MX2013014098A

MX2013014098A - Composiciones, sistemas, metodos, microorgnismos, y plantas de transformacion de patata.

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Publication number: MX2013014098A
Application number: MX2013014098A
Authority: MX
Inventors: Ian S Curtis; Javier Gonzalez Ramos; T Erik Mirkov
Original assignee: Texas A & M Univ Sys
Priority date: 2011-06-04
Filing date: 2012-06-04
Publication date: 2014-10-14
Also published as: US20170283813A1; WO2012170355A3; WO2012170355A2; US20120311734A1; CA2836911A1

Abstract

La presente descripción se refiere, en ciertas modalidades, a composiciones, sistemas, métodos, microorganismos y plantas de transformación de patata (por ejemplo, una o más variedades para elaboración de patatas fritas). En ciertas modalidades, un método para transformar y/o transfectar una planta (por ejemplo, patata 'Atlantic') puede comprender (a) cultivar una planta de patata 'Atlantic' (por ejemplo, a partir de un tubérculo) desde aproximadamente 3 semanas hasta aproximadamente 4 semanas, (b) remover una o más secciones foliculares (por ejemplo, cada sección desde aproximadamente 0.5 cm hasta aproximadamente 1 cm en su dimensión más larga) a partir de la planta, (c) cultivar dichas una o más secciones en un medio de inducción de callo que comprende zeatina durante aproximadamente 2 días, y/o (d) poner en contacto dichas una o más secciones con Agrobacterium que comprende el ácido nucléico exógeno bajo condiciones que permiten la transferencia del ácido nucléico exógeno hacia dichas una o más secciones a fin de producir por lo menos una célula vegetal transformada y/o transfectada.

Description

COMPOSICIONES. SISTEMAS. MÉTODOS. MICROORGANISMOS. Y PLANTAS DE TRANSFORMACIÓN DE PATATA REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 61/520,116, presentada el 4 de junio del 2011, la cual está incorporada en la presente mediante referencia.] CAMPO DE LA DESCRIPCIÓN La presente descripción se refiere, en ciertas modalidades, a composiciones, sistemas, métodos, microorganismos, y plantas de transformación de patata (por ejemplo, una o más variedades para elaboración de patatas fritas).

ANTECEDENTES DE LA DESCRIPCIÓN Las patatas suman la mitad de la producción anual mundial de todos los cultivos de raíces y tubérculos y está clasificada como el cuarto cultivo alimenticio más importante. Las plagas y ¡las enfermedades son los principales factores que contribuyen! a rendimientos de cultivo reducidos. Una nueva enfermedad emergente que ocasiona pérdidas económicas importantes a la industria de elaboración de patatas fritas en América del Sur y Central y México, llamada "patata rayada" [Zebra chip (ZC, por sus siglas en inglés)], se está esparciendo con rapidez y las patatas fritas hechas a partir de tubérculos infectados exhiben tiras oscuras que se vuelven más I pronunciadas después del freído y son inaceptables para :los fabricantes. En la actualidad no hay una resistencia natural para esta enfermedad. Aunque el agente causante de ZC no es evidente, se considera que un patógeno posible, Candidatus Liberibacter (Ca. Liberibacter), es transmitido por el psílido de la patata, Bactericera cockerelli. Además, otras enfermedades tales como el tizón tardío¡ el cancro y el pie negro ocasionadas por hongos y la plaga Colorado Beetle se mantienen como los mayores problemas para la industria de la patata. Las estrategias para mejorar la resistencia de otros cultivos a las plagas y enfermedades han incluido transformar estos otros cultivos con uno o más ácidos nucléicos exógenos. Sin embargo, hasta la fecha, la mayoría de los sistemas j de transformación desarrollados para la patata se han enfocado en el uso de las variedades culinarias/de mesa en lugar de los tipos para elaboración de patatas fritas, los cuales son de mayor importancia económica en especial para las industrias de patatas y frituras.

BREVE DESCRIPCIÓN En consecuencia ha surgido la necesidad de composiciones, sistemas, métodos, microorganismos, y plantas de transformación de patata mejorados.

La presente descripción se refiere, de acuerdo a ciertas I i modalidades, a composiciones, sistemas, métodos, microorganismos, y plantas de transformación de patata. Por ejemplo, los métodos para ! transformar y/o transfectar una planta (por ejemplo la pat'ata í i "Atlantic") con un ácido nucléico exógeno. En ciertas modalidades, un método para transformar y/o transfectar una planta (por ejemplo, una patata 'Atlantic') puede comprender (a) cultivar una planta j de patata 'Atlantic' (por ejemplo, a partir de un brote) desde 3 semanas hasta aproximadamente 4 semanas, (b) remover una o más secciones de hoja (por ejemplo, cada sección desde aproximadamente 0.5 jcm hasta aproximadamente 1 cm en su dimensión más grande) de¡ la planta., (c) cultivar dichas una o más secciones en un medio j de inducción de callo (por ejemplo, que comprende zeatina, NAAÍ, y ácido giberélico) durante aproximadamente 2 días, y/o (d) poner! en contacto dichas una o más secciones con Agrobacterium j]ue comprende los ácidos nucléicos bajo condiciones que permiten! la transferencia del ácido nucléico exógeno hacia dichas una o rnás i secciones a fin de producir por lo menos una célula vegetal i transformada y/o transfectada. De acuerdo con ciertas modalidades, j un método puede comprender, el cultivo (por ejemplo, cultivar de manera subsecuente) una o más secciones en un medio de selección y/o un medio de inducción de raíz. Un método puede comprender la regeneración de una planta de patata a partir de una célula i transformada y/o transfectada en ciertas modalidades. La presente descripción se refiere también, de acuerdo con ciertas modalidades, i i I a plantas (y la progenie de plantas) así creadas. Un ácido nucléico exógeno puede comprender (por ejemplo, en una dirección 5' a |3') i por lo menos una secuencia de control de expresión, por lo merjios J una secuencia de codificación, y por lo menos una secuencia ¡de terminación en ciertas modalidades. Una secuencia de codificación Í I puede codificar, de acuerdo con ciertas modalidades, por lo menos i un producto de gen con actividad antimicrobial (por ejemplo, SoD2, SoD7), actividad antiviral, y/o actividad insecticida (por ejemplo, I gna). i En ciertas modalidades, la presente descripción se refiere a métodos para expresar (por ejemplo, expresar de manera j constitutiva) un ácido nucléico exógeno en una planta (por ejemplo, patata Atlantic). Por ejemplo, un método puede comprender j(a) cultivar una sección de una planta en un medio de inducción de callo que comprende una citoquinina (por ejemplo, zeatina) durante unas í cuantas horas hasta unos cuantos días (por ejemplo, aproximadamente 2 días) y/o (b) poner en contacto un casetej de i expresión o vector de expresión con el citosol de una célula vegetal i comprendido en la sección cultivada de la planta, en donde el cásete i de expresión o vector de expresión comprende (i) el ácido nucléjco exógeno , (ii) una secuencia de control de expresión operable en la i planta para impulsar la expresión constitutiva del ácido nucléico exógeno, y (iii) se expresa una secuencia de terminación! 3' operablemente enlazada al ácido nucléico exógeno y al ácido i nucléico exógeno. En ciertas modalidades, el contacto puede ! ! comprender bombardeo biolístico de una célula con una partícula que comprende el cásete de expresión o vector de expresión y/o co-cultivar una célula vegetal con una célula Agrobacterium que comprende el cásete de expresión o vector de expresión. Úna sección de planta para expresar (por ejemplo, expresar de manera constitutiva) un ácido nucleico exógeno puede ser tomada, de acuerdo con ciertas modalidades, a partir de una planta que tiene una edad desde aproximadamente 3 semanas hasta aproximadamente 4 semanas. Un ácido nucléico exógeno (o una porción del mismo) puede codificar, en ciertas modalidades, por lo menos un producto i de gen con actividad antimicrobial (por ejemplo, SoD2, SoD7), actividad antiviral, y/o actividad insecticida (por ejemplo, gna). En ciertas modalidades, el contacto de un cásete de expresión o vector de expresión con una planta puede comprender el contacto dej un callo embrionico de la planta con el cásete de expresión o vector de expresión. Una planta transgénica puede ser regenerada a partir de la célula vegetal, en ciertas modalidades. Por ejemplo, un método puede comprender el cultivo de la sección de la planta en un medio de selección y/o un medio de enraizamiento. La presente descripción se refiere también, de acuerdo con ciertas modalidades, a plantas (y progenie de plantas) así creadas. j La presente descripción se refiere a productos y/o composiciones alimenticias de patata 'Atlantic', en ciertas modalidades. Por ejemplo, un producto y/o composición aliment¡icia i puede comprender y/o puede ser preparada a partir de una patata "Atlantic' que comprende por lo menos un ácido nucléico exógeno.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS 1 La presentación de esta patente contiene por lo menos un dibujo realizado a color. Las copias de esta patente con dibujo(s) a color serán proporcionadas por la Oficina de Patentes y Marcas mediante el pedido y pago de los derechos necesarios. Ciertas modalidades de la descripción se pueden comprender mediante referencia, en parte, a la presente descripción y los dibujos que la acompañan, en donde: La FIGURA 1A ilustra un vector de expresión SoD2 de acuerdo con una modalidad específica de la descripción; La FIGURA 1B ilustra un vector de expresión SoD7de acuerdo con una modalidad específica de la descripción; La FIGURA 2A ilustra una región ADN-T de un plásmido Ti que transporta un gen anti-insecto (gna) de acuerdo con una modalidad específica de la descripción; La FIGURA 2B ilustra una región ADN-T de un plásmido Ti que transporta un gen antimicrobial A (SoD2) de acuerdo con una modalidad específica de la descripción; La FIGURA 2C ilustra una región ADN-T de un plásmido Ti que transporta un gen antimicrobial B (SoD7) de acuerdo con una modalidad específica de la descripción; La FIGURA 2D ilustra una región ADN-T de un plásmido Ti que transporta un gen anti-insecto (gna) de acuerdo con una modalidad específica de la descripción; La FIGURA 3 ilustra una caja GA-7 Magenta ventilada en la cual se pueden mantener las plantas de acuerdo con una modalidad específica de la descripción (por ejemplo, para evitar el desarrollo de planta vitrificada); La FIGURA 4A ilustra la tinción histoquímica GUS de hoja madura a partir de una línea transformada pBinGUS-gna de patata^ de acuerdo con una modalidad específica de la descripción; La FIGURA 4B ilustra la tinción histoquímica GUS de tallo a partir de una línea transformada pBinGUSgna de patata de acueVdo con una modalidad específica de la descripción; La FIGURA 4C ilustra la tinción histoquímica GUS de ra ík a partir de una línea transformada pBinGUSgna de patata de acuerdo con una modalidad específica de la descripción; La FIGURA 4D ilustra tinción histoquímica GUS de tubérculo a partir de una línea transformada pBinGUS-gna de patata de acuerdo con una modalidad específica de la descripción; La FIGURA 5A ilustra la transferencia Southern que muestra la integración de gen gna en el genoma de plantas transgénicas de patata de acuerdo con una modalidad específica de la descripción; La FIGURA 5B ilustra una transferencia Northern que muestra i los niveles de transcripción del gen gna en patata transgénica¡ de acuerdo con una modalidad específica de la descripción; La FIGURA 5C ilustra transferencias Western que muestran'los niveles de expresión de gen gna como se demostró en el nivel | de proteína a través de líneas individuales de patata de acuerdo con una modalidad específica de la descripción; ¡ La FIGURA 6 ilustra una prueba Northern de ARN a partir|de i líneas de patata transformadas que transportan genes i antimicrobiales A (SoD2) o B (SoD!) o un gen anti-insecto (gna)\de acuerdo con una modalidad específica de la descripción; ¡ La FIGURA 7 ilustra una detección de Lso en brotes apicajles de patata transgénica que transporta genes antimicrobiales A (SoD2) I o B (SoD!) de acuerdo con una modalidad específica de j la descripción después de intervalos fijos a partir de infestacjión utilizando PCR; j i La FIGURA 8 ilustra fenotipos de plantas de patata (WT y SoD2) infestadas con psílidos 'en frío' o 'en caliente' de acuerdo con una modalidad específica de la descripción.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIA Ciertas modalidades de la descripción se pueden comprender al hacer referencia, en parte, a la presente descripción y el listado! de secuencia acompañante, en donde: NO ID SEC: 1 ilustra una secuencia de aminoácido de un gen anti-insecto (gna) de campanilla de invierno (Galanthus nivalis)\ óe acuerdo con una modalidad específica de la descripción; j NO ID SEC: 2 ilustra una secuencia de ácido nucléico de! un i gen anti-insecto (gna) de campanilla de invierno (Galanthus nivalis) dé acuerdo con una modalidad específica de la descripción; NO ID SEC: 3 ilustra una secuencia de aminoácido de una defensina (SoD2) de espinaca (Spinacia olerácea) de acuerdo con una modalidad específica de la descripción; NO ID SEC: 4 ilustra una secuencia de ácido nucleico GenScript-optimizado para expresión de una defensina espinaca (Spinacia olerácea) en patata de acuerdo < modalidad especifica de la descripción; NO ID SEC: 5 ilustra una secuencia de aminoáci defensina (SoD7) de espinaca (Spinacia olerácea) de acuerdo con i una modalidad específica de la descripción; y i NO ID SEC: 6 ilustra una secuencia de ácido nucléico GenScript-optimizado para expresión de una defensina (SoD7) de espinaca (Spinacia olerácea) en patata de acuerdo con una modalidad específica de la descripción.

