JP2011026213A

JP2011026213A - １型糖尿病抑制ペプチド

Info

Publication number: JP2011026213A
Application number: JP2009170752A
Authority: JP
Inventors: Yukio Kadooka; 幸男門岡; Satoshi Higure; 聡志日暮; Tomohiro Hosoya; 知広細谷; Atsushi Enomoto; 淳榎本
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 2009-07-22
Filing date: 2009-07-22
Publication date: 2011-02-10

Abstract

【課題】日常的な摂取が可能であり、なおかつ摂取することで、１型糖尿病疾患の予防に有用な１型糖尿病疾患予防剤、及び、この機能を配合した飲食品及び飼料を提供すること。
【解決手段】チーズに含まれるペプチド及びチーズに含まれるペプチドであるαs1-カゼインの4−13残基（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln）を有効成分とする１型糖尿病疾患予防剤、それを配合した飲食品及び飼料。
【選択図】なし

Description

本発明は、チーズに含まれるペプチドを有効成分とする１型糖尿病疾患予防剤に関するものである。また、チーズに含まれるペプチドが、αs1-カゼインの4−13残基（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln）であることを特徴とする１型糖尿病疾患予防剤である。本発明によるαs1-カゼインの4−13残基（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln）を摂取することにより、１型糖尿病疾患を予防、低減することができる。

インスリンは血糖値の恒常性維持に重要なホルモンであり、膵臓のランゲルハンス島で産生される。しかし、自己反応性Ｔ細胞及び抗体によって、インスリンを産生するランゲルハンス島の膵臓β細胞が破壊されると、自己免疫疾患のひとつである1型糖尿病の発症につながる。
詳細なメカニズムは完全に解明されてはいないが、自己抗原であるグルタミン酸デカルボキシラーゼの524〜543残基（GAD524-543）に特異的なヘルパーＴ細胞応答が自発的に誘導され、それが細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するために引き起こされることがメカニズムの一つと考えられている。そしてこのＴ細胞が膵臓のランゲルハンス島に侵入し、β細胞を選択的に破壊し糖尿病を発症させることがわかっている。
特に、このようなＴ細胞応答にはTh1応答とTh2応答があり、Th1応答ではインターロイキン−２やインターフェロン−γ等のサイトカインが産生され、Th2応答ではインターロイキン−４、10等のサイトカインが産生される。このバランス、すなわちTh1-Th2バランスがインターフェロン−γ産生を主な指標とするTh1応答優位となることが、１型糖尿病等の臓器特異的な自己免疫疾患が起こりやすくなる要因の一つであることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
また、ヒトの1型糖尿病の実験動物モデルとしてnon-obese diabetic (NOD)マウスが知られている。このモデルでは、Ｔ細胞による膵臓のランゲルハンス島β細胞の破壊によって糖尿病が引き起こされるとされている（例えば、非特許文献２参照）。
このようなNODマウスを用い、Th1応答を抑制することで糖尿病を抑制する検討がされている。この検討では、Th1応答が攻撃する自己抗原の中のペプチドをワクチンとしてアジュバントである鉱油とともに注射する方法が用いられている（例えば、特許文献１参照）。
また、副腎皮質ステロイド薬、免疫抑制薬、モノクローナル抗体（抗ＣＤ3抗体、抗ＴＮＦ-ａ抗体等）、可溶化型サイトカイン受容体（可溶化型ＴＮＦ‐α受容体）等の使用による自己免疫疾患の治療も検討されている（例えば、非特許文献３参照）。
なお、日常的に食されているチーズの中から抗酸化活性等の有用な作用を有するペプチドも見出されており（例えば、非特許文献４参照）、チーズに含まれるペプチドが、血中アディポネクチン濃度の増加を促進、あるいは血中アディポネクチン濃度の減少を抑制することも開示されている（例えば、特許文献２参照）。

特許第3905126号公報特開2007−254449号公報

埼玉医科大学雑誌, 第30巻,第1号,29頁,2002年近畿大医誌,24巻,第2号,275頁,1999年最新医学、61巻、５号、917-1009、2006年。インターナショナル・デイリー・ジャーナル（International Dairy Journal）,17巻,224頁,2007年

