JP4554728B2 - 移植片拒絶反応またはアレルギーまたは自己免疫反応と関連した病状を治療するための医薬または食品組成物 - Google Patents

Description

発明の主題
本発明は移植片拒絶反応またはアレルギーまたは自己免疫反応と関連した病状を治療することを意図した新規な医薬または食品組成物に関する。
発明の技術的背景
この１２年間に、アレルゲンの経口投与に基づく脱感作の対照研究が記載されている（参照文献１）。この方法は抗原の経口投与が抗原に対する免疫寛容の獲得を容易とするという事実に基づいている。消化系統は食品または微生物起源の抗原と人体との接触モードを構成する。しかし、アレルギー反応はまれである。ラットへのヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）の経口投与は皮下注射後の抗−ＳＲＢＣ抗体の後生成からラットを予防するが、先立つ経口摂取なしではアレルギー応答が存在したであろう。この現象は免疫学的に経口免疫寛容と呼ばれるものを構成する。
この経口脱感作法は見込み研究及び対照研究で確認されており、特に樺花粉及びダニ目に対するアナフィラキシーの危険を減少させることができる。既にワクチン市場で飲用可能な形で入手可能である

更に、新しい酵素的に前消化された粉末ミルク配合物の導入以来観察されたミルクに対するアレルギーに対して幼児を保護することに関して、ペプチドの形の抗原を提供することによって免疫寛容を導入することによって利益がもたらされるであろうことが考えられる。
しかし、脱感作の効能を予想しまたは述べることは困難である。臨床的な観察は症状の如何なる改善を確認しまたは否定することを可能とする。
国際特許出願ＷＯ ９６／３６８８０から、試料中に存在するリガンドと他の識別しうるリガンドの間の競合試験により、アレルギーまたは自己免疫応答または肺癌と関連した病状に特異的なリガンドを検出及び／または定量することが可能であることが知られている。この試験はアレルギー及び症状を有する個体がそれらの抗体により、前記症状の同じ特異的な抗原構造に関して寛容な個体の抗体により認識されたエピトープと異なるエピトープを認識するという事実に基づく。その文献はまた特にミルクに対してアレルギーを示す子供がこの特異性を発展（evolution）させてミルクに対する寛容をインビボ獲得するという変化を測定する可能性を記述している。
発明の目的
本発明の目的はアレルギーまたは自己免疫反応と関連した病状に対するまたは移植片拒絶現象に対する患者の免疫応答を前記患者の免疫応答が正常な個体（この病状に暴露されても症状のないままの人）により示された自然寛容に近くなるように改変するように設計された、医薬または食品形式であることのできる新規な組成物を提供することにある。
本発明はまた投与するのが容易であり予防及び／または治療態様で使用されることのできる安価な医薬または食品組成物を提供することを指向する。
発明の特徴的要素
本発明は適切な医薬または食品賦形剤、ストレス蛋白（また“熱ショック蛋白”またはＨＳＰとして知られている）、及び抗原構造のエピトープ（立体配座型または連続型エピトープ）を含む医薬または食品組成物に関し、前記抗原構造は移植片拒絶反応、アレルギー反応または自己免疫反応を誘発する。好ましくは、この組成物の医薬または食品賦形剤は粘膜（特に経口）または皮膚投与に適切なものである。
有利には、ストレス蛋白とエピトープは、参照までに以下に組み入れられる、RoamnらのFebs（１９９４）、FouriらのThe Journal of Biological Chemistry, ２６９巻，４８号，３０４７０−３０４７８頁（１９９４）、PallerosらのThe Journal of Biological Chemistry, ２６９巻，４８号，１３１０７−１３１１４頁（１９９４）、GrageroovとGottesmanのJournal of Molecular Biology, ２４１号，１３３−１３５頁（１９９４）、及びSchmidらのScience, ２６０巻，１９９１頁（１９９４）に記述される如く、複合体を自然に形成する。
この発明によれば、エピトープ（また抗原決定基として知られる）は前記抗原構造の加水分解により、特にペプシンによる酵素的加水分解により得られる。
有利には、ストレス蛋白は例えば大腸菌（イー・コリ（E. coli））のような腐生バクテリアに存在する細菌性ストレス蛋白である。
本発明のストレス蛋白の中で、特にHendrickとHartlにより（Annual Review of Biochemistry, ６２号，３４９頁（１９９３））に記載された如きストレス蛋白ＧｒｏＥＬ、ストレス蛋白ＧｒｐＥ，ＤｎａＫまたはＤｎａＪ、または熱ショック蛋白ＨＳＰ６０，７０等をあげることができる。
表現“移植片拒絶反応またはアレルギーまたは自己免疫反応”は特に抗原と接触して引き起こされた即時または遅延形式の過敏性反応（この反応は即時的及び特異的（アナフィラキシー、じんま疹等）または遅延的であることができる）または移植片に対する宿主形式の及び宿主に対する移植片形式の移植片拒絶反応と関連した即時または遅延形式の免疫システムの自己免疫疾患及び傷害を意味する。
