JPH07274993A - 抗原の調製方法及び抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 目的抗原を高収率かつ簡便に調製し、この抗
原から菌体の生育抑制効果に優れた抗体を効率的に調製
する。 【構成】 液体培地から高分子画分を除去し、この液体
培地を用いて菌株を培養して、その菌株及び上清から抗
原を緩衝液で抽出することにより有効抗原を得、この抗
原を免疫することにより目的抗体を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、菌体の定着・感染防御
に有効な抗原を効率よく得ることができる抗原の調製方
法及びその抗原を免疫することにより得られる菌体定着
・感染防御作用を有する抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】細菌
が、宿主に感染して病原菌として作用するためには、細
菌が目的部位に定着することがまず第１段階であり、そ
の後細菌の分泌する毒素等による宿主組織の破壊、ある
いは組織を持続的に刺激することにより生体の防御応答
である免疫反応を特異的、非特異的に誘発して宿主側に
不利に働き、病原性を発揮することになる。この場合、
細菌が宿主の目的部位に付着する際、感染菌体の菌体表
層に存在する付着・感染因子等が宿主組織と相互作用す
るが、菌種によってはそれが複雑になることが多く、例
えば菌体表層のプロテアーゼ等の蛋白質、菌体が分泌す
る多糖類、ＬＴＡ，ＬＰＳ糖の脂質など、多岐に渡って
いる。

【０００３】このような細菌感染の防御、治療に当該細
菌から得られた抗原を免疫して得られる抗体が有効であ
ることが知られており、抗体の投与によって目的菌体が
宿主に付着するのを防止すると共に、菌体の生育を抑制
して感染を防御、治療することが可能である。

【０００４】ここで、近年ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄
色ブドウ球菌）等の常在菌が日和見感染の主役として注
目されるようになってきており、このような常在細菌に
よる日和見感染にも抗体の投与が有効であると考えられ
る。しかしながら、これらの菌の感染は希にしかなく、
健常人が感染して急性の経過をとる病原性菌の研究ほど
には特定の病原因子が十分に究明されていないのが現状
であり、従って感染防御抗体の特定には至っていない。
更に、日和見感染菌の治療には、抗生物質が多用されて
いるため、現在も耐性菌の出現が問題となっており、今
後さらに新たな耐性菌が生ずることが頻繁になると推察
され、このような耐性の問題を生じるおそれがなく、か
つ感染の防御・治療が可能なことから、これら常在細菌
に有効な抗体の供給が望まれる。

【０００５】従来、細菌に対する抗体を得る場合、まず
菌株を培養に適した培地を用いて培養し、その菌体及び
培養液から抗原を抽出する。そして、得られた抗原を適
宜な動物に免疫して、抗体を得る方法が採用されてい
る。

【０００６】しかしながら、従来方法により抗原を調製
し、この抗原から抗体を得る場合、菌株を培養してその
菌体及び培養液から抗原を抽出する際に菌体及び培養液
に培地成分が多量に混入し、目的抗原を効率よく得るこ
とができず、十分な収量が得られない上、高度な精製技
術を要する。このため、抗原の調製を工業化することが
困難であり、この抗原から抗体を安定的に供給すること
ができないという問題がある。

【０００７】本発明は、上記事情に鑑みなされたもの
で、特に複雑な操作を要することなく、目的抗原を高収
率かつ容易に得ることができる抗原の調製方法、及び該
調製方法により得られた抗原から得られる菌体の生育抑
制効果に優れた抗体を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段及び作用】本発明者は、上
記目的を達成するため鋭意検討を行った結果、液体培地
に菌株を植菌して培養し、その上清及び菌株から抗原を
抽出する場合に、上記液体培地中の高分子画分を透析、
限外濾過、ゲル濾過等の簡易な操作により除去し、この
液体培地に適宜糖や塩基等の培養必要成分を添加して培
養を行い、その上清及び菌株から緩衝液を用いて抗原を
抽出することにより、培地成分が混入することなく、目
的抗原を高収率かつ容易に得ることができ、しかもこの
ようにして調製した抗原を免疫して得られた抗体は高い
力価を有し、菌体と効率よく反応して菌体の生育を効果
的に阻止することを見い出し、本発明を完成したもので
ある。

