CZ2004335A3

CZ2004335A3 - Peptidy odvozené od kaseinu a jejich použití pro léčení

Info

Publication number: CZ2004335A3
Application number: CZ2004335A
Authority: CZ
Inventors: Zvi Sidelman
Original assignee: Chay 13 Medical Research Group N. V.
Priority date: 2001-08-30
Filing date: 2002-08-29
Publication date: 2004-07-14
Also published as: CA2458924A1; IL160548A0; WO2003018606A2; HUP0500995A3; EP1556074A2; EP1556074A4; ZA200401574B; PL375113A1; BR0212625A; HUP0500995A2; MXPA04001890A; CN1694719A; KR20040078639A; NO20040880L; WO2003018606A3; AU2002324323A2; WO2003018606A9; JP2005511499A

Description

1

···· ·· ·ν • ι ·

Peptidy odvozené od kaseinu a jejich použití pro léčení

Oblast techniky Předkládaný vynález se týká biologicky aktivních peptidů odvozených ze sekvencí nebo podobné sekvencím, které jsou identické s N-koncem frakce aSl mléčného kaseinu. Tyto peptidy jsou schopné stimulovat a zesilovat imunitní odpověď, ochranu proti virové infekci, upravovat množství cholesterolu v séru a podporovat krvetvorbu. Peptidy odvozené od kaseinu nejsou toxické a mohou se použít při léčbě a prevenci poruch imunity, hypercholesteremii, hematologických poruch a onemocnění spojených s viry.

Dosavadní stav techniky

Biologicky aktivní molekuly pocházející z potravy:

Vedle nutriční hodnoty řady potravin jisté frakce a produkty v trávící soustavě mají schopnost ovlivnit fyziologické děje. Některé z těchto částí, které nemají jen nutriční charakter, jsou v potravě přítomny ve svých aktivních formách. Jsou to například imunoglobuliny v mateřském mléku a v mlezivu, fytoestrogeny, které se nacházejí v potravě založené na sóje, polyfenolické antioxidanty pocházející z ovoce a vitaminů. Jiné části jsou obsažené v nutričních molekulách a uvolňují se v aktivní formě během trávení nebo zpracování potravin. Jsou to například antihypertenzní peptidy pocházející z laktoglobinu (popisuje se v publikaci

Kitts, D.D. (1999), Can. J. Physiol. Pharmacol. 72:4, 423 až 434).

Biologická aktivita mléčných proteinů: 2

• · I 2 • · I • · · · • Μ • · · • · · • · · Μ

Kasein, který je převládajícím mléčným proteinem, se podle tradiční definice skládá ze tří frakcí. Jsou to frakce α, β a γ v závislosti na jejich elektroforetické pohyblivosti (popisuje se v publikaci N. J. Hipp, a kol. (1952), Dairy Sci., 35:272). V současné době se kasein definuje podle aminokyselinových sekvencí každé podskupiny aSl, aS2, a a κ (popisuje se v publikaci W.N. Engel a kol., (1984), J. Dairy Sci. 67: 1599). Během trávení jsou kaseinové proteiny vystaveny proteolytickému štěpení kyselými proteázami, jako je chymosin (renin), trypsin a pepsin, přičemž vznikají kratší peptidy a dochází ke srážení mléka a výsledné proteinové fragmenty váží vápník. V několika studiích mléčných sloučenin se prokázala baktericidní aktivita spojená s kaseinem. V patentovém dokumentu USA č. 3 764 670 se popisují proteolytická štěpení kaseinu poskytující antibiotické vlastnosti proti mikroorganizmům. V izraelském patentu č. 42 863 se popisuje peptid získaný z kaseinu, který obsahuje 23 aminokyselin N-konce kaseinu a vykazuje antibakteriální aktivitu. Navíc se v případě kaseinu a jeho derivátů zvažují další fyziologicky aktivní vlastnosti, jako jsou opiátová aktivita a aktivita podobná aktivitě růstového faktoru (popisuje se v publikaci Kitts, D.D., (1999), tamtéž).

Aktivita upravující imunitu se také pozorovala u kaseinových peptidů. V publikaci Coste a kol. (1992, Immun. Lett. 33: 41-46) se pozorovalo zesílení množení krysích lymfocytů, které následovalo po léčbě peptidem získaným z C-konce kaseinu β. Avšak v žádné této studii se nezjistily u těchto kaseinových peptidů specifické sekvence, které jim propůjčují vlastnosti jiné než nutriční.

Krvetvorba při léčbě zhoubného bujení:

Po chemoterapii aplikované ve vysokých dávkách, zvláště po myeloablačnich dávkách chemoradioterapie podporované transplantaci vlastni kostní dřeně nebo kmenových buněk periferní krve (ASCT) nebo cizorodé kostní dřeně (BMT), jsou pacienti silně ohroženi pancytopenií. Granulocytopenie může vést v období bezprostředně po transplantaci ke vzniku vážných, někdy smrtelných, infekčních komplikací způsobených běžnými bakteriálními, virovými, plísňovými a parazitickými činidly. Podobně trombocytopenie často vede ke krvácení a někdy k dlouhodobé závislosti na krevních destičkách. Jakmile se vyvine rezistence vůči krevním destičkám, krvácení může ohrozit život a hemoragické komplikace jsou často smrtelné. Ohrožení způsobené granulocytopenií se může částečně předejít podpůrnými opatřeními a účinněji aplikací rekombinantních lidských cytokinů, které mohou zesílit obnovu granulocytů, zvláště aplikací faktoru podporujícího kolonie granulocytů (G-CSF) a faktoru podporujícího granulocytové makrofágové kolonie (GM-CSF). Tato činidla jsou velmi nákladná (přibližně 200 až 400 dolarů na den a pacienta) a často mají vedlejší účinky způsobující hypersenzitivní reakce, zvýšenou teplotu, bolesti kostí a vaskulární úbytkový syndrom zahrnující zánět osrdečníku a pohrudnice. Některé z těchto vedlejších účinků mohou být způsobeny jinými cytokiny, které se mohou uvolnit těmito krvetvornými růstovými faktory. Avšak u pacientů s nádorovými buňkami nesoucími receptory G-CSF nebo GM-CSF, což je u akutní a chronická myelodní leukemie a u myelodisplastických syndromů, je použití těchto krvetvorných růstových faktorů zakázáno. Zatímco hlavní zlepšení u léčených pacientů, kterým hrozí pancytopenie, se dosáhlo použitím cytokinů podporujících krvetvorbu, žádného zlepšení se nedosáhlo při léčbě trombocytopenie. Po chemoterapii ve vysokých dávkách a zvláště po ASCT jsou pacienti ohroženi trombocytopenií, která může trvat řadu měsíců, dokonce až tři roky, a někteří pacienti trpící trombocytopenií se nemusí 4 ·· · ·

nikdy vyléčit. Řada pacientů, která se dříve léčila četnými krevními produkty, se stává rezistentní vůči krevním destičkám a proto trombocytopenii není možné nikdy překonat, dokonce ani navzdory intenzivním a častým transfúzím krevních destiček od jednoho dárce. Rezistence vůči krevním destičkám a dlouhotrvající trombocytopenii představuje běžný způsob úmrtí v centrech ASCT po celém světě. V současné době se několik nových rekombinantních cytokinů, jako je rekombinantní lidský interleukin 3 (rhIL3) a rekombinantní lidský interleukin 6 (rhIL6), zkoumá jako potencionální činidlo pro zesílení megakaryocytopoézy a obnovu krevních destiček. Naneštěstí předběžné klinické studie ukázaly, že ačkoli rhIL3 a rhIL6 mohou zesílit obnovu krevních destiček, takové účinky nejsou v žádném případě dramatické a mohou trvat značně dlouho.

Je zřejmé, že dlouho trvající trombocytopenie představuje v současné době hlavní problém v klinických centrech transplantace kostní dřeně, pro který se nenašlo uspokojivé řešení.

Je proto nutné a velmi výhodné získat bezpečný, laciný, rychle účinný a dobře definovaný stimulátor krvetvorby a zvláště megakaryocytopoézy, zbavených shora uvedených omezení.

Trombopoetin (TPO) v regulaci krvetvorby a funkce destiček:

Zdá se, že TPO je hlavní regulátor produkce destiček in vivo, ačkoliv zvýšení množství růstového faktoru odvozeného z ledvin a odvozeného z jater při nedostatku destiček není způsobeno úpravou biosyntézy TPO v těchto orgánech. Spíše se zdá, že existuje „smyčka zpětné vazby", ve které množství destiček v oběhu určuje jak mnoho TPO v oběhu je dostupného pro kostní dřeň pro produkci destiček. Navíc bylo prokázáno, že TPO je záhy působící cytokin s důležitými mnohočetnými účinky: TPO samotný nebo v kombinaci s dalšími záhy působícími 5 5

• · · · cytokiny dokáže (i) podporovat životaschopnost a potlačovat apoptosu progenitorových buněk; (ii) regulovat funkci a produkci krvetvorných kmenových buněk; (iii) spouštět buněčné dělení u neaktivních buněk; (iv) vyvolávat diferenciaci a (v) podporovat tvorbu kolonií obsahujících granulocyty, erytrocyty, makrofágy a megakaryocyty (MK, CFU-GEMM) . Navíc TPO stimuluje produkci více omezených předků pro kolonie granulocyt/monocyt, megakaryocytů a erythroidů a stimuluje adhezi primitivní lidské kostní dřeně a megakaryocytických buněk k fibronektinu a fibrinogenu. Proto je TPO důležitý cytokin pro klinické odborníky na hematologii a transplantace: pro mobilizaci, zesílení a ex vivo expanzi kmenových buněk a determinovaných prekursorových buněk pro autologní a alogenní transplantace (popisuje se v publikaci von dem Borne, A.E.G.Kr., a kol., (1998) Thrombopoetin: its role in platelet disorders and as a new drug in clinical medicine. Bailliers Clin. Hematol. červen: 11(2), 427 až 445).

Kromě účinků TPO v krvetvorbě, tento účinný růstový faktor připravuje destičky pro různé agonisty a upravuje matricové interakce extracelulárních destiček. Ačkoliv to samo o sobě nezpůsobuje agregaci destiček, TPO podporuje ADP-vyvolanou agregaci, zejména druhou vlnu agregace, podporuje uvolňování okrouhlých tělísek (ADP, ATP, serotonin, atd.) a produkci tromboxanu B2, zvyšuje připojení destičky ke kolagenu a znásobuje trháním vyvolanou agregaci destiček. TPO také stimuluje aktivaci PMN, vyvolává uvolňování IL-8 a aktivuje produkci metabolitů kyslíku, čímž pravděpodobně zvyšuje obranu proti bakteriím.

Klinické studie ukázaly hodnotu TPO v porozumění a léčení různých hematologických stavů. U pacientů s idiopatickou aplastickou anémií (AA) přetrvávají zvýšená množství TPO dokonce i po dočasném vymizení projevů nemoci po imunosupresivní terapii, což ukazuje na poruchu krvetvorby. Stejným způsobem jsou zvýšena množství TPO i v jiných formách aplastické trombocytopenie, ale ne při stavech se zvýšených odbouráváním destiček. Je zjevné, že zvýšení produkce TPO je v případech destruktivní trombocytopenie nedostatečné. Proto TPO není pouze terapeutickou možností pro aplastii, ale také pro destruktivní trombocytopenii.

Trombopoetická činidla vyvolávají v klinické praxi velký zájem pro prevenci a/nebo léčení patologické nebo léčením vyvolané trombocytopenie a jako náhrada transfúze destiček. Z testovaných cytokinů jsou všechny s výjimkou IL-11, který je mírně účinný, nepřijatelné pro klinické použití. 0 TPO se předpokládá, že se stane cytokinem první volby pro léčení trombocytopenie. V poslední době je dostupný rekombinantní lidský TPO (Genentech), což umožňuje přesné farmakokinetické stanovení a klinické zkoušky. Tak případná použití TPO zahrnují oblasti podpůrné péče (po chemoterapii nebo radioterapii, transplantace kostní dřeně a transplantace kmenových buněk), hematologických onemocnění (AA, myelodysplasie, vrozené a získané trombocytopenie), onemocnění jater, transfúzi (expanzi, odebírání, mobilizaci a skladování destiček) a chirurgii (včetně transplantace jater). Zvláštní zájem vyvolává případné použití směsi TPO/EPO/G-CSF pro myelodysplasii, kombinace G-CSF a TPO pro mobilizaci periferních kmenových buněk a TPO v odběru CD 34+ buněk a ex vivo expanzi megakaryocytů pro vynikající rekonstituci destiček. Nicméně podobně jako ostatní léky pro krvetvorbu uvažované pro klinické použití, TPO je v terapeuticky účinných množstvích nákladný a potenciálně antigenní. Proto by bylo výhodné mít bezpečný, nenákladný a snadno dostupný stimulátor trombopoézy schopný rozšířit aktivitu TPO.

Frakce aSl kaseinu:

Frakce aSl kaseinu se může získat z mléčných proteinů použitím různých metod (popisuje se v publikacích • · ♦ · • · · · · ♦ · · n ······· / ····· ·· · · • · · A · ♦ D. G. Schmidth a T. A. J. Paynes (1963) , Biochim. , Biophys. Acta, 78: 492, M. P. Thompson a C. A. Kiddy (1964) , J. Dairy Sci., 47 : 626, J. C. Mercier, a kol. (1968), Bull. Soc. Chim. Biol. 50 : 521) a úplná aminokyselinová sekvence frakce aSl kaseinu se popisuje v publikaci J. C. Mercier akol. (1971) Eur. J. Biochem. 23: 41) . Genomové a kódující sekvence frakce aSl telecího kaseinu se také klonovaly a sekvenovaly s použitím metod rekombinantní DNA (popisuje se v publikaci D. Koczan, a kol. (1991), Nucl. Acids Res. 19(20): 5591, McKnight, R. A., a kol. (1989), J. Dairy Sci. 72: 2464-73). V publikaci J. C. Mercier, a kol. (1970), Eur. J. Biochem. 16: 439, P. L. H. McSweeney a kol. (1993), J. Dairy Res., 60: 401) se dokumentovalo, ačkoli po požití celých mléčných proteinů dochází k absorpci ve střevech, proteolytické štěpení a identifikace fragmentů N-konce z frakce aSl kaseinu a výskyt tohoto fragmentu v plazmě savců (Fiat, A. M., a kol. (1998) Biochimie, 80(2):2155-65). V publikaci Meisel, H. and Bockelmann, W. (1999), Antonie Van Leeuwenhoek, 76:207-15) se popisuje detekce aminokyselinových sekvencí imunologických peptidů, kasokininů a kasomorfinů, v peptidech uvolněných štěpením frakci a a β kaseinu bakteriemi, které štěpí mléčné kyseliny. Zajímavá je anti-agregační a trombolytická aktivita, kterou vykazují C-terminální části frakcí α-kaseinu a κ-kaseinu (popisuje se v publikaci Chabance, B. a kol. (1997), Biochem. Mol. Biol. Int. 42(1) 77-84, Fiat AM. a kol. (1993), J. Dairy Sci. 76(1):301-310). Předchozí studie zaznamenaly bioaktivní peptidy uschované v aminokyselinové sekvenci N-konce aSl, ale nezmiňuje se použití těchto proteinových fragmentů, specifických sekvencí nebo definovaných syntetických peptidů při zesílení krvetvorby, prevenci virové infekce nebo regulaci vzniku autoimunitního onemocnění.

Podstata vynálezu

Shrnutí vynálezu Předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení autoimunitního onemocnění, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení virového onemocnění, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence virového onemocnění, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuj e. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání krvetvorby, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání megakaryocytopoézy, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného 9 • · · · · * * • · · · * · ·»···· * tM · · · · · · • 1 1 • · · · • · · · · · * • · · z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuj e. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání erytropoézy, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu oíSI pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání leukocytopoézy, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání trombocytopoézy , přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu oíSI pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání proliferace plasmových buněk, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuj e. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání proliferace dendritických buněk, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuj e. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání proliferace makrofágů, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení trombocytopenie, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální potřebuje. části kaseinu aSl pacientovi, který to Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení pancytopenie, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení granulocytopenie, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení hyperlipidemie, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuj e. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení cholesteremie, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení glukosurie, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení cukrovky, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. 11 Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení AIDS, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení infekce HIV, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuj e. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení stavů souvisejících s myeloablačními dávkami chemoradioterapie podpořené transplantací vlastní kostní dřeně nebo kmenových buněk periferní krve (ASCT) nebo transplantace cizorodé kostní dřeně (BMT), přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob léčení stavu léčitelného erytropoetinem, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob umocnění účinku erytropoetinu, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob léčení stavu léčitelného trombopoetinem, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuj e. 12 ·· «··· «· · • · · · · · i · · ♦ * · * « ··· # * · · «···· • · · · · · · · t· ·· · · · Dále předkládaný vynález poskytuje způsob umocnění účinku trombopoetinu, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob zesílení mobilizace periferních kmenových buněk, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení autoimunitního onemocnění, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení virového onemocnění, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci virové infekce, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání krvetvorby, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace a diferenciace 13 13 • ♦ ·« · ·· · • · * • · * • · * krvetvorných kmenových buněk, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání megakaryocytopoézy, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání erytropoézy, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání leukocytopoézy, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání trombocytopoézy, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace plasmových buněk, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace dendritických buněk, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace makrofágů, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení trombocytopenie, který 14

obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu ctSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení pancytopenie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení granulocytopenie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení hyperlipidemie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení cholesteremie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení glukosurie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení cukrovky, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení AIDS, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení infekce HIV, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci a léčení stavů spojených s myeloblačními dávkami chemoradioterapie, které jsou podpořeny transplantací vlastní kostní dřeně (ASCT) nebo cizorodé kostní dřeně (BMT), přičemž farmaceuticky prostředek obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro léčení stavu léčitelného trombopoetinem, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro umocnění účinku trombopoetinu, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro zlepšení mobilizace periferních kmenových buněk, který obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání krvetvorby, který obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk, který obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk, který obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání megakaryocytopoézy, který obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání erytropoézy, který obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání leukocytopoézy, který obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání trombocytopoézy, který obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení trombocytopenie, který obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení pancytopenie, který obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení granulocytopenie, který obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro léčení nebo prevenci stavů vybraných ze skupiny sestávající z autoimunitního onemocnění nebo stavu, virového onemocnění, virové infekce, hematologického onemocnění, hematologické nedostatečnosti, trombocytopenie, pancytopenie, granulocytopenie, hyperlipidemie, hypercholesterolemie, glukosurie, hyperglykémie, cukrovky, AIDS, HIV-1, poruch pomocných T-buněk, nedostatečnosti dendritických buněk, nedostatečnosti makrofágů, poruch krvetvorných kmenových buněk včetně destiček, lymfocytů, poruch plasmových buněk a poruch neutrofilů, předleukemických stavů, leukemických stavů, poruch imunitního systému způsobených chemoterapií nebo radioterapií, poruch lidského imunitního systému způsobených léčením nemocí souvisejících s nedostatkem imunity a bakteriálními infekcemi, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro léčení nebo prevenci stavů vybraných ze skupiny sestávající z hematologického onemocnění, hematologické nedostatečnosti, trombocytopenie, pancytopenie, granulocytopenie, nedostatečnosti dendritických buněk, nedostatečnosti makrofágů, poruch krvetvorných kmenových buněk včetně destiček, lymfocytů, poruch plasmových buněk a poruch neutrofilů, předleukemických stavů, leukemických stavů, myelodysplastického syndromu, aplastické anemie a nedostatečnosti kostní dřeně, který obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob zlepšení kolonizace darovaných krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci, přičemž tento způsob zahrnuje léčení dárce těchto darovaných krevních kmenových buněk peptidem získaným z N-terminální části kaseinu aSl před darováním a implantací darovaných krevních kmenových buněk příjemci. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob zlepšení kolonizace darovaných krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci, přičemž tento způsob zahrnuje úpravu těchto darovaných krevních kmenových buněk peptidem získaným z N-terminální části kaseinu aSl před implantací darovaných krevních kmenových buněk příjemci. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob zlepšení kolonizace krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci, přičemž tento způsob zahrnuje úpravu těchto krevních kmenových buněk peptidem získaným z N-terminální části kaseinu aSl před implantací krevních kmenových buněk příjemci. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob zlepšení kolonizace darovaných krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci, přičemž tento způsob zahrnuje léčení dárce těchto darovaných krevních kmenových buněk peptidem získaným z N-terminální části kaseinu aSl před a trombopoetinem darováním a implantací darovaných krevních kmenových buněk příjemci. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob zlepšení kolonizace darovaných krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci, přičemž tento způsob zahrnuje úpravu těchto darovaných krevních kmenových buněk peptidem získaným z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetinem před implantací darovaných krevních kmenových buněk příjemci. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob zlepšení kolonizace krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci, přičemž tento způsob zahrnuje úpravu těchto krevních kmenových buněk peptidem získaným z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetinem před implantací krevních kmenových buněk příjemci. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro prevenci nebo léčení autoimunitního onemocnění. 19 ·«·· Dále předkládaný vynález popisuje použiti peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro prevenci nebo léčení virového onemocněni. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro prevenci virového onemocnění. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro vyvolání krvetvorby. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro vyvolání megakaryocytopoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro vyvolání erytropoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro vyvolání leukocytopoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro vyvolání trombocytopoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro vyvolání proliferace plasmových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro vyvolání proliferace dendritických buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro vyvolání proliferace makrofágů. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro prevenci nebo léčení trombocytopenie. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro prevenci nebo léčení pancytopenie. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro prevenci nebo léčení granulocytopenie. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro prevenci nebo léčení hyperlipidemie. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro prevenci nebo léčení cholesteremie. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro prevenci nebo léčení glukosurie. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro prevenci nebo léčení cukrovky. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro prevenci nebo léčení AIDS. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro prevenci nebo léčení infekce HIV. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro prevenci a léčení stavů spojených s myeloblačními dávkami 21 21 ·« ···· • · · ♦ • · · « ·· 4 · • fc » • t · • * * · • · · ···« • · · ·· * chemoradioterapie, které jsou podpořeny transplantací vlastní kostní dřeně (ASCT) nebo cizorodé kostní dřeně (BMT). Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro léčení stavů léčitelných trombopoetinem. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro umocnění účinku trombopoetinu. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro zesílení mobilizace periferních kmenových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro zlepšení kolonizace darovaných kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léku pro zlepšení kolonizace krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení autoimunitního onemocnění. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení virového onemocnění. Dále předkládaný vynález popisuje použiti farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní -složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení virové infekce. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání krvetvorby. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání megakaryocytopoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání erytropoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání leukocytopoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání trombocytopoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání proliferace plasmových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu nosič pro vyvolání proliferace Dále předkládaný vynález prostředku obsahujícího jako z N-terminální části kaseinu nosič pro vyvolání proliferace Dále předkládaný vynález prostředku obsahujícího jako z N-terminální části kaseinu nosič pro prevenci nebo léčení Dále předkládaný vynález prostředku obsahujícího jako z N-terminální části kaseinu nosič pro prevenci nebo léčení Dále předkládaný vynález prostředku obsahujícího jako z N-terminální části kaseinu nosič pro prevenci nebo léčení Dále předkládaný vynález prostředku obsahujícího jako z N-terminální části kaseinu nosič pro prevenci nebo léčení Dále předkládaný vynález prostředku obsahujícího jako z N-terminální části kaseinu nosič pro prevenci nebo léčení Dále předkládaný vynález prostředku obsahujícího jako z N-terminální části kaseinu nosič pro prevenci nebo léčení Dále předkládaný vynález prostředku obsahujícího jako z N-terminální části kaseinu nosič pro prevenci nebo léčení aSl a farmaceuticky přijatelný dendritických buněk, popisuje použití farmaceutického aktivní složku peptid získaný aSl a farmaceuticky přijatelný makrofágů. popisuje použití farmaceutického aktivní složku peptid získaný aSl a farmaceuticky přijatelný trombocytopenie. popisuje použití farmaceutického aktivní složku peptid získaný aSl a farmaceuticky přijatelný pancytopenie. popisuje použití farmaceutického aktivní složku peptid získaný aSl a farmaceuticky přijatelný granulocytopenie. popisuje použití farmaceutického aktivní složku peptid získaný aSl a farmaceuticky přijatelný hyperlipidemie. popisuje použití farmaceutického aktivní složku peptid získaný aSl a farmaceuticky přijatelný cholesteremie. popisuje použití farmaceutického aktivní složku peptid získaný aSl a farmaceuticky přijatelný glukosurie. popisuje použití farmaceutického aktivní složku peptid získaný aSl a farmaceuticky přijatelný cukrovky. 24

• I MM Dále předkládaný vynález popisuje použiti farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení AIDS. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení infekce HIV. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení stavů spojených s myeloblačními dávkami chemoradioterapie, které jsou podpořeny transplantací vlastní kostní dřeně (ASCT) nebo cizorodé kostní dřeně (BMT). Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro léčení stavu léčitelného trombopoetinem. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro umocnění účinku trombopoetinu. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro zlepšení kolonizace darovaných krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro zlepšení kolonizace krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetin a farmaceuticky přijatelný nosič pro zlepšení mobilizace periferních kmenových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetin a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání krvetvorby. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetin a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetin a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetin a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání megakaryocytopoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetin a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání erytropoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetin a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání leukocytopoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetin a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání trombocytopoézy. 26 • · · · • * · ···< Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetin a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení trombocytopenie. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetin a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení pancytopenie. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetin a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení granulocytopenie. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení stavů vybraných ze skupiny sestávající z autoimunitního onemocnění nebo stavu, virového onemocnění, virové infekce, hematologického onemocnění, hematologické nedostatečnosti, trombocytopenie, pancytopenie, granulocytopenie, hyperlipidemie, hypercholesterolemie, glukosurie, hyperglykémie, cukrovky, AIDS, HIV-1, poruch pomocných T-buněk, nedostatečnosti dendritických buněk, nedostatečnosti makrofágů, poruch krvetvorných kmenových buněk včetně destiček, lymfocytů, poruch plasmových buněk a poruch neutrofilů, předleukemických stavů, leukemických stavů, poruch imunitního systému způsobených chemoterapií nebo radioterapií, poruch lidského imunitního systému způsobených léčením nemocí souvisejících s nedostatkem imunity a bakteriálními infekcemi. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetin a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčeni stavů vybraných ze skupiny sestávající z hematologického onemocnění, hematologické nedostatečnosti, trombocytopenie, pancytopenie, granulocytopenie, nedostatečnosti dendritických buněk, nedostatečnosti makrofágů, poruch krvetvorných kmenových buněk včetně destiček, lymfocytů, poruch plasmových buněk a poruch neutrofilů, předleukemických stavů, leukemických stavů, myelodysplastického syndromu, aplastické anemie a nedostatečnosti kostní dřeně. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetin a farmaceuticky přijatelný nosič pro zlepšení kolonizace darovaných krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetin a farmaceuticky přijatelný nosič pro zlepšení kolonizace krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci. V dalších rysech v preferovaných provedeních předkládaného vynálezu, které jsou popsány dále, je peptid fragment získaný fragmentací kaseinu aSl. V dalších rysech v popsaných preferovaných provedeních je peptid syntetický peptid. V dalších rysech v popsaných preferovaných provedeních má peptid sekvenci uvedenou v jedné ze sekvencí sekvence id. č. 1 až 25. Dále předkládaný vynález poskytuje čištěný peptid, který má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze sekvence id. č. 1 až 25. peptid Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek obsahující čištěný peptid, který má 28 28 • · • · · * • * Μ · * aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze sekvence id. č. 1 až 25 a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek obsahující trombopoetin a čištěný peptid, který má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze sekvence id. č. 1 až 25 a farmaceuticky přijatelný nosič.

