ES2354941T3 - Composición farmacéutica o alimentaria para el tratamiento de patologías asociadas a un rechazo de injerto. - Google Patents

Abstract

Composición farmacéutica y/o alimentaria que contiene con un vehículo farmacéutico y/o alimentario adecuado, una proteína de estrés y al menos un epítopo conformacional o secuencial de una estructura antigénica que induce un rechazo de injerto.

Description

Objeto de la invención

La presente invención se refiere a una nueva composición farmacéutica o alimentaria destinada al trata-miento de patologías asociadas a un rechazo de injerto.

Campo tecnológico en el que se basa la invención. 5

Desde hace una docena de años, estudios controlados describen la desensibilización que se produce tras la administración oral de alergenos (1). Este método se basa en el hecho de que la administración oral de un antígeno facilita la adquisición de una tolerancia inmunológica. La vía digestiva constituye el modo de contacto del organismo con antígenos, de origen alimentario o microbiano. Sin embargo, las reacciones alérgicas son raras. La administración por vía oral de glóbulos rojos de borrego (GRB) a ratas impide a éstas producir más tarde anticuerpos 10 anti-GRB después de una inyección subcutánea, mientras que sin toma oral previa, la respuesta alérgica está pre-sente. Este fenómeno constituye inmunológicamente lo que se denomina tolerancia oral.

Este método de desensibilización por vía oral ha sido validado en estudios prospectivos y controlados, y permite reducir los riesgos de anafilaxia, en particular para el polen de abedul y los ácaros. El método es ya accesi-ble en el mercado de vacunas mediante una presentación en forma bebible (vendida por la sociedad Laboratoire des 15 Stallergènes - Paris).

Por otra parte, se puede considerar que el beneficio en términos de protección de la alergia a la leche de los niños de pecho que está constatado desde la introducción de nuevas fórmulas de leche en polvo predigeridas enzimáticamente, resultaría de la inducción de tolerancias inmunológicas por la presentación de antígenos en forma de péptidos. 20

Sin embargo, es difícil predecir o constatar la eficacia de la desensibilización. La observación clínica permite, a posteriori, constatar o no la mejora final de los síntomas.

Se sabe, por la solicitud de patente internacional WO96/36880, que se puede detectar y/o cuantificar ligandos específicos de una patología asociada a una respuesta alérgica, auto-inmune o de cáncer de pulmón, por un ensayo de competición entre los ligandos presentes en una muestra con otros ligandos discriminables. Este 25 ensayo se basa en el hecho de que los sujetos alérgicos y sintomáticos reconocen por sus anticuerpos epítopos diferentes de los reconocidos por los anticuerpos de sujetos tolerantes en la misma estructura antigénica específica de dicha patología. Este documento describe, además, la posibilidad de medir la evolución de esta especificidad, en particular en el caso de niños alérgicos a la leche, y la evolución hacia la adquisición in vivo de la tolerancia a la leche. 30

Objetos de la invención

La presente invención tiene por objeto suministrar una nueva composición que puede ser de tipo farmac-éutico o alimentario, que trata de modificar la respuesta inmunitaria del paciente frente a fenómenos de rechazo de injerto, de manera que la respuesta inmunitaria de dichos pacientes se aproxime a la tolerancia natural manifestada por sujetos normales (que permanecen asintomáticos aunque susceptibles de estar expuestos también a esta pato-35 logía).

La presente invención trata igualmente de proporcionar una composición farmacéutica o alimentaria de bajo coste, cuya administración sea facilitada y que pueda ser utilizada de manera profiláctica y/o terapéutica.

Elementos característicos de la invención

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica o alimentaria que contiene un vehículo 40 farmacéutico o alimentario adecuado, una proteína de estrés de una bacteria saprofita (denominada igualmente "heat shock protein" o HSP) y al menos uno de los epítopos (conformacional o secuencial) de una estructura anti-génica que induce un rechazo de injerto. Con preferencia, el vehículo farmacéutico o alimentario de la composición es adecuado para una administración por vía mucosal (especialmente por vía oral) o cutánea.

De forma ventajosa, la proteína de estrés y el epítopo forman un complejo de manera natural (es decir sin 45 formación de enlace covalente) como se describe por Roamn et al., febrero (1994), Fouri et al., The Journal of Biolo-gical Chemistry, Vol. 269, nº 48, pp. 30470-30478 (1994), Palleros et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol.

269, nº 48, pp. 13107-13114 (1994), Grageroov y Gottesman, Journal of Molecular Biology, nº 241, pp. 133-135 (1994), y Schmid et al., Science, Vol. 260, p. 1991 (1994), documentos que se incorporan a la presente memoria como referencias. 50

Según la invención, el epítopo (denominado igualmente determinante antigénico) se obtiene por una hidrólisis, con preferencia enzimática, especialmente por pepsina, de dicha estructura antigénica.

De modo ventajoso. la proteína de estrés es una proteína bacteriana de estrés, por ejemplo, presente en las bacterias saprofitas tales como E. coli.

Entre las proteínas de estrés, se pueden mencionar la proteína de estrés GroEL, las proteínas de estrés GrpE, DnaK o DnaJ tales como las descritas especialmente por Hendrick y Hartl (Annual Review of Biochemistry, nº 62, p. 349 (1993) o las proteínas que en lengua inglesa se denominan heat shock proteins HSP 60, 70, ... 5

Se entiende por "fenómeno de rechazo de injerto, los desórdenes del sistema inmunitario de tipo inme-diato o diferido asociados a los rechazos de injertos de tipo hospedante contra injerto e injerto contra hospedante.