自己免疫は自分自身の要素に対する個体の免疫の状態であり、移植片拒絶反応の現象は患者に計画的にインプラントされた外来要素（血液、髄液等のような体液、細胞、組織、器官、抗体等）に対する個体の免疫の状態である。これらの現象は特にＳＬＥ（全身性エリテマトーデス病）、グージェロ−ショーグレーン症候群

（またはショーグレーン病）及び類リウマチ多発関節炎と関連した感染からなる群から選ばれた病状、ならびにサルコイドーシス及びオステオペニアのような病状、脊椎関節炎、強皮症、多発性硬化症、筋萎縮性横硬化症、甲状腺機能亢進症、アジソン病、自己免疫溶血性貧血、クローン病、ゴッドパスチュアー症候群、グラベス病、ハシモト甲状腺炎、突発性紫斑出血、インシュリン依存性糖尿病、筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、後連鎖球菌性糸球体腎炎、乾癬及び自発不妊症、並びに移植片拒絶反応時に観察される即時または遅延現象中に特に観察される。
表現“移植片拒絶反応またはアレルギーまたは自己免疫反応を誘発する抗原構造”は好ましくは卵、大豆及びミルクのような食品中に存在する主要アレルギー抗原、特に、牛のミルクからのウシベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）、植物、カビ、薬剤（特に抗生物質）及び花粉中に存在する主要アレルギー抗原、動物、特に毛及び毒液、特にすずめばち毒液中に存在する主要アレルギー抗原、ダニ目に対する、ハウスダスト中に存在するダニに対するアレルギー反応の主要抗原（デルマトファゴイデス・プテロニッシヌス（Dermatophogoides pteronyssinus）（これは皮癬

亜目のダニである）の抗原Ｐ１）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumagatus）の主要抗原、及び葡萄球菌性腸毒素Ｂ（ＳＥＢ）からなる群から選ばれた抗原を意味する。
抗原または抗原の混合物の他の非限定的例はまたここに参照迄に組み入れられるPharmacia ＡＢによる刊行物ＩＳＢＮ−９１−９７０４７５−５−４中に記載されている。
“抗原構造”はまた自己免疫疾患を誘発する抗原複合体であることができる。好ましくはこの抗原構造は狼瘡（ＳＬＥ）またはショーグレーン病、特に形質膜または１００ＫＤより大きな重量を持つ膜ＤＮＡを含むこの形質膜の一部、特に参照迄に公開番号を組み入れられる特許出願ＷＯ ９６／１３７２３中に記載されているものに特異的である。
自己免疫疾患を誘発する抗原複合体の他の非限定的例はまたRoitt I. M. により（Essential Immunology, Blackwell Scientific Publication（ch. １４）ＩＳＢＮ ０−６３２−０１９９４−８）及びHumbel R. L. により（Auto-anticorps et maladies auto-immunes［Autoantibodies and autoimmune diseases］,Ed. Scientifiques Elsevier（１９９４）ＩＳＢＮ ２−９０６０７７−５８−５）記載されている。
この抗原構造はまた主要組織適合座（ＭＨＣ Ｉ及び／またはＭＨＣ II）または個体に対して特異的であり移植片拒絶現象（体液輸注を含む）に関与するそれらの座の一部であることができる。
本発明による適切な医薬または食品賦形剤はこの発明による組成物の患者への投与のための非毒性適合物質のような添加物または担体であることができる。使用される適切な医薬または食品賦形剤は選択された投与の方式に依存するであろう。特に、経口投与のためにはこれらの賦形剤は水溶液、シロップ、ロゼンジ、カプセル等からなることができる。クリームまたは軟膏のような特に皮膚投与のための他の医薬賦形剤は投与の形式によって選ぶことができる。
当業者はまた医薬賦形剤を皮下、皮内、静脈、筋内または鼻または口吸入等を介しての非経口投与の機能に適合させることができる。
本発明による組成物中に存在する活性化合物のパーセントは患者のタイプ、治療する病状及び投与の経路に依存するであろう。投与量は製品に対する患者の寛容さ、並びに投与速度によってのみ制限されるであろう。
投与濃度は特に投与量を薬量学によって予想することによって、上述の病状徴候及び症状が減少し、好ましくは排除されるように選ばれるであろう
本発明者は予想に反して、この発明による医薬及び／または食品組成物が前記抗原構造で誘発される患者の免疫応答を改変することを可能とすることを発見した。患者の免疫応答の改変は特に特許出願ＷＯ ９６／３６８８０に記載された方法と技術によりまたは当業者に良く知られた治療患者の臨床分析のいずれかの方法（予防法を含む）により検出し定量化することができる。
