JP2010065010A - 胃炎、胃潰瘍および／または十二指腸潰瘍の予防および／または治療用組成物、ならびにそれを含有する飲食品 - Google Patents

Abstract

【課題】抗生物質の使用に伴う副作用や耐性菌増加という欠点を持たず、ヘリコバクター・ピロリ感染によって引き起こされる胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍に対して、効果的で安全性の高い予防剤および治療剤を提供する。
【解決手段】本発明は、ヘリコバクター・ピロリの炎症性サイトカイン産生誘導蛋白質を抗原として免疫した鳥類または哺乳類が産生する該抗原に特異的な抗体を有効成分として含む、胃炎、胃潰瘍および／または十二指腸潰瘍の予防および／または治療用組成物に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヘリコバクター・ピロリの感染によって引き起こされる胃炎、胃潰瘍および／または十二指腸潰瘍を効果的に予防および／または治療するための組成物に関する。本発明は、胃炎、胃潰瘍および／または十二指腸潰瘍を予防または治療するため飲食品にも関する。

現在、消化性潰瘍の根治的治療にはヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）の除菌が不可欠であると考えられており、その除菌療法としては抗生物質と胃酸分泌抑制剤との併用療法が広く提唱されている。

ヘリコバクター・ピロリは、グラム陰性桿菌で、ヒトの胃粘膜に生息する菌である。この菌は、1983年オーストラリアのMarshall, B. J. とWarren, J. R. によって、胃炎、胃潰瘍患者の胃生検材料から高率に検出されることが報告された。当時は形態および増殖性状からカンピロバクターに類似していたので、カンピロバクター・ピロリ (Campylobacter pylori) と命名された。その後、外膜の脂肪酸組成やリボゾームの16S-RNA配列がカンピロバクターと大きく相違していることが分かり、新たにヘリコバクター属が設けられ、今日、この菌はヘリコバクター・ピロリ(以下、Hpまたはピロリ菌と略称する場合がある)と呼ばれている。

以来、疫学的研究から、この菌は胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍の起因菌であり、さらには胃癌などの疾患と関連があるとの報告が相次いで発表されている。現状ではHpの除菌には次サリチル酸ビスマス（bismuth subsalicylate）、メトロニダゾールおよびテトラサイクリンの新３剤併用療法が最も高い除菌率を示すことが分かっているが、この併用に使うメトロニダゾールは単独で使用すると耐性発現が急速に起こることが知られている。発展途上国では下痢患者に対してこの薬剤が広く使用された結果、メトロニダゾールに耐性のHp感染が高率で生じているとの報告もある。このように、抗生物質の長期投与については、その副作用に加え、耐性菌の増加という非常に重大な問題が危惧される。

従来の文献には、Hpに対する特異的抗体を含有する組成物を使用することが開示されている。これらの組成物を経口摂取することにより、胃腸管内におけるHpに対する保護に利用することができる。特許文献１および２には、抗Hp抗体を含有する組成物の製造方法が開示されているが、これらにはHp全菌体を抗原として得られた抗体が記載されているにすぎない。抗体製品の効果を発揮するために菌体の病原性に関与する抗原を使用することが重要である。全菌体を免疫抗原として利用すると、菌の病原因子に対する抗体の割合が極めて低いためその抗体製品の効果は十分とはいえない。また、特許文献３には、Hpから抽出された分子量1 kDa〜30 kDaの蛋白質および分子量80 kDa〜200 kDaの蛋白質を抗原として免疫した鶏の卵から得られた抗体を有効成分として含有することを特徴とする消化性潰瘍抑制組成物が開示されているが、特許文献１および２と同じ欠点がある。また、抗原として用いる蛋白質が同定されてないため製造レベルに応用するのが困難である。

一方、特許文献４には、Hpのウレアーゼおよび鞭毛を抗原として鶏に免疫し、この免疫鶏が産生した卵から得られる特異的な抗体が開示されている。ウレアーゼおよび鞭毛はHpの重要な接着因子として知られているため、これらの抗体はHpの胃粘膜への定着を抑制し、本菌による感染症を予防できる。しかし、胃粘膜や上皮細胞に既に定着した菌または炎症が始まった場合にはこれらの抗体の効果は十分ではない（非特許文献１）。

Hpは、強いウレアーゼ活性を有し、宿主由来の胃内の尿素をアンモニアに分解して胃酸を中和し、当該菌の胃の中での生育を可能とする。また、本菌は胃上皮細胞からの炎症性サイトカインの産生を誘導し、胃炎あるいは胃・十二指腸潰瘍を起こす。従って、胃腸炎および潰瘍を予防および治療するために、Hpの除菌とともに本菌による炎症性サイトカイン誘導活性を抑制することが重要である。

