakrát aplikovaly peptidy získané z přirozeného kaseinu a zaznamenávaly se změny v počtu buněk periferní krve.
Příklad 4: Inhibice in vitro infekce lidských lymfocytů virem
HIV
Peptidy
Peptidy (buď peptidy získané z přirozeného kaseinu nebo syntetické peptidy (v délce 8 až 26 aminokyselin, popisuje se v tabulce 3, získané z kaseinu) ve formě lyofilizovaného prášku se resuspendovaly v úplném kultivačním médiu RPMI a přidaly se do buněčných kultur v konečné koncentraci 50 až 1 000 pg/ml.
Buňky
Je známo, že několik typů čerstvě izolovaných lidských buněk (primární buňky) a buněčných linií je náchylných k in
9
9 9 ··
9· 9999 vitro infekci HIV-1, ačkoli v podstatě libovolná buňka vykazující dokonce nízká povrchová množství molekuly CD4 se může považovat za potencionální cíl in vitro infekce HIV-1. Vybraly se dvě běžně používané lidské buněčné linie, které jsou vysoce citlivé vůči infekci HIV-1. Jsou to CEM a Sup-Tl.
CEM je lidská T4-lymfoblastová buněčná linie z počátku získaná z periferní krve čtyři roky staré čtyřleté dívky trpící akutní lymfoblastová leukémií (popisuje se v publikaci G.E.
Foley et al. (1965), Cancer 18: 522). Tyto buňky se nepřetržitě udržovaly v suspenzi v kultivačním médiu a užívají se při analýze infekčnosti, antivirových činidel a neutralizačních protilátek.
Sup-Tl je lidská T-lymfoblastová buněčná linie izolovaná z pleurálního průsaku osmiletého chlapce trpícího T-buněčným lymfomem, který není lymfom Hodgkinsova typu (Smith, S.D. et al. (1984) Cancer Research 44: 5657). Tato buňka exprimuje vysoké množství povrchového CD4 a je možné ji použít při studiu buněčných fúzí, cytopatického účinku a infekčnosti HIV-1. Buňky Sup-Tl se kultivují v suspenzi v obohaceném médiu.
Kultivační médium
Buňky se kultivovaly v úplném kultivačním médiu RPMI-1640 obohaceném 10% fetálním bovinním sérem, 2 mM glutaminem a 2 mM antibiotiky penicilin-streptomycin (GIBCO).
Virus
Použitý virus HIV je HIV-1IIIB, který se původně označoval jako HTLV-IIIB. Pro dosažení permanentní produktivní infekce v buňkách H-9 se použily koncentrované tekutiny kultur periferní krve z několika pacientů trpících AIDS nebo příbuzných onemocnění. Tento subtyp B viru vykazuje vysokou kapacitu replikace v lidské linii T-buněk. Virový titr v zásobní kultuře je 5,38 ng/ml.
Peptidy značené FITC • ♦ · 9
999 99 ·« 9
9 9 9 9
99 99
9
9 ·· 99
9 9
9 9
9 9
9 9
9999
Použil se FITC F-1300 (isomer I fluorescin izotiokyanátu, Sigma (F25o-2), st. Louis, Mi, USA) vykazující maximum emise/ekcitace při vlnové délce 494 respektive 520 nm. Derivát fluoresceinu, který reaguje s aminem, je pravděpodobně nejběžnější fluorescenční derivatizační činidlo vhodné pro kovalentní značení proteinů. Peptidy konjugované s FITC získané z přirozeného kaseinu se připravily kovalentní vazbou FITC na aminoskupiny lyzinu.
Test záchytu antigenu HIV-1 P24
Použitá testovací sada záchytu antigenu HIV-1 P24 se navrhla pro kvantifikaci jaderného antigenu HIV-1 P24, který je přímo úměrný stupni produkce viru v buňkách. Tato sada se získala z vakcinačního programu AIDS z instituce SAIC-NCI-Frederick Cancer Research Institute, P.O. Box B, Frederick, M.D 21702, USA a zahrnuje destičky s 96 prohlubněmi potaženými monoklonální protilátkou proti HIV-1 P24, primární protilátka je králičí anti-HIV P24 sérum, sekundární protilátka je kozí protilátka proti králičímu IgG (H+L) konjugovaná peroxidázou, TMB peroxidázový substrátový systém a lyžovaný standard HIV-1 P24. Test záchytu antigenu HIV-1 P24 se analyzoval čtecím zařízením pro test ELISA Organon-Technica při vlnové délce 450 nm s odkazem na vlnovou délku 650 nm.
Test ELISA záchytu antigenu HIV-1 P24
Infekce HIV se měřila nepřímým enzymatickým imunologickým testem, který detekuje jaderné antigeny HIV-1 P24 v kultivačním médiu tkáňové kultury. Supernatant tkáňové kultury reagoval s primárním králičím anti-HIV-1 P24 antigenem a zviditelnil se kozí anti-králičím IgG konjugovaným s peroxidázou. Reakce se ukončila přidáním 4N kyseliny sírové, kde intenzita barvy, která se vyvinula, je úměrná množství antigenu HIV-1 přítomném v supernatantu tkáňové kultury.
M · 0·· ·0 ·· ·«»·
Laboratoř vhodná pro práci s vysokým stupněm biologického rizika (BL-3)
Produkce, Izolace a infekce viru, tkáňové kultury buněk infikovaných HIV-1, shromážděni supernatantu antigenů P24 a ELISA záchytu antigenů P24 se provedly v zařízení BL-3 v instituci Hebrew University, Hadassah Medical School, které vyhovuje praxi biologické bezpečnosti dané institucemi NIH a CDC (USA).
Průtoková cytometrie
Třídící zařízení buněk FACSort (Becton & Dickinson, San Jose, CA. USA) se použilo v případě i) stanovení procenta buněk CEM a Sup-Tl pozitivních na antigen CD4 před infekcí HIV-1 za účelem zajistit stejný stupeň infekce v každém experimentu a ii) detekce T buněk, které nesou ve své cytoplazmě a jádru peptidy konjugované s FITC z přirozeného kaseinu.
Inkubátor s atmosférou CO2
V případě buněk produkujících virovou kulturu s HIV-1 se buňky a virus předem ošetřený peptidy získanými z přirozeného kaseinu a buňky, které se dále inkubovaly s HIV-1, se udržovaly v inkubátoru s atmosférou C02 po dobu trvání experimentu.
HIV infekce lidských kultivovaných buněk CD4+
Buňky (CEM, Sup-1) se předem inkubovaly s několika zvyšujícími se koncentracemi peptidů získaných z přirozeného kaseinu (50 až 1 000 pg/ml) nebo syntetických peptidů získaných z kaseinu (10 až 500 pg/ml) po dobu 3, 24 (v případě syntetických a přirozených peptidů) a 48 hodin (pouze v případě přirozených peptidů) a po kultivaci se do každé prohlubně přidal HIV-1IIIB (v konečné koncentraci 45 pg/ml). HIV-1IIIB se předem inkuboval s peptidy po dobu 3 hodin a pak se přidal k buňkám (5 000 buněk do jedné prohlubně) na destičkách vhodných pro tkáňové kultury. Kontroly byly IF (infikované, buňky kultivované s HIV-1
a bez peptidů), UIF (neinfikované, buňky kultivované bez HIV-1 a bez peptidů) a UIF+Ch (neinfikované + peptidy získané z přirozeného kaseinu, buňky kultivované v přítomnosti peptidů se získaly z přirozeného kaseinu [50 až 1 000 pg/ml]) a použila se k testování účinku peptidů získaných z přirozeného kaseinu a syntetických peptidů získaných z kaseinu na schopnost buněk přežít a na jejich růst. U buněk se hodnotila schopnost přežít a rychlost proliferace v den 7, 10 a 14 po infekci (den shromáždění supernatantu s kultury s antigenem P24. Buňky a supernatanty tkáňových kultur (kultivační médium) se shromáždily a lyžovaly bezprostředně v 1/10 objemu 10% Tritonu X-100. Tyto vzorky se dále inkubovaly při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny a udržovaly se při teplotě -80 °C až do okamžiku testování antigenu P24.
Konfokální mikroskopie
Konfokální systém laserového snímání Zeiss LSM 410 připojený k inverznímu mikroskopu TW Zeiss Axiovert 135M používající laserový snímací konfokální mikroskopický postup se použil k detekci vstupu peptidů konjugovaných s FITC do buněk. T buňky se inkubovaly s peptidy konjugovanými s FITC získanými z přirozeného kaseinu v inkubátoru s atmosférou 5% C02, 95% vzduchu při teplotě 37 °C. Po inkubaci se buňky promyly třikrát fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem (PBS), aby se odstranily nevázané peptidy konjugované s FITC. Buňky se fixovaly s 3,8% formalinem po dobu 10 minut, dvakrát se promyly PBS a před mikroskopickým pozorování se buňky resuspendovaly v 50 až 100 μΐ PBS. Vybraná zobrazení buněk z různých časových bodů inkubace (15 minut, 30 minut, jedna hodina, 1,5 hodiny a 3 hodiny) vykazují různá množství peptidů konjugovaných s FITC získaných z přirozeného kaseinu v jejich cytoplazmě a v jádru se uložila na 3,5 palcovou disketu v ve formátu Zip (230 MB) a obrázky se zpracovaly použitím softwaru Photoshop.
Test začlenění [3H]-thymidinu
Za účelem testovat účinek peptidů získaných z přirozeného kaseinu na proliferaci T buněk, několik koncentrací peptidů získaných z přirozeného kaseinu (10 mg/ml zásobního roztoku v kultivačním médiu RPMI) se přidalo do kultur buněk Sup-Tl na destičce s 96 mikroprohlubněmi s plochým dnem (5 000 buněk v jedné prohlubni), jak se popisuje v případě infekce HIV-1 v buňkách Sup-Tl. Určil se počet buněk a jejich životnost se stanovila exkluzí barviva trypanové modře. Buňky se vystavily pulzům s [3H]-thymidin v každém časovém bodě (3, 7, 10 a 14 dní) po dobu 18 hodin (přes noc) a shromáždily se na filtrech se skleněnými vlákny za účelem zaznamenání radioaktivity (začlenění [3H]-thymidinu do buněčné DNA je úměrné stupni buněčné proliferace).
Toxicita peptidů získaných z přirozeného kaseinu u normálních, myeloblačních myší a morčat, které jsou příjemci transplantátu
Normálním zvířatům se aplikovalo intravenózní nebo intramuskulární injekcí v jedné nebo ve třech dávkách až 5 000 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu na jeden kilogram hmotnosti zvířete. Použila se řada kmenů myší, které zahrnují myši BALB/c, C3H/HeJ a neobézní diabetické myši (NOD). Myši se sledovaly 10 měsíců před usmrcením a provedl se test po jejich smrti (test toxicity) nebo se sledovaly po dobu 200 dní (míra přežití) . Morčatům se aplikovalo jediná intramuskulární injekce s 20 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu na jedno zvíře.