特許文献１に記載されているこのような注射という方法は医療行為としてのみ可能であり、応用範囲が限定される。
非特許文献３に記載されているこれらの物質は、上述したペプチドワクチンの投与と同様に医薬そのものである。
特許文献２では、チーズに含まれるペプチドが、血中アディポネクチン濃度の増加を促進、あるいは血中アディポネクチン濃度の減少を抑制することが開示されているが、１型糖尿病に関する記載や示唆は認められない。
前述したような自己免疫疾患を予防、または治療するには、これらの薬物を摂取するよりも、日常的に摂取でき、長期にわたって摂取しても問題がなく、食品素材としても使用可能なものから得られる、穏やかな自己免疫疾患予防剤の開発が強く望まれている。
よって、本発明は、日常的に摂取でき、長期にわたって摂取しても安全性の高い自己免疫疾患の予防作用を有する物質を得ることを課題とする。

すなわち本発明は以下の通りである。
（１）チーズに含まれるペプチドを有効成分とする１型糖尿病疾患予防剤。
（２）チーズに含まれるペプチドが、αs1-カゼインの4−13残基（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln）であることを特徴とする１型糖尿病疾患予防剤。
（３）（１）又は（２）に記載の１型糖尿病疾患予防剤を配合した飲食品。
（４）（１）又は（２）に記載の１型糖尿病疾患予防剤を配合した飼料。

本発明の１型糖尿病疾患予防剤は、チーズに含まれるペプチドを投与することにより１型糖尿病疾患を予防することができる。

チーズに含まれるペプチドであるαs1-カゼインの4−13残基（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln）による自己抗原特異的Ｔ細胞応答抑制作用を、平均値及び標準偏差で示した説明図である。（試験例１）

本発明者らは、１型糖尿病疾患を予防あるいは治療する物質を得るために、チーズに存在する活性物質を探索し続けてきた。その結果、チーズが熟成する過程で生成するペプチドに、１型糖尿病疾患予防作用を有する効果があることを見出した。そして、ペプチドを１型糖尿病疾患予防剤の有効成分として利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
チーズに含まれるペプチドは、例えばチーズを溶媒に懸濁した後、脱脂、遠心分離によって不溶性物質の除去を行って得ることができる。さらにその得られた画分からタンパク質を除去してもよい。本発明においてチーズを溶媒に懸濁するということは、チーズに溶媒を加えて均質化したり、または溶媒中で破砕したりして、水溶性ペプチド画分を得やすい大きさにすることをいう。溶媒としては、水、リン酸緩衝液等の水性溶媒を用いる事ができる。その後、透析膜やイオン交換樹脂等によって脱塩を行ってもよいし、さらに、凍結乾燥や噴霧乾燥等によって乾燥させることにより粉末化してもよい。また、これらの画分を透析膜やゲルろ過、イオン交換等の各種クロマトグラフィーにより精製した画分を使用することもできる。

また、１型インスリン依存性糖尿病疾患の予防に有用であるペプチドを得るためのチーズ原料としては、パルメザンチーズ、グリュイエールチーズ、マリボーチーズ、ゴーダチーズ、チェダーチーズ、エメンタールチーズ、エダムチーズ、カマンベールチーズ、ブリーチーズ、マンステールチーズ、ポン・レヴェックチーズ、スチルトンチーズ、ダナブルーチーズ、ブルーチーズ等のナチュラルチーズ、及びこれらのナチュラルチーズを原料としたプロセスチーズ等を用いることができる。特に、熟成度の進んだナチュラルチーズを用いる事が望ましい。

チーズを溶媒に懸濁した後、脱脂、不溶性物質の除去及び未分解タンパク質の除去によって得られるペプチドを含む画分は、さらに、C18カラムを用いた逆相クロマトグラフィーにより精製することも可能である。ペプチドを含む画分をトリフルオロ酢酸（TFA）等の酸性条件下あるいは蒸留水等の中性条件下でC18カラムに通した場合、カラムに吸着されない透過画分と、カラムに吸着されエタノールで溶出されてくる画分に主として分かれる。これらの画分についてゲルろ過クロマトグラフィーによりさらに精製を行った場合の、活性画分の分子量分布は、いずれの画分も400〜6,000の範囲である。
さらに、このペプチドを含む画分を0.05%TFAで溶解した後、YMC-Pack ODS-Aカラム（4.6mm x 150mm）を用いて逆相ＨＰＬＣに供してペプチドを分画する。クロマトグラフィーは、溶媒（Ａ液：0.05%TFA；Ｂ液：100%アセトニトリル）、濃度勾配（0%B⇒45%B,125 min）、流速0.8ml/min、検出波長220nmの条件で行うことが望ましい。
なお、上述するようにチーズより精製することもできるが、有機合成化学的にペプチドを合成することもできるし、遺伝子工学的にペプチドを合成することもできる。