Hpの外膜蛋白質は宿主組織の炎症を引き起こす様々な蛋白質を含む（非特許文献２）。外膜蛋白質の一つであるOipA蛋白質は炎症性サイトカインの産生に関与することが報告された（非特許文献３）。マウス感染モデルにおいて、OipA欠損Hp株は胃内に接着し、増殖するが、炎症をまったく起こさない（非特許文献４）。また、OipA陽性Hp分離株は人の胃炎、胃腸潰瘍などの病態と直接に関係することが報告された（非特許文献５）。一方、熱ショック蛋白質（HspAと HspB；約58〜60kD）はGroESとGroELに類似する外膜蛋白質で、炎症性サイトカイン産生を促進することが解明された（非特許文献６および７）。また、Tipα（分子量38〜41kDa)は炎症性サイトカインであるTNFを誘導するだけではなく、胃癌と関係することが解明された（非特許文献８）。すなわち、Hpは、ウレアーゼによって胃粘膜へ定着し、増殖してからOipA蛋白質、Tipαおよび熱ショック蛋白質によって胃と十二指腸の炎症を引き起こすと考えられる。

特許第3072353号 特許第2968095号 特許第3597784号 特許第3430853号 Suzuki et al., Aliment Pharmacol Ther 2004; 20: 185-192 Shao et al., World J Gastroenterol, 2005, 11: 3011-3013 Yamaoka et al. PNAS, 2000, 97:7533-7538 Yamaoka et al., Gastroenterology, 2002, 123:1992-2004 Yamaoka et al., Gastroenterology, 2002, 123:414-424 Lin et al., J Med Microbiol 2005, 54: 225-33 Zhao et al., J Med Microbiol 2007, 56: 154-64 Suganuma et al. J Biochem Mol Biol. 2006 Jan 31;39(1):1-8

本発明の目的は、抗生物質の使用に伴う副作用や耐性菌増加という欠点を持たず、ヘリコバクター・ピロリ感染によって引き起こされる胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍に対して、効果的で安全性の高い予防剤および治療剤を提供することである。

本発明者らは、Hpによる胃腸炎を完全に阻止するためには、Hpの全菌体に対する抗体では不十分であり、Hpの重要な病原因子である炎症に関与する蛋白質に対する抗体が有効であることを見出した。そして、本発明者らは、ヘリコバクター・ピロリの炎症性サイトカイン産生誘導蛋白質を抗原として免役した鳥類または哺乳類が産生する該抗原に特異的な抗体が、胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍の予防および治療に有効であることを見出した。さらに本発明者らは、上記抗体と、Hpのウレアーゼに対する抗体との併用が相乗効果を有することも見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下を包含する。
(1) ヘリコバクター・ピロリの炎症性サイトカイン産生誘導蛋白質を抗原として免疫した鳥類または哺乳類が産生する該抗原に特異的な抗体を有効成分として含む、胃炎、胃潰瘍および／または十二指腸潰瘍の予防および／または治療用組成物。
(2) 炎症性サイトカイン産生誘導蛋白質がヘリコバクター・ピロリの外膜蛋白質である、(1)記載の組成物。
(3) 外膜蛋白質がOipA蛋白質である、(2)記載の組成物。
(4) 外膜蛋白質が熱ショック蛋白質である、(2)記載の組成物。
(5) 炎症性サイトカイン産生誘導蛋白質がTipαである、(1)記載の組成物。
(6) 抗体が、鳥類の鶏卵抗体、ならびに哺乳類の初乳抗体および常乳抗体から選択される、(1)〜(5)のいずれかに記載の組成物。
(7) 有効成分としてヘリコバクター・ピロリのウレアーゼに対する抗体をさらに含む、(1)〜(6)のいずれかに記載の組成物。
(8) (1)〜(7)のいずれかに記載の組成物を含む飲食品。

本発明によれば、ヘリコバクター・ピロリ感染によって引き起こされる胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍に対して、安全で効果的な予防剤および治療剤を提供することができる。

以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の胃炎、胃潰瘍および／または十二指腸潰瘍の予防および／または治療用組成物は、ヘリコバクター・ピロリの炎症性サイトカイン産生誘導蛋白質を抗原として免疫した鳥類または哺乳類が産生する該抗原に特異的な抗体（以下、本発明の抗体と称する場合がある）を有効成分として含む。