Por ejemplo, una estructura antigénica puede ser un locus del complejo principal de histocompatibilidad (MHC I y/o MHC II) o una porción de éste específica de un individuo y que interviene en los fenómenos de rechazo de injertos (incluyendo transfusiones de fluidos corporales). 10

El vehículo farmacéutico o alimentario adecuado según la presente invención puede ser cualquier aditivo o vehículo, tal como una sustancia compatible, no tóxica para la administraciíón a un paciente de la composición según la invención. El tipo de vehículo farmacéutico o alimentario adecuado utilizado dependerá del modo de admi-nistración elegido. En particular, para la administración oral, estos pueden consistir en disoluciones acuosas, jara-bes, comprimidos, cápsulas, etc. Pueden elegirse otros vehículos farmacéuticos tales como cremas o ungüentos, en 15 función del tipo de administración, en particular para administraciones cutáneas.

El experto en la técnica puede igualmente adaptar el vehículo farmacéutico en función de una adminis-tración subcutánea, intradérmica, intravenosa, intramuscular, parenteral, por vía de inhalación nasal o bucal, etc.

El porcentaje de compuesto activo presente en la composición según la invención dependerá del tipo de paciente, de la patología tratada y de la vía de administración. Las dosis estarán únicamente limitadas por la toleran-20 cia del producto por el paciente, así como por las frecuencias de administración.

Las concentraciones de administración se elegirán en particular de manera que se reduzcan los signos y síntomas de las patologías anteriormente mencionadas y, con preferencia, se supriman, por las dosis de administra-ción previstas por la posología.

De forma inesperada, los inventores han descubierto que la utilización de la composición farmacéutica 25 y/o alimentaria según la invención permite modificar la respuesta inmunitaria de un paciente inducida por dicha es-tructura antigénica. La modificación de la respuesta inmunitaria de un paciente puede especialmente ser detectada y cuantificada según el procedimiento y la técnica descritos en la solicitud de patente WO96/36880 o por cualquier método de análisis clínico del paciente tratado, bien conocido por el experto en la técnica (incluyendo el modo pro-filáctico). 30

La presente invención se refiere a la utilización de la composición según la invención para la preparación de un medicamento destinado a modificar la respuesta inmunitaria de un paciente frente a una estructura antigénica que induce un rechazo de injerto.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a la utilización de la composición farmacéutica y/o ali-mentaria según la invención para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o a la prevención de 35 rechazos de injerto, eventualmente en combinación con un producto específico para disminuir o neutralizar las reac-ciones alérgicas, las reacciones auto-inmunes y los fenómenos de rechazo de injerto (en particular la administración de inmuno-supresores tales como azatioprina, esteroides, globulinas anti-linfocitarias, ciclosporina A, rapamicina, KF-506 (tacrolimus) o linfoquinas (en particular IL-10), sus análogos y sus agonistas bien conocidos por el experto en la técnica. 40

Se entiende por "análogos y agonistas" de estas moléculas, otras moléculas o derivados de estas molé-culas, que actúan sobre el mismo receptor o a través del mismo mecanismo de acción que los productos específicos antes mencionados.

La presente invención se refiere igualmente a un procedimiento de tratamiento terapéutico o profiláctico de un paciente, que comprende la etapa de administración de la composición según la invención a dicho paciente, 45 de manera que se modifique la respuesta inmunitaria del paciente frente a una estructura antigénica que induce un rechazo de injerto.

La presente invención se describirá de modo más detallado refiriéndose a las Figuras de los dibujos descritas en los ejemplos de realización que siguen a continuación.

Ejemplos 50

A. Base del modelo considerado

a) Utilización de la vía oral.

La administración oral permite una inducción de tolerancia inmunológica, y se aplica de forma cada vez más extendida en el dominio de la desensibilización anti-alérgica. Sin embargo, requiere el uso de cantidades más importantes de antígenos que por vía parenteral, y debe extenderse a periodos de al menos varios años (2, 3). La optimización del régimen de dosis administrada y de su periodicidad es adaptable para el experto en la técnica, de forma que se eviten las reacciones sindrómicas (replicación de la sintomatología alérgica en caso de sobredosis), 5 que son frecuentes pero no peligrosas debido a la lenta progresividad del aumento de las dosis administradas (2).

b) Utilización de complejos péptidos-proteínas de estrés

Las proteínas de estrés (heat shock proteins (HSP)) constituyen una serie de familias de proteínas, muy bien conservadas durante la evolución desde las bacterias hasta el hombre, y que tienen la capacidad de unirse a los péptidos o a las proteínas cuya estructura conformacional está alterada o en vía de su conformación definitiva 10 (4).

Estas proteínas tienen varias funciones, cuya participación en el transporte intracelular lleva al ensambla-je polipeptídico para la síntesis de ciertas proteínas o su eliminación. Algunas se expresan en la superficie de dife-rentes células y pueden contribuir a la presentación antigénica, en particular de linfocitos T a los receptores para antígenos de tipo gamma-delta, que colonizan las mucosas y los órganos linfoideos asociados a la mucosa digesti-15 va.

La presentación antigénica por intermedio de las HSP de la familia HSP70, a los linfocitos T gamma-delta (γ, δ) permite prescindir de la presentación dependiente del complejo principal de histocompatibilidad de tipo II.

La inyección parenteral a animales de experimentación de complejos HSP-péptidos permite obtener un notable efecto adyuvante (5, 6) que determina o amplifica el poder antigénico de estos péptidos. 20

Ciertas HSP de bacterias de las familias HSP60 y HSP70 son la diana de respuestas inmunes que tienen un papel protector respecto a la infección por estos gérmenes.