O 15 dní později se zvířata usmrtila a zjišťovaly se změny v těle.
Obnova leukocytů a krevních destiček u myší, které jsou příjemci transplantátu kostní dřeně
Myši BALB/c se vystavily subletálnímu záření ze zdroje vzdáleného od kůže 70 cm, dávka je 50 cGy/minutu při celkové dávce 600 cGy. Ozářeným myším se transplantovala syngenní kostní dřeň, jak se popisuje shora v textu. O 24 hodin později se • · • ·· · · ♦ · · ···· · ···· · • · · ·· ··· ··· ·· ······· · * ···· zavedl intravenózní injekcí 1 mg (na jedno zvíře) peptidů získaných z přirozeného kaseinu, syntetických peptidů získaných z kaseinu (13 až 26 aminokyselin, popisuje se v tabulce č. 13 shora v textu) nebo lidského sérového albuminu (slouží jako kontrola) při dvojitém slepém pokusu. Obnova leukocytů se stanovila podle počtu buněk v periferní krvi shromážděné v uvedených časových intervalech od 6 do 12 dní po léčbě. Obnova krevních destiček se stanovila počtem buněk v krvi shromážděné z retroorbitálního plexusu do heparizovaných kapilár v uvedených intervalech od 6 do 15 dní po léčbě.
V dalších sériích experimentů se myši CBA letálně ozářily (900 cGy) a ošetřily se peptidy získanými z přirozeného kaseinu nebo lidského sérového albuminu, jak se popisuje shora v textu. Obnova krevních destiček se testovala způsobem uvedeným shora v textu.
Rekonstituce myší, které jsou příjemci transplantátu kostní dřeně
Myši C57/B1/6 se letálně ozářily ze zdroje vzdáleného od kůže 70 cm. Dávka záření byla 50 cGy za minutu. Celková dávka byla 900 cGy. Ozářeným myším se provedla transplantace kostní dřeně z myší, které se ošetřily před shromážděním kostní dřeně 1 mg (na jedno zvíře) peptidů získaných z přirozeného kaseinu nebo fyziologickým roztokem. Následuje dvojitý slepý protokol.
V jednom experimentu se myší, které přežily sledovaly po 18 dní.
V jiném experimentu se myši usmrtily po 10 dnech a sledovala se kolonizace sleziny.
Příklad 5: Výsledky experimentů
Peptidy získané z přirozeného kaseinu
Na základě pozorování, že sražené mléko nahodile inhibuje bakteriální růst se izoloval z mléčných proteinů fragment kaseinu, který má baktericidní vlastnosti (popisuje se v patentovém dokumentu USA č. 3 764 670, Katzirkatchalsky, et ···· ···'»· '4 • « ···· · ··«··· · • · · ····«·
9· · *»· ·« ·β ·♦·· al.). Surové peptidy získané proteolýzou přirozeného kaseinu se připravily kyselým srážením rozpustné frakce produktu protelytického štěpení kaseinu, dialýzou a lyofilizací. Když se provedly testy biologické aktivity po dlouhodobém skladování, zaznamenalo se, že tento surový přípravek, když se lyofilizoval a uchovával při teplotě 4 °C, zůstal aktivní (in vitro a in vivo) po dobu alespoň 12 měsíců.
Za účelem identifikovat aktivní peptidy obsažené v peptidech získaných z přirozeného kaseinu se lyofilizovaný surový přípravek rozdělil na frakce za použití vysoce výkonné kapalinové chromatografie (HPLC), jak se popisuje shora v textu. Všechny z lyofilizovaných analyzovaných vzorků vykazovaly podobné retenční časové profily v souladu s informacemi uvedenými shora v textu.
Pak hlavní složka surových peptidů získaný z přirozeného kaseinového přípravku je N-terminální fragment kaseinu aSl.
Peptidy získané z přirozeného kaseinu nejsou pro hlodavce ani člověka toxické
Rozsáhlé zkoumání krátkodobých a dlouhodobých účinků vysokých dávek peptidů získaných z přirozeného kaseinu u myší, morčat a člověka potvrdilo, že přípravky nevykazují toxicitu, teratogenicitu nebo nežádoucí vedlejší účinky. V jedné sérii testů jediná dávka reprezentující 1 750 a 12 500 násobek odhadnuté účinné dávky peptidů získaných z přirozeného kaseinu se aplikovala intramuskulárně letálně ozářeným myším, kterým se aplikovaly syngenní transplantáty kostní dřeně. Standardní pitva myší ve stáří 8 měsíců po léčbě neprokázala žádné toxické účinky na vnitřní orgány nebo jiné odchylky od normálu. Podobné testy toxicity provedené na morčatech neprokázaly žádné abnormality dva týdny po jediné intramuskulární dávce obsahující 20 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu. V jiných sériích experimentů vysoké dávky peptidů získaných z přirozeného kaseinu aplikované zdravým myším nevykazují žádný účinek na několik hematologických parametrů zjišťovaných o dva týdny později. Tyto • · · · ·· ·· · · • · · · · · ♦ ··· • · · · ··· fcfc · • ······ ·· · · · · · • 99 · 9 · fcfc· ·· · ····· ······ parametry zahrnují bílé krvinky (WBC), červené krvinky (RBC), hemoglobin (HGB), elektrolyty, glukózu a jiné. Třetí série experimentů testovala opakované vysoké dávky 100 mg na jeden kilogram tělesné hmotnosti u myší a krys po dobu dvou týdnů, při pitvě se neprokázaly žádné alergické, zpožděné kožní nebo anafylaktické odezvy a žádné patologické účinky. Když se testoval účinek peptidů získaných z přirozeného kaseinu v dlouhodobé studii dlouhodobého přežívání ozářených myší BALB/c a C3H/HeJ, kterým se provedla transplantace kostní dřeně, počet přeživších ošetřených myší (18 jedinců z 27 myší BALB/c a C3H/HeJ, 66 %) jasně přesahuje míru přežití kontrol ošetřených albuminem (4 jedinci z 26 myší BALB/c a C3H/HeJ, 15 %).
Standardní teratogenní testy (podrobněji se popisují v publikaci Drug safety in pregnancy, Folb and Dakes, p. 336, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford (1990)) u myší ošetřených peptidy získanými z přirozeného kaseinu neprokázal žádný účinek peptidů na jakýkoliv vývojový parametr.
Podobně jako se neprokázala žádná toxicita nebo vedlejší účinky při testování na hlodavcích, peptidy získané z přirozeného kaseinu byly bezpečné, když se aplikovaly člověku. Porovnání vzorků krve a moči, které pocházejí ze sedmi zdravých dobrovolníků, odebraných před, během a 7 dní po intramuskulární injekci peptidů získaných z přirozeného kaseinu neprokázaly žádné změny v klinických parametrech. Nepozorovaly se žádné jiné negativní účinky.
Tak vysoká dávka a rozsáhlá léčba hlodavců peptidy získanými z přirozeného kaseinu neprokázala zjevnou toxicitu, hypersenzitivitu, patologické, teratogenní, serologické nebo jiné negativní účinky. Avšak aplikace peptidů získaných z přirozeného kaseinu ozářeným myším, kterým hrozilo nebezpečí krátce nebo dlouze trvajících komplikací, potvrdilo podstatné zvýšení počtu myší, které přežily 200 až 300 dní. Tato skutečnost a nepřítomnost žádných nežádoucích účinků u zdravých dobrovolníků, kterým se injekcí aplikovaly peptidy získané • ·
z přirozeného kaseinu bezpečnost peptidů při parenterální aplikaci.
Rekonstituce myší, které jsou příjemci transplantátu kostní dřeně
Když myši C57/B1/6 se letálně ozářily a rekonstituovaly se syngenní kostní dření z myší, které se buď ošetřily den před odsátím kostní dřeně 1 mg (na jedno zvíře) peptidů získaných z přirozeného kaseinu nebo se jim uvedené peptidy neaplikovaly, počet přeživších myší, kterým se aplikovala kostní dřeň z ošetřených myší daleko překročil počet přeživších myší, kterým se aplikovala kostní dřeň z neošetřených myší (počet přeživších ozářených myší, kterým se aplikovala kostní dřeň z ošetřených myší, byl 10 dní po ozáření 15 z 18, zatímco počet přeživších ozářených myší, kterým se aplikovala kostní dřeň z neošetřených myší byl 10 dní po ozáření 4 ze 17). Sleziny získané z ozářených myší, kterým se aplikovala kostní dřeň z ošetřených myší, zahrnovaly přibližně dvakrát až třikrát více kolonií v jedné slezině ve srovnání se slezinami ozářených myší, kterým se aplikovala kostní dřeň z neošetřených myší (1 až 5 kolonií ve srovnání s 0 až 3 koloniemi).
Peptidy získané z přirozeného kaseinu stimulují proliferaci lymfocytů
Přirozené buňky K (NK) a cytotoxické buňky T jsou rozhodující pro schopnost imunitního systému chránit proti invazi infekčních patogenů a buněk zhoubného bujení a to aktivní cytotoxicitou a vylučováním imunoregulačních lymfokinů.
Oslabenost imunity, jako je AIDS nebo jako nastává po chemoterapii vede k nadměrné, zeslabené aktivitě buněk T nebo přirozených buněk K. Když se normální buňky myší kostní dřeně pocházející z myší BALB/c a C57B1/6 kultivovaly v přítomnosti 100 μς/ιηΐ peptidů získaných z přirozeného kaseinu, následně se pozorovala soustavně více než dvojnásobné zvýšení lýze cílových buněk (zobrazeno na obrázku č. 1) Podobné experimenty • · ·· · ····· ······ používající lidské kmenové buňky z periferní krve dárců ošetřených faktorem stimulujícím kolonie granulocytů prokázaly dokonce podstatnější stimulaci lýze cílových buněk použitím 10 pg/ml peptidů získaných z přirozeného kaseinu, která je závislá na koncentraci (zobrazeno na obrázku č. 2).
V jiných sériích experimentů s PBSC shromážděných ze zdravých lidských dárců, peptidy získané z přirozeného kaseinu stimulovaly zvýšení podíl přirozených buněk K a buněk T, ke kterému došlo po 10 (zobrazeno na obrázku č. 3a) a 14 dnech (zobrazeno na obrázku 3b) kultivace, po 28 dnech bylo toto navýšení třínásobné nebo vyšší. Imunitní stimulační účinek peptidů získaných z přirozeného kaseinu na buňky PBSC byl nejpodstatnější u dárců s počáteční nízkým množstvím buněk T a přirozených buněk K (zobrazeno na obrázcích 3a až b). Tak peptidy získané z přirozeného kaseinu stimulují proliferaci Tlymfocytů a přirozených buněk K, které pocházejí z normálních předchůdců myších a lidských krevních buněk.