DESCRIPCIÓN DETALLADA i La patata (Solanum tuberosum L. subsp. tuberosum), esí el cultivo de raíz más ampliamente cultivado en el mundo siendo Chi;na, India, Ucrania y los Estados Unidos los mayores productores. Las i plagas y enfermedades han afectado de manera drástica la producción mundial. Se han desarrollado numerosos protocolos para generar plantas transgénicas de patata aunque éstos han sido i dirigidos en gran medida a las variedades culinarias en vez de los j tipos para elaboración de patatas fritas los cuales son de mayor importancia económica para la industria de patatas fritas. En í general, se ha observado que estos protocolos tienen poca o ninguna eficacia con las variedades para elaboración de patatas fritas. La presente descripción proporciona, por ejemplo, métodos, sistemas, composiciones, y microorganismos parta transformar la patata (por ejemplo, las variedades para elaboración de patatas fritas) así colmo las plantas de patata transformadas (por ejemplo, variedades para elaboración de patatas fritas transformadas). El desarrollo de \os sistemas de transformación para la patata (por ejemplo, patata cv. 'Atlantic') que expresan genes antimicrobiales y anti-insecto ofrece una barrera potencial de resistencia ante un amplio espectro de plagas y enfermedades. Además, el desarrollo de dicho sistema de transformación ofrece la posibilidad de mejorar la calidad nutricional y expresar objetivos industriales tales como productos de almidón específicos en este plasma germinal.

Composiciones: Péptidos Antimicrobiales y Anti-Insecto La presente descripción se refiere, de acuerdo con ciertas modalidades, a péptidos y/o proteínas que tienen actividad insecticida, actividad antimicrobial, y/o actividad antiviral, los cuales pueden incluir, sin limitación, avidina, proteínas insecticidas vegetativas (por ejemplo, Vip3A), proteínas cristalinas insecticidas a partir de Bacillus thuringiensis (por ejemplo, Cryl, CryIAb, Cr!y2, I Cry9), albúmina de chícharo (por ejemplo, PAIb), hirsutelina j A, lectinas (por ejemplo, lectina de campanilla de invierno, lectina: de ajo, lectina de cebolla), inhibidores de amilasa (por ejemplo., inhibidor de alfa amilasa), arcelinas (por ejemplo, arcelinas a partir de frijoles), inhibidores de proteinasa, lisozimas (por ejemplo, lisozima de bovino, lisozima humana, lisozima de molusco), defensina (por ejemplo, SoD2 y/o SoD7), quitinasa, ~-1 ,3-glucanasa, variantes de los mismos y combinaciones de los mismos. Un péptido antimicrobial puede comprender, por ejemplo, uno o más péptidos antimicrobiales que pertenecen a la familia de defensinas de planta. Estos polipéptidos fueron aislados originalmente a partir de hojasj de espinaca (Spinacia olerácea). En ciertas modalidades, una defensina puede ser menor (aproximadamente 5 kDa), puede ser básica y/o puede ser rica en cisteína. En ciertas modalidades, un péptido puede comprender una secuencia de amino ácido que comparte por; lo menos aproximadamente 90% de identidad, por lo menos aproximadamente 91% de identidad, por lo menos aproximadamente 92% de identidad, por lo menos aproximadamente 93% de identidad, por lo menos aproximadamente 94% de identidad, por lo menos aproximadamente 95% de identidad, por lo menos aproximadamente 96% de identidad, por lo menos aproximadamente 97% de identidad, por lo menos aproximadamente 98% de identidad, por lo menos aproximadamente 99% de identidad, y/o aproximadamente 100% de identidad con NO ID SEC: 1, NO ID SEC: 3 y/o NO ID SEC: 5. En ciertas modalidades, un péptido antimicrobial puede comprender además uno o más aminoácidos que son independiente y/o colectivamente ya sea neutros (por ejemplo, no impacta de manera adversa la funcionalidad antibacterial) y/o aumenta la funcionalidad antibacterial (por ejemplo, al dirigir el péptido hacia una ubicación deseada (por ejemplo, celular y/o extracelular). Por ejemplo; un i péptido puede comprender un péptido de señal derivado a partir de proteína (PR)-lb relacionada con patogénesis de tabaco que permite el transporte de los péptidos dentro del apoplasto de células vegetales (por ejemplo, a través de la vía de secreción) ;y/o acumulación en los espacios intercelulares de hojas, tallos, flores, frutas, semillas, y/o raíces. ; En ciertas modalidades, un péptido puede comprender üna secuencia de amino ácido que tiene una identidad de secuencia deseada y/o requerida para NO ID SEC: 1 y/o una o más propiedades. Por ejemplo, un péptido puede ser un péptido a'nti-insecto gna. Un péptido puede tener, de acuerdo con ciertas modalidades, actividad anti-insecto. En ciertas modalidades, la actividad anti-insecto se puede demostrar cuando las plantas comprenden un péptido anti-insecto que exhibe rendimiento mejorado (por ejemplo, formación mejorada, tamaño, numeralidad, calidad, y/o combinaciones de los mismos de tubérculos, fruto, hojas jy/o i combinaciones de los mismos), crecimiento mejorado, floración mejorada (por ejemplo, mejorada en ritmo, fertilidad, y/o número), y/o formación de lesión reducida en presencia de uno o más insectos, con relación a plantas similares que carecen de el péptido expuesto bajo condiciones similares. De acuerdo con ciertas modalidades, la actividad anti-insecto se puede demostrar cuando los insectos que hacen contacto con las plantas que comprenden un péptido anti-insecto que exhibe menor herbivoría, mortalidad incrementada, tiempo extendido para reproducción, y/o susceptibilidad incrementada a la depredación, con relación a insectos que hacen contacto con plantas similares que carecen |del péptido expuesto bajo condiciones similares. Un péptido anti-insecto, i en ciertas modalidades, puede tener actividad anti-insecto simila!r a gna aislado a partir de Galanthus nivalis.

Un péptido puede comprender una secuencia de amino ácido que tiene una identidad de secuencia deseada y/o requerida para NO ID SEC: 3 y/o NO ID SEC: 5 y/o una o más de otras propiedades. Por ejemplo, un péptido puede ser un péptido SoD2 y/o SoD7. Un péptido puede tener, de acuerdo con ciertas modalidades, actividad antimicrobial. En ciertas modalidades, la actividad antimicrobial puede ser demostrado cuando las plantas que comprenden ' un péptido antimicrobial exhibe rendimiento mejorado (por ejemplo, formación mejorada, tamaño, numeralidad, calidad, :y/o combinaciones de los mismos de tubérculos, fruto, hojas :y/o combinaciones de los mismos), crecimiento mejorado, floración mejorada (por ejemplo, mejoramiento en sincronización, fertilidad, y/o número), y/o formación de lesión reducida en presencia de uno o más microbios, con relación a plantas similares que carecen del péptido expuesto bajo condiciones similares. De acuerdo con ciertas modalidades, la actividad antimicrobial se puede demostrar cuando I los microbios hacen contacto con las plantas que comprenden i un péptido antimicrobial exhiben crecimiento reducido y/o más lento, mortalidad incrementada, formación de toxina reducida, y/o susceptibilidad incrementada a la depredación, con relación! a microbios que hacen contacto con plantas similares que carecen ¡del péptido expuesto bajo condiciones similares. Un péptjido I antimicrobial, en ciertas modalidades, puede tener actividad i antimicrobial similar a SoD2 y/o SoD7 aislados a partir de espinaca.

Composiciones: Ácidos Nucléicos Antimicrobiales v Anti-lnsecto j i i La presente descripción se refiere, en ciertas modalidades, a ácidos nucléicos (por ejemplo, casetes, vectores) que comprenden una o más secuencias que codifican uno o más péptidos antimicrobiales. Por ejemplo, un ácido nucléico puede comprender! un cásete que comprende una secuencia sintética de ácido nucléicoj de genes gna, SoD2 y/o SoD7. Los codones sintéticos SoD2 y/o SoD7 pueden especificar las mismas secuencias de aminoácido que1 la : i espinaca nativa, que tiene sus codones optimizados para uso! de codón de dicotiledónea (por ejemplo, patata). Un ácido nucléico ¾ue comprende una secuencia de codificación gna, SoD2 y/o SoD7 puede i comprender una secuencia que codifica un péptido de señal (¡por ejemplo, PR-lb). En ciertas modalidades, la expresión de un ácido nucléico que comprende una secuencia que codifica un péptido antimicrobial se puede optimizar al colocar un codón de iniciación! en i un contexto favorable (por ejemplo, óptimo). De acuerdo con ciertas modalidades, un ácido nucléico puede comprender una secuencia de control de expresión (por ejemplo, operablemente enlazada a una secuencia de codificación). Por ejemplo, un ácido nucléico puede comprender una secuencia de gen de codificación bajo el control de un promotor CaMV 35S mejorado dual con un 5' UTR a partir ¡del potyvirus vegetal TEV (por ejemplo, a fin de proporcionar una actividad de mejoramiento de traducción para los genes ; de defensina).