Recientemente se ha propuesto desensibilizar por vía oral dando extractos peptídicos de E. coli que con-tenían HSP60, a pacientes afectados de artritis reumatoide, con un cierto efecto beneficioso (5, 6). Considerando el poco efecto secundario, los autores propusieron intentar el ensayo en otras afecciones inflamatorias para manipular 25 una repuesta dirigida contra una de estas HSP microbianas, considerada como sustituto de un auto-antígeno.

De forma inesperada, los inventores descubrieron que las proteínas de estrés constituían un vector nota-ble para presentar péptidos al sistema linfoide del tubo digestivo e inducir una tolerancia. Las proteínas de estrés de las bacterias saprofitas parecen ser las más abundantes naturalmente en el canal digestivo. Es probable también que los péptidos procedentes de la digestión alimentaria constituyan la masa más abundante de fragmentos anti-30 génicos disponibles para la formación de complejos HSP-péptidos. Sin embargo, la abundancia de péptidos genera-dos y la cantidad supuesta limitada de HSP bacterianas hacen aleatoria la formación de una cantidad inmunológi-camente eficaz de estos complejos HSP-péptidos antigénicos, y esto tanto más cuanto que la cantidad absorbida de antígeno deseado desensibilizante es muy baja (algunas decenas de μg), respecto a la carga proteica alimentaria.

Los inventores propusieron favorecer la formación de estos complejos antes de la llegada al tubo digesti-35 vo, es decir in vitro, utilizando proteínas de estrés de E. coli purificadas y péptidos procedentes de la digestión pepsínica de la beta-lacto-globulina (BLG).

c) Utilización de ensayos de competición entre anticuerpos séricos y monoclonales para BLG

Los dos anticuerpos monoclonales denominados de aquí en adelante M6 y M7 reconocen cada uno un epítopo conformacional diferente en la molécula de BLG. Se utilizan sus propiedades cualitativas diferentes como 40 marcadores de reconocimiento de epítopos singulares en una competición con el conjunto de anticuerpos séricos de un sujeto. Los estudios clínicos pusieron de manifiesto que los sujetos sintomáticos y los sujetos asintomáticos reco-nocen en esta molécula epítopos que, por una parte al menos, eran diferentes (7), lo que se denomina a continua-ción perfiles epitópicos.

El epítopo reconocido por M6 fue particularmente bien reconocido por los sujetos alérgicos y sintomáti-45 cos. La fijación del anticuerpo M6 en BLG intacto fue, en efecto, mejor inhibida por los sueros de niños alérgicos a la leche que por los de sujetos no alérgicos, ya se tratase de niños o de adultos con buen estado de salud (donantes de sangre).

El epítopo reconocido por M7 fue mejor reconocido por los sujetos asintomáticos que por los sujetos alérgicos. La fijación del anticuerpo M7 en la BLG fue mejor inhibida por los sujetos asintomáticos que por los suje-50 tos alérgicos.

Se utilizó la competición de enlace antigénico contra M6 como índice de especificidad que representa el perfil de epítopos reconocido por los sujetos alérgicos, y complementariamente la competición contra M7 como índi-ce de especificidad que representa el perfil de epítopos reconocido por los sujetos asintomáticos.

La validación de esta interpretación se confirmó longitudinalmente por estudios clínicos.

La adquisición de un estado de tolerancia a la leche va acompañada de una conversión de la especifici-dad fina de los anticuerpos séricos, hacia el perfil típico de los sujetos asintomáticos.

Esta discriminación de epítopos expresada a escala de los anticuerpos circulantes es la que sirve aquí de herramienta de análisis para la influencia de la modulación antigénica oral. 5

B. Modelo experimental

Ratones singénicos recibieron, en su agua de bebida, cantidades muy pequeñas de péptidos proceden-tes de la digestión pepsínica de beta-lactoglobulina (BLG) previamente acoplados o no con proteínas de estrés puri-ficadas y cuya capacidad funcional estaba intacta (capacidad de unirse a péptidos o a proteínas alteradas).

a) Origen animal y condiciones de cría. 10

Se tomaron 40 individuos de 8 a 16 semanas en un criadero de ratones Balbc sometidos después de varias generaciones a una alimentación pobre de leche de vaca: 30 μg de beta-lactoglobulina / gramo de gránulos nutritivos.

b) Preparación de complejos antigénicos

La BLG se digirió en contacto con pepsina acoplada a agarosa (Sigma) en condiciones de digestión in-15 completa, y luego se filtró sobre filtro de 10.000 Daltons. La concentración del producto de digestión (pB) se midió por espectrofotometría (rendimiento de 30 a 50% de la proteína intacta).

Se incubaron disoluciones en tampón de fosfato (PBS) de 1 μg/ml con disoluciones de 1 μg/ml de proteí-nas de estrés de las E. coli siguientes: DnaK, DnaJ, GroEL, GrpE (Stressgen) durante una hora al menos, a tempe-ratura ordinaria. Se congelaron partes alícuotas de 1 ml de cada combinación. 20

c) Grupos de tratamiento y posología de los complejos por vía oral

Se añadió una disolución de complejos (1 ml), después de descongelada, al biberón de agua de 100 ml cotidianamente distribuido para cada jaula de cuatro ratones. Cada tipo de complejo se administró a 8 ratones. Un grupo de control recibió el antígeno pB no complejado.

