JPH0545570B2 - - Google Patents
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Description
背 景
ADP−リボシル化トキシンの不活性化をホル
ムアルデヒド及びグルタールアルデヒド等の架橋
剤を用いて検討した。Cryz等“シユードモナス
アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)ト
キシンAに対するホルマリンのトキソイド化効
果:生物学的、化学的及び免疫化学的研究”
(Effect of Formalin toxoiding on
Pseudomonas aeruginosa Toxin A:
Biological、Chemical、and Immunochemical
Studies)、Infec and Immun、32巻、2号、759
−768頁、1981年5月、はそのようなトキソイド
を記載している。或る種のそのようなトキソイド
についての2つの問題は、毒性型への転換及び抗
原性及び免疫原性の消失であつた。そのようなト
キソイドが毒性状態に戻る可能性があるために、
これまでそのようなトキソイドから人間の抗血清
を得ること、或は活性ワクチンとして使用するこ
とが不可能であつた。 発明の概要 ピー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)からの
エキソトキシンAのようなADP−リボシル化ト
キシンは、ある種の光に不安定なアフイニテイー
試薬によつてトキソイドへ変換可能であるという
ことが見出された。この工程は非可逆的であり、
トキソイドはもとの毒素の抗原性及び免疫原性を
保持している。従つて、このトキソイドはもとの
毒性によつてひきおこされる特定の病気に対する
免疫原として有用であり、或はピー.アエルギノ
ーサ(P.aeruginosa)の場合、このトキソイドを
細菌のエンドトキシンに対するワクチン、又はそ
れから調製した抗血清と結合させ、グラム陰性細
菌に対してこれまで可能であつたよりも、より広
範囲の保護機能を付与することが可能である。 本発明の1つの目的は、抗原性及び免疫原性を
有し、毒性状態に自発的に逆戻りしないADP−
リボシル可トキシンに由来する細菌トキソイドで
ある。 本発明の他の1つの目的は、相当するトキシン
を或る種の光に不安定な親和性試薬(affinity
reagent)と反応させることによつてそのような
トキソイドを生産する方法に関するものである。 更にもう1つの本発明の目的は、ピー.アエル
ギノーサ(P.aeruginosa)からの特定のトキソイ
ドを或る種のエンドトキシンワクチンと結合する
ことである。このワクチンは哺乳動物に於て抗血
清を誘導するために使用することが可能である。
それから得た免疫グロブリンは、急性のグラム陰
性菌による敗血症を療法学的に治療するために、
或は予防的に使用することが可能であり、ピー.
アエルギノーサ(P.aeruginosa)細菌の場合に
は、この最も恐ろしい敗血症を予防し、治療する
助けとなる。別法として、本ワクチンは免疫を活
性化することによつてこれらの感染を予防するた
めに使用することが可能である。 発明の詳細な記載 本発明では使用し得るADP−リボシル化トキ
シンは、当業界に於てADP−リボシルトランス
フエラーゼ活性及びNAD−グリコヒドロラーゼ
活性を示すトキシン類である。これらには、シユ
ードモナスアエロギノーサ(Pseudomonas
aeruginosa)からのエキソトキシン−A、大腸
菌(E.coli)ATCC31361からの熱不安定な
(LT)エンテロトキシン、ビブリオ コレラ
(Vibrio cholerae)ATCC14035からのコレラエ
ンテロトキシン、及びグラム陰性細菌の場合に
は、コリネバクテリウム ジフテリアエ
(Corynebacterium diphtheriae)ATCC19409か
らのエキソトキシンが含まれる。これらのトキシ
ンはすべて既知のものである。 ピー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)は、グ
ラム陰性細菌に共通なエンドトキシンだけでなく
エキソトキシン−Aと呼ばれるエキソトキシンも
生産する。このエキソトキシンは分子量約70000
の蛋白質であり、細胞内に於てはNADに対する
基質特異性を有する酵素として作用し、エロンゲ
ーシヨンフアクター2のADP−リボシル化作用、
これによつて標的細胞内での蛋白質合成を不可逆
的に阻害するが、によつてその毒作用を発現す
る。本発明のトキソイドは酵素活性が著しく減少
しているが(つまり無毒である)、高い抗原性及
び抗免疫性を有する。この物質は哺乳類に於ける
抗対を高めるために使用される。生成した免疫プ
ラズマは単価の、或はエンドトキシンに対する一
般的な抗原に対して活性を強めた免疫血漿(又は
それから単離した抗体)と併用して、グラム陰性
敗血症に対する2価の免疫治療又は予防剤として
使用される。 当該トキソイドをキーホールアオガイヘモシア
ニンのような蛋白に結合させることにより、トキ
ソイドの免疫応答を高めることも本発明の範囲内
に入る。 本発明の本法に於ては、好ましくは水溶液中、
1:100か1:10000の範囲のモル比でエキソトキ
シンを光に不安定なアフイニテイー試薬と混合す
る。1:1300の割合が良いことが見出されてい
る。反応試薬容器を0℃に保ち、容器内に不活性
ガス(例えばN2)を満たすことによつてエキソ
トキシン及びトキソイドの分解は最少限に抑えら
れる。この混合物を有効量の非−変性化光、例え
ばそのスペクトルのU.V.部分が殆んどない光、
にあつる。光による活性化の後で反応物質を溶出
カラムを通過させることなどによつて精製する。 好ましい光に不安定なアフイニテイー試薬に8
−アジドアデノシンである。本発明の範囲内に含
まれる他のもう1つのものは、8−アジドアデニ
ンであり、これはかなり効率的であることが見出
されている。本発明の方法に於て、8−アジドア
デニン又は8−アジドアデノシンは、光照射した
時に窒素をN2の型で失い、不安定なニトレン中
間体()を形成する。次いで当該ニトレンを
ADP−リボシル化トキシンと結合させ新規トキ
ソイド:各各8−アデニルアミノトキシン及び8
−アデノシルアミノトキシン()を形成させ
る。 式中、RHはADP−リボシル化トキシンであ
る。従つてこの複合体は構造的には次のように表
すことができる。 8−アデニルアミノ トキシン 8−アデノシルアミノ トキシン 式中、RはADP−リボシル化トキシン基であ
る。例えば、ピー.アエルギノーサ(P.
aeruginosa)エキソトキシンA及び8−アジド
アデニンから調製した本発明のトキソイドは、8
−アデニルアミノ ピー.アエルギノーサ(P.
aeruginosa)エキソトキシンAであり、8−ア
ジドデノシンから調製したものは、8−アデノシ
ルアミノ ピー.アエルギノーサ(P.
aeruginosa)エキソトキシンAである。 本発明は以下の調製法及び実施例を引用するこ
とによつて、更に定義されるが、以下の調製法及
び実施例は例示的なものであり、本発明に制限を
加えるものではない。 以下の方法を用いてピー.アエルギノーサ(P.