本発明の今一つの特徴は移植片拒絶反応またはアレルギーまたは自己免疫反応を誘発する抗原構造に対する患者の免疫応答を改変するように設計された薬剤の調製のためのこの発明による組成物の使用に関する。特に、本発明はアトピー性または非アトピー性アレルギーを脱感作することを意図した薬剤の調製のためのこの発明による医薬及び／または食品組成物の使用に関する。
本発明の今一つの特徴は、所望によりアレルギー反応、自己免疫反応及び移植片拒絶現象を減少しまたは中和させるための特定の製品（特にアザチオプリン、ステロイド、抗リンパ球グロブリン、シクロスポリンＡ、ラパミシン（rapamycin）、ＫＦ−５０６（tacrolimus）またはリンフォカイン（特にＩＬ−１０））、及びその類似体及び当業者に良く知られたそれらの作動薬と組み合わせて、移植片拒絶反応の治療または予防のための、上述のアレルギー反応及び自己免疫疾患の予防または治療を意図した薬剤の調製のためのこの発明による医薬及び／または食品組成物の使用に関する。
これらの分子の“類似体”及び“作動薬”なる用語は上述の特定の製品と同じレセプタ上にまたは同じ作用機構を介して作用する他の分子、またはこれらの分子の誘導体を意味する。
本発明はまた移植片拒絶反応またはアレルギーまたは自己免疫反応を誘発する抗原構造に対する患者の免疫応答を改変するようにこの発明による組成物の患者への投与の段階を含む患者の治療的または予防的処置のための方法に関する。
本発明は以下の実施例中に記載された図を参照してより詳細に説明されるであろう。
例
Ａ．検討モデルの基礎
a） 経口経路の使用
経口投与は免疫学的寛容の誘発を可能とし、抗アレルギー脱感作の分野でますます広く適用されている。しかし、それは非経口経路を介して投与する場合より大量の抗原の使用を必要とし、少なくとも数年の期間にわたって使用せねばならない（文献２，３）。服用投与体制及びそれらの周期の最適化は症候性反応（過剰服用の場合のアレルギー症候の反復）を避けるように当業者によって適合化されることができる。この症候性反応はしばしば起こるが、投与された服用量の増加の遅い進行のために危険ではない（文献２）。
b） ペプチド−ストレス蛋白複合体の使用
ストレス蛋白（熱ショック蛋白（ＨＳＰ））は一連の蛋白族を構成し、それらはバクテリアから人間への進化の過程においても高度に保存されており、しかも立体配座構造が変化したまたはその最終立体配座への変化過程にあるペプチドまたは蛋白に結合する能力を持つ（文献４）。
それらはある蛋白の合成またはそれらの除去のためのポリペプチド組合せに導く細胞間輸送への関与を含む、幾つかの役割を持つ。あるものは種々の細胞の表面に圧出され（expressed）、特にガンマ−デルタ形式の抗原のためのレセプタに対するＴリンパ球に対する抗原性付与に寄与することができる。これは粘膜及び消化粘膜と組み合わされたリンパ系器官を集落形成する。
ＨＳＰ７０族のＨＳＰｓを介してのガンマ−デルタ（γ，δ）Ｔリンパ球への抗原付与はタイプII主要組織適合複合体に依存する付与と共に投薬することを可能とする。
ＨＳＰ−ペプチド複合体の実験動物への非経口注射はこれらのペプチドの抗原力を決定しまたは増幅する顕著な補強効果を得ることを可能とする（文献５，６）。
ＨＳＰ６０及びＨＳＰ７０族のあるバクテリアＨＳＰｓはこれらの微生物の感染に関して防護役割を持つ免疫応答のターゲットである。
最近ＨＳＰ６０を含むイー・コリのペプチド抽出物をリウマチ様関節炎にかかった患者に与えることにより、ある有利な効果を伴って、経口的に脱感作を実行することが提案された（文献５，６）。無視できる副作用を考慮して、著者は自己抗原代用物と考えられるこれらの微生物ＨＳＰｓ自体の一つに対して指向された応答を取扱うために他の炎症性症状についての試験を試みることを提案している。
本発明者は予想に反して、ストレス蛋白が消化管のリンパ系システムに対するペプチドを提供し、寛容を誘発するための顕著なベクターを構成することを発見した。腐生性のバクテリアのストレス蛋白は消化管腔内に自然に最も豊富なものであるようにみえる。また食品の消化から導出されたペプチドはＨＳＰ−ペプチド複合体の形成のために利用しうる抗原性フラグメントの最も豊富なマスを構成するものと思われる。しかし、発生したペプチドの豊富さ及びバクテリアＨＳＰｓの推定された限定量がこれらのＨＳＰ−抗原性ペプチド複合体の免疫学的に効果的な量の形成を不確実とし、脱感作を意図する抗原の吸収された量が食品蛋白負荷に関して非常に低い（μｇの数１０倍）のでますます不確実とする。
本発明者は消化管を用いた生体内実験を行う前に、即ち生体外で、純化されたイー・コリストレス蛋白及びペプシンによるＢＬＧの消化から導出されたペプチドを用いて、これらの複合体の形成を促進することを提案した。
c） 血清抗体とＢＬＧのためのモノクローナル抗体間の競合試験の使用
以下にそれぞれＭ６及びＭ８と呼ばれる二つのモノクローナル抗体はＢＬＧ分子上の異なる立体配座エピトープを認識する。それらの異なる定性的特性は個体の血清抗体の全てと競合する単一エピトープのための認識マーカーとして使用される。臨床的研究から症状を有する個体及び無症状個体がこの分子上の、少なくとも一部は異なっているエピトープを認識することが明らかである（文献７）。このエピトープは以下エピトーププロファイルと呼ばれる。