De acuerdo con ciertas modalidades, un ácido nucléico puede comprender una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos aproximadamente 75% de identidad para NOS ID SEC: 2, 4, y/ó 6, por lo menos aproximadamente 80% de identidad para NOS ID SEC: 2,4, y/o 6, por lo menos aproximadamente 85% de identidad pjara NOS ID SEC: 3,4, y/o 6, por lo menos aproximadamente 90% de identidad para NOS ID SEC: 2,4, y/o 6, por lo menos i aproximadamente 95% de identidad para NOS ID SEC: 2, 4, y/ó 6, por lo menos aproximadamente 97% de identidad para NOS ID SEC: 2, 4, y/o 6, por lo menos aproximadamente 98% de identidad para NOS ID SEC: 2, 4, y/o 6, por lo menos aproximadamente 99% de identidad para NOS ID SEC: 2,4, y/o 6, y/o aproximadamente 100% de identidad para NOS ID SEC: 2,4, y/o 6. Una secuencia ! de nucleótido puede codificar, en ciertas modalidades, una secuencia de i armiño ácido que tiene por lo menos aproximadamente 98% jde identidad para NOS ID SEC: 1,3, y/o 5, por lo menos aproximadamente 99% de identidad para NOS ID SEC: 1,3, y/o 5, ¡y/o aproximadamente 100% de identidad para NOS ID SEC: 1, 3, y/o 5;. j De acuerdo con ciertas modalidades, un ácido nucléico puede tener una primera medición de identidad de secuencia para una i secuencia de ácido nucléico de referencia y puede codificar una secuencia de amino ácido que tiene una segunda medición j de i identidad de secuencia para una secuencia de aminoácido ¡ de i referencia. Por ejemplo, un ácido nucléico puede te¡ner aproximadamente 85% de identidad para NOS ID SEC: 2,4, y/o 6 y i codificar una secuencia de amino ácido que tiene aproximadame!nte ; i 100% de identidad con los NOS ID SEC: 1,3, y/o 5, de acuerdo con i ciertas modalidades. j i Una secuencia de ácido nucléico, de acuerdo con ciertas i modalidades, puede hibridizar para un ácido nucléico que tiene la secuencia de nucleótido de NOS ID SEC: 2, 4, y/o 6 bajo condiciones severas. Las condiciones severas pueden incluir, por ejemplo, (a)| 4X S'SC a 65°C seguida por 0.I X SSC a 65°C durante 60 minutos y/o¡(b) i 5|0% formamida, 4X SSC a 65°C. Un ácido nucléico puede comprender un fragmento de eliminación (por ejemplo, una I eliminación desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente j 12 bases) de un ácido nucléico que tiene una secuencia de NOS¡ ID j SEC: 2, 4, y/o 6 que retiene la actividad antimicrobial co°ntra por lo menos un microorganismo capaz de infectar una planta de patata. j j Alguien con experiencia ordinaria en la técnica que tiene el benef ¡icio de la presente descripción puede preparar uno o más fragmentosj de i eliminación de un ácido nucléico que tiene una secuencia de NOS¡ ID SEC: 2,4, y/o 6 y tamizar los fragmentos resultantes para actividad antimicrobial contra por lo menos un microorganismo capaz ¡ de infectar una planta de patata. ! I Una secuencia de ácido nucléico que tiene una secuencia i similar a NOS ID SEC: 2,4, y/o 6 puede ser identificada por medioj de i búsquedas de base de datos empleando la secuencia o elementos! de 1 ¡ la misma como la secuencia de consulta utilizando el algoritmo i Gapped BLAST (Altschul et al., 1997 Nucí. Acids Res. 25:3389-3402) I con la Matriz BLOSUM62, un valor de hueco de 11 y valor J de persistencia de 1 por residuo y un valor E de 10. La identidad | de i secuencia se puede determinar a través de cualquier método disponible de acuerdo con ciertas modalidades. Por ejemplo, j se puede comparar dos secuencias con cualquiera de ALIGN (alineación i Global) o LALIGN (alineación de homología Local) en el paquetej de aplicaciones FASTA (Pearson and Lipman, 1988 Proc. Nat. Acad. Sci. 8!5:2444-2448; Pearson, 1990 Methods in EnZYIHOIogy 183:63-|98) con la matriz BLOSUM50 y penalidades de hueco de -16, -4.! La similitud de secuencia se puede determinar de acuerdo con ClustalW (Larkin et al., 2007, Bioinfonnatics 23(21 J .2947-2948), BLA|ST, PASTA o algoritmo similar. ¡ i En ciertas modalidades, un ácido nucléico puede comprender | una secuencia de ácido nucléico que tiene una identidad | de i i secuencia deseada y/o requerida para NO ID SEC: 2 y/o una o más de otras propiedades. Por ejemplo, un ácido nucléico puede codificar un péptido anti-insecto gna. Un ácido nucléico puede codificar, ¡ de acuerdo con ciertas modalidades, un péptido que tiene actividad a'nti-insecto. En ciertas modalidades, la actividad anti-insecto se puede demostrar cuando las plantas que comprenden un ácido nucléico anti-insecto exhiben rendimiento mejorado (por ejemplo, formación, tamaño, numeralidad, calidad mejoradas, y/o combinaciones de los mismos de tubérculos, fruto, hojas y/o combinaciones de los mismos), crecimiento mejorado, floración mejorada (por ejemplo, mejora en sincronización, fertilidad, y/o número), y/o formación; de lesión reducida en presencia de uno o más insectos, con relación a plantas similares que carecen del ácido nucléico expuesto bajo condiciones similares. De acuerdo con ciertas modalidades, la actividad anti-insecto se puede demostrar cuando los insectos hacen contacto con las plantas que comprenden un ácido nucléico anti- i insecto exhiben menor herbivoría, mortalidad incrementada, tiempo extendido para reproducción, y/o susceptibilidad incrementada a depredación, con relación a insectos que hacen contacto con plantas similares que carecen del ácido nucléico expuesto bajo condiciones similares. Un péptido anti-insecto, en ciertas modalidades, puede tener actividad anti-insecto similar a gna aislado a partir | de Galanthus nivalis. \ Un ácido nucléico puede comprender una secuencia de ácido nucléico que tiene una identidad de secuencia deseada y/o requerida i para NO ID SEC: 4 y/o SEQ ID NO: 6 y/o una o más de otras propiedades. Por ejemplo, un ácido nucléico puede codificar un péptido SoD2 y/o un péptido SoD7. Un ácido nucléico puede codificar, de acuerdo con ciertas modalidades, un péptido que tiene actividad antimicrobial. En ciertas modalidades, la actividad antimicrobial se puede demostrar cuando las plantas que comprenden un ácido nucléico anti-microbial exhiben rendimiento mejorado formación, tamaño, numeralidad, calidad mejoradas, ly/o I combinaciones de las mismas de los tubérculos, frutos, hojas ¡y/o I combinaciones de los mismos), crecimiento mejorado, floración mejorada (por ejemplo, mejorada en sincronización, fertilidad, y/o número), y/o formación de lesión reducida en presencia de uno o más microbios, con relación a plantas similares que carecen del ácido nucléico expuesto bajo condiciones similares. De acuerdo con ciertas modalidades, la actividad antimicrobial se puede demostrar cuando los microbios que hacen contacto con plantas que comprenden ; un ácido nucléico anti-microbial exhiben crecimiento reducido y/o más lento, mortalidad incrementada, formación de toxina reducida, y/o susceptibilidad incrementada a depredación, con relación a microbios que hacen contacto con plantas similares que carecen del ácido nucléico expuesto bajo condiciones similares. Un ácido nucléico a'nti-microbial, en ciertas modalidades, puede codificar un péptido c)ue tiene actividad antimicrobial similar a SoD2 y/o SoD7 aislado a partir de espinaca.

Casetes y Vectores de Expresión ! I De acuerdo con ciertas modalidades, la patata (por ejemplo, variedades para elaboración de patatas fritas) puede !ser transformada con uno o más ácidos nucléicos. Un ácido nucleico puede comprender una o más secuencias de control de expresión, una o más secuencias de codificación, una o más secuencias ; de terminación, y/o combinaciones de las mismas en ciertas modalidades.

La descripción se refiere, en ciertas modalidades, a vectores de expresión y/o casetes de expresión para expresar una secuencia de ácido nucléico (por ejemplo, una secuencia de codificación) ' en una célula y que comprende una secuencia de control de expresión y la secuencia de ácido nucléico operablemente enlazada a la secuencia de control de expresión. Un cásete, en ciertas modalidades, puede incluir una secuencia de nucleótido capaz de expresar una secuencia de codificación particular insertada para estar operablemente enlazada a una o más secuencias de control de expresión presentes en la secuencia de nucleótido. Por tanto, como ejemplo, un cásete de expresión puede incluir una secuencia de codificación heteróloga que se desea expresar en una semilla vegetal de acuerdo con ciertas modalidades.

La descripción se refiere, en ciertas modalidades, a un vector de expresión que puede comprender, por ejemplo, un ácido nucléico que tiene una secuencia de control de expresión y una secuencia de codificación operablemente enlazada a la secuencia de control de expresión. Un vector de expresión puede ser puesto en contacto con I una célula (por ejemplo, una célula vegetal) bajo condiciones que permiten la expresión (por ejemplo, transcripción) de la secuencia¡de codificación. Una secuencia de control de expresión puede ser puesta en contacto con una célula vegetal (por ejemplo, una célula embriónica, una célula madre, una célula callosa) bajo condicrohes que permiten la expresión de la secuencia de codificación en la célula y/o células derivadas a partir de la célula vegetal de acuerdo j con ciertas modalidades. Un vector de expresión puede ser puesto! en contacto con una célula (por ejemplo, una célula vegetal), en ciertas modalidades, bajo condiciones que permiten la herencia de por lo menos una porción del vector de expresión en la progenie de la célula. Los ejemplos de vectores de expresión pueden incluir, sin limitación los vectores mostrados en la FIGURA IA y en la FIGURA IB y/o los vectores que comprenden las construcciones de ácido i nucléico mostradas en la FIGURA 2. De acuerdo con ciertas modalidades, un vector de expresión puede incluir uno o más marcadores seleccionables. Por ejemplo, un vector de expresión puede incluir un marcador para selección cuando el vector está en un huésped bacterial, un huésped de levadura, y/o un huésped vegetal.

Una secuencia de control de expresión puede comprender,' de acuerdo con ciertas modalidades, uno o más promotores, uno o más ? operadores, uno o más mejoradores, uno no más sitios de enlace de ribosoma, y/o combinaciones de los mismos. En ciertas modalidades, una secuencia de control de expresión puede comprender una secuencia de un ácido nucléico encontrado en virus (por ejemplo, I un virus vegetal). Por ejemplo, una secuencia de control de expresión puede comprender, de acuerdo con ciertas modalidades, un promotor de virus baciliforme de caña de azúcar, un promotor de virus Rice tungro bacilliform , un promotor de virus Commellna yellow mosaic, un promotor de virus Banana streak, un promotor de virus 7~aro bacilliform , un promotor de virus del mosaico de la coliflor (por ejemplo, CaMV35S), un virus del mosaico de la escrofularia (por ejemplo, FMV34S), variantes de los mismos, y/o combinaciones i de los mismos. Una secuencia de control de expresión puede ser seleccionada a partir de un promotor rico en prolina (por ejemplo un PRP de caña de azúcar), un promotor del factor de alargamiento (por ejemplo, SEFal de caña de azúcar), un promotor de 0-metiltransferasa (por ejemplo, un promotor OMT de caña de azúcar), promotor de jasmonato (por ejemplo, un promotor JAS de caña de azúcar), variantes de los mismos operables en patata, y/o combinaciones de los mismos.

Una secuencia de codificación, en ciertas modalidades, puede comprender cualquier secuencia de codificación expresable en por lo menos una célula vegetal. Por ejemplo, una secuencia | de codificación puede comprender una secuencia humana (por ejemplo, una secuencia de anticuerpo), una secuencia animal no-humana, una secuencia vegetal, una secuencia de levadura, una secuencia bacterial, una secuencia viral (por ejemplo, virus vegetal, virus animal, y/o secuencia de vacuna), una secuencia artificial, una secuencia antisentido de la misma, un fragmento de la misma, una i variante de la misma, y/o combinaciones de las mismas. De acuerdo con ciertas modalidades, una secuencia de codificación puede comprender, un gen de transporte de azúcar y/o un gen ; de acumulación de azúcar. Ejemplos de genes de transporte de azúcar pueden incluir, sin limitación, un transportador de disacárido (por I ejemplo, un transportador de sacarosa y/o un transportador | de monosacárido. Una secuencia de codificación puede comprender, en ciertas modalidades, una secuencia que codifica uno o más productos de gen con actividad insecticida, antimicrobial, y/o antiviral. Ejemplos de productos de gen que pueden tener actividad insecticida, actividad antimicrobial, y/o actividad antiviral pueden incluir, sin limitación, superóxido dismutasas antimicrobiales, defensinas de espinaca (por ejemplo, SoD2, SoD7), avid na, proteínas insecticidas vegetativas (por ejemplo, Vip3A), proteínas cristalinas insecticidas a partir de Bacillus thuringiensis (por ejemplo, Cryl, CryIAb, Cry2, Cry9), albúmina de chícharo (por ejemplo, PAIb), hirsutelina A, lectinas (por ejemplo, lectina de campanilla de invierno (Galanthus nivalis aglutinina, GNA), lectina de ajo, lectina de cebolla), inhibidores de amilasa (por ejemplo, inhibidor de alfa amilasa), arcelinas (por ejemplo, arcelinas a partir de frijoles), inhibidores de proteinasa, lisozimas (por ejemplo, lisozima de bovino, lisozima humana, lisozima de molusco), defensina, quitinasa, ~-1 ,3-glucanasa, variantes de los mismos, y/o combinaciones de los mismos. A secuencia de codificación puede comprender una enzima para formar y/o modificar un polímero de acuerdo con ciertas modalidades. Los ejemplos de enzimas p¡ara formar y/o modificar un polímero pueden incluir, sin limitación, polihidroxialcanoato sintasas, 4-hidroxibutiryl-CoA transferasas, variantes de las mismas, y/o combinaciones de las mismas. ; En ciertas modalidades, una secuencia de codificación puede comprender una secuencia que codifica una o más enzimas que hiidroliza celulosa. Los ejemplos de enzimas que hidrolizan celulosa incluyen, sin limitación, celulasa, endoglucanasas (por ejemplo, endo I ~-1,4 glucanasas), glucosidasas (por ejemplo, ~glucosidasa), hidrolasas (por ejemplo, ~-l ,4-glucan celobiohidrolasa), exocelulasas), variantes de los mismos, y/o combinaciones de los mismos. En ciertas modalidades, una secuencia de codificación puede comprender una secuencia que codifica una o más enzimas que forman y/o modifican un azúcar (por ejemplo, sacarosa, trehalosa, sorbitol, fructano, poli-fructanos, fructosa, tagatpsa, sucralosa). Los ejemplos de enzimas que forman y/o modifican un azúcar pueden incluir, sin limitación, trehalosa-6-fosfato sintasa (TPS) y trehalosa-6-fosfato fosfatasa (TPP). De acuerdo con ciertas modalidades, una secuencia de codificación puede comprender iuna secuencia que codifica una enzima para formar o modificar glicina I betaina, una poliamina, prolina, trehalosa, una variante de las mismas, y/o combinaciones de las mismas. Una secuencia; de codificación puede comprender, en ciertas modalidades, un codóh de inicio, un intrón, y/o una secuencia de terminación de traducción. ¡De acuerdo con ciertas modalidades, una secuencia de codificacjión i puede comprender una o más secuencias de codificación naturales o artificiales (por ejemplo, que codifica una proteína individual o una quimera). De acuerdo con ciertas modalidades, un cásete ; de expresión puede comprender de manera opcional una secuencia; de terminación.