本発明の抗体を得るには、まず、鳥類または哺乳類に免疫するための抗原として、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）の炎症性サイトカイン産生誘導蛋白質を調製する。炎症性サイトカインとは、炎症時に、マクロファージ、リンパ球、単球などの炎症細胞により産生される蛋白質である。炎症性サイトカインは炎症性プロスタグランジンを誘導し、これらが組織細胞に障害を与え、また、発熱、腫脹、赤み、痛みを全身に及ぼす。炎症性サイトカインとしては、インターロイキン-1α（IL-1α）、インターロイキン-1β（IL-1β）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-8（IL-8）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）などが挙げられる。

ヘリコバクター・ピロリの炎症性サイトカイン産生誘導蛋白質としては、ヘリコバクター・ピロリの外膜蛋白質（OMP）及び分泌蛋白質が挙げられる。外膜蛋白質の具体例としては、OipA蛋白質（登録番号AF233683、分子量34 kD、HopH蛋白質とも称される）、熱ショック蛋白質（例えば、HspAおよびHspB；分子量58〜60 kD、登録番号L23798）、およびHop蛋白質（HopA（EU146281）、HopB（EU146283）、HopC（EU146285）、HopD（EU146287）、HopE（EU146289）、HopO（AE017125）、HopP（AE017125）、HopZ（AY300009）;分子量31〜67 kD）、BabA (分子量80k D)、SabA(分子量 70〜76 kD)が挙げられる。分泌蛋白質の具体例としては、Tipα（登録番号HP0596）が挙げられる。

本発明において、上記炎症性サイトカイン産生誘導蛋白質を抗原として免疫することには、上記炎症性サイトカイン産生誘導蛋白質の免疫原性断片を用いて免疫することも包含される。免疫原性断片は、１つまたはそれ以上のエピトープを含有し、免疫原として使用し得るものであれば、特に制限はない。抗体は、3個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を認識できるとの報告(F. Hudecz et al., J. Immunol. Methods, 147: 201-210 (1992))があることから、前記免疫原性断片の最小単位としては、アミノ酸残基数3以上のペプチドが考えられ、好ましくはアミノ酸残基数5以上、更に好ましくはアミノ酸残基数10以上のペプチドまたはポリペプチドが挙げられる。

炎症性サイトカイン産生誘導蛋白質またはその免疫原性断片は、ヘリコバクター・ピロリの菌株を培養し、培養物から精製することにより調製できる。例えば、外膜蛋白質は、Birgit Peck et al., Nucleic Acids Research, Vol 27, 16: 3325-3333, 1999に記載された方法、Suganuma et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 131, 305-313, 2005に記載された方法により調製できる。抗原の調製に用いるヘリコバクター・ピロリの菌株としては、特に限定するものではないが、例えば#130(Cag A+)(Vac A+)、NSP#305(Cag A+)(Vac A+)、NSP#335(Cag A+)(Vac A+)、NSP#355(Cag A-)(Vac A-)等のヒト臨床分離株が挙げられる。

炎症性サイトカイン産生誘導蛋白質またはその免疫原性断片は、液相法および固相法等のペプチド合成の方法により合成することもでき、更にペプチド自動合成装置を用いてもよく、例えば、日本生化学会編「生化学実験講座１ タンパク質の化学IV」、東京化学同人、1975年、泉屋ら「ペプチド合成の基礎と実験」、丸善、1985年、日本生化学会編「続生化学実験講座２ タンパク質の化学 下」、東京化学同人、1987年等に記載された方法に従い合成することができる。更に、外膜蛋白質抗原またはその免疫原性断片は、対応する塩基配列を有するDNAまたはRNAより遺伝子工学技術（例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法I」、東京化学同人、1986年、日本生化学会編「続生化学講座１ 遺伝子研究法II」、東京化学同人、1986年、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法III」、東京化学同人、1987年参照）を用いて調製してもよい。

上記炎症性サイトカイン産生誘導蛋白質を抗原として、鳥類または哺乳類に免疫することによって、本発明の抗体を得ることができる。鳥類または哺乳類への免疫は、抗原を所望により免疫増強剤 (アジュバント) と共に接種することにより行う。この接種は皮下注射、筋肉注射などの方法が可能である。抗原の接種量は、使用抗原の種類および免疫増強剤の種類に応じて、目的とする特異的抗体が体内に適当量形成され、しかも動物に対して過度の毒性が発揮されないように決定する。なお、抗原の接種は数回に分けて行うことができ、また高力価が持続するように追加接種することもできる。本発明においては、免疫に複数種の抗原を用いてもよく、その場合は各抗原を別々に使うかまたは混ぜてから免疫することができる。