Ｍ６により認識されたエピトープはアレルギー及び症状を有する個体によって特に良く認識される。Ｍ６抗体の無傷ＢＬＧへの結合は健康な子供または成人（血液提供者）の非アレルギー性個体の血清によるよりもミルクに対してアレルギー性である子供の血清によって実際により良好に抑制される。
Ｍ７により認識されたエピトープはアレルギー性個体によるよりも非症状個体によってより良く認識される。Ｍ７抗体のＢＬＧへの結合はアレルギー性個体によるよりも非症状個体によってより良く抑制される。
Ｍ６に対する競合的な抗原結合はアレルギー性個体により認識されたエピトーププロファイルを表す特異性指標として用いられ、そして相補態様で非症状個体により認識されたエピトーププロファイルを表す特異性指標としてＭ７に対する競合が用いられる。
この解釈の正当性は臨床的研究により長期にわたって確認されている。ミルクに対する寛容状態の獲得は非症状個体の標準プロファイルに対して、血清抗体の微細特異性の変換を伴う。
循環する抗体の水準で表したこのエピトープ識別はここでは経口抗原性転形に影響を及ぼす分析ツールとして役立つ。
Ｂ．実験モデル
純化されたストレス蛋白で前結合等され、かつその機能的能力（欠陥ペプチドまたは蛋白への結合能力）が無傷であるベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）のペプシン消化から導出されたペプチドの非常に少量を、飲料水に混入して同系のマウスに与えた。
a） 動物の由来及び飼育条件
８から１６週令の４０個体が牛のミルクの乏しい食事：１３μｇのベータ−ラクトグロブリン／ｇの栄養細粒、で数世代飼育されたＢａｌｂｃマウスの飼育群から取られた。
b） 抗原複合体の調製
不完全消化条件下にアガロース（Sigma）に結合されたペプシンと接触させてＢＬＧが消化され、それから１００００ダルトンフィルターでろ過された。消化生成物（ｐＢ）の濃度は分光光度計により測定された（無傷蛋白の収率３０から５０％）。
１μｇ／ｍｌの燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）が以下のイー・コリストレス蛋白：ＤｎａＫ，ＤｎａＪ，ＧｒｏＥＬ，ＧｒｐＥ（Stressgen）、の１μｇ／ｍｌ溶液で周囲温度で少なくとも１時間インキュベートされた。各組み合わせのそれぞれ１ｍｌが凍結された。
c） 処理群及び複合体の経口薬量
複合体の溶液（１ｍｌ）が解凍後１００ｍｌの水瓶に加えられ、４マウスの各かごに毎日与えられた。複合体の各タイプが８マウスに投与される。対照群は非複合体化ｐＢ抗原を与えられる。
溶液はゼロ時点から週当たり３回２週間（即ち６回）添加された。
d） 抗体応答
各個体の血液試料がゼロ時点及び４週後に後−眼窩叢から取られた。８週後に、動物はエーテルで麻酔をかけられ、それから全採血された。
血清抗体の特異性がＥＬＩＳＡタイプ競合試験により検査された。
e） 競合による抗体特異性試験
ポリスチレンのマルチウエル板が周囲温度で吸収により少量のＢＬＧ（０．３μｇ／ｍｌ重炭酸塩緩衝液）で受動的に覆われ、それからゼラチン（１重量％／容積−Haemacel（Ｒ））で飽和される。
マウス血清がＰＢＳ−ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）−Tween ２０（０．０５％）−ゼラチン（Haemacel−１％）からなる希釈緩衝液（ＰＢＳｄｉｌ）で１００倍に希釈される。
生成した二つのマウスモノクローナル抗体がＢＬＧの立体配座エピトープに関してそれらの特異性のために選択された。それらはビオチン化され、以下に規定される抗原性結合のためにそれらの限界希釈度で使用される。この希釈度はその特定の希釈度で、最大シグナルを可能とするがそれは抗原負荷の如何なる減少にも敏感であり、非処理マウスからの血清のプールで競合的に抑制されることができる。この理由は食品抗原に対する暴露に関して、最少の暴露でさえも非処理マウスはＢＬＧに対して自然抗体を作るからである。
希釈された血清の１００μｌとビオチン化された抗体の１００μｌが二組、ウエル中で一緒に混合される。
周囲温度で一夜インキュベートされた後、西洋ワサビ過酸化酵素に結合されたストレプトアビジンのビオチンへの結合がビオチン量に比例することを利用してモノクローナル抗体の結合が測定される。この過酸化酵素はオルソ−フェニレンジアミン基体を着色する。光学濃度（O.D.）が分光光度計により測定される。バックグラウンドノイズ（b.n.）が抗原を含まないウエルで測定される。最大結合は競合の不存在（モノクローナル抗体のみ）でまたは比較的抑制されない血清の存在のいずれかで規定される。
結果はモノクローナル抗体の結合の抑制のパーセントとして：抑制％＝１００×（試験O.D.−b.n. O.D.）／（最大O.D.−b.n. O.D.）により表される。
抗原で認識されたエピトープのプロファイルと個体の臨床状態間の対応は他の例により確認される：
− ダニ目に対するアレルギーのモデル：
アレルギー性子供における抗ダニ抗体の微細特異性の発展は非経口的及び経口的の両者で誘発された脱感作の影響下のエピトーププロファイルの存在を示す、