Peptidy získané ze syntetického kaseinu stimulují proliferaci lymfocytů in vitro
Když peptidy získané ze syntetického kaseinu reprezentující prvních 1 až 16 zbytků kaseinu aSl se inkubovaly s lidskými buňkami PBSC ze zdravých dárců a pacientů trpících zhoubným bujením (popisuje se dále v textu), pozorovalo se podstatné zvýšení aktivity přirozených buněk K. Lýze cílových buněk byla nejvyšší (3 až více jak 5 krát vyšší než kontrolní stanovení) u kultur PBSC pacientů Non-Hodkinsova lymfomu a pacientů s karcinomem prsu po dvou dnech inkubace s 10 gg/ml peptidů, které obsahují prvních 10 nebo více zbytků kaseinu aSl (obrázek č. 4). Za stejných podmínek žádný z testovaných peptidů neměl podstatný účinek na aktivitu přirozených buněk K v kulturách PBSC pocházejících ze zdravých lidských dárců. Tak dokonce nízké koncentrace peptidů obsahující alespoň prvních deset zbytků
N-terminální sekvence kaseinu aSl jsou schopné selektivně povzbuzovat proliferaci lymfocytů in vivo v buňkách pocházejících z pacientů trpícím zhoubným bujením.
Stimulace krvetvorby u předchůdců lidských krevních buněk
Předchůdci krevních buněk se diferencují na různé druhy krevních buněk: makrofágy, monocyty, granulocyty, lymfocyty, erytrocyty a megakaryocyty. Předchůdci buněk se ve velkém počtu vyskytují v kostní dřeni, ale také po aplikaci faktoru stimulujícího granulocytové kolonie (buňky PBSC) se jejich výskyt zjistil v periferní krvi a v pupečníkové krvi. Když se do kultur lidské kostní dřeně, PBSC a pupečníkové krve přidaly rostoucí koncentrace peptidu (50 až 600 pg/ml) získaných z přirozeného kaseinu, došlo ke zvýšení proliferace buněk, jak se stanovilo na základě začlenění [3H]-thymidinu (zobrazeno na obrázku č. 5a až 5c). Množení lidských PBSC bylo nejvíce ovlivněno koncentrací peptidů 300 gg/ml (zobrazeno na obrázku č. 5) po patnácti dnech kultivace. Dokonce vyšší účinek se zaznamenal v případě kultur buněk pupečníkové krve (3 až 4 násobné zvýšení začlenění [3H]-thymidinu) po čtrnácti dnech inkubace (ale nikoli po sedmi dnech) s peptidy získanými z přirozeného kaseinu (koncentrace 600 pg/ml, zobrazeno na obrázku č. 5c). Kultivované buňky lidské kostní dřeně tří ze čtyř dárců silně reagovaly (3 až 5 násobné zvýšení začlenění) na peptidy získané z přirozeného kaseinu (300 gg/ml) po 21 dnech inkubace (zobrazeno na obrázku č. 5b). Pak peptidy získané z přirozeného kaseinu podporují množení předchůdců lidských krevních buněk z kostní dřeně stejně jako tomu je u buněk z jiných zdrojů. Je zajímavé, že inkubace kultivovaných lidských buněčných kolonií K562 (chronická myeloidní leukemie) a Colon (karcinom tlustého střeva) s vysokými koncentracemi (až 500 pg/ml) peptidů získaných z přirozeného kaseinu za podobných podmínek neměla žádný účinek na začlenění [3H]-thymidinu. Tak peptidy získané z přirozeného kaseinu podporují množení • ·
předchůdců buněk lidské krve, ale nepodporují růst buněk zhoubného bujení.
Příklad 6: Povzbuzení megakaryocytopoézy peptidy získanými z kaseinu
Peptidy získané z přirozeného kaseinu povzbuzují množení předchůdců megakaryocytů v kultivovaných buňkách myší kostní dřeně
Megakaryocyty s více jádry se vyvíjí v kostní dřeni z prvotních kmenových buněk zráním na obrovské buňky, přičemž z jednoho megakaryocytů vzniká tisíce trombocyt. Trombocyty jsou rozhodující při tvorbě krevních sraženin a u myeloblačních stavů (po chemoterapii nebo radioterapii) je hlavním problémem trombocytopenie.
U kultur prvotních buněk kostní dřeně se může vyvolat tvorba kolonií CFU-GM (granulocyt a monoocyt) a kolonie CFU-GEMM (grybulocyt, erytroid, makrofág a megakaryocyt) obsahující další typy krevních buněk. Počet kolonií odráží rozpínání specifických předchůdců, počet buněk odráží rychlost množení a počet diferenciovaných buněk odráží druh vyvinuté specifické buněčné linie (popisuje se v publikaci Patenkin, D. et al. (1990), Mol. Cel. Biol. 10, 6046-50). U buněk myší kostní dřeně kultivované s erytropoetinem a IL-3 se přidáním peptidů získaných z přirozeného kaseinu v koncentraci 25 pg/ml po dobu osmi dnů došlo ke zvýšení počtu CFU-GEMM na dvojnásobek a jeden a půl násobek počtu ve srovnání s kontrolami stimulující třínásobné zvýšení relativních počtů buněk v jedné kolonii CFU-GEMM.
V podobných sériích experimentů přidání peptidů získaných z přirozeného kaseinu k buňkám kostní dřeně inkubovaných s erytropoetinem a v upraveném kultivačním mediu (popisuje se v části materiál a experimentální metody) podporovalo zvýšení procenta časných a pozdních megakaryocytů v závislosti na koncentraci peptidů (15 % megakaryocytů bez přítomnosti peptidů, zvýšení na 50 % při přidání peptidů • · · • · · · • · · · · · · • · ·
získaných z přirozeného kaseinu v koncentraci 500 pg/ml). Tak osmi denní aplikace peptidů získaných z přirozeného kaseinu podpořila podstatné zvýšení tvorby megakaryocytů a vývoj prvotních kultur myší kostní dřeně.
Syntetické peptidy získané z kaseinu podporují množení předchůdců megakaryocytů v kultivovaných buňkách myší kostní dřeně
Podobně jako ve shora uvedeném textu a za podobných experimentálních podmínek peptidy získané ze syntetického kaseinu představující prvních 10 a 11 aminokyselin kaseinu aSl měly silný (více než deseti násobek) stimulační účinek na množení buněk myší kostní dřeně CFU-GEMM po osmi dnech inkubace. Mírnější, ale stále dostatečná stimulace se pozorovala u peptidů získaných ze syntetického kaseinu, které představují prvních 12 až 26 aminokyselin aSl.
Peptidy získané z přirozeného kaseinu podporují megakaryocytopoézu v kultivovaných buňkách lidské kostní dřeně
Když se do kultur buněk lidské kostní dřeně, které pocházejí ze zdravých dárců za podobných podmínek přidaly peptidy získané z přirozeného kaseinu v koncentraci 100 pg/ml, vzrostla tvorba kolonií CFU-GM ať už se přidaly nebo nepřidaly další stimulační faktory (GM-CSF, CM). Peptidy získané z přirozeného kaseinu také stimulovaly tvorbu kolonií erytroidních buněk v přítomnosti erytropoetinu. Ošetření buněk lidské kostní dřeně trombopoetinem (TPO) podporuje tvorbu megakaryocytových kolonií (MK). Přidáním peptidů získaných z přirozeného kaseinu v koncentraci 300 pg/ml k buňkám ošetřených TPO se podporuje více jak dvojnásobné zvýšení (16 kolonií na 2 x 105 buněk bez přítomnosti peptidů, 35 kolonií na 2 x 105 buněk v přítomnosti peptidů získaných z kaseinu) při množení kolonií MK.
V přítomnosti dalších faktorů krvetvorby, jako je erytropoetin, lidský IL-3, hSCF a sérum AB, čtrnáctidenní • to to· • to inkubace s peptidy získanými z přirozeného kaseinu stimulovala skoro třínásobné zvýšení kolonií CFU-GEMM z buněk lidské kostní dřeně (158 kolonií v přítomnosti peptidů získaných z přirozeného kaseinu v koncentraci 500 pg/ml, 68 kolonií v přítomnosti samotného faktoru), ale měly menší účinek (jeden násobek a jeden a půl násobek) v případě tvorby kolonií CFU-GEMM v kultivované pupečníkové krvi. Relativní počet buněk stanovený v koloniích kultivované lidské kostní dřeně a pupečníkové krve odráží množení megakaryocytových buněk na základě přidání peptidů získaných z přirozeného kaseinu v koncentraci 25 pg/ml (uvádí se v tabulce zobrazené na obrázku č. 6). Tak inkubace kultivovaných prvotních buněk lidské kostní dřeně a pupečníkové krve spolu s peptidy získanými z přirozeného kaseinu podporuje vývoj a množení determinovaných kolonií megakaryocytů a erytroidních buněk.
Peptidy získané z přirozeného kaseinu podporují krvetvorbu in vivo následující po ozáření a transplantaci kostní dřeně
Myeloblační terapie může vést k životu nebezpečnému snížení trombocytů a leukocytů, které může přetrvávat navzdory aplikaci krevních buněk a růstových faktorů. Následující text ukazuje účinek peptidů získaných přirozeného kaseinu po ozáření a transplantaci kostní dřeně.
Peptidy získané z přirozeného kaseinu zesilují obnovu leukocytů a krevních destiček po syngenní transplantaci kostní dřeně u myší
Když se myši BALB/c (n = 60) ozářily subletální dávkou (600 cGy) a došlo k minimální obnově kostní dřeně, aplikovalo se myším jeden den po transplantaci buněk kostní dřeně intravenózní injekcí 1 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu na jednu myš. Po období 7 až 14 dní se zaznamenalo ve srovnání s kontrolami, kterým se aplikoval pouze lidský sérový albumin, zvýšení počtu bílých krvinek v periferní krvi (zobrazeno na
64a obrázku č. 7). Počet krevních destiček v periferní krvi u ošetřených myší a ·· · ·
999 9 kontrolních ozářených myší po transplantaci kostní dřeně byl shodně snížený až do doby 8 dní po léčbě. Avšak devátý den se zaznamenala jasná výhoda v případě myší ošetřených peptidy získanými z přirozeného kaseinu, které vykazovaly dvojnásobné zvýšení ve srovnání s kontrolami ošetřenými lidským sérovým albuminem v den 13 (zobrazeno na obrázku č. 8). Tak peptidy získané z přirozeného kaseinu zesilují obnovu krevních destiček a leukocytů následující po transplantaci omezených počtů buněk kostní dřeně. Očekává se, že tento účinek se bude dále zvyšovat s optimálním spíše než omezeným počtem buněk kostní dřeně.