免疫する鳥類としては、特に限定されないが、通常、鶏、鶉、アヒル等の家禽が挙げられ、抗体の量産性という観点から、鶏、特に、産卵種を用いるのが好ましい。鳥類への免疫は、例えば、特許第3430853号に記載された方法に従って行うことが望ましい。免疫した鶏の卵中に抗体が適当量生成したことが確認できた後、鶏卵を採取し、目的とする特異的抗体（鶏卵抗体）を回収する。本発明の組成物には、精製抗体を配合してもよいし、抗体を含む全卵もしくは卵黄をそのまま配合してもよいし、また全卵もしくは卵黄からスプレードライ法や凍結乾燥法などにより粉末化したものを配合してもよい。あるいは、卵黄からヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリエチレングリコールなどを用いる方法により卵黄脂質成分を除去した後粉末化したもの、さらに硫酸アンモニウム塩析、硫酸ナトリウム塩析、低温エタノール沈殿法等の既知の蛋白質精製法により精製したものなど、種々の形態のものを目的に応じて配合することができる。

免疫する哺乳類としては、畜産に適する産乳動物が望ましく、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の反芻動物、好ましくは乳牛を用いることができる。哺乳類を感作して免疫グロブリンを含む乳を採取する方法として、例えば、特開昭52-1014号公報、特開昭54-113425号公報、特開昭57-188523号公報等に記載された方法が挙げられる。免疫した哺乳類の乳中に抗体が適当量生成したことが確認できた後、乳を採取し、目的とする特異的抗体（初乳抗体および常乳抗体）を回収する。本発明の組成物には、精製抗体を配合してもよいし、抗体を含む乳をそのまま配合してもよいし、また乳からスプレードライ法や凍結乾燥法などにより粉末化したものを配合してもよい。あるいは、乳からヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリエチレングリコールなどを用いる方法により脂質成分を除去した後粉末化したもの、さらに硫酸アンモニウム塩析、硫酸ナトリウム塩析、低温エタノール沈殿法等の既知の蛋白質精製法により精製したものなど、種々の形態のものを目的に応じて配合することができる。

抗原で感作した乳牛から採取した乳から調製された脱脂粉乳、または乳清蛋白質濃縮物は、例えば、脱脂粉乳として商品名「スターリミルク」、乳清蛋白質濃縮物として商品名「スターリ乳清」、または脱脂粉乳／乳清蛋白質濃縮物混合物として商品名「スターリミルクゴールド」（いずれも兼松ウェルネス株式会社から販売）等が市販されており、本発明に好ましく用いることができる。

免疫後の抗体価は、既知の測定方法、例えば、ELISAや凝集反応を用いる方法により測定できる。免疫後の特異的な抗体価は、抗原の種類や動物種類によって異なるが、10,000倍から500,000倍までの間である。

本発明の組成物は、ヘリコバクター・ピロリの炎症性サイトカイン誘導蛋白質に対する抗原を含んでいる限り、単独の抗原でそれぞれ免疫した鳥類または哺乳類が産生する複数種の抗体を組み合わせて含んでいてもよく、また複数種の抗原で免疫した鳥類または哺乳類が産生する複数種の抗体の混合物を含んでいてもよい。

本発明の組成物は、哺乳類におけるヘリコバクター・ピロリによる炎症性サイトカイン産生誘導活性を効果的に阻害し、哺乳類における胃炎、胃潰瘍および／または十二指腸潰瘍を予防および／または治療するために有効である。本発明において哺乳類は、温血脊椎動物をさし、例えば、ヒトおよびサルなどの霊長類、マウス、ラットおよびウサギなどの齧歯類、イヌおよびネコなどの愛玩動物、ならびにウシ、ウマおよびブタなどの家畜が挙げられる。胃炎、胃潰瘍および／または十二指腸潰瘍に罹患している哺乳類、胃炎、胃潰瘍および／または十二指腸潰瘍に罹患する可能性がある哺乳類、胃炎、胃潰瘍および／または十二指腸潰瘍を予防する必要がある哺乳類に、本発明の組成物を投与することが特に好ましい。

本発明の組成物は、医薬組成物の形態とすることもできる。医薬組成物は、有効成分である抗体または該抗体を含む成分（例えば、卵もしくは乳、またはその処理物）に、慣用の添加剤を剤型に応じて配合し、常法に従って製造することができる。医薬組成物の剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、液剤、懸濁剤、吸入剤などの経口剤、坐剤などの経腸製剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤などの外用剤、点滴剤、注射剤などが挙げられる。これらのうちでは、経口剤が好ましい。本発明の組成物は、経口投与によって簡便に、胃炎、胃潰瘍および／または十二指腸潰瘍を予防および／または治療できる点で特に有利である。