ペプチドの剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤等の製剤を例示することができる。
また、上述のようにして得られるチーズに含まれるペプチドを有効成分とする飲食品であるが、飲食品としてはどのような飲食品でも良く、チーズに含まれるペプチド自体であっても良いし、チーズに含まれるペプチド自体を配合した飲食品としても良い。チーズに含まれるペプチドは、喫食時にどのような飲食品に添加しても良く、飲食品の製造工程中に製品の原料に配合しても良い。飲食品の例として、チーズ、バター、発酵乳等の乳食品、飲料、ゼリー、プリン、クッキー、ビスケット、ウエハース、スナック等の菓子、ケーキ、麺類、ソーセージ、各種粉乳、更には、冷凍食品等の飲食品を例示することができる。
また、上述のようにして得られるチーズに含まれるペプチドを有効成分とする飼料であるが、飼料としてはチーズに含まれるペプチド自体であっても良いし、チーズに含まれるペプチド自体を配合した飼料としても良い。チーズに含まれるペプチドは、飼料に直接添加しても良いし、飼料の製造工程中に製品の原料に配合しても良い。
本発明の１型糖尿病疾患予防剤は、これを投与することにより１型糖尿病疾患を予防することができるので、自己抗原特異的Ｔ細胞応答による１型インスリン依存性糖尿病の予防や治療に有用である。

以下に、実施例及び試験例を示し、本発明についてより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

（ゴーダタイプチーズのペプチドの調製１）
原料乳を加熱殺菌（75℃、15秒間）した後、30℃まで冷却し、0.01％塩化カルシウムを添加した。さらに、市販乳酸菌スターター及びラクトバチルス・ヘルベチカスを添加し、さらにレンネットを添加して乳を凝固させた。このようにして得られた凝乳をカッティングし、pHが6.2〜6.1となるまで撹拌してホエーを排出し、カード粒を得た。そして、このカード粒を型詰めして圧搾し、さらに加塩して、10℃で８ヶ月熟成させ、ゴーダタイプの硬質ナチュラルチーズを調製した。
調製したゴーダチーズ20ｇに蒸留水80mlを加え、ストマッカー（オルガノ社）で15分間摩砕した後、水中においてウルトラディスパーサー（ULTRA-TURRAX、T-25；IKAジャパン社）で30秒間さらに破砕した。破砕時に生じた乳脂肪を取り除き、得られたチーズスラリーを振盪機で30分間振盪した後、遠心分離（6,000rpm、20min、４℃）で不溶物を除き、上清をろ紙(No.113；ワットマン社)によりろ過した。得られたろ過液にエタノールを70％濃度になるように加え、４℃で4時間静置した後、遠心分離（10,000rpm、20min、４℃）により不溶物を除去し、エバポレーターでエタノールを除いた後、凍結乾燥してゴーダタイプチーズの水溶性ペプチドを含む水溶性ペプチド画分を得た。

（ゴーダタイプチーズのペプチドの調製２）
実施例１で得られた水溶性ペプチド画分を0.05%TFAで溶解した後、YMC-Pack ODS-Aカラム（4.6mm x 150mm）を用いて逆相HPLCに供し、水溶性ペプチド精製画分に分画した。クロマトグラフィーは、溶媒（Ａ液：0.05%TFA；Ｂ液：100%アセトニトリル）、濃度勾配（0%B⇒45%B,125 min）、流速0.8ml/min、検出波長220nmの条件で行った。
この水溶性ペプチド精製画分をCosmosil 5C22-AR-II（4.6mm x 150mm）を用いて逆相HPLCに供し、更に分画しペプチドを得た。クロマトグラフィーは、溶媒（Ａ液：0.1%TFA；Ｂ液：80%アセトニトリル）、濃度勾配（0%B⇒15%B,40 min）、流速0.8ml/min、検出波長220nmの条件でおこなった。
このようにして得られたペプチドについて、ペプチドシークエンサー（アプライド・バイオシステムズ社）でアミノ酸配列を解析した。その結果、αs1-カゼインの4−13残基から、His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Glnで表されるアミノ酸配列からなるペプチドが確認された。
得られたペプチドの自己抗原に応答するＴ細胞抑制作用を以下に示す試験例１の方法で測定したところ、強い自己抗原特異的Ｔ細胞応答抑制作用が確認された。
これらのペプチドは未熟成チーズ中にはほとんど認められず、熟成によって生成してくるものである。また、このようにして得られた本発明のペプチドは、そのまま１型糖尿病疾患の予防剤として利用可能である。なお、αs1-カゼインの4−13残基（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln）の分解物や誘導体等も用いることができる。