aeruginosa)エキソトキシンAを調製し、単離、
精製することが可能である。 精製法1 ピー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)の精製
したエキソトキシンA 段階1:DE−52の調製 a 過剰のDE−52(ワツトマンDE−52ジエチ
ルアミノエチルセルロース、予め膨潤させて
おいたもの、乾燥容量で600−700ml)の2バ
ツチを2倍量の水に懸濁して放置する。水を
除いてから、DE−25を再懸濁する。第2回
めの処理によつて微粒の量が著しく減少する
のがわかる。もしこの現象が観察されなかつ
たならば、この操作をもう1度くり返す。 b このDE−52のバツチを粗いガラスフイル
ターにのせ、3200mlの0.5N NaOH、次いで
3200mlの水、3200mlの0.5N HCl、3200mlの
水、3200mlの0.5N NaOHそして最後にPHが
8以下になるまで水で洗う。 c このDE−52を数倍容の0.01M NaCl、
0.01Mトリス緩衝液で洗う。 d 洗浄したDE−52 100mlを用いてK16/40カ
ラムを調製し、このカラムを室温に於て流速
1.4ml/分で流す。このカラムを平衡になる
まで0.05M NaCl、0.01MトリスPH8.0で洗う
(1ないし2日)。 段階2:セフアデツクスG−75カラムの調製 a 136gのG−75(フアルマシア)を3の
0.5M NaCl、0.1MトリスPH8.0中で再加水
し、煮沸して脱気し、次いで一晩かけて4℃
に冷却する。 b フアルマシアK50/100カラムにG−75(約
6hどを4℃で充填し、0.02%重量/容量%の
ナトリウムアジドを含有する緩衝液で洗う。 c このカラムを20mlの緩衝液中の40mgのブル
ーデキストラン2000(フアルマシア)を用い
て、流速0.5ml/分、頭部圧37cmに調節し、
7.6mlづつの分画として集めてチエツクする。
Voは714ml(ベツド容量の40%)であり、希
釈フアクターは5.3であつた。このカラムを
4℃で保存する。 段階3:ヒドロキシアルパルタイト(HTP)カ
ラムの調製 a 乾燥容量120−150mlのヒドロキシルアパル
タイト(バイオーゲルHTP、バイオーラツ
ド130−0420番)を2倍容の0.005M
NaH2PO4、0.1M NaCl、PH8.0緩衝液に懸濁
する。 b フアルマシアK26/40カラムを、4℃、流
速1.5ml/分に於てHTPで充填し、緩衝液で
洗う。 段階4:醗酵 倍地−TSB−D(CM−679) a トリプチカーゼソイブロス(パルチモアバ
イオロジカルラボラトリー(BBL)No.
11768)を、400メツシユ以下のものを除いた
600gのキレツクス100のナトリウム型(バイ
オーラツド142−2852番)と5400mlの水中
(濃縮物×10)、5ないし6時間撹拌すること
により脱鉄する。次いでワツトマンの1番の
紙で過し、使用するまで凍結しておく。 b キレート処理した倍地(上述のa)を、ア
ミコン社DC−30システム中のH10P10中空フ
アイバーカートリツジを通過させることによ
つてダイヤフイルトレーシヨンした。この濃
縮物蒸溜硫中で1×(60)希釈し、過し
て40のTSB−Dを得る。この倍地のPHは
7.0から7.5、塩素イオン濃度は約0.1モルであ
り、過滅菌(0.45μm)する。この倍地を
4℃で保存する。 c 醗酵前日に2のTSB−Dを無菌的に取
りだす。この1600mlに374gのグルタミン酸
1ナトリウム塩、400mlのグリセリンを加え、
溶解するまで室温で撹拌し、0.45μmのフイ
ルターを通して過し、醗酵槽に高栄養倍地
として加え、最終濃度がグルタミン酸1ナト
リウム塩0.05M、1.0%のグリセリンとなる
ようにする。無添加の残りの400mlの倍地を
シードフラスコ用に保存する。 トリプチツク ソイ寒天斜面 a 40gのTSAを1の水中で15分間膨潤させ
る。この混合物を1分間煮沸し、一定量(1.2
×12cmのネジブタ付き試験管当り8ml)を15分
間、121℃、15psiでオートクレーブ滅菌し、次
いで15°の角度に維持して長い斜面をつくる。 倍 地 a ピー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)PA
−103株(ATCC 29260)*の凍結保存物から4
本のTSA(トリプチツクソイ寒天)斜面に各1
白金耳づつ接種し、37℃で18ないし20時間培養
する。 *この株はATCCより取得した。この株はル
イスビル大学のP.V.Liuによつて1976年2月17
日ATCCに寄託されたものである。ATCCによ
ればこの株は現在入手可能であり、少なくとも
西暦2002年まで入手可能の状態が継続される。 b 4本の斜面全部の生育物を、合計4mlの倍地
で洗い流す。この懸濁液1mlづつを用いて、
100mlの無添加TSB−D倍地を含む250mlのコ
ブ付きフラスコ4本に接種する。これを32±1
〓に於て毎分250回の回転で5ないし6時間振
盪培養をする。 c 400mlのシード全部を用いて40の添加TSB
−D倍地に接種する。醗酵倍地をO2で飽和さ
せる。32°±1℃で撹拌しながら培養を行い、
この間PH(範囲7.0−8.0)、光学密度(定常状
態生育期まで)を監視し続け、溶存酸素量を飽
和量の25%以下に保つ。醗酵は18−24時間かか
る。 d この細菌をモデルK遠心分離機(エレクト
ロ−ニユークレオニツクス)を用いた遠心分離
により除去し、上清液を予備−過し、過滅
菌(0.45μm)する。 段階5:濃縮 a H10P10カートリツジを備えたアミコンDC
−10中空フアイバーシステムを用いて上清液
の容量を、ダイアフイルトレーシヨン
(diafiltration)によつて40から3ないし
4に減らす。 b 保持された液に冷水を加えて15にし、PH
を7.0から7.5、塩素イオン濃度が0.02Mとな
るようにする。もしCl-の濃度が十分に現象
しなかつたならば、許容範囲の濃度となるま
でダイアフイルトレーシヨン
(diafiltration)を続ける。 段階6:DE−52バツチ分画 a 2の洗浄したDE−52を希釈した保持液
に加えてうすめ、室温で約2時間、PHを8.0
に維持しながら撹拌する。PHが安定化した
ら、この懸濁液を4℃に冷却し、一晩放置す
る。 b 約14から15の上清液をサイフオンで除
き、残つたセルロースを2.5のガラスフイ
ルター上に注ぐ。減圧して残つた液体を除去
し、湿つたセルロースを得る。 c このセルロースを過法によつて、2.5
の0.01M NaCl、0.01MトリスPH8.0;0.05M
NaCl、0.01MトリスPH8.0;及び0.25M
NaCl、0.01MトリスPH8.0で洗う。このセル
ロースを廃棄する。 d 下記の酵素検定法を行い、更に精製を進め
るに先立つて毒素が0.25M NaCl画分にある
ことを確認する。 e 0.25M NaCl活性画分に、PHを8に維持し
ながら固体の硫安を加えて70%飽和とし、沈
澱させる。活性画分を一晩放置し、沈澱を完
全にする。 段階7:G−75脱塩 a この沈澱画分を良く混合し、懸濁液の約1/
3を除去する。残りは4℃に保存する。 b 一部を4℃に於て16000×gで20分間遠心
分離し(ソルバールRC5B、GSAローター、
10000回転/分)、上清液をすてる。 c ペレツトを0.02%のナトリウムアジドを含
有する30mlの0.5M NaCl、0.1MトリスPH8.0
緩衝液中にゆるやかに再懸濁する。これを4
℃、17000×gで5分間遠心分離して透明化
する。次いで予備過し(0.8μm)次いで
過滅菌(0.45μm)する。 d この試料をG−75のカラムにより1.5ml/
分の流速でクロマトグラフイーを行い、7.5
mlづつの分画として集める。各分画を向流免
疫電気泳動(ハイランドCEPサプライパツ
ケージ、ハイランドラボラトリー)によつて
毒素の検定を行い、毒素を含有する画分を集
める。免疫電気泳動は、毒素に対する1価特
異的な馬の抗血清を用いて使つた(段階9−
b参照)。 e 集めた画分を硫安の80%飽和、PH8によつ
て沈澱させ、4℃で保存する。 f 残りのDE−52画分について段階aからe
をもう2回くり返す。次いで沈澱を集める。 段階8:HTP分画 a G−75の沈澱画分を上述したように遠心分
離によつて集める。 b ペレツトを20mlの0.005M NaH2PO4、
0.1M NaClPH7.0の初発緩衝液にゆるやかに
溶かし、2の緩衝液に対して4℃で一晩透
析する。 c この試料をヒドロキシルアパルタイトバイ
オーゲルHTP(バイオーラツド)カラムによ
り、流速1.5ml/分、3ベツト容の0.1M
NaH2PO4、0.1M NaClPH7.0を用いてクロマ
トグラフイーを行う。280nmの光学密度
(O.D.)をベツクマン分光計モデル26で測定
する。次の段階に移る前にこのカラムから吸
収を示さない物質が完全に溶出される。 d 緩衝液を0.06M NaH2PO4、0.1M NaClPH
7.0に変え、7mlづつの分画として集める。
O.D.ピークをCIEによつて検定する。 e 毒素画分を集め、飽和硫安に対し4℃で一
晩透析することによつて沈澱させる。 段階9:DE−52勾配分画 a 4℃に於て、12000×g、10分間の遠心分
離(ソルバールSS34ローター、10000回転/
分)によつて沈澱を集める。次いでこれを5
mlの0.05M NaCl、0.01MトリスPH8.0(初発
緩衝液)にゆるやかに再懸濁し、20℃に於て
1の初発緩衝液に対して18ないし24時間透
析する。 b 0.01MトリスPH8.0中の0.05Mから0.5M
NaClの直線グラジエント1によつてDE−
52のクロマトグラフイーを行う。流速1.4
ml/分で2.5mlづつの分画を集める。毒素の
ピーク(O.D.280nm)は約0.15M Cl-付近で
溶出される。これを1価特異的な馬抗血清を
用い、免疫電気泳動(CIE)を30mAで60分
間行うことにより検定し、集めるべき画分を
決定する。 c 集めた画分のO.D.280nmを測定し、蛋白
濃度を以下の式により計算する: 〔1%溶液O.D.280nm=18.5〕 d 6mlの容器に一部2.5mlを入れ、−70℃で保
存する。 次いで精製したエキソトキシンAを用いて、実
施例1のピー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)
トキソイドを調製する。 実施例 1 ピー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)トキソ
イドの調製 12mgの−アジドアデノシン(Holmes等、J.