− 抗体の発展。
g） 結果
図１は実験データを要約する。
Ｍ６抗体の抑制
図１の左側は種々の処理群に対する、個体血清によるＭ６モノクローナル抗体の結合の平均抑制（＋標準偏差）の変化を示す。
数値データは表１に集められている。
ペプシンで消化されたペプチド（ｐＢ）を与えられる対照群はその平均抑制がゼロ時点の４５％から４週及び８週後には６０％と５９％へと増加する。この変化はスタート時に関して顕著である（ｐ＜０．０５−ペアＴ試験）が、４週後に安定する。
ＤｎａＫ−ｐＢ複合体を与えられる群に対しては、この能力は同じ期間で４８％から５６％そしてそれから７７％に上昇し、後者は対照群におけるよりも大きく（ｐ＜０．０１−非ペアＴ試験）、ゼロ時点に比べて非常に顕著である（ｐ＜０．００１−ペアＴ）。
同様に複合体ＤｎａＪ−ｐＢ，ＧｒｏＥＬ−ｐＢ及びＧｒｐＥ−ｐＢを与えられる群は４週後に非常に顕著な増加を示し、それは更に８週目に上昇する（この値は対応する時点の複合体ＧｒｏＥＬ−ｐＢ及びＧｒｐＥ−ｐＢに対して対照群の値より顕著に高い）。
Ｍ７抗体の抑制
図１の右側は種々の処理群に対する、個体血清によるＭ７モノクローナル抗体の結合の平均抑制（＋標準偏差）の変化を示す。
数値データは表２に集められている。
ペプシンで消化されたＢＬＧペプチド（ｐＢ）を与えられる対照群はゼロ時点の７０％から４週及び８週で５２％と５７％に落ちる平均抑制能力を持つ。この変化は４週後に安定するけれども顕著である（ｐ＜０．０１−ペアＴ試験）。
ＤｎａＫ−ｐＢ複合体を与えられる群に対しては、この能力は対照群における如く、既に４週で顕著に減少し、６８％から５１％に落ちる。
しかし、結果は８週で１７％に急落し（ｐ＜０．００１−ペアＴ）、これは対応試験に対する対照群のそれよりきわだって低い（ｐ＜０．０１−非ペアＴ試験）。
この変化はＤｎａＪ−ｐＢ複合体で処理された群に対するそれに相似する。
ＧｒｏＥＬ−ｐＢ複合体を与えられる群に対しては、抑制力の減少は直ちに最大であり、４週から２８％に達し、８週で同じ水準の３０％のまま残る。
ＧｒｐＥ−ｐＢ複合体を与えられる群においては、抑制力の減少はまた直ちに最大となり、４週から７２％から２２％に落ちるが、続いて４１％の平均水準に戻り、減少するように見える。
h） 結論
主要ミルク抗原、この例ではベータ−ラクトグロブリン、の酵素的消化から導出されたペプチドの、この発明によるストレス蛋白と組み合わされた複合体の形の、かつ経口経路を介しての投与は循環抗体により認識されたエピトープのプロファイルの過激で非常に速い改変をもたらす。これらの抗体は食品を介して抗原に暴露された全ての個体中に自然に存在する。この経路を介して少量の抗原に慢性的に暴露されたマウスのモデルにおいて、短期間に渡って投与された抗原の服用量は自然に摂取された量よりはるかに低く、非常に低いものである（複合体の形で処理された個体当たり及び１日当たり０．２５μｇに対し、通常の食餌では個体当たり及び１日当たり１５０μｇと推定される）。
変化の速度は血清抗体、主としてＩｇＧｓの半減期が３週であるのでますます顕著であり、これは８週目に２週のみの処理の終わりに存在する抗体のなお４分の１であるべきであることを意味する。用いられた全てのストレス蛋白は有効であった。ＤｎａＫ−ｐＢ複合体による第二実験において、１０倍低い服用量（０．１μｇ／１００ｍｌ瓶／週当たり３日）を使用したにもかかわらず、下限服用量を決定する試みは成功しなかった。
Ｃ．主要組織適合性抗原に関する経口誘発寛容
１．実験モデル
同系動物（Ｂａｌｂｃマウス）がそれらの飲料水中に溶解された蛋白製剤を与えられる。それは他の系統の同系マウスからの組織適合性抗原のフラグメントを含み、それからの如何なる移植片もそれらは拒絶するであろう（Ｃ３Ｈマウス）。
寛容発生効果はこれらのフラグメントがバクテリアストレス蛋白（この場合イー・コリからのＤｎａＫ）と組み合わされるとき強化されると予想される。
対照として、マウスの一群が、同様な方法で、ベータ−ラクトグロブリン（ミルクの主要抗原）から同様に得られたペプチドフラグメントを持つＤｎａＫの複合体を与えられる。
経口感作が経口調剤のために使用されるのと同じタイプの外来リンパ球の系統に関してはリンパ球反応性を特に弱め、無関係の第三系統に関しては弱めないであろうことが予想されるべきである。
２．材料及び方法
a） 動物
Ｂａｌｂｃ系統の同系マウスの飼育群から取られる１２マウスの３群が６動物のかごで飼育される。各群は２週間、飲料水の瓶に混入された次の調剤の一つを週当たり３配分の割合でかつ水１００ｍｌ当たり１μｇの複合体の投与量で与えられる（１日おきにかつ週末はなしで）：
− ＤｎａＫ−ベータ−ラクトグロブリンペプチドの複合体（対照製剤）
− ＣＨ３マウスからのペプシン消化脾臓リンパ球膜ペプチドの溶液（組織適合性抗原のフラグメントを含む）
− イー・コリからの純化ＤｎａＫ（Stressgen）と組み合わされたこれらのペプチドの複合体。
b） 獲得した寛容の試験（生体外で）
この試験は単方向混合リンパ球培養に基づいている。