La disolución se añadió 3 veces por semana durante dos semanas (o sea 6 veces), a partir del tiempo 25 cero.

d) Respuesta de anticuerpos

Se realizó una extracción individual de sangre en el plexo retro-orbital, en el tiempo cero y después de cuatro semanas. Los animales se anestesiaron con éter y a continuación se les extrajo sangre, al cabo de 8 sema-nas. 30

La especificidad de los anticuerpos séricos se examinó por un ensayo de competición de tipo ELISA.

e) Ensayo de especificidad de anticuerpos por competición

Placas multipocillos de poliestireno se recubrieron pasivamente, por absorción a temperatura ordinaria, con una pequeña cantidad de BLG (0,3 μg/ml en tampón de hidrógeno-carbonato), y luego se saturaron con gelatina (1%, peso/volumen - Haemacel (R). 35

El suero de ratones se diluyó a 1/100 en tampón de disolución (PBSdil) constituido de: PBS-EDTA (10 mM)-Tween 20 (0,05%)-gelatina (Haemacel-1%).

Se seleccionaron dos anticuerpos monoclonales de ratón producidos por su especificidad con respecto a epítopos conformacionales de BLG. Se biotinizaron y se utilizaron en su dilución límite de fijación antigénica definida de la forma siguiente: la que permite una señal máxima pero sensible a cualquier reducción de la carga de antígeno, 40 a su propia dilución, e inhibible por la competición con una cantidad de suero de ratones no tratados. Estas produje-ron en efecto anticuerpos naturales contra la BLG, en relación con la exposición antigénica alimentaria, incluso mínima.

Se mezclaron en un pocillo 100 μl de suero diluido y de anticuerpo biotinilado, en doble ejemplar.

Después de una incubación de una noche a temperatura ordinaria, se midió la fijación del anticuerpo 45 monoclonal por la retención proporcional de biotina revelada por captación de estreptavidina acoplada a peroxidasa de rábano silvestre. Esta coloreó un sustrato de orto-fenilén-diamina. Se midió la densidad óptica (D.O.) por espec-

trofotometría. Se midió el ruido de fondo (r.f.) en pocillos sin antígeno. Se definió la fijación máxima, bien en ausen-cia de competición (anticuerpo monoclonal solo), o bien en presencia de suero particularmente poco inhibidor.

Los resultados se expresaron en porcentaje de inhibición de la fijación del anticuerpo monoclonal por: % inhib. = 100 x (D.O. del ensayo - D.O. r.f.) / (D.O. máxima - D.O. r.f.).

La correspondencia entre el perfil de epítopos reconocidos en el antígeno y el estado clínico del sujeto 5 (tolerancia o no) se confirmó por otros ejemplos:

- modelo de alergia a los ácaros:

la evolución de la especificidad fina de los anticuerpos antiácaros en los niños alérgicos mostró la exis-tencia de un perfil de epítopos bajo el efecto de la desensibilización inducida tanto por vía parenteral como oral, 10

- evolución de los anticuerpos.

g) Resultados

La Figura 1 resume los datos de la experimentación:

Inhibición del anticuerpo M6

En la parte izquierda, se representan las evoluciones de los medios de inhibición (+ la desviación típica) 15 de la fijación del anticuerpo monoclonal M6 por los sueros individuales, para los diferentes grupos de tratamiento.

Los datos en cifras se recogen en la Tabla 1.

El grupo de control que recibió los péptidos digeridos por pepsina (pB) vio aumentar su capacidad media de inhibición de 45 a 60%, y 59% después de 4 y 8 semanas. Esta variación fue significativa (p < 0,05 - ensayo T doble) con respecto al principio, pero estable después de 4 semanas. 20

Para el grupo que recibió los complejos de DnaK-pB, esta capacidad pasó de 48 a 56% y luego 77% en el mismo periodo, siendo esta última más importante que en el grupo de control (p < 0,01 - ensayo T no doble) y muy significativo con respecto al tiempo cero (p< 0,001 - T doble).

De igual modo, los grupos que recibieron los complejos DnaJ-pB, GroEL-pB y GrpE-pB mostraron una elevación muy significativa después de 4 semanas y que se acentuó todavía en la octava semana (situada bien por 25 encima del valor del grupo de control para los complejos GroEL-pB y GrpE-pB en el momento correspondiente).

Inhibición del anticuerpo M7

En la parte derecha de la Figura 1, se representan las evoluciones de los medios de inhibición (+ la des-viación típica) de la fijación del anticuerpo monoclonal M7, por los sueros individuales, para los diferentes grupos tratados. 30

Los datos en cifras se incluyen en la Tabla 2.

El grupo de control que recibió los péptidos de BLG digeridos por pepsina (pB) tenía una capacidad me-dia de inhibición que disminuyó de 70 a 52%, y 57% en 4 y 8 semanas. Esta variación fue significativa (p < 0,01 - ensayo T doble), aunque estable después de 4 semanas.

Para el grupo que recibió los complejos DnaK-pB, esta capacidad se redujo ya significativamente en la 35 cuarta semana, pasando de 68 a 51%, como en el grupo de control.

Pero el resultado bajó a 17% en la octava semana (p < 0,001 - T doble), lo que fue claramente inferior al del grupo de control para la muestra correspondiente (p < 0,01 - ensayo T no doble).

La evolución fue paralela a la del grupo tratado con los complejos de DnaJ-pB.

Para el grupo que recibió complejos de GroEL-pB, la reducción del poder inhibidor fue, de entrada, 40 máxima, alcanzando 28% desde la cuarta semana, y permaneció al mismo nivel de 30% en la octava semana.