Syntetické peptidy získané z kaseinu zesilují u myší obnovu leukocytů po transplantaci syngenní kostní dřeně
Když se myši BALB/c (n = 5 v případě syntetického peptidu, n = 10 v kontrolní skupině) ozářily subletální dávkou (600 cGy) a došlo k minimální obnově kostní dřeně, aplikovalo se myším jeden den po transplantaci buněk kostní dřeně intravenózní injekcí 1 mg na jednu myš syntetických peptidů (v délce 13 až 26 aminokyselin, jsou uvedeny v tabulce č. 3) získaných z přirozeného kaseinu. Po uplynutí období 10 až 14 dní se zaznamenalo podstatné zvýšení počtu bílých krvinek v periferní krvi související s peptidy, které vykazují 13 aminokyselin (den 10: 17,2 x 106 buněk v jednom mililitru, den 12: 65,4 x 106 buněk v jednom mililitru) a 17 aminokyselin (den 10: 27,4 buněk v jednom mililitru, den 12: 52,0 x 106 buněk v jednom mililitru) (popisuje se v tabulce č. 3) ve srovnání s kontrolami, kterým se aplikoval lidský sérový albumin (den 10: 16,7 x 106 buněk v jednom decilitru, den 12: 46,4 x 106 buněk v jednom decilitru). Tak syntetické peptidy získané z kaseinu zesilují obnovu leukocytů následující po transplantaci omezeného počtu buněk kostní dřeně.
Peptidy získané z přirozeného kaseinu inhibují in vitro infekci buněčné linie lymfocytů T virem HIV-1
·· ·* ·· • · · · · • · · · • · · · · • · · · • ···· *· · · · ·
65a
Penetrace peptidů získaných z přirozeného kaseinu do lymfocytických buněk T
Za účelem zkoumat mechanizmy imunitních stimulačních a antivirových účinků peptidů získaných z přirozeného kaseinu <· ··· ···· 9 · · • · · · 9 9 9 ·· · • 9 «999 9 99 999 9 9
999 999 999 •9 9 999 9· 99 9999 vhodné kultivované lidské buňky T Sup-Tl a CEM se ošetřily peptidy získanými z přirozeného kaseinu před infekcí in vitro virem HIV-1. Fluorescenční mikroskopie ukázala, že peptidy získané z přirozeného kaseinu konjugované s FITC (v koncentraci 100 pg/ml) při společné inkubaci s buňkami Sup-Tl vstoupily do těchto buněk, jak se popisuje shora v textu (zobrazeno na obrázcích č. 9a až f). Malé množství značení se pozorovalo v cytoplazmě buněk po 15 minutách (zobrazeno na obrázku č. 9a až b). Po 30 minutách (obrázky č. 9c až d) se při limitovaném pohlcení do jádra pozorovalo v cytoplazmě více značení. Od délky inkubace jedna hodina a dále (obrázek č. 9e až f) se v citoplazmě pozorovaly peptidy získané z přirozeného kaseinu značené FITC, ale většinou se koncentrovaly v buněčném jádru. Analýza buněk Sup-Tl průtokovou cytometrií potvrdila zvýšené pohlcování značených peptidů získaných z přirozeného kaseinu od doby pěti minut po inkubaci.
Peptidy získané z přirozeného kaseinu zesilují množení lidských lymfocytů
Přítomnost peptidů získaných z přirozeného kaseinu v kultivačním médiu vede ke zvýšenému počtu buněk Sup-Tl během 14 dní. Nejvyšší nárůst počtu buněk v sedmi dnech se pozoroval v případě peptidů získaných z přirozeného kaseinu při koncentraci 50 pg/ml (42 %), v případě množství peptidů 1 000 pg během deseti dnů (30 %) a v případě 600 pg (32 %) během 14 dnů inkubace. Měření začlenění [3H]-thymidinu kultivovanými buňkami poskytují proliferační index, který odráží nejpodstatnější zvýšení počtu buněk při koncentraci peptidů získaných z přirozeného kaseinu 100 pg/ml v den 10 (zobrazeno na obrázku č. 10). Snížené proliferační indexy během 14 dnů pravděpodobně odráží nadměrný růst buněk a vyčerpání nutrientů.
Syntetické peptidy získané z kaseinu zesilují množení lidských lymfocytů • 9 * · •
·« · * » • «· « t 4 · • 0 · ·<· *· · «« ·· * 0 0 • · * • · · * « · · • 0 ··· ·
Přítomnost syntetických peptidů získaných z kaseinu (všechny peptidy jsou uvedeny v tabulce č. 3) v kultivačním médiu vedou ke zvýšení počtu buněk Sup-Tl v období deseti dní. Nárůst byl podobný v případě všech syntetických peptidů. Nejvyšší zvýšení počtu buněk u infikovaných buněk se pozorovalo při koncentraci peptidu 250 pg/ml (délka peptidu je 9 aminokyselin, zvýšení 80 %). Při koncentraci peptidu 500 pg/ml a délce peptidu 8 aminokyselin je zvýšení 33 %).
Peptidy získané z přirozeného kaseinu inhibují infekci HIV-1 v lidských lymfocytových buňkách
Vhodné lymfocytové buňky CEM ošetřené peptidy získanými z přirozeného kaseinu (50 až 1 000 pg/ml) 24 nebo 48 hodin před inkubací s virem HIV-1 nebo vystavené působení viru HIV-1 předem ošetřeným po dobu 3 hodiny peptidy odvozenými z přirozeného kaseinu vykazovaly zvýšenou buněčnou proliferaci a snížené množství buněk infikovaných virem ve srovnání s neošetřenými kontrolami. Počty buněk a test antigenů P24 HIV-1 peovedený 15 dní po infekci ukázal 100 % inhibici virové infekce po 3 hodinách inkubace s peptidy získanými z přirozeného kaseinu v koncentraci 600 až 1 000 pg/ml a 98% a 99% inhibici po 24 hodinách inkubace s peptidy v koncentraci 50 respektive 600 pg/ml. Zjistilo se, že delší doba inkubace nezvýšila účinnost (zobrazeno na obrázku č. 11). Ačkoli zvýšení koncentrací peptidů získaných z přirozeného kaseinu zesílilo množení buněk 3 a 24 hodin po infekci, virová infekce se nejpodstatněji inhibuje v těchto nej rychleji rostoucích kulturách. Dokonce více dramatické zesílení proliferace buněk a inhibice infekce HIV-1 se pozorovalo v buňkách Sup-Tl předem ošetřených peptidy získanými z přirozeného kaseinu před infekcí HIV-1 (průměrná inhibice virové infekce je 96,7 %, 88,7 % a 95,7 % v případě předchozího ošetření viru po dobu 3 hodin, 24 hodin respektive 48 hodin. Tak peptidy získané z přirozeného kaseinu vstupují do
67a lidských kultivovaných lymfocytových buněk a jejich jádra, zesilují růst buněk a podstatně snižují náchylnost buněk CD4 k infekci HIV-1. Očekává se, že peptidy získané • · · « · ·« ·· • · · · · ··« ··· · ··· · • · · · · ···· ♦ ··· ·· ··· •·· ·· ····*·· ·· ···· z přirozeného kaseinu jako takoví se mohou použít při prevenci infekce HIV a v případě léčby pacientů infikovaných HIV a pacientů trpících AIDS.
Peptidy získané z přirozeného kaseinu brání vývoji glukosurie u neobézních diabetických myší (NOD) (J neobézních diabetických myší (NOD) se spontánně vyvinula cukrovka (typ I (IDDM), což je autoimunitní onemocnění způsobující zánět pankreatických buněk β končící smrtí. Samice myší NOD jsou extrémně náchylné k tomuto onemocnění. Už ve stáří pěti týdnů demonstrují důkaz invaze makrofágů pankreatického ostrůvkovitého intersticiálního pojivá. Injekce obsahující 100 pg peptidů získaných z přirozeného kaseinu aplikovaná jednou nebo dvakrát týdně po dobu pěti týdnů (celkem se aplikuje 5 nebo 10 injekcí) byly zcela účinné při prevenci glukosurie spojené se vznikem a průběhem onemocnění. Během 200 dní se 100 % neošetřených kontrolních myší (n=5) stalo diabetickými a následně zemřely, zatímco ošetřené myší (n=5) zůstaly 100% euglykemické a po dobu 230 dní byly stále naživu (zobrazeno na obrázku č. 12). Tak peptidy získané z přirozeného kaseinu ochránily geneticky náchylné myši proti vzniku tohoto autoimunitního zánětlivého onemocnění.
Klinické studie s peptidy získanými z přirozeného kaseinu
Každému z pacientů se aplikovala intramuskúlární injekce obsahující 50 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu v jedné nebo ve třech dávkách.
Peptidy získané z přirozeného kaseinu podporují krvetvorbu u pacientů trpících zhoubným bujením
Hematologické profily šesti pacientů se zhoubným bujením, kteří se vystavili chemoterapii nebo prodělávají chemoterapii, se testovaly před a po aplikaci peptidů získaných z přirozeného kaseinu. Zvláštní pozornost se věnovala změnám v hodnotách krevních destiček (PLT), leukocytů (WBC), erytrocytů (RBC) a hemoglobinu (HBG), které reprezentují trombocytopoézu, leukocytopoézu respektive erytrocytopoézu.
G.T. (pacient ženského pohlaví, pacient 1)
Pacientka měla karcinom vaječníků, prodělala hysterektomii následovanou chemoterapií. Aplikovaly se jí dvě intramuskulární injekce peptidů získaných z přirozeného kaseinu v intervalu dva a pak dva a jeden a půl měsíce po operaci. Mezi první a druhou aplikací peptidů odvozených z přirozeného kaseinu se neaplikovala chemoterapie. Krevní testy provedené 6 dní po první injekci, 7 a 13 dní po druhé injekci odráží podstatné zvýšení krevních destiček a složek WBC, stejně jako zvýšení RBC (zobrazeno na obrázku č. 13).
E.C. (pacient ženského pohlaví, pacient 2)
Pacientka je po radikální mastektomii z důvodu lobulárního karcinomu v roce 1983. 0 šest let později se objevily metastáze v žaludku. Tři dni před zahájením chemoterapie se jí aplikovaly jedenkrát intramuskulárně peptidy získané z přirozeného kaseinu injekcí a druhou dávku obdržela deset dní po chemoterapii.
Ačkoli počet krevních buněk od deseti a šestnácti dní po chemoterapii ukazuje útlum snížení hematologického profilu, což je obvyklé po chemoterapii, nejvíce podstatné účinky peptidů získaných z přirozeného kaseinu se zaznamenaly 3 dni po první injekci před chemoterapií (zobrazeno na obrázku č. 13).
E.S. (pacient ženského pohlaví, pacient 3)
Pacientka trpí roztroušenými metastázemi karcinomu prsu, který se poprvé objevil roku 1987. 0 dva roky později se jí aplikovala první intramuskulární injekce peptidů získaných z přirozeného kaseinu a druhá injekce se aplikovala o 23 dní později. Během tohoto období pacientka neprodělala žádnou další terapii. Krevní testy ukazují silné zvýšení PLT sedm dní po
ΊΟ první léčbě a podstatné zvýšení RBC a WBC sedm dní po druhé léčbě (zobrazeno na obrázku č. 13) .