反応細胞は試験動物の脾臓から分離される。リンパ単球細胞はficoll-isopaque混合物（Pharmacia）による密度勾配の遠心分離後に得られる。それらは２−メルカプトエタノール、グルタミン、ゲオマイシン及び１０％子牛血清を添加された、重炭酸塩とHepesとで緩衝された、１ｍｌ当たり４００万個の細胞を含むＲＰＭＩ１６４０培養媒地を用いて再懸濁される。
刺激細胞は同じ方法で異なる系統のマウスから、それらのＭＨＣから得られた：Ｃ３Ｈ系統はドメスチック（ＤＯＭ）系統である。
それらはそれらの増殖能力を阻止するためにマイトマイシンの存在下で１時間インキュベートされ、次に反応細胞と同じ条件下で再懸濁される。
リンパ球培養
反応細胞の懸濁液と刺激細胞の等容量（０．１ｍｌ）をポリスチレン培養板の丸底ウエル中で混合したものが三組準備され、それらは続いて空気／ＣＯ₂（容量で９５／５％）で充満された湿ったインキュベータ中で３７．５℃で５日間インキュベートされる。
各マイクロ培養ウエルは培養停止の１６時間前にトリチウム化されたチミジン（Amersham）２Ｃ／ｍＭの２μｃを与えられる。これは細胞核を保持するガラス繊維膜上で各マイクロ培養物をろ過するＭＡＳＨ II機を用いて実行される。
各ペレットの核放射能（これはＤＮＡ中へのチミジンのディノボ取り込みを反映する）が液体シンチレーションカウント（Packard Tricarb）により測定される。
結果は分当たりのカウント数で表され、個体スケールでの同じ培養物の３試料の平均を表す。
c） 実験法
試料は二つの異なる時点で取られる：
− 調剤の一つの経口投与の開始に続く第３週中、
− 第７週中。
動物は各期間当たり３回犠牲とされる。
各培養実験は処理された群当たり２動物を含む。
混合リンパ球培養は並行に調製される：
a） Ｃ３Ｈ起源のマイトマイシン処理細胞に関して
b） ＤＯＭ起源のマイトマイシン処理細胞に関して。
d） ペプチドの調製
適当なマウス系統のリンパ球（２０００万個）が脾臓から分離される。これはほぼ等量のＴリンパ球とＢリンパ球の混合物であり、かくしてタイプＩとIIの抗原を産生する。それらは超音波で処理され（３×１０秒）、それから１０分間１０００×ｇで遠心分離される。上澄み液が集められ同じ方法で再遠心分離される。次に、上澄み液は８０００×ｇで二回遠心分離される。最終上澄み液は細胞膜に富んでおり、細胞核片及びゴルジ装置は含んでいない。それはそれからアガロースビーズに結合されたペプシンにより、グリシン緩衝液中でｐＨ２で、３７℃で１時間３０分間消化を受けさせる。アガロースビーズを分離するためにおだやかに遠心分離し、ＴＲＩＳ緩衝液でｐＨ７に中和した後に、混合物はフィルター（Millipore、限界１０ｋＤ）を通してろ過される。約５００μｇのＬＭｐと呼ばれるペプチド（分光光度計による決定）が得られる。
５０μｇのペプチドの溶液がの５０μｇのＤｎａＫ（Stressgen）溶液と混合され、ＤｎａＫ−ＬＭｐ複合体を形成する。
ベータ−ラクトグロブリンペプチド（Ｂｐ）とのＤｎａＫ複合体は純化されたベータ−ラクトグロブリンのペプシン消化から導出されたペプチドを用いて同じ方法で作られた（上記参照）。
３．結果
３週間処理後（図２）
ＤｎａＫ−ＬＭｐ複合体を与えられたマウスの群はマイトマイシン処理Ｃ３Ｈ細胞（Ｃ３Ｈｍ）の刺激に最も低く応答する。
これはペプチドＬＭｐ単独を与えられた群と異なり（ｐ＜０．０２；Ｔ−試験）、ＤｎａＫ−Ｂｐ対照複合体を与えられたものに等しい（ｐ＜０．０１；Ｔ−試験）。
しかし、ペプチド単独の投与（ＤｎａＫなし）はある効果を持つことに注目されるべきである。なぜならこの群は対照群（ｐ＜０．０１；Ｔ−試験）より顕著に低く応答するからである。
しかし、この応答抑制の特異性は三つの群のリンパ球反応性が第三の、無関係系統（ＤＯＭｍ）のマイトマイシン処理細胞に関して均等であるという事実により保証される。
経口投与停止後７週（図３）、または４週後
三つの群間の差は全く明白である。ＤｎａＫ−ＬＭｐで処理された群は膜ペプチド単独を与えられた群（ｐ＜０．０２；Ｔ−試験）及び対照群（ｐ＜０．０１；Ｔ−試験）の両者に関して最も抑制される。
ペプチド単独の投与は再び対照群（ｐ＜０．０１；Ｔ−試験）に関して応答の減少を可能とする。
応答の特異性は無関係系統（ＤＯＭｍ）のマイトマイシン処理細胞に関して並行試験によりもう一度確認され、そして三つの別個に処理された群が同じように反応することが確認された。
ＫとＤ水準での及び極めて低量のＡ−Ｅ水準での両者によるかつ二週間のＨ−２システムにおける非適合性により特徴づけられるマウス系統からの脾臓リンパ球のペプシン消化により得られたペプチドの投与は、生体外で、免疫応答性リンパ球の無条件応答を強力に減ずるという効果を持ち、これは通常この非適合性を示す。
この減少はペプチド−ＤｎａＫ複合体の形のこのタイプのペプチドの付与により強化される。
この減少は特異的であり種々の変化に関して応答の能力に決して到達せず、それは寛容化（tolerization）のために使用された系統に関係しない。
Ｄ．同種異系の細胞の移植に関する同系マウスの寛容