Se puede utilizar una secuencia de control de expresión, ' en ciertas modalidades, para construir un cásete de expresión que comprende, en la dirección 5' a 3', (a) la secuencia de control de expresión (por ejemplo, un promotor SCBV), (b) un gen heterólogd o una secuencia de codificación, o secuencia complementaria para: un gen vegetal nativo bajo control de la secuencia de control ' de expresión, y/o (c) una secuencia de terminación 3' (por ejemplo, una secuencia de terminación que comprende un sitio de poliadenilación). Los ejemplos de ácidos nucléicos exógenos pueden incluir, en ciertas modalidades, las secuencias mostradas en NO ID SEC: 1 (LECGNA2), NO ID SEC: 3 (SoD2), NO ID SEC: 5 (SoD7), y/o secuencias que tienen por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 91 %, por lo menos aproximadamente 92%, por lo menos aproximadamente 93%, por lo menos aproximadamente 94%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 96%, por lo menos aproximadamente 97%, por lo menos aproximadamente 98%, y/o por lo menos aproximadamente 99% de identidad para las mismas. Se puede incorporar un cásete de expresión dentro de Una variedad de vectores de replicación autónoma a fin de construid un vector de expresión. Se puede construir un cásete de expresión, por ejemplo, al ligar una secuencia de control de expresión a üna secuencia que se va a expresar (por ejemplo, una secuencia de codificación).

Algunas técnicas para construcción de cásete de expresión son bien conocidas por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, está disponible una variedad de estrategias para fragmentos de ADN, la opción de las cuales depende de la naturaleza de los términos de los fragmentos de ADN. Los fragmentos : de restricción y/o eliminación que contienen una caja TATA de sujeto promotor pueden ser ligados en una orientación hacia adelante a un gen heterólogo o secuencia de codificación sin promotor tal como la secuencia de codificación de GUS. Se puede proporcionar Una secuencia de control de expresión y/o porciones de la misma a través de otros medios, por ejemplo síntesis química o enzimática como lo puede apreciar un técnico con experiencia ordinaria que tiene el beneficio de la presente descripción.

En ciertas modalidades, el extremo 3' de una secuencia de codificación heteróloga puede ser operablemente enlazada a una secuencia de terminación que incluye, por ejemplo, un sitio! de poliadenilación, ejemplificado por, aunque no limitado a, un sitio! de poliadenilación de nopalina sintasa y/o un sitio de poliadelinación de gen 7 de octopina ADN-T. Se puede proporcionar un sitio j de i poliadenilación por medio del gen heterólogo o secuencia ¡ de codificación de acuerdo con ciertas modalidades. Un ácido nucléiico, de acuerdo con ciertas modalidades, puede comprender una región 5' no traducida (5' UTR), una región 3' no traducida (3' UTR), y/o combinaciones de las mismas. Por ejemplo, un ácido nucléico puede comprender (por ejemplo, en una dirección 5' a 3') una secuenciaj de control de expresión, una 5' UTR, a secuencia de codificación (por ; í ejemplo, un transgen), una 3' UTR, y/o una secuencia i de i terminación. I Microorganismos j i La presente descripción se refiere, en ciertas modalidades, a un microorganismo capaz de mantener un ácido nucléico, replicar' un ácido nucléico, y/o transferir un ácido nucléico a una célula vegejtal. Por ejemplo, un microorganismo puede comprender una bacteria, una levadura, y/o un virus. Un microorganismo puede comprender ! un cásete de expresión, un vector, y/o combinaciones de los mismos) en ciiertas modalidades. Por ejemplo, un microorganismo puede comprender una secuencia de control de expresión y una secuencia dje codificación operablemente enlazada a la secuencia de control de expresión. Los ejemplos de microorganismos pueden incluir, sin a limitación, Agrobacterium tumefaciens, Escherichia coli, una línea celular de lepidóptero, un virus Rice tungro bacilliform, un virus! de mosaico Commelina yellow, un virus Banana streak, un virus Taro bacilUform, y/o baculovirus. Un cásete de expresión, si está presente, puede estar ubicado en un ácido nucléico genómico y/o¡ un ácido nucléico extra-genómico.

Plantas La presente descripción se refiere, en ciertas modalidades, a variedades para elaboración de patatas fritas de patata que incluyen una célula (por ejemplo, una célula embriónica, una célula madre, una célula callosa), un tejido, un órgano, y/o una planta completa que comprende un ácido nucléico exógeno (por ejemplo, un transgen). Los ejemplos de planta de patata que comprenden un ácido nucléico exógeno pueden incluir, sin limitación, una o más variedades para elaboración de patatas fritas de la patata (por ejemplo, Alturas, Andover, Atlantic, Chipeta, Dakota Pearl, Ivory Crisp, Kennebec, LaChipper, Marcy, Megachip, NorValley, Nor is, Pike, Reba y Snowden). En ciertas modalidades, las plantas adecuadas para transformación y/o transfeccion puede incluir patata Atlantic. Por ejemplo, la patata Atlantic puede exhibir mayor eficiencia de transformación y/o transfeccion cuando se compara con transformación y/o transfeccion de patata Atlantic por medio! de protocolo pre-existente y/o cuando se compara con una o más variedades transformadas y/o transfectadas de acuerdo con ¡una modalidad de la presente descripción.

Una célula vegetal puede ser incluida en un tejido vegetal, un órgano vegetal, y/o una planta completa en ciertas modalidades. Una célula vegetal en un tejido, órgano y/o planta completa puede estar adyacente, de acuerdo con ciertas modalidades, a una o más células isogénicas y/o una o más células heterogénicas. En ciertas modalidades, una planta puede incluir transformantes primarios y/o progenie de los mismos. Una planta que comprende un ácido nucléico exógeno (por ejemplo, un transgen) puede comprender además una secuencia de control de expresión operablemente enlazada al ácido nucléico exógeno (por ejemplo, un transgen), ¡ en ciertas modalidades. Un transgen puede ser expresado, de acuerdo con ciertas modalidades, en una planta que comprende una secuencia de control de expresión en todos (por ejemplo, sustancialmente todos) los órganos, tejidos, y/o tipos de célula que incluyen, sin limitación, tallos, hojas, raíces, semillas, flores, frutos, meristemo, parénquima, parénquima de almacenamiento, colénquima, esclerénquima, epidermis, mesófilo, cubierta perivascular, células de guarda, protoxilema, metaxilema, floema, compañía de floema, y/o combinaciones de los mismos. En ciertas modalidades, un transgen y/o su producto de gen puede estar ubicado en y/o translocado hacia uno o más organelos (por ejemplo, vacuolas, cloroplastos, mitocondria, plástidos).

Sistema de Expresión La presente descripción se refiere, de acuerdo con ciertas modalidades, a un sistema para expresión de (por ejemplo, a niveles elevados) de una secuencia de ácido nucléico (por ejemplo, que comprende una o más secuencias de codificación). Por ejemplo, un sistema de expresión puede estar comprendido en plantas para mejorar la resistencia a la enfermedad, alterar el metabolismo ¡ de I azúcar, y/o ser usado como a biofábrica para proteínas de alto valor.

I Sin estar limitado a ningún mecanismo de acción particular, | un sistema de expresión puede beneficiarse a partir de actividades aditivas y/o sinergísticas de una secuencia de control de expresión, sinergismo transcripcional, y/o silenciamiento reducido de una secuencia de codificación introducida (por ejemplo, transgen), un fenómeno observado de manera frecuente en plantas cuando se usan los mismos promotores para expresar el mismo o diferentes transgenes, y que constituye un riesgo importante para la explotación económica de las plantas como biofábricas. Las plantas que comprenden un sistema de expresión pueden retener niveles de expresión deseables (por ejemplo, elevados) a través de una o más generaciones consecutivas de plantas transgénicas. En ciertas j modalidades, un sistema de expresión puede comprender uno o más i casetes de expresión, uno o más vectores, uno o más i microorganismos, una o más plantas isogénicas, uno o más reactivos de transformación, y/o uno o más medios de regeneración. j Métodos De acuerdo con ciertas modalidades, la presente descripción se refiere a métodos para transformar y/o transfectar una planta con un ácido nucléico exógeno. Por ejemplo, un método puede comprender poner en contacto una célula (por ejemplo, una célula de levadura y/o célula vegetal) con un ácido nucléico exógeno. El poner en contacto un ácido nucléico con una célula puede comprender, i en i ciertas modalidades, co-cultivar la célula de objetivo con una bacteria (por ejemplo, Agrobacterium) que comprende el ácido nucléico (por ejemplo, en un vector binario), electroporar la c é I u I a en presencia del ácido nucléico, infectar la célula con un virus (baculovirus) que comprende el ácido nucléico, bombardear la célula (por ejemplo, una célula en una hoja, un tallo, y/o callo) con partículas que comprenden el ácido nucléico, agitar la célula en una solución que comprende el ácido nucléico y uno o más filamentos (por ejemplo, filamentos de carburo de silicio), y/o inducir químicamente la célula para captación de ADN extracelular. En ciertas modalidades, poner en contacto un ácido nucléico con una célula puede comprender el contacto del ácido nucléico con un foliar vegetal y/o un protoplasto vegetal. ¡ Un método para transformar y/o transfectar una planta con¡ un i ácido nucléico exógeno puede comprender, en ciertas modalidades, i cultivar una planta de patata (por ejemplo, una variedad elaboración de patatas fritas) durante 3-4 semanas, remover una o r ás i secciones (por ejemplo, 0.5 - 1 cm en su dimensión más larga) a i partir de la planta, cultivar una o más secciones (por ejemplo, secciones de hoja) en un medio de inducción calloso, y/o poner: en contacto los segmentos con Agrobacterium a fin de producir por lo menos una célula vegetal transformada y/o transfectada. En ciertas modalidades, un método puede comprender además cultivar una i sección de planta de patata que comprende dicha por lo menos una célula transformada y/o transfectada en un medio de selección y/o un medio de inducción de raíz. En ciertas modalidades, el cultivo en] un medio de inducción calloso se puede realizar durante menos de aproximadamente 1 día, durante aproximadamente 1 día, durante aproximadamente 2 días, durante aproximadamente 3 días, y/o durante aproximadamente 4 días. El cultivo de una o más secciones (por ejemplo, secciones de hoja) puede comprender, de acuerdo con ciertas modalidades, cultivar secciones bajo condiciones (por ejemplo, tiempo, temperatura, iluminación, composición de medio) que permiten, estimular, optimizar y/o aumentar al máximo la división de la célula (por ejemplo, en o cerca de las regiones dañadas). En ciertas modalidades, un medio de inducción calloso puede comprender una o más sales, una o más vitaminas, uno o más micronutrientes, y/o una o más fitohormonas (por ejemplo, naturales o sintéticas). Un medio de inducción calloso puede comprender, de acuerdo con ciertas modalidades, una citoquinina (por ejemplo, zeatina, 6-bencilaminopurina) a una concentración, por ejemplo, desde aproximadamente 0.5 mg/L hasta aproximadamente 4 mg/L, desde aproximadamente 0.5 mg/L hasta aproximadamente 2 mg/L, desde aproximadamente 1 mg/L hasta aproximadamente 3 mg/L, desde aproximadamente 2 mg/L hasta aproximadamente 3 mg/L, y/o desde aproximadamente 2 mg/L hasta aproximadamente 4 mg/L en ciertas modalidades. Un medio de inducción calloso puede comprender una auxina (por ejemplo, ácido í-naftaleneacético) a una concentración, por ejemplo, desde aproximadamente 0.1 mg/L hasta aproximadamente 4 mg/L, desde aproximadamente 0.1 mg/L hajsta aproximadamente 1.5 mg/L en ciertas modalidades, desde aproximadamente 1 mg/L hasta aproximadamente 2.5 mg/L en ciertas modalidades, desde aproximadamente 2 mg/L hasta aproximadamente 3.5 mg/L en ciertas modalidades, y/o desde aproximadamente 1.5 mg/L hasta aproximadamente 4 mg/L en ciertas modalidades en ciertas modalidades. Un medio de inducción calloso puede comprender un ácido giberílico a una concentración de, por ejemplo, desde aproximadamente 0.01 mg/L hasta aproximadamente 2 mg/L, desde aproximadamente 0.01 mg/L hasta aproximadamente 0.5 mg/L, desde aproximadamente 0.01 mg/L hasta aproximadamente 1.5 mg/L, desde aproximadamente 0.1 mg/L hasta aproximadamente 1.5 mg/L, desde aproximadamente 0.5 mg/L hasta aproximadamente 2 mg/L, y/o desde aproximadamente 1 mg/L hasta aproximadamente 2 mg/L; en ciertas modalidades. ? El material vegetal puede ser expuesto (por ejemplo, durante la inducción callosa) a iluminación que comprende alternar períodos de i iluminación y oscuridad, oscuridad total, o iluminación continua. j La I iluminación, cuando se proporciona, puede comprender desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 70 pmol"2 sec" horasj de iluminación fluorescente de luz fría.