添加剤には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤などがあり、必要に応じて使用する。長時間作用できるように徐放化するためには、既知の遅延剤等でコーティングすることもできる。賦形剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、軽質無水ケイ酸、ゼラチン、結晶セルロース、ソルビトール、タルク、デキストリン、デンプン、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム等が使用できる。結合剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、エタノール、エチルセルロース、カゼインナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、精製水、ゼラチン、デンプン、トラガント、乳糖、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類等が挙げられる。抗酸化剤としては、トコフェロール、没食子酸エステル、ジブチルヒドロキシトルエン（BHT）、ブチルヒドロキシアニソール（BHA）、アスコルビン酸等が挙げられる。

本発明の組成物は飲食品に配合することもできる。飲食品には、健康食品、機能性食品、サプリメントも包含される。具体的には、粉剤、タブレット、細粒、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、流動食等の各種製剤形態の飲食品が挙げられる。このような製剤形態の飲食品は、上記医薬組成物と同様に製剤することができる。例えば、有効成分である抗体または該抗体を含む成分（例えば、卵もしくは乳、またはその処理物）に適当な賦形剤（例えば、でん粉、加工でん粉、乳糖、ブドウ糖、水等）を加えた後、慣用の手段を用いて製造することができる。一般的な飲食品の形態、例えば、スープ類、ジュース類、乳飲料、ココア飲料、茶飲料、ゼリー状飲料などの液状食品、プリン、ヨーグルトなどの半固形食品、パン、菓子、うどんなどの麺類、クッキー、チョコレート、キャンディ、ガム、せんべいなどの菓子、ふりかけ、バター、ジャムなどのスプレッド類、水性液体に分散させて飲料とするための粉末状飲料等の形態もとりうる。

本発明において飲食品には飼料も包含される。飼料にはペットフードも含まれる。飼料の原材料としては、畜肉類、魚介類、野菜類、穀類、澱粉、油脂類、魚粉、食物繊維、乳製品、ビタミン、ミネラル、水分等の各種成分を調整したもので、形態が生、半生、乾燥等のものであるが、そのほとんどは上記各原料を混合、撹拌して成型することにより製造するのが一般的な製法である。いずれの場合でも、原料を混合する段階で有効成分である抗体または該抗体を含む成分（例えば、卵もしくは乳、またはその処理物）を配合したり、最終段階で添加して撹拌したりすることにより製造できる。飼料には、ペット用クッキー類、ビスケット類、スナック類、ガム類、ニュートリエント類等も包含される。

本発明の組成物は、ヘリコバクター・ピロリの炎症性サイトカイン産生誘導蛋白質を抗原として免疫した鳥類または哺乳類が産生する特異的抗体に加えて、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼに対する抗体を含むことが好ましい。ウレアーゼに対する抗体としては、ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼを抗原として免疫した鳥類が卵中に産生する抗体が好ましい。ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼとしては、ウレアーゼ A(32kDa)、ウレアーゼ B(60kDa)及びこれらの混合物を使用できる。ウレアーゼに対する抗体は、例えば、特開平10-287585に記載の方法により調製できる。ウレアーゼに対する抗体を併用することにより、胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍の予防および治療において優れた相乗効果が得られる。

本発明の組成物には、さらに、各種油脂、生薬、アミノ酸、多価アルコール、天然高分子、ビタミン、ミネラル、食物繊維、界面活性剤、安定剤、ｐＨ調製剤、酸化防止剤、甘味料、呈味成分、酸味料および香料などを配合してもよい。その他の有効成分、例えば、抗生剤、抗TNF-α抗体などを配合してもよい。

本発明の組成物は、有効成分である炎症性サイトカイン産生誘導蛋白質に対する抗体を、乾燥質量に基づいて、医薬組成物では通常0.5〜10重量％、飲食品では通常0.1〜1.0質量％含むことが好ましい。

本発明の組成物の有効量を哺乳類に投与することにより、哺乳類の胃炎、胃潰瘍および／または十二指腸潰瘍を予防および／または治療することができる。有効量とは、例えば、医師によって探索される、動物の生理学的または医学的応答を引き出すのに十分な量を意味し、より具体的には、そのような量の投与を受けなかった対応する被験体と比較したときに、疾患、障害、もしくは副作用の、治療、治癒、予防の向上、もしくは改善をもたらすような量、または疾患もしくは障害の進行速度の低減をもたらすような量を意味する。

本発明の組成物の投与量は、特に制限されないが、1日当たり、体重1 kgあたり、抗体の質量を基準として、乾燥質量に基づいて、通常25〜45 mg、好ましくは90〜180 mgである。