Am.Chem Soc.87巻、1772頁(1965年)に従つ
て調製)に10mlのPH7.4の緩衝液(9.5ミリモル
リン酸塩、140ミリモルNaCl)を加え、大部分が
溶けるまで、つまり飽和溶液となるまで振盪す
る。この懸濁液をガラスフイルターを通して過
し、液の濃度を紫外吸収スペクトルで決定す
る。液を上述のPH7.4のリン酸緩衝液で1ない
し50倍にうすめ、λmax282(ε=14500)によつ
て定量する。8−アジドアデノシンの濃度は2.9
×103モルである。この溶液7.5mlを調製方法1か
らのピー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)エキ
ソトキシンA7.5mlと混合する。アジド化合物の
毒素の対する最終モル比は1300:1である。 この溶液を、ポンプで氷水を通じているジヤケ
ツトで取り囲んでいる12mlのパレツクス反応器内
に入れる(2×7.5mlバツチ)。照射する前に反応
溶液を血清キヤツプで栓をする。このキヤツプを
通して皮下注射針を差し込み、次いで容器内の空
気を除去し、窒素を導入する。容器から4インチ
離したところにおいて450Wのハイビア中圧ラン
プ(6794 0360)によつて、冷却しながら光分解
を進行させる。 次いでこの溶液を6本のセフアデツクスPD10
カラム(2.5mlづつ添加し、3.5mlのPH7.4の緩衝液
で溶出)を通過させることによつて脱塩する。溶
出液を60cmの東洋ソーダモレキユラーシーブカラ
ムを用いた高速液体クロマトグラフイーによつて
検定する。この物質(8−アデノシルアミノ ピ
ー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)エキソトキ
シンA)は約68000ダルトンの単一ピークである
ことが判明し、ピーク面積によつて決定した量は
約55±μg/mlに相当した(純粋の毒素を基準と
する)。比色蛋白検定法によつても同じ値が得ら
れた。 実施例 2 毒性の検定 実施例1で調製したエキソトキソドを、細胞毒
性、モルモツト反慮反応及び酵素活性についてエ
キソトキシンAと比較した。 in vitroの微量細胞毒性検定に於ては、我々の
研究室で継続的に維持している細胞ラインからの
マウスの線維芽細胞又はL細胞を使用した。微量
培養中で生育しているこれらのL細胞を、ナノグ
ラム量の精製したエキソトキシンで処理した場
合、顕微鏡的にこれらの細胞が死亡したという証
拠(つまり、正常組織構造の消失、“球形成”及
びプラスチツス表面に対する付着性の消失)が得
られた。これらの可視的な細胞毒性による変化
は、毒素で処理した培養物による〔3H〕チミジ
ン取込みの阻害に対応するものであり、この阻害
率によつて定量化することが可能である。50%阻
害を示す力価は阻害%を、毒素の稀釈の対数の関
数としてグラフ表示することによつて計算され
る。 モルモツトの皮膚試験は、大人のハートレイ白
色モルモツトの毛をそつた場所及び脱毛した場所
の2ケ所に、0.1mlの試験化合物を皮内注射する
ことによつて行う。注射3日後、反応部位の面積
をmm2の単位で測定する。 酵素検定法は、トレーサー(アデニン−14C)−
NADのTCA沈澱生成物への取り込みを測定する
ことによつて、EF−2のADP−リボシル化の程
度を定量化するものである。検定条件下では以下
の反応が生ずる: EF−2+(14C)−NAD試料 ―――→ ―――→ ADP−リボースEF−2(生成物)←ナニコチソアミド
+H+ エキソトキシンの存在はEF−2のADP−リボ
シル化を促進するので、沈澱性生物中の放射能の
量(毎分のカウントからバツクグランドの雑音を
差し引いたもの)は、試料中の毒素の量のものさ
しとなる。もし毒素の量が一定ならば、EF−2
へ取り込まれた放射能の量は時間の関数となる。
種々の時間間隔で検定すると反応速度が明らかと
なる。実施例1で調製したエキソトキソイド試料
及びエキソトキシンAを上述のようにして検定し
て以下ののデータが得られた。
ムアルデヒド及びグルタールアルデヒド等の架橋
剤を用いて検討した。Cryz等“シユードモナス
アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)ト
キシンAに対するホルマリンのトキソイド化効
果:生物学的、化学的及び免疫化学的研究”
(Effect of Formalin toxoiding on
Pseudomonas aeruginosa Toxin A:
Biological、Chemical、and Immunochemical
Studies)、Infec and Immun、32巻、2号、759
−768頁、1981年5月、はそのようなトキソイド
を記載している。或る種のそのようなトキソイド
についての2つの問題は、毒性型への転換及び抗
原性及び免疫原性の消失であつた。そのようなト
キソイドが毒性状態に戻る可能性があるために、
これまでそのようなトキソイドから人間の抗血清
を得ること、或は活性ワクチンとして使用するこ
とが不可能であつた。 発明の概要 ピー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)からの
エキソトキシンAのようなADP−リボシル化ト
キシンは、ある種の光に不安定なアフイニテイー
試薬によつてトキソイドへ変換可能であるという
ことが見出された。この工程は非可逆的であり、
トキソイドはもとの毒素の抗原性及び免疫原性を
保持している。従つて、このトキソイドはもとの
毒性によつてひきおこされる特定の病気に対する
免疫原として有用であり、或はピー.アエルギノ
ーサ(P.aeruginosa)の場合、このトキソイドを
細菌のエンドトキシンに対するワクチン、又はそ
れから調製した抗血清と結合させ、グラム陰性細
菌に対してこれまで可能であつたよりも、より広
範囲の保護機能を付与することが可能である。 本発明の1つの目的は、抗原性及び免疫原性を
有し、毒性状態に自発的に逆戻りしないADP−
リボシル可トキシンに由来する細菌トキソイドで
ある。 本発明の他の1つの目的は、相当するトキシン
を或る種の光に不安定な親和性試薬(affinity
reagent)と反応させることによつてそのような
トキソイドを生産する方法に関するものである。 更にもう1つの本発明の目的は、ピー.アエル
ギノーサ(P.aeruginosa)からの特定のトキソイ
ドを或る種のエンドトキシンワクチンと結合する
ことである。このワクチンは哺乳動物に於て抗血
清を誘導するために使用することが可能である。
それから得た免疫グロブリンは、急性のグラム陰
性菌による敗血症を療法学的に治療するために、
或は予防的に使用することが可能であり、ピー.