【０００９】従って、本発明は、高分子画分を除去する
と共に、培養必要成分を添加した液体培地に菌株を植菌
して培養し、その培養上清及びその培養菌株から緩衝液
により抗原を抽出することを特徴とする抗原の調製方
法、及び、この調製法により調製した抗原を免疫するこ
とにより得られたことを特徴とする抗体を提供するもの
である。

【００１０】以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明の抗原の調製方法は、上述したように、高分子画
分を除去した液体培地を用いて菌株を培養した後、その
上清及び菌株から緩衝液を用いて抗原を抽出するもので
ある。

【００１１】ここで、本発明の抗原の調製方法が適用さ
れる菌種としては、特に制限されるものではないが、体
液性免疫を防御免疫機構として使用できる疾患、特に滲
出性疾患に関与する細菌が好適に適用される。即ち、表
１に示すように、細菌性感染症は、毒素性疾患、滲出性
疾患、増殖性疾患の三つに大別されるが、本発明の調製
法は、体液性免疫を防御機構として使用できる毒素性疾
患及び滲出性疾患に関与する細菌の抗原調製に利用する
ことができ、中でも化膿性疾患に関与するブドウ球菌，
レンサ球菌、淋疾に関与する淋菌、咽頭炎に関与するレ
ンサ球菌、肺炎に関与する肺炎球菌などの滲出性疾患に
関与する細菌の抗原調製に好適に使用される。

【００１２】

【表１】

【００１３】本発明調製方法に好適に用いられる細菌と
してより具体的には、下表に示すものを例示することが
できる。即ち、ヒト口腔内、上気道及び皮膚に常在する
種な連鎖球菌としては下記表２、また緑膿菌及びブドウ
球菌としては表３、更に病原性を有するインフルエンザ
菌としては表４に示した細菌を例示することができる。

【００１４】

【表２】

【００１５】

【表３】

【００１６】

【表４】

【００１７】本発明の抗原の調製方法は、上記対象細菌
の菌株をまず液体倍地により培養するが、この場合液体
培地としては、通常市販されている培地の中から各菌株
の培養にふさわしい培地を選択して使用することがで
き、この場合本発明調製法においては、その液体培地か
ら高分子成分を除去して培養を行うものである。除去す
る高分子画分としては、分子量３０００以上、特に３０
００〜１００００の画分であり、より具体的には、液体
培地中に含有される脳、心臓等の動物組織の酵素分解物
などを除去するものである。この場合、培地から高分子
成分を除去する方法には特に制限はなく、培地の種類に
応じて透析、限外濾過、ゲル濾過等の適宜な方法を採用
することができる。

【００１８】この液体培地を用いて菌株の培養を行う場
合、培養する菌株に応じてその培養に必要な糖、塩類、
アミノ酸及びその他の成分を添加することができ、また
培養温度は、菌体増殖が得られかつ菌体表層抗原の生産
性から判断すればよいが、通常は３７℃程度とすること
ができる。更に、培養時間は培養温度、培地の種類等の
条件によって異り、菌体表層抗原の収量が最大に達する
時期を選択して決定すればよい。

【００１９】培養後培地の上清及び菌株から緩衝液を用
いて抗原を抽出するが、この場合遠心分離等の適宜な手
段により上清と菌株とに分離し、これら上清及び菌株か
らそれぞれ緩衝液を用いて抗原を抽出する。抽出に用い
る緩衝液としては、特に制限されるものではないが、一
般に生理食塩水に対して等張以上の浸透圧を有する緩衝
液を用いることができ、好ましくは生理食塩水に対して
等張〜１０００倍、より好ましくは菌株からの抽出には
１〜１００倍の浸透圧を有する緩衝液が用いられる。抽
出に用いられる緩衝液として具体的には、リン酸緩衝
液，トリス緩衝液，クエン酸緩衝液，炭酸緩衝液等の緩
衝液に塩化ナトリウム，尿素，グアニジン−塩酸，ブド
ウ糖，ポリエチレングリコール等を加えてその浸透圧を
調節したものなどを挙げることができる。なお、抽出緩
衝液のｐＨは、菌種や培地の種類に応じて適宜選択され
るが、通常は４０〜１０の範囲とすることが一般的であ
る。