Vynález se úspěšně zabývá nedostatky v současně známém uspořádání tím, že popisuje peptidy, které jsou vhodné pro léčení lidského onemocnění a které se získaly z N-terminální části kaseinu aSl a nevykazují stanovitelnou toxicitu a mají vysokou terapeutickou účinnost.

Stručný popis obrázků

Vynález je zde popsán pouze cestou příkladů vynálezu s odkazem na přiložené obrázky. Specifické odkazy na detaily na obrázcích zdůrazňují, že podrobnosti jsou zobrazeny způsobem příkladu a pouze pro účely názorné diskuse výhodných provedení vynálezu a jsou předkládány způsobem, který se považuje za nejlépe použitelný a snadno srozumitelný popis principů a pojmových hledisek vynálezu. Vzhledem k tomu se neusilovalo o hlubší zobrazení strukturních detailů vynálezu, než je nutné pro základní pochopení vynálezu. Odborníkovi je z popisu podpořeného obrázky zřejmé, jak je možné několik forem vynálezu využít v praxi. V obrázcích:

Obrázek 1 zobrazuje stimulaci aktivity buněk přirozených zabíječů (NK) v kultivovaných buňkách myší kostní dřeně peptidy získanými z přirozeného kaseinu. Lýze cílových buněk YAC značených 35S pomocí kultivovaných buněk myší kostní dřeně inkubovaných v přítomnosti nebo v nepřítomnosti 100 pg/ml peptidů získaných z přirozeného kaseinu se vyjádřila jako část celkové radioaktivity uvolněné z buněk YAC do supernatantu kultury (procento uvolněného 35S). Obrázek 1 představuje • ·

• · ♦ • · · · · aktivitu NK v poměru efektor : cílová buňka rovná se 25 : 1 a 50 : 1.

Obrázky 2a a 2b zobrazují stimulaci aktivity buněk přirozených zabiječů (NK) v kultivovaných lidských kmenových buňkách periferní krve (PBSC) peptidy získanými z přirozeného kaseinu. Lýze cílových buněk K562 značených 35S pomocí kultivovaných lidských PBSC z faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (G-CSF) upravených donorů inkubovaných v nepřítomnosti nebo ve zvyšujících se koncentracích (5 pg až 500 pg na mililitr) peptidů získaných z přirozeného kaseinu se vyjádřila jako část celkové radioaktivity uvolněné z buněk K562 do supernatantu kultury (procento uvolněného 35S) . Obrázek 2a představuje aktivitu NK dvou krevních vzorků od stejného pacienta, inkubovaných v různých poměrech efektor : cílová buňka (1 : 25 a 1 : 50). Obrázek 2b představuje aktivitu krevních vzorků od normálního a postiženého dárce inkubovaných ve stejných poměrech efektor : cílová buňka. Čtverce představují poměr efektor : cílová buňka 100 : 1, kosočtverce představují poměr efektor : cílová buňka 50 : 1.

Obrázky 3a až 3c znázorňují stimulaci proliferace buněk přirozených zabíječů (NK) a T-lymfocytů (T) z kultivovaných lidských kmenových buněk periferní krve (PBSC) peptidy získanými z přirozeného kaseinu. Proliferace buněk NK a T v kultivovaných PBSC, které pocházejí z dárce ošetřeného faktorem stimulujícím kolonie granulocytů a které se inkubovaly s peptidy nebo bez nich, jenž se získaly z přirozeného kaseinu, se vyjádřila jako procento (%) buněk vázajících se na anti-CD3/FITC fluorescenční protilátku UCHTi proti T buňkám nebo anti-CD56/RPE fluorescenční protilátku MOC-1 proti buňkám NK (DAKO A/S, Dánsko). Jako kontroly slouží FITC a protilátka proti myšímu IgG konjugovaná s RPE. Obrázek 3a znázorňuje procento kultivovaných lidských PBSC, které se váží na protilátku CD5g (5 nezávislých vzorků), po 10 dnech inkubace s peptidy nebo bez nich (kontrola) v koncentraci 100 pg/ml peptidů z přirozeného kaseinu. Obrázek 3b znázorňuje procento kultivovaných buněk PBSC, které se vážou na fluorescenční anti-CD3 protilátku (buňka T) , po 14 dnech inkubace s peptidy nebo bez nich (kontrola) v koncentraci 100 pg/ml peptidů z přirozeného kaseinu. Obrázek 3c znázorňuje procento kultivovaných buněk PBSC, které se vážou na fluorescenční anti-CD3 protilátku (buňka T) , a buňky vážící se na CD3 a CD56 (buňky T a buňky NK) protilátky po 28 dnech inkubace s peptidy nebo bez nich (kontrola) v koncentraci 100 pg/ml peptidů z přirozeného kaseinu.

Obrázek č. 4 znázorňuje stimulaci aktivity buňky přirozeného zabiječe (NK) v kultivovaných lidských kmenových buňkách periferní krve (PBSC) syntetickými peptidy, které se získaly z kaseinu. Lýze cílových buněk K562 značených 35S kultivovaným lidským PBSC (pochází z pacientů s karcinomem prsu) inkubované bez (0 pg) nebo se vzrůstajícími koncentracemi (10 až 500 pg/ml) syntetických peptidů získaných z kaseinu se vyjadřuje jako část celkové radioaktivity uvolněné z buněk K562 do supernatantu kultury (procento uvolnění). Peptidy reprezentují sekvence N-konce 1 až 10 (la, kosočtverce) , 1 až 11 (2a, čtverce) a 1 až 12 (3a, trojúhelníky) prvních aminokyselin N-terminální části kaseinu aSl (sekvence syntetických peptidů se popisují v tabulce č. 3 dále v textu).

Obrázky 5a až 5c znázorňují stimulaci proliferace kultivovaných lidských buněk různého původu peptidy získanými z přirozeného kaseinu. Proliferace kultivovaných lidských buněk po 14 až 21 dnech inkubace se vzrůstajícími koncentracemi peptidů získanými z přirozeného kaseinu se vyjadřuje jako množství [3H]-thymidinu začleněného do vzorku. Obrázek 5a znázorňuje začlenění radioaktivního značení do dvou vzorků (PBSC 1, čtverce, 15 dní inkubace; a PBSC 2, kosočtverce, 20 dní inkubace) lidských kmenových buněk z periferní krve inkubovaných s nebo bez (kontrola) peptidy získanými z přirozeného kaseinu v koncentraci 50 až 600 pg/ml. Obrázek 5b znázorňuje začlenění [3H]-thymidinu do kultivovaných buněk lidské kostní dřeně po 21 dnech inkubace s nebo bez (kontrola) peptidy získanými z přirozeného kaseinu v koncentraci 50 až 600 pg/ml. Dárci kostní dřeně byli pacienti s dočasným vymizením projevů zhoubného bujení (BM Auto, uzavřené čtverce, BM 1, trojúhelníky a BM 2, otevřené čtverce) nebo zdraví dobrovolníci (normální BM, kosočtverce). Obrázek 5c znázorňuje začlenění [3H]-thymidinu do kultivovaných buněk lidské pupečníkové krve po 14 dnech inkubace s nebo bez (kontrola) peptidy získanými z přirozeného kaseinu v koncentraci 50 až 1 000 pg/ml. Buňky pupečníkové krve se získaly od dvou nezávislých dárců (C.B. 1, trojúhelníky, C.B. 2, čtverce).

Obrázek 6 ukazuje tabulku znázorňující proliferaci předchůdců krevních buněk z lidské kostní dřeně a pupeční krve jako odezvu na inkubaci s peptidy odvozenými z přirozeného kaseinu. Relativní počet buněk x 104 v jednom mililitru odpovídající proliferaci kultivovaných buněk se stanovil počítáním buněk, jak se popisuje v příkladech provedení vynálezu dále v textu. Kostní dřeň ze zdravých dobrovolníků (kostní dřeň) a pupečníkové krev odebraná při normálních porodech (pupečníkové krev) se inkubovaly po dobu 13 dní (pupečníkové krev) nebo 14 dní (kostní dřeň) v přítomnosti růstových faktorů a AB séra s nebo bez peptidů získaných z přirozeného kaseinu ve vzrůstajících koncentracích 25 až 500 pg/ml.

Obrázek 7 ukazuje tabulku znázorňující vliv in vitro inkubace se syntetickými peptidy získanými z přirozeného kaseinu na relativní distribuci megakaryocytických, erytroidních, plasmových a dendritických buněk (různé počty) v CFU-GEMM koloniích z progenitorických buněk z myší kostní dřeně. Buňky byly spočteny v makroskopických koloniích rostoucích z buněk myší kostní dřeně připravené podobně jako již dříve popsané CFU-GEMM kolonie. Buňky byly inkubovány s faktorem krvetvorby a 25 pg nebo více syntetických peptidů získaných z kaseinu po dobu 14 dnů. Různé počty byly vyjádřeny jako procenta celkového množství buněk představovaná jednotlivými typy buněk.

Obrázek 8 znázorňuje stimulaci obnovy periferních bílých krevních buněk u myeloblatovaných myší po transplantaci kostní dřeně jako odezvou na aplikaci peptidů získaných z přirozeného kaseinu. Počty buněk znázorňují počet bílých krevních buněk (x 106 v jednom mililitru, k počítání se použil hemocytometr). Myši (skupina obsahovala 6 jedinců) se vystavily subletální dávce radiace a následující den se podrobily transplantaci syngenní kostní dřeně (jedné myši se aplikovalo 106 buněk) a intravenózně se každé myši aplikoval 1 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu (peptidy: čtverce) nebo o den později 1 mg lidského sérového albuminu (kontrola: kosočtverce).

Obrázek 7 (z IL01 00198) chybí.

Obrázek 9 znázorňuje stimulaci obnovy krevních destiček u myeloblatovaných myší po transplantaci kostní dřeně jako odezvu na léčení peptidy získanými z přirozeného kaseinu. Počet krevních destiček (PLT) reprezentuje počet trombocytů (x 106 v jednom mililitru, jak se stanovilo použitím hemocytometru) . Myši (skupina obsahovala 60 jedinců) se vystavily letálni dávce radiace a v den 1 se podrobily transplantaci syngenní kostní dřeně (jedné myši se aplikovalo 106 buněk) a intravenózně se každé myši aplikoval 1 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu (peptidy, kosočtverce) nebo 1 mg lidského sérového albuminu (kontrola, čtverce).

Obrázky 10a až lOf znázorňuje průchod a pohlcení peptidů získaných z přirozeného kaseinu konjugovaných s FITC do jádra kultivovaných lidských T-lymfocytů, jak se zaznamenalo fluorescenční mikroskopií. F1 a F2 jsou stejné frakce peptidů získaných z přirozeného kaseinu konjugovaných s FITC. Buňky

Sup-Τχ se inkubovaly se 100 pg v jednom mililitru peptidů získaných z přirozeného kaseinu konjugovaných s FITC, jak se popisuje v příkladech provedení vynálezu dále v textu. Ve stanoveném čase se z buněk promytím odstranilo volné radioaktivní značení. Buňky se fixovaly ve formalinu a připravily se pro pozorování a záznam laserovým snímáním konfokální mikroskopií. Obrázky 10a až lOf jsou vybrané obrázky buněk z postupných inkubačních časů znázorňující peptidy získané z přirozeného kaseinu konjugované s FITC, jak procházejí membránou buněk Sup-Τι (obrázky 10a a 10b) a hromadí se v jádru (obrázky 10c až lOf).

Obrázek 11 znázorňuje tabulku zobrazující stimulaci proliferace buněk Sup-Τι lymfocytů při odezvě na inkubaci s peptidy získanými z přirozeného kaseinu. Buňky Sup-Τχ (5000 v jedné jamce) se inkubovaly se vzrůstajícími koncentracemi peptidů získanými z přirozeného kaseinu (50 až 1000 pg/ml). V určitém čase po kultivaci se stanovil jejich počet v jamkách a vystavily se pulsům s [3H] -thymidinem po dobu 18 hodin. Index proliferace je poměr průměru začlenění [3H]-thymidinu do buněk kultivovaných s peptidy získanými z přirozeného kaseinu (trojíce vzorků) děleno začleněním do buněk kultivovaných bez peptidů získaných z přirozeného kaseinu (kontrola).

Obrázek 12 zobrazuje tabulku znázorňující inhibici infekce HIV-1 lymfocytů CEM peptidy získanými z přirozeného kaseinu. Buňky CEM buď přišly do kontaktu s virem HIV-1, který se předem inkuboval s peptidy získanými z přirozeného kaseinu (3 hodiny), nebo se předem inkubovaly po stanovený počet hodin (24 a 48 hodin) se vzrůstající koncentrací peptidů získaných z přirozeného kaseinu (50 až 1000 pg/ml) před kontaktem s virem HIV-1, jak se popisuje v příkladech provedení vynálezu, které následují dále v textu. Patnáctý den po infekci se stanovil počet buněk a testovala se vážnost infekce HIV-1 testem za použití antigenu P24, jak se popisuje v příkladech provedení vynálezu dále v textu. Jako kontroly sloužila kultura IF: buňky CEM, které přišly do kontaktu s virem HIV-1, aniž se předem ošetřily peptidy získanými z přirozeného kaseinu, a UIF: buňky CEM kultivované za stejných podmínek bez peptidů získaných z přirozeného kaseinu a aniž byly v kontaktu s virem HIV-1.

Obrázek 13 zobrazuje tabulku znázorňující inhibici infekce HIV-1 lymfocytů CEM syntetickými peptidy získanými z kaseinu. Buňky CEM buď přišly do kontaktu s virem HIV-1, který se předem inkuboval s různými koncentracemi (10 až 500 pg/ml) syntetických peptidů získaných z přirozeného kaseinu (IP, 3P a 4P) po dobu 3 hodin (v přítomnosti peptidů), jak se popisuje v příkladech provedení vynálezu, které následují dále v textu. Sedmý den po infekci se stanovil počet buněk a testovala se vážnost infekce HIV-1 testem za použití antigenu P24, jak se popisuje v příkladech provedení vynálezu dále v textu. Jako kontroly sloužila kultura IF, což jsou buňky CEM, které přišly do kontaktu s virem HIV-1, aniž se předem ošetřily peptidy získanými z přirozeného kaseinu.

Obrázek 14 znázorňuje prevenci peptidy získanými z přirozeného kaseinu před cukrovkou typu I (IDDM) u samic neobézních diabetických (NOD) myší. Po dobu pěti týdnů se u myší NOD, kterým se aplikovala jednou (trojúhelníky a čtverce) nebo dvakrát týdně injekce 100 pg peptidů získaných z přirozeného kaseinu (celkem 5 nebo 10 injekcí), a u neléčené kontroly, sledovala glukosurie v intervalu 365 dní po léčbě. U všech kontrol došlo ke glukosurii a zvířata následně zemřela.

Obrázek 15 znázorňuje snížení způsobené syntetickými peptidy získanými z kaseinu v případě stravou vyvolané hypercholesterol/hyperlipidemie u samic C57 Bl/6 myší. Celkové množství cholesterolu (TC), lipoproteinů s vysokou hustotou (HDL) a lipoproteinů s nízkou hustotou (LDL) bylo testováno v krvi spojené ze dvou (2) myší na vzorek od hypercholesterol/hyperlipidemických myší dostávajících (intraperitonálně) peptidy B, C, 2a nebo 3P získané z kaseinu 35

• · « · nebo nedostávaly nic (kontrola). „Normální" vzorky představují kontrolní myši nekrmené aterogenní stravou.

Obrázek 16 znázorňuje tabulku zobrazující stimulaci krvetvorby u pacientů trpících karcinomem jako odezvu na injekce peptidů získaných z přirozeného kaseinu. V periferní krvi z pěti pacientů ženského pohlaví trpících karcinomem, kterým se aplikuje nebo se aplikovala chemoterapie, jak se popisuje shora v textu, se stanovil celkový počet bílých krvinek (WBC, x 103) , krevních destiček (PLT, x 103) , erytrocytů (RBC, x 103) hemoglobinu (vyjádřeno v gramech na decilitr) před (n) a po (n +...) injekcích s peptidy získanými z přirozeného kaseinu aplikovaných do svalu, jak se popisuje shora v textu. Pacient 1 je ve vztahu s G.T., pacient 2 je ve vztahu s E.C., pacient 3 je ve vztahu s E.S., pacient 4 je ve vztahu s J.R. a pacient 5 je ve vztahu s D.M.

Obrázek 17 znázorňuje stimulaci trombocytopoézy pomocí peptidů získaných z přirozeného kaseinu u pacienta trpícího rezistencí na krevní destičky při akutní myeloidní leukémii (M-l). Obnova trombocytů se vyjádřila jako změna obsahu krevních destiček v periferní krvi (PLA, x 106 v jednom mililitru). Výpočet se provedl stejným způsobem uvedeným shora v textu v označených intervalech po injekci obsahující 100 pg peptidů získaných z přirozeného kaseinu zavedené do svalu (jak se popisuje v části příkladů dále v textu).

Obrázek 18 znázorňuje stimulaci trombocytopoézy pomocí peptidů získaných z přirozeného kaseinu u pacienta trpícího rezistencí na krevní destičky při akutní myeloidní leukémii (M-2). Obnova trombocytů se vyjádřila jako změna obsahu krevních destiček v periferní krvi (PLA, x 106 v jednom mililitru). Výpočet se provedl stejným způsobem uvedeným shora v textu v označených intervalech po injekci obsahující 100 pg peptidů získaných z přirozeného kaseinu zavedené do svalu (jak se popisuje v části příkladů dále v textu).

Popis preferovaných provedení Předkládaný vynález jsou biologicky aktivní peptidy, které se získaly ze sekvencí nebo jsou těmto sekvencím podobné, přičemž uvedené sekvence jsou stejné jako N-konec části aSl mléčného kaseinu, prostředky obsahující uvedené peptidy a způsoby jejich využití například při stimulaci a zesílení imunitní odezvy, ochrany proti virové infekci, upravení množství cholesterolu v krvi a stimulaci krvetvorby. Peptidy získané z kaseinu nejsou toxické a mohou se použít při léčení a prevenci například poruch imunity, hypercholesteremie, hematologických poruch a onemocnění spojených s viry.

Principy a postupy podle vynálezu jsou srozumitelnější s odkazy na obrázky a doprovodnými popisy. Dříve než se vysvětlí detailněji alespoň jedno provedení vynálezu, je nutné porozumět, že vynález není omezen svým využitím na detaily uvedené v následujícím popisu nebo v části příkladů. Vynález je schopen jiných provedeních nebo se zavádí do praxe nebo se provádí různými způsoby. Také je nutné porozumět, že zde uvedené fráze a termíny se používají pro účely popisu a nepovažují se za limitující.

Zde používaný termín „léčení" zahrnuje podstatnou inhibici, zpomalení nebo zvrácení postupu onemocnění, podstatné zlepšení klinických symptomů onemocnění.

Termín „peptid" zahrnuje přirozené peptidy (buď degradační produkty, uměle syntetizované peptidy nebo rekombinantní peptidy) a napodobeniny peptidů (typicky, uměle syntetizované peptidy), jako jsou peptoidy a semipeptoidy, které jsou analogy peptidů. Tyto analogy mohou například vykazovat úpravy, které činí peptidy v těle stabilnější. Takové úpravy zahrnují, ale nejsou omezeny na cyklizaci, úpravy N-konce, úpravy C-konce, úpravy peptidové vazby, které zahrnují, ale neomezují se na CH2-NH, CH2-S, CH2-S=0, 0=C-NH, CH2-0, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH nebo CF=CH, úpravy základního řetězce a úpravy zbytku. Způsoby přípravy sloučenin, které napodobují peptidy jsou dobře známy v oboru a popisují se například v publikaci Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd. , Kapitola 17.2, F. Chopíin Pergamon Press (1992), která je zde uvedena jako reference. Další související detaily jsou uvedeny dále v textu.

Pak peptid podle vynálezu může být cyklický peptid. Cyklizace je možné dosáhnout například pomocí vytvoření amidových vazeb, například začleněním Glu, Asp, Lys, Orn, kyseliny diaminobutanové (Dab), diaminopropionové (Dap) do různých poloh v řetězci (vazby -CO-NH nebo -NH-CO). Hlavní řetězec pro cyklizaci hlavního řetězce se může také získat začleněním upravených aminokyselin do vzorců H-N( (CH2)n-COOH)-C (R) H-COOH nebo H-N ( (CH2) n-COOH) -C (R) H-NH2, kde symbol a je 1 až 4 a dále symbol R je libovolný přirozený nebo nepřirozený vedlejší řetězec aminokyseliny.

Také je možná cyklizace prostřednictvím vytvoření vazeb S-S pomocí začlenění dvou zbytků Cys. Další postranní řetězec pro cyklizaci postranního řetězce je možné získat prostřednictvím vytvoření interakční vazby vzorce - (-CH2-) n-S-CH2-C-, kde symbol n je 1 nebo 2, což je například možné prostřednictvím začlenění Cys nebo homoCys a reakce jejich volné skupiny SH s například bromoacetylovaným Lys, Orn, Dab nebo Dap.

Peptidové vazby (-CO-NH-) v peptidu se mohou substituovat například N-methylovánými vazbami (-N (CH3)-CO-) , esterovými vazbami (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-), ketomethylenovými vazbami (-CO-CH2-), vazby α-aza (-NH-N(R)-CO-), kde symbol R je libovolný alkyl, například methyl, karbaovými vazbami (-CH2-NH-), hydroxyethylenovými vazbami (-CH(OH)-CH2-) , thioamidovými vazbami (-CS-NH-), nenasycenými dvojnými vazbami (-CH=CH-), retroamidovými vazbami (-NH-CO-), peptidovými deriváty (-N(R)-CH2-CO-) , kde symbol R je „normální" postranní řetězec, který se přirozeně vyskytuje na atomu uhlíku. 38 38

·· ··*· • · ♦ • · ·

Tyto úpravy se mohou vyskytovat v libovolné z vazeb v peptidovém řetězci a dokonce několikrát (2 až 3 krát) ve stejnou dobu. Přirozené aromatické aminokyseliny Trp, Tyr a Phe mohou být substituovány umělou nepřirozenou aminokyselinou, jako je TIC, naftylelanin (Nol), což jsou kruhové methylované deriváty Phe, halogenované deriváty Phe nebo o-methyl-Tyr.

Tabulky 1 až 2 uvedené dále v textu obsahují seznam přirozeně se vyskytujících aminokyselin (tabulka 1) a upravené aminokyselině a aminokyseliny, které nejsou běžné (uvádí se v tabulce č. 2).

Tabulka č. 1

aminokyselina třípísmenná zkratka jednopísmenná zkratka alanin Ala A arginin Arg R asparagin Asn N asparagová kyselina Asp D cystein Cys C glutamin Gin Q glutamová kyselina Glu E glycin Gly G histidin His H izoleucin Iie I leucin Leu L lysin Lys K metionin Met M fenylalanin Phe F prolin Pro P serin Ser S threonin Thr T tryptofan Trp W tyrosin Tyr Y