En el grupo que recibió complejos GrpE-pB, la reducción del poder inhibidor fue también, de entrada, máxima, pasando de 72 a 22% desde la cuarta semana, pero pareció aumentar luego alcanzando un porcentaje medio de 41%.

h) Conclusión

La administración de péptidos procedentes de la digestión enzimática de un antígeno principal de leche, en el caso de la beta-lactoglobulina, en forma de complejos unidos a proteínas de estrés, según la invención, y por vía oral, implicó una modificación radical y muy rápida del perfil de los epítopos reconocidos por los anticuerpos circulantes. Estos anticuerpos estuvieron presentes naturalmente en todos los sujetos expuestos al antígeno para su alimentación. En un modelo de ratones, expuestos crónicamente a una pequeña cantidad del antígeno por esta vía, 5 la dosis de antígeno administrada durante un breve lapso de tiempo fue muy pequeña, lejos por debajo de la canti-dad ingerida naturalmente (estimación 0,25 μg por sujeto y por día de tratamiento en forma de complejos, y 150 μg por sujeto y por día en la alimentación corriente).

La rapidez del cambio fue más notable cuando la semi-vida de los anticuerpos séricos, principalmente de los IgG fue 3 semanas, lo que significa que en la octava semana, debería aún subsistir la cuarta parte de los anti-10 cuerpos presentes al final del tratamiento de solamente 2 semanas. Todas las proteínas de estrés utilizadas fueron eficaces. En una segunda experiencia con complejos DnaK-pB. una tentativa de determinar una dosis límite inferior no tuvo éxito, a pesar del uso de dosis hasta 10 veces inferiores (0,1 μg / biberón de 100 ml / 3 días por semana.

C. Tolerancia inducida oralmente respecto a los antígenos del complejo principal de histocompatibilidad.

I. Modelo experimental 15

Animales singénicos (ratones Balbc) recibieron una preparación proteica disuelta en su agua de bebida. Esta preparación contenía fragmentos de antígenos de histocompatibilidad de ratones singénicos de otra raza, que rechazarían cualquier injerto (ratones C3H).

Se espera el efecto tolerógeno de manera reforzada cuando estos fragmentos estén asociados a una proteína de estrés de bacterias (aquí DnaK de E. coli). 20

Como control, un grupo de ratones recibió de la misma manera un complejo de DnaK con fragmentos peptídicos, obtenidos de forma análoga, a partir de beta-lactoglobulina (antígeno principal de la leche).

Se debería esperar que la sensibilización oral debe atenuar de forma específica la reactividad linfocitaria respecto de una cepa de linfocitos extraños del mismo tipo que los utilizados para la preparación oral y no frente a una tercera cepa no emparentada. 25

2. Material y método

a) animales:

Se tomaron 3 grupos de 12 ratones en un criadero de ratones singénicos de la raza Balbc que se criaron en jaulas de 6 animales, Cada grupo recibió durante 2 semanas una de las preparaciones siguientes en el biberón de agua de bebida, a razón de 3 distribuciones por semana (un día sobre dos y no el fin de semana) y una dosis de 30 1 μg de complejo por 100 ml de agua:

- un complejo de Dnak-péptidos de beta-lactoglobulina (preparación de control);

- una disolución de péptidos de membrana linfocitaria de bazo de ratón C3H digerida por pepsina (que contenía fragmentos de antígenos de histocompatibilidad);

- un complejo de estos péptidos asociado a Dnak purificado de E. coli (Gen de estrés). 35

b) Ensayo de tolerancia adquirida (in vitro)

Este ensayo se basó en un cultivo linfocitario mixto unidireccional.

Las células que respondían se aislaron a partir del bazo de los animales que se iban a ensayar. Las células linfomonocitarias se obtuvieron después de centrifugación en gradiente de densidad con una mezcla de ficoll-isopaque (Farmacia). Se resuspendieron con ayuda de 4 millones de células/ml en medio de cultivo RPMI 1640 40 tamponado en Hepes y con bicarbonato, suplementado con 2-mercapto-etanol, glutamina, geomicina, y de suero de vaca al 10%.

Las células estimulantes se obtuvieron de la misma manera, de ratones de razas diferentes a nivel de su MHC: la raza C3H fue una raza doméstica (DOM).

Se incubaron durante una hora en presencia de mitomicina, a fin de bloquear su potencial de multiplica-45 ción. Se resuspendieron luego en las mismas condiciones que las células que respondían.

Cultivo linfocitario:

Se mezcló un volumen igual de suspensión (0,1 ml) de células que respondían y de células estimulantes, en 3 ejemplares, en pocillos de fondo redondo de placas multipocillos de cultivo, de poliestireno, para ser incubadas después durante 5 días en una incubadora de aire/CO2 (95/5%; vol/vol), humidificada, a 37,5ºC.

Cada pocillo de microcultivo recibió 2 μc de timidina tritiada con 2 C/mM (Amersham) 16 horas antes de la detención del cultivo que se realizó con ayuda de un aparato MASH II que filtró cada microcultivo sobre una mem-5 brana de fibra de vidrio que retuvo los núcleos celulares.

La radiactividad nuclear de cada sedimento que refleja la incorporación de novo de timidina en el ADN, se midió por recuento mediante centelleo de líquidos (Packard Tricarb).

Los resultados se indican en cuentas por minuto y representan el valor medio de 3 muestras del mismo cultivo a escala individual. 10

c) Planificación experimental

Las tomas de muestras tuvieron lugar en 2 momentos diferentes:

- durante la 3ª semana que siguió al comienzo de la administración oral de una de las preparaciones;

- durante la 7ª semana.

Los animales se sacrificaron 3 veces por periodo. 15

Cada experiencia de cultivo empleó 2 animales por grupo tratado.