【００２０】抽出の方法については、種々の方法を採用
することができるが、通常菌株から抽出を行う場合には
抽出用緩衝液に培養後の菌株を分散させて所定期間（通
常１〜３日程度）放置した後、遠心分離により沈澱を回
収してその沈澱を緩衝液で洗浄する方法が好適に採用さ
れ、また上清から抽出する場合には、上清に硫安、硫酸
ナトリウム、リン酸混合液等を添加して上清中の菌体由
来物質を塩析した後、遠心分離により沈澱を得、これを
抽出用緩衝液を用いて透析する方法が好ましく採用され
る。なお、上記菌株及び上清から抽出した抗原は、凍結
保存される。また、凍結保存前に得られた抗原をイオン
交換、ゲル濾過等のカラムクロマトグラフィーにより精
製することもできるが、本発明調製法においては培地成
分がほとんど混入することはなく、この精製操作を省略
することができる。

【００２１】このようにして得られた抗原からは、これ
を免疫することにより該抗原を取り出した菌体と効率よ
く反応して菌体の生育を効果的に阻止することができる
抗体を得ることができる。この場合、抗体を得るために
免疫される動物としては、特に制限されるものではない
が、通常は牛，馬，羊，山羊，兎等の哺乳類や鶏，鶉等
の家禽類が好適に使用される。また、抗原の免疫方法と
しては、免疫される動物の種類等に応じて一般的な方法
を適宜選択することができ、具体的には皮下注射、筋肉
注射、腹腔内注射や点鼻、点眼等の通常の方法を採用す
ることができ、血清抗体、乳抗体、卵抗体等として抗体
を採取することができる。また、抗原の投与量は、所望
の抗体価が得られ、かつ動物に対して悪影響を与えない
量を適宜選択すればよい。このような操作により、通常
は初回免疫から数週間で投与抗原に対して特異的に反応
する抗体が得られる。なお、必要に応じてＦＣＡ（フロ
ント完全アジュバント）、ＦＩＡ（フロント不完全アジ
ュバント）等のアジュバントを抗原と併用して免疫を行
ってもよく、また抗体価は、免疫を適当に繰り返すこと
により高く維持することができる。

【００２２】このようにして本発明の調製法により調製
された抗原から得られる抗体は、洗口剤、うがい液、塗
布剤、錠剤、カプセル剤、注射液、その他許容される全
ての形状の製剤化が可能である。

【００２３】

【発明の効果】本発明の抗原の調製方法によれば、菌株
の培養を行う際に培地から高分子成分を除去して培養を
行い、培養後の菌体及び上清から抗原を抽出するように
したことにより、培地成分の混入等の不都合を生じるこ
となく、菌体及び上清から目的抗原を高収率かつ容易に
調製することができる。また、本発明の調製方法により
得られた抗原を免疫して得られた抗体は、菌体と効率よ
く反応して菌体の生育を効果的に阻止することができ、
例えば抗体がＭＲＳＡに対するものであれば、抗生物質
単独使用の耐性菌出現防止の一助となることが期待され
る。更に、上述のように該抗体を得るための抗原の調製
が実用的かつ簡便であるため、工業化を十分に行い得る
量の抗原を確実に得ることができ、この抗原から必要に
応じて有効抗体を確実に供給することが可能である。

【００２４】

【実施例】以下、実施例を示して本発明を具体的に説明
するが、本発明は下記実施例に制限されるものではな
い。

【００２５】菌体の培養 ＜ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）
属＞１．ストレプトコッカス ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ １９６１
５） 市販のブレイン・ハート・インフュージョン（Ｂｒａｉ
ｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地を用意し、水
にその用量の２倍量を溶解させ、透析膜に入れて４℃で
２日間透析し、その透析外液１リットルにつき５グラム
のブドウ糖を加え、０．２２μｍのフィルターで濾過滅
菌し、培養培地を得た。

【００２６】この培地２ｍｌにグリセリン含有培地に保
存しておいたストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ １
９６１５株）を１白金耳接種し、１晩放置後２ｍｌの培
養液を１リットルの上記培地に入れて４８時間以上培養
し、培養液を８０００ｒｐｍで３０分遠心して、菌体と
培養上清とに分離し、菌体は集菌後リン酸緩衝液で３回
洗浄した。