J.R. (pacient ženského pohlaví, pacient 4)
Diagnóza pacientky je karcinom prsu s metastázami v kostech.
Pacientce se aplikovala jedna intramuskulární injekce peptidů získaných z přirozeného kaseinu 8 dní před zahájením chemoterapie a další injekce se aplikovala o 14 dní později.
Nejvýznamnější účinek se zaznamenal v rychlém návratu množtví WBC po snížení vyvolaném chemoterapií (obrázek č. 13).
D.M. (pacient ženského pohlaví, pacient 5)
Pacientka trpící karcinomem jater s roztroušenými metastázami. Pacientce se aplikovaly tři intramuskulární injekce peptidů získaných z přirozeného kaseinu 10, 8 a 6 dní před aplikací chemoterapie. Druhá série injekcí začala 10, 12 a 14 dní po léčbě chemoterapií. Ačkoli se po první sérii injekcí před chemoterapií zaznamenal podstatný účinek na hematologický profil, nejvíce dramatické zlepšení je možné vidět v rychlém návratu snížených hodnot po chemoterapii na normální počty buněk po druhé sérii injekcí peptidů získaných z přirozeného kaseinu (zobrazeno na obrázku č. 13).
Tak aplikace peptidů získaných z přirozeného kaseinu pacientům trpících karcinomem vede ke zlepšení hematologických profilů, specificky k zesílení erytropoézy, leukocytopoézy a trombocytopoézy a je schopna upravovat a zkracovat trvání snížení počtu krevních buněk vyvolané chemoterapií.
Peptidy získané z přirozeného kaseinu podporují trombocytopoézu u příjemců transplantátu trpících rezistentní trombocytopenií
Dlouhodobá trombocytopenie s rezistencí vůči transfúzi s výskytem těžkého krvácení může být komplikací transplantace kostní dřeně ohrožující život, zvláště když tradiční terapie nejsou účinné. Dva pacienti s těžkou rezistentní trombocytopenií se léčily peptidy získanými z přirozeného kaseinu.
M-l (pacient ženského pohlaví)
Pacientka ve věku 32 let trpí akutní myelodní leukémií ve stádiu úplné remise po transplantaci autologních kmenových buněk. Pacientka prodělala dva případy krvácení ohrožující její život zahrnující pulmonární krvácení a velký obstruktivní hematom měkkého patra. Více než 114 dní po transfúzi počty krevních destiček neodpovídaly na léčbu rhIL-3, rhIL-6, intravenozním gammaglobulinem a rekombinantním erytropoetinem.
Po dvou intramuskulárních aplikacích 50 pg peptidů získaných z přirozeného kaseinu rozdělených do tří dávek se její stav bezprostředně zlepšil. Spolu s rychlým návratem normálního počtu krevních destiček (zobrazeno na obrázku č. 14) pominulo krvácení distálních končetin spojené s námahou a patechyemi. Pacientka byla schopná opět chodit a vrátila se domů bez komplikací a bez vedlejších účinků.
M-2 (pacient mužského pohlaví)
Třicetiletý pacient trpící akutní myelodní leukémií ve stádiu druhé úplné remise po transplantaci autologních kmenových buněk vykazující celkovou rezistencí destiček a rozsáhlé gastrointestinální krvácení. Jeho stav vyžadoval každodenní transfúzi shluknutých buněk a došlo hypoalbuminii a neodpovídal ani na rozsáhlou léčbu pomocí rhIL-3 a rhIL-6 a gammaglobulinem. Po jediné intramuskulární aplikaci 50 pg peptidů získaných z přirozeného kaseinu ve třech dávkách 86 dní po transfúzi se pozorovalo rychlá obnova krevních destiček (zobrazeno na obrázku č. 15) a postupné přerušení krvácení.
Nebyla nutná žádná jiná léčba a pacient je v současné době úplně bez příznaků s vykazuje normální počet krevních destiček.
Tak jedna kůra dvou intramuskulárních injekcí peptidů získaných z přirozeného kaseinu v množství 0,7 až 1,0 mg na jedno kilo tělesné hmotnosti rozdělené do tří aplikací byla účinná při rychlé obnově počtu krevních destiček a vymizení spojených klinických symptomů u pacientů trpících dlouhotrvající • 4 trombocytopenií odolávající transfúzi s epizodami krvácení, které ohrožují život.
Peptidy získané z přirozeného kaseinu snižují hladinu triglyceridů a LDL-cholesterolu u rodinné hyperlipemie
M.S. (pacient ženského pohlaví)
Pacient je žena ve věku 38 let s rodinou anamnézou hyperlipemie. Před léčbou pomocí peptidů získaných z přirozeného kaseinu krevní chemický profil ukázal zvýšený celkový cholesterol (321 mg v jednom decilitru), triglyceridy (213 mg v jednom decilitru, normální hodnoty jsou v rozmezí 45 až 185 mg v jednom decilitru) a zvýšený LDL-cholesterol (236,4 mg v jednom decilitru, normální hodnoty jsou v rozmezí 75 až 174 mg v jednom decilitru). Jeden měsíc po jediné aplikaci 50 pg peptidů získaných z přirozeného kaseinu ve třech intramuskulárních dávkách se hyperlipemie stabilizovala: celkový cholesterol se snížil na 270 mg v jednom decilitru, triglyceridy byly 165 mg v jednom decilitru a LDL-cholesterol byl 201 mg v jednom decilitru, což je hodnota stále vyšší než normální rozmezí, ale podstatně se snížila ve srovnání s hodnotou před léčbou. Neaplikovala se žádná další léčba. Tak léčba pomocí peptidů získaných z přirozeného kaseinu je účinná při rychlém snížení jinak neléčitelné lidské hyperlipemie.
Peptidy získané z přirozeného kaseinu podporují normoglobinemii v případě okultního krvácení D.G. (pacient mužského pohlaví)
Pacient je muž 75 let starý trpící anemií a hypoglobinemií (snížené počty RBC, HGB, HCT a MCHC), což je spojené s rozsáhlým okultním krvácením. Jeden měsíc po aplikaci dvou intramuskulárních injekcích s 50 pg peptidů získanými z přirozeného kaseinu ve třech dávkách se pozorovalo podstatné omezení anémie. Po dvou měsících hodnoty RBC dosáhly normálních hodnot (4,32 ·· ·· ·· ♦ ♦ ♦ · • · « • · · · · • ♦ · ♦
odolávající transfúzi s epizodami krvácení život.
které ohrožují
Peptidy získané z přirozeného kaseinu snižují hladinu triglyceridů a LDL-cholesterolu u rodinné hyperlipemie
M.S. (pacient ženského pohlaví)
Pacient je žena ve věku 38 let s rodinou anamnézou hyperlipemie. Před léčbou pomocí peptidů získaných z přirozeného kaseinu krevní chemický profil ukázal zvýšený celkový cholesterol (321 mg v jednom decilitru), triglyceridy (213 mg v jednom decilitru, normální hodnoty jsou v rozmezí 45 až 185 mg v jednom decilitru) a zvýšený LDL-cholesterol (236,4 mg v jednom decilitru, normální hodnoty jsou v rozmezí 75 až 174 mg v jednom decilitru). Jeden měsíc po aplikaci 50 pg peptidů získaných z přirozeného kaseinu ve třech intramuskulárních dávkách se hyperlipemie stabilizovala: celkový cholesterol se snížil na 270 mg v jednom decilitru, triglyceridy byly 165 mg v jednom decilitru a LDL-cholesterol byl 201 mg v jednom decilitru, což je hodnota stále vyšší než normální rozmezí, ale podstatně se snížila ve srovnání s hodnotou před léčbou. Neaplikovala se žádná další léčba. Tak léčba pomocí peptidů získaných z přirozeného kaseinu je účinná při rychlém snížení jinak neléčitelné lidské hyperlipemie.
Peptidy získané z přirozeného kaseinu podporují normoglobinemii v případě okultního krvácení
D.G. (pacient mužského pohlaví)
Pacient je muž 75 let starý trpící anemií a hypoglobinemií (snížené počty RBC, HGB, HCT a MCHC), což je spojené s rozsáhlým okultním krvácením. Jeden měsíc po aplikaci jedné intramuskulární injekce s 50 pg peptidů získanými z přirozeného kaseinu ve třech dávkách se pozorovalo podstatné omezení anémie.
Po dvou měsících hodnoty RBC dosáhly normálních hodnot (4,32 ·
4
44 místo 3,44 molů v jednom mikrolitru), hodnoty HGB se zvýšily (11,3 místo 8,9 g v jednom decilitru) a HCT, MCH a MCHC dosáhly skoro normálních hodnot navzdory přetrvávání okultního krvácení. Tak jedna injekce peptidů získaných z přirozeného kaseinu se zdá být schopná stimulovat u lidí erytropoézu a snížit anemii spojenou se ztrátou krve u lidí.
Oceňuje se, že jisté rysy vynálezu, které jsou za účelem objasnění, popsány v souvislosti s jednotlivými provedeními se mohou také vyskytovat v kombinaci v jediném provedení. Naopak různé rysy vynálezu, které jsou za účelem stručnosti popsány v souvislosti s jediným provedením se mohou také vyskytovat odděleně nebo v libovolné vhodné dílčí kombinaci.
Ačkoli se vynález popisuje ve spojení s jeho specifickými provedeními, je jasné, že řada možností, úprav a variací bude odborníkovi zřejmá. V souladu s tím se uvažuje obsáhnout všechny takové možnosti, úpravy a variace, které spadají do rozsahu přiložených nároků. Všechny publikace, patentové dokumenty, patentové přihlášky a sekvence identifikované číslem jsou zde začleněny ve své úplnosti citací ve stejném rozsahu, jako kdyby každá jednotlivá publikace, patentový dokument, patentová přihláška nebo sekvence byla specificky a jednotlivě označena za účelem být zde začleněna odkazem. Navíc citace nebo identifikace libovolného odkazu v této přihlášce by neměla být konstruována tak, aby se zjistilo, že takový odkaz je dostupný jako dosavadní stav techniky.