１．モデル及び実験計画
マウス系統：
− 寛容化された動物のためのＢａｌｂｃ
− （同種異系の）移植される細胞を寄付し、混合されたリンパ球培養（ＭＬＣ）中の細胞を刺激する動物のためのＣ３Ｈ。
それらは６動物のかご内で飼育される。各群は処理当たり１２動物からなる。
経口処理は先の手順により実行される。
実験計画
複合体は飲料水中で投与した：
０日目，２日目，４日目，７日目及び９日目
同種異系移植：２０×１０⁶個の腹腔内Ｃ３Ｈ脾臓細胞：
１６日目
犠牲、脾臓の収集及び脾臓細胞の培養：
移植後１５週
同種異系細胞の検出及びカウント
a） ＭＨＣタイプIIを産生する細胞の存在によるもの
二方向同系混合培養の機能試験。
処理され移植されたマウスの脾臓細胞が非処理（ナイーブな）同系マウス（Ｂａｌｂｃ）からの細胞と共に培養される。
通常、もし処理され移植された動物の脾臓細胞の内容が同系細胞単独で構成されるなら予想される増殖応答は存在しない。
他方、生体内の移植片の生着を示唆する、同種異系細胞の存在はいわゆるナイーブな、非寛容細胞によるＭＬＣタイプの増殖をもたらし、この増殖は外来細胞の数が大きいほど比例的に大きくなる。
移植片の生着の大きさの度合を評価するために、応答の相対的定量化の試みが既知の増大する量のＣ３Ｈ同種異系細胞を同一量（２００×１０³細胞／ウエル）のナイーブで応答する細胞に加えることにより得られた服用量／応答曲線に関して実行される。
b） ＭＨＣタイプＩを産生する細胞の存在によるもの
脾臓細胞の懸濁液の蛍光色素またはフィコエリスリンに結合された、Ｃ３ＨマウスのＭＨＣタイプＩに特有のマウスモノクローナル抗体：Ｈ−２ｋｋ（Serotec）を用いる流動細胞蛍光分析による免疫蛍光の直接カウント。
２．結果
図４で分かるように、腹膜移植後１５週の、ＤｎａＫ−Ｃ３Ｈマウスリンパ球膜ペプチド複合体で処理された群の脾臓細胞はマイトマイシン処理Ｃ３Ｈ細胞での刺激に応答することができない。これは同種異系寛容の誘発の証拠である。
ペプチド単独で処理された群はまたより小さい程度で寛容化される。
ＤｎａＫ−ベータ−ラクトグロブリンペプチドで処理された群は全く寛容的でない。
更に、Ｃ３Ｈ以外の組織不適合性系統起源の、他の同種異系個体群で刺激された混合培養は全て同様である。これは処理がＭＬＣ応答能力を損なわないかまたは変えないこと、処理の効果が膜ペプチド起源のマウス系統に全く特異的であることの証拠である。
図５に示されるように、処理も移植もされていない動物からの細胞のＭＬＣ応答が移植された動物（この場合これはＣ３Ｈ起源のものである）からの脾臓細胞の混合物中の外来細胞の存在を示すのに使用される。
ＬＭｐ及びＤｎａＫ−ＬＭｐで移植される前に経口処理されたマウスの脾臓は同種異系の要素を含むと思われる。なぜならそれらはＤｎａＫ−無関係ペプチド（ベータ−ラクトグロブリン）複合体で処理された対照群の応答とは異なる非常に顕著に増殖性の応答を起こすからである。上記複合体はバックグラウンドノイズと同様の応答を持つ。
比較目的のために、一連の混合培養が既知の増大する量のＣ３Ｈ細胞と並行して実施された（図６）。それらは外来細胞の量に比例する増殖応答を起こす。
移植された動物からのかつＤｎａＫ−ＬＭｐ複合体で寛容化された脾臓細胞で記録された平均応答水準は約３０％のＣ３Ｈ細胞の含量に相当すると考えられる。
脾臓中の移植タイプの細胞の存在はＣ３ＨのＭＨＣ Ｉに特有の抗体（Ｈ−２ｋｋ）を使用する免疫蛍光により測定される（表５）。ＤｎａＫ−ＬＭｐで処理された群は平均して１４．７％のこの抗体を含み、この値は他の二つの群のそれよりも顕著に高い。
同種抗原の存在は移植された動物脾臓細胞が血清の不存在下に３７℃でしばらくの間放置されるとすれば観察することができ、これはこれらの抗原を再圧出することができることが必須であることを示唆し、かくしてこれらの抗原の存在は生体内で抗−Ｈ−２ｋｋ抗体により（全く可能性だけであるが）改変されることができよう。これは応答Ｔ細胞に純粋に由来する寛容に対して移植片の寛容の今一つの機構を追加する。

Claims (25)

1. 免疫学的寛容を誘発するために使用される医薬組成物であって、それが適切な医薬賦形剤と共に、イー・コリからのストレス蛋白及び移植片拒絶反応、アレルギー反応または自己免疫反応を誘発する抗原構造の少なくとも一つの立体配座型または連続型エピトープを含むことを特徴とする医薬組成物。
2. 医薬賦形剤が粘膜または皮膚投与のために適していることを特徴とする請求の範囲１に記載の医薬組成物。
3. ストレス蛋白とエピトープが複合体を形成することを特徴とする請求の範囲１または２に記載の医薬組成物。
4. エピトープが前記抗原構造の加水分解により得られることを特徴とする請求の範囲１〜３のいずれか一つに記載の医薬組成物。
5. 加水分解が酵素的加水分解であることを特徴とする請求の範囲４に記載の医薬組成物。
6. 酵素的加水分解がペプシンによるものであることを特徴とする請求の範囲５に記載の医薬組成物。
7. ストレス蛋白がストレス蛋白ＧｒｏＥＬ，ＧｒｐＥ，ＤｎａＫまたはＤｎａＪからなる群から選ばれることを特徴とする請求の範囲１〜６のいずれか一つに記載の医薬組成物。