【００２７】２．ストレプトコッカス ニューモニエ
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
ＡＴＣＣ ２７３３６） 市販のブレイン・ハート・インフュージョン（Ｂｒａｉ
ｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地を用意し、水
にその用量の２倍量を溶解させ、透析膜に入れて４℃で
２日間透析し、その透析外液１リットルにつき５グラム
のブドウ糖、２００ｍｇのＬ−アスパラギン、２００ｍ
ｇのＬ−システイン塩酸、２００ｍｇのＬ−トリプトフ
ァンを加え、０．２２μｍのフィルターで濾過滅菌し、
培養培地を得た。

【００２８】この培地２ｍｌにグリセリン含有培地に保
存しておいたストレプトコッカスニューモニエ（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣ
Ｃ２７３３６株）を１白金耳接種し、１晩放置後２ｍｌ
の培養液を１リットルの上記培地に入れて６０時間以上
培養し、培養液を８０００ｒｐｍで３０分遠心して、菌
体と培養上清とに分離し、菌体は集菌後リン酸緩衝液で
３回洗浄した。

【００２９】＜シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属＞３．シュードモナス アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ２７８５
３） 市販のトリプチケイス・ソイ・ブロース（Ｔｒｙｐｔｉ
ｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）培地を用意し、水にそ
の用量の２倍量を溶解させ、この培養液を限外濾過膜に
通して高分子画分を除去し、更にこの限外濾過培地１リ
ットルにつき１ｇのブドウ糖及び５ｇの塩化ナトリウム
を加え、０．２２μｍのフィルターで濾過滅菌し、培養
培地を得た。

【００３０】この培地２ｍｌにグリセリン含有培地に保
存しておいたシュードモナス アエルギノーザ（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ
２７８５３株）を１白金耳接種し、１夜培養後、その培
養液２ｍｌを上記培地１リットルに注入して更に３７℃
で７２時間以上培養し、培養液を８０００ｒｐｍで３０
分遠心して菌体と培養上清とに分離し、菌体は集菌後リ
ン酸緩衝液で３回洗浄した。

【００３１】＜スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ）属＞４．スタフィロコッカス アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２９２１
３） 市販のコロンビア・ブロース（Ｃｏｌｕｍｂｉａ ｂｒ
ｏｔｈ）培地を用意し、水にその用量の２．５倍量を溶
解させ、これに透析外液に対して２％となるように酵母
エキス（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）を溶解し、これ
を透析チューブに入れて滅菌水に透析を行い、４℃で２
時間透析し、透析外液を得た。この透析外液１リットル
につきブドウ糖１ｇ及び塩化ナトリウム５ｇを加え、
０．２２μｍのフィルターで濾過滅菌し、培養培地を得
た。

【００３２】この培地２ｍｌにグリセリン含有培地に保
存しておいたスタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２９
２１３株）を１白金耳接種し、１夜培養後、その培養液
２ｍｌを上記培地１リットルに注入して更に３７℃で７
２時間以上培養し、培養液を８０００ｒｐｍで３０分遠
心して、菌体と培養上清とに分離し、菌体は集菌後リン
酸緩衝液で３回洗浄した。

【００３３】＜ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）属＞５．ヘモフィルス インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＡＴＣＣ ９００６） 市販のブレイン・ハート・インフュージョン（Ｂｒａｉ
ｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地を用意し、水
にその用量の２倍量を溶解させ、この培養液を限外濾過
膜に通して高分子画分を除去し、更にこの限外濾過培地
１リットルにつき２０ｍｇのヘミン（Ｈｅｍｉｎ）及び
４ｍｇのＮＡＤを加え、０．２２μｍのフィルターで濾
過滅菌し、培養培地を得た。

【００３４】この培地２ｍｌにグリセリン含有培地に保
存しておいたヘモフィルス インフルエンゼ（Ｈａｅｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＡＴＣＣ ９
００６株）を１白金耳接種し、１晩放置後２ｍｌの培養
液を１リットルの上記培地に入れて３７℃で７２時間以
上培養し、培養液を８０００ｒｐｍで３０分遠心して、
菌体と培養上清とに分離し、菌体は集菌後リン酸緩衝液
で３回洗浄した。