アエルギノーサ(P.aeruginosa)細菌の場合に
は、この最も恐ろしい敗血症を予防し、治療する
助けとなる。別法として、本ワクチンは免疫を活
性化することによつてこれらの感染を予防するた
めに使用することが可能である。 発明の詳細な記載 本発明では使用し得るADP−リボシル化トキ
シンは、当業界に於てADP−リボシルトランス
フエラーゼ活性及びNAD−グリコヒドロラーゼ
活性を示すトキシン類である。これらには、シユ
ードモナスアエロギノーサ(Pseudomonas
aeruginosa)からのエキソトキシン−A、大腸
菌(E.coli)ATCC31361からの熱不安定な
(LT)エンテロトキシン、ビブリオ コレラ
(Vibrio cholerae)ATCC14035からのコレラエ
ンテロトキシン、及びグラム陰性細菌の場合に
は、コリネバクテリウム ジフテリアエ
(Corynebacterium diphtheriae)ATCC19409か
らのエキソトキシンが含まれる。これらのトキシ
ンはすべて既知のものである。 ピー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)は、グ
ラム陰性細菌に共通なエンドトキシンだけでなく
エキソトキシン−Aと呼ばれるエキソトキシンも
生産する。このエキソトキシンは分子量約70000
の蛋白質であり、細胞内に於てはNADに対する
基質特異性を有する酵素として作用し、エロンゲ
ーシヨンフアクター2のADP−リボシル化作用、
これによつて標的細胞内での蛋白質合成を不可逆
的に阻害するが、によつてその毒作用を発現す
る。本発明のトキソイドは酵素活性が著しく減少
しているが(つまり無毒である)、高い抗原性及
び抗免疫性を有する。この物質は哺乳類に於ける
抗対を高めるために使用される。生成した免疫プ
ラズマは単価の、或はエンドトキシンに対する一
般的な抗原に対して活性を強めた免疫血漿(又は
それから単離した抗体)と併用して、グラム陰性
敗血症に対する2価の免疫治療又は予防剤として
使用される。 当該トキソイドをキーホールアオガイヘモシア
ニンのような蛋白に結合させることにより、トキ
ソイドの免疫応答を高めることも本発明の範囲内
に入る。 本発明の本法に於ては、好ましくは水溶液中、
1:100か1:10000の範囲のモル比でエキソトキ
シンを光に不安定なアフイニテイー試薬と混合す
る。1:1300の割合が良いことが見出されてい
る。反応試薬容器を0℃に保ち、容器内に不活性
ガス(例えばN2)を満たすことによつてエキソ
トキシン及びトキソイドの分解は最少限に抑えら
れる。この混合物を有効量の非−変性化光、例え
ばそのスペクトルのU.V.部分が殆んどない光、
にあつる。光による活性化の後で反応物質を溶出
カラムを通過させることなどによつて精製する。 好ましい光に不安定なアフイニテイー試薬に8
−アジドアデノシンである。本発明の範囲内に含
まれる他のもう1つのものは、8−アジドアデニ
ンであり、これはかなり効率的であることが見出
されている。本発明の方法に於て、8−アジドア
デニン又は8−アジドアデノシンは、光照射した
時に窒素をN2の型で失い、不安定なニトレン中
間体()を形成する。次いで当該ニトレンを
ADP−リボシル化トキシンと結合させ新規トキ
ソイド:各各8−アデニルアミノトキシン及び8
−アデノシルアミノトキシン()を形成させ
る。 式中、RHはADP−リボシル化トキシンであ
る。従つてこの複合体は構造的には次のように表
すことができる。 8−アデニルアミノ トキシン 8−アデノシルアミノ トキシン 式中、RはADP−リボシル化トキシン基であ
る。例えば、ピー.アエルギノーサ(P.
aeruginosa)エキソトキシンA及び8−アジド
アデニンから調製した本発明のトキソイドは、8
−アデニルアミノ ピー.アエルギノーサ(P.
aeruginosa)エキソトキシンAであり、8−ア
ジドデノシンから調製したものは、8−アデノシ
ルアミノ ピー.アエルギノーサ(P.
aeruginosa)エキソトキシンAである。 本発明は以下の調製法及び実施例を引用するこ
とによつて、更に定義されるが、以下の調製法及
び実施例は例示的なものであり、本発明に制限を
加えるものではない。 以下の方法を用いてピー.アエルギノーサ(P.
aeruginosa)エキソトキシンAを調製し、単離、
精製することが可能である。 精製法1 ピー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)の精製
したエキソトキシンA 段階1:DE−52の調製 a 過剰のDE−52(ワツトマンDE−52ジエチ
ルアミノエチルセルロース、予め膨潤させて
おいたもの、乾燥容量で600−700ml)の2バ
ツチを2倍量の水に懸濁して放置する。水を
除いてから、DE−25を再懸濁する。第2回
めの処理によつて微粒の量が著しく減少する
のがわかる。もしこの現象が観察されなかつ
たならば、この操作をもう1度くり返す。 b このDE−52のバツチを粗いガラスフイル
ターにのせ、3200mlの0.5N NaOH、次いで
3200mlの水、3200mlの0.5N HCl、3200mlの
水、3200mlの0.5N NaOHそして最後にPHが
8以下になるまで水で洗う。 c このDE−52を数倍容の0.01M NaCl、
0.01Mトリス緩衝液で洗う。 d 洗浄したDE−52 100mlを用いてK16/40カ
ラムを調製し、このカラムを室温に於て流速
1.4ml/分で流す。このカラムを平衡になる
まで0.05M NaCl、0.01MトリスPH8.0で洗う
(1ないし2日)。 段階2:セフアデツクスG−75カラムの調製 a 136gのG−75(フアルマシア)を3の
0.5M NaCl、0.1MトリスPH8.0中で再加水
し、煮沸して脱気し、次いで一晩かけて4℃
に冷却する。 b フアルマシアK50/100カラムにG−75(約
6hどを4℃で充填し、0.02%重量/容量%の
ナトリウムアジドを含有する緩衝液で洗う。 c このカラムを20mlの緩衝液中の40mgのブル
ーデキストラン2000(フアルマシア)を用い
て、流速0.5ml/分、頭部圧37cmに調節し、
7.6mlづつの分画として集めてチエツクする。
Voは714ml(ベツド容量の40%)であり、希
釈フアクターは5.3であつた。このカラムを
4℃で保存する。 段階3:ヒドロキシアルパルタイト(HTP)カ
ラムの調製 a 乾燥容量120−150mlのヒドロキシルアパル
タイト(バイオーゲルHTP、バイオーラツ
ド130−0420番)を2倍容の0.005M
NaH2PO4、0.1M NaCl、PH8.0緩衝液に懸濁
する。 b フアルマシアK26/40カラムを、4℃、流
速1.5ml/分に於てHTPで充填し、緩衝液で
洗う。 段階4:醗酵 倍地−TSB−D(CM−679) a トリプチカーゼソイブロス(パルチモアバ
イオロジカルラボラトリー(BBL)No.