El cultivo linfocitario mixto se realizó paralelamente:

a) frente a células tratadas con mitomicina de origen C3H,

b) frente a células tratadas con mitomicina de origen DOM.

d) Preparación de péptidos 20

Se aislaron linfocitos (20 millones) de una raza de ratones apropiada, a partir del bazo. Se trató de una mezcla de linfocitos T y B en cantidades aproximadamente iguales y, por tanto, portadores de antígenos de tipo I y II. Se trataron por ultrasonidos (3 x 10 segundos) y luego se centrifugaron a 1.000 g durante 10 minutos. El líquido sobrenadante se recogió y se centrifugó de la misma manera. A continuación, se centrifugó el líquido sobrenadante en dos muestras de 8.000 g. El último sobrenadante estuvo enriquecido en membranas celulares y liberado de resi-25 duos de núcleo celular y de aparato de Golgi. Se sometió luego a una digestión por pepsina acoplada a bolas de agarosa, a pH 2 en tampón de glicina, durante 1 hora 30 minutos y a 37ºC. Después de la centrifugación suave para separar las bolas de agarosa, y neutralización a pH 7 por tampón TRIS, se filtró la mezcla sobre filtro (Millipore limite 10 kD). El rendimiento fue del orden de 500 μg de péptido (determinación por espectrofotometría) denominado LMp. 30

Se mezcló una disolución de 50 μg de péptido con una disolución de 50 μg de Dnak (gen de estrés) para formar un complejo Dnak-LMp.

El complejo Dnak con péptido de beta-lactoglobulina (Bp) se formó de la misma manera, utilizando pépti-dos procedentes de la digestión pepsínica de beta-lactoglobulina purificada (véase supra).

3. Resultados 35

Al cabo de 3 semanas de tratamiento (Figura 2)

El grupo de ratones que había recibido el complejo Dnak-LMp respondió al menos bien a la estimulación de células C3H tratadas con mitomicina (C3Hm).

Este fue diferente (p < 0,02; ensayo T) del grupo que recibió el péptido LMp sólo, e igualmente el que recibió el complejo testigo Dnak-Bp (p < 0,01; ensayo T). 40

Sin embargo, es preciso advertir que la administración del péptido sólo (sin Dnak) tiene igualmente un efecto, ya que este grupo es significativamente menos apto para responder que el grupo testigo (p <0,01; ensayo T).

Sin embargo, la especificidad de la inhibición de respuesta está garantizada por el hecho de que la reac-tividad linfocitaria de los tres grupos era equivalente respecto a células tratadas con mitomicina de una tercera raza, no emparentada (DOMm). 45

Al cabo de 7 semanas (Figura 3), o sea 4 semanas después de la detención de la administración oral

Las diferencias entre los 3 grupos quedaron bien marcadas. El grupo tratado con Dnak-LMp fue el más inhibido tanto respecto al que recibió el péptido membranal solamente (p < 0,02; ensayo T) como al grupo testigo (p < 0,01; ensayo T).

La administración del péptido sólo permitió también una atenuación de respuesta frente al grupo testigo 5 (p < 0,01; ensayo T).

La especificidad de la respuesta fue también, una vez verificada por el ensayo paralelo frente a las célu-las tratadas con mitomicina de una raza no emparentada (DOMm) y en donde los 3 grupos tratados diferentemente reaccionaron de la misma forma.

La administración de péptidos obtenidos por digestión pepsínica de linfocitos del bazos de razas de rato-10 nes caracterizadas por una incompatibilidad en el sistema H-2 tanto en los niveles K y D como en A-E en cantidades extremadamente pequeñas y durante dos semanas, tiene como efecto atenuar fuertemente la respuesta incondicio-nal de linfocitos inmuno-competentes, in vitro, que confirma habitualmente esta incompatibilidad.

Esta atenuación se reforzó por la presentación de este tipo de péptido en forma de complejos péptidos-Dnak. 15

Esta atenuación fue específica y no alcanzó en ningún caso la capacidad de respuesta respecto a una variedad diferente, sin relación con la raza utilizada para la tolerancia.

D. Tolerancia de los ratones singénicos respecto a un injerto de células alogénicas

1. Modelo y esquema experimental

Razas de ratones: 20

- Balbc para los animales convertidos en tolerantes

- C3H para los animales donantes de células para injertar (alogénicas) y de células estimulantes en cultivo linfocita-rio mixto (CLM).

Se criaron en jaulas de 6 animales. Cada grupo estuvo constituido por 12 animales por tratamiento.

El tratamiento oral se efectuó según el protocolo precedente. 25

Esquema experimental:

Complejos administrados en el agua de bebida:

días 0, 2, 4, 7 y 9

Injerto alogénico: 20 x 106 células esplénicas de C3H en forma intra-peritoneal:

día 16 30

Sacrificio, recogida de bazos y puesta en cultivo de las células del bazo:

15 semanas después del injerto

Detección y numeración de las células alogénicas

a) Por la presencia de células portadoras de MHC tipo II

Ensayo funcional en cultivo mixto singénico bidireccional. 35

Las células del bazo de ratones tratados e injertados se pusieron en cultivo con células de ratones singé-nicos (Balbc) no tratados (naturales).

Normalmente, no ha de esperarse ninguna respuesta proliferante si el contenido de las células del bazo de animales tratados e injertados estuviera compuesto únicamente de células singénicas.

Por el contrario, la presencia de células alogénicas, que señalan la aceptación del injerto in vivo, debería 40 implicar una proliferación de tipo MLC para las células denominadas naturales, no tolerantes, tanto más importantes cuanto más elevado sea el número de células extrañas.