Los índices de regeneración (por ejemplo, la formación de brjOte primordial) pueden ser mayores a aproximadamente 20%, mayores a aproximadamente 25%, mayores a aproximadamente 30%, mayores a aproximadamente 35%, mayores a aproximadamente 40%, mayores a aproximadamente 45%, mayores a aproximadamente 50%, mayores a aproximadamente 55%, y/o mayores a aproximadamente 60%. ¡ El índice de regeneración puede ser expresado, por ejemplo, como el número de secciones que tienen uno o más brotes regenerados dividido entre el número total de secciones. En ciertas modalidades, el índice de regeneración se puede determinar dejsde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 28 días, desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 25 días, de¡sde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 14 días, y/o desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 21 días, después de ¡que las secciones son transferidas a medios de inducción callosos El índice de regeneración puede ser determinado en el tiempo en ¡que los brotes (por ejemplo, la mayoría de brotes presentes) son competentes para ser transferidos a medio de inducción de raíz.

La descripción se refiere, en ciertas modalidades, a métodos para expresar una secuencia de ácido nucléico (por ejemplo, que i comprende una o más secuencias de codificación) en una célula. Por ejemplo, un método puede comprender poner en contacto una célula (por ejemplo, una célula de levadura y/o una célula vegetal) conj un ácido nucléico que comprende una secuencia de control de expresjión i y una secuencia de codificación operablemente enlazada a la secuencia de control de expresión bajo condiciones que permiten la expresión de la secuencia de codificación. La expresión, de acuerdo con ciertas modalidades, puede ser constitutiva, condicional, nativa (por ejemplo, en el tiempo normal y/o tejido), y/o ectópico. En ciertas modalidades, un método puede comprender además expresar una i secuencia de ácido nucléico en una planta (por ejemplo, una monocotiledónea y/o una dicotiledónea). Un método puede incluir cultivar (por ejemplo, purificar de manera parcial) a partir de| un producto de gen vegetal de una secuencia de ácido nucléico (por ejemplo, una secuencia exógena) expresada en la planta, de acuerdo con ciertas modalidades.

! De acuerdo con ciertas modalidades, la presente descripción se refiere a métodos para transformar y/o transfectar una planta con; un ácido nucléico que comprende una secuencia de control ¡ de expresión. Por ejemplo, un método puede comprender poner ; en contacto una célula (por ejemplo, una célula de levadura y/o una célula vegetal) con un ácido nucléico que comprende una secuencia de control de expresión. Poner en contacto un ácido nucléico con una célula puede comprender, en ciertas modalidades, co-cultivar la célula de objetivo con una bacteria (por ejemplo, Agrobacterium) que comprende el ácido nucléico (por ejemplo, en un vector binario), electroporar la célula en presencia del ácido nucléico, infectar! la célula con un virus (baculovirus) que comprende el ácido nucléico, bombardear la célula (por ejemplo, una célula en una hoja, tallo y/o callo) con partículas que comprenden el ácido nucléico, someter la célula a agitación en una solución que comprende el ácido nucléico y uno o más filamentos (por ejemplo, filamentos de carburo j de silicona), y/o inducir químicamente la célula para captar el ADN extracelular. En ciertas modalidades, poner en contacto un ácido nucléico con una célula puede comprender poner en contacto el ácido nucléico con un disco foliar vegetal y/o un protoplasto vegetal.

La descripción se refiere, en ciertas modalidades, a méto(dos para expresar a secuencia de ácido nucléico (por ejemplo, que comprende una o más secuencias de codificación) en una célula. !Por i ejemplo, un método puede comprender el poner en contacto juna célula (por ejemplo, una célula de levadura y/o una célula vegetal) con un ácido nucléico que comprende una secuencia de control de expresión y una secuencia de codificación operablemente enlazada a la secuencia de control de expresión bajo condiciones que permiten la expresión de la secuencia de codificación. La expresión, j de acuerdo con ciertas modalidades, puede ser constituti a, condicional, nativa (por ejemplo, en el tiempo y/o tejido normal),; y/o éctópica. En ciertas modalidades, un método puede comprender además la expresión de una secuencia de ácido nucléico en ¡una planta (por ejemplo, una monocotiledónea y/o una dicotiledónea)j. Un método puede incluir el cultivar (por ejemplo, purificando parcialmente) a partir de una planta, un producto de gen de una secuencia de ácido nucléico (por ejemplo, una secuencia exógena) expresada en la planta, de acuerdo con ciertas modalidades. ' Composiciones La presente descripción se refiere además, en ciertas modalidades, a productos de patata (por ejemplo, un producto I alimenticio). Por ejemplo, un producto de patata 'Atlantic' puede comprender una o más porciones de una planta de patata 'Atlan¡tic' (por ejemplo, un tubérculo, una raíz, un tallo, una hoja, iy/o combinaciones de los mismos). Por ejemplo, en ciertas modalidades, un producto de patata 'Atlantic' puede comprender una porción de! un tubérculo de cualquier tamaño y/o de cualquier forma. Por ejemplo, una sección de tubérculo de patata puede ser seleccionada a partir de una patata frita, una rebanada, una viruta, una rodaja fina, un cubo, una bola, y/o combinaciones de las mismas. Un productoj de patata 'Atlantic' puede comprender un alimento procesado (con o son componentes adicionales) que incluyen, por ejemplo, un producto de patata deshidratado y/o cocido. Un producto de patata deshidratado puede incluir un polvo, una harina, una hojuela y/o una tira. : Un producto de patata cocido puede comprender una patata horneada, una patata frita, una tira delgada, una patata a la francesa, una í patata rallada y dorada ("hash brown"), una tortita, una bola¡ de masa, una salsa, un panecillo, y similares. Un producto de patata i I cocido puede ser preparado a través de cualquier método que incluya, por ejemplo, hornear, freír, asar, hervir, inflar mediante introducción de aire caliente, y/o combinaciones de los mismos. Una composición de patata 'Atlantic' puede comprender, de acuerdo con ciertas modalidades, un carbohidrato (por ejemplo, un almidón), una proteína, un lípido, y/o un ácido nucléico preparado a partir de una patata 'Atlantic'. De acuerdo con ciertas modalidades, un producto y/o composición de patata 'Atlantic' se puede preparar a partir' de una patata 'Atlantic' que comprende por lo menos un ácido nucléico exógeno. En ciertas modalidades, puede ser deseable y/o requerido que un producto y/o composición de patata 'Atlantic' tenga poco o ningún ácido nucléico exógeno y/o producto de gen de ácido nucléico exógeno detectable a partir de la planta fuente, lo cual se puede lograr utilizando las secuencias de control de expresión para expresar de manera selectiva un ácido nucléico exógeno en ciertas células y/o tejidos (por ejemplo, hojas) y no en otras (por ejemplo, raíces, tubérculos). Una planta de patata 'Atlantic' puede tener, j en ciertas modalidades, un genotipo de mosaico con un ácido nucléico exógeno presente en ciertos sectores pero no en otros.

Como lo comprenderán aquellos con experiencia en la técnica quienes tienen el beneficio de la presente descripción, se pueden considerar otras composiciones, métodos, organismos y sistemas equivalentes o alternativos para transformar plantas (por ejemplo, variedades para elaboración de patatas fritas) sin apartarse de la i descripción aquí contenida. En consecuencia, la manera de llevar a I i í j | cabo la descripción como se muestra y describe está considerada únicamente como ilustrativa. j Las personas con experiencia en la técnica pueden hajcer varios cambios en la forma, tamaño, número y/o disposición de lias i p'artes sin apartarse del alcance de la presente descripción. Por ejemplo, se puede variar la posición y número de ácidos nucléipos exógenos. En ciertas modalidades, las secuencias de control de expresión y/o secuencias de codificación pueden 'ser intercambiables. La capacidad de intercambio puede permitir quejlos i niveles de expresión sean ajustados para adaptarse a Jlas i necesidades y/o deseos del practicante. Cada método y etapai de método descritos puede ser realizado en asociación con cualquier otro método o etapa de método descritos y en cualquier o de acuerdo con ciertas modalidades. Cuando aparece el verbo "poder", se pretende que indique una condición opcional y/o permisiva, aunque su uso no está destinado a sugerir ninguna falta! de operatividad a menos de que se indique de otro modo. Asimisjmo, cuando se han proporcionado rangos, los puntos terminales descrjitos pueden ser tratados como exactos y/o aproximaciones según¡ se i desee o requiera para la modalidad particular. Cuando los puntos i terminales son aproximados, el grado de flexibilidad puede variar en proporción al orden de magnitud del rango. Por ejemplo, por ;una I parte, un punto terminal de rango de aproximadamente 50 en el contexto de un rango de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50 puede incluir 50.5, pero no 52.5 o 55 y, por otra parte, un ?µ??? terminal de rango de aproximadamente 50 en el contexto de un rango de aproximadamente 0.5 hasta 50 puede incluir 55, pero no 60 o 75.