【００３５】抗原の抽出 ＜ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）
属＞１．ストレプトコッカス ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ １９６１
５） 上記培養液２０リットルから得られた菌株を５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に塩化ナトリウムを加えて塩
化ナトリウムの濃度を２．５Ｍとした緩衝液１リットル
（浸透圧は生理食塩水に比較して１５倍以上となる）に
分散させ、４℃で２日間撹拌した後、８０００ｒｐｍで
３０分遠心して沈澱を得、その沈澱をリン酸緩衝液で洗
浄し、凍結保存した。また、培養上清からは、培養上清
に硫安を６０％飽和になるように加え、４℃で１夜放置
した後、８５００ｒｐｍで遠心して沈澱を得、この沈澱
を５０ｍＭのリン酸緩衝液にて透析し、透析後−２０℃
にて凍結保存した。

【００３６】２．ストレプトコッカス ニューモニエ
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
ＡＴＣＣ ２７３３６） 上記培養液２０リットルから得られた菌株を５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に尿素を加えて尿素の濃度を
８Ｍとした緩衝液１リットル（浸透圧は生理食塩水に比
較して２５倍以上となる）に分散させ、４℃で１日間ゆ
っくり撹拌した後、８０００ｒｐｍで３０分遠心して沈
澱を得、その沈澱をリン酸緩衝液で洗浄し、凍結保存し
た。また、培養上清からは、培養上清に硫安を６０％飽
和になるように加え、４℃で１夜放置した後、８５００
ｒｐｍで遠心して沈澱を得、この沈澱を５０ｍＭのリン
酸緩衝液にて透析し、透析後−２０℃にて凍結保存し
た。

【００３７】＜シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属＞３．シュードモナス アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ２７８５
３） 上記培養液２０リットルから得られた菌株を５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に尿素を加えて尿素の濃度を
８Ｍとした緩衝液１リットル（浸透圧は生理食塩水に比
較して２５倍以上となる）に分散させ、４℃で１日間ゆ
っくり撹拌した後、８０００ｒｐｍで３０分遠心して沈
澱を得、その沈澱をリン酸緩衝液で洗浄し、凍結保存し
た。また、培養上清からは、培養上清に硫安を６０％飽
和になるように加え、４℃で１夜放置した後、８５００
ｒｐｍで遠心して沈澱を得、この沈澱を５０ｍＭのリン
酸緩衝液にて透析し、透析後−２０℃にて凍結保存し
た。

【００３８】＜スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ）属＞４．スタフィロコッカス アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２９２１
３） 上記培養液２０リットルから得られた菌株を５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にグアニジン−塩酸を加えて
グアニジン−塩酸の濃度を８Ｍとした緩衝液１リットル
（浸透圧は生理食塩水に比較して５０倍以上となる）に
分散させ、４℃で１日間ゆっくり撹拌した後、８０００
ｒｐｍで３０分遠心して沈澱を得、その沈澱をリン酸緩
衝液で洗浄し、凍結保存した。また、培養上清からは、
培養上清に硫安を６０％飽和になるように加え、４℃で
１夜放置した後、８５００ｒｐｍで遠心して沈澱を得、
この沈澱を５０ｍＭのリン酸緩衝液にて透析し、透析後
−２０℃にて凍結保存した。

【００３９】＜ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）属＞５．ヘモフィルス インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＡＴＣＣ ９００６） 上記培養液２０リットルから得られた菌株を５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に尿素を加えて尿素の濃度を
８Ｍとした緩衝液１リットル（浸透圧は生理食塩水に比
較して２５倍以上となる）に分散させ、４℃で１日間ゆ
っくり撹拌した後、８０００ｒｐｍで３０分遠心して沈
澱を得、その沈澱をリン酸緩衝液で洗浄し、凍結保存し
た。また、培養上清からは、培養上清に硫安を６０％飽
和になるように加え、４℃で１夜放置した後、８５００
ｒｐｍで遠心して沈澱を得、この沈澱を５０ｍＭのリン
酸緩衝液にて透析し、透析後−２０℃にて凍結保存し
た。

【００４０】抗体の調製 １．鶏卵抗体の調製 上記方法により得られた抗原を１ｍｇ含む液０，５ｍｌ
とＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント）０．５ｍｌ
とを１：１の割合で混合し、Ｗ／Ｏ型のエマルジョンと
した。次いで、このエマルジョンを鶏の左右の胸筋に
０．５ｍｌずつ注射し、初回免疫を行った後、更に１週
間ごとに免疫を続け、１ヶ月後から採卵した。なお、抗
体価が低下したときは適宜免疫を繰り返すことにより１
年間採卵を続けることができる。