Para evaluar el orden de magnitud de la aceptación del injerto, se efectuó una tentativa de cuantificación relativa de la respuesta por referencia a una curva dosis/respuesta obtenida añadiendo cantidades conocidas y cre-cientes de células alogénicas C3H a una cantidad idéntica de células naturales y de respuesta (200 x 103 célu-las/pocillo).

b) Por la presencia de células portadoras de MHC tipo I 5

Numeración directa por inmunofluorescencia en citofluorometria de flujo utilizando un anticuerpo mono-clonal de ratón específico de MHC tipo I del ratón C3H : H-2 kk (Serotec), acoplado a fluoresceína o a ficoeritrina en una suspensión de células del bazo.

2. Resultados

Como se ve en la Figura 4, 15 semanas después del injerto peritoneal, las células del bazo del grupo 10 tratado por complejos DnaK-péptidos de membranas linfocitarias de ratón C3H, fueron incapaces de responder a la estimulación por células C3H tratadas con mitomicina. Esto indicó la inducción de una tolerancia alogénica.

El grupo tratado por el péptido sólo fue igualmente tolerado en una menor medida.

El grupo tratado por DnaK-péptido de beta-lactoglobulina no fue tolerante del todo.

Por otra parte, los cultivos mixtos estimulados por otra población proveniente de una raza histo-15 incompatible diferente de C3H, fueron todos semejantes. Esto indicó que ningún tratamiento alteró ni diferenció la capacidad de respuesta en MLC, y que el efecto de tratamiento fue bien específico de la raza de ratón de la que provenían los péptidos de membranas.

Como se representa en la Figura 5, se utilizó la respuesta en MLC de células de animales ni tratados, ni injertados, para revelar la existencia de células extrañas en una mezcla de células del bazo de animales injertados, 20 que serían, por tanto aquí de origen C3H.

Se vió que los bazos de ratones tratados oralmente antes del injerto por LMp y DnaK-LMp contenián elementos alogénicos, puesto que dieron lugar a una respuesta proliferativa muy significativamente diferente de la respuesta del grupo controlado tratado por un complejo DnaK-péptidos irrelevantes (beta-lactoglobulina). Esta última tuvo una respuesta que no se diferenció del ruido de fondo. 25

Como ejemplo comparativo, una serie de cultivos mixtos se llevaron paralelamente con cantidades cono-cidas y crecientes de células C3H (Figura 6). Estos dieron lugar a una respuesta proliferativa proporcional a la canti-dad de células extrañas.

El nivel medio de respuesta registrado con células del bazo de animales injertados y hechos tolerantes por complejos DnaK-LMp correspondió a un contenido de aproximadamente 30% de células C3H. 30

La presencia de células de tipo injertado en el bazo se midió por inmuno-fluorescencia, con ayuda de un anticuerpo específico de MHC I de C3H (H-2kk) (Tabla 5). El grupo tratado por DnaK-LMp contenía 14,7% de valor medio, valor significativamente superior al de los otros grupos.

Esta presencia de alo-antígenos no fue observable más que con la condición de dejar reposar las células del bazo de animales injertados durante al menos una sesión a 37ºC en ausencia de suero. Esto sugirió que era 35 indispensable permitir la re-expresión de estos antígenos cuya presencia sería así modulada in vivo, probablemen-te, por anticuerpos anti-H-2kk. Esto añadió otro mecanismo de tolerancia del injerto a la tolerancia puramente dirigi-da a las células T que respondían.

Tabla 1

Inhibiciones del anticuerpo monoclonal M6 que se une al nBLG para sueros de ratón individuales: evolución en fun-ción del tiempo en función del tipo de complejo administrado oralmente.

% de inhibición de la unión de M6

Media

Desviación típica Número de casos

Grupo 1 : Control (dBLG solamente)

PREL

1 45,0100 8,4146 8

PREL

2 60,6750 3,9304 8

PREL

3 59,6338 17,4714 8

Grupo 2 : complejos dBLG-DnaK

PREL

1 48,4350 7,0540 8

PREL

2 56,3675 5,6146 8

PREL

3 77,0975 3,8966 8

Grupo 3 : dBLG-DnaJ

PREL

1 23,7350 15,3990 8

PREL

2 65,7013 6,2958 8

PREL

3 65,3863 4,7270 8

Grupo 4 : dBLG-GroEL

PREL

1 24,9538 4,7972 8

PREL

2 56,0100 4,3929 8

PREL

3 80,0287 1,9401 8

Grupo 5 : dBLG-GrpE

PREL

1 37,3313 6,4248 8

PREL

2 56,6962 5,5641 8

PREL

3 87,1525 7,8731 8

Tabla 2

Inhibiciones del anticuerpo monoclonal M7 que se une al nBLG para sueros de ratón individuales: evolución en fun-ción del tiempo en función del tipo de complejo administrado oralmente.

% de inhibición del enlace de M7

Media

Desviación típica Número de casos

Grupo 1 : Control (dBLG solamente)

PREL

1 70,0658 3,5541 8

PREL

2 52,8224 2,3458 8

PREL

3 57,0592 7,8996 8

Grupo 2 : complejos dBLG-DnaK

PREL

1 68,9145 2,6698 8

PREL

2 51,6908 3,0857 8

PREL

3 17,2697 8,0473 8

Grupo 3 : dBLG-DnaJ

PREL

1 78,4276 3,4832 8

PREL

2 50,8553 3,9778 8

PREL

3 26,9145 3,2069 8

Grupo 4 : dBLG-GroEL

PREL

1 73,9671 3,1679 8

PREL

2 28,5132 8,6072 8

PREL

3 30,2829 14,2174 8

Grupo 5 : dBLG-GrpE

PREL

1 72,8355 4,7722 8

PREL

2 22,2961 9,5040 8

PREL

3 41,3684 6,4331 8

5

Tabla 3

Títulos de anticuerpos anti (natural) nBLG después de las transformaciones logarítmicas: evolución en función del tiempo en función del tipo de complejo administrado oralmente.