Además, puede ser deseable, en ciertas modalidades, mezclar y acoplar puntos terminales de rango. Asimismo, en ciertas modalidades, cada cantidad descrita (por ejemplo, en uno o más! de los ejemplos, cuadros y/o dibujos) puede formar la base de un rango (por ejemplo, el valor descrito +/- aproximadamente 10%, el valor descrito +/- aproximadamente 50%, el valor descrito +/-aproximadamente 100%) y/o un punto terminal de rango. Con respecto a lo anterior, un valor de 50 mostrado en un ejemplo, cuadro, y/o dibujo puede formar la base de un rango de, por ejemplo, aproximadamente 45 hasta aproximadamente 55, aproximadamente 25 hasta aproximadamente 100, y/o aproximadamente 0 hasta aproximadamente 100. Las personas con experiencia en la técnica pueden hacer varios cambios en los métodos de preparación y uso de una composición, dispositivo, y/o sistema de la descripción. ¡Por ejemplo, se puede preparar y/o utilizar una composición, dispositivo, y/o sistema según resulte adecuado para uso animal y/o humano (por ejemplo, con respecto a consideraciones sanitarias, de falta de efectividad, seguridad, toxicidad, biométricas, y otras). i Se pretende que estos equivalentes y alternativas junto con: los cambios y modificaciones obvias estén incluidos dentro del alcance de la presente descripción. En consecuencia, la descripción anterior está destinada a ser ilustrativa, aunque no limitante, del alcance de j la descripción como se ilustra por medio de las siguientes reivindicaciones.

EJEMPLOS | i Algunas modalidades de ejemplo específicas de la descripción pueden ser ilustradas por medio de uno o más de los ejemplos aquí proporcionados.

EJEMPLO 1: Transformación de Patata c.v. 'Atlantic' -— Métodos ( i | DÍA 1. Se pueden preparar discos foliares (por ejemplo, 0.5¡cm cuadrados) y ser cultivados en un medio de inducción calloso (por ejemplo, RBI) durante -2 días (por ejemplo, 0-4 días) en condiciones de iluminación (40 µ???? m"2 seg"1) con un fotoperíodo de 16 horas a 18-22°C. Los discos foliares pueden ser colocados hacia abajo i adaxiales si se desea y/o requiere.

La Agrobacterium que contiene el ácido nucléico exógenoj de interés puede ser cultivada por la técnica de estría sobre placas! de Caldo Luria + Kanamicina 50 mg/L + Rifampicina 50 mg/L, py cultivada durante 1 día a 28°C.

DÍA 2. El Caldo Luria (5 mL) que contiene Kanamicina 50 mg/L + Rifampicina 30 mg/L puede ser inoculado con la Agrobacterjium cultivada desde el Día 1 y cultivado en un agitador orbital (150 rpm) a 28°C.

D ÍA 3. Se pueden cortar explantes (por ejemplo, explahtes I i internodales de tallo) en segmentos (por ejemplo, 0.5-1 cm ¡ de í longitud) y se dejan en el medio MS20 hasta que están listos pára uso. Los explantes (por ejemplo, segmento de hojas, peciolos', y explantes internodales de tallo) pre-cultivados en medios i de inducción de callo (por ejemplo, desde el Día 1) pueden ser inoculados con Agrobacterium cultivado desde el Día 2. Se puede hacer flotar los explantes en una mezcla de MS20 (15 mL) y la Agrobacterium cultivada (1 mL) durante 20 minutos (por ejemplo, segmentos de hoja y peciolos) o 45 minutos (por ejemplo, internodos de tallo). Los explantes pueden ser transferidos hacia filtros estériles hasta deshidratación y después transferidos a medio de inducción calloso durante 2 días en la oscuridad.

DÍA 5. Los explantes pueden ser transferidos a medio de selección (por ejemplo, segmentos de hoja y peciolos para Selección HBI e internodos de tallo para ZR3C-1) y cultivados en condiciones de iluminación (40 µ???? m"2 sec"1) con un fotoperíodo de 16 horas a 18-22°C.

DÍA 6 + . Los explantes pueden ser subcultivados cada 7-10 días o de modo más frecuente si se observa nuevo crecimiento de Agrobacterium. Una vez que los explantes muestran callo, pueden ser transferidos al medio de regeneración (por ejemplo, hojas a Selección HB2, internodos a 5ZR3C-2). Los brotes pueden ser cortados cuando tengan una longitud de -0.5 a -1 cm y ser colocados en medio Rooting (de enraizamiento).

Los Cuadros 1-8 a continuación ilustran la composición de cáda o uno de los medios utilizados.

Cuadro 1. Medio de cultivo de planta concentrando (MSO) Sales Murashige y Skoog (MS) 4.4 g/L \ y vitaminas (Medio Vegetal) Sacarosa 20 g/L Phytagel (Medio Vegetal) 2.5 g/L pH 5.8 (ajustado utilizando ' 1 M KOH) i Cuadro 2. Medio de Co-cultivo/lnducción de callo (HBI) Sales MS y vitaminas 4.4 g/L Sacarosa 30 g/L NAA 0.2 mg/L Ácido giberélico 0.02 mg/L Zeatin Ribosida 2.5 mg/L Agar 8 g/L pH 5.8 (ajustado utilizando 1M KOH) Cuadro 3. Medio de Selección HBI Igual al medio HB 1 con las siguientes adiciones: Cefotaxima, o 400 mg/L Timentina 300 mg/L Sulfato de Kanamicina 50-75 mg/L (Opcionalmente) Tiosulfato de plata (STS)* 10-40 mg/L * La adición no pareció tener un beneficio para el número de brqtes transformados que se regeneran por planta. i Cuadro 4. Medio de regeneración de brote (Medio de selección HB2) Sales MS y vitaminas 4.4 g/L ¡ Sacarosa 30 g/L NAA 0.02 mg/L . i Ácido giberélico 0.02 mg/L Zeatin Ribosida 2 mg/L Cefotaxima 250 mg/L ¡ Sulfato de Kanamicina 50-75 mg/L Agar 8 g/L pH 5.8 (ajustado utilizando 1 M KOH) Cuadro 5. Medio líquido MS20 Sales MS y vitaminas 4.4 g/L Sacarosa 20 g/L Cuadro 6. Medio de Enraizamiento Sales MS y vitaminas 4.4 g/L Sacarosa 30 g/L Cefotaxima 100 mg/L Sulfato de Kanamicina 50 mg/L Cuadro 7. Medio 5ZR3C-I (inducción de callo) Sales MS 4.4 g/L Vitaminas JHMS* 1 ml/L Vitaminas MSVI* 1 ml/L BAP 1 ml/L NAA 2 mg/L Sacarosa 30 g/L Agar 6 g/L pH 5.6 (ajustado utilizando 1 M KOH) Como lo describió Haines et al. 2003.

Cuadro 8. Medio 5ZR3C-2 (inducción de brote) Sales MS 4.4 g/L Vitaminas 3R 2 ml/L Inositol 100 mg/L Zeatin Ribosida 2.5 mg/L NAA 0.02 mg/L Caseína enzimáticamente digerida 1 g/L Sacarosa 30 g/L Nitrato de plata 10 mg/L Sulfato de Kanamicina 100 mg/L Cefotaxima 250 mg/L Agar 6 g/L pH 5.9 (ajustado utilizando 1 M ¡ KOH) ! EJEMPLO 2: Transformación de Patata c.v. 'Atlantic' con GUS-pha -Métodos I Se describe un sistema de transformación de gen confiable de las variedades elaboración de patatas fritas más importantes, de América, la cual es susceptible a muchas enfermedades en el campo.

Se han estudiado varios factores que pueden influir en la eficiencia de transformación en términos de las líneas de producción ¡que transportan la campanilla de invierno (Galanthus nivalis aglutiriina, GNA) anti-insectos.

Los explantes de patata (internodos de hoja, peciolo y tallo) fueron cortados a partir de las plántulas de patata 'Atlantic' cultivada in vitro de 3-4 semanas de edad las cuales fueron mantenidas en medio MSO contenido en cajas Magenta GA-7 boxes ventiladas I (FIGURA 3). Las plantas son mantenidas en cajas GA-7 Magenta ventiladas a fin de evitar el desarrollo de planta vitrificada. Eri los estudios de transformación se utilizaron Agrobacterium tumefaciens EHA105 y LBA4404 que contienen pBinGUS-gna (FIGURA 2D). Los materiales vegetales (piezas foliares, peciolos, e internodos de tallo) fueron cultivados en medio de inducción de callo (CIM) durante 0-4 días. Las piezas foliculares pre-cultivadas (0-4 días en medico de i inducción de callo, CIM) y los peciolos fueron inoculados mediante flotación en medio MS20 líquido (15 mi MS20 a 1 mi de un cultivo nocturno de Agrobacterium) durante 20 minutos (internodos de tallo, 45 min). Los explantes fueron secados con material absorbente y, después transferidos de nuevo a CIM durante 2 días (oscuridad). Las piezas foliculares y los peciolos fueron transferidos a continuación a medio HB 1 y los internodos de tallo a medio 5ZR3C-1 para la selección de las células transformadas. El tratamiento de selección dual (400 mg/L Cefotaxima + 300 mg/L Timentina) fue comparado contra la Cefotaxima y Timentina por sí solas parta controlar el crecimiento de Agrobacterium. Una vez que los explantes mostraron la inducción de callo (14-21 días), las hojas y los peciolos fueron transferidos a HB2-CK y los internodos a SZR3C-2 a fin de promover la regeneración de brote. Los brotes de aproximadamente 0.5-1j cm de longitud fueron cortados y enraizados en medio MSO que contiene 50 mg/L sulfato de kanamicina. Las plántulas transformadas putativas fueron examinadas para expresión GUS por medio de i tinción histoquímica. Se extrajo el ADN genómico a partir de plantas GUS-positivas a través del método de Doyle y Doyle (1990). El número de copias del gen gna integrado dentro del genoma vegetal se determinó por medio de transferencia Southern utilizando; un fragmento gna radioetiquetado como sonda. Los niveles de expresión del gen gna fueron determinados a nivel de ARN por medid de transferencia Northern (Verwoerd et al. 1989) y a nivel de proteípa a través de transferencia Western (Yang et al. 10 2000).

; EJEMPLO 3: Transformación de patata c.v, 'Atlantic' con GUS-an'a - Resultados Los discos foliares pre-cultivados durante 2 días en CIM arites I de la inoculación con Agrobacterium fue el tratamiento más efectivo en la producción de plantas transformadas (42.5%) en comparación con los internodos IS de tallo (2%) y explantes de peciolo (0%). Una cepa A. tumefaciens EHAIOS (48%) fue la más eficiente en¡ la i producción de líneas transformadas en comparación a LBA4404 I (37%). Los explantes de internodo de tallo requirieron de un sistema de selección dual para controlar el sobrecrecimiento bacterial selección de brotes transformados (6-12% contaminantes después de 3 días en Cef+ Tim; 68-76% contaminantes cuando se utilizaron !Cef y Tim solas). No hubo un sobrecrecimiento bacterial utilizando explantes de hoja y peciolo. Los brotes GUS-positivos enraizados en medio que contiene 50 mg/L kanamicina (95% frecuencia) y exhibieron coloración en azul en hoja, tallo, raíz y tubérculo después de la tinción histoquímica (FIGURA 4). Se muestra la tinción histoqiuímica GUS de tejidos a partir de línea transformada pBinGUS-gna de patata. La actividad GUS res observada en hoja madura (A), tallo (B), raíz (C) y tubérculo (D) de una plantaj de patata transformada por gna pBinGUS-gna. El análisis tipo Southern reveló que las plantas 2S transformadas con la cepa LBA4404 tuvieron más copias del gen gna gene en comparación con aquellas producidas por medio de EHAIOS (FIGURA SA). El ADN genómico! de la patata fue digerido con Xbal para mostrar el número '¦ de inserciones ADN-T. La línea V = pBinGUS-gna; U = ADN no recortado a partir de línea de patata transgénica; líneas 1, 2 y 5 = ADN a partir de plantas transgénicas independientes transformadas mediante la cepa LBA4404; líneas 3, 4, 6-11 = ADN a partir de plantas transgénicas independientes transformadas mediante la cepa EHAIOS; g = ADN a partir de planta de patata transgénica pBinGUS; wt = natural.

Las plantas transgénicas que exhiben altos niveles ! de transcrito gna mostrados por medio de transferencia Northern (FIGURA 5B, misma leyenda que en 6A), produjeron también ! los niveles más elevados de proteína GNA (FIGURA 5C; Línea = marcador de peso molecular; s = proteína a partir de planta de cjaña de azúcar que transporta el gen gna (control positivo)).