valin Val V libovolná shora uvedená aminokyselina Xaa X

Tabulka č. 2 nekonvenčni aminokyselina kód nekonvenčni aminokyselina kód α-aminobutanová kyselina Abu L-N-methylalanin Nmala a-amino-a-methylbutyrát Mgabu L-N-methylarginin Nmarg aminocyklopropankarbo- xylát Cpro L-N-methylasparagin Nmasn L-N-methylasparagová kyselina Nmasp aminoisobutanová kyselina Aib L-N-methylcystein Nmcys aminonorbornylkarboxylát Norb L-N-methylglutamin Nmgin L-N-methylglutamová kyselina Nmglu cyklohexy1alanin Chexa L-N-methylhistidin Nmhis cyklopentylalanin Cpen L-N-methylizoleucin Nmile D-alanin Dal L-N-methylleucin Nmleu D-arginín Darg L-N-methyllysin Nmlys D-asparágová kyselina Dasp L-N-methylmetionin Nmmet D-cystein Dcys L-N-methylnorleucin Nmnle D-glutamin Dgln L-N-methylnorvalin Nmnva D-glutamová kyselina Dglu L-N-methylornithin Nmorn D-histidin Dhis L-N-methylfenylalanin Nmphe D-izoleucin Dile L-N-methylprolin Nmpro D-leucin Dleu L-N-methylserin Nmser D-lysin Dlys L-N-methylthreonin Nmthr D-metionin Drnět L-N-methyltryptofan Nmtrp D-ornithin Dorn L-N-methyltyrosin Nmtyr D-fenylalanin Dphe L-N-methylmethylvalin Nmval D-prolin Dpro L-N-methylethylglycin Nmetg D-serin Dser L-N-methyl-t-butylgly-cin Nmtbug D-threonin Dthr L-norleucin Nle D-tryptofan Dtrp L-norvalin Nva D-tyrosin Dtyr α-methyl-aminoizobuty-rát Maib D-valin Dval a-methyl-y-aminobutarát Mgabu D-a-methylalanin Dmala a-methylcyklohexylalanin Mchexa D-a-methylarginin Dmarg a-methylcyklopentylala-nin Mcpen D-a-methylasparagin Dmasn α-methyl-a-naftylalanin Manap D-a-methylaspartát Dmasp a-methylpenicilamin Mpen D-a-methylcystein Dmcys N-(4-aminobutyl)glycin Nglu D-a-methylglutamin Dmgln N-(2-aminoethyl)glycin Naeg D-a-methylhistidin Dmhis N-(3-aminopropyl)glycin Norm D-a-methylizoleucin Dmile N-amino-a-methylbutyrát Nmaabu D-a-methylleucin Dmleu α-naftylalanin Anap D-a-methyllysin Dmlys N-benzylglycin Nphe D-a-methylmetionin Dmmet N-(2-karbamylethyl)glycin Ngln D-a-methylornithin Dmorn N-(karbamylmethyl)glycin Nasn D-a-methylfenylalanin Dmphe N-(2-karboxyethyl)glycin Nglu D-a-methylprolin Dmpro N-(karboxymethyl)glycin Násp D-cx-methyl ser in Dmser N-cyklobutylglycin Ncbut D-a-methylthreonin Dmthr N-cykloheptylglycin Nchep D-a-methyltryptofan Dmtrp N-cyklohexylglycin Nchex D-a-methyltyrosin Dmty N-cyklodecylglyc in Ncdec D-a-methylvalin Dmval N-cyklododecylglyc in Ncdod 41 D-α-methylalanin Dnmala N-cyklooktylglycin Ncoct D-a-methylarginin Dnmarg N-cyklopropylglycin Ncpro D-a-methylasparagin Dnmasn N-cykloundecylglycin Ncund D-a-methylaspartát Dnmasp N-(2,2-difenylethyl)-glycin Nbhm D-a-methylcystein Dnmcys N-(3,3-difenylpropyl)-glycin Nbhe D-N-methylleucin Dnmleu N-(3-indolylethyl)glycin Nhtrp D-N-methyllysin Dnmlys N-methyl-y-aminobutyrát Nmgabu N-methylcyklohexylalanin Nmchexa D-N-methylmetionin Dnmmet D-N-methylorníthin Dnmorn N-methylcyklopentylala- nin Nmcpen N-methylglycin Nala D-N-methylfenylalanin Dnmphe N-methylaminoizobutyrát Nmaib D-N-methylprolin Dnmpro N-(1-methylpropyl)glycin Nile D-N-methylserin Dnmser N-(2-methylpropyl)glycin Nile D-N-methylserin Dnmser N-(2-methylpropyl)glycin Nleu D-N-methylthreonin Dnmthr D-N-methyltryptofan Dnmtrp N-(1-methylethyl)glycin Nva D-N-methyltyrosin Dnmtyr N-methyla-naftyllalanin Nmanap D-N-methylvalin Dnmval N-methylpenicilinamin Nmpen γ-aminobutanová kyselina Gábu N-(p-hydroxyfenyl)glycin Nhtyr L-t-butylglycin Tbug N-(thiomethyl)glycin Ncys L-ethylglycin Etg penicilamin Pen L-homofenylalanin Hphe L-a-methylalanin Mala L-a-methylarginin Marg L-a-methylasparagin Masn L-a-methylaspartát Masp L-a-methyl-t-butylgly-cin Mtbug L-a-methylcystein Mcys L-methylethylglycin Metg L-a-methylglutamin Mgln L-a-methylglutamát Mglu L-a-methylhistidin Mhis L-a-methylhomofenylala- nin Mhphe L-α-methylizoleucin Mile N- (2-methylthioethyl) -glycin Nmet D-N-methylglutamin Dnmgln N-(3-guanidopropyl)glycin Narg D-N-methylglutamát Dnmglu N-(1-hydroxyethyl)glycin Nthr D-N-methylhistidin Dnmhis N-(hydroxyethyl)glycin Nser D-N-methylizoleucin Dnmile N-(imidazolylethyl)glycin Nhis D-N-methylleucin Dnmleu N-(3-idolylyethyl)glycin Nhtrp D-N-methyllysin Dnmlys N-methyl-y-aminobutyrát Nmgabu N-methylcyklohexylalanin Nmchexa D-N-methylmetionin Dnmmet D-N-methylornithin Dnmorn N-methylcyklopentylala- nin Nmcpen N-methylglycin Nala D-N-methylfenylalanin Dnmphe N - me t hy1amino i zobutyrá t Nmaib D-N-methylprolin Dnmpro N-(1-methylpropyl)glycin Nile D-N-methylserin Dnmser N-(2-methylpropyl)glycin Nleu D-N-methylthreonin Dnmthr D-N-methyltryprofan Dnmtrp N-(1-methylethyl)glycin Nval D-N-methyltyrosin Dnmtyr N-methyla-naftylalanin Nmanap D-N-methylvalin Dnmval N-methylpenicilinamin Nmpen γ-aminobutanová kyselina Gábu N-(p-hydroxyfenyl)glycin Nhtyr L-t-butylglycin Tbug N-(thiomethyl)glycin Ncys L-ethylglycin Etg penicilamin Pen L-homofenylalanin Hphe L-a-methylalanin Mala L-a-methylarginin Marg L-or-methylasparagin Masn L-a-methylaspartát Masp L-a-methyl-t-butylgly-cin Mtbug L-a-methylcystein Mcys L-a-methylethylglycin Metg L-a-methylglutamin Mgln L-a-methylglutamát Mglu L-a-methylhistidin Mhis L-a-methylhomofenylala- Mhphe ·· •fr ··«· • · • · • · 43 » ·· · · • · · · · · · • * * • · · · • · **·· • · · ·· · nin L-α-methylizoleucín Mile N-(2-methylthioethyl)-glycin Nmet L-a-methylleucin Mleu L-a-methyllysin Mlys L-a-methylmet ionin Mmet L-a-methylnorleucin Mnle L-a-methylnorvalin Mnva L-a-methylornithin Morn L-a-methylfenylalanin Mphe L-a-methylprolin Mpro L-a-methylserin Mser L-a-methylthreonin Mthr L-a-methylvalin Mtrp L-a-methyltyros in Mtyr L-a-methylleucin Mval L-N-methylhomofenylala- nin Nmhphe N-(N-(2,2-difenyl-ethyl)karbamylmethylgly-cin Nnbhm N-(N-(3,3-difenylpro-pyl)karbamylme-thyl-1-glycin Nnbhe 1-karboxy-l-(2,2-dife-nylethylamino)cyklopro-pan Nmbc

Peptid podle předkládaného vynálezu se může použít ve své stávající formě nebo může být součástí složek, jako jsou proteiny, a zobrazuje složky, jako jsou bakterie a fágy. Peptidy podle vynálezu se mohou také chemicky upravovat za vzniku aktivních dimérů nebo multimérů v jednom polypeptidovém řetězci nebo kovalentně zesíťovaných řetězcích.

Peptid podle vynálezu navíc zahrnuje alespoň čtyři, podle volby alespoň pět, podle volby alespoň šest, podle volby alespoň sedm, podle volby alespoň osm, podle volby alespoň devět, podle volby alespoň deset, podle volby alespoň jedenáct, podle volby alespoň dvanáct, podle volby alespoň třináct, podle volby alespoň čtrnáct, podle volby alespoň patnáct, podle volby alespoň šestnáct, podle volby alespoň sedmnáct, podle volby alespoň osmnáct, podle volby alespoň devatenáct, podle volby alespoň dvacet, podle volby alespoň dvacet jedna, podle volby alespoň dvacet dva, podle volby 44 t · · · · · « · « O · ·

• · · · • · · · • · · · • · · · · · • · · • · · alespoň dvacet tři, podle volby alespoň dvacet čtyři, podle volby alespoň dvacet pět, podle volby alespoň dvacet šest, podle volby dvacet sedm až šedesát nebo více aminokyselinových zbytků (v tomto dokumentu se používá zaměnitelný výraz aminokyseliny).

Termín „aminokyselina" nebo „aminokyseliny" zahrnuje 20 přirozeně se vyskytujících aminokyselin. Tyto aminokyseliny často upravené po translaci in vivo zahrnují například hydroxyprolin, fosfoserin a fosfothreonin a jiné neobvyklé aminokyseliny mezi něž patří 2-aminoadipová kyselina, hydroxylysin, izodesmosin, norvalin, norleucin a ornithin. Dále termín „aminokyselina" zahrnuje jak D-aminokyseliny tak L-amino-kyšelíny.

Termín „získaný z N-terminální části kaseinu aSl" znamená peptidy podle zde uvedené definice. Jsou to například produkty štěpení kaseinu aSl (peptidy získané z přirozeného kaseinu), syntetické peptidy chemicky syntetizované v souladu s aminokyselinovou sekvencí N-terminální části kaseinu aSl (syntetický peptid získaný z kaseinu), peptidy podobné (homologní) N-terminální částí kaseinu aSl, což jsou například peptidy charakterizované jednou nebo více substitucí aminokyselin, jako jsou například bez omezení povolené substituce, což umožňuje, zachování alespoň 70%, s výhodou alespoň 80%, výhodněji alespoň 90% podobnosti, a jejich funkční homology. Zde používané termíny „homology" a „funkční homology" znamenají peptidy s libovolnými inzerty, delecemi a substitucemi, které neovlivňují biologickou aktivitu peptidu.

Termín „kasein" znamená kasein aSl savců, mezi než patří bez omezení dobytek (například kráva, ovce, koza, klisna, velbloud, jelen a buvol), člověk a mořští savci. Dále v textu se uvádí seznam kaseinu aSl, které mají známou aminokyselinovou sekvenci a jsou charakterizovány číslem uložení v genové bance GenBank (NCBI) a zdrojem: CAA26982 (Ovis aries (ovce)), CAA51022 (Capra hircus) (koza)), CAA42516 45 45 • · • ti • · · · · • ·· ·· · · · · ·· ···· * · · · • · · · · · · • · · · · · ··· ····· ·· ·· ·· (Bos taurus (dobytek)), CAA55185 (Homo sapiens), CAA38717 (Sus scrofa) (prase)), P09115 (králík) a 097943 (Camelus dromedurius) (velbloud)).

Termín „N-terminální část" znamená M aminokyselin kaseinu aSl získaných z prvních 60 aminokyselin kaseinu aSl, kde symbol M znamená libovolné celé číslo mezi 2 a 60 (zahrnující celé číslo 2 a 60). Je výhodné, když termín zahrnuje prvních M aminokyselin kaseinu aSl.

Peptidy podle vynálezu mohou být získány extrakcí z mléka, jak se popisuje dříve v textu, nebo syntézou peptidu na pevné fázi, což jsou standardní metody známé v oboru. Čištění peptidů podle vynálezu se provádí standardními postupy, které jsou dobře známy v oboru, jako je vysoce výkonná kapalinová chromatografie (HPLC). Aby se získaly peptidy podle vynálezu, fragmentace mléčného kaseinu může být provedena použitím různých enzymatických a/nebo chemických postupů.

Jak se detailněji popisuje dále v textu a v části příkladů, peptidy podle vynálezu mají různé terapeutické účinky. V části příkladů se popisuje řada testů použitím, kterých může odborník testovat specifický terapeutický účinek specifického peptidu vytvořeného v souladu s vynálezem. Libovolné zde popsané peptidy se mohou aplikovat samostatně nebo se mohou začlenit do farmaceutického prostředku, který se může použít při léčení nebo prevenci onemocnění. Takový prostředek zahrnuje jako aktivní složku libovolný ze zde popsaných peptidů a farmaceuticky přijatelný nosič.

Termín „farmaceutický prostředek" znamená přípravek obsahující jeden nebo více zde popsaných peptidů a jiné chemické složky, jako jsou farmaceuticky přijatelné nosiče a pomocné látky. Úkolem farmaceutického prostředku je umožnit aplikaci sloučeniny do organizmu.

Termín „farmaceuticky přijatelný nosič" znamená nosič nebo ředidlo, které nezpůsobuje podstatné dráždění organizmu a neporušuje biologickou aktivitu a vlastnosti aplikované látky. Příklady nosičů bez omezení jsou: propylenglykol, fyziologický roztok, emulze a směsi organických rozpouštědel s vodou. Termín „pomocná látka" znamená inertní látku přidanou do farmaceutického prostředku, která dále usnadňuje aplikaci látky. Příklady pomocných látek bez omezení zahrnují uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé cukry a typy škrobu, deriváty celulózy, želatinu, rostlinné oleje a polyethylenglykoly.

Metody výroby a aplikace léků se také popisují v publikaci „Remington"s Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, poslední vydání.

Vhodné aplikace mohou například zahrnovat orální, rektální, transdermální, intestinální nebo parenterální zavedení zahrnující intramuskulární, subkutánní a intramedulární injekce stejně jako intratekální, přímé intravenózní, intraperitoneální, intranasální nebo intraokulární injekce.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou vyrábět postupem, který je dobře znám v oboru. Je to například běžné míšení, rozpouštění, granulace, příprava dražé, rozmělnění, příprava emulze a kapsulí, uzavírací nebo lyofilizační postupy.

Farmaceutické prostředky pro použití podle vynálezu se mohou tvořit běžným postupem za použití jednoho nebo více farmaceuticky přijatelných nosičů, které obsahují pomocné látky a pomocné prostředky, které usnadňují zpracování aktivních peptidů do prostředku, který se může použít jako farmaceutický prostředek. Vhodné složení závisí na způsobu zvolené aplikace. V případě injekce peptidy podle vynálezu se mohou tvořit ve vodných roztocích, přednostně ve fyziologicky kompatibilních pufrech, jako je Hankův, Ringerův roztok, fyziologický roztok s organickými rozpouštědly samotný fyziologický roztok. Mezi organická rozpouštědla patří propylenglykol, polyethylenglykol. Jestliže je nutné, aby prostředek prošel po aplikaci sliznici, přidávají se penetračni činidla. Taková penetračni činidla jsou obecně známa v oboru. V případě orální aplikace se mohou peptidy často připravovat kombinováním aktivních peptidů s farmaceuticky přijatelnými nosiči, který jsou dobře známy v oboru. Takové nosiče umožňují peptidům podle vynálezu tvořit tablety, pilulky, dražé, kapsula, roztoky, gely, sirupy, kaše, suspenze a podobně, které jsou vhodné pro orální požití. Farmakologické prostředky vhodné pro orální aplikaci se mohou připravit použitím pevných pomocných prostředků, mletím výsledné směsi a zpracováním směsi granulí po přidání vhodných pomocných prostředků, jestliže je to nutné, přičemž vznikají tablety nebo dražé. Vhodnými pomocnými látkami jsou zvláště plnidla, jako jsou cukry zahrnující laktózu, sacharózu, manitol nebo sorbitol, celulózové přípravky, jako je například kukuřičný, pšeničný, rýžový, bramborový škrob, želatina, tragant, methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, natrium karbomethylcelulóza, a/nebo fyziologicky přijatelné polymery, jako je polyvinylpyrrolidon (PVP) . Jestliže je to nutné mohou se přidat činidla zajišťující rozpad, jako jsou síťovaný polyvinylpyrrolidon, agar nebo kyseliny alginová nebo její sůl, jako je alginát sodný.

Dražé obsahují vhodné potahy. Pro tyto účely se používají koncentrované roztoky cukru, které mohou obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidon, karbopolový gel, polyethylenglykol, oxid titaničitý, ředěné roztoky a vhodná organická rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel. Za účelem identifikace nebo charakterizace různých kombinací dávek aktivních látek se mohou do tablet a dražé přidávat barviva a pigmenty.

Farmaceutické prostředky, které se mohou použít orálně, zahrnují zásuvné kapsle připravené z želatiny stejně jako 48 měkké uzavřené kapsle připravené z želatiny a změkčovadla, kterým je glycerol nebo sorbitol. Zásuvné kapsle mohou obsahovat aktivní složky ve směsi s plnidlem, jako je laktóza, pojidlo, jako jsou škroby, lubrikant, jako je talek nebo stearát hořečnatý a také je možné přidat stabilizátor. V měkkých kapslích se aktivní peptidy mohou rozpustit nebo suspendovat ve vhodných kapalinách, jako jsou oleje, kapalný parafin nebo kapalné polyethylenglykoly. Navíc se mohou přidat stabilizátory. Všechny prostředky vhodné pro orální aplikaci by se měly podávat v dávkách vhodných pro zvolený způsob aplikace.

Pro bukální aplikaci může být prostředek ve formě tablet nebo pastilek, které se připravily běžným způsobem. V případě aplikace inhalací se peptidy podle vynálezu běžně aplikují ve rozprašováním aerosolu z balení se zvýšeným tlakem nebo z atomizéru za použití vhodné hnací látky, jako je například dichlordifluormethan, trichlorfluormethan, dichlortetrafluorethan nebo oxid uhličitý. V případě aerosolu pod uměle zvýšeným tlakem se může jednotková dávka regulovat ventilem, který umožní zavedení měřeného množství. Kapsle a patrony například želatinové, které je možné použít v inhalátoru nebo v zařízení pro zavádění plynu nebo prášku do tělních dutin nebo otvorů, se mohou připravit tak, že obsahují směs látky ve formě prášku a vhodné práškové báze, jako je laktóza nebo škrob.

Zde popsané peptidy se mohou připravit tak, aby byly vhodné pro parenterální podání, například jednorázovou injekcí nebo kontinuální infúzí. Prostředky určené pro aplikaci injekcí se mohou vyskytovat ve formě jednotkové dávky, například v ampulích nebo v nádobkách obsahujících více dávek, které mohou také obsahovat konzervační činidlo. Prostředky mohou být suspenze, roztoky nebo emulze v oleji nebo ve vodě a mohou obsahovat další přísady jako je suspendační, stabilizační a/nebo dispergační činidlo. 49

Farmaceutické prostředky pro parenterálni aplikaci zahrnuji vodni roztoky aktivního přípravku ve formě, která je ve vodě rozpustná. Navíc suspenze aktivních peptidů se mohou připravit jako vhodné olejové suspenze vhodné pro aplikaci injekcí. Vhodná lipofilní rozpouštědla nebo pojidla zahrnují mastné oleje, jako je sezamový olej nebo syntetické estery mastných kyselin, jako je ethyloleát, triglyceridy nebo liposomy. Vodné suspenze vhodné pro aplikaci injekcí mohou obsahovat látky, které zvyšují viskozitu suspenze, jako je natrium karboxylmethylcelulóza, sorbitol nebo dextran. Suspenze mohou také obsahovat vhodné stabilizátory nebo činidla, která zvyšují rozpustnost peptidů, což umožňuje připravit vysoce koncentrované roztoky. V jiném případě může být aktivní složka ve formě prášku a před použitím se smíchá s vhodným nosičem, kterým je například sterilní bezvodý pyrogen.

Peptidy podle vynálezu se mohou také použít pro vytvoření prostředků pro aplikaci do rekta, jako jsou čípky nebo retenční klystýr, přičemž se používá například běžný čípkový základ, jako je kakaový olej nebo jiné glyceridy.

Zde popsané farmaceutické prostředky mohou také obsahovat vhodnou pevnou složku gelových nosičů nebo pomocné látky. Příklady takových nosičů nebo pomocných látek zahrnují bez omezení uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé cukry, škroby, deriváty celulózy, želatinu a polymery, jako jsou polyethylenglykoly.

Pro odborníka je jednoduché stanovit optimální dávky a způsob dávkování libovolného z peptidů podle vynálezu. V případě libovolného peptidů používaného v souladu s vynálezem je možné terapeuticky účinné množství, což se také definuje jaké terapeuticky účinná dávka, stanovit na začátku na základě testů provedených na buněčných kulturách nebo in vivo na zvířatech. Dávky se mohou například stanovit ve zvířecích modelech tak, aby se dosáhlo rozmezí koncentrace v 50

·« ·· · oběhu, která zahrnuje hodnoty IC50 nebo ICi0o^ jak se určilo v buněčné kultuře. Taková informace se může použit při přesném stanoveni dávek použitelných u lidi. Počáteční dávky se mohou také odhadnout z dat získaných in vivo. Podle tohoto počátečního vodítka by odborník mohl stanovit dávku účinnou pro člověka.

Mimo to toxicita a terapeutická účinnost zde popsaných peptidů se může stanovit standardními farmaceutickými postupy v buněčných kulturách nebo na experimentálních zvířatech. Je to možné například provést stanovením hodnoty LD50 a ED50.Poměr dávek způsobující toxický respektive terapeutický účinek je terapeutický index a může se vyjádřit jako poměr mezi LD50 a EDso. Výhodné jsou peptidy, které vykazují vysoké terapeutické indexy. Data získaná z těchto testů na buněčných kulturách a ze studií provedených na zvířatech se mohou použít při vytvoření dávkového rozmezí, které pro člověka není toxické. Dávka takových peptidů se pohybuje s výhodou v rozmezí koncentrací v oběhu, které zahrnují hodnotu ED50 a nevykazují toxicitu nebo jsou pouze slabě toxické. Dávka může kolísat v tomto rozmezí v závislosti na použité dávkové formě a použitém způsobu aplikace. Praktický lékař může zvolit skutečné složení, způsob aplikace a dávku v závislosti na stavu pacienta (popisuje se například v knize Fingl a kol., 1975, The Pharmacological Basis of Therapeutics, kapitola 1, strana 1). Dávkové množství a interval aplikace dávky se může stanovit individuálně, aby se zajistilo množství aktivní složky v plazmě, které je dostatečné pro udržení terapeutického účinku. Obvyklé dávky při orální aplikaci jsou v rozmezí přibližně 50 až 2000 mg/kg při jedné aplikaci, běžně se pohybují přibližně mezi 100 až 1000 mg/kg při jedné aplikaci, s výhodou jsou přibližně 150 až 700 mg/kg při jedné aplikaci a nejvýhodnější je rozmezí přibližně 250 až 500 mg/kg při jedné aplikaci. V některých případech terapeuticky 51 • · · · · · • · · · · « • · · · « •·· ·« ·· Μ · • · · • · · · • · ·Μ· • · ♦ účinného množství v seru se dosáhne aplikací několika dávek každý den. V případech lokální aplikace nebo selektivního pohlcení účinná lokální koncentrace léku nemusí být vztažena na koncentraci plazmy. Odborník bude schopen optimalizovat terapeuticky účinné lokální dávky bez experimentů. V závislosti na vážnosti stavu pacienta a jeho odpovědi na léčení se může také provést jediná aplikace prostředku, který pomalu uvolňuje aktivní látku. Průběh léčby pak trvá od několika dní do několika týdnů nebo dokud je léčení účinná nebo se dosahuje zmírnění stádia onemocnění.

Množství aplikovaného prostředku bude samozřejmě záviset na léčeném subjektu, vážnosti strádání, způsobu aplikace, odhadu praktického lékaře atd..

Prostředky podle předkládaného vynálezu, je-li to nutné, se mohou vyskytovat v balení nebo v dávkovacím zařízení, jako je sada schválená FDA, která může obsahovat jednu nebo více jednotkových dávkových forem, jenž zahrnují aktivní složku. Balení může například obsahovat kovovou nebo plastovou folii, jako je měkké průhledné balení. Balení nebo dávkovači zařízení může být doprovázeno instrukcemi pro aplikaci. Balení nebo dávkovači zařízení může být doprovázeno poznámkou vládní instituce řídící výrobu, použití nebo prodej léků. Tato poznámka obsahuje povolení formy prostředku nebo použití prostředku při léčení člověka nebo veterinární použití udělené uvedenou agenturou. Taková poznámka může být například označení předepisovaných léků schválených Úřadem pro kontrolu potravin a léků v USA nebo příbalový leták. Prostředky obsahující peptid podle vynálezu spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem může také být umístěn do vhodné nádoby a je označen jako vhodný pro léčení nebo prevenci daného stavu nebo vyvolání požadovaného účinku. Vhodná poznámka na obalu může zahrnovat léčení a/nebo prevenci autoimunitního onemocnění nebo stavu, virového onemocnění, virové infekce, bakteriální infekce, hematologického onemocnění, hematologické 52 #· ···· ·* 0 • · ♦ · • · # · • ♦ • · · • ♦

• · · ·· ·· ·· • · · • t··· • · nedostatečnosti, granulocytopenie, trombocytopenie hyperlipidemie, pancytopenie, hypercholesterolemie, glukosurie, hyperglykémie, cukrovky, AIDS, infekce HIV-1, poruch pomocných T-buněk, nedostatečnosti dendritických buněk, nedostatečnosti makrofágů, poruch krvetvorných kmenových buněk včetně destiček, poruch lymfocytů, poruch plasmových buněk a poruch neutrofilů, proliferace krvetvorných kmenových buněk, proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk, předleukemických stavů, leukemických stavů, poruch imunitního systému vzniklých v důsledku chemoterapie nebo radioterapie a poruch lidského imunitního systému vzniklých v důsledku léčení onemocnění nedostatkem imunity.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou použít při udržení a/nebo obnově složek v krevním systému, při uvedení do rovnovážného stavu počtu krevních buněk, při uvedení do rovnovážného stavu množství metabolitů v krvi, které zahrnují cukr, cholesterol, vápník, kyselinu močovou, močovinu a enzymy, jako je alkalická fosfatáza. Dále se farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou použít při vyvolání proliferace krevních buněk, úpravy počtu bílých a/nebo červených krvinek, zvláště při zvýšení počtu bílých a/nebo červených krvinek, zvýšení obsahu hemoglobinu v krvi a úpravě počtu krevních destiček.

Termín „úprava" zde použitý ve vztahu k hladině jistých fyziologických parametrů znamená změny hladin uvedených parametrů, přičemž se tyto hladiny přibližují normálním hodnotám.

Termín „normální hodnota" zde použitý ve vztahu k jistým fyzioterapeutickým parametrům znamená hodnoty, které jsou v rozmezí hodnot zdravých lidí nebo zvířat.

Ve specificky preferovaných provedeních vynálezu peptidy podle vynálezu uvádějí do rovnováhy počty červených krvinek, bílých krvinek, krevních destiček a množství hemoglobinu.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou použít při aktivaci proliferace krevních buněk.

Navíc farmaceutické prostředky se mohou použít při léčení a/nebo prevenci poruch krvetvorných kmenových buněk, které zahrnují poruchy krevních destiček, lymfocytů, plazmatických buněk a neutrofilní poruchy, stejně jako nedostatečnost a funkční poruchu při předleukemických nebo leukemických stavech a trombocytopenii. Dále farmaceutické prostředky se mohou použít při léčení a/nebo prevenci buněčných proliferativních onemocnění. V této souvislosti je nutné poznamenat, že farmaceutické prostředky podle vynálezu jsou výhodné při stimulaci imunitní odezvy během léčby chemoterapií nebo ozářením, při zmírnění negativních účinků, při redukci zvracení vyvolané chemoterapií a radiací a podporují rychlé uzdravení.

Stále další farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou použít při stimulaci lidské imunitní odezvy během léčby onemocnění spojených s imunitní nedostatečností, jako je například HIV a autoimunitní onemocnění.

Prostředky podle vynálezu se mohou použít ve veterinární medicíně.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou použít při léčení a/nebo prevenci například poruch zahrnujících abnormální množství krevních buněk, poruch zahrnujících produkci a diferenciaci krvetvorných kmenových buněk, léčení poruch krevních destiček, poruchy lymfocytů a/nebo neutrofilní poruchy, při léčení předleukemických a leukemických stavů a při léčení trombocytopenie. Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou také použít při léčení buněčném proliferačním onemocnění a onemocnění zahrnujícím imunitní nedostatečnost, jako je HIV a autoimunitní onemocnění. Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou dále použít při stimulaci imunitní odezvy během léčby chemoterapií nebo ozářením, omezují například zvracení vyvolané chemoterapií. 54 • · · Z hlediska praktického provedeni předkládaného vynálezu bylo překvapivě zjištěno, že peptidy podle předkládaného vynálezu mají synergický vliv na proliferaci a diferenciaci lidských krvetvorných buněk a na ostatní krvetvorné růstové faktory. Zvláštní význam má zesílení erytropoetinem zprostředkované stimulace tvorby kolonií erytroidů a na dávkování závislé zlepšení trombopoetinem (TPO) vyvolané proliferace proliferace megakaryocytů pomocí peptidů podle předkládaného vynálezu. Rekombinantní lidský (rh) EPO je v současnosti schválen jako terapie pro indikování nemocí jako je ledvinová anemie, anemie způsobená předčasnou dospělostí, anemie související s rakovinou a s AIDS a pro preelektivní chirurgické léčení (Sowade, B., a kol., Int. J. Mol. Med., 1998; 1: 305). Předkládaný vynález poskytuje způsob léčení stavu léčitelného erytropoetinem, přičemž tento způsob sestává v podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob umocnění účinku erytropoetinu, přičemž tento způsob sestává v podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuj e.

Trombopoetin je záhy působící cytokin s důležitými mnohočetnými účinky: TPO samotný nebo v kombinaci s dalšími záhy působícími cytokiny dokáže (i) podporovat životaschopnost a potlačovat apoptosu progenitorových buněk; (ii) regulovat funkci a produkci krvetvorných kmenových buněk; (iii) spouštět buněčné dělení u neaktivních buněk; (iv) vyvolávat diferenciaci a (v) podporovat tvorbu kolonií obsahujících granulocyty, erytrocyty, makrofágy a megakaryocyty (MK, CFU-GEMM). Navíc TPO stimuluje produkci více omezených předků pro kolonie granulocyt/monocyt, megakaryocytů a erythroidů a stimuluje adhezi primitivní lidské kostní dřeně a megakaryocytických buněk k fibronektinu a fibrinogenu. Proto je TPO důležitý cytokin pro klinické odborníky na hematologii a transplantace: pro mobilizaci, zesílení a ex vivo expanzi kmenových buněk a determinovaných prekursorových buněk pro autologní a alogenní transplantace. Navíc lze podávání TPO zdravým dárcům destiček použít pro zvýšení výtěžku pherese. Nicméně klinické použití léčby pomocí TPO je, kromě jiných důvodů, komplikováno relativně vysokými náklady na rekombinantní lidský cytokin rhTPO a potenciální antigenicitou TPO při opakovaném podávání.