〔試験例１〕
（チーズに含まれるペプチドによる自己抗原特異的Ｔ細胞応答抑制作用）
チーズに含まれるペプチドである、αs1-カゼインの4-13残基（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln）が、膵臓のランゲルハンス島β細胞を破壊する自己抗原特異的Ｔ細胞の応答を抑制するかどうかを調べた。
前述したように、1型糖尿病の発症メカニズムとしては、自己抗原であるグルタミン酸デカルボキシラーゼの524〜543残基（GAD524-543）に特異的なヘルパーＴ細胞応答が自発的に誘導され、それが細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するために引き起こされることが知られている。そしてこのＴ細胞が膵臓のランゲルハンス島に侵入し、β細胞を選択的に破壊し糖尿病を発症させることがわかっている。従って、この自己抗原であるGAD524-543に特異的な自己免疫応答の誘導を抑制することができれば、１型糖尿病の予防が可能になる。
10週齢のNODマウスの脾臓細胞（1×10⁷cells/ml）に、チーズに含まれるペプチドであるαs1-カゼインの4-13残基（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln）を20〜100 μM 濃度で添加し、自己抗原であるGAD524-543存在下で３日間培養し、一次抗原刺激を行った。次に、IL-2を5 ng/ml添加して３日間培養した。これらの細胞を回収・洗浄後、さらにGAD524-543存在下で24時間培養した。その培養上清中に認められるインターフェロン-γの産生量を酵素免疫測定法（ELISA）により測定することで、自己抗原（GAD524-543）特異的Ｔ細胞応答の強さを評価した。その結果を平均値及び標準偏差（n=6）として図１に示した。自己抗原特異的Ｔ細胞応答は、αs1-カゼインの4−13残基（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln）を添加した場合、対照と比較して約1/3に低下した。

表１に示した組成で各成分を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、本発明の１型糖尿病疾患予防作用を持つペプチドを配合した１型糖尿病疾患予防用飲料を製造した。

[表１]
──────────────────────────────
混合異性化糖 15.4 (重量％)
果汁 10.0
クエン酸 0.5
His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln 0.1
（実施例２）
香料 0.2
水 73.8
──────────────────────────────

表２に示す組成のドウを作成し、成形した後、焙焼して本発明の１型糖尿病疾患予防作用を持つペプチドを配合した１型糖尿病疾患予防用ビスケットを製造した。

[表２]
───────────────────────────────
小麦粉 51.0 (重量％)
砂糖 20.0
食塩 0.5
マーガリン 12.5
卵 12.5
水 2.5
ミネラル混合物 0.8
His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln 0.2
（実施例２）
───────────────────────────────

表３に示す組成で各成分を混合し、本発明の１型糖尿病疾患予防作用を持つペプチドを配合した動物飼育用飼料を製造した。

[表３]
───────────────────────────────
大豆粕 12.0 (重量％)
脱脂粉乳 14.9
大豆油 4.0
コーン油 2.0
パーム油 28.0
とうもろこし澱粉 15.0
小麦粉 8.0
ふすま 2.0
ビタミン混合物 9.0
ミネラル混合物 2.0
セルロース 3.0
His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln 0.1
（実施例２）
───────────────────────────────

実施例１で得られたペプチドを含む水溶性ペプチド画分（αs1-カゼインの4−13残基（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln）を100 μM 濃度で含む）20重量％、乳糖（DMV社）46重量％、結晶セルロース（和光純薬工業社）31重量％、水３重量部を十分混合した後、打錠機（冨士薬品機械社）により打錠し、本発明の１型糖尿病疾患予防剤を製造した。

実施例２で調製したペプチドを配合したタブレットを製造した。すなわち、炭酸カルシウム25％、実施例２で得られたペプチド５％、マルトース40％、エリスリトール16％、ソルビトール２％、香料４％、甘味料 0.5％、賦形剤５％、滑択剤 2.5％の組成で原料を混合し、常法により打錠し、１型糖尿病疾患予防用タブレットを製造した。

本発明の１型糖尿病疾患予防剤は、チーズに含まれるペプチドを投与することにより１型糖尿病疾患を予防及び治療できるため、医薬品、機能性飲食品、その他飼料などに利用できる。

Claims

チーズに含まれるペプチドを有効成分とする１型糖尿病疾患予防剤。
チーズに含まれるペプチドが、αs1-カゼインの4−13残基（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln）であることを特徴とする１型糖尿病疾患予防剤。
請求項１又は２記載の１型糖尿病疾患予防剤を配合した飲食品。
請求項１又は２記載の１型糖尿病疾患予防剤を配合した飼料。