Seznam sekvencí • · ···· • ·· ·* *· • ♦ · · * * · • · · · · · ·»···· ♦ • · · « · » • · · ♦ · » · »·· · <110> Sidelman, Zvi <120> Způsob, farmaceutický prostředek, použití a čištěný peptid <130> 01/21676 <150> IL 134 830 <151> 1.3.2000 <160> 19 <170> Patentln verze 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> protein <213> umělá <220>
<223> syntetický peptid <400> 1
Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> protein <213> umělá <22 0>
<223> syntetický peptid <400> 2
Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin 1 5 <210> 3 <211> 10 »· · « <212> protein <213> umělá <220>
<223> syntetický peptid <400> 3
A.rg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> protein <213> umělá <220>
<223> syntetický peptid <400> 4
Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu 15 10 <210> 5 <211> 12 <212> protein <213> umělá <220>
<223> syntetický peptid <400> 5
Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro 15 10 <210> 6 <211> 13 <212> protein <213> umělá »
t · • «> · • · · · to toto· • to ···* · • · · ·· to · »to to · to <220>
<223> syntetický peptid <400> 6
Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin 15 10 <210> 7 <211> 14 <212> protein <213> umělá <220>
<223> syntetický peptid <400> 7
Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu 1 5 10 <210> 8 <211> 15 <212> protein <213> umělá <220>
<223> syntetický peptid <400> 8
Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val <210> 9 <211> 16 <212> protein <213> umělá <220>
<223> syntetický peptid • 999
9949 · 4 4
9 9 9 9 • · 4 9 • 99 4·
99
4 · *
• <400>
Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu 1 5 10 15 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
protein umělá <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
syntetický peptid
Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu 15 10 15
Asn protein umělá syntetický peptid
Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu 15 10 15
Asn Glu <210>
<211>
<212>
<213>
<22 0>
protein umělá <223> syntetický peptid • · <4 00>
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
<210>
<211>
<212>
<213>
9
9 9 • ♦ · *
9 9999 ·
9 9
9
Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu 15 10 15
Asn Glu Asn protein umělá syntetický peptid
Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu 15 10 15
Asn Glu Asn Leu 20 protein umělá syntetický peptid
Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu 1.5 10 15
Asn Glu Asn Leu Leu 20 protein umělá <220>
9« 9 9 99 94
994 44 4 4 44
4 4 4 9 4 9 9 4
4 4449 4 4 4 444 9
9 9 99999
9 999 99 99
79
<223> syntetický peptid
<400> 15 Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu 15 10 15 Asn Glu Asn Leu Leu Arg 20
<210> 16
<211> 23
<212> protein
<213> umělá
<22 0>
<223> syntetický peptid
<400> 16
<210> Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu 15 10 15 Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe 20 17
<211> 24
<212> protein
<213> umělá
<220>
<223> syntetický peptid
<400> 17
<210> Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu 15 10 15 Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe 20 18
<211> 25 <212> protein <213> umělá ·· · • ·· »· ·· ·» · · * ϊ * • » · ϊ i · • · · · · ;
♦ · · · · * ,, . .·......·· <220>
<223> syntetický peptid <400> 18
Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu Val Leu 15 10 15
Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val 20 25 <210> 19 <211> 26 <212> protein <213> umělá <220>
<223> syntetický peptid <400> 19
Tr iw

Claims (71)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Čištěný peptid vykazující aminokyselinou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO: 1 až 19.
  2. 2. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení autoimunitního onemocnění, vyznačující se tím, ž e zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  3. 3. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení virového onemocnění, vyznačující se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  4. 4. Farmaceutický prostředek pro prevenci virové infekce, vyznačující se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  5. 5. Farmaceutický prostředek pro vyvolání krvetvorby, vyznačující se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  6. 6. Farmaceutický prostředek pro vyvolání množení krvetvorných kmenových buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  7. 7. Farmaceutický prostředek pro vyvolání množení a diferenciace krvetvorných kmenových buněk, vyznačuj íci se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  8. 8. Farmaceutický prostředek pro vyvolání megakaryocytopoézy, vyznačující se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  9. 9. Farmaceutický prostředek pro vyvoláni erytropoézy, vyznačující se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  10. 10. Farmaceutický prostředek pro vyvolání leukocytopoézy, vyznačující se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  11. 11. Farmaceutický prostředek pro vyvolání trombocytopoézy, vyznačující se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  12. 12. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení trombocytopenie, vyznačující se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  13. 13. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení pancytopenie, vyznačující se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  14. 14. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení granulocytopenie, vyznačující se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  15. 15. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení hyperlipemie, vyznačující se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  16. 16. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení cholesteremie, vyznačující se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  17. 17. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení glukosurie, vyznačující se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  18. 18. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení cukrovky, vyznačující se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  19. 19. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení AIDS, vyznačující se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  20. 20. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení infekce HIV, vyznačující se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  21. 21. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení stavů spojených s myeloblačními dávkami chemoradioterapie podporované transplantací autologní kostní dřeně nebo kmenových buněk periferní krve (ASCT) nebo transplantací alogenní kostní dřeně (BMT), vyznačuj ící se tím, že zahrnuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.
  22. 22. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 21, vyznačující se tím, že uvedený peptid je fragment získaný fragmentací kaseinu aSl.
  23. 23. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 21, vyznačující se tím, že uvedený peptid je syntetický peptid.
  24. 24. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 21, vyznačující se tím, že uvedený peptid má sekvenci uvedenou v jedné ze sekvencí SEQ ID NO: 1 až 19.
  25. 25. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje čištěný peptid vykazující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO
    1 až 19 a farmaceuticky přijatelný nosič.
  26. 26. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení autoimunitního onemocnění.
  27. 27. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení virového onemocnění.
  28. 28. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení virové infekce.
  29. 29. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro vyvolání krvetvorby.
  30. 30. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro vyvolání množení krvetvorných kmenových buněk.
  31. 31. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro vyvolání množení a dělení krvetvorných kmenových buněk.
  32. 32. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání megakaryocytopoézy.
  33. 33. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro vyvolání erytropoézy.
  34. 34. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro vyvolání leukocytopoézy.
  35. 35. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro vyvolání trombocytopoézy.
  36. 36. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení trombocytopenie.
  37. 37. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení pancytopenie.
  38. 38. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení granulocytopenie.
  39. 39. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení hyperlipemie.
  40. 40. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení cholesteremie.
    ΦΦ φφ • · · • · φ • · · φφ φφφφ
  41. 41. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení glukosurie.
  42. 42. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení cukrovky.
  43. 43. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení AIDS.
  44. 44. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení infekce HIV.
  45. 45. Peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl pro použití pro prevenci nebo léčení stavů spojených s myeloblačními dávkami chemoradioterapie podporovanými transplantací autologní kostní dřeně nebo kmenových buněk periferní krve (ASCT) nebo transplantací alogenní kostní dřeně (BMT).
  46. 46. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 26 až 45, přičemž peptid je fragment získaný štěpením kaseinu aSl.
  47. 47. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 26 až 45, přičemž peptid je syntetický peptid.
  48. 48. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 26 až 45, přičemž peptid má sekvenci odpovídající jedné ze sekvencí SEQ ID NO: 1 až 19.
  49. 49. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení autoimunitního onemocnění.
  50. 50. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení virového onemocnění.
  51. 51. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení virové infekce.
  52. 52. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání krvetvorby.
    I 1 ·· • ·· ♦· ·· • · · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · ·«· ···· ·* ··*·
  53. 53. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání množení krvetvorných kmenových buněk.
  54. 54. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání množení a diferenciace krvetvorných kmenových buněk.
  55. 55. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání megakaryocytopoézy.
  56. 56. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání erytropoézy.
  57. 57. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání leukocytopoézy.
  58. 58. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro vyvolání trombocytopoézy.
  59. 59. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení trombocytopenie.
  60. 60. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení pancytopenie.
  61. 61. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení granulocytopenie.
  62. 62. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení hyperlipemie.
  63. 63. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení cholesteremie.
  64. 64. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu ccSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení glukosurie.
  65. 65. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení cukrovky.
  66. 66. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení AIDS.
  67. 67. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení infekce HIV.
    I ·· • ·· ·· ·· · · » · * • · · · · • · · · · · • · · · · ····»·» · · ····
  68. 68. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení stavů spojených s myeloblačními dávkami chemoradioterapie podporovanými transplantací autologní kostní dřeně nebo kmenových buněk periferní krve (ASCT) nebo transplantací alogenní kostní dřeně (BMT).
  69. 69. Použití peptidu podle kteréhokoliv z nároků 4 9 až 68 pro výrobu léčiva, kde uvedený peptid je fragment získaný štěpením kaseinu aSl.
  70. 70. Použití peptidu podle kteréhokoliv z nároků 49 až 68 pro výrobu léčiva, kde uvedený peptid je syntetický peptid.
  71. 71. Použití peptidu podle kteréhokoliv z nároků 49 až 68 pro výrobu léčiva, kde tento peptid má sekvenci odpovídající jedné ze sekvencí SEQ ID NO: 1 až 19.
    • ·
    1/10 ?/ IfioL- Mtí aktivita NK
    50:1 uvolnění aktivita NK
    25:1 /2,
    J
    2/10
    44 4 4 • > ί 4* *
    4 4 4 4 4 4 • 4 4444 4 4 4
    4 · 4 4 4 •4 4 44·
    44 44
CZ20022915A 2000-03-01 2001-03-01 Čištěný peptid a farmaceutický prostředek s jeho obsahem CZ20022915A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL13483000A IL134830A0 (en) 2000-03-01 2000-03-01 Peptides and immunostimulatory and anti-bacterial pharmaceutical compositions containing them

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20022915A3 true CZ20022915A3 (cs) 2003-03-12

Family

ID=11073892

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20022915A CZ20022915A3 (cs) 2000-03-01 2001-03-01 Čištěný peptid a farmaceutický prostředek s jeho obsahem

Country Status (21)

Country Link
US (6) US20020147144A1 (cs)
EP (1) EP1261360B1 (cs)
JP (1) JP2003528827A (cs)
KR (1) KR20030025907A (cs)
CN (1) CN1427725A (cs)
AT (1) ATE451929T1 (cs)
AU (1) AU782662B2 (cs)
BR (1) BR0109027A (cs)
CA (1) CA2401550A1 (cs)
CZ (1) CZ20022915A3 (cs)
DE (1) DE60140794D1 (cs)
DK (1) DK1261360T3 (cs)
EA (3) EA005579B1 (cs)
HU (1) HUP0301003A3 (cs)
IL (2) IL134830A0 (cs)
MX (1) MXPA02008569A (cs)
NO (1) NO20024157L (cs)
NZ (1) NZ521016A (cs)
PL (1) PL361307A1 (cs)
WO (1) WO2001064234A1 (cs)
ZA (1) ZA200206842B (cs)

Families Citing this family (142)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR0212625A (pt) * 2001-08-30 2007-06-19 Chay 13 Medical Res Group N V peptìdeos derivados de caseìna e usos dos mesmos em terapia
WO2003067904A2 (en) * 2002-02-06 2003-08-14 University Of North Carolina At Chapel Hill High-throughput cell identification and isolation method and apparatus
EP1359157A1 (en) * 2002-04-29 2003-11-05 Société des Produits Nestlé S.A. Metallo-proteinase inhibitory agent
KR101188292B1 (ko) * 2002-11-27 2012-10-09 디엠아이 바이오사이언시스, 인크 인산화 증가로 인한 질병 및 증상의 치료방법
GB0313892D0 (en) * 2003-06-16 2003-07-23 Hannah Res Inst Control of lactation
CA2558155A1 (en) * 2004-03-01 2005-09-09 Zvi Sidelman Casein derived peptides and therapeutic uses thereof
BRPI0509541A (pt) 2004-03-30 2007-09-18 Monsanto Technology Llc métodos para controlar agentes patógenos de planta utilizando n-fosfonometilglicina
WO2005099724A2 (en) * 2004-04-13 2005-10-27 Parallel Solutions, Inc. Functionalized water-soluble polyphosphazene and uses thereof as modifiers of biological agents
US9000040B2 (en) 2004-09-28 2015-04-07 Atrium Medical Corporation Cross-linked fatty acid-based biomaterials
EP1811935B1 (en) 2004-09-28 2016-03-30 Atrium Medical Corporation Heat cured gel and method of making
US9012506B2 (en) 2004-09-28 2015-04-21 Atrium Medical Corporation Cross-linked fatty acid-based biomaterials
GB0423352D0 (en) * 2004-10-21 2004-11-24 Hannah Res Inst "Control of mammary cell number"
AU2006242842B2 (en) * 2005-05-02 2011-12-08 Mileutis Ltd. Pharmaceutical compositions comprising casein derived peptides and methods of use thereof
ES2319475B1 (es) * 2005-06-08 2010-02-16 Consejo Superior Investig. Cientificas Peptidos bioactivos identificados en hidrolizados enzimaticos de caseinas lacteas y procedimiento de obtencion.