Se observó que las piezas foliculares, pre-cultivadas durante 2 días, e inoculadas con la cepa EHAI05 tienen el mayor índice! de transformación de la variedad Atlantic. Solamente se requirió dé un sistema de selección dual para controlar el sobre-crecimiento bacterial para los explantes de internodo de tallo. Las plantas derivadas a partir de explantes inoculados con LBA4404 tuvieron más copias del gen gna en comparación con aquellas a partir de la cepa EHAI05. Las plantas que exhiben mayor nivel de expresión de GNA tuvieron solamente 1-2 10 copias del gen de transformación integrado en su genoma. ' EJEMPLO 4: Transformación de patata c.v. 'Atlantic' i ¡ . Se describe un sistema de transferencia de gen Agrobacterium-mediado para una de las variedades elaboración de patatas fritas más importantes de América, la variedad Atlantic, la cual i es I susceptible a muchas enfermedades en el campo. Se investigajron varios factores que pueden influir en la eficiencia de transformación como el tipo de explantes, la cepa de Agrobacterium , j la concentración de antibiótico para seleccionar brotes transformados y contra-selección contra Agrobacterium, período de precultivo i de explantes utilizando los métodos previamente publicados a finj de optimizar la producción de planta transgénica. j . i En este ejemplo, se utilizaron Agrobacterium, las cepas I ue transportan pBinGUS o pBinGUS con la lectina de campanilla de invierno (Galanthus nivalis aglutinina, GNA). Los discos foliares fueron más aptos para regenerar los brotes transformados (aproximadamente 60%) en comparación con los peciolos y líos i internodos de tallo. Una cepa A. tumefaciens EHA 1 05 (48 %) ¡fue más eficiente en la producción de plantas transgénicas ¡ en I comparación con LBA4404 (37%). Los brotes GUS positijves enraizados en medio que contiene 50 mg/l kanamicina (a una I frecuencia de 95%) y que exhibieron coloración azul en las hojas, tallos, raíces, tubérculos y flores después de la tinción histoquímica. El análisis Southern reveló que las plantas transformadas con la cepa LBA4404 tuvieron más copias del gen gna en comparación con EHAI05. Las plantas transgénicas que exhiben altos niveles del transcrito de gen gna por medio de transferencia Northern produjeron í también los niveles más elevados de la proteína GNA. Dicho material transgénico se está utilizando ahora para examinación de líneas útiles para evaluar la resistencia/tolerancia contra insectos patógenos. J Los discos foliares de patata cv. 'Atlantic' han sido inducidos piara regenerar los brotes a una frecuencia de aproximadamente 60% e;n cultivo. La regeneración de peciolos y los explantes intermodales d¡e tallo fueron menos eficientes. Este sistema de regeneración fue utilizado en el desarrollo de un sistema de transformación para i patata Atlantic utilizando dos cepas de Agrobacterium tumefaciens (LBA4404 y EHAI05) que portan el vector binario pBINGUS con genes i antimicrobiales y anti-insectos clonados entre los límites ADN-T (FIGURA 2). La eficiencia de transformación (el número de explantes i que regeneran brotes y expresan el gen marcador gus en un medio de selección/número total de explantes inoculados ¡con Agrobacterium) utilizando estas dos cepas de bacteria para todasilas construcciones en patata Atlantic fue del 37% para LBA4404 y! de 4i8% utilizando EHAI05. Los brotes que expresan GUS se enraizajron : i ejxitosamente en un medio de selección a una frecuencia j de I aproximadamente 95%. Se realizaron análisis de transferencia ¡ Northern para determinar el nivel de expresión de cada evento transgénico para los genes antimicrobiales o anti-insecto. Dic'hos i análisis revelaron una población de expresores elevados, medios y ¡ bajos para cada construcción de gen. En un intento por evaluarj el valor de los genes antimicrobiales y anti-insecto para conferir resistencia ante las enfermedades ZC, expresores elevados que forman cada construcción de gen fueron expuestos a psílidos que transportan Ca. Liberibacter. Las pruebas preliminares sugieren que los transformadores de defensina de espinaca SoD2- y So07-tienen una reducción en el nivel de of Ca. Liberibacter en comparación! al tipo natural como se demostró por medio de Real-time PCR siendo más efectivo el gen SoD7. j El sistema de transformación desarrollado para la patata Jcv.

'Atlantic' ofrece una ruta para la transferencia de genes resistentes a plagas y enfermedades a fin de ser incorporados dentro de e|sta importante variedad para elaboración de patatas fritas comercial|es. Se ha demostrado a través de este sistema que los pépticos antimicrobiales de genes SoD2 y SoD7 y el gen gna pueden (ser expresados de manera individual en la variedad 'Atlantic'. j EJEMPLO 5: Transformación de Patata c.v. 'Atlantic' - Resumen ¡ Se han generado plantas transgénicas de la variedad pjara elaboración de patatas fritas 'Atlantic' por medio de transformación -Agroftacfer/um-mediada que transporta genes ya sea antimicrobiales o anti-insecto derivados de planta. Los experimentos preliminares i an demostrado que la expresión de genes antimicrobiales A (So\D2) ¡ í 0 B (SoD7) puede retrasar el inicio de la invasión de Candidatus Liberibacter solanacearum (Lso) dentro de la patata a partir j de alimentación de psílido y reduce el nivel de inoculo bacterial : en tejidos vegetales según lo demuestra el análisis PCR. En términos del fenotipo vegetal, las plantas que expresan el gen antimicrobial A en niveles moderadamente elevados mostraron fijación a 28 días a partir de la infestación junto con las plantas de tipo silvestre aunque la línea transformada A-I mostró más brotes verdes en comparación con el tipo silvestre. De manera similar, la línea transformada exhibió menor necrosis dentro de los tubérculos, antes y después'del freído, en comparación con el tipo silvestre. Estas observaciones sugieren que los genes antimicrobiales pueden tener valor en la reducción del nivel de ZC en la patata. Las plantas de patata que exhiben altos niveles de expresión de transgen pueden mostrar control económico efectivo. : 1 ntroducción ¡ Se supone ahora que el agente que causa la enfermedad de patata rayada (zebra chip [ZC]) en la patata es Candidatus Liberibacter solanacearum (Lso) como se demostró medíante injerto y transmisión de psílido, microscopía electrónica y PCR (Secor et al. 2009, Plant Dis 93:574-583). Esta enfermedad fue identificada inicialmente en campos de patata comerciales de México en el año de 1994 y posteriormente se expandió a Texas y Nebraska en elj año 2000 y ahora en muchas de las áreas de cultivo más importantes ¡ de I los Estados Unidos, Nueva Zelanda y Guatemala. El síntoma de diagnóstico más importante que separa la ZC de otras enfermedades de patata conocidas es que los tubérculos muestran extensos patrones de tiras oscuras y claras, en anillo vascular y rayos medulares, de los tubérculos y se incrementan aún más cuando; se fríen como patatas fritas. En la actualidad, no hay reportes ' de I ninguna resistencia natural a ZC en la patata comercial y por tanto se requieren estrategias alternativas para ayudar a controlar la I incidencia de esta problemática enfermedad. En este estudio, se; ha investigado la efectividad de introducir genes antimicrobiales y a.nti-insecto derivados de planta dentro de la importante variedad para elaboración de patatas fritas comerciales 'Atlantic' por medio; de transformación de >Agro6acrer/um-mediada. Las líneas de patata' de alta expresión seleccionadas para el transgen fueron infectadas con Lso utilizando el psílido de patata como vector en jaulas y se midió su fenotipo en términos de tolerancia a la enfermedad ZC utilizando PCR para el gen I6S ADNr para la bacteria y mediante frituraj de tubérculos a partir de plantas infectados.

! Materiales y Métodos Agrobacterium y plásmidos j El vector binario pBin34SGUS (Yang et al. 2000) que transpbrta i el gen de neomicina transferasa II (npll) marcador seleccionable i vegetal y el gen reportero B-glucuronidasa (gusA) ubicados entre ¡las secuencias de los extremos izquierdo y derecho ADN-T respectivamente fue utilizado en todos los estudios ! de transformación. Los genes anti-insecto o antimicrobial (A o B) fueron insertados entre los dos genes marcadores (FIGURA 2).

Transformación de planta Í Se usaron varios explantes a partir de plantas derivadas de cultivo tisular para inoculación Agrobacterium . Los explantesj se hicieron flotar en un cultivo nocturno de Agrobacterium. Los tejidos vegetales fueron transferidos a un medio de co-cultivo durante 2 días y después en medio de inducción de callo que contiene kanamicina para la selección positiva de células transformadas. Después de ¡2-3 semanas, los explantes fueron transferidos a medio de regeneración de brote a fin de promover la organogénesis a partir de callo! de j patata. Los brotes de aproximadamente 1 cm de longitud fueron cortados a partir de tejido padre y enraizados en medio de cul|tivo que contiene kanamicina. Para confirmar la expresión GUS en dichos brotes, piezas de hoja, tallo y raíz fueron teñidos histoquímicos. ¡ Análisis molecular de plantas transgénicas i Se utilizó hibridación Southern para confirmar la integración1 del gen útil agronómico dentro del genoma nuclear de cada evento j transgénico. Aproximadamente 10 ÍQ de ADN genómico fueiron extraídos a partir de tejido folicular utilizando un método de extracción CTAB (Dellaporta et al. 1983, Plant Mol Biol Rep 1: 19-21) y digeridos con una enzima de restricción que se cortó una vez en el borde del gen agronómico de manera que el número de bandas observadas representaría el número de copias integradas dentro del genoma vegetal. El ADN digerido fue sometido a electroforesís en un gel de agarosa al 0.8%, transferido sobre una membrana j de nitrocelulosa e hibrídado mediante el uso de una sonda P32-etiquetada a través del empleo de procedimientos estándar (Sambrook et al. 1989, CSHL Press). Se realizó la transferencia Northern para estudiar los niveles de expresión de los genes agronómicos. Se extrajeron quince g de ARN total a partir del tejido tisular de acuerdo con el método descrito por Verwoerd et al. (1989, Nucí Acids Res 17:2362). La electroforesís, transferencia e hibridaciones se realizaron utilizando métodos estándar (Sambrook et al. 1989). Se efectuó la transferencia Western para detector la i expresión de nuestro gen agronómico a nivel de proteína. | Se separaron aproximadamente 40-50 g de proteína total a partir de cada planta en un gel SDS-PAGE y la cantidad de proteína fue visualizada por medio de análisis colorimétrico utilizando el método descrito por Yang et al. (2000, Plant Cell Rep 19: 1203-1211). 1 I : PCR para examinar la presencia de Lso en patata Se transfirieron plantas de cuatro semanas de edad de antimicrobialA-l (evento 1) y antimicrobialB-1 (expresores moderadamente elevados) a jaulas de insectos desde una cámara; de crecimiento y se les permitió aclimatarse durante un fotoperiodoj de 16h a 22°C durante 10 días. Se agregaron diez psílidos 'calienjtes' (que transportan Lso) a una caja que contiene una macetaj (4 plantas/maceta), y de manera similar, se agregaron 10 psílidos 'frjíos' (sin Lso) a otra jaula para comparación. En intervalos regulares] se cultivaron puntas de brotes apicales a partir de cada conjunto de plantas desde los cuales se extrajo ADN genómico utilizando P^wer Plant DNA Kit (MoBio, Carlsbad, CA). Se utilizaron ciento cincuenta ríg a partir de cada preparación de muestra como una plantilla para detector la presencia de Liberibacter utilizando iniciadores OA2/0I2C por medio de PCR. Al final del experimento (aproximadamente 35 días a partir de la infestación), se recolectaron los tubérculos! se Rebanaron (2 mm de espesor) y se observó la presencia de la enfermedad ZC antes y después del freído (350°C, 2 min en aceite vegetal). j Resultados y Discusión ¡ Caracterización molecular de plantas transqénicas ¡ I j Se realizó la transferencia Southern en todas las pla!ntas aintimicrobiales A y B y las plantas de patata anti-insecto para determinar el número de integraciones del gen extraño dentro del genoma. El número de inserciones varió para cada construcción de gen con 1-7 copias que son detectadas para genes A anti-insect|o y i antimicrobial y 1-6 copias que se encontraron para el gen' B antimicrobial. Las sondas P32-etiquetadas tuvieron fallas hibridizar el ADN genómico de tipo natural. En términos del niv transcripto para estos genes en la patata transgénica, se encontró^ un rango de expresores elevados, medios y bajos como se determinó por medio de transferencia Northern (FIGURA 6). Se muestran jlos análisis tipo Northern de las líneas de patata transformadas que transportan genes antimicrobiales A (SoD2) o B (SoD7) o un gen j anti-insecto (gna). Parece que hay un enlace entre el número; de copia bajo y el alto nivel de expresión del gen anti-insecto. |por ejemplo, los expresores más elevados para el gen anti-insecto tuvieron 1 o 2 inserciones y los expresores débiles tuvieron hastja 7 integraciones. Esto sugiere que un elevado número de copia de gen puede provocar un mecanismo de silenciamiento de gen, el cual oculta la expresión del transgen. Sin embargo, dicha relaciónj no existió para las construcciones de gen antimicrobial con ¡los expresores más elevados que tienen un rango de integraciones desde 3-7 copias. Para determinar el nivel de expresión del transgen i I en el nivel de proteína para el gen anti-insecto, como se demostró por medio de la transferencia Western, las plantas que exhibieron altos niveles de transcripto como se mostró por medio de! la hibridación tipo Northern proporcionaron también la mayor acumulación de proteína. Esto sugiere que hay una bu na correlación entre el nivel de transcripción y la acumulación! de proteína para el gen anti-insecto. En la actualidad, se continúa el trabajo para ver si existe una correlación para los genes antimicrobiales.