Společná léčba pomocí TPO a peptidu podle předkládaného vynálezu, buď dohromady v jediném farmaceutickém prostředku obsahujícím obě uvedené složky, nebo odděleně, poskytuje nenákladné a prokázané netoxické umocnění vlivu TPO na proliferaci a funkci cílových buněk. V takové kombinaci lze peptid podle předkládaného vynálezu použít na léčení, kromě výše uvedených stavů, poruch, jako je myelodysplastický syndrom (MDS) , aplastická anemie a komplikace při selhání jater. Předběžné léčení dárců destiček peptidem podle předkládaného vynálezu samotným nebo v kombinaci s TPO případně dále zvýší účinnost výtěžků pherese. Předkládaný vynález poskytuje způsob léčení stavu léčitelného trombopoetinem, přičemž tento způsob sestává v podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuj e. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob umocnění účinku trombopoetinu, přičemž tento způsob sestává v podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje. 56 • · · · Dále předkládaný vynález poskytuje způsob zlepšeni mobilizace periferních kmenových buněk, přičemž tento způsob sestává v podáváni terapeuticky účinného množství farmaceutického prostředku obsahujícího účinná množství trombopoetinu a peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro léčení stavu léčitelného trombopoetinem, přičemž tento farmaceutický prostředek obsahuje jako aktivní složku peptidu získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro umocnění účinku trombopoetinu, přičemž tento farmaceutický prostředek obsahuje jako aktivní složku peptidu získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro zlepšení mobilizace periferních kmenových buněk, přičemž tento farmaceutický prostředek obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro zlepšení krvetvorby, přičemž tento farmaceutický prostředek obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk, přičemž tento farmaceutický prostředek obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk, přičemž tento farmaceutický prostředek obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání megakaryocytopoézy, přičemž tento farmaceutický prostředek obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání erytropoézy, přičemž tento farmaceutický prostředek obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání leukocytopoézy, přičemž tento farmaceutický prostředek obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání trombocytopoézy, přičemž tento farmaceutický prostředek obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení trombocytopenie, přičemž tento farmaceutický prostředek obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení pancytopenie, přičemž tento farmaceutický prostředek obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič. 58 • » • · • · Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčeni granulocytopenie, přičemž tento farmaceutický prostředek obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminálni části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro léčeni nebo prevenci stavů vybraných ze skupiny sestávající z hematologického onemocnění, hematologické nedostatečnosti, trombocytopenie, pancytopenie, granulocytopenie, nedostatečnosti dendritických buněk, nedostatečnosti makrofágů, poruch krvetvorných kmenových buněk včetně destiček, lymfocytů, poruch plasmových buněk a poruch neutrofilů, předleukemických stavů, leukemických stavů, myelodysplastického syndromu, aplastické anemie a nedostatečnosti krevní dřeně, přičemž tento farmaceutický prostředek obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek obsahující trombopoetin a čištěný peptid, který má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze sekvencí id. č. 1 až 25 a farmaceuticky přijatelného nosiče. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob zlepšení kolonizace darovaných krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci, přičemž tento způsob zahrnuje léčení dárce těchto darovaných krevních kmenových buněk peptidem získaným z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetinem před darováním a implantací darovaných krevních kmenových buněk příjemci. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob zlepšení kolonizace darovaných krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci, přičemž tento způsob zahrnuje úpravu těchto darovaných krevních kmenových buněk peptidem • · · · 59

získaným z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetinem před implantací darovaných krevních kmenových buněk příjemci. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob zlepšení kolonizace krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci, přičemž tento způsob zahrnuje úpravu těchto krevních kmenových buněk peptidem získaným z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetinu před implantací krevních kmenových buněk příjemci. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro léčení stavu léčitelného trombopoetinem. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro umocnění účinku trombopoetinu. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro zlepšení kolonizace darovaných krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro zlepšení kolonizace krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro zlepšení mobilizace periferních kmenových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání krvetvorby. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání megakaryocytopoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání erytropoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání leukocytopoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání trombocytopoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení trombocytopenie. 61 • · • · · · · Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení pancytopenie. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení granulocytopenie. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro léčení nebo prevenci stavů vybraných ze skupiny sestávající z autoimunitního onemocnění nebo stavu, virového onemocnění, virové infekce, hematologického onemocnění, hematologické nedostatečnosti, trombocytopenie, pancytopenie, granulocytopenie, hyperlipidemie, hypercholesterolemie, glukosurie, hyperglykémie, cukrovky, AIDS, HIV-1, poruch pomocných T-buněk, nedostatečnosti dendritických buněk, nedostatečnosti makrofágů, poruch krvetvorných kmenových buněk včetně destiček, lymfocytů, poruch plasmových buněk a poruch neutrofilů, předleukemických stavů, leukemických stavů, poruch imunitního systému způsobených chemoterapií nebo radioterapií, poruch lidského imunitního systému způsobených léčením nemocí souvisejících s nedostatkem imunity a bakteriálními infekcemi. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro léčení nebo prevenci stavů vybraných ze skupiny sestávající z hematologického onemocnění, hematologické nedostatečnosti, trombocytopenie, pancytopenie, granulocytopenie, nedostatečnosti dendritických buněk, nedostatečnosti makrofágů, poruch krvetvorných kmenových buněk včetně destiček, lymfocytů, poruch plasmových buněk a poruch neutrofilů, předleukemických stavů, leukemických stavů, myelodysplastického syndromu, aplastické anemie a nedostatečnosti kostní dřeně. Dále předkládaný vynález popisuje použiti farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro zlepšení kolonizace darovaných krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič pro zlepšení kolonizace krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci.

Vynález se dále týká antibakteriálních farmaceutických prostředků obsahujících jako aktivní složku alespoň jeden peptid podle předkládaného vynálezu a použití peptidů podle předkládaného vynálezu jako antibakteriálních činidel.

Jak je podrobněji popsáno dále v příkladech provedení vynálezu, peptidy podle předkládaného vynálezu a farmaceutické prostředky obsahující jako aktivní složku peptid podle předkládaného vynálezu lze použít pro léčení nebo prevenci poruch krevních buněk, poruch proliferativních buněk, onemocnění zahrnujících imunitní nedostatečnost a autoimunitní onemocnění. Předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení autoimunitního onemocnění, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení virového onemocnění, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence virového onemocněni, přičemž tento způsob zahrnuje podáváni terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání krvetvorby, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuj e. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-termínální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání megakaryocytopoézy, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuj e. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání erytropoézy, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání leukocytopoézy, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného 64 • · z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvoláni trombocytopoézy, přičemž tento způsob zahrnuje podáváni terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuj e. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání proliferace plasmových buněk, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuj e. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání proliferace dendritických buněk, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuj e. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob vyvolání proliferace makrofágů, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení trombocytopenie, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení pancytopenie, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení granulocytopenie, přičemž tento způsob zahrnuje 65 ·· ·

• · · • · · · · podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení hyperlipidemie, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení hypercholesterolemie, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuj e. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení glukosurie, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuj e. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení cukrovky, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuj e. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení AIDS, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčení infekce HIV, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. 66 ·· · ► ♦ · ·* ♦♦ Dále předkládaný vynález poskytuje způsob prevence nebo léčeni stavů souvisejících s myeloablačními dávkami chemoradioterapie podpořené transplantací vlastní kostní dřeně nebo kmenových buněk periferní krve (ASCT) nebo transplantace cizorodé kostní dřeně (BMT), přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu odvozeného z N-terminální části kaseinu aSl pacientovi, který to potřebuje. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení autoimunitního onemocnění, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení virového onemocnění, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci virového onemocnění, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání krvetvorby, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk, který obsahuje jako aktivní 67 • ·· ·· ···· ·» · · • · • • · · • · • m * · • · · • • · · • * • · ··« ·· ♦ ♦ ♦ · • · · • · * · • · · ···· • · · ·· * složku peptid získaný z N-terminální části kaseínu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvoláni megakaryocytopoézy, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvoláni erytropoézy, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání leukocytopoézy, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání trombocytopoézy, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace plasmových buněk, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace dendritických buněk, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace makrofágů, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení trombocytopenie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. 68

Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčeni pancytopenie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení granulocytopenie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení hyperlipidemie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení hypercholesterolemie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení glukosurie, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení cukrovky, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení AIDS, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení infekce HIV, který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález popisuje farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení stavů spojených s myeloblačními dávkami chemoradioterapie podporované transplantací vlastní kostní dřeně nebo transplantací periferních kmenových buněk (ASCT) nebo transplantací cizorodé kostní dřeně (BMT), který obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného 2 : N-terminální části kaseinu aSl pro prevenci nebo léčení autoimunitního onemocnění. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného 2 : N-terminální části kaseinu aSl pro prevenci nebo léčení virového onemocnění. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro prevenci virové infekce. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro vyvolání krvetvorby. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro vyvolání megakaryocytopoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro vyvolání erytropoézy • Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro vyvolání leukocytopoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro vyvolání t rombocytopoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro vyvolání proliferace plasmových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro vyvolání proliferace dendritických buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminálni části kaseinu aSl pro vyvolání proliferace makrofágů. Dále předkládaný vynález popisuj e použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro prevenci nebo léčení trombocytopenie. Dále předkládaný vynález popisuj e použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro prevenci nebo léčení pancytopenie. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro prevenci nebo léčení granulocytopenie. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro prevenci nebo léčení hyperlipidemie. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro prevenci nebo léčení cholesteremie. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro prevenci nebo léčení glukosurie. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro prevenci nebo léčeni cukrovky. 71 • « ···· Dále předkládaný vynález popisuje použiti peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro prevenci nebo léčeni AIDS. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro prevenci nebo léčení infekce HIV. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro prevenci nebo léčení stavů spojených s myeloblačními dávkami chemoradioterapie podporovanými transplantací vlastní kostní dřeně nebo periferních kmenových buněk (ASCT) nebo transplantací cizorodé kostní dřeně (BMT). Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro léčení stavu léčitelného trombopoetinem. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro umocnění účinku trombopoetinu. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro zlepšení mobilizace periferních krevních kmenových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro zlepšení kolonizace darovaných krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci. Dále předkládaný vynález popisuje použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro zlepšení kolonizace krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení autoimunitního onemocnění. ·«· • · ···· · · · · · · ··· · · c ··« · • · ··· · · * * ····« ··· · · · · « · · • ·« ·· ·· · » · · · 72 Dále předkládaný vynález popisuje použiti farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení virového onemocnění. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení virové infekce. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání krvetvorby. Dále předkládaný vynález popisuje použiti farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání megakaryocytopoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání erytropoézy. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání leukocytopoézy. 73 ·· ·· c · * · ♦ • · · · · · · t ·····

• »· ·* M Dále předkládaný vynález popisuje použiti farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání trombocytopoézy. Dále předkládaný vynález prostředku obsahujícího jako z N-terminální části kaseinu nosič pro vyvolání proliferace Dále předkládaný vynález prostředku obsahujícího jako z N-terminální části kaseinu nosič pro vyvolání proliferace Dále předkládaný vynález prostředku obsahujícího jako z N-terminální části kaseinu nosič pro vyvolání proliferace Dále předkládaný vynález prostředku obsahujícího jako z N-terminální části kaseinu nosič pro prevenci nebo léčení Dále předkládaný vynález prostředku obsahujícího jako z N-terminální části kaseinu nosič pro prevenci nebo léčení Dále předkládaný vynález prostředku obsahujícího jako z N-terminální části kaseinu nosič pro prevenci nebo léčení Dále předkládaný vynález prostředku obsahujícího jako z N-terminální části kaseinu nosič pro prevenci nebo léčení Dále předkládaný vynález prostředku obsahujícího jako popisuje použití farmaceutického aktivní složku peptid získaný aSl a farmaceuticky přijatelný plasmových buněk, popisuje použití farmaceutického aktivní složku peptid získaný aSl a farmaceuticky přijatelný dendritických buněk, popisuje použití farmaceutického aktivní složku peptid získaný aSl a farmaceuticky přijatelný makrofágů. popisuje použití farmaceutického aktivní složku peptid získaný aSl a farmaceuticky přijatelný trombocytopenie. popisuje použití farmaceutického aktivní složku peptid získaný aSl a farmaceuticky přijatelný pancytopenie. popisuje použití farmaceutického aktivní složku peptid získaný aSl a farmaceuticky přijatelný granulocytopenie. popisuje použití farmaceutického aktivní složku peptid získaný aSl a farmaceuticky přijatelný hyperlipidemie. popisuje použití farmaceutického aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčeni cholesteremie. Dále předkládaný vynález popisuje použiti farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení glukosurie. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení cukrovky. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení AIDS. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení infekce HIV. Dále předkládaný vynález popisuje použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení stavů spojených s myeloblačními dávkami chemoradioterapie podporovanými transplantací vlastní kostní dřeně nebo transplantací kmenových buněk periferní krve (ASCT) nebo transplantací cizorodé kostní dřeně (BMT). Dále předkládaný vynález poskytuje čištěný peptid, který má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25. Dále předkládaný vynález poskytuje farmaceutický prostředek obsahující čištěný peptid, který má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25 a farmaceuticky přijatelný nosič.

Tento vynález se úspěšně zaměřuje na problémy v současné době známých provedení tím, že popisuje peptidy vhodné pro léčení lidského onemocnění, které se získaly z N-terminální části kaseinu oíSI a které nevykazují detekovatelnou toxicitu, ale vykazují vysokou terapeutickou účinnost.

Další cíle, výhody a nové rysy vynálezu se stanou pro odborníka zřejmé po uvedení následujících příkladů provedení, které nejsou limitující. Navíc každé z různých provedení a hledisek tohoto vynálezu, jak se uvádí shora v textu a jak se nárokuje v části patentové nároky dále v textu, je experimentálně podloženo následujícími příklady. Příklady provedení vynálezu

Nyní se provede odvolání na následující příklady, které spolu s popisem uvedeným shora v textu bez omezení objasňují vynález.

Materiály a experimentální metody Příprava peptidů získaných z přirozeného kaseinu

Frakce kaseinu z kravského mléka se izolovala způsobem popsaným v publikaci N. J. Hipp, a kol. (1952), Dairy Sci., 35:272 a podrobila se vyčerpávajícímu proteolytickému štěpení chymosinem (také znám jako renin) v koncentraci 20 ng v jednom mililitru a při teplotě 30 °C. Po dokončení reakce se roztok zahřál, aby se deaktivoval enzym, a produkt štěpení se srážel jako parakaseinát okyselením organickou kyselinou, v tomto případě se může použít kyselina octová nebo trichloroctová. Parakaseinát se oddělil centrifugací a frakce supernatantu obsahující peptidové fragmenty se znovu srážela jako kaseicidin vyššími koncentracemi kyselin. Výsledný kaseicidin po opětném vytvoření suspenze, dialýze a neutralizaci se lyofilizoval. U výsledného prášku se testovala jeho biologická aktivita, jak se popisuje dále v textu, a oddělila se pomocí HPLC a provedla se analýza peptidů. 76 ·· · · • · • · · ·

Analýza HPLC peptidů získaných z přirozeného kaseinu

Peptidy získané z přirozeného kaseinu, jak se popisuje shora v textu, se analyzovaly pomocí HPLC ve dvou stádiích. Nejdříve se lyofilizované produkty štěpení kaseinu oddělily na koloně C18 s reverzní fází s gradientem 0,1% (hmotnost/hmotnost) vodná kyselina trifluoroctová-acetonitril. K detekci došlo podle absorpce UV záření při vlnové délce 214 nm. Pak se vzorky analyzovaly pomocí HPLC-hmotnostní spektrometrie (MS), přičemž uvedené zařízení obsahuje elektrický vstřikovací zdroj. Výpočty hmotností reprezentují hmotnost ionizovaných vzorků peptidů, jak se odvodilo z retenčních časů. Po oddělení se pomocí mikrosekvenátoru s plynou fází (Applied Biosystems 470A) stanovilo složení aminokyselin peptidů. Následující data jsou charakteristická: V typickém případě se pozorovalo osm peptidových píků, z nichž tři byly hlavní píky, které mají hodnoty Rt 17,79, 19,7, 23,02 a pět jich bylo minoritních s hodnotami Rt 12,68, 14,96, 16,50, 21,9 a 25,1. Hodnoty Rt reprezentují molekulovou hmotnost 2764, 1697, 1880, 2616, 3217, 2333, 1677 a 1669 daltonů. Při hodnotě Rt 17,79 (odpovídající molekulové hmotnosti 2764 daltonů ) hlavní pík peptidů obsahující 23 aminokyselin reprezentující aminokyseliny 1 až 23 kaseinu aSl má sekvenci RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRF (sekvence id. č.: 22, úplná sekvence kaseinu aSl se popisuje v publikaci McSweeny et al., 1993, ibidem) Jiné peptidy byly peptidy kaseinu β v polohách 208 až 224, kaseinu aSl v polohách 16 až 37 a peptid kaseinového prekurzoru podobnému kaseinu aS2 v polohách 197 až 222. Přítomny byly také jiné peptidy.

Syntetické peptidy získané z kaseinu

Firma NoVetide Ltd., (Haifa, Izrael) syntetizovala peptidy s prodlouženou délkou odpovídající aminokyselinám 2 až 26 77

N-konce kaseinu aSl. Čistota peptidů stanovená HPLC byla vyšší než 95 %. Kontrola kvality zahrnovala HPLC, hmotovou spektrometrii (El), analýzu aminokyselin a obsah peptidů. Tabulka č. 3 zahrnuje sekvence uvedených peptidů.

Tabulka č. 3 identi sekvence počet sekvence fikace (N konec-C konec) aminokyselin id. č. 74 RP 2 1 IP RPK 3 2 2P RPKH 4 3 3P RPKHP 5 4 4P RPKHPI 6 5 5P RPKHPIK 7 6 Y RPKHPIKH 8 7 X RPKHPIKHQ 9 8 la RPKHPIKHQG 10 9 2a RPKHPIKHQGL 11 10 3a RPKHPIKHQGLP 12 11 A RPKHPIKHQGLPQ 13 12 B RPKHPIKHQGLPQE 14 13 C RPKHPIKHQGLPQEV 15 14 D RPKHPIKHQGLPQEVL 16 15 E RPKHPIKHQGLPQEVLN 17 16 F RPKHPIKHQGLPQEVLNE 18 17 G RPKHPIKHQGLPQEVLNEN 19 18 H RPKHPIKHQGLPQEVLNENL 20 19 I RPKHPIKHQGLPQEVLNENLL 21 20 J RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLR 22 21 K RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRF 23 22 L RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFF 24 23 M RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFV 25 24 N RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFVA 26 25 78 ·«· • ·

Juvenilní diabetes (typ I, IDDM) u neobezních diabetických myší (NOD)

Peptidy získané z přirozeného kaseinu

Myši NOD jsou běžně používaný model pro výzkum autoimunitního onemocnění a juvenilní diabetes u člověka. Šest týdnů starým samicím myší NOD se aplikovala jednou týdně jedna nebo dvě injekce obsahující 100 pg peptidů získaných z přirozeného kaseinu do doby, kdy se dosáhlo 5 nebo 10 ošetření. Kontrolním myším se neaplikovala žádná léčba. Vážnost onemocnění se stanovila vzhledem k glukosurii, která se měřila použitím testovacích papírků Combi (popisuje se v publikaci Gross, D.J. a kol. (1994), Diabetology, 37: 1195). Výsledky se vyjádřily jako procento myší v každém vzorku, které netrpí glukosurii, po dobu 365 dní.

Syntetické peptidy získané z kaseinu V dalším experimentu se šest týdnů starým samicím myší NOD aplikovala jednou týdně jedna injekce obsahující 100 pg syntetických peptidů získaných z kaseinu do doby, kdy se dosáhlo 5 ošetření. Kontrolním myším se neaplikovala žádná léčba. Vážnost onemocnění se stanovila jako počet zdravých myší v různých léčených skupinách.

Test tolerance na intraperitoneální glukosu (IPGTT)

Test tolerance na glukosu je rozhodující způsob jak prozkoumat metabolismus glukosy a tendenci k cukrovce u savců. Dvacet pět (25) týdnů po podání syntetických peptidů získaných z kaseinu byla zjištěna reakce na glukosu provedením testu tolerance na intraperitoneální glukosu. Injekce glukosy sestávala z 1 g na kg tělesné hmotnosti. Glykemické hodnoty byly stanoveny z krve odebrané před testem (Ominut) a 60 minut po podání. Množství glukosy v plasmě byla stanovena pomocí Glucose Analyzer 2 (Beckman Instruments, Fullerton, CA) a 79

vyjádřeny jako milimoly na litr. Normální hodnoty nepřesahují 140 mmol/1.

Stimulace proliferace buněk přirozených zabíječů (NK) Z lidských kmenových buněk periferní krve (PBSC) PBSC pocházející ze subjektů léčených G-CSF se oddělily na gradientu sloučeniny FICOLL, dvakrát se promyly kultivačním médiem RPMI-1640 a nanesly se do prohlubní o objemu 1,5 ml spolu s peptidy, které se získaly z přirozeného nebo syntetického kaseinu (koncentrace peptidů je 0 až 500 pg/ml), nebo se peptidy nepřidávaly. Po dvou dnech inkubace se u buněk testovala přirozená smrtící aktivita měřením radioaktivity uvolněné z cílových buněk K562 značených 35S (NEG-709A, 185,00 MBq, 2,00 mCi EASYTAGth metionin, L-[3sS] 43,48 Tbq/mmol, 1175,0 Ci/mmol, 0,488 ml, Boston USA). Dvě koncentrace efektorových buněk (2,5 x 105 a 5 x 105 buněk v jamce) se inkubovalo s 5 x 103 cílových buněk v jedné jamce (poměry efektor:cílové buňky je 50:1 respektive 100:1) na tkáňových kultivačních destičkách s 96 jamkami s dnem ve tvaru U. Buňky se inkubovaly po dobu 5 hodin při teplotě 37 °C v atmosféře 5% C02, 95% vzduchu. Sraženina se separovala centrifugací při 1000 ot./min. po dobu 5 minut. V kapalném supernatantu vzorku o objemu 50 μΐ se měřila uvolněná 35S. Z buněk myší kostní dřeně (BM)

Kostní dřeň se získala z dlouhých kostí přední a zadní končetiny neošetřených myší BALB/c a C57B1/6 pomocí injekce média za použití jehly 25 gauge. Odsáté buňky se promyly kultivačním médiem RPMI 1640, hemocytometrem se určil jejich počet a barvením se určil počet živých buněk (20 μΐ buněk do 380 μΐ směsi kyselina octová/trypanová modř), buňky se vnesly do kultivačních lahví v koncentraci 2 až 5 x 106 buněk v jednom mililitru kultivačního média RPMI-1640, které obsahuje 10% fetální telecí sérum, antibiotika a glutamin s peptidy získanými z přirozeného kaseinu v koncentraci 100 pg/ml nebo peptidy nejsou obsaženy. Buněčná kultura se inkubovala v atmosféře 5% C02, 95% vzduchu po dobu 12 až 15 dní při teplotě 37 °C. Buňky se shromáždily centrifugací při 1500 ot./min. po dobu 10 minut, stanovil se jej ich počet a buňky se vnesly do jamek se dnem ve tvaru u, které obsahuj í buňky myšího lymfomu (YAC) značené 51Cr (chrom-51, 740 MBq, 2,00 mCi) nebo 35S ( (NEG-709A, 185,00 MBq, 2,00 mCi EASYTAGth metionin, L-[35S] 43,48 Tbq/mmol, 1 175,0 Ci/mmol, 0,488 ml,

Boston USA) v poměru efektor:cílová buňky 25:1 nebo 50:1. Aktivita NK se vyjádřila jako procento radioaktivity v supernatantech bez buněk.

Proliferace lidských buněk v kultuře

Periferní krev se získala ze zdravých nebo nemocí postižených pacientů. Postižení pacienti se neléčili před plazmaferézou jiným způsobem než aplikací G-CSF. Buňky kostní dřeně (BM) se získaly ze zdravých dobrovolníků nebo od nemocných pacientů ve stádiu remise, která následuje po chemoterapii, odsátím. Pupečníková krev se shromáždila během normálního porodu. Lidské buňky různého původu se oddělily pomocí gradientu sloučeniny FICOLL, dvakrát se promyly kultivačním médiem RPMI-1640 a vnesly se do jamek s rovným dnem na destičky určené pro tkáňové kultury v udaných koncentracích spolu s peptidy získanými z přirozeného nebo syntetického kaseinu nebo bez nich. Vše, včetně kontrol, se provedlo ve třech provedeních. Proliferace buněk se stanovila začleněním 3HT: přidal se radioaktivní thymidin (thymidin(methyl-[3H] ) , specifická aktivita 65 Ci/ml, 37 MBq/ml, ICN Corp.), pak následovala inkubace po uvedený počet dní. Buňky se inkubovaly se značením 16 až 20 hodin, shromáždily se a promyly se kultivačním médiem. Začleněná radioaktivita se měřila β-scintilačním počítačem.

Proliferace leukémie K562 a buněčná linie karcinomu tlustého střeva

Buňky Colon a K562 jsou zavedené buněčné linie rakovinových buněk, které rostou v kultuře. Obě buněčné linie se kultivovaly v kultivačních nádobách v atmosféře 5% C02, 95% vzduchu při teplotě 37 °C, shromáždily se a promyly se kultivačním médiem, pak se vnesly do jamek vhodných pro tkáňové kultury v koncentraci 4 x 105 buněk (K562) nebo 3 x 103 buněk (Colon) do jedné prohlubně. Do prohlubní se přidaly peptidy získané z přirozeného kaseinu v uvedených koncentracích, po 9 (buňky K562) nebo 3 (buňky Colon) dnech inkubace se přidal značený thymidin, jak se popisuje shora v textu. Shromáždění buněk a měření začleněné radioaktivity se provedlo způsobem popsaným shora v textu.