11768)を、400メツシユ以下のものを除いた
600gのキレツクス100のナトリウム型(バイ
オーラツド142−2852番)と5400mlの水中
(濃縮物×10)、5ないし6時間撹拌すること
により脱鉄する。次いでワツトマンの1番の
紙で過し、使用するまで凍結しておく。 b キレート処理した倍地(上述のa)を、ア
ミコン社DC−30システム中のH10P10中空フ
アイバーカートリツジを通過させることによ
つてダイヤフイルトレーシヨンした。この濃
縮物蒸溜硫中で1×(60)希釈し、過し
て40のTSB−Dを得る。この倍地のPHは
7.0から7.5、塩素イオン濃度は約0.1モルであ
り、過滅菌(0.45μm)する。この倍地を
4℃で保存する。 c 醗酵前日に2のTSB−Dを無菌的に取
りだす。この1600mlに374gのグルタミン酸
1ナトリウム塩、400mlのグリセリンを加え、
溶解するまで室温で撹拌し、0.45μmのフイ
ルターを通して過し、醗酵槽に高栄養倍地
として加え、最終濃度がグルタミン酸1ナト
リウム塩0.05M、1.0%のグリセリンとなる
ようにする。無添加の残りの400mlの倍地を
シードフラスコ用に保存する。 トリプチツク ソイ寒天斜面 a 40gのTSAを1の水中で15分間膨潤させ
る。この混合物を1分間煮沸し、一定量(1.2
×12cmのネジブタ付き試験管当り8ml)を15分
間、121℃、15psiでオートクレーブ滅菌し、次
いで15°の角度に維持して長い斜面をつくる。 倍 地 a ピー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)PA
−103株(ATCC 29260)*の凍結保存物から4
本のTSA(トリプチツクソイ寒天)斜面に各1
白金耳づつ接種し、37℃で18ないし20時間培養
する。 *この株はATCCより取得した。この株はル
イスビル大学のP.V.Liuによつて1976年2月17
日ATCCに寄託されたものである。ATCCによ
ればこの株は現在入手可能であり、少なくとも
西暦2002年まで入手可能の状態が継続される。 b 4本の斜面全部の生育物を、合計4mlの倍地
で洗い流す。この懸濁液1mlづつを用いて、
100mlの無添加TSB−D倍地を含む250mlのコ
ブ付きフラスコ4本に接種する。これを32±1
〓に於て毎分250回の回転で5ないし6時間振
盪培養をする。 c 400mlのシード全部を用いて40の添加TSB
−D倍地に接種する。醗酵倍地をO2で飽和さ
せる。32°±1℃で撹拌しながら培養を行い、
この間PH(範囲7.0−8.0)、光学密度(定常状
態生育期まで)を監視し続け、溶存酸素量を飽
和量の25%以下に保つ。醗酵は18−24時間かか
る。 d この細菌をモデルK遠心分離機(エレクト
ロ−ニユークレオニツクス)を用いた遠心分離
により除去し、上清液を予備−過し、過滅
菌(0.45μm)する。 段階5:濃縮 a H10P10カートリツジを備えたアミコンDC
−10中空フアイバーシステムを用いて上清液
の容量を、ダイアフイルトレーシヨン
(diafiltration)によつて40から3ないし
4に減らす。 b 保持された液に冷水を加えて15にし、PH
を7.0から7.5、塩素イオン濃度が0.02Mとな
るようにする。もしCl-の濃度が十分に現象
しなかつたならば、許容範囲の濃度となるま
でダイアフイルトレーシヨン
(diafiltration)を続ける。 段階6:DE−52バツチ分画 a 2の洗浄したDE−52を希釈した保持液
に加えてうすめ、室温で約2時間、PHを8.0
に維持しながら撹拌する。PHが安定化した
ら、この懸濁液を4℃に冷却し、一晩放置す
る。 b 約14から15の上清液をサイフオンで除
き、残つたセルロースを2.5のガラスフイ
ルター上に注ぐ。減圧して残つた液体を除去
し、湿つたセルロースを得る。 c このセルロースを過法によつて、2.5
の0.01M NaCl、0.01MトリスPH8.0;0.05M
NaCl、0.01MトリスPH8.0;及び0.25M
NaCl、0.01MトリスPH8.0で洗う。このセル
ロースを廃棄する。 d 下記の酵素検定法を行い、更に精製を進め
るに先立つて毒素が0.25M NaCl画分にある
ことを確認する。 e 0.25M NaCl活性画分に、PHを8に維持し
ながら固体の硫安を加えて70%飽和とし、沈
澱させる。活性画分を一晩放置し、沈澱を完
全にする。 段階7:G−75脱塩 a この沈澱画分を良く混合し、懸濁液の約1/
3を除去する。残りは4℃に保存する。 b 一部を4℃に於て16000×gで20分間遠心
分離し(ソルバールRC5B、GSAローター、
10000回転/分)、上清液をすてる。 c ペレツトを0.02%のナトリウムアジドを含
有する30mlの0.5M NaCl、0.1MトリスPH8.0
緩衝液中にゆるやかに再懸濁する。これを4
℃、17000×gで5分間遠心分離して透明化
する。次いで予備過し(0.8μm)次いで
過滅菌(0.45μm)する。 d この試料をG−75のカラムにより1.5ml/
分の流速でクロマトグラフイーを行い、7.5
mlづつの分画として集める。各分画を向流免
疫電気泳動(ハイランドCEPサプライパツ
ケージ、ハイランドラボラトリー)によつて
毒素の検定を行い、毒素を含有する画分を集
める。免疫電気泳動は、毒素に対する1価特
異的な馬の抗血清を用いて使つた(段階9−
b参照)。 e 集めた画分を硫安の80%飽和、PH8によつ
て沈澱させ、4℃で保存する。 f 残りのDE−52画分について段階aからe
をもう2回くり返す。次いで沈澱を集める。 段階8:HTP分画 a G−75の沈澱画分を上述したように遠心分
離によつて集める。 b ペレツトを20mlの0.005M NaH2PO4、
0.1M NaClPH7.0の初発緩衝液にゆるやかに
溶かし、2の緩衝液に対して4℃で一晩透
析する。 c この試料をヒドロキシルアパルタイトバイ
オーゲルHTP(バイオーラツド)カラムによ
り、流速1.5ml/分、3ベツト容の0.1M
NaH2PO4、0.1M NaClPH7.0を用いてクロマ
トグラフイーを行う。280nmの光学密度
(O.D.)をベツクマン分光計モデル26で測定
する。次の段階に移る前にこのカラムから吸
収を示さない物質が完全に溶出される。 d 緩衝液を0.06M NaH2PO4、0.1M NaClPH
7.0に変え、7mlづつの分画として集める。
O.D.ピークをCIEによつて検定する。 e 毒素画分を集め、飽和硫安に対し4℃で一
晩透析することによつて沈澱させる。 段階9:DE−52勾配分画 a 4℃に於て、12000×g、10分間の遠心分
離(ソルバールSS34ローター、10000回転/
分)によつて沈澱を集める。次いでこれを5
mlの0.05M NaCl、0.01MトリスPH8.0(初発
緩衝液)にゆるやかに再懸濁し、20℃に於て
1の初発緩衝液に対して18ないし24時間透
析する。 b 0.01MトリスPH8.0中の0.05Mから0.5M
NaClの直線グラジエント1によつてDE−
52のクロマトグラフイーを行う。流速1.4
ml/分で2.5mlづつの分画を集める。毒素の
ピーク(O.D.280nm)は約0.15M Cl-付近で
溶出される。これを1価特異的な馬抗血清を
用い、免疫電気泳動(CIE)を30mAで60分
間行うことにより検定し、集めるべき画分を
決定する。 c 集めた画分のO.D.280nmを測定し、蛋白
濃度を以下の式により計算する: 〔1%溶液O.D.280nm=18.5〕 d 6mlの容器に一部2.5mlを入れ、−70℃で保
存する。 次いで精製したエキソトキシンAを用いて、実
施例1のピー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)
トキソイドを調製する。 実施例 1 ピー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)トキソ
イドの調製 12mgの−アジドアデノシン(Holmes等、J.