US11266607B2 (en) * 2005-08-15 2022-03-08 AbbVie Pharmaceuticals GmbH Process for the manufacture and use of pancreatin micropellet cores
US9278161B2 (en) 2005-09-28 2016-03-08 Atrium Medical Corporation Tissue-separating fatty acid adhesion barrier
US9427423B2 (en) 2009-03-10 2016-08-30 Atrium Medical Corporation Fatty-acid based particles
CN101351554B (zh) 2005-10-04 2016-05-18 索利金尼克斯公司 包括通过调节先天免疫治疗和预防感染在内的治疗和预防免疫相关疾病的新型肽
US20070086958A1 (en) * 2005-10-14 2007-04-19 Medafor, Incorporated Formation of medically useful gels comprising microporous particles and methods of use
GB2436328A (en) * 2006-03-22 2007-09-26 Regen Therapeutics Plc Peptide derived from colostrinin
WO2007110296A1 (en) * 2006-03-24 2007-10-04 Unilever N.V. Healthy food product
EP1836906B1 (en) * 2006-03-24 2009-07-01 Unilever N.V. Healthy food product
BRPI0717500A2 (pt) * 2006-10-04 2014-03-25 Inimex Pharmaceuticals Inc Peptídeos para o tratamento e a prevenção de desordens relacionadas à imunidade, incluindo tratamento e prevenção de infecção por modulação da imunidade inata.
JP5592652B2 (ja) * 2007-02-05 2014-09-17 ナショナル ユニバーシティ オブ シンガポール 推定サイトカイニン受容体およびその使用方法
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
US20110004019A1 (en) * 2008-03-12 2011-01-06 Shiseido Company Ltd. Parakeratosis Inhibitor, Pore-Shrinking Agent, Or Rough Skin Inhibiting/Ameliorating Agent, And External Composition For Skin Containing The Same
KR101355695B1 (ko) * 2009-02-06 2014-01-27 더 프록터 앤드 갬블 캄파니 붕괴성 수분-함유 캡슐
US20130195983A1 (en) * 2009-04-10 2013-08-01 Neil P. Desai Nanoparticle formulations and uses thereof
CN105476951A (zh) 2009-05-04 2016-04-13 普西维达公司 多孔硅药物洗脱颗粒
WO2010135324A1 (en) * 2009-05-18 2010-11-25 Monsanto Technology Llc Use of glyphosate for disease suppression and yield enhancement in soybean
GB0912481D0 (en) 2009-07-17 2009-08-26 Reckitt Benckiser Healthcare I Skincare compositions
US20110038910A1 (en) 2009-08-11 2011-02-17 Atrium Medical Corporation Anti-infective antimicrobial-containing biomaterials
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
BR112012015653B1 (pt) * 2009-12-29 2023-09-26 W.R. Grace & Co. -Conn. Composição que compreende um material de sílica particulado poroso e película transparente que compreende a mesma
AU2011212859B2 (en) * 2010-02-04 2014-05-08 Isp Investments Inc. Self adapting polymers for anhydrous sunscreen formulations
MX2012009634A (es) * 2010-02-18 2012-09-28 Athenix Corp Genes delta-endotoxinicos axmi218, axmi219, axmi220, axmi226, axmi227, axmi228, axmi229, axmi230, y axmi231 y metodos para sus uso.
AR080200A1 (es) * 2010-02-18 2012-03-21 Athenix Corp Genes delta-endotoxinicos axmi221z, axmi222z, axmi223z, axmi224z, y axmi225z y metodos para su uso
HUE033056T2 (hu) 2010-03-08 2017-11-28 Monsanto Technology Llc Polinukleotid molekulák génszabályozáshoz növényekben
FR2958155B1 (fr) * 2010-04-02 2012-04-20 Oreal Composition de decoloration comprenant un sel peroxygene dans une base fortement riche en corps gras
WO2011137563A1 (en) * 2010-05-07 2011-11-10 Unilever Plc High solvent content emulsions
JP5957447B2 (ja) 2010-06-04 2016-07-27 モンサント テクノロジー エルエルシー 遺伝子組換えアブラナ事象ｍｏｎ８８３０２および同使用方法
WO2012009707A2 (en) 2010-07-16 2012-01-19 Atrium Medical Corporation Composition and methods for altering the rate of hydrolysis of cured oil-based materials
CN103201388A (zh) * 2010-08-19 2013-07-10 先锋国际良种公司 对鳞翅目昆虫具有活性的新苏云金杆菌基因
US9757374B2 (en) 2010-10-28 2017-09-12 Aequus Pharmaceuticals Inc. Aripiprazole compositions and methods for its transdermal delivery
CA2816203C (en) * 2010-10-28 2017-02-21 Transdermal Research Pharm Laboratories, Llc Aripiprazole compositions and methods for its transdermal delivery
CN104622790A (zh) 2010-11-01 2015-05-20 普西维达公司 用于递送治疗剂的可生物侵蚀的硅基装置
US20120311734A1 (en) * 2011-06-04 2012-12-06 The Texas A&M University System Potato transformation compositions, systems, methods, microorganisms, and plants
AU2012296987A1 (en) * 2011-08-12 2014-02-27 Bayer Cropscience Nv Guard cell-specific expression of transgenes in cotton
MX343071B (es) 2011-09-13 2016-10-21 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para el control de malezas.
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
CA2848689A1 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control targeting pds
WO2013040033A1 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
ES2645927T3 (es) 2011-09-13 2017-12-11 Monsanto Technology Llc Procedimientos y composiciones para el control de malezas
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
US9826763B2 (en) * 2011-10-05 2017-11-28 Fmc Corporation Stabilizer composition of microcrystalline cellulose and carboxymethylcellulose, method for making, and uses
US9492363B1 (en) * 2012-01-16 2016-11-15 American Spraytech, L.L.C. Aerosol sprayable color composition
MX2014008693A (es) * 2012-01-27 2014-08-27 Agile Therapeutics Inc Administracion transdermica de hormonas.
FR2988566B1 (fr) * 2012-03-28 2014-08-08 Yoplait France Compositions alimentaires pour stimuler la formation de tissu osseux
UY34822A (es) 2012-05-24 2013-12-31 Seeds Ltd Ab Composiciones y métodos para silenciar la expresión genética
EP4215213A1 (en) * 2012-08-03 2023-07-26 MSM Innovations, Inc. Method and kit for bowel preparation
US9567631B2 (en) 2012-12-14 2017-02-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CA2881685C (en) 2012-08-14 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Microcapsule compositions and methods
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10584381B2 (en) 2012-08-14 2020-03-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9617297B2 (en) * 2012-10-11 2017-04-11 The Regents Of The University Of California Apoplast wash fluid recovery for improved recombinant endoglucanase extraction in tabacco leaves
US10077451B2 (en) 2012-10-18 2018-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9206436B2 (en) * 2012-12-20 2015-12-08 Ut-Battelle, Llc Key gene regulating cell wall biosynthesis and recalcitrance in Populus, gene Y
EP2941488B1 (en) 2013-01-01 2023-03-22 Monsanto Technology LLC Methods of introducing dsrna to plant seeds for modulating gene expression
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
CA2900543C (en) 2013-02-08 2023-01-31 10X Genomics, Inc. Partitioning and processing of analytes and other species
US8961680B2 (en) * 2013-03-08 2015-02-24 Tbf Environmental Technology Inc. Solvent formulations
WO2014165108A1 (en) * 2013-03-12 2014-10-09 Psivida Us, Inc. Bioerodible silicon-based delivery vehicles for delivery of therapeutic agents
CN105263329B (zh) 2013-03-13 2020-09-18 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
US10609930B2 (en) 2013-03-13 2020-04-07 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
US9289461B2 (en) * 2013-03-15 2016-03-22 Mead Johnson Nutrition Company Reducing the risk of autoimmune disease
US8889633B2 (en) 2013-03-15 2014-11-18 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional compositions containing a peptide component with anti-inflammatory properties and uses thereof
US9345727B2 (en) 2013-03-15 2016-05-24 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional compositions containing a peptide component and uses thereof
CA2942000C (en) * 2013-03-15 2024-04-16 Maria Beug-Deeb Inc. Dba T&M Associates Methods and compositions for cleaning and disinfecting surfaces
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9345741B2 (en) 2013-03-15 2016-05-24 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional composition containing a peptide component with adiponectin simulating properties and uses thereof
WO2014151381A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Psivida Us, Inc. Bioerodible silicon-based compositions for delivery of therapeutic agents
US9352020B2 (en) 2013-03-15 2016-05-31 Mead Johnson Nutrition Company Reducing proinflammatory response
US9138455B2 (en) 2013-03-15 2015-09-22 Mead Johnson Nutrition Company Activating adiponectin by casein hydrolysate
CA2817728A1 (en) * 2013-05-31 2014-11-30 Pharmascience Inc. Abuse deterrent immediate release formulation
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
EP3608412A3 (en) 2013-07-19 2020-04-08 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for controlling leptinotarsa
ES2693580T3 (es) * 2013-10-07 2018-12-12 Bristol-Myers Squibb Holdings Ireland Formulación de tratamiento del VIH de atazanavir y cobicistat
CA2929533C (en) 2013-11-04 2023-06-06 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
CN105979770B (zh) 2014-01-15 2019-07-05 孟山都技术公司 用于使用epsps多核苷酸的杂草控制的方法和组合物
ES2544153B1 (es) * 2014-02-24 2016-06-06 Ntd Labs, S.L. Uso de un hidrolizado de caseína como agente antiviral
US11091770B2 (en) 2014-04-01 2021-08-17 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests
CN106413896B (zh) 2014-04-10 2019-07-05 10X基因组学有限公司 用于封装和分割试剂的流体装置、系统和方法及其应用
WO2015200223A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference
US11807857B2 (en) 2014-06-25 2023-11-07 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
JP6838969B2 (ja) 2014-06-26 2021-03-03 １０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド 個々の細胞または細胞集団由来の核酸の分析方法
JP6640826B2 (ja) 2014-07-08 2020-02-05 ミメディクス グループ インコーポレイテッド 微粒子化ワルトン膠質
US20160022604A1 (en) * 2014-07-23 2016-01-28 Cadila Healthcare Limited Directly compressed ospemifene compositions
RU2754955C2 (ru) 2014-07-29 2021-09-08 Монсанто Текнолоджи Ллс Композиции и способы борьбы с насекомыми-вредителями
WO2016037745A1 (en) * 2014-09-11 2016-03-17 Gelita Ag Gelatin/pectin particles
CA2961639A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Lonza, Inc. Activated disinfectant hydrogen peroxide compositions
US20160122817A1 (en) 2014-10-29 2016-05-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
US10471096B2 (en) * 2015-01-06 2019-11-12 Osamu Yamada Medicinal composition, blood treatment device, cosmetic, food and drink using combustion synthesis material
CN112126675B (zh) 2015-01-12 2022-09-09 10X基因组学有限公司 用于制备核酸测序文库的方法和系统以及用其制备的文库
MX2017009521A (es) 2015-01-22 2018-11-09 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para controlar leptinotarsa.