8. 抗原構造がミルク中に存在する主要アレルギー抗原、植物中に存在する主要アレルギー抗原、動物の毛及び動物の毒液、ダニ目に対して、ハウスダスト中に存在するダニに対してアレルギー反応する主要抗原（デルマトファゴイデス・プテロニッシヌスの抗原Ｐ１）、アスペルギルス・フミガタスの主要抗原、葡萄球菌性腸毒素Ｂ（ＳＥＢ）及びタイプＩまたはIIの主要組織適合座からなる群から選ばれたアレルゲンであることを特徴とする請求の範囲１〜７のいずれか一つに記載の医薬組成物。
9. 抗原構造が牛のミルクからのウシベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）、花粉、及びすずめばち毒液からなる群から選ばれたアレルゲンであることを特徴とする請求の範囲８に記載の医薬組成物。
10. アザチオプリン、ステロイド、抗リンパ球グロブリン、シクロスポリンＡ、ラパミシン、ＫＦ５０６（tacrolimus）、またはリンフォカインからなる群から好ましくは選ばれた免疫抑制薬、またはそれらの混合物を含むことを特徴とする請求の範囲１〜９のいずれか一つに記載の医薬組成物。
11. 移植片拒絶反応、アレルギー反応または自己免疫反応と関連した病状に特異的な抗原構造に関して患者の免疫応答を改変することを意図した薬剤の調製のための、請求の範囲１〜１０のいずれか一つに記載の医薬組成物の使用。
12. アトピー性または非アトピー性アレルギーを脱感作することを意図した薬剤の調製のための、請求の範囲１〜９のいずれか一つに記載の医薬組成物の使用。
13. 自己免疫疾患の治療または予防のためを意図した薬剤の調製のための、請求の範囲１〜９のいずれか一つに記載の医薬組成物の使用。
14. 自己免疫疾患がＳＬＥ（全身性エリテマトーデス病）、グージェロ−ショーグレーン症候群（またはショーグレーン病）及び類リウマチ多発関節炎と関連した感染からなる群から選ばれた病状、並びにサルコイドーシス及びオステオペニアのような病状、脊椎関節炎、強皮症、多発性硬化症、筋萎縮性横硬化症、甲状腺機能亢進症、アジソン病、自己免疫溶血性貧血、クローン病、ゴッドパスチュアー症候群、グラベス病、ハシモト甲状腺炎、突発性紫斑出血、インシュリン依存性糖尿病、筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、後連鎖球菌性糸球体腎炎、乾癬及び自発不妊症からなる群から選ばれることを特徴とする請求の範囲１３に記載の医薬組成物の使用。
15. 移植片拒絶反応の治療または予防のためを意図した薬剤の調製のための、請求の範囲１〜１０のいずれか一つに記載の医薬組成物の使用。
16. 免疫学的寛容を誘発するために使用される食品組成物であって、それが適切な食品賦形剤と共に、イー・コリからのストレス蛋白及び移植片拒絶反応、アレルギー反応または自己免疫反応を誘発する抗原構造の少なくとも一つの立体配座型または連続型エピトープを含むことを特徴とする食品組成物。
17. 食品賦形剤が粘膜または皮膚投与のために適していることを特徴とする請求の範囲１６に記載の食品組成物。
18. ストレス蛋白とエピトープが複合体を形成することを特徴とする請求の範囲１６または１７に記載の食品組成物。
19. エピトープが前記抗原構造の加水分解により得られることを特徴とする請求の範囲１６〜１８のいずれか一つに記載の食品組成物。
20. 加水分解が酵素的加水分解であることを特徴とする請求の範囲１９に記載の食品組成物。
21. 酵素的加水分解がペプシンによるものであることを特徴とする請求の範囲２０に記載の食品組成物。
22. ストレス蛋白がストレス蛋白ＧｒｏＥＬ，ＧｒｐＥ，ＤｎａＫまたはＤｎａＪからなる群から選ばれることを特徴とする請求の範囲１６〜１９のいずれか一つに記載の食品組成物。
23. 抗原構造がミルク中に存在する主要アレルギー抗原、植物中に存在する主要アレルギー抗原、動物の毛及び動物の毒液、ダニ目に対して、ハウスダスト中に存在するダニに対してアレルギー反応する主要抗原（デルマトファゴイデス・プテロニッシヌスの抗原Ｐ１）、アスペルギルス・フミガタスの主要抗原、葡萄球菌性腸毒素Ｂ（ＳＥＢ）及びタイプＩまたはIIの主要組織適合座からなる群から選ばれたアレルゲンであることを特徴とする請求の範囲１６〜２２のいずれか一つに記載の食品組成物。
24. 抗原構造が牛のミルクからのウシベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）、花粉、及びすずめばち毒液からなる群から選ばれたアレルゲンであることを特徴とする請求の範囲２３に記載の食品組成物。
25. アザチオプリン、ステロイド、抗リンパ球グロブリン、シクロスポリンＡ、ラパミシン、ＫＦ５０６（tacrolimus）、またはリンフォカインからなる群から好ましくは選ばれた免疫抑制薬、またはそれらの混合物を含むことを特徴とする請求の範囲１６〜２４のいずれか一つに記載の食品組成物。

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