Am.Chem Soc.87巻、1772頁(1965年)に従つ
て調製)に10mlのPH7.4の緩衝液(9.5ミリモル
リン酸塩、140ミリモルNaCl)を加え、大部分が
溶けるまで、つまり飽和溶液となるまで振盪す
る。この懸濁液をガラスフイルターを通して過
し、液の濃度を紫外吸収スペクトルで決定す
る。液を上述のPH7.4のリン酸緩衝液で1ない
し50倍にうすめ、λmax282(ε=14500)によつ
て定量する。8−アジドアデノシンの濃度は2.9
×103モルである。この溶液7.5mlを調製方法1か
らのピー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)エキ
ソトキシンA7.5mlと混合する。アジド化合物の
毒素の対する最終モル比は1300:1である。 この溶液を、ポンプで氷水を通じているジヤケ
ツトで取り囲んでいる12mlのパレツクス反応器内
に入れる(2×7.5mlバツチ)。照射する前に反応
溶液を血清キヤツプで栓をする。このキヤツプを
通して皮下注射針を差し込み、次いで容器内の空
気を除去し、窒素を導入する。容器から4インチ
離したところにおいて450Wのハイビア中圧ラン
プ(6794 0360)によつて、冷却しながら光分解
を進行させる。 次いでこの溶液を6本のセフアデツクスPD10
カラム(2.5mlづつ添加し、3.5mlのPH7.4の緩衝液
で溶出)を通過させることによつて脱塩する。溶
出液を60cmの東洋ソーダモレキユラーシーブカラ
ムを用いた高速液体クロマトグラフイーによつて
検定する。この物質(8−アデノシルアミノ ピ
ー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)エキソトキ
シンA)は約68000ダルトンの単一ピークである
ことが判明し、ピーク面積によつて決定した量は
約55±μg/mlに相当した(純粋の毒素を基準と
する)。比色蛋白検定法によつても同じ値が得ら
れた。 実施例 2 毒性の検定 実施例1で調製したエキソトキソドを、細胞毒
性、モルモツト反慮反応及び酵素活性についてエ
キソトキシンAと比較した。 in vitroの微量細胞毒性検定に於ては、我々の
研究室で継続的に維持している細胞ラインからの
マウスの線維芽細胞又はL細胞を使用した。微量
培養中で生育しているこれらのL細胞を、ナノグ
ラム量の精製したエキソトキシンで処理した場
合、顕微鏡的にこれらの細胞が死亡したという証
拠(つまり、正常組織構造の消失、“球形成”及
びプラスチツス表面に対する付着性の消失)が得
られた。これらの可視的な細胞毒性による変化
は、毒素で処理した培養物による〔3H〕チミジ
ン取込みの阻害に対応するものであり、この阻害
率によつて定量化することが可能である。50%阻
害を示す力価は阻害%を、毒素の稀釈の対数の関
数としてグラフ表示することによつて計算され
る。 モルモツトの皮膚試験は、大人のハートレイ白
色モルモツトの毛をそつた場所及び脱毛した場所
の2ケ所に、0.1mlの試験化合物を皮内注射する
ことによつて行う。注射3日後、反応部位の面積
をmm2の単位で測定する。 酵素検定法は、トレーサー(アデニン−14C)−
NADのTCA沈澱生成物への取り込みを測定する
ことによつて、EF−2のADP−リボシル化の程
度を定量化するものである。検定条件下では以下
の反応が生ずる: EF−2+(14C)−NAD試料 ―――→ ―――→ ADP−リボースEF−2(生成物)←ナニコチソアミド
+H+ エキソトキシンの存在はEF−2のADP−リボ
シル化を促進するので、沈澱性生物中の放射能の
量(毎分のカウントからバツクグランドの雑音を
差し引いたもの)は、試料中の毒素の量のものさ
しとなる。もし毒素の量が一定ならば、EF−2
へ取り込まれた放射能の量は時間の関数となる。
種々の時間間隔で検定すると反応速度が明らかと
なる。実施例1で調製したエキソトキソイド試料
及びエキソトキシンAを上述のようにして検定し
て以下ののデータが得られた。
【表】
ド
減少率 99% 95% 94%
実施例 3 抗原性検定 エキソトキシン(調製1)及びエキソトキソイ
ド実施例1の試料を1価特異的馬抗血清を用い
て、抗原生の試験をした。以下のデータが得られ
た。
減少率 99% 95% 94%
実施例 3 抗原性検定 エキソトキシン(調製1)及びエキソトキソイ
ド実施例1の試料を1価特異的馬抗血清を用い
て、抗原生の試験をした。以下のデータが得られ
た。
【表】
これらのデータから、トキソイドはもとの毒素
の抗原性をほゞ100%保持していると結論される。 実施例 4 力価検定(抗体応答) マウスに対し第1日に5μgのミヨウバンに吸
収させたトキソイド(ミヨウバン−トキソイド)
を腹腔内に;そして第21日に5μgの水性−トキ
ソイドを静脈内にワクチン接種する。第25日に32
匹の免疫化したマウスから採血に、抗毒素力価を
ELISA検定法で決定する。 血清を1:40、1:160、1:640に稀釈する。
第4−1に於て以下のとりきめを使用している。
の抗原性をほゞ100%保持していると結論される。 実施例 4 力価検定(抗体応答) マウスに対し第1日に5μgのミヨウバンに吸
収させたトキソイド(ミヨウバン−トキソイド)
を腹腔内に;そして第21日に5μgの水性−トキ
ソイドを静脈内にワクチン接種する。第25日に32
匹の免疫化したマウスから採血に、抗毒素力価を
ELISA検定法で決定する。 血清を1:40、1:160、1:640に稀釈する。
第4−1に於て以下のとりきめを使用している。
【表】
高い応答 〓4×BKg. 1:640に於て
* BKg.=血清を含有しない試料の
O.D.のバツクグランド(つ
まり血清のコントロール)
表4−1 トキソイド免疫化したマウスのELISAの結果 応答のタイプ 試験したマウスの% 陰性 12.5 低 6.25 中 59.4 高 21.8 これらの結果に基づき、最低量15μgまでの投
与に対し合計で約87%の抗体応答があると結論さ
れる。 実施例 5 トキソイドの安定性 トキソイドが毒素の状態に逆戻りしないという
ことを示すために、トキソイド実施例1及び毒素
(調製1)を室温で1週間リン酸緩衝液に対し徹
底的に透析し、次いでトキソイドを更に3週間、
4℃で放置した。試料を取りだし酵素活性を試験
し、以下のデータを得た。 表5−1 酵素活性(cpm/μg蛋白) 毒 素 947 トキソイド(0日) 90 トキソイド(1週間) 91 トキソイド(1ケ月) 92 これらの結果に基づき、トキソイドは安定であ
り少なくとも1ケ月の期間内に毒素に逆戻りする
ことはないと結論される。 実施例1の方法に従えば、大腸菌(E.coli)、
ビブリオ コレラ(Vibrio cholerae)及びコリ
ネバクテリウム ジフテリアエ
(Corynebacterium diphtheriae)からの毒素の
ような、他のADP−リボシル化毒素からトキソ
イドを調製することが可能である。 本発明のトキソイドは哺乳動物に於て、相当す
る微生物によつてひきおこされる病気に対し予防
的又は治療的に、能動的又は受動的な免疫化の目
的のために使用し得る。受動的なワクチン化は、
トキソイドで予めワクチン化した哺乳動物から得
た抗血清全体又は免疫グロブリンのどちらかを単
独、又は薬学的に許容される担体と共に注射する
ことによつて実行される。そのようなグロブリン
は標準的な技法によつて全抗血清から得られる。 本発明の好ましい具体例に於ては、実施例1の
エキソトキソイドはワクチンと併用されるが、こ
の組み合せはグラム陰性細菌に対しより広範囲の
防御作用を示す。グラフ陰性細菌のエンドトキシ
ンに対する抗体を上昇させるために、第2の成分
を使用する。好ましい微生物はサルモネラ ミネ
ソタ(Salmonella minnesota)Re595及び大腸
菌(E.coli)0111B4のJ−5突然変異株である。
これらはグラム陰性エンドトキシンに共通な核グ
リコリピドに対する抗体を高めるように思われ、
従つて単に単独の微生物に特異的な抗体を高める
だけの微生物よりも、より広範囲の防御スペクト
ルを与えるが故に、これら微生物が好ましい。J
−5の使用はBraude等、グラム陰性菌の抗血清
治療、Schweiz.Med.Wschr.108巻、48号、1872
−1876頁(1978年)によつて教示された。本特許
で使用したJ−5大腸菌(E.coli)微生物は、
1982年1月21日にアメリカン タイプ カルチヤ
ーコレクシヨンに受理番号39041番として制約を
つけずに永久寄託した。本発明の実施に際し大腸
菌(E.coli)の他の株を使用し得るが、
ATCC39041が好ましいものである。 この好ましい具体例の実施に際し、Braude等、
又はZiegler等、Trans.Assoc of Amer.Phys.91
巻、253−258頁(1978年)によつて教示されたよ
うにして抗血清を上昇させる。次いでこれらの抗
血清をトキソイド抗血清と併合して、2価の免疫
治療又は予防物質とする。好ましい別法としてこ
れら抗血清の免疫グロブリンを、全抗血清の代り
に使用する。 従つて本発明のトキソイドは相当する微生物に
よつて惹起される病気に対して、哺乳動物を能動
的に、予防的に免疫化するための注射物として使
用される。別法として当該トキソイドに由来する
免疫グロブリンを、予防的又は治療的な受動的免
疫化のために使用することが可能である。ピー.