以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。

（実施例１）抗体の調製
(1) ヘリコバクター・ピロリ全菌体抗原の調製
胃炎患者由来のHp#130株（東海大学医学部生体防御機構系感染症学部門より分与）を5％馬血液加ブレインハートインフュージョン寒天培地に接種した後、ガスパック嫌気性ジャーで37℃で72時間培養した。培養終了後、弱いα溶血を示すスムーズで透明な光沢のあるコロニーを釣菌し、１〜10％牛胎児血清加ブルセラブロースに浮遊し、気相を10％CO₂、10％H₂および80％N₂混合ガスと置換して37℃で24〜48時間振とう培養した。継代ごとに培養液量を増やし、4代まで継代培養した。各培養液については、継代ごとにグラム染色性、運動性、ウレアーゼ、カタラーゼおよびオキシダーゼ産生能を確認した。4代継代した培養菌液(5.2×10⁸CFU/ml)を12,000×gで20分間遠心し、その菌体を出発培養液量の約1/100 になるように滅菌精製水に浮遊した後、超高速ホモゲナイザー (キネマティカ社製)で15,000rpmで60秒間処理することにより菌体を可溶化した。菌体が破砕されたかどうかは、破砕物を10％馬血液加寒天培地に接種し、菌の発育の有無によって判定した。

(2) OipA抗原の調製
OipA抗原はDNA組み換え技術によって作製した。OipA遺伝子（登録番号AF233683）をHp#130株からPCR法によって増幅してからpGEXベクター（Amershambiosciences）にライゲーションし、大腸菌BL21株に導入した。本組み換え大腸菌を培養し、0.5mM IPTGによってOipA蛋白質の発現を誘導した。産生された組み換えOipA蛋白質を大腸菌からAffinity columnで精製して免疫抗原として用いた。

(3) Tipα抗原の調製
Hp#130株を(1)に従って培養した後、Tipα抗原を培養液から精製した。この培養液に40%飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、4℃で3時間攪拌した後、10,000rpmで60分間遠心し、沈殿物を少量のPBSに溶かした。さらに、ゲル濾過(YMC-Pack Diol-200,500×8.0mm I.D., YMC)により、分子量38〜40kDaのTipα蛋白質の画分を回収した。

(4) HspA抗原およびHspB抗原の調製
HspA遺伝子（登録番号P0A0R3）及びHspB遺伝子（登録番号AAC41441）をPCRでクローニングしてから(2)の方法に従って抗原を作製した。

(5) OMP抗原の調製
外膜蛋白質抗原は、Birgit Peck et al., Nucleic Acids Research, Vol 27, 16: 3325-3333, 1999に記載された方法等で調製した。Hp#130株を(1)に従って培養してから10mM Tris液に浮遊した後、超高速ホモゲナイザー (キネマティカ社製)で4,000rpmで15分間処理することにより菌体を可溶化した。さらに、100,000gで60分間遠心によって外膜蛋白質画分を回収し、-80℃で保存した。

(6) 産卵鶏への免疫
免疫には18週齢前後の白色レグホン種、ハイラインW77 系群を用いた。上記(1)〜(5)で得られた抗原 (蛋白量を0.5 〜1.0mg/mlに調整) を別々に油性アジュバントと混和した後、左右の胸筋内に0.5 mlずつ注射した (初回免疫)。その6週後にブスターとして同量の抗原を各々免疫し、卵黄中の抗体価が有意に上昇して安定した、ブスター注射2週後から集卵を開始し、4週間卵を集めた。なお、卵黄中の抗体価は4〜6ヶ月間安定していた。その後、抗体価が低下したので、同様の方法で再注射したところ、元の抗体価のレベルまで回復した。