【００４１】次いで、採卵した卵から分離した卵黄に等
量の水を加え、更に等量の０．５％λ−カラギーナンの
懸濁液を加えて撹拌した後、８０００ｒｐｍで２０分遠
心してその上清を得、これを抗体含有画分（ＷＳＦ）と
した。 得られたＷＳＦの力価を下記の測定法により測
定した。その結果、上記操作により鶏卵抗体８０〜３２
０単位／ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ） の液が１０ｍｌ得られ
ていた。

【００４２】２．抗血清、母乳及び抗体の調製 上記方法により得られた抗原を１０〜１００ｍｇ／ｍｌ
の濃度に調製して等量のフロイント不完全アジュバント
と混合し、妊娠した山羊、兎、牛、馬の背部皮下に体重
１ｋｇあたり０．０３〜０．３ｍｇ程度の抗原を注射し
て免疫し、その後２〜４週間おきに抗原とフロイント不
完全アジュバントとを混合したもので３回免疫し、出産
後に初乳を採取してこれを初乳サンプルとした。また、
これと同様に４回免疫した後、採血して凝固させ、その
遠心上清を抗血清サンプルとした。

【００４３】次に上記初乳サンプルに等量の０．９％食
塩水を加え、１２００ｒｐｍで６０分遠心分離した後、
上層の脂肪と沈澱物を除いて中間の液成分を採取し、こ
れに濃塩酸を加えてｐＨ４に調整した。更に、これを５
０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、その上清をト
リスハイドロキシアミノメタンで中和し、これに硫酸ア
ンモニウムを加えて７５％飽和にし、得られた沈澱物を
採取してリン酸緩衝液で透析し、母乳の抗体成分（内
液）を得た。一方、上記抗血清サンプルに硫酸アンモニ
ウムを加えて５０％飽和とし、得られた沈澱物をリン酸
緩衝液で透析して抗血清の抗体（内液）を得た。得られ
た抗体の力価を下記測定法により測定した。その結果、
以上の操作により、血清抗体として約８０〜３２０単位
／ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）の液が得られ、また初乳抗体と
して約１０〜２０単位／ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）の液が得
られていた。

【００４４】抗体価（力価）の測定 以下の試料及び手順に従って菌体凝集試験法により得ら
れた抗体の抗体価（力価）を測定した。 ・菌体浮遊液の調整 最適培地の寒天上のコロニー１〜２個を２００ｍｌの最
適培地のブロースに接種し、３７℃で１８時間嫌気的に
培養後集菌し、０．１％牛血清アルブミンを添加した生
理食塩水（以下、ＢＳＡ生食水と略記する）で３回洗浄
する。洗浄後、菌体をＢＳＡ生食水に浮遊させ、ＯＤ５
５０ｎｍ１．０に調製し、菌体浮遊液とする。なお、菌
体浮遊液は用時調製とする。 ・試料抗体 得られた抗体を希釈倍率２０，３０，５０，７０，９０
からそれぞれ２ｎ倍希釈して試料抗体とする。 ・操作法 マイクロプレート上で上記菌体浮遊液５０μｌの菌体浮
遊液に上記試料抗体を混合して撹拌し、３７℃で３時間
静置し、更に４℃で１夜静置する。 ・菌体凝集の判定 １夜静置後、マイクロプレートの底を観察し、菌体のス
ポットが出現しない場合を凝集陽性、わずかでもスポッ
トが観察された場合を凝集陰性とする。

【００４５】抗原性の評価 上記本発明の抗原調製法によりストレプトコッカス ピ
オゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｙｏｇｅｎ
ｅｓ ＡＴＣＣ １９６１５株）から菌体抗原及び上清
抗原を得、これら抗原から上記抗体調製法によりそれぞ
れ兎抗体を得、上記の抗体価（力価）測定法によりその
力価を測定した。結果を表５に示す。また、比較として
高分子画分を除去せずに通常の培地をそのまま用いて菌
株を培養し、以下本発明方法と同様にして得られた抗体
について同様に力価を測定した。結果を表５に併記す
る。