アエルギノーサ(P.aeruginosa)トキソイドを使
用する場合、細菌性エンドトキシンに対して力価
を上昇させた抗体と併用する。ピー.アエルギノ
ーサ(P.aeruginosa)トキソイドをグラム陰性細
菌エンドトキシンワクチン又はその誘導体(抗血
清又は免疫グロブリンなど)と併用する時、注射
し得る型のものはグラム陰性細菌血症に対しより
広範囲の防御作用を示す。本発明のトキソイドの
注射しうる型のものとは、有効量の当該トキソイ
ドを意味し、単独であるいはグラム陰性細菌エン
ドトキシンワクチン、当該エンドトキシンワクチ
ンから得られる抗血清、ガンマグロブリンもしく
は抗体含有画分と併用して使用することができ
る。当該の注射し得る型のものは、更に好みによ
つては滅菌食塩水のような薬学的に許容される担
体とから成る。許容される補助薬(例えばミヨウ
バン)の使用もまた本発明の範囲内であることを
意図している。人間以外の哺乳動物に於て、完全
な又は不完全な補助薬(例えばフロインド補助
薬)を使用することが可能である。 本発明のトキソイドは人間で試験していない
が、実施例4のマウスのデータは少なくとも5−
25μgのトキソイドが哺乳動物に於て抗体応答を
誘起するのに有効である、つまりそのような量は
志願者に於て免疫化する、或は抗血清を産生する
ための有効量であるということを示唆している。
長期間にわたつて抗血清を生産するためには、2
週間毎の補強注射となるかも知れない。同様に実
施例6のデータから、グラム陰性細菌のエンドト
キシンに対して体重70Kgの人間を防御するには、
細菌生エンドトキシンに対して高められ、最低
PHA(受動血球凝集検定)力価が1:32である人
間の抗血清約90ml(体重1Kg当り1.25mlまたはそ
れ以上)が少なくとも必要であると計算される。 調製2 マウスの免疫抑制 実施例4で使用したマウスを実施例6でも使用
した。臨床的に関係した状況により良く似たモデ
ルを入手するために、毒素に対する抗体を発達さ
せた後、これらのマウスは免疫抑制された。 カエザリアン由来のバリヤ支持異系交配
(barrier−sustained、outbred)アルビ(CF1)
マウスをチヤールスリバー社より求めて使用し
た。感作させた時マウスは週令5.5ないし7であ
つた(20ないし24グラム)。 感染1日前にマウスをサイクロホスフアマイド
(サイトキサン、メアド ジヨンソン社)によつ
て免疫抑制する。サイトキサンを滅菌した、ピロ
ーゲンを含まぬ蒸溜水に20mg/mlの濃度となるよ
うに溶解する(サイトキサンは等張にするために
NaClを含有している)。この溶液の濃度を1mlの
減菌した、ピローゲンを含まぬリン酸緩衝食塩水
により腹腔内注射で投与するのに適した量(400
mg/Kg)に調節する。 調製3 ピー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)の感染 ピー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)の臨床
単離株の凍結保存物を、感染1日前に融解し、ト
リプチカーゼソイ寒天斜面上に接種し、37℃で一
晩培養する。翌日この細菌を2.5mlのリン酸緩衝
食塩水に懸濁し、100mlのトリプチカーゼソイブ
ロスに接種し、振盪培養機中で培養する。細菌の
生長が対数期の中間点に達したら、これらをリン
酸緩衝食塩水で3回洗い、リン酸緩衝食塩水中に
7×106細菌/mlとなる濃度に懸濁する。この懸
濁液0.1mlをマウスに腹腔内注射(つまりLD95投
与量)する。 実施例 6 マウスの免疫化 実施例1で調製したトキソイドの免疫原性を説
明するために、抗体力価分布が表4−1であるマ
ウスを免疫抑制し、腹腔内注射によつてピー.ア
エルギノーサ(P.aeruginosa)を感染させる(調
製3)。偽薬を用いての治療と共に正及び負のコ
ントロールを用いる。当該トキソイド活性免疫
法、及びJ−5大腸菌(E.coli)をワクチン化し
た人間の志願者から得た抗血清による受動的免疫
法、を組み合せることによつて達成される、改善
された効能もまた証明された。抗血清はZiegler
等、Trans.Assoc.of Amer.Phys。91巻253−258
頁(1978年)に記載されてある方法に従つて得
た。使用したJ−5大腸菌(E.coli)微生物は、
アメリカンタイプカルチヤーコレクシヨンに受託
番号ATCC39041として寄託してある。表6−1
のデータが得られた。 これらのデータは以下のことを示している。 (1) 治療しない感染動物は速かに死亡した()。 (2) 治療しない非感染動物は、後になり自然感染
によつて死亡した()。 (3) J−5抗血清のみによつてある防御効果が得
られた(対) (4) トキソイドによる治療と受動的J−5抗血清
治療は効果的である(対)。 (5) 4の故にトキソイドは免疫原性である。 (6) 組合せ治療は自然感染に対して防御的に作く
(対)。
* BKg.=血清を含有しない試料の
O.D.のバツクグランド(つ
まり血清のコントロール)
表4−1 トキソイド免疫化したマウスのELISAの結果 応答のタイプ 試験したマウスの% 陰性 12.5 低 6.25 中 59.4 高 21.8 これらの結果に基づき、最低量15μgまでの投
与に対し合計で約87%の抗体応答があると結論さ
れる。 実施例 5 トキソイドの安定性 トキソイドが毒素の状態に逆戻りしないという
ことを示すために、トキソイド実施例1及び毒素
(調製1)を室温で1週間リン酸緩衝液に対し徹
底的に透析し、次いでトキソイドを更に3週間、
4℃で放置した。試料を取りだし酵素活性を試験
し、以下のデータを得た。 表5−1 酵素活性(cpm/μg蛋白) 毒 素 947 トキソイド(0日) 90 トキソイド(1週間) 91 トキソイド(1ケ月) 92 これらの結果に基づき、トキソイドは安定であ
り少なくとも1ケ月の期間内に毒素に逆戻りする
ことはないと結論される。 実施例1の方法に従えば、大腸菌(E.coli)、
ビブリオ コレラ(Vibrio cholerae)及びコリ
ネバクテリウム ジフテリアエ
(Corynebacterium diphtheriae)からの毒素の
ような、他のADP−リボシル化毒素からトキソ
イドを調製することが可能である。 本発明のトキソイドは哺乳動物に於て、相当す
る微生物によつてひきおこされる病気に対し予防
的又は治療的に、能動的又は受動的な免疫化の目
的のために使用し得る。受動的なワクチン化は、
トキソイドで予めワクチン化した哺乳動物から得
た抗血清全体又は免疫グロブリンのどちらかを単
独、又は薬学的に許容される担体と共に注射する
ことによつて実行される。そのようなグロブリン
は標準的な技法によつて全抗血清から得られる。 本発明の好ましい具体例に於ては、実施例1の
エキソトキソイドはワクチンと併用されるが、こ
の組み合せはグラム陰性細菌に対しより広範囲の
防御作用を示す。グラフ陰性細菌のエンドトキシ
ンに対する抗体を上昇させるために、第2の成分
を使用する。好ましい微生物はサルモネラ ミネ
ソタ(Salmonella minnesota)Re595及び大腸
菌(E.coli)0111B4のJ−5突然変異株である。
これらはグラム陰性エンドトキシンに共通な核グ
リコリピドに対する抗体を高めるように思われ、
従つて単に単独の微生物に特異的な抗体を高める
だけの微生物よりも、より広範囲の防御スペクト
ルを与えるが故に、これら微生物が好ましい。J
−5の使用はBraude等、グラム陰性菌の抗血清
治療、Schweiz.Med.Wschr.108巻、48号、1872
−1876頁(1978年)によつて教示された。本特許
で使用したJ−5大腸菌(E.coli)微生物は、
1982年1月21日にアメリカン タイプ カルチヤ
ーコレクシヨンに受理番号39041番として制約を
つけずに永久寄託した。本発明の実施に際し大腸
菌(E.coli)の他の株を使用し得るが、
ATCC39041が好ましいものである。 この好ましい具体例の実施に際し、Braude等、
又はZiegler等、Trans.Assoc of Amer.Phys.91
巻、253−258頁(1978年)によつて教示されたよ
うにして抗血清を上昇させる。次いでこれらの抗
血清をトキソイド抗血清と併合して、2価の免疫
治療又は予防物質とする。好ましい別法としてこ
れら抗血清の免疫グロブリンを、全抗血清の代り
に使用する。 従つて本発明のトキソイドは相当する微生物に
よつて惹起される病気に対して、哺乳動物を能動
的に、予防的に免疫化するための注射物として使
用される。別法として当該トキソイドに由来する
免疫グロブリンを、予防的又は治療的な受動的免
疫化のために使用することが可能である。ピー.