Fluorescenční protilátková detekce proliferace buněk přirozených zabíječů a T buněk v lidských kmenových buňkách periferní krve (PBSC)

Kmenové buňky periferní krve (PBSC) pocházející z lidských subjektů, kterým se aplikovala léčba G-CSF, se shromáždily plazmaferézou, separovaly se gradientem sloučeniny FICOLL, dvakrát se promyly kultivačním médiem RPMI-1640, které obsahuje 10% fekální telecí sérum a vše se inkubovalo při teplotě 37 °C v atmosféře 5% C02, 95% vzduch s peptidy získanými z přirozeného kaseinu v uvedených koncentracích nebo bez nich. Po 10, 14 nebo 28 dnech inkubace s peptidy získanými z přirozeného kaseinu se přítomnost buněk T (povrchový antigen CD3) a přirozených buněk K (povrchový antigen CD56) stanovila přímou imunofluorescencí za použití fluorescenčních protilátek proti antigenu CD3 (CD3/FITC klon UHCTi) , fluorescenční protilátky proti CD56 (CD56/RPE klon MOC-1) (DAKO A/S, Dánsko) a jako kontrola sloužily myší protilátky IgGl/RPE a IgGl/FITC. Detekce fluorescenčně značených buněk se provedla selekcí fluorescenčně aktivních buněk (FACS). 82

Stimulace krvetvorby z buněk kostní dřeně (BM) v kultuře

Proliferace megakaryocytů za vzniku multipotencionálních kolonií (CFU-GEMM) z myších buněk kostní dřeně

Primární buňky kostní dřeně (v koncentraci 1 x 105 buněk/ml) pocházející z 8 až 12 týdnů starých myší C3H/HeJ se kultivovaly v kultivačním médiu IMDM s methylcelulózou bez séra v atmosféře 5% C02, 95% vzduchu při teplotě 37 °C po dobu 8 až 9 dní. Kultivační médium vhodné pro kultivaci multipotencionálních kolonií (CFU-GEMM) obsahovalo 1% BSA (Sigma), 1(Γ4 M thioglycerol (Sigma), 2,8 x 1(Γ4 M transferin (TF, Biological Industries, Izrael), 10% WEHI-CM jako zdroj IL-3 a 2 U/ml erytropoetinu (rhEPO, R & D Systems, Minneapolis) . Kolonie se hodnotily po 8 až 9 dnech za použití mikroskopu s tmavým polem Olympus. Kolonie se izolovaly mikropipetou, centrifugovaly se na cytocentrifuze a obarvily se metodou podle May-Grunwald-Giemsa za účelem stanovení počtu diferenciovaných buněk. V každém přípravku se stanovilo nejméně 700 buněk.

Proliferace dendritických buněk v CFU-GEMM

Multipotenciální (CFU-GEMM) kolonie kultivované z primárních buněk kostní dřeně způsobem popsaným shora v textu v testu proliferace megakaryocytů byly odebrány, barveny a spočítán počet dendritických buněk. V každém preparátu bylo napočítáno alespoň 700 buněk.

Proliferace plasmových buněk v CFU-GEMM

Multipotenciální (CFU-GEMM) kolonie kultivované z primárních buněk kostní dřeně způsobem popsaným shora v textu v testu proliferace megakaryocytů byly odebrány, barveny a spočítán počet plasmových buněk. V každém preparátu bylo napočítáno alespoň 700 buněk. 83 • · Μ·· » t

Proliferace makrofágových buněk v CFU-GEMM

Multipotenciální (CFU-GEMM) kolonie kultivované z primárních buněk kostní dřeně způsobem popsaným shora v textu v testu proliferace megakaryocytů byly odebrány, barveny a spočítán počet makrofágových buněk. V každém preparátu bylo napočítáno alespoň 700 buněk.

Proliferace červených krvinek v CFU-GEMM

Multipotenciální (CFU-GEMM) kolonie kultivované z primárních buněk kostní dřeně způsobem popsaným shora v textu v testu proliferace megakaryocytů byly odebrány, barveny a spočítán počet červených krvinek. V každém preparátu bylo napočítáno alespoň 700 buněk.

Proliferace polymorfonukleárnich buněk v CFU-GEMM

Multipotenciální (CFU-GEMM) kolonie kultivované z primárních buněk kostní dřeně způsobem popsaným shora v textu v testu proliferace megakaryocytů byly odebrány, barveny a spočítán počet polymorfonukleárnich buněk. V každém preparátu bylo napočítáno alespoň 700 buněk.

Proliferace buněk tvořících megakaryocyty a erytroidy z buněk lidské kostní dřeně a pupečníkové krve

Vzorek kostní dřeně pocházející ze zjevně zdravého člověka se oddělil hustotním gradientem použitím Histopaque-107 (Sigma Diagnostics), přičemž se získala čistá populace jednojaderných buněk (MNC). Testy kolonií se provedly v kultivačním mediu naneseném na plotny obsahujícím methylcelulózu v konečné koncentraci 0,92 % (4000 centripase prášek, Sigma Diagnostic), opětně se hydratovaly v Dulbeccově médiu upraveném podle Iscova obsahujícím 36 mM uhličitan sodný (Gibco), 30% fetální telecí sérum (FBS) (Hyclone), 0,292 mg/ml glutaminu, 100 U/ml penicilinu a 0,01 mg/ml streptomycinu (Biological Industries,

Beit Haemek). Při normálním porodu se shromáždila pupečníková krev a upravila se způsobem popsaným shora v textu.

Kultivační médium obsahující 105 MNC v jednom mililitru o objemu 0,33 ml se naneslo do jamek v trojnásobném provedení na tkáňové kultivační destičky s 24 jamkami (Greiner). Kultury se inkubovaly při teplotě 37 °C v atmosféře 5% C02, 95% vzduchu a 55% relativní vlhkosti s peptidy získanými z přirozeného kaseinu nebo syntetického kaseinu v uvedené koncentraci nebo bez nich. Na destičkách se po 14-ti dnech odečetly kolonie obsahující více než 50 buněk. Megakaryocyty se identifikovaly přímou imunofluorescencí za použití vysoce specifických králičích protilátek, které rozeznávají glykoproteiny lidských krevních destiček a kozí anti-králičí IgG konjugované s FITC. Přidané růstové faktory zahrnovaly 15 ng/ml leukomaxu (GM-CSF) (Sandoz Pharma) a 5% (objem/objem) médium (CM) upravené lidským fytohemaglutininem-m (Difco Lab), aby se vyvolal vývoj kolonií granulocyty-monocyty (CFU-GM). Erytropoetin (EPO) 2 U/ml se použil k vyvolání tvorby erytroidových kolonií (shluk tvořící jednotkový erytroid BFU-E). V jiném případě buňky lidské kostní dřeně pocházející z dobrovolných dárců nebo pacientů, kteří prodělali transplantaci vlastní kostní dřeně se předem kultivovaly v kultivačním médiu obsahujícím 10 až 1000 pg/ml peptidů získaných z přirozeného kaseinu. Buňky se kultivovaly na semi-pevném agaru a stanovil se počet granulocytových makrofágových krvetvorných koloní (GM-CFU) 7 nebo 14 dní po léčbě.

Megakaryocytopoéza se stanovila u normálních buněk kostní dřeně, které pocházejí z dobrovolných lidských dárců, stanovením počtu megakaryocytů ve vzorcích kapalné kultury (RPMI-1640 plus 10 % lidské sérum AB, glutamin a antibiotika) s peptidy získanými s přirozeného kaseinu v koncentraci 100 pg/ml nebo se odhadla tvorba kolonií v methylcelulózovém testu. Inokulovalo se 2 x 105 buněk kostní dřeně v přítomnosti standardního růstového faktoru s peptidy získanými • · • · • · ······ * ♦ «·· ·· · · · · · • · · · · · ··· · *··· • · · · · · · ·· * ··· ·· ·· ·· ·· · z přirozeného kaseinu nebo bez těchto peptidů. Megakaryocyty v methylcelulózovém testu se počítaly použitím inverzního mikroskopu 10 až 14 dní po inokulaci.

Klinické studie použití peptidů získaných z přirozeného kaseinu V jedné sérii studií se jediná dávka obsahující 50 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu se aplikovala do svalu lidských subjektů ve 3 uloženích v období 2 hodin. Klinické parametry se zaznamenávaly v uvedených intervalech. Při jiných studiích se pacientům v různých fázích léčby a/nebo ve stádiu remise onemocnění zhoubným bujením a metastatickým onemocněním jednou nebo dvakrát aplikovaly peptidy získané z přirozeného kaseinu a zaznamenávaly se změny v počtu buněk periferní krve.

Inhibice in vitro infekce lidských lymfocytů virem HIV

Peptidy

Peptidy (buď peptidy získané z přirozeného kaseinu nebo syntetické peptidy (v délce 2 až 26 aminokyselin, popisuje se v tabulce 3) získané z kaseinu ve formě lyofilizovaného prášku se resuspendovaly v úplném kultivačním médiu RPMI a přidaly se do buněčných kultur v konečné koncentraci 50 až 1000 pg/ml.

Buňky

Je známo, že několik typů čerstvě izolovaných lidských buněk (primární buňky) a buněčných linií je náchylných k in vitro infekci HIV-1, ačkoli v podstatě libovolná buňka vykazující dokonce nízká povrchová množství molekuly CD4 se může považovat za potencionální cíl in vitro infekce HIV-1. Vybraly se dvě běžně používané lidské buněčné linie, které jsou vysoce citlivé vůči infekci HIV-1. Jsou to CEM a Sup-Tl. CEM je lidská T4-lymfoblastová buněčná linie z počátku získaná z periferní krve čtyři roky staré čtyřleté dívky trpící akutní lymfoblastová leukémií (popisuje se v publikaci G.E. Foley a kol. (1965), Cancer 18: 522). Tyto buňky se nepřetržitě udržovaly v suspenzi v kultivačním médiu a užívají se při analýze infekčnosti, antivirových činidel a neutralizačních protilátek.

Sup-Tl je lidská T-lymfoblastová buněčná linie izolovaná z pleurálního průsaku osmiletého chlapce trpícího T-buněčným lymfomem, který není lymfom Hodgkinsova typu (Smith, S.D. a kol. (1984) Cancer Research 44: 5657). Tato buňka exprimuje vysoké množství povrchového CD4 a je možné ji použít při studiu buněčných fúzí, cytopatického účinku a infekčnosti HIV-1.

Buňky Sup-Tl se kultivují v suspenzi v obohaceném médiu.

Kultivační médium

Buňky se kultivovaly v úplném kultivačním médiu RPMI-1640 obohaceném 10% fetálním bovinním sérem, 2 mM glutaminem a 2 mM antibiotiky penicilin-streptomycin (GIBCO).

Virus

Použitý virus HIV je HIV-1IIIB, který se původně označoval jako HTLV-IIIB. Pro dosažení permanentní produktivní infekce v buňkách H-9 se použily koncentrované tekutiny kultur periferní krve z několika pacientů trpících AIDS nebo příbuzných onemocnění. Tento subtyp B viru vykazuje vysokou kapacitu replikace v lidské linii T-buněk. Virový titr v zásobní kultuře je 5,38 ng/ml.

Peptidy značené FITC

Použil se FITC F-1300 (isomer I isothiokyanát fluoresceinu, Sigma (F25o-2), st. Louis, Mi, USA) vykazující maximum emise/excitace při vlnové délce 494 respektive 520 nm. Derivát fluoresceinu, který reaguje s aminem, je pravděpodobně nejběžnější fluorescenční derivatizační činidlo vhodné pro kovalentní značení proteinů. Peptidy konjugované s FITC získané z přirozeného kaseinu se připravily kovalentní vazbou FITC na aminoskupiny lyzinu.

Test záchytu antigenu HIV-1 P24

Použitá testovací sada záchytu antigenu HIV-1 P24 se navrhla pro kvantifikaci jaderného antigenu HIV-1 P24, který je přímo úměrný stupni produkce viru v buňkách. Tato sada se získala z vakcinačního programu AIDS z instituce SAIC-NCI-Frederick Cancer Research Institute, P.O. Box B, Frederick, M.D 21702, USA a zahrnuje destičky s 96 prohlubněmi potaženými monoklonální protilátkou proti HIV-1 P24, primární protilátka je králičí anti-HIV P24 sérum, sekundární protilátka je kozí protilátka proti králičímu IgG (H+L) konjugovaná peroxidázou, TMB peroxidázový substrátový systém a lyžovaný standard HIV-1 P24. Test záchytu antigenu HIV-1 P24 se analyzoval čtecím zařízením pro test ELISA Organon-Technica při vlnové délce 450 nm s odkazem na vlnovou délku 650 nm.

Test ELISA záchytu antigenu HIV-1 P24

Infekce HIV se měřila nepřímým enzymatickým imunologickým testem, který detekuje jaderné antigeny HIV-1 P24 v kultivačním médiu tkáňové kultury. Supernatant tkáňové kultury reagoval s primárním králičím anti-HIV-1 P24 antigenem a zviditelnil se kozí anti-králičím IgG konjugovaným s peroxidázou. Reakce se ukončila přidáním 4N kyseliny sírové, kde intenzita barvy, která se vyvinula, je úměrná množství antigenu HIV-1 přítomném v supernatantu tkáňové kultury.

Laboratoř vhodná pro práci s vysokým stupněm biologického rizika (BL-3)

Produkce, Izolace a infekce viru, tkáňové kultury buněk infikovaných HIV-1, shromáždění supernatantu antigenu P24 a ELISA záchytu antigenu P24 se provedly v zařízení BL-3 v instituci Hebrew University, Hadassah Medical School, které 88 • · «· ···· 88 • · «· ···· * * • · • · · ·· ·· • · ·

• · • · · ·· · · • · · * ♦ t « · · ··· «· vyhovuje praxi biologické bezpečnosti dané institucemi NIH a CDC (USA).

Průtoková cytometrie Třídiči zařízení buněk FACSort (Becton & Dickinson, San Jose, CA. USA) se použilo v případě (i) stanovení procenta buněk CEM a Sup-Tl pozitivních na antigen CD4 před infekcí HIV-1 za účelem zajistit stejný stupeň infekce v každém experimentu a ii) detekce T buněk, které nesou ve své cytoplazmě a jádru peptidy konjugované s FITC z přirozeného kaseinu.

Inkubátor s atmosférou C02 V případě buněk produkujících virovou kulturu s HIV-1 se buňky a virus předem ošetřený peptidy získanými z přirozeného kaseinu a buňky, které se dále inkubovaly s HIV-1, se udržovaly v inkubátoru s atmosférou C02 po dobu trvání experimentu. HIV infekce lidských kultivovaných buněk CD4

Pro delší inkubace byly buňky (CEM, Sup-1) předem inkubovány s několika zvyšujícími se koncentracemi peptidů získaných z přirozeného kaseinu (50 až 1000 pg/ml) nebo syntetických peptidů získaných z kaseinu (10 až 500 pg/ml) po dobu 24 (v případě syntetických a přirozených peptidů) a 48 hodin (pouze v případě přirozených peptidů) a po kultivaci se do každé jamky přidal HIV-1IIIB (v konečné koncentraci 45 pg/ml). Pro kratší inkubace se (3 hodiny) se HIV-1IIIB předem inkuboval s peptidy po dobu 3 hodin a pak se přidal k buňkám (5000 buněk do jedné jamky) na destičkách vhodných pro tkáňové kultury. Kontroly byly IF (infikované, buňky kultivované s HIV-1 a bez peptidů), UIF (neinfikované, buňky kultivované bez HIV-1 a bez peptidů) a UIF+Ch (neinfikované + peptidy získané z přirozeného kaseinu, buňky kultivované 89 • · • · • · · · · · • · * · • · · · • · · • · · · · * • · · · · • · · · · · ·

v přítomnosti peptidů se získaly z přirozeného kaseinu [50 až 1000 pg/ml]) a použila se k testování účinku peptidů získaných z přirozeného kaseinu a syntetických peptidů získaných z kaseinu na schopnost buněk přežít a na jejich růst. U buněk se hodnotila schopnost přežít a rychlost proliferace v den 7, 10 a 14 po infekci (den shromáždění supernatantu s kultury s antigenem P24). Buňky a supernatanty tkáňových kultur (kultivační médium) se shromáždily a lýzovaly bezprostředně v 1/10 objemu 10% Tritonu X-100. Tyto vzorky se dále inkubovaly při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny a udržovaly se při teplotě -80 °C až do okamžiku testování antigenu P24.

Konfokální mikroskopie

Konfokální systém laserového snímání Zeiss LSM 410 připojený k inverznímu mikroskopu TW Zeiss Axiovert 135M používající laserový snímací konfokální mikroskopický postup se použil k detekci vstupu peptidů konjugovaných s FITC do buněk. T buňky se inkubovaly s peptidy konjugovanými s FITC získanými z přirozeného kaseinu v inkubátoru s atmosférou 5% C02, 95% vzduchu při teplotě 37 °C. Po inkubaci se buňky promyly třikrát fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem (PBS), aby se odstranily nevázané peptidy konjugované s FITC. Buňky se fixovaly s 3,8% formalinem po dobu 10 minut, dvakrát se promyly PBS a před mikroskopickým pozorování se buňky resuspendovaly v 50 až 100 μΐ PBS. Vybraná zobrazení buněk z různých časových bodů inkubace (15 minut, 30 minut, jedna hodina, 1,5 hodiny a 3 hodiny) vykazují různá množství peptidů konjugovaných s FITC získaných z přirozeného kaseinu v jejich cytoplazmě a v jádru se uložila na 3,5 disk „ZIP" (230 MB) a obrázky se zpracovaly použitím softwaru Photoshop. 90 • · ···· • · • · • · · • · · · ·

Test začlenění [3H] -thymidinu

Za účelem testovat účinek peptidů získaných z přirozeného kaseinu na proliferaci T buněk, několik koncentrací peptidů získaných z přirozeného kaseinu (10 mg/ml zásobního roztoku v kultivačním médiu RPMI) se přidalo do kultur buněk Sup-Tl na destičce s 96 mikrojamkami s plochým dnem (5000 buněk v jedné jamce), jak se popisuje v případě infekce HIV-1 v buňkách Sup-Tl. Určil se počet buněk a jejich životnost se stanovila exkluzí barviva trypanové modře. Buňky se vystavily pulzům s [3H]-thymidin v každém časovém bodě (3, 7, 10 a 14 dní) po dobu 18 hodin (přes noc) a shromáždily se na filtrech se skleněnými vlákny za účelem zaznamenání radioaktivity (začlenění [3H]-thymidinu do buněčné DNA je úměrné stupni buněčné proliferace).

Toxicita peptidů získaných z přirozeného kaseinu u normálních, myeloblatovaných myší a morčat, které jsou příjemci transplantátu

Normálním zvířatům se aplikovalo intravenózní nebo intramuskulární injekcí v jedné nebo ve třech dávkách až 5000 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu na jeden kilogram hmotnosti zvířete. Použila se řada kmenů myší, které zahrnují myši BALB/c, C3H/HeJ a neobézní diabetické myši (NOD). Myši se sledovaly 10 měsíců před usmrcením a provedl se test po jejich smrti (test toxicity) nebo se sledovaly po dobu 200 dní (míra přežití). Morčatům se aplikovalo jediná intramuskulární injekce s 20 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu na jedno zvíře. O 15 dní později se zvířata usmrtila a zjišťovaly se změny v těle.

Obnova leukocytů a krevních destiček u myší, které jsou příjemci transplantátu kostní dřeně

Myši BALB/c se vystavily subletálnímu záření ze zdroje vzdáleného od kůže 70 cm, dávka je 50 cGy/minutu při celkové 91 dávce 600 cGy. Ozářeným myším se transplantovala syngenní kostní dřeň, jak se popisuje shora v textu. O 24 hodin později se zavedl intravenózní injekcí 1 mg (na jedno zvíře) peptidů získaných z přirozeného kaseinu, syntetických peptidů získaných z kaseinu (13 až 26 aminokyselin, popisuje se v tabulce č. 13 shora v textu) nebo lidského sérového albuminu (slouží jako kontrola) při dvojitém slepém pokusu. Obnova leukocytů se stanovila podle počtu buněk v periferní krvi shromážděné v uvedených časových intervalech od 6 do 12 dní po léčbě. Obnova krevních destiček se stanovila počtem buněk v krvi shromážděné z retroorbitálního plexusu do heparizovaných kapilár v uvedených intervalech od 6 do 15 dní po léčbě. V dalších sériích experimentů se myši CBA letálně ozářily (900 cGy) a ošetřily se peptidy získanými z přirozeného kaseinu nebo lidského sérového albuminu, jak se popisuje shora v textu. Obnova krevních destiček se testovala způsobem uvedeným shora v textu.

Ve třetí sérii experimentů se myši ozářily (900 cGy) , rekonstituovaly a intraperitoneálně jim bylo injikováno 100 gg syntetických peptidů získaných z kaseinu (peptidy 3a a 4P představující 6 a 12 aminokyselin N-koncové části aSl kaseinu, viz tabulka 3 shora v textu) jednou denně ve dnech 4, 5, 6 a 7 po transplantaci. Obnova krevních destiček se testovala 10 a 12 dnů po transplantaci.

Rekonstituce myší, které jsou příjemci transplantátu kostní dřeně

Myši C57/B1/6 se letálně ozářily ze zdroje vzdáleného od kůže 70 cm. Dávka záření byla 50 cGy za minutu. Celková dávka byla 900 cGy. Ozářeným myším se provedla transplantace kostní dřeně z myší, které se ošetřily před shromážděním kostní dřeně 1 mg (na jedno zvíře) peptidů získaných z přirozeného kaseinu nebo fyziologickým roztokem. Následuje dvojitý slepý protokol. V jednom experimentu se myší, které přežily sledovaly po 18 dní. V jiném experimentu se myši usmrtily po 8 dnech a sledovala se kolonizace sleziny.

Syntetické peptidy získané z kaseinu znatelně snižují množství cholesterolu

Schopnost syntetických peptidů získaných z kaseinu snižovat množství cholesterolu u sedmitýdenních samic myší C57Bl/6j byla posuzována po krmení aterogenní stravou. Myši byly rozděleny do skupin po osmi. Jedna kontrolní skupina byla krmena normální stravou. Druhá kontrolní skupina byla krmena upravenou Thomas Hartroftovou stravou obsahující cholát (#TD 88051: Teklad, Madison, WI) [Gerber, D. W. a kol., Journal of Lipid Research, 42, 2001]. Jeden týden po krmení touto stravou se hodnoty cholesterolu v séru znatelně zvýšily a syntetické peptidy získané z kaseinu byly intraperitoneálně injikovány v množství 1 mg na myš s další injekcí v množství 0,1 mg o jeden týden později.

Množství cholesterolu v krvi byla stanovena pomocí testu Roche Cholesterol Assay založeném na enzymatickém postupu Roeschlou & Allin (Roche, lne., Německo). Výsledky experimentů

Peptidy získané z přirozeného kaseinu

Na základě pozorování, že sražené mléko nahodile inhibuje bakteriální růst se izoloval z mléčných proteinů fragment kaseinu, který má baktericidní vlastnosti (popisuje se v patentovém dokumentu USA č. 3 764 670, Katzirkatchalsky, a kol.). Surové peptidy získané proteolýzou přirozeného kaseinu se připravily kyselým srážením rozpustné frakce produktu protelytického štěpení kaseinu, dialýzou a lyofilizací. Když se provedly testy biologické aktivity po dlouhodobém skladování, zaznamenalo se, že tento surový přípravek, když se 93 • · ·Μ· • · • · · · « · · · ··· ····· • · · · • · · lyofilizoval a uchovával při teplotě 4 °C, zůstal aktivní {in vitro a in vivo) po dobu alespoň 12 měsíců.

Za účelem identifikovat aktivní peptidy obsažené v peptidech získaných z přirozeného kaseinu se lyofilizovaný surový přípravek rozdělil na frakce za použití vysoce výkonné kapalinové chromatografie (HPLC), jak se popisuje shora v textu. Všechny z lyofilizovaných analyzovaných vzorků vykazovaly podobné retenční časové profily v souladu s informacemi uvedenými shora v textu.

Pak hlavní složka surových peptidů získaný z přirozeného kaseinového přípravku je N-terminální fragment kaseinu aSl.

Peptidy získané z přirozeného kaseinu nejsou pro hlodavce ani člověka toxické

Rozsáhlé zkoumání krátkodobých a dlouhodobých účinků vysokých dávek peptidů získaných z přirozeného kaseinu u myší, morčat a člověka potvrdilo, že přípravky nevykazují toxicitu, teratogenicitu nebo nežádoucí vedlejší účinky. V jedné sérii testů jediná dávka reprezentující 7000 násobek odhadnuté účinné dávky peptidů získaných z přirozeného kaseinu se aplikovala intramuskulárně letálně ozářeným myším, kterým se aplikovaly syngenní transplantáty kostní dřeně. Standardní pitva myší 14 dnů po léčbě neprokázala žádné toxické účinky na vnitřní orgány nebo jiné odchylky od normálu. Podobné testy toxicity provedené na morčatech neprokázaly žádné abnormality dva týdny po jediné intramuskulární dávce obsahující 20 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu. V jiných sériích experimentů vysoké dávky peptidů získaných z přirozeného kaseinu aplikované zdravým myším nevykazují žádný účinek na několik hematologických parametrů zjišťovaných o dva týdny později. Tyto parametry zahrnují bílé krvinky (WBC), červené krvinky (RBC), hemoglobin (HGB), elektrolyty, glukózu a jiné. Třetí série experimentů testovala opakované vysoké dávky 100 mg na jeden kilogram tělesné hmotnosti u myší a krys po dobu dvou týdnů, při pitvě se neprokázaly žádné alergické, zpožděné kožní nebo anafylaktické odezvy a žádné patologické účinky. Když se testoval účinek peptidů získaných z přirozeného kaseinu v dlouhodobé studii dlouhodobého přežívání ozářených myší BALB/c a C3H/HeJ, kterým se provedla transplantace kostní dřeně, počet přeživších ošetřených myší (18 jedinců z 27 myší BALB/c a C3H/HeJ, 66 %) jasně přesahuje míru přežití kontrol ošetřených albuminem (4 jedinci z 26 myší BALB/c a C3H/HeJ, 15 %) . Standardní teratogenní testy (podrobněji se popisují v publikaci Drug safety in pregnancy, Folb and Dakes, str. 336, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford (1990)) u myší ošetřených peptidy získanými z přirozeného kaseinu neprokázal žádný účinek peptidů na jakýkoliv vývojový parametr.

Podobně jako se neprokázala žádná toxicita nebo vedlejší účinky při testování na hlodavcích, peptidy získané z přirozeného kaseinu byly bezpečné, když se aplikovaly člověku. Porovnání vzorků krve a moči, které pocházejí ze sedmi zdravých dobrovolníků, odebraných před, během a 7 dní po intramuskulární injekci peptidů získaných z přirozeného kaseinu neprokázaly žádné změny v klinických parametrech. Nepozorovaly se žádné jiné negativní účinky.

Tak vysoká dávka a rozsáhlá léčba hlodavců peptidy získanými z přirozeného kaseinu neprokázala zjevnou toxicitu, hypersenzitivitu, patologické, teratogenní, serologické nebo jiné negativní účinky. Avšak aplikace peptidů získaných z přirozeného kaseinu ozářeným myším, kterým hrozilo nebezpečí krátce nebo dlouze trvajících komplikací, potvrdilo podstatné zvýšení počtu myší, které přežily 200 až 300 dní. Tato skutečnost a nepřítomnost žádných nežádoucích účinků u zdravých dobrovolníků, kterým se injekcí aplikovaly peptidy získané z přirozeného kaseinu bezpečnost peptidů při parenterální aplikaci. které jsou příjemci transplantátu

Rekonstituce myší, kostní dřeně

Když myši C57/B1/6 se letálně ozářily a rekonstituovaly se syngenní kostní dření z myší, které se buď ošetřily den před odsátím kostní dřeně 1 mg (na jedno zvíře) peptidů získaných z přirozeného kaseinu nebo se jim uvedené peptidy neaplikovaly, počet přeživších myší, kterým se aplikovala kostní dřeň z ošetřených myší daleko překročil počet přeživších myší, kterým se aplikovala kostní dřeň z neošetřených myší (počet přeživších ozářených myší, kterým se aplikovala kostní dřeň z ošetřených myší, byl 10 dní po ozáření 15 z 18, zatímco počet přeživších ozářených myší, kterým se aplikovala kostní dřeň z neošetřených myší byl 10 dní po ozáření 4 ze 17). Sleziny získané z ozářených myší, kterým se aplikovala kostní dřeň z ošetřených myší, zahrnovaly přibližně dvakrát až třikrát více kolonií v jedné slezině ve srovnání se slezinami ozářených myší, kterým se aplikovala kostní dřeň z neošetřených myší (1 až 5 kolonií ve srovnání s 0 až 3 koloniemi).