【００４６】

【表５】

【００４７】表５に示した結果から、本発明方法により
得られた抗原は、使用菌体に対して高力価の抗体を誘導
し得ることが確認された。

【００４８】抗体の菌生育抑制効果 上記方法により得られた各抗原からそれぞれ上記方法に
より兎抗体を得、下記試験方法により菌生育抑制効果を
調べた。結果を表６に示す。 ・試験方法 菌体の培養に用いたものと同様の培地を用意し、その一
方で同様の培地で前培養した菌液を遠心により集め洗浄
後、生理食塩水中に分散してＯＤ５５０ｎｍ１．０の菌
浮遊液を調製する。そして、用意した上記培地３．９ｍ
ｌに調製した菌体浮遊液を１０μｌ及び兎抗体を最終濃
度２０凝集単位となるように添加し、３７℃で１夜培養
する。培養後、その培養液のｐＨと菌の濁度を測定し、
抗体の菌生育抑制効果とした。なお、コントロールとし
て同一希釈の正常血清（正常抗体）を用いて同様に菌生
育抑制効果を調べた。

【００４９】

【表６】

【００５０】表６の結果から明らかなように、各菌株と
も菌の生育の指標である濁度が免疫抗体を含む培地では
低く、菌の生育抑制が見られ、また同様に免疫抗体含有
培地では、ｐＨの低下が小さく、菌の生育抑制を間接的
に示している。このように、本発明の調製法により調製
された抗原から得られた抗体は、各菌体の生育を抑制す
るメカニズムを通して菌体の感染予防、治療の手段とし
て十分期待されるものであった。

【００５１】以下、本発明の調製法により調製した抗原
から得られる抗体の処方例を示す。 ［処方例１］歯磨剤 第２リン酸カルシウム・２水和物 ５０．０％ ソルビット １０．０％ グリセリン １０．０％ カラゲナン １．０％ ソディウムラウリルサルフェート １．０％ Ｌ−メントール ０．７％ カルボン ０．３％ サッカリン ０．１％ エタノール ２．０％ デキストラナーゼ ０．０２％ 抗Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１９６１５） 菌体抽出抗原山羊乳抗体 ０．２％ 水 残 計 １００．０％

【００５２】 ［処方例２］歯磨剤 無水ケイ酸 ３０．０％ グリセリン ３０．０％ ソルビット ２０．０％ カルボキシメチルセルロース １．０％ ソディウムラウリルサルフェート １．２％ Ｌ−メントール ０．５％ カルボン ０．３％ アネトール ０．２％ サッカリン ０．１％ エタノール ２．０％ フッ化ナトリウム ０．１％ 抗Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ２７８５３） 菌体抽出抗原馬血清抗体 ０．１％ 水 残 計 １００．０％

【００５３】 ［処方例３］歯磨剤 水酸化アルミニウム ４５．０％ ソルビット ２０．０％ カラゲナン ０．５％ カルボキシメチルセルロース １．０％ ラウリルジエタノールアマイド １．０％ ショ糖モノラウレート ２．０％ Ｌ−メントール ０．５％ カルボン ０．９％ ペパーミント油 ０．４％ サッカリン ０．１％ 抗Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２９２１３） 菌体抽出抗原牛乳抗体 ０．３％ 水 残 計 １００．０％

【００５４】 ［処方例４］歯磨剤 第２リン酸カルシウム ４５．０％ カルボキシメチルセルロース １．０％ カラゲナン ０．５％ ソルビット ３５．０％ プロピレングリコール ３．０％ Ｎ−ラウロイルメチルタウリンナトリウム ０．５％ ゼラチン １．０％ パラオキシ安息香酸エチル ０．２％ サッカリンナトリウム ０．１％ Ｌ−メントール ０．３％ カルボン ０．４％ アネトール ０．０５％ モノフルオロリン酸ナトリウム ０．７％ 抗Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＡＴＣＣ９００６） 菌体抽出抗原鶏卵抗体 ０．４％ 水 残 計 １００．０％