(7) 鶏卵卵黄中の抗体価の測定
免疫卵を割卵して卵黄を取り出した後、重量を計り、これに等量の生理的食塩水を加えて卵黄成分をよく溶解し、この混合物に対して等量のクロロホルムを加え、激しく振とう攪拌した後、遠心して上清を得た。この上清を抗体価測定用試料とした。抗体価の測定はELISAによって行った。方法は以下に示した通りであるが、固相化抗原並びにホースラディッシュペルオキシダーゼ−抗ニワトリIgGコンジュゲートはチェッカーボードタイトレーションを行うことにより、至適濃度を設定した。プレートは96ウエルヌンクイムノプレートを用い、固相化には精製した各抗原を用いた。抗原は蛋白量が5 μg/mlになるように炭酸緩衝液(pH9.6) で希釈し、１ウエル当たり100 μlずつ加え、＋4℃で18時間静置した。使用時にはPBS-Tween で各ウエルを3回洗浄した後、ブロッキングのため2％スキムミルク溶液に200 μlずつ加え、37℃で60分静置した。次に、各ウエルをPBS-Tween で3回洗浄した後、各試料をウエル当たり100 μlずつ加え、37℃で60分反応させた。反応後、再びPBS-Tween で洗浄し、12,000倍に希釈したコンジュゲートを100 μl/ウエルに加え、再び37℃で60分反応させた。ウエルを５回洗浄した後、基質 (H₂O₂を含むO-フェニレンジアミン塩酸塩) を加えて室温で発色させ、20分後に50μl/ウエルの3N H₂SO₄を添加して反応を停止させた。その後、各ウエルの吸光度(490nm) をELISA オートリーダーで測定した。試料の抗体価は最終的に陽性ならびに陰性対照の吸光度を基準にして補正して求めた。

(8) 鶏卵卵黄抗体の調製
上記方法によって鶏卵中に抗体が適当量生成したことが確認できた後、鶏卵を採取し、目的とする特異的抗体を回収した。

卵黄粉末の調製：割卵により卵黄を分離後、60℃で30分低温殺菌を行ってから噴霧乾燥により抗体含有卵黄粉末を得た(以下卵黄粉末)。

精製卵黄抗体粉末の調製：卵黄粉末7.5 kgを出発材料とし、卵黄重量に対し10倍量の精製水を加えて脱脂した。上清に40％飽和になるように硫酸アンモニウムを加えて攪拌し、遠心によりペレットを得た。ペレットを生理的食塩水で溶かし、再び30％飽和塩析を行いペレットを得た。このペレットを少量の生理的食塩水で溶解し、これに最終濃度が50％になるように攪拌しながら、−20℃に冷却したエタノールを徐々に加えた。遠心後、ペレットを生理的食塩水で溶かし凍結乾燥した。その結果、淡黄白色の粉末が約11ｇ得られた。抗体の回収率は47％前後、IgG純度は95％以上、水分含量は2％以下であった。この方法で作製した粉末を、精製卵黄抗体粉末とした（以下精製抗体）。

（実施例２）細胞におけるサイトカイン産生抑制試験
KATOIIIまたはHL-60細胞を単層になるように培養してから各種抗体（精製抗体；ELISA抗体価10,000倍）で処理したヘリコバクター・ピロリを加えた（細胞：菌＝1：100）。対照抗体として、非免疫鶏卵から作製した精製抗体を用いた。24時間後細胞培養液を取り、サイトカイン産生量を測定した。結果を表１に示す。

表１から、抗OipA抗体、抗Tipα抗体、及び抗HspA＋HspB抗体、特に抗OipA抗体で処理したヘリコバクター・ピロリは、細胞に対するサイトカイン産生誘導活性が抑制されていることがわかる。

（実施例３）マウスにおける除菌試験
NS:Hr/ICRマウス（雄、8週齢）を使用し、各種抗体による除菌試験を実施した。上記マウスに、ヘリコバクター・ピロリ NSP335株（1×10⁹個）を経口投与し、１週間後、試験群の一部を屠殺して胃内の菌数を測定して菌が定着していることを確認した。その後、試験動物を6群（１群10匹）に分け、下記の飼料を与えた（自由摂取）。対照抗体として、非免疫鶏卵から作製した抗体を用いた。
１群：通常飼料
２群：通常飼料＋抗OipA抗体（卵黄粉末5%）
３群：通常飼料＋抗OMP抗体（卵黄粉末5%）
４群：通常飼料＋抗OipA抗体＋抗ウレアーゼ抗体（卵黄粉末2.5%ずつ）
５群：通常飼料＋対照抗体（卵黄粉末5%）

ここで卵黄粉末5%とは、抗体を卵黄粉末として5重量％含有することを示し、卵黄粉末2.5%ずつとは、各抗体を卵黄粉末としてそれぞれ2.5重量％含有することを示す。

上記飼料で10週間飼育した後、開腹し、胃内のヘリコバクター・ピロリの数を測定した。その結果を表２に示す。

表２から、本発明の組成物を投与した群（2〜4群）では、40〜60％のマウスにおいてピロリ菌が完全に除去され、対照群（1および5群）に比べて胃内ピロリ菌数を有意に減少することが示された。