Peptidy získané z přirozeného kaseinu stimulují proliferaci lymfocytů

Buňky přirozených zabíječů (NK) a cytotoxické buňky T jsou rozhodující pro schopnost imunitního systému chránit proti invazi infekčních patogenů a buněk zhoubného bujení a to aktivní cytotoxicitou a vylučováním imunoregulačních lymfokinů. Oslabení imunity, jako je AIDS nebo jako nastává po chemoterapii vede k nadměrné, zeslabené aktivitě buněk T nebo buněk přirozených zabíječů. Když se normální buňky myší kostní dřeně pocházející z myší BALB/c a C57B1/6 kultivovaly v přítomnosti 100 pg/ml peptidů získaných z přirozeného kaseinu, následně se pozorovalo jasné zvýšení aktivity buněk přirozených zabíječů v obou skupinách poměrů efektor : cílová buňka. Navíc porovnání mezi oběma skupinami ukázalo jasnou závislost reakce na dávce. Při poměru efektor : cílová buňka 1 : 25 byla průměrná aktivita NK zvýšena z 13,93 % na 30,77 % a při poměru efektor : cílová buňka 1 : 50 byla průměrná aktivita NK zvýšena z 13,68 % na 44,05 % (zobrazeno na obrázku 1). Podobné experimenty používající lidské kmenové buňky z periferní krve dárců ošetřených faktorem stimulujícím kolonie granulocytů prokázaly dokonce podstatnější stimulaci lýze cílových buněk použitím peptidů získaných z přirozeného kaseinu, která je závislá na koncentraci. V první sadě experimentů (zobrazeno na obrázku 2a) byla aktivita NK měřena ve vzorcích krve odebraných z jednoho pacienta a inkubovaných ve dvou poměrech efektor : cílová buňka se vzrůstajícími koncentracemi peptidů získaných z přirozeného kaseinu. Pouze 4 % uvolnění 35S byla naměřena v kontrolní kultuře neléčené PBSC. Prakticky stejná procentuální úroveň radioaktivity (4 %) byla nalezena při nejnižší koncentraci peptidů (5 pg/ml). nicméně při vyšších koncentracích peptidů v rozsahu 10 pg na mililitr až 100 pg na mililitr bylo naměřeno uvolnění 10,8 až 14,9 % 35S pro poměry efektor : cílová buňka 100 : 1 a 8,3 až 14,5 % 35S pro poměry efektor : cílová buňka 50 : 1 (zobrazeno na obrázku 2a).

Když byly PBS buňky od normálních (pacient 1) a nemocných (pacienti 2 až 6) lidských dárců inkubovány se zvyšujícími se koncentracemi peptidů získaných z přirozeného kaseinu, bylo naměřeno znatelné zvýšení aktivity NK buněk u nemocných pacientů. Takže zatímco peptidy získané z přirozeného kaseinu měly minimální vliv na NK aktivitu normálních pacientů (zvýšeno ze 13 % na 15 % uvolnění 35S u pacienta 1) , PBS buňky od pacientů s rakovinou prsu a pacientů s ne-Hodgkinsovým lymfomem (například pacient 3 a pacient 4) vykazovaly dramatické zvýšení aktivity NK závislé na dávce (ze 3,5 % na 10,8 % 35S; případně ze 12,2 % na 19,1 % 35S) (zobrazeno na obrázku 2b). 97

Peptidy získané z přirozeného kaseinu stimulují proliferaci buněk pozitivních na CD56 povrchový antigen (NK) V dalších sériích experimentů byly kmenové buňky periferní krve (PBSC) od pěti lidských dárců, kteří byli léčeni GCSF, inkubovány s peptidy získanými z přirozeného kaseinu po dobu 10, 14 nebo 28 dnů a pak testovány na přítomnost antigenu CD 56. Dramatické zvýšení množství antigenu CD 56 bylo pozorováno v peptidem upravených buňkách od všech dárců s výjimkou jednoho (pacient 1). Reprezentativní reakce je vyobrazena na obrázku 3a. Deset dnů po inkubaci s nebo bez peptidů získaných z přírodního kaseinu byla přítomnost buněk pozitivních na CD56 povrchový antigen (NK) detekována přímým imunofluorescenčním barvením. Celkově inkubace s peptidy odvozenými z přirozeného kaseinu zvýšila průměrné procento buněk pozitivně barvených na CD 56 z 0,64 % v kontrolní skupině na 2,0 % po léčení (obrázek 3a).

Peptidy získané z přirozeného kaseinu stimulují proliferaci buněk (T) pozitivních na CD3 povrchový antigen

Vliv peptidů získaných z přirozeného kaseinu na proliferaci buněk (T) pozitivních na CD3 povrchový antigen u PBS buněk od pěti pacientů byl testován přímou imunofluorescencí. U všech s výjimkou jednoho pacienta (pacient 4) inkubace s peptidy získanými z přirozeného kaseinu v délce 14 dnů znatelně zvýšila proliferaci T-buněk, v některých případech až na pětinásobek. Průměrná procenta buněk pozitivně barvených na CD3 byla zvýšena z 19,45 % v kontrolní skupině na 35,54 % v léčené skupině (obrázek 3b).

Peptidy získané z přirozeného kaseinu stimulují proliferaci buněk pozitivních na CD56 a CD3 (NK/T buňky) V dalším experimentu byly PBSC od sedmi pacientů inkubovány po dobu 28 dnů s peptidy získanými z přirozeného kaseinu a vliv na proliferaci NK/T buněk (pozitivních na antigeny CD56 a CD3) byl detekován přímou imunofluorescenci. Inkubace s peptidy získanými z přirozeného kaseinu stimulovala proliferaci T-buněk v některých případech více než pětkrát (pacient 6) , kdy se průměrné procento CD3 pozitivních T-buněk zvýšilo z 2,08 % v kontrolní skupině na 6,49 % v léčené skupině. Počet buněk (NK/T) pozitivních na antigeny CD56 a CD3 se zvýšil z 1,1 % u kontroly na 4,3 % u léčené skupiny (obrázek 3c). Takže peptidy získané z přirozeného kaseinu stimulují proliferaci buněk T-lymfocytů a buněk přirozených zabiječů, které pocházejí z normálních předchůdců myších a lidských krevních buněk. Největší vliv na stimulaci imunity peptidy získanými z přirozeného kaseinu byl zaznamenán u lidských dárců, u kterých byla původní množství T-buněk a buněk přirozených zabíječů nízká (obrázky 3a až 3c).

Peptidy získané ze syntetického kaseinu stimulují proliferaci lidských lymfocytů in vitro

Když se peptidy získané ze syntetického kaseinu reprezentující první 3 až 26 zbytků kaseinu aSl inkubovaly s lidskými buňkami PBSC ze zdravých dárců a pacientů trpících zhoubným bujením (popisuje se dále v textu), pozorovalo se podstatné zvýšení aktivity buněk přirozených zabíječů. Lýze cílových buněk byla nejvyšší (tři až více jak pětkrát vyšší než kontrolní stanovení) u kultur PBSC pacientů ne-Hodgkinsova lymfomu a pacientů s karcinomem prsu po dvou dnech inkubace s 10 pg/ml peptidů, které obsahují prvních 9 nebo více zbytků kaseinu aSl (obrázek 4). Za stejných podmínek žádný z testovaných peptidů neměl podstatný vliv na aktivitu buněk přirozených zabíječů v kulturách PBSC pocházejících ze zdravých lidských dárců. Tak dokonce nízké koncentrace peptidů obsahující alespoň prvních deset zbytků N-terminální sekvence kaseinu aSl jsou schopné selektivně povzbuzovat proliferaci lymfocytů in vivo v buňkách pocházejících z pacientů trpícím zhoubným bujením. 99 • · ·« « ·

·· t

Podobná stimulace aktivity buněk NK byla pozorována když byly PBS buňky od lidských dárců s poruchou krvetvorby inkubovány se syntetickými peptidy získanými z kaseinu představujícími první tři aminokyselinové zbytky aSl kaseinu. Inkubace PBS buněk s peptidy zvýšila lýzu cílových buněk ze dvou na více než osminásobek neléčené kontroly. Z pěti testovaných pacientů, tři (3) reagovali na koncentraci 25 pg/ml peptidu, jeden (1) reagoval na koncentraci 100 pg/ml peptidu a jeden (1) reagoval na koncentraci 250 pg/ml peptidu. Tři z pěti (5) pacientů reagovali na koncentraci 25 pg/ml. Nebyl pozorován žádný znatelný vliv na aktivitu NK v PBSC kulturách ze zdravých lidských dárců léčených syntetickým peptidem představujicím první tři aminokyselinové zbytky aSl kaseinu, což potvrzuje selektivní povahu stimulačních vlivů peptidů získaných z kaseinu na lidské lymfocyty.

Stimulace krvetvorby u předchůdců lidských krevních buněk Předchůdci krevních buněk se diferencují na různé druhy krevních buněk: makrofágy, monocyty, granulocyty, lymfocyty, erytrocyty a megakaryocyty. Předchůdci buněk se ve velkém počtu vyskytují v kostní dřeni, ale také po aplikaci faktoru stimulujícího granulocytové kolonie (buňky PBSC) se jejich výskyt zjistil v periferní krvi a v pupečníkové krvi. Když se do kultur lidské kostní dřeně, PBSC a pupečníkové krve přidaly rostoucí koncentrace peptidů (50 až 600 pg/ml) získaných z přirozeného kaseinu, došlo ke zvýšení proliferace buněk, jak se stanovilo na základě začlenění [3H]-thymidinu (zobrazeno na obrázcích 5a až 5c) . Proliferace lidských PBSC byla nejvíce ovlivněna koncentrací peptidů 300 pg/ml (obrázek 5a) po patnácti dnech kultivace. Dokonce ještě vyšší účinek se zaznamenal v případě kultur buněk pupečníkové krve (tří až čtyřnásobné zvýšení začlenění [3H]-thymidinu) po čtrnácti dnech inkubace (ale nikoli po sedmi dnech) s peptidy získanými z přirozeného kaseinu (koncentrace 600 pg/ml, obrázek 5c). 100 «· « • · • · • · ··· ·· ·· · • * • ·

• « · ·♦··· • ♦ · ♦ • · · • · • · • ·

Kultivované buňky lidské kostní dřeně tří ze čtyř dárců silně reagovaly (tří až pětinásobné zvýšení začlenění) na peptidy získané z přirozeného kaseinu (300 pg/ml) po 21 dnech inkubace (zobrazeno na obrázku 5b) . Pak peptidy získané z přirozeného kaseinu podporuji množení předchůdců lidských krevních buněk z kostní dřeně stejně jako tomu je u buněk z jiných zdrojů. Je zajímavé, že inkubace kultivovaných lidských buněčných kolonií K562 (chronická myeloidní leukemie) a Colon (karcinom tlustého střeva) s vysokými koncentracemi (až 500 pg/ml) peptidů získaných z přirozeného kaseinu za podobných podmínek neměla žádný účinek na začlenění [3H]-thymidinu. Tak peptidy získané z přirozeného kaseinu podporují množení předchůdců buněk lidské krve, ale nepodporují růst buněk zhoubného bujení in vitro.

Stimulace megakaryocytopoézy peptidy získanými z kaseinu

Peptidy získané z přirozeného kaseinu povzbuzují množení předchůdců megakaryocytů v kultivovaných buňkách myší kostní dřeně

Megakaryocyty s více jádry se vyvíjí v kostní dřeni z prvotních kmenových buněk zráním na obrovské buňky, přičemž z jednoho megakaryocytů vzniká tisíce trombocyt. Trombocyty jsou rozhodující při tvorbě krevních sraženin a u myeloblačních stavů (po chemoterapii nebo radioterapii) je hlavním problémem trombocytopenie. U kultur prvotních buněk kostní dřeně se může vyvolat tvorba kolonií CFU-GM (granulocyt a monocyt) a kolonie CFU-GEMM (granulocyt, erytroid, makrofág a megakaryocyt) obsahující další typy krevních buněk. Počet kolonií odráží rozpínání specifických předchůdců, počet buněk odráží rychlost množení a počet diferenciovaných buněk odráží druh vyvinuté specifické buněčné linie (popisuje se v publikaci Patenkin, D. a kol. (1990), Mol. Cel. Biol. 10, 6046-50). U buněk myší kostní dřeně kultivované s erytropoetinem a IL-3 se přidáním peptidů získaných z přirozeného kaseinu v koncentraci 25 pg/ml po dobu osmi dnů došlo ke zvýšení počtu CFU-GEMM na dvojnásobek a jeden a půl násobek počtu ve srovnání s kontrolami stimulující třínásobné zvýšení relativních počtů buněk v jedné kolonii CFU-GEMM. V podobných sériích experimentů přidání peptidů získaných z přirozeného kaseinu k buňkám kostní dřeně inkubovaných s erytropoetinem a v upraveném kultivačním mediu (popisuje se v části materiál a experimentální metody) podporovalo zvýšení procenta časných a pozdních megakaryocytů v závislosti na koncentraci peptidů (15 % megakaryocytů bez přítomnosti peptidů, zvýšení na 50 % při přidání peptidů získaných z přirozeného kaseinu v koncentraci 500 pg/ml). Tak osmidenní aplikace peptidů získaných z přirozeného kaseinu podpořila podstatné zvýšení tvorby megakaryocytů a vývoje megakaryocytů v prvotních kulturách myší kostní dřeně.

Syntetické peptidy získané z kaseinu podporují množení předchůdců megakaryocytů v kultivovaných buňkách myší kostní dřeně

Podobně jako ve shora uvedeném textu a za podobných experimentálních podmínek peptidy získané ze syntetického kaseinu představující prvních 5 až 24 aminokyselin kaseinu aSl zvýšily procento časných a pozdních megakaryocytů z 15 % bez syntetického peptidů na více než 40 % s 25 pg na ml syntetických peptidů (obrázek 7). Tak osmidenní aplikace peptidů získaných ze syntetického kaseinu představujících prvních 5, 6, 11, 12, 17, 18, 19, 20, 21 a 24 aminokyselin stimulovala podstatné zvýšení tvorby a vývoje megakaryocytů v prvotních kulturách myší kostní dřeně. Poněkud mírnější, ale stále dostatečná stimulace se pozorovala u dalších peptidů získaných ze syntetického kaseinu.

Peptidy získané z přirozeného kaseinu podporují megakaryocytopoézu v kultivovaných buňkách lidské kostní dřeně

Když se do kultur buněk lidské kostní dřeně, které pocházejí ze zdravých dárců za podobných podmínek přidaly peptidy získané z přirozeného kaseinu v koncentraci 100 pg/ml, vzrostla tvorba kolonií CFU-GM ať už se přidaly nebo nepřidaly další stimulační faktory (GM-CSF, CM) . Peptidy získané z přirozeného kaseinu také stimulovaly tvorbu kolonií erytroidních buněk v přítomnosti erytropoetinu. Ošetření buněk lidské kostní dřeně trombopoetinem (TPO) podporuje tvorbu megakaryocytových kolonií (MK). Přidáním peptidů získaných z přirozeného kaseinu v koncentraci 300 yg/ml k buňkám ošetřených TPO se podporuje více jak dvojnásobné zvýšení (16 kolonií na 2 x 105 buněk bez přítomnosti peptidů, 35 kolonií na 2 x 105 buněk v přítomnosti peptidů získaných z kaseinu) při proliferaci kolonií MK. V přítomnosti dalších faktorů krvetvorby, jako je erytropoetin, lidský IL-3, hSCF a sérum AB, čtrnáctidenní inkubace s peptidy získanými z přirozeného kaseinu stimulovala skoro třínásobné zvýšení kolonií CFU-GEMM z buněk lidské kostní dřeně (158 kolonií v přítomnosti peptidů získaných z přirozeného kaseinu v koncentraci 500 yg/ml, 68 kolonií v přítomnosti samotného faktoru), ale měly menší účinek (jeden násobek a jeden a půl násobek) v případě tvorby kolonií CFU-GEMM v kultivované pupečníkové krvi. Relativní počet buněk stanovený v koloniích kultivované lidské kostní dřeně a pupečníkové krve odráží množení megakaryocytových buněk na základě přidání peptidů získaných z přirozeného kaseinu v koncentraci 25 pg/ml (uvádí se v tabulce zobrazené na obrázku 6). Tak inkubace kultivovaných prvotních buněk lidské kostní dřeně a pupečníkové krve spolu s peptidy získanými z přirozeného kaseinu podporuje vývoj a množení determinovaných kolonií megakaryocytů a erytroidních buněk. Součinnost pozorovaná mezi TPO a peptidy získanými 103 z přirozeného kaseinu při stimulaci megakaryocytopoézy významně poukazuje na pravděpodobnou roli tohoto účinného růstového faktoru krvetvorby v mechanismu stimulačních vlastností peptidů získaných z kaseinu a dále ukazuje na snadnost podobného posílení široké škály účinků zprostředkovaných pomocí TPO peptidy získanými z přirozeného kaseinu.

Peptidy získané z přirozeného kaseinu a syntetické peptidy získané z přirozeného kaseinu podporují účinek erytropoetinu (EPO) v kultivovaných buňkách lidské kostní dřeně

Vliv přirozených a syntetických peptidů získaných z kaseinu na proliferaci erytroidních buněk v kultivovaných buňkách lidské kostní dřeně byl stanoven za stejných podmínek, které již byly popsány výše v textu u megakaryocytopoézy. Když byly v přítomnosti EPO přidány peptidy získané z přirozeného kaseinu v množství 50 až 300 pg/ml nebo syntetické peptidy získané z přirozeného kaseinu v množství 100 pg/ml (F, tabulka 3, sekvence id. č. 18) stimulovaly jednou až jeden a půlkrát (syntetický peptid) až čtyřikrát proliferaci prekursorů erytroidních buněk (vznik BFU-E kolonií) v porovnání s buňkami kostní dřeně, na které se působilo samotným EPO. Takže peptidy získané z přirozeného kaseinu a jejich syntetické deriváty působí tak, že posilují erytropoetické stimulační vlivy vyvolané EPO a jako takové je lze použít pro umocnění široké škály klinicky důležitých vlivů vyvolaných EPO.

Syntetické peptidy získané z kaseinu stimulují proliferaci dendritických buněk v myší CFU-GEMM

Vliv syntetických peptidů získaných z kaseinu na proliferaci dendritických buněk v myších primárních buňkách krevní dřeně byl stanoven za stejných podmínek, které již byly popsány výše v textu u megakaryocytopoézy. Syntetické peptidy získané z kaseinu představující první 2, 3, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 16, 23, 24 a 26 aminokyselin z aSl kaseinu stimulovaly proliferaci dendritických buněk z 2,2 % až na 23 % celkového množství buněk v porovnání s 0,1 % až 0,2 % dendritických buněk ve vzorcích buněk inkubovaných bez syntetických peptidů získaných z kaseinu (obrázek 7).

Syntetické peptidy získané z kaseinu stimulují proliferaci plasmových buněk v myší CFU-GEMM

Vliv syntetických peptidů získaných z kaseinu na proliferaci plasmových buněk v myších primárních buňkách krevní dřeně byl stanoven za stejných podmínek, které již byly popsány výše v textu u megakaryocytopoézy. Syntetické peptidy získané z kaseinu představující první 2, 3, 5, 7, 11, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 a 24 a 26 aminokyselin z aSl kaseinu stimulovaly proliferaci plasmových buněk z 1,5 % až na 12,3 % celkového množství buněk v porovnání s 0,3 % celkového množství plasmových buněk bez syntetických peptidů získaných z kaseinu (obrázek 7).

Syntetické peptidy získané z kaseinu stimulují proliferaci makrofágů v CFU-GEMM

Vliv syntetických peptidů získaných z kaseinu na proliferaci makrofágů v myších primárních buňkách krevní dřeně byl stanoven za stejných podmínek, které již byly popsány výše v textu u megakaryocytopoézy. Inkubace buněk se syntetickými peptidy získanými z kaseinu představujícími prvních 7, 9, 16 a 23 aminokyselin z aSl kaseinu významně stimulovaly proliferaci makrofágů ze 17 % celkového množství buněk v případě kontroly až na téměř 30 % celkového množství buněk inkubovaných se syntetickými peptidy získanými z kaseinu (obrázek 7).

Syntetické peptidy získané z kaseinu stimulují proliferaci červených krvinek v CFU-GEMM 105 • · • · · ·

Vliv syntetických peptidů získaných z kaseinu na proliferaci červených krvinek v myších primárních buňkách krevní dřeně byl stanoven za stejných podmínek, které již byly popsány výše v textu u megakaryocytopoézy. Inkubace buněk se syntetickými peptidy získanými z kaseinu představujícími první 4 aminokyseliny z aSl kaseinu významně stimulovaly proliferaci makrofágů z 53 % celkového množství buněk v případě kontroly až na téměř 71 % celkového množství buněk inkubovaných se syntetickými peptidy získanými z kaseinu (obrázek 7).

Syntetické peptidy získané z kaseinu stimulují proliferaci polymorfonukleárních (PMN) buněk v CFU-GEMM

Vliv syntetických peptidů získaných z kaseinu na proliferaci polymorfonukleárních (PMN) buněk v myších primárních buňkách krevní dřeně byl stanoven za stejných podmínek, které již byly popsány výše v textu u megakaryocytopoézy. Inkubace buněk se syntetickými peptidy získanými z kaseinu představujícími první 3, 6, 7, 9, 16 a více až do 26 aminokyselin z aSl kaseinu významně stimulovaly proliferaci PMN z 1,6 % celkového množství buněk v případě neinkubované kontroly až na 2,9 % až 14,9 % celkového množství buněk inkubovaných se syntetickými peptidy získanými z kaseinu (obrázek 7).

Peptidy získané z přirozeného kaseinu podporují krvetvorbu in vivo následující po ozáření a transplantaci kostní dřeně

Myeloblační terapie může vést k životu nebezpečnému snížení trombocytů a leukocytů, které může přetrvávat navzdory aplikaci krevních buněk a růstových faktorů. Následující text ukazuje účinek peptidů získaných přirozeného kaseinu po ozáření a transplantaci kostní dřeně.

Peptidy získané z přirozeného kaseinu zesilují obnovu leukocytů a krevních destiček po syngenní transplantaci kostní dřeně u myší

Když se myši BALB/c (n = 12) ozářily subletální dávkou (600 cGy) a došlo k minimální obnově kostní dřeně, aplikovalo se myším jeden den po transplantaci buněk kostní dřeně intravenózní injekcí 1 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu na jednu myš. Ve dnech 4, 6 a 15 po léčení se zaznamenalo ve srovnání s kontrolami, kterým se aplikoval pouze lidský sérový albumin, zvýšení počtu bílých krvinek v periferní krvi (zobrazeno na obrázku 8). Počet krevních destiček v periferní krvi u ošetřených myší a kontrolních ozářených myší po transplantaci kostní dřeně byl shodně snížený až do doby 8 dní po léčbě. Avšak třináctý den se zaznamenala jasná výhoda v případě myší ošetřených peptidy získanými z přirozeného kaseinu, které vykazovaly znatelné zvýšení ve srovnání s kontrolami ošetřenými lidským sérovým albuminem, což se ještě prohloubilo v den 15 (zobrazeno na obrázku 9) . Tak peptidy získané z přirozeného kaseinu zesilují obnovu krevních destiček a leukocytů následující po transplantaci omezených počtů buněk kostní dřeně. Očekává se, že tento účinek se bude dále zvyšovat s optimálním spíše než omezeným počtem buněk kostní dřeně.

Syntetické peptidy získané z kaseinu zesilují u myší obnovu leukocytů po transplantaci syngenní kostní dřeně

Když se myši BALB/c (n = 5 v případě syntetického peptidu, n = 10 v kontrolní skupině) ozářily subletální dávkou (600 cGy) a došlo k minimální obnově kostní dřeně, aplikovalo se myším jeden den po transplantaci buněk kostní dřeně intravenózní injekcí 1 mg na jednu myš syntetických peptidů (v délce 13 až 26 aminokyselin, jsou uvedeny v tabulce 3) získaných z přirozeného kaseinu. Po uplynutí období 10 až 14 dní se zaznamenalo podstatné zvýšení počtu bílých krvinek které v periferní krvi související s peptidy, které mají 15 aminokyselin (den 10: 1,72 x 106 buněk v jednom mililitru, den 12: 6,54 x 106 buněk v jednom mililitru) a 17 aminokyselin (den 10: 2,74 x 106 buněk v jednom mililitru, den 12: 5,20 x 106 buněk v jednom mililitru) (popisuje se v tabulce 3) ve srovnání s kontrolami, kterým se aplikoval lidský sérový albumin (den 10: 1,67 x 106 buněk v jednom mililitru, den 12: 4,64 x 106 buněk v jednom mililitru). Tak syntetické peptidy získané z kaseinu zesilují obnovu leukocytů následující po transplantaci omezeného počtu buněk kostní dřeně.

Syntetické peptidy získané z kaseinu zlepšují rekonstituci destiček následující po syngenní transplantaci kostní dřeně u myší

Aby se potvrdila pozorovaná schopnost syntetických peptidů získaných z kaseinu zlepšovat proliferaci megakaryocytů v kulturách krvetvorných kmenových buněk (viz obrázky 6 a 7), byl prozkoumán vliv peptidů na rekonstituci destiček in vivo. Když se myši (n = 5 na skupinu) ozářily letální dávkou (800 cGy) a došlo k minimální obnově kostní dřeně, aplikovalo se myším ve čtyřech intraperitoneálních injekcích (4 až 7 dnů po transplantaci) 100 pg na jednu myš syntetických peptidů 4P a 3a (v délce 6 až 12 aminokyselin, jsou uvedeny v tabulce 3). Bylo zaznamenáno jasné zlepšení rekonstituce destiček v porovnání s neléčenou kontrolou. Znatelné zvýšení počtů destiček 10 a 12 dnů po transplantaci bylo zaznamenáno pro oba peptidy. Léčení peptidem 4P zvýšilo počty o 29 % (872 x 103 na mililitr v porovnání s 676 x 103 na mililitr v kontrolní skupině) 12 dnů po transplantaci, zatímco léčení peptidem 3a zvýšilo počty až o 35,5 % (229 x 103 na mililitr v porovnání se 169 x 103 na mililitr v kontrolní skupině) 10 dnů po transplantaci a až o 13,5 % (622 x 103 na mililitr v porovnání se 461 x 103 na mililitr v kontrolní skupině) 10 dnů po transplantaci. Takže tytéž syntetické peptidy získané 108 • ·· · • · · • «#*·

z kaseinu zvyšují proliferaci megakaryocytů in vitro a rekonstituci následující po transplantaci kostní dřeně in vivo.