EP4286516A3 (en) 2015-02-24 2024-03-06 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
KR20170119710A (ko) 2015-02-24 2017-10-27 10엑스 제노믹스, 인크. 표적화된 핵산 서열 커버리지 방법
WO2016137804A1 (en) 2015-02-25 2016-09-01 The Procter & Gamble Company Fibrous structures comprising a surface softening composition
US20160303043A1 (en) * 2015-04-16 2016-10-20 Kate Somerville Skincare, LLC Self-foaming compositions and methods
US10883103B2 (en) 2015-06-02 2021-01-05 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
AU2016270913A1 (en) 2015-06-03 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants
JP6866343B2 (ja) 2015-07-10 2021-04-28 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニーＴｈｅ Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏｍｐａｎｙ メタセシス化不飽和ポリオールエステルを含む布地ケア組成物
SG11201804086VA (en) 2015-12-04 2018-06-28 10X Genomics Inc Methods and compositions for nucleic acid analysis
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
BR112019000371A2 (pt) 2016-07-08 2019-04-24 The Gillette Company Llc composições líquidas para dispositivos de remoção de pelos que compreendem ésteres de poliol insaturados metatetizados
DE102016223333A1 (de) * 2016-11-24 2018-05-24 Henkel Ag & Co. Kgaa Alkalische Mittel zum Aufhellen von Haaren enthaltend Oxidationsmittel und spezielle Carbonsäureester als Keratinvernetzer
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2018140966A1 (en) 2017-01-30 2018-08-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
MA47686A (fr) * 2017-03-01 2021-05-12 Arena Pharm Inc Compositions comprenant des agonistes du récepteur pgi2 et procédés de préparation associés
US10398670B2 (en) * 2017-04-24 2019-09-03 Knoze Jr. Corporation Oral microbiota promotion for oral and/or sinus infections
US10844372B2 (en) 2017-05-26 2020-11-24 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
EP4230746A3 (en) 2017-05-26 2023-11-01 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
US10471033B2 (en) * 2017-09-15 2019-11-12 Knoze Jr. Corporation Oral microbiota promotion for immune system associated inflammations
SG11201913654QA (en) 2017-11-15 2020-01-30 10X Genomics Inc Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
CN112262218A (zh) 2018-04-06 2021-01-22 10X基因组学有限公司 用于单细胞处理中的质量控制的系统和方法
AU2020348683A1 (en) * 2019-09-16 2022-04-28 Kiverdi, Inc. Microbial protein hydrolysate compositions and methods of making same

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3764670A (en) * 1970-10-28 1973-10-09 Ministry Of Agriculture Polypeptidic anti-biotic substances derived from casein
US3778426A (en) * 1970-12-16 1973-12-11 Research Corp Therapeutically useful polypeptides
US4636384A (en) * 1982-06-03 1987-01-13 Stolle Research & Development Corporation Method for treating disorders of the vascular and pulmonary systems
US4959455A (en) * 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
JP2631470B2 (ja) * 1987-05-15 1997-07-16 雪印乳業株式会社 感染防御剤
US5344820A (en) * 1987-05-15 1994-09-06 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Infection protectant
JP2805490B2 (ja) * 1989-02-07 1998-09-30 雪印乳業株式会社 細菌毒素中和剤
US5514646A (en) * 1989-02-09 1996-05-07 Chance; Ronald E. Insulin analogs modified at position 29 of the B chain
FR2686085B1 (fr) * 1992-01-10 1995-08-04 Agronomique Inst Nat Rech Peptides representant des fragments du cmp, anticorps diriges contre lesdits peptides, et leurs utilisations.
GB9310472D0 (en) * 1993-05-20 1993-07-07 Univ Warwick Phenylalanine-free protein and dna coding thereof
TW282398B (cs) * 1993-12-22 1996-08-01 Bristol Myers Squibb Co
US5707968A (en) * 1994-05-26 1998-01-13 Abbott Laboratories Inhibition of attachment of H.influenzae to human cells
US5538952A (en) * 1994-05-26 1996-07-23 Abbott Laboratories Inhibition of infection of mammalian cells by respiratory syncytial virus
US5506209A (en) * 1994-05-26 1996-04-09 Abbott Laboratories Product for inhibition of infection of mammalian cells by respiratory syncytial virus
US5712250A (en) * 1994-09-16 1998-01-27 Abbott Laboratories Product for inhibition of human rotavirus infection
KR0140248B1 (ko) * 1995-03-23 1998-06-15 한상기 신규한 카제인 포스포펩티드, 그것을 포함하는 카제인 및 그 제조방법
US5985275A (en) * 1995-04-12 1999-11-16 New York Blood Center β-Lactoglobulin modified with aromatic anhydride compound for preventing HIV infection
US6570060B2 (en) * 1995-05-16 2003-05-27 Mclachlan Corran Norman Stuart Milk lacking β-casein A1
KR100221124B1 (ko) * 1996-09-23 1999-10-01 한상기 신규한 카제인 및 그 제조방법
US5830434A (en) * 1997-02-26 1998-11-03 Medical University Of South Carolina Foundation For Research Development Methods of treating non-insulin dependent diabetes mellitus with pancreatic polypeptide
EP0922769A4 (en) * 1997-03-21 2000-07-12 Snow Brand Milk Products Co Ltd HYDROLYSATE OF THE IRON-CASE COMPLEX AND A METHOD FOR ITS PRODUCTION.
US6358508B1 (en) * 1997-06-11 2002-03-19 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human tumor necrosis factor receptor TR9
PT996726E (pt) * 1997-08-29 2004-04-30 Brigham & Womens Hospital Proteina de membrana de celulas t (tirc7) peptidos e anticorpos dela derivados e suas utilizacoes
AUPP051497A0 (en) * 1997-11-24 1997-12-18 University Of Melbourne, The Antimicrobial peptides
US5985575A (en) * 1998-05-20 1999-11-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Tethered function assay for protein function
US6570606B1 (en) * 1998-05-29 2003-05-27 3Com Corporation Method and apparatus for controlling transmission of media signals over a data network in response to triggering events at participating stations
WO2000029008A2 (en) * 1998-11-16 2000-05-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Hiv-specific t-cell induction
GB9927603D0 (en) * 1999-11-22 2000-01-19 Nestle Sa Use of a milk protein hydrolysate in the treatment of diabetes
IL138946A0 (en) * 2000-10-11 2001-11-25 Compugen Ltd Method for the identification of peptides and proteins
US20080293671A1 (en) * 2005-09-28 2008-11-27 Dnp Canada, Inc. Combination of Polychitosamine and Fibrate for the Prevention and Treatment of Hyperlipidemia
US8865876B2 (en) * 2008-06-02 2014-10-21 California Institute Of Technology Engineered lectin oligomers with antiviral activity

Also Published As

Publication number Publication date
AU782662B2 (en) 2005-08-18
JP2003528827A (ja) 2003-09-30
NO20024157L (no) 2002-10-30
EA007814B1 (ru) 2007-02-27
EA007217B1 (ru) 2006-08-25
US20090192081A1 (en) 2009-07-30
EP1261360B1 (en) 2009-12-16
US20100317601A1 (en) 2010-12-16
US20020147144A1 (en) 2002-10-10
US20070161557A1 (en) 2007-07-12
CN1427725A (zh) 2003-07-02
EA200401467A1 (ru) 2005-04-28
US7741274B2 (en) 2010-06-22
HUP0301003A3 (en) 2007-08-28
DE60140794D1 (de) 2010-01-28
EA005579B1 (ru) 2005-04-28
EP1261360A1 (en) 2002-12-04
KR20030025907A (ko) 2003-03-29
CA2401550A1 (en) 2001-09-07
US8735348B2 (en) 2014-05-27
HUP0301003A2 (hu) 2003-07-28
EP1261360A4 (en) 2004-03-10
BR0109027A (pt) 2003-06-03
AU3596201A (en) 2001-09-12
NZ521016A (en) 2005-08-26
ATE451929T1 (de) 2010-01-15
IL134830A0 (en) 2001-05-20
NO20024157D0 (no) 2002-08-30
IL151351A (en) 2012-04-30
PL361307A1 (en) 2004-10-04
WO2001064234A1 (en) 2001-09-07
ZA200206842B (en) 2003-07-28
EA200400376A1 (ru) 2005-06-30
MXPA02008569A (es) 2003-02-24
US20130096073A1 (en) 2013-04-18
US20100298216A1 (en) 2010-11-25
EA200200820A1 (ru) 2003-08-28
DK1261360T3 (da) 2010-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7741274B2 (en) Casein derived peptides and uses thereof in therapy
US20070203060A1 (en) Casein Derived Peptides And Therapeutic Uses Thereof
US7666996B2 (en) Casein derived peptides and uses thereof
US7435716B2 (en) Compounds pharmaceutical compositions and methods for treatment of bacteremia and/or septicemia
US11560417B2 (en) Isolated polypeptides of CD44 and uses thereof
CZ2004335A3 (cs) Peptidy odvozené od kaseinu a jejich použití pro léčení
US20240131111A1 (en) Composition of bl-8040
US8691760B2 (en) Peptides, pharmaceutical compositions comprising same and uses thereof
US20210023164A1 (en) Treatment of inflammation
EP3197913B1 (en) Alpha-1 anti-trypsin for treating liver diseases
US20050163790A1 (en) Method of treatment and agents useful for same