（実施例４）スナネズミにおける効果試験
ヘリコバクター・ピロリ経口接種により胃潰瘍を発症することが報告されているスナネズミを用いて試験を行った。５週令の雄性スナネズミにヘリコバクター・ピロリ 1×10⁹ CFU/匹を経口感染させた。感染8週後に、ヘリコバクター・ピロリの感染を確認したスナネズミのみを選定して、各種抗体を混餌で投与を開始し、8週間投与を継続した。対照抗体として、非免疫鶏卵から作製した抗体を用いた。その後、胃粘膜組織の炎症をミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性、炎症性サイトカインであるIL-1βおよびTNF-αの産生量で評価した。試験動物の群設定は次の4群（1群10匹）のように行った。結果を表３に示す。
１群：通常飼料
２群：通常飼料＋抗OipA抗体（卵黄粉末5%）
３群：通常飼料＋抗OipA抗体＋抗ウレアーゼ抗体（卵黄粉末2.5%ずつ）
４群：通常飼料＋対照抗体（卵黄粉末5%）

ここで卵黄粉末5%とは、抗体を卵黄粉末として5重量％含有することを示し、卵黄粉末2.5%ずつとは、各抗体を卵黄粉末としてそれぞれ2.5重量％含有することを示す。

表３に示されるように、本発明の組成物を投与した群（2及び3群）においては、炎症に関与するMPO活性と炎症性サイトカイン産生量が有意に減少した。

（実施例５）ヒト臨床試験
本試験には、試験への参加に同意された方で、20歳以上65歳未満の胃部に不快感を示す、抗ピロリ菌抗体および糞便中ピロリ菌抗原陽性60名が参加した。選択した60名の年齢および性別を指標にして、連続無作為法にて3群（食品A群、食品B群、プラセボC群）に分け、1群20名にて試験を実施した。対照抗体として、非免疫鶏卵から作製した抗体を用いた。被験者は、各抗体を配合した顆粒を、8週間に渡り1日2粒を摂取した。
群の設定
A群：抗OipA抗体（卵黄粉末3g）配合顆粒
B群：抗OipA抗体（卵黄粉末1.5g） + 抗ウレアーゼ抗体（卵黄粉末1.5g）配合顆粒
C群：対照抗体（卵黄粉末3g）配合顆粒

各被験物質の摂取中4週目、8週目と12週目に検査を行った。検査は尿素呼気試験（UBT）および血清ペプシノゲンＩ/ＩＩ比を測定した。試験結果を図１および２に示す。

図１に示したように、対照抗体摂取群においてはUBT値はほとんど変わらなかったが、A群とB群においてはUBT値が有意に減少した。また、図２に示したように、A群とB群においては血清ペプシノゲンＩ/ＩＩ比が増加する傾向があった。

（実施例６）処方例
（１）ヨーグルトの処方例（重量％）
牛乳 95％
脱脂粉乳 1％
実施例１で製造した抗OipA抗体(卵黄粉末) 3％
水 1％

（２）顆粒粉末の処方例（重量％）
牛乳 44％
卵 30％
糖質 20％
香料 1％
実施例１で製造した抗OipA抗体(卵黄粉末) 5％

（３）胃炎、胃潰瘍および／または十二指腸潰瘍予防タブレットの処方例（重量％）
糖質 51％
結晶セルロース 20％
香料 1％
ショ糖脂肪酸エステル 3％
実施例１で製造した抗OipA抗体(卵黄粉末） 25％

抗ピロリ菌抗体および糞便中ピロリ菌抗原陽性の被検者に、本発明の組成物を投与し、尿素呼気試験（UBT）を検査した結果を示す。 抗ピロリ菌抗体および糞便中ピロリ菌抗原陽性の被検者に、本発明の組成物を投与し、血清ペプシノゲンＩ/ＩＩ比を検査した結果を示す。

Claims (8)

1. ヘリコバクター・ピロリの炎症性サイトカイン産生誘導蛋白質を抗原として免役した鳥類または哺乳類が産生する該抗原に特異的な抗体を有効成分として含む、胃炎、胃潰瘍および／または十二指腸潰瘍の予防および／または治療用組成物。
2. 炎症性サイトカイン産生誘導蛋白質がヘリコバクター・ピロリの外膜蛋白質である、請求項１記載の組成物。
3. 外膜蛋白質がOipA蛋白質である、請求項２記載の組成物。
4. 外膜蛋白質が熱ショック蛋白質である、請求項２記載の組成物。
5. 炎症性サイトカイン産生誘導蛋白質がTipαである、請求項１記載の組成物。
6. 抗体が、鳥類の鶏卵抗体、ならびに哺乳類の初乳抗体および常乳抗体から選択される、請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
7. 有効成分としてヘリコバクター・ピロリのウレアーゼに対する抗体をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
8. 請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物を含む飲食品。

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