Peptidy získané z přirozeného kaseinu inhibují in vitro infekci buněčné linie lymfocytů T virem HIV-1

Penetrace peptidů získaných z přirozeného kaseinu do lymfocytických buněk T

Za účelem zkoumat mechanismy imunitních stimulačních a antivirových účinků peptidů získaných z přirozeného kaseinu vhodné kultivované lidské buňky T Sup-Tl a CEM se ošetřily peptidy získanými z přirozeného kaseinu před infekcí in vitro virem HIV-1. Fluorescenční mikroskopie ukázala, že peptidy získané z přirozeného kaseinu konjugované s FITC (v koncentraci 100 pg/ml) při společné inkubaci s buňkami Sup-Tl vstoupily do těchto buněk, jak se popisuje shora v textu (zobrazeno na obrázcích 10a až lOf). Malé množství značení se pozorovalo v cytoplazmě buněk po 15 minutách (zobrazeno na obrázcích 10a a 10b) . Po 30 minutách (obrázky 10c a lOd) se při limitovaném pohlcení do jádra pozorovalo v cytoplazmě více značení. Od délky inkubace jedna hodina a dále (obrázky lOe a lOf) se v cytoplazmě pozorovaly peptidy získané z přirozeného kaseinu značené FITC, ale většinou se koncentrovaly v buněčném jádru. Analýza buněk Sup-Tl průtokovou cytometrií potvrdila zvýšené pohlcování značených peptidů získaných z přirozeného kaseinu od doby pěti minut po inkubaci.

Peptidy získané z přirozeného kaseinu zesilují proliferaci lidských lymfocytů Přítomnost peptidů získaných z přirozeného kaseinu v kultivačním médiu vede ke zvýšenému počtu buněk Sup-Tl během 14 dní. Nejvyšší nárůst počtu buněk v sedmi dnech se pozoroval v případě peptidů získaných z přirozeného kaseinu při koncentraci 50 pg/ml (42 %), v případě množství peptidů 1000 μς během deseti dnů (30 %) a v případě 600 pg (32 %) během 14 dnů inkubace. Měření začlenění [3H]-thymidinu kultivovanými buňkami poskytují proliferační index, který odráží nejpodstatnější zvýšení počtu buněk při koncentraci peptidů získaných z přirozeného kaseinu 600 pg/ml v den 10 a 50 pg/ml v den 14 (zobrazeno na obrázku 11) . Snížené proliferační indexy během 14 dnů pravděpodobně odráží nadměrný růst buněk a vyčerpání nutrientů.

Syntetické peptidy získané z kaseinu zesilují proliferaci lidských lymfocytů Přítomnost syntetických peptidů získaných z kaseinu (všechny peptidy jsou uvedeny v tabulce č. 3) v kultivačním médiu vedou ke zvýšení počtu buněk Sup-Tl v období deseti dní. Nárůst byl podobný v případě všech syntetických peptidů. Nej vyšší zvýšení počtu buněk u infikovaných buněk se pozorovalo při koncentraci peptidů 250 pg/ml a 500 pg/ml peptidů představujícího prvních 9 aminokyselin (80 % a 33 %) (data nejsou vyobrazena).

Peptidy získané z přirozeného kaseinu inhibují infekci HIV-1 v lidských lymfocytových buňkách

Vhodné lymfocytové buňky CEM ošetřené peptidy získanými z přirozeného kaseinu (50 až 1000 pg/ml) 24 nebo 48 hodin před inkubací s virem HIV-1 nebo vystavené působení viru HIV-1 předem ošetřeným po dobu 3 hodiny peptidy odvozenými z přirozeného kaseinu, vykazovaly zvýšenou buněčnou proliferaci a snížené množství buněk infikovaných virem ve srovnání s neošetřenými kontrolami. Počty buněk a test antigenu P24 HIV-1 provedený 15 dní po infekci ukázal 100 % inhibici virové infekce po 3 hodinách inkubace s peptidy získanými z přirozeného kaseinu v koncentraci 600 až 1000 pg/ml a 98% a 99% inhibici po 24 hodinách inkubace 110 • · · · • · » · i · · * s peptidy v koncentraci 50 respektive 600 pg/ml (porovnání počtu buněk s neinfikovanými kontrolami UIF) . Zjistilo se, že delší doba inkubace nezvýšila účinnost (zobrazeno na obrázku 12). Ačkoli zvýšení koncentrací peptidů získaných z přirozeného kaseinu zesílilo množení buněk 3 a 24 hodin po infekci, virová infekce se nejpodstatněji inhibuje v těchto nej rychleji rostoucích kulturách. Dokonce více dramatické zesílení proliferace buněk a inhibice infekce HIV-1 se pozorovalo v buňkách Sup-Tl předem ošetřených peptidy získanými z přirozeného kaseinu před infekcí HIV-1 (průměrná inhibice virové infekce je 96,7 %, 88,7 % a 95,7 % v případě předchozího ošetření viru po dobu 3 hodin a 24 hodin respektive 48 hodin) (nevyobrazeno). Tak peptidy získané z přirozeného kaseinu vstupují do lidských kultivovaných lymfocytových buněk a jejich jádra, zesilují růst buněk a podstatně snižují náchylnost buněk CD4 k infekci HIV-1. Očekává se, že peptidy získané z přirozeného kaseinu jako takové se mohou použít při prevenci infekce HIV a v případě léčby pacientů infikovaných HIV a pacientů trpících AIDS.

Syntetické peptidy získané z kaseinu inhibují infekci HIV-1 v lidských lymfocytových buňkách

Schopnost syntetických peptidů získaných z kaseinu inhibovat infekci HIV-1 v lidských lymfocytových buňkách byla prokázána za použití CEM-lymfocytových buněk za stejných podmínek, které již byly uvedeny v textu výše. Tři hodiny ošetření CEM lymfocytů syntetickým peptidem získaným z kaseinu představujícím první tři aminokyseliny aSl kaseinu vedlo k znatelnému stupni odolnosti proti infekci po inkubaci s HIV-1. Počet lymfocytových buněk byl 1,29 x 106 (100 pg na mililitr) a 2,01 x 106 (500 pg na mililitr) v případě léčených buněk v porovnání s kontrolou infikovanou HIV-1, kde tento počet činil 1,06 x 106 (obrázek 13). Úroveň infekce HIV-1 u stejných buněk měřená testem antigenu P24 HIV-1 provedeným 7 dni po infekci byla znatelně snížena u buněk léčených peptidem (0,17 a 0,14 ng antigenu P24 na mililitr při 100 pg na mililitr a 500 pg na mililitr) v porovnání s neléčenými kontrolami (0,52 ng antigenu P24 na mililitr).

Podobně byla pozorována znatelná inhibice infekce HIV-1 v CEM buňkách vystavených viru předem kultivovanému (3hodiny) se syntetickým peptidem získaným z kaseinu představujícím prvních pět aminokyselin aSl kaseinu.

Počty buněk v kulturách inkubovaných s 10 pg a 25 pg peptidu 3P na mililitr byly 1,17 x 106 a 1,26 x 106 v porovnání s kontrolou infikovanou HIV-1, kde tento počet činil 1,06 x 106.

Test antigenu P24 HIV-1 provedený 7 dní po infekci prokázal znatelné snížení úrovně infekce HIV-1 u léčených kultur (0,26 a 0,18 ng antigenu P24 na mililitr při 10 pg na mililitr a 25 pg na mililitr) v porovnání s neléčenou kontrolou (0,52 ng antigenu P24 na mililitr) .

Podobně 3 hodinová kultivace viru se syntetickým peptidem 4P získaným z kaseinu představujícím prvních šest aminokyselin aSl kaseinu mělo významný vliv na susceptibilitu CEM lymfocytových buněk na infekci HIV-1.

Počty buněk byly nejvíce ovlivněny v koncentracích 25 pg a 250 pg na mililitr (1,26 x 106 a 1,59 x 106 v porovnání s infikovanou kontrolou, kde tato hodnota byla 1,06 x 106) .

Test antigenu P24 HIV-1 provedený 7 dní po infekci prokázal znatelné snížení počtu částic závislé na dávce v porovnání s neléčenými infikovanými kontrolními kulturami (obrázek 13). Takže ochrana před infekcí HIV-1 poskytnutá lymfocytovým buňkám peptidy získanými z přirozeného kaseinu byla zachována u syntetických peptidů získaných z kaseinu představujících prvních pět aminokyselin N-koncové části aSl kaseinu. brání vývoji

Peptidy získané z přirozeného kaseinu glukosurie u neobézních diabetických myší (NOD) U neobézních diabetických myší (NOD) se spontánně vyvinula juvenilní cukrovka (typ I (IDDM), což je autoimunitní onemocnění způsobující zánět pankreatických buněk β končící smrtí. Samice myší NOD jsou extrémně náchylné k tomuto onemocnění. Už ve stáří pěti týdnů demonstrují důkaz invaze makrofágů pankreatického ostrůvkovitého intersticiálního pojivá. Injekce obsahující 100 pg peptidů získaných z přirozeného kaseinu aplikovaná jednou nebo dvakrát týdně po dobu pěti týdnů (celkem se aplikuje 5 nebo 10 injekcí) byly zcela účinné při prevenci glukosurie spojené se vznikem a průběhem onemocnění. Během 200 dní se 100 % neošetřených kontrolních myší (n=5) stalo diabetickými a následně zemřely, zatímco ošetřené myší (n=5) zůstaly 100% euglykemické a po dobu 3 65 dní byly stále naživu (zobrazeno na obrázku 13) . Tak peptidy získané z přirozeného kaseinu ochránily geneticky náchylné myši proti vzniku tohoto autoimunitního zánětlivého onemocnění.

Syntetické peptidy získané z kaseinu brání vývoji glukosurie u neobézních diabetických myší (NOD)

Preventivní účinek syntetických peptidů získaných z kaseinu na rozvoj glukosurie u NOD myší byl demonstrován za stejných podmínek, které již byly popsány výše v textu, s tou výjimkou, že myším bylo injikováno pouze jednou týdně po dobu pěti týdnů 100 pg syntetických peptidů získaných z kaseinu. Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny v následující tabulce 4: 113

« · * • · · · «

Tabulka 4

Vliv syntetických peptidů na IDDM u NOD myši Kód peptidového derivátu Zdravé / celkové* Cukr v moči Test IPGT 0 minut (před podáním) 60 minut po podání Y 1/5 Negativní 121 138 X 3/5 Negativní 94 114 Negativní 104 119 Negativní 141 114 la 1/5 Negativní 88 106 2a 4/5 Negativní 215 183 Negativní 112 119 Negativní 95 107 Negativní 159 204 3a 3/5 Negativní 135 137 Negativní 205 197 Negativní 201 211 A 2/5 Negativní 134 164 Negativní 105 107 B 2/5 Negativní 130 117 Negativní 130 97 D 2/5 Negativní 99 108 Negativní 130 136 I 2/5 Negativní 324 netestován o Negativní 124 138 J 3/5 Negativní 166 netestován o Negativní 193 netestován o Negativní 186 netestován o K 2/5 Negativní 116 143 114 • · · ♦

Negativní 443 netestován o Chay-13 2/5 Negativní 123 130 Negativní 111 111 Chay-13 2/5 Negativní 128 116 Negativní 113 125 Kontrola 0/5

Krev byla odebrána z paraorbitálního plexu v čase 0 minut a 60 minut po intraperitoneální injekci glukosy v množství 1 g/kg tělesné hmotnosti. Množství glukosy v plasmě byla stanovena pomocí Glucose Analyzer 2 (Beckman Instruments, Fullerton, CA) a vyjádřeny jako milimoly na litr. * Zdravé = v moči nebyl zjištěn cukr

Glukosurie => 1000 mg/dl. IPGTT provedena se šesti zdravými samicemi kontrolních myší: 0 minut - 110 mmol/1; 60 minut - 106 mmol/1 glukosy v krvi.

Syntetické peptidy získané z kaseinu představující prvních 9 (X), 11 (2a) a 12 (3a) aminokyselin a vyšší homology s delším řetězcem z aSl kaseinu byly vysoce účinné při prevenci glukosurie související s počátkem a průběhem nemoci.

Vliv léčení syntetickými peptidy získanými z kaseinu byl vyhodnocen po 25 týdnech. V té době bylo všech pět myší z neléčené kontrolní skupiny (n = 5) diabetických, jak ukazuje zjevná (> 1000 mg/dl) přítomnost glukosurie (tabulka 4). Žádná glukosurie nebyla zjištěna u tří z pěti (3/5) NOD myší léčených syntetickým peptidem představujícím prvních devět (9) aminokyselin z N-koncové části aSl kaseinu. Ze skupiny, které byl injikován syntetický peptid sestávající z jedenácti (11) aminokyselin z N-koncové části aSl kaseinu, nebyla žádná glukosurie zjištěna u čtyř z pěti (4/5) NOD myší.

Ve skupině peptidem léčených myši, u kterých byla zjištěna glukosurie, byl nástup nemoci znatelně pozdržen (o 3 až 5 týdnů) relativně k nástupu glukosurie u neléčené kontroly (data nejsou vyobrazena), což ukazuje jasný ochranný účinek peptidů dokonce i když nejsou kompletní.

Ochranný účinek kratších syntetických peptidů získaných z kaseinu byl také studován na NOD myších. V další sérii experimentů podobných těm, které již byly popsány výše, vedlo podávání peptidů představujících první 3 (IP) a 4 (2P) aminokyseliny z N-koncové části aSl kaseinu k účinné prevenci počátku glukosurie u léčených myší (testováno v šestnáctém týdnup, zatímco neléčené kontroly se všechny staly diabetickými (100 % glukosurie) (data nejsou uvedena).

Test tolerance na glukosu (IPGT) byl proveden po 25 týdnech se zdravými NOD myšmi ze skupiny, které byl injikován syntetický peptid získaný z kaseinu sestávající z prvních 9 aminokyselin, neukázal žádný důkaz abnormálního metabolismu glukosy (normální glykemické hodnoty před a 60 minut po podání glukosy).

Ve skupině léčené syntetickým peptidem získaným z kaseinu představujícím prvních 11 aminokyselin z N-koncové části aSl kaseinu (2a) byla zbytková hladina glukosy v plasmě poněkud zvýšena u dvou z pěti myší (215 a 159 mmol/1) a zůstala poněkud zvýšená (183 a 204 mmol/1) v 60 minutě po podání, což ukazuje mírnou tendenci k cukrovce. Zbylé dvě myši zůstaly v normálním glykemickém rozsahu po celý test (tabulka 4) . Obecně normální výsledky IPGTT odrážely nepřítomnost glukosurie u zdravých myší, které byly léčeny peptidem (tabulka 4). Takže syntetické peptidy představující pouze několik aminokyselin z N-koncové části aSl kaseinu, stejně jako peptidy získané z přirozeného kaseinu dramaticky snižují susceptibilitu geneticky náchylných NOD myší k nástupu autoimunitního diabetického onemocnění. 116 116

Syntetické peptidy získané z kaseinu významně snižuji celková množství cholesterolu v krvi (TC), lipoproteinů s nízkou hustotou (LDL) a lipoproteinů s vysokou hustotou (HDL)

Intraperitoneální podávání syntetických peptidů získaných z kaseinu způsobilo znatelné snížení hodnot lipidů (HDL, LDL a TC) v krvi u experimentálně hypercholesrolemických myší. Po jednou týdnu krmení aterogenní stravou podle Thomase Hartrofta, se množství cholesterolu u myší zvýšilo na množství 318 mg/dl.

Jeden týden po podání 1 mg syntetických peptidů získaných z kaseinu každé myši měla skupina léčená syntetickými peptidy získanými z kaseinu představujícími prvních pět (3P) a jedenáct (2a) aminokyselin aSl kaseinu měly znatelně snížené hodnoty TC, HDL a LDL v porovnání s těmi, které vykazovala kontrolní skupina [TC: 308 mg/dl a 279 mg/dl; HDL: 42,5 mg/dl a 41 mg/dl a LDL: 24 7 mg/dl a 221 mg/dl v porovnání s 393 mg/dl (TC), 54,5 mg/dl (HDL) a 326 mg/dl (LDL) v kontrolní skupině se stravou vyvolanou hypercholesterol/hyperlipidemií ] (obrázek 15) . Takže syntetické peptidy představující pouze několik aminokyselin z N-koncové části aSl kaseinu účinnmě snižují experimentálně vyvolanou hyperlipidemii a hypercholesterolemii v jednom týdnu po jediném intraperitoneálním podání.

Klinické studie s peptidy získanými z přirozeného kaseinu

Každému z pacientů se aplikovala intrámuskulární injekce obsahující 50 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu rozdělených do tří dávek, jak je uvedeno dále.

Peptidy získané z přirozeného kaseinu podporují krvetvorbu u pacientů trpících zhoubným bujením

Hematologické profily šesti pacientů se zhoubným bujením, kteří se vystavili chemoterapii nebo prodělávají chemoterapii, 117 se testovaly před a po aplikaci peptidů získaných z přirozeného kaseinu. Zvláštní pozornost se věnovala změnám v hodnotách krevních destiček (PLT), leukocytů (WBC), erytrocytů (RBC) a hemoglobinu (HBG), které reprezentují trombocytopoézu, leukocy-topoézu respektive erytrocytopoézu. G.T. (pacient ženského pohlaví, pacient 1)

Pacientka měla karcinom vaječníků, prodělala hysterektomii následovanou chemoterapií. Aplikovaly se jí dvě intramuskulární injekce peptidů získaných z přirozeného kaseinu v intervalu dva a pak dva a jeden a půl měsíce po operaci. Mezi první a druhou aplikací peptidů odvozených z přirozeného kaseinu se neaplikovala chemoterapie. Krevní testy provedené 6 dní po první injekcí, 7 a 13 dní po druhé injekci odráží podstatné zvýšení krevních destiček a složek WBC, stejně jako zvýšení RBC (zobrazeno na obrázku 16). E.C. (pacient ženského pohlaví, pacient 2)

Pacientka je po radikální mastektomii z důvodu lobulárního karcinomu v roce 1983. 0 šest let později se objevily metastáze v žaludku. Tři dni před zahájením chemoterapie se jí aplikovaly jedenkrát intramuskulárně peptidy získané z přirozeného kaseinu injekcí a druhou dávku obdržela deset dní po chemoterapii. Ačkoli počet krevních buněk od deseti a šestnácti dní po chemoterapii ukazuje útlum snížení hematologického profilu, což je obvyklé po chemoterapii, nejvíce podstatné účinky peptidů získaných z přirozeného kaseinu se zaznamenaly 3 dni po první injekci před chemoterapií (zobrazeno na obrázku 16). E.S. (pacient ženského pohlaví, pacient 3)

Pacientka trpí roztroušenými metastázemi karcinomu prsu, který se poprvé objevil roku 1987. 0 dva roky později se jí aplikovala první intramuskulární injekce peptidů získaných 118 • · · · • · «I · • · z přirozeného kaseinu a druhá injekce se aplikovala o 23 dni později. Během tohoto období pacientka neprodělala žádnou další terapii. Krevní testy ukazují silné zvýšení PLT sedm dní po první léčbě a podstatné zvýšení RBC a WBC sedm dní po druhé léčbě (zobrazeno na obrázku 16) . J.R. (pacient ženského pohlaví, pacient 4)

Diagnóza pacientky je karcinom prsu s metastázami v kostech. Pacientce se aplikovala jedna intramuskulární injekce peptidů získaných z přirozeného kaseinu 8 dní před zahájením chemoterapie a další injekce se aplikovala o 14 dní později. Nej významnější účinek se zaznamenal v rychlém návratu množtví WBC po snížení vyvolaném chemoterapií (obrázek 16). D.M. (pacient ženského pohlaví, pacient 5)

Pacientka trpící karcinomem jater s roztroušenými metastázami. Pacientce se aplikovaly tři intramuskulární injekce peptidů získaných z přirozeného kaseinu 10, 8 a 6 dní před aplikací chemoterapie. Druhá série injekcí začala 10, 12 a 14 dní po léčbě chemoterapií. Ačkoli se po první sérii injekcí před chemoterapií zaznamenal podstatný účinek na hematologický profil, nejvíce dramatické zlepšení je možné vidět v rychlém návratu snížených hodnot po chemoterapii na normální počty buněk po druhé sérii injekcí peptidů získaných z přirozeného kaseinu (zobrazeno na obrázku 16).

Tak aplikace peptidů získaných z přirozeného kaseinu pacientům trpících karcinomem vede ke zlepšení hematologických profilů, specificky k zesílení erytropoézy, leukocytopoézy a trombocytopoézy a je schopna upravovat a zkracovat trvání snížení počtu krevních buněk vyvolané chemoterapií.

Peptidy získané z přirozeného kaseinu podporují trombocytopoézu u příjemců transplantátu trpících rezistentní trombocytopenií 119 • · *

Dlouhodobá trombocytopenie s rezistencí vůči transfúzi s výskytem těžkého krvácení může být komplikací transplantace kostní dřeně ohrožující život, zvláště když tradiční terapie nejsou účinné. Dva pacienti s těžkou rezistentní trombocytopenií se léčily peptidy získanými z přirozeného kaseinu. M-l (pacient ženského pohlaví)

Pacientka ve věku 32 let trpí akutní myelodní leukémií ve stádiu úplné remise po transplantaci vlastních kmenových buněk. Pacientka prodělala dva případy krvácení ohrožující její život zahrnující pulmonární krvácení a velký obstruktivní hematom měkkého patra. Více než 114 dní po transfúzi počty krevních destiček neodpovídaly na léčbu rhIL-3, rhIL-6, intravenózním gamaglobulinem a rekombinantním erytropoetinem. Po dvou intramuskulárních aplikacích 50 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu (rozdělených do tří dávek) se její stav bezprostředně zlepšil. Spolu s rychlým návratem normálního počtu krevních destiček (zobrazeno na obrázku 17) pominulo krvácení distálních končetin spojené s námahou a patechyemi. Pacientka byla schopná opět chodit a vrátila se domů bez komplikací a bez vedlejších účinků. M-2 (pacient mužského pohlaví) Třicetiletý pacient trpící akutní myelodní leukémií ve stádiu druhé úplné remise po transplantaci vlastních kmenových buněk vykazující celkovou rezistencí destiček a rozsáhlé gastrointestinální krvácení. Jeho stav vyžadoval každodenní transfúzi shluknutých buněk a došlo hypoalbuminii a neodpovídal ani na rozsáhlou léčbu pomocí rhIL-3 a rhIL-β a gamaglobulinem. Po dvou intramuskulárních aplikacích 50 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu ve třech dávkách 86 dní po transfúzi se pozorovalo rychlá obnova krevních destiček (zobrazeno na obrázku 18) a postupné přerušení krvácení. Nebyla nutná žádná jiná léčba a pacient je v současné době úplně bez příznaků s vykazuje normální počet krevních destiček.

Tak jedna kůra dvou intramuskulárních injekcí peptidů získaných z přirozeného kaseinu v množství 0,7 až 1,0 mg na kilogram tělesné hmotnosti rozdělené do tří aplikací byla účinná při rychlé obnově počtu krevních destiček a vymizení spojených klinických symptomů u pacientů trpících dlouhotrvající trombocytopenií odolávající transfúzi s epizodami krvácení, které ohrožují život.

Peptídy získané z přirozeného kaseinu snižují hladinu triglyceridů a celková hladina LDL-cholesterolu u rodinné hyper1ipidemie M.S. (pacient ženského pohlaví)

Pacient je žena ve věku 38 let s rodinou anamnézou hyperlipidemie. Před léčbou pomocí peptidů získaných z přirozeného kaseinu krevní chemický profil ukázal zvýšený celkový cholesterol (321 mg v jednom decilitru), triglyceridy (213 mg v jednom decilitru, normální hodnoty jsou v rozmezí 45 až 185 mg v jednom decilitru) a zvýšený LDL-cholesterol (236,4 mg v jednom decilitru, normální hodnoty jsou v rozmezí 75 až 174 mg v jednom decilitru). Jeden měsíc po jediné aplikaci 50 mg peptidů získaných z přirozeného kaseinu ve třech intramuskulárních dávkách se hyperlipemie stabilizovala: celkový cholesterol se snížil na 270 mg v jednom decilitru, triglyceridy byly 165 mg v jednom decilitru a LDL-cholesterol byl 201 mg v jednom decilitru, což je hodnota stále vyšší než normální rozmezí, ale podstatně se snížila ve srovnání s hodnotou před léčbou. Neaplikovala se žádná další léčení. Tak léčení pomocí peptidů získaných z přirozeného kaseinu je účinná při rychlém snížení jinak neléčitelné lidské hyperlipemie. podporuj í kaseinu

Peptidy získané z přirozeného normoglobinemii v případě okultního krvácení D.G. (pacient mužského pohlaví)

Pacient je muž 75 let starý trpící anemií a hypoglobinemií (snížené počty RBC, HGB, HCT a MCHC) , což je spojené s rozsáhlým okultním krvácením. Jeden měsíc po aplikaci dvou intramuskulárních injekcích s 50 mg peptidů získanými z přirozeného kaseinu ve třech dávkách se pozorovalo podstatné omezení anemie. Po dvou měsících hodnoty RBC dosáhly normálních hodnot (4,32 místo 3,44 molů v jednom mikrolitru) , hodnoty HGB se zvýšily (11,3 místo 8,9 g v jednom decilitru) a HCT, MCH a MCHC dosáhly skoro normálních hodnot navzdory přetrvávání okultního krvácení. Tak jedna série injekcí peptidů získaných z přirozeného kaseinu se zdá být schopná stimulovat u lidí erytropoézu a snížit anemii spojenou se ztrátou krve u lidí.

Oceňuje se, že jisté rysy vynálezu, které jsou za účelem objasnění, popsány v souvislosti s jednotlivými provedeními se mohou také vyskytovat v kombinaci v jediném provedení. Naopak různé rysy vynálezu, které jsou za účelem stručnosti popsány v souvislosti s jediným provedením se mohou také vyskytovat odděleně nebo v libovolné vhodné dílčí kombinaci. Ačkoli se vynález popisuje ve spojení s jeho specifickými provedeními, je jasné, že řada možností, úprav a variací bude odborníkovi zřejmá. V souladu s tím se uvažuje obsáhnout všechny takové možnosti, úpravy a variace, které spadají do rozsahu přiložených nároků. Všechny publikace, patentové dokumenty, patentové přihlášky a sekvence identifikované číslem jsou zde začleněny ve své úplnosti citací ve stejném rozsahu, jako kdyby každá jednotlivá publikace, patentový dokument, patentová přihláška nebo sekvence byla specificky a jednotlivě označena za účelem být zde začleněna odkazem. Navíc citace nebo identifikace libovolného odkazu v této přihlášce takový by neměla být konstruována tak, aby se zjistilo, že odkaz je dostupný jako dosavadní stav techniky.