Evaluación de genes antimicrobiales en enfermedad ZC en plantas transgénicas Las líneas transgénicas antimicrobial A-l (gen A, evento 1) y antimicrobial B-1 fueron seleccionados para este análisis ya que demostraron niveles de expresión relativamente elevados del transgen. En el caso del evento A-I, se cultivaron brotes apicales a los 0, 14 y 28 días después de la infestación de psílido 'caliente' y 0, 7, 14, 21, 28 y 35 días para evento B-1 para determinar la presencia i de Lso en estas plantas por medio de PCR (FIGURA 7). En esta figura, la detección de Lso se mostró en brotes apicales de patata después de los intervalos establecidos a partir de la infestación utilizando PCR (marca de flechas -1,160 bp) (wt = tipo natural; A-l, B-1 = líneas transgénicas; -c = control de agua; +c = psílido 'caliente'). Para el evento A-l, se detectó Lso el día 14 tanto en la línea natural como en la transgénica aunque el nivel de inoculo estuvo mucho muy reducido en la línea transgénica en comparación con el tipo natural en los días 14 y 28. En términos de la línea I I transgénica B-1, se detectó Lso desde los 7 días a partir de la infestación en el tipo natural aunque no en la planta transformada. No fue sino hasta el día 21 que la línea B-1 mostró una clara señal del inoculo, en cuyo momento, el tipo natural mostró sustancialmente más inoculo en comparación con B-1. Sin embargo, para los días 28 y 35 del experimento, el nivel de bacteria en el tipo natural y la línea B-1 fueron comparables. Estos resultados PCR preliminares sugieren que ambas líneas transgénicas parecen haber retrasado el inicio de la acumulación de inoculo en la planta y que la expresión de estos genes antimicrobiales pueden ser el factor contribuyente. Fjara estudiar los efectos del fenotipo vegetal A-Ion de gen antimicrobial, tanto la línea transgénica como el tipo natural fueron fotografiados en los días 3 y 28 después de la infestación (FIGURA 8). ! Se muestran los fenotipos de plantas de patata infestadas con ps í I id os 'fríos' o 'calientes'. En el día 3, tanto la línea transgénica como el tipo natural no mostraron deterioro en el crecimiento. Sin embargo en el día 28, tanto A-I como el tipo natural mostraron fijación y necrosis de brote con la línea transformada que muestra más brotes verdes después de la infestación con psílidos 'calientes'. En el día 28, se cultivaron tubérculos a partir de A-l y del tipo natural para observar si podían detectarse los síntomas típicos de la enfermedad ZC tanto en las rebanadas de tubérculos no cocidos como en! los fritos (FIGURA 8). Como se esperaba, las plantas infestadas ¡con psílidos "fríos" no mostraron lesiones necróticas tanto en ! los tubérculos transgénicos como en los de tipo natural, antes y después del freído. Sin embargo, aquellas plantas infestadas con psílidos 'calientes' mostraron las lesiones típicas de color marrón indicativas de la enfermedad ZC aunque el nivel de necrosis fue más intenso en el tipo natural en comparación con la línea A-I. En general, el POR y los datos fenotípicos sugieren que los genes antimicrobiáles utilizados pueden tener valor no solamente en el retraso del inició de la enfermedad ZC sino que reducen también el nivel de Lso en la patata.

Claims

62 REIVINDICACIONES

1. Un método para transformar y/o transfectar por lo menos una ! célula de patata 'Atlantic' con un ácido nucléico exógeno, el métpdo que comprende: j cultivar una patata 'Atlantic'; ¡ remover una o más secciones foliculares; i cultivar dichas una o más secciones en un medio de inducción de callo; y i i poner en contacto dichas una o más secciones ¡con Agrobacterium que comprende el ácido nucléico exógeno jo condiciones que permiten transferir el ácido nucléico exóge a dichas una o más secciones a fin de producir por lo menos na célula vegetal transformada y/o transfectada.

2. Un método de conformidad con la reivindicación 1 , que j comprende además cultivar dichas una o más secciones que ; I comprende por lo menos una célula vegetal en un medio ! de ¡ selección. j

3. Un método de conformidad con la reivindicación 1 , que comprende además cultivar dichas una o más secciones ¡que comprende dicha por lo menos una célula vegetal en un medioj de inducción de raíz. ! !

4. Un método de conformidad con la reivindicación 1 , que comprende además regenerar una planta de patata a partir de dicha i por lo menos una célula de planta de patata. ¡

5. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucléico exógeno comprende en juna dirección 5' a 3' por lo menos una secuencia de control de expresjón, j por lo menos una secuencia de codificación, y por lo menos una secuencia de terminación.

6. Un método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque dicha por lo menos una secuencia ; de codificación codifica por lo menos un producto de gen con actividad I ajntimicrobial, actividad antiviral, y/o actividad insecticida.

7. Un método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque dicha por lo menos una secuencia i de codificación comprende SoD2, SoD7, gna, variantes de los mismos, y'/ o combinaciones de los mismos.

8. Una planta preparada de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 4.

9. Una planta preparada de acuerdo con el método I de i conformidad con la reivindicación 7. ;

10. Un método de conformidad con la reivindicación 4 pue comprende además el mejoramiento genético de la progenie de la I planta.

11. Un método de conformidad con la reivindicación! 1, i caracterizado porque la patata es cultivada a partir de un brote ; i durante aproximadamente 3 semanas hasta aproximadamente 4 semanas. j

12. Un método de conformidad con la reivindicación! 1, caracterizado porque cada sección es desde aproximadamente ¡0.5 cm hasta aproximadamente 1 cm en su dimensión más larga de la planta.

13. Un método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el medio de inducción de callo comprende un compuesto seleccionado a partir del grupo que un compuesto seleccionado a partir del grupo que consta de zeatina, desde I aproximadamente 0.5 mg/L hasta aproximadamente 4 mg/L ácido I-naftalenacético, ácido giberílico, y una combinación de los mismos.

14. Un método de conformidad con la reivindicación ; 1 , caracterizado porque el medio de inducción de callo comprende desde aproximadamente 0.5 mg/L hasta aproximadamente 4 nríg/L zeatina, desde aproximadamente 0.1 mg/L hasta aproximadamente 4 mg/L ácido l-naftalenacétíco, and desde aproximadamente 0.01 mg/L hasta aproximadamente 2 mg/L de ácido giberílico.

15. Un método de conformidad con la reivindicación : 1 , caracterizado porque el cultivo de una o más secciones comprende c;ultivar dichas una o más secciones hasta durante aproximadamente 4 días. !

16. Un método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el cultivo de una o más secciones comprende cultivar dichas una o más secciones hasta durante aproximadamente 2 días.

17. Un método para expresar constitutivamente un ácido nucléico exógeno en una célula vegetal, el método que comprende:

I cultivar una sección de una planta que comprende una célula vegetal en un medio de inducción de callo que comprende una citoquinina hasta durante aproximadamente 4 días; poner en contacto un cásete de expresión o vector de expresión con el citosol de la célula vegetal, en donde el cásete de expresión o vector de expresión comprende (i) el ácido nucléico exógeno, (ii) una secuencia; de control de expresión operable en la planta para impulsar la expresión constitutiva del ácido nucléico exógeno, y (iii) una secuencia¡ de terminación 3' operablemente enlazada al ácido nucléico exógeno, en donde la planta es la variedad cultivada de patata Atlantic, y en donde se expresa el ácido nucléico exógeno. ¡ 18. Un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la citoquinina comprende zeatina.

19. Un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la sección de la planta es cultivada durante aproximadamente 2 días. i

20. Un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la sección de la planta es desde aproximadamente 3 semanas hasta aproximadamente 4 semanas' de edad en el momento del cultivo en el medio de inducción de callo.:

21. Un método de conformidad con la reivindicación ¡17, caracterizado porque el ácido nucléico exógeno codifica por lo menos un producto de gen con actividad antimicrobial, actividad i antiviral, y/o actividad insecticida. ; I

22. Un método de conformidad con la reivindicación ¡21, caracterizado porque dicho por lo menos un producto de gen comprende SoD2, SoD7, gna, variantes de los mismos, y/o combinaciones de los mismos. ;

23. Un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la puesta en contacto comprende además bombardear biolísticamente la planta con una partícula que comprende el cásete de expresión o vector de expresión.

24. Un método de conformidad con la reivindicación caracterizado porque la puesta en contacto comprende además cultivar la planta con una célula Agrobacterium que comprende el cásete de expresión o vector de expresión. j

25. Un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la puesta en contacto comprende además po^ner i en contacto un callo embriónico de la planta con el cásete de expresión o vector de expresión.

26. Un método de conformidad con la reivindicación 17, que comprende además regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal. j I

27. Un método de conformidad con la reivindicación '26, caracterizado porque la regeneración comprende además cultivar la sección de la planta en un medio de selección y/o un medio; de enraizamiento.

28. una planta transgénica regenerada de conformidad con la reivindicación 26. ! ! I

29. Un método de conformidad con la reivindicación 26, que comprende además el mejoramiento genético de la progenie dé la planta transgénica.

30. Un método de conformidad con la reivindicación 22, que comprende además regenerar una planta transgénica a partir dé la célula vegetal.

31. Un método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la regeneración comprende además cultivar la sección de la planta en un medio de selección y/o un medio; de enraizamiento.

32. Una planta transgénica regenerada de conformidad con la reivindicación 30.

33. Un método de conformidad con la reivindicación 30, que comprende además mejorar genéticamente la progenie de la planta transgénica. 1

34. Un producto alimenticio de patata 'Atlantic' que comprende por lo menos una célula de patata 'Atlantic' con un ácido nucléico exógeno. I

35. Un producto alimenticio de patata 'Atlantic' de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el producto alimenticio i es una patata frita.

36. Un producto alimenticio de patata 'Atlantic' de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el producto alimenticio es un polvo, una harina, una hojuela, una tira, una patata horneada, una patata a la francesa, una papa rallada y dorada ("hash brown"), una tortita, una bola de masa, una salsa o un panecillo. I

37. Un producto alimenticio de patata 'Atlantic' preparad|o a partir de una patata 'Atlantic' que comprende por lo menos un ácido nucléico exógeno.

38. Un producto alimenticio de patata 'Atlantic' de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el producto alimenticio es una patata frita. j I

39. Un producto alimenticio de patata 'Atlantic' de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el producto alimenticio es un polvo, una harina, una hojuela, una tira, una patata horneada, una patata a la francesa, una papa rallada y dorada ("hash brown"), una tortita, una bola de masa, una salsa o un panecillo. !