【００５５】 ［処方例５］歯磨剤 水酸化アルミニウム ４０．０％ カルボキシメチルセルロースナトリウム １．０％ カラゲナン ０．５％ ソルビット ３５．０％ プロピレングリコール ３．０％ Ｎ−ミリストイルメチルタウリンナトリウム ０．５％ ペプタイド １．０％ パラオキシ安息香酸エチル ０．２％ サッカリンナトリウム ０．１％ Ｌ−メントール ０．５％ カルボン ０．５％ アネトール ０．１％ オイゲノール ０．０５％ 抗Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ２７３３６） 菌体抽出抗原羊血清抗体 ０．５％ 水 残 計 １００．０％

【００５６】 ［処方例６］歯磨剤 無水ケイ酸 ２０．０％ カルボキシメチルセルロースナトリウム １．０％ ソルビット ５０．０％ ポリエチレングリコール ５．０％ Ｎ−パルミトイルメチルタウリンナトリウム ０．５％ カゼイン １．０％ パラオキシ安息香酸ナトリウム ０．２％ サッカリンナトリウム ０．１％ Ｌ−メントール ０．７％ カルボン ０．３％ アネトール ０．３％ オイゲノール ０．１％ リナロール ０．０５％ フッ化ナトリウム ０．２％ 抗Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１９６１５） 培養上清抽出抗原鶏卵抗体 ０．３％ 水 残 計 １００．０％

【００５７】 ［処方例７］洗口剤 エタノール ２０．０％ Ｌ−メントール １．５％ カルボン ０．５％ アネトール ０．４％ サッカリン ０．０５％ ラウリルジエタノールアマイド ０．３％ クロルヘキシジングルコン酸塩 ０．０１％ 抗Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ２７８５３） 培養上清抽出抗原馬血清抗体 ０．１％ 水 残 計 １００．０％

【００５８】 ［処方例８］洗口剤 ソルビット １０．０％ エタノール ２０．０％ Ｎ−ミリストイルメチルタウリンナトリウム ０．５％ ショ糖ステアリン酸エステル １．０％ ペプタイド ０．５％ パラオキシ安息香酸メチル ０．１％ ステビオサイド ０．１％ Ｌ−メントール １．５％ カルボン ０．５％ アネトール ０．４％ デキストラナーゼ ０．２％ フッ化ナトリウム ０．２％ 抗Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２９２１３） 培養上清抽出抗原鶏卵抗体 ０．２％ 水 残 計 １００．０％

【００５９】 ［処方例９］洗口剤 ソルビット １０．０％ エタノール ２０．０％ Ｎ−ステアロイルメチルタウリンナトリウム ０．５％ ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノオレート １．０％ コラーゲン ０．５％ パラオキシ安息香酸メチル ０．１％ サッカリンナトリウム ０．１％ Ｌ−メントール １．５％ カルボン ０．５％ アネトール ０．４％ オイゲノール ０．２％ シネオール ０．１％ 抗Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＡＴＣＣ９００６） 培養上清抽出抗原牛乳抗体 ０．４％ 水 残 計 １００．０％

【００６０】 ［処方例１０］タブレット アラビアゴム ６．０％ ブドウ糖 ７２．０％ ゼラチン ３．０％ Ｌ−メントール ０．５％ カルボン ０．５％ スペアミント油 １．０％ アスコルビン酸ナトリウム ０．１％ 抗Ｓ．ｐｕｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ２７３３６） 培養上清抽出抗原羊乳抗体 ０．１％ 水 残 計 １００．０％

【００６１】 ［処方例１１］ガム ガムベース ４３．９％ 炭酸カルシウム ２．０％ 水アメ １５．０％ 砂糖 ２９．０％ ショ糖パルミテート １．０％ フルクトース ４．０％ アルドース ３．０％ Ｌ−メントール ０．５％ カルボン ０．５％ 香料 １．０％ 抗Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１９６１５） 菌体抽出抗原鶏卵抗体 ０．１％ 水 残 計 １００．０％

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/315 8318−4Ｈ 14/37 8318−4Ｈ 16/12 8318−4Ｈ 16/14 8318−4Ｈ Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ // Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:385） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:21）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 高分子画分を除去すると共に、培養必要
   成分を添加した液体培地に菌株を植菌して培養し、その
   培養上清及びその培養菌株から緩衝液により抗原を抽出
   することを特徴とする抗原の調製方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の調製法により調製した抗
   原を免疫することにより得られたことを特徴とする抗
   体。