Ln de títulos (A.U.)

Media

Desviación típica Número de casos

Grupo 1 : Control (dBLG solamente)

PREL

1 3,8526 0,4547 8

PREL

2 4,2162 0,3395 8

PREL

3 4,2059 0,2946 8

Grupo 2 : complejos dBLG-DnaK

PREL

1 3,9738 0,7957 8

PREL

2 4,3749 0,6353 8

PREL

3 3,2562 0,5057 8

Grupo 3 : dBLG-DnaJ

PREL

1 3,7073 0,4435 7

PREL

2 4,1348 0,5475 8

PREL

3 4,3917 0,5047 8

Grupo 4 : dBLG-GroEL

PREL

1 4,3714 0,4215 8

PREL

2 3,6419 0,4704 8

PREL

3 3,9964 0,2724 8

Grupo 5 : dBLG-GrpE

PREL

1 4,1526 0,6401 8

PREL

2 4,1739 0,4464 8

PREL

3 3,6126 0,4873 8

Tabla 4

Diferencias de la inhibición entre la unión de los anticuerpos M6 y M7 en nBLG

% de inhibición de la unión de M6 - % de inhibición de la unión de M7

Media

Desviación típica Número de casos

Grupo 1 : Control (dBLG solamente)

PREL

1 -25,0558 9,0035 8

PREL

2 7,8526 5,6470 8

PREL

3 2,5745 19,8676 8

Grupo 2 : complejos dBLG-DnaK

PREL

1 -20,4795 8,5253 8

PREL

2 4,6767 6,1131 8

PREL

3 59,8278 9,2686 8

Grupo 3 : dBLG-DnaJ

PREL

1 -54,6926 13,8705 8

PREL

2 14,8460 6,4665 8

PREL

3 38,4718 5,6903 8

Grupo 4 : dBLG-GroEL

PREL

1 -49,0134 3,9824 8

PREL

2 27,4968 10,6337 8

PREL

3 49,7459 14,6732 8

Grupo 5 : dBLG-GrpE

PREL

1 -35,5043 4,8959 8

PREL

2 34,4002 13,4093 8

PREL

3 45,7841 8,7931 8

Tabla 5

Células alogénicas persistentes (H-2kk +) en los bazos de ratones Balbc injertados con células C3H.

Tratamiento oral

DnaK-Bp

Linfocito Membrana péptido (LMp) sólo DnaK-LMp

1,0%

0,9% 14,2%

1,5

2,8 25,0

0,5

3,6 9,2

0,5

3,7 10,4

Media

DT Media DT Media DT

0,9%

0,5 2,7% 1,3 14,7% 7,2

Ensayos T acoplados:

DnaK-LMp / DnaK-Bp: p = 0,026 5

DnaK-LMp / LMp : p = 0,052

REFERENCIAS

1. Patterson, R. et al., Allergy Proc., Vol.15 (5), pp. 239-264 (1994).

2. Ferrick, D.A., Mak-TW Tolerance and Self-Reactivity in V gamma 1.1 C gamma 4 transgenic mice.

3. Staines, U. et al., J. Rheumatol., Vol. 54 (3), pp. 145-154 (1995). 10

4. Polla, B.S. et al., Clin. Exp. Allergy, Vol. 23(7), pp. 548-556 (1993).

5. Healy, A.M. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., Vol. 663, pp. 319-330 (1992).

6. Revillard, J.P. et al., Dev. Viol. Stand., Vol. 77, pp. 31-37 (1992).

7. Bousquet, J. et al., Allergy, Vol.49, pp. 31-36 (1994).

15

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Composición farmacéutica y/o alimentaria que contiene con un vehículo farmacéutico y/o alimentario adecuado, una proteína de estrés y al menos un epítopo conformacional o secuencial de una estructura antigénica que induce un rechazo de injerto.
2. 2. Composición farmacéutica y/o alimentaria según la reivindicación 1, caracterizada porque el vehículo 5 farmacéutico y/o alimentario es adecuado para una administración por vía mucosal o por vía cutánea.
3. 3. Composición farmacéutica y/o alimentaria según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la pro-teína de estrés y el epítopo forman un complejo.
4. 4. Composición farmacéutica y/o alimentaria según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el epítopo se obtiene por una hidrólisis ventajosamente enzimática, con preferencia con 10 pepsina, de dicha estructura antigénica.
5. 5. Composición farmacéutica y/o alimentaria según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracte-rizada porque la proteína de estrés es una proteína de estrés bacteriana.
6. 6. Composición farmacéutica y/o alimentaria según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la estructura antigénica es el locus del complejo principal de histocompatibilidad de tipo I o 15 II.
7. 7. Composición farmacéutica y/o alimentaria según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque contiene un inmunosupresor elegido preferentemente entre el grupo constituido por azatio-prina, esteroides, globulinas anti-linfocitarias, ciclosporina A, rapamicina, FK 506 (tacrolimus) o linfoquinas, sus análogos, sus agonistas o una mezcla de estos. 20
8. 8. Utilización de la composición farmacéutica y/o alimentaria según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para la preparación de un medicamento destinado a modificar la respuesta inmunitaria de un paciente frente a una estructura antigénica específica de una patología asociada a un rechazo de injerto.
9. 9. Utilización de la composición farmacéutica y/o alimentaria según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o a la prevención de rechazos de injerto. 25