Průmyslová využitelnost Předkládaný vynález je průmyslově využitelný pro výrobu 123 1« *···

Seznam sekvencí <110> Sidelman, Zvi <12 0> Peptidy získané z kaseinu a jejich použití v terapii <13 0> 02/23922 <160> 25 <170> Patentln verze 3.1 <210> 1 <211> 2 <212> PRT <213> <22 0> umělá sekvence <223> syntetický peptid <400> 1

Arg Pro 1 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> <22 0> umělá sekvence <223> syntetický peptid <4 00> 2

Arg Pro Lys 1 <210> 3 124

·% • « •«- ·

<211> 4 <212> PRT <213> umělá sekvence <22 0> <223> syntetický peptid <400> 3

Arg Pro Lys His 1

<210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> umělá sekvence <22 0> <223> syntetický peptid <400> 4

Arg Pro Lys His Pro 1 5

<210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> umělá sekvence <220> <223> syntetický peptid <400> 5

Arg Pro Lys His Pro Ile 1 5 125

<210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> umělá sekvence <22 0> <223> syntetický peptid <400> 6

Arg Pro Lys His Pro Ile Lys 1 5

<210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> umělá sekvence <22 0> <223> syntetický peptid <400> 7

Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His 1 5 • ·· ·· · · • · · • · · # · · ··· ··

<210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> umělá sekvence <22 0> <223> syntetický peptid <400> 8 • « · 126 • · • ·

Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin 1 5

<210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> umělá sekvence <220> <223> syntetický peptid <4 0 0> 9

Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> <220> umělá sekvence <223> syntetický peptid <400> 10

Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> umělá sekvence <22 0> <223> syntetický peptid .,, ·· ···· «· · ···· ·· · * : : . ..· ·· · .··· .. . , « · ··· ····· m ·········· x^ / ,·· ·· ·· ·· ·· # <400> 11

Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro 15 10 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> <22 0> umělá sekvence <223> syntetický peptid <400> 12

Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin 1 5 10 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> <22 0> umělá sekvence <22 3> syntetický peptid <400> 13

Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu 1 5 10 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> umělá sekvence <220> 128 • · · • · · · · <223> syntetický peptid <4 00> 14 Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly 1 5 10 Val 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> umělá sekvence <220> <2 23> syntetický peptid <400> 15 Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly 1 5 10 Val Leu 15 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> umělá sekvence <22 0> Λ tO to U) V syntetický peptid <400> 16 • · · · · · · · · • « · · · · · • · · *> • · • · · · · « • · · • · * 129 129 Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu 5 10

Arg Pro Lys His 1

Val Leu Asn 15 <210> 17 <211> 18 <212> PRT <213> umělá sekvence <22 0> <223> syntetický peptid <400> 17

Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu 15 10

Val Leu Asn Glu 15

<210> 18 <211> 19 <212> PRT <213> umělá sekvence <22 0> <223> syntetický peptid <400> 18

Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu 15 10

Val Leu Asn Glu Asn 15 <210> 19 ···· ·· * ·· ··· ·· · · · · · • · · · « * ··* ···· • · 9 · · * · ·· * <211> 20 <212> PRT <213> <22 0> umělá sekvence <223> syntetický peptid <4 00> 19

Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu 15 10

Val Leu Asn Glu Asn Leu 15 20 <210> 20 <211> 21 <212> PRT <213> <22 0> umělá sekvence <223> syntetický peptid <400> 20

Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu 15 10

Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu 15 20 <210> 21 <211> 22 <212> PRT <213> <22 0> umělá sekvence <223> syntetický peptid <400> 21 131

• I • · · · • · «

Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu 15 10

Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg 15 20

<210> 22 <211> 23 <212> PRT <213> umělá sekvence <22 0> <223> syntetický peptid <400> 22

Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu 1 5 10 Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe 15 20

<210> 23 <211> 24 <212> PRT <213> umělá sekvence <220> <223> syntetický peptid <400> 23

Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu 15 10

Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe 15 20 132

<210> 24 <211> 25 <212> PRT <213> umělá sekvence <220> <223> syntetický peptid <400> 24

Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu 10 Leu Leu Arg Phe Phe Val 20 25

Arg Pro Lys His Pro 1 5

Val Leu Asn Glu Asn 15 <210> 25 <211> 26 <212> PRT <213> umělá sekvence <22 0> <223> syntetický peptid <400> 25

Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gin Gly Leu Pro Gin Glu 15 10

Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala 15 20 25

Praha a.s*

Claims

133 • · · PATENTOVÉ NÁROKY 1. Způsob prevence nebo léčení autoimunitního onemocněni, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuj e.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

5. Způsob prevence nebo léčení virového onemocnění, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

7. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

8. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25. • · · · · 134

9. Způsob prevence virové infekce, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje podáváni terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

11. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

12. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

13. Způsob vyvolání krvetvorby, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

15. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

16. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

17. Způsob vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje.

18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

19. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

20. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

21. Způsob vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje.

22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

23. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

24. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

25. Způsob vyvolání megakaryocytopoézy, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuj e.

26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

27. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

28. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

29. Způsob vyvoláni erytropoézy, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje.

30. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

31. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

32. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

33. Způsob vyvolání leukocytopoézy, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje.

34. Způsob podle nároku 33, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. s e

35. Způsob podle nároku 33, vyznačuj ící tím, že peptid je syntetický peptid.

36. Způsob podle nároku 33, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25. 37. Způsob vyvolání trombocytopoézy, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje.

38. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací očSI kaseinu.

39. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

40. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

41. Způsob vyvolání proliferace plasmových buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje.

42. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. s e

43. Způsob podle nároku 41, vyznačuj ící tím, že peptid je syntetický peptid. 138 138 • · • ·· ·· ··♦· ······ ·

44. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

45. Způsob vyvolání proliferace dendritických buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje.

46. Způsob podle nároku 45, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

47. Způsob podle nároku 45, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

48. Způsob podle nároku 45, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

49. Způsob vyvolání proliferace makrofágů, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z M-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje.

50. Způsob podle nároku 49, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. s e

51. Způsob podle nároku 49, vyznačuj ící tím, že peptid je syntetický peptid. s e

52. Způsob podle nároku 49, vyznačuj ící tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

53. Způsob prevence nebo léčení trombocytopenie, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje.

54. Způsob podle nároku 53, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

55. Způsob podle nároku 53, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

56. Způsob podle nároku 53, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

57. Způsob prevence nebo léčení pancytopenie, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální částí aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuj e.

58. Způsob podle nároku 57, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

59. Způsob podle nároku 57, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

60. Způsob podle nároku 57, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

61. Způsob prevence nebo léčeni granulocytopenie, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuj e.

62. Způsob podle nároku 61, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

63. Způsob podle nároku 61, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

64. Způsob podle nároku 61, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

65. Způsob prevence nebo léčeni hyperlipidemie, vyznačuj í c í se tím, že zahrnuj e podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální potřebuj e. části aSl kaseinu pacientovi, který to

66. Způsob podle nároku 65, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

67. Způsob podle nároku 65, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid. • · · 141

68. Způsob podle nároku 65, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

69. Způsob prevence nebo léčení cholesterolemie, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuj e.

70. Způsob podle nároku 69, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

71. Způsob podle nároku 69, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

72. Způsob podle nároku 69, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25. léčení glukosurie, že zahrnuj e podávání peptidu získaného pacientovi, který to

73. Způsob prevence nebo vyznačující se tím, terapeuticky účinného množství z N-terminální části aSl kaseinu potřebuj e.

74. Způsob podle nároku 73, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. s e

75. Způsob podle nároku 73, vyznačuj ící tím, že peptid je syntetický peptid. 142 ·· ···· « 9 · · · · · • · · · · · · • · · · ♦ *·*·· •C ·· ♦· *

76. Způsob podle nároku 73, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

77. Způsob prevence nebo léčení cukrovky, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množstvi peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuj e.

78. Způsob podle nároku 77, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

79. Způsob podle nároku 77, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

80. Způsob podle nároku 77, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

81. Způsob prevence nebo léčení AIDS, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje.

82. Způsob podle nároku 81, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

83. Způsob podle nároku 81, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid. 143 • · ♦ · • · · ·

• · · t · · • · · · · · · • · ··· ····· • · · · · · · • · · · · · ·

84. Způsob podle nároku 81, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

85. Způsob prevence nebo léčení infekce HIV, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuj e.

86. Způsob podle nároku 85, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

87. Způsob podle nároku 85, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

88. Způsob podle nároku 85, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

89. Způsob prevence nebo léčení stavů spojených s myeloblačními dávkami chemoradioterapie podporované transplantací vlastní kostní dřeně nebo kmenových buněk periferní krve - ASCT nebo transplantací cizorodé kostní dřeně BMT, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuj e.

90. Způsob podle nároku 89, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. s e

91. Způsob podle nároku 89, vyznačuj ící tím, že peptid je syntetický peptid. s e

92. Způsob podle nároku 89, vyznačuj ící tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

93. Způsob léčení stavu léčitelného erytropoetinem, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuj e.

94. Způsob podle nároku 93, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

95. Způsob podle nároku 93, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

96. Způsob podle nároku 93, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

97. Způsob umocnění účinku erytropoetinu, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje.

98. Způsob podle nároku 97, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

99. Způsob podle nároku 97, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid. • φ · · · 145

100. Způsob podle nároku 97, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

101. Způsob léčeni stavu léčitelného trombopoetinem, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje.

102. Způsob podle nároku 101, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

103. Způsob podle nároku 101, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

104. Způsob podle nároku 101, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

105. Způsob umocnění účinku trombopoetinu, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuj e.

106. Způsob podle nároku 105, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. s e

107. Způsob podle nároku 105, vyznačuj ící tím, že peptid je syntetický peptid. 146 • · ··«· • ·

108. Způsob podle nároku 105, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

109. Způsob zlepšení mobilizace periferních kmenových buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství peptidu získaného z N-terminální části aSl kaseinu pacientovi, který to potřebuje.

110. Způsob podle nároku 109, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

111. Způsob podle nároku 109, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

112. Způsob podle nároku 109, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

113. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení autoimunitního onemocnění, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

114. Farmaceutický prostředek podle nároku 113, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

115. Farmaceutický prostředek podle nároku 113, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid. 116. Farmaceutický prostředek podle nároku 113, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

117. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení virového onemocnění, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

118. Farmaceutický prostředek podle nároku 117, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

119. Farmaceutický prostředek podle nároku 117, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

120. Farmaceutický prostředek podle nároku 117, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

121. Farmaceutický prostředek pro prevenci virové infekce, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

122. Farmaceutický prostředek podle nároku 121, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. prostředek podle nároku 121, tím, že peptid je syntetický s e

123. Farmaceutický vyznačuj ící peptid. 148 1« ·· «··· • · ♦ · ·

124. Farmaceutický prostředek podle nároku 121, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

125. Farmaceutický prostředek pro vyvolání krvetvorby, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

126. Farmaceutický prostředek podle nároku 125, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

127. Farmaceutický prostředek podle nároku 125, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

128. Farmaceutický prostředek podle nároku 125, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

129. Farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

130. Farmaceutický prostředek podle nároku 129, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

131. Farmaceutický prostředek podle nároku 129, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid. 132 . Farmaceutický prostředek podle nároku 129, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

133. Farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

134. Farmaceutický prostředek podle nároku 133, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

135. Farmaceutický prostředek podle nároku 133, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

136. Farmaceutický prostředek podle nároku 133, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

137. Farmaceutický prostředek pro vyvolání megakaryocytopoézy, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

138. Farmaceutický prostředek podle nároku 137, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. 150 • · · ·· » » · ·· ···· ♦ * · • t • · • · «

139. Farmaceutický prostředek podle nároku 137, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

140. Farmaceutický prostředek podle nároku 137, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

141. Farmaceutický prostředek pro vyvolání erytropoézy, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

142. Farmaceutický prostředek podle nároku 141, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

143. Farmaceutický prostředek podle nároku 141, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

144. Farmaceutický prostředek podle nároku 141, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

145. Farmaceutický prostředek pro vyvolání leukocytopoézy, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

146. Farmaceutický prostředek podle nároku 145, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. 151 151 ·· ···» % Μ Μ * V • · · • · · · • * * • Μ · · * * · • · · • « · • · · * ·· ·· ·· · • 4 · • · f « • · · * · · • « · ΦΦ ·

147. Farmaceutický prostředek podle nároku 145, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

148. Farmaceutický prostředek podle nároku 145, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

149. Farmaceutický prostředek pro vyvolání trombocytopoézy, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

150. Farmaceutický prostředek podle nároku 149, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

151. Farmaceutický prostředek podle nároku 149, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

152. Farmaceutický prostředek podle nároku 149, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

153. Farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace plasmových buněk, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

154. Farmaceutický prostředek podle nároku 153, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. 155. Farmaceutický prostředek podle nároku 153, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

156. Farmaceutický prostředek podle nároku 153, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

157. Farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace dendritických buněk, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

158. Farmaceutický prostředek podle nároku 157, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

159. Farmaceutický prostředek podle nároku 157, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

160. Farmaceutický prostředek podle nároku 157, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

161. Farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace makrofágů, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

162. Farmaceutický prostředek podle nároku 161, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. 163. Farmaceutický prostředek podle nároku 161, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

164. Farmaceutický prostředek podle nároku 161, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

165. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení trombocytopenie, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

166. Farmaceutický prostředek podle nároku 165, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

167. Farmaceutický prostředek podle nároku 165, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

168. Farmaceutický prostředek podle nároku 165, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

169. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení pancytopenie, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

170. Farmaceutický prostředek podle nároku 169, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. 154 «·Μ

171. Farmaceutický prostředek podle nároku 169, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

172. Farmaceutický prostředek podle nároku 169, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

173. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení granulocytopenie, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

174. Farmaceutický prostředek podle nároku 173, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

175. Farmaceutický prostředek podle nároku 173, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

176. Farmaceutický prostředek podle nároku 173, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

177. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení hyperlipidemie, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

178. Farmaceutický prostředek podle nároku 177, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. 155 • ····

179. Farmaceutický prostředek podle nároku 177, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

180. Farmaceutický prostředek podle nároku 177, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

181. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení cholesterolemie, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

182. Farmaceutický prostředek podle nároku 181, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

183. Farmaceutický prostředek podle nároku 181, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

184. Farmaceutický prostředek podle nároku 181, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

185. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení glukosurie, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

186. Farmaceutický prostředek podle nároku 185, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. 156 156

• · · · • ♦ · · · ··· ····· • · · · · • · · · · η ·

187. Farmaceutický prostředek podle nároku 185, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

188. Farmaceutický prostředek podle nároku 185, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

189. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení cukrovky, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

190. Farmaceutický prostředek podle nároku 189, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

191. Farmaceutický prostředek podle nároku 189, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

192. Farmaceutický prostředek podle nároku 189, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

193. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení AIDS, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

194. Farmaceutický prostředek podle nároku 193, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. 157 ·

195. Farmaceutický prostředek podle nároku 193, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

196. Farmaceutický prostředek podle nároku 193, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

197. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení infekce HIV, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

198. Farmaceutický prostředek podle nároku 197, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

199. Farmaceutický prostředek podle nároku 197, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

200. Farmaceutický prostředek podle nároku 197, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

201. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení stavů spojených s myeloblačními dávkami chemoradioterapie podporované transplantací vlastní kostní dřeně nebo kmenových buněk periferní krve - ASCT nebo transplantací cizorodé kostní dřeně - BMT, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič. 202. Farmaceutický prostředek podle nároku 201, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

203. Farmaceutický prostředek podle nároku 201, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

204. Farmaceutický prostředek podle nároku 201, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

205. Farmaceutický prostředek pro léčení stavu léčitelného trombopoetinem, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

206. Farmaceutický prostředek podle nároku 205, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

207. Farmaceutický prostředek podle nároku 205, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

208. Farmaceutický prostředek podle nároku 205, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

209. Farmaceutický prostředek pro umocnění účinku trombopoetinu, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič. 210. Farmaceutický prostředek podle nároku 209, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

211. Farmaceutický prostředek podle nároku 209, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

212. Farmaceutický prostředek podle nároku 209, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

213. Farmaceutický prostředek pro zlepšení mobilizace periferních kmenových buněk, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

214. Farmaceutický prostředek podle nároku 213, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

215. Farmaceutický prostředek podle nároku 213, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

216. Farmaceutický prostředek podle nároku 213, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

217. Farmaceutický prostředek pro vyvolání krvetvorby, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič. 218. Farmaceutický prostředek podle nároku 217, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

219. Farmaceutický prostředek podle nároku 217, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

220. Farmaceutický prostředek podle nároku 217, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

221. Farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

222. Farmaceutický prostředek podle nároku 221, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

223. Farmaceutický prostředek podle nároku 221, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

224. Farmaceutický prostředek podle nároku 221, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

225. Farmaceutický prostředek pro vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní 161 ·· ··*· 161 ·· ··*· • # • · • · Ψ * · I · • · · · · · · ··« «· ·« ·· složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální částí aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

226. Farmaceutický prostředek podle nároku 225, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

227. Farmaceutický prostředek podle nároku 225, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

228. Farmaceutický prostředek podle nároku 225, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

229. Farmaceutický prostředek pro vyvolání megakaryocytopoézy, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

230. Farmaceutický prostředek podle nároku 229, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

231. Farmaceutický prostředek podle nároku 229, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

232. Farmaceutický prostředek podle nároku 229, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

233. Farmaceutický prostředek pro vyvolání erytropoézy, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

234. Farmaceutický prostředek podle nároku 233, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

235. Farmaceutický prostředek podle nároku 233, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

236. Farmaceutický prostředek podle nároku 233, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

237. Farmaceutický prostředek pro vyvolání leukocytopoézy, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

238. Farmaceutický prostředek podle nároku 237, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

239. Farmaceutický prostředek podle nároku 237, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

240. Farmaceutický prostředek podle nároku 237, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25. 163

241. Farmaceutický prostředek pro vyvoláni trombocytopoézy, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

242. Farmaceutický prostředek podle nároku 241, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

243. Farmaceutický prostředek podle nároku 241, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

244. Farmaceutický prostředek podle nároku 241, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

245. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení trombocytopenie, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

246. Farmaceutický prostředek podle nároku 245, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. prostředek podle nároku 245, tím, že peptid je syntetický s e

247. Farmaceutický vyznačuj ící peptid. 164 • « • · · • · • · · ·

248. Farmaceutický prostředek podle nároku 245, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

249. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení pancytopenie, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

250. Farmaceutický prostředek podle nároku 249, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

251. Farmaceutický prostředek podle nároku 249, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

252. Farmaceutický prostředek podle nároku 249, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

253. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení granulocytopenie, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části aSl kaseinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

254. Farmaceutický prostředek podle nároku 253, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. 255. Farmaceutický prostředek podle nároku 253, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

256. Farmaceutický prostředek podle nároku 253, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

257. Farmaceutický prostředek pro léčení nebo prevenci stavů vybraných ze skupiny sestávající z autoimunitního onemocnění nebo stavu, virového onemocnění, virové infekce, hematologického onemocnění, hematologické nedostatečnosti, trombocytopenie, pancytopenie, granulocytopenie, hyperlipidemie, hypercholesterolemie, glukosurie, hyperglykémie, cukrovky, AIDS, HIV-1, poruch pomocných T-buněk, nedostatečnosti dendritických buněk, nedostatečnosti makrofágů, poruch krvetvorných kmenových buněk včetně destiček, lymfocytů, poruch plasmových buněk a poruch neutrofilů, předleukemických stavů, leukemických stavů, poruch imunitního systému způsobených chemoterapií nebo radioterapií, poruch lidského imunitního systému způsobených léčením nemoci souvisejících s nedostatkem imunity a bakteriálními infekcemi, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.

258. Farmaceutický prostředek podle nároku 257, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

259. Farmaceutický prostředek podle nároku 257, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid. 260. Farmaceutický prostředek podle nároku 257, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

261. Farmaceutický prostředek pro léčení nebo prevenci stavů vybraných ze skupiny sestávající z hematologického onemocnění, hematologické nedostatečnosti, trombocytopenie, pancytopenie, granulocytopenie, nedostatečnosti dendritických buněk, nedostatečnosti makrofágů, poruch krvetvorných kmenových buněk včetně destiček, lymfocytů, poruch plasmových buněk a poruch neutrofilů, předleukemických stavů, leukemických stavů, myelodysplastického syndromu, aplastické anemie a nedostatečnosti kostní dřeně, vyznačuj ící se tím, že obsahuje jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič.

262. Farmaceutický prostředek podle nároku 261, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

263. Farmaceutický prostředek podle nároku 261, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

264. Farmaceutický prostředek podle nároku 261, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25. 265. Čištěný peptid, který má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

266. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se tím, že obsahuje čištěný peptid, který má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

267. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje trombopoetin a čištěný peptid, který má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

268. Způsob zlepšeni kolonizace darovaných krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci, vyznačující se tím, že zahrnuje léčení dárce těchto darovaných krevních kmenových buněk peptidem získaným z N-terminální části kaseinu aSl před darováním a implantací darovaných krevních kmenových buněk příjemci.

269. Způsob podle nároku 268, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

270. Způsob podle nároku 268, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

271. Způsob podle nároku 268, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

272. Způsob zlepšení kolonizace darovaných krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci, vyznačující se tím, že zahrnuje úpravu těchto darovaných krevních kmenových buněk peptidem získaným z N-terminální části kaseinu aSl před implantací darovaných krevních kmenových buněk příjemci.

273. Způsob podle nároku 272, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. 168

« ·

274. Způsob podle nároku 272, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

275. Způsob podle nároku 272, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

276. Způsob zlepšeni kolonizace krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci, vyznačující se tím, že zahrnuje úpravu těchto krevních kmenových buněk peptidem získaným z N-terminální části kaseinu aSl před implantací krevních kmenových buněk příjemci.

277. Způsob podle nároku 276, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

278. Způsob podle nároku 276, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

279. Způsob podle nároku 276, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

280. Způsob zlepšení kolonizace darovaných krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci, vyznačující se tím, že zahrnuje léčení dárce těchto darovaných krevních kmenových buněk peptidem získaným z N-terminální části kaseinu aSl před a trombopoetinem darováním a implantací darovaných krevních kmenových buněk příjemci.

281. Způsob podle nároku 280, vyznačující se tím, ze peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. s e

282. Způsob podle nároku 280, vyznačuj ící tím, že peptid je syntetický peptid.

283. Způsob podle nároku 280, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

284. Způsob zlepšení kolonizace darovaných krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci, vyznačující se tím, že zahrnuje úpravu těchto darovaných krevních kmenových buněk peptidem získaným z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetinem před implantací darovaných krevních kmenových buněk příjemci.

285. Způsob podle nároku 284, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

286. Způsob podle nároku 284, vyznačující se tím, že peptid je syntetický peptid.

287. Způsob podle nároku 284, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

288. Způsob zlepšení kolonizace krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci, vyznačující se tím, že zahrnuje úpravu těchto krevních kmenových buněk peptidem získaným z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetinem před implantací krevních kmenových buněk příjemci.

289. Způsob podle nároku 288, vyznačující se tím, že peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu. s e

290. Způsob podle nároku 288, vyznačuj ící tím, že peptid je syntetický peptid.

291. Způsob podle nároku 288, vyznačující se tím, že peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

292. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení autoimunitního onemocnění.

293. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení virového onemocnění.

294. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení virové infekce.

295. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro vyvolání krvetvorby.

296. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk.

297. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk.

298. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro vyvolání megakaryocytopoézy. 299 . Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro vyvolání erytrotopoézy.

300. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro vyvolání leukocytopoézy.

301. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro vyvolání trombocytopoézy.

302. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro vyvolání proliferace plasmových buněk.

303. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro vyvolání proliferace dendritických buněk.

304. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro vyvolání proliferace makrofágů.

305. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení trombocytopenie.

306. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení pancytopenie.

307. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení granulocytopenie. » ·· · 172 : : ··· ·· ·· ···· ·· · . . · · * * ! • ·· · · · · ··· · ··♦ ··· • · · · · · · ·· ·· ·· ·· • • · • • 308. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení hyperlipidemie. 309. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení cholesterolemie. 310. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení glukosurie. 311. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro cukrovky. přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení 312. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení AIDS. 313. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení infekce HIV. 314. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení stavů spojených s myeloblačními dávkami chemoradioterapie podporované transplantací vlastní kostní dřeně nebo kmenových buněk periferní krve - ASCT nebo transplantací cizorodé kostní dřeně - BMT.

315. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro léčení stavu léčitelného trombopoetinem. 173

z N-terminální části pro umocnění účinku

316. Použití peptidu získaného kaseinu aSl pro přípravu léčiva trombopoetinu.

317. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro přípravu léčiva pro zlepšení mobilizace periferních kmenových buněk.

318. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro zlepšení kolonizace darovaných krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci.

319. Použití peptidu získaného z N-terminální části kaseinu aSl pro zlepšení kolonizace krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci.

320. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení autoimunitního onemocnění.

321. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení virového onemocnění.

322. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení virové infekce.

323. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání krvetvorby. 174

324. Použiti farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk.

325. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk.

326. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání megakaryocytopoézy.

327. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání erytrocytopoézy.

328. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání leukocytopoézy.

329. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání trombocytopoézy.

330. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání proliferace plasmových buněk. 175 • ·

331. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání proliferace dendritických buněk.

332. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání proliferace makrofágů.

333. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení trombocytopenie.

334. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení pancytopenie.

335. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení granulocytopenie.

336. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení hyperlipidemie.

337. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení cholesterolemie.

338. Použiti farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení glukosurie.

339. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení cukrovky.

340. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální částí kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení AIDS.

341. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení infekce HIV.

342. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení stavů spojených s myeloblačními dávkami chemoradioterapie podporované transplantací vlastní kostní dřeně nebo kmenových buněk periferní krve - ASCT nebo transplantací cizorodé kostní dřeně - BMT.

343. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro léčení stavu léčitelného trombopoetinem.

344. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro umocnění účinku trombopoetinu.

345. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro zlepšení mobilizace periferních kmenových buněk.

346. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro zlepšení kolonizace darovaných krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci.

347. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složku peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro zlepšení kolonizace krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci.

348. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání krvetvorby.

349. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání proliferace krvetvorných kmenových buněk.

350. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro

• · · ·« · · 178 : : : • · · »· vyvolání proliferace a diferenciace krvetvorných kmenových buněk.

351. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání megakaryocytopoézy.

352. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání erytropoézy.

353. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání leukocytopoézy.

354. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro vyvolání trombocytopoézy.

355. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální částí kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení trombocytopenie.

356. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení pancytopenie. 179 ·» ···· • *

357. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení granulocytopenie.

358. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení stavů vybraných ze skupiny sestávající z autoimunitního onemocnění nebo stavu, virového onemocnění, virové infekce, hematologického onemocnění, hematologické nedostatečnosti, trombocytopenie, pancytopenie, granulocytopenie, hyperlipidemie, hypercholesterolemie, glukosurie, hyperglykémie, cukrovky, AIDS, HIV-1, poruch pomocných T-buněk, nedostatečnosti dendritických buněk, nedostatečnosti makrofágů, poruch krvetvorných kmenových buněk včetně destiček, lymfocytů, poruch plasmových buněk a poruch neutrofilů, předleukemických stavů, leukemických stavů, poruch imunitního systému způsobených chemoterapií nebo radioterapií, poruch lidského imunitního systému způsobených léčením nemocí souvisejících s nedostatkem imunity a bakteriálními infekcemi.

359. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky trombopoetin a peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a farmaceuticky přijatelný nosič pro prevenci nebo léčení stavů vybraných ze skupiny sestávající z hematologického onemocnění, hematologické nedostatečnosti, trombocytopenie, pancytopenie, granulocytopenie, nedostatečnosti dendritických buněk, nedostatečnosti makrofágů, poruch krvetvorných kmenových buněk včetně destiček, lymfocytů, poruch plasmových buněk a poruch neutrofilů, předleukemických stavů, leukemických stavů, myelodysplastického syndromu, aplastické anemie a nedostatečnosti kostní dřeně.

360. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetin a farmaceuticky přijatelný nosič pro zlepšení kolonizace darovaných krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci.

361. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího jako aktivní složky peptid získaný z N-terminální části kaseinu aSl a trombopoetin a farmaceuticky přijatelný nosič pro zlepšení kolonizace krevních kmenových buněk v myeloablatovaném příjemci.

362. Použití podle kteréhokoliv z nároků 292 až 361, ve kterém peptid je fragment získaný fragmentací aSl kaseinu.

363. Použití podle kteréhokoliv z nároků 292 až 361, ve kterém peptid je čištěný peptid, který má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25.

364. Použití podle kteréhokoliv z nároků 292 až 361, ve kterém peptid je syntetický peptid.

365. Použití podle kteréhokoliv z nároků 292 až 361, ve kterém peptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence id. č. 1 až 25. )

/ Praha a.s.