アエルギノーサ(P.aeruginosa)トキソイドを使
用する場合、細菌性エンドトキシンに対して力価
を上昇させた抗体と併用する。ピー.アエルギノ
ーサ(P.aeruginosa)トキソイドをグラム陰性細
菌エンドトキシンワクチン又はその誘導体(抗血
清又は免疫グロブリンなど)と併用する時、注射
し得る型のものはグラム陰性細菌血症に対しより
広範囲の防御作用を示す。本発明のトキソイドの
注射しうる型のものとは、有効量の当該トキソイ
ドを意味し、単独であるいはグラム陰性細菌エン
ドトキシンワクチン、当該エンドトキシンワクチ
ンから得られる抗血清、ガンマグロブリンもしく
は抗体含有画分と併用して使用することができ
る。当該の注射し得る型のものは、更に好みによ
つては滅菌食塩水のような薬学的に許容される担
体とから成る。許容される補助薬(例えばミヨウ
バン)の使用もまた本発明の範囲内であることを
意図している。人間以外の哺乳動物に於て、完全
な又は不完全な補助薬(例えばフロインド補助
薬)を使用することが可能である。 本発明のトキソイドは人間で試験していない
が、実施例4のマウスのデータは少なくとも5−
25μgのトキソイドが哺乳動物に於て抗体応答を
誘起するのに有効である、つまりそのような量は
志願者に於て免疫化する、或は抗血清を産生する
ための有効量であるということを示唆している。
長期間にわたつて抗血清を生産するためには、2
週間毎の補強注射となるかも知れない。同様に実
施例6のデータから、グラム陰性細菌のエンドト
キシンに対して体重70Kgの人間を防御するには、
細菌生エンドトキシンに対して高められ、最低
PHA(受動血球凝集検定)力価が1:32である人
間の抗血清約90ml(体重1Kg当り1.25mlまたはそ
れ以上)が少なくとも必要であると計算される。 調製2 マウスの免疫抑制 実施例4で使用したマウスを実施例6でも使用
した。臨床的に関係した状況により良く似たモデ
ルを入手するために、毒素に対する抗体を発達さ
せた後、これらのマウスは免疫抑制された。 カエザリアン由来のバリヤ支持異系交配
(barrier−sustained、outbred)アルビ(CF1)
マウスをチヤールスリバー社より求めて使用し
た。感作させた時マウスは週令5.5ないし7であ
つた(20ないし24グラム)。 感染1日前にマウスをサイクロホスフアマイド
(サイトキサン、メアド ジヨンソン社)によつ
て免疫抑制する。サイトキサンを滅菌した、ピロ
ーゲンを含まぬ蒸溜水に20mg/mlの濃度となるよ
うに溶解する(サイトキサンは等張にするために
NaClを含有している)。この溶液の濃度を1mlの
減菌した、ピローゲンを含まぬリン酸緩衝食塩水
により腹腔内注射で投与するのに適した量(400
mg/Kg)に調節する。 調製3 ピー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)の感染 ピー.アエルギノーサ(P.aeruginosa)の臨床
単離株の凍結保存物を、感染1日前に融解し、ト
リプチカーゼソイ寒天斜面上に接種し、37℃で一
晩培養する。翌日この細菌を2.5mlのリン酸緩衝
食塩水に懸濁し、100mlのトリプチカーゼソイブ
ロスに接種し、振盪培養機中で培養する。細菌の
生長が対数期の中間点に達したら、これらをリン
酸緩衝食塩水で3回洗い、リン酸緩衝食塩水中に
7×106細菌/mlとなる濃度に懸濁する。この懸
濁液0.1mlをマウスに腹腔内注射(つまりLD95投
与量)する。 実施例 6 マウスの免疫化 実施例1で調製したトキソイドの免疫原性を説
明するために、抗体力価分布が表4−1であるマ
ウスを免疫抑制し、腹腔内注射によつてピー.ア
エルギノーサ(P.aeruginosa)を感染させる(調
製3)。偽薬を用いての治療と共に正及び負のコ
ントロールを用いる。当該トキソイド活性免疫
法、及びJ−5大腸菌(E.coli)をワクチン化し
た人間の志願者から得た抗血清による受動的免疫
法、を組み合せることによつて達成される、改善
された効能もまた証明された。抗血清はZiegler
等、Trans.Assoc.of Amer.Phys。91巻253−258
頁(1978年)に記載されてある方法に従つて得
た。使用したJ−5大腸菌(E.coli)微生物は、
アメリカンタイプカルチヤーコレクシヨンに受託
番号ATCC39041として寄託してある。表6−1
のデータが得られた。 これらのデータは以下のことを示している。 (1) 治療しない感染動物は速かに死亡した()。 (2) 治療しない非感染動物は、後になり自然感染
によつて死亡した()。 (3) J−5抗血清のみによつてある防御効果が得
られた(対) (4) トキソイドによる治療と受動的J−5抗血清
治療は効果的である(対)。 (5) 4の故にトキソイドは免疫原性である。 (6) 組合せ治療は自然感染に対して防御的に作く
(対)。
【表】
た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 RがADP−リボシル化トキシンラジカルで
ある式(1): 又は である免疫用細菌トキソイド。 2 Rがシユードモナス・アエルギノーサ
(Pseudomonas aeruginosa)からのエキソトキ
シン−A、大腸菌(Escherichia coli)からの熱
不安定なエンテロトキシン、ビブリオ・コレラ
(Vibrio cholerae)からのコレラエンテロトキシ
ン、又はコリネバクテリウム・ジフテリアエ
(Corynebacterium diphtheriae)からのジフテ
リヤエキソトキシンである特許請求の範囲第1項
記載のトキソイド。 3 8−アデニルアミノ ピー.アエルギノーサ
(P.aeruginosa)エキソトキシン−Aである特許
請求の範囲第1項記載のトキソイド。 4 8−アデノシルアミノ ピー.アエルギノー
サ(P.aeruginosa)エキソトキシン−Aである特
許請求の範囲第1項記載のトキソイド。 5 (1) 8−アジドアデノシン及び8−アジドア
デニンからなる群から選ばれた光に不安定な親
和性試薬とADP−リボシル化トキシンを0℃
において不活性雰囲気下で混合し、 (2) 第1段階の混合物を有効量の非変性光に照射
し、 (3) 好適には第2段階のトキソイド生成物を精製
する ことから成るトキソイドを製造する方法。 6 トキシンがピー.アエルギノーサ(P.
aeruginosa)エキソトキシン−Aであり、光に
不安定な親和性試薬が8−アジドアデノシンであ
り、エキソトキシンの光に不安定な親和性試薬に
対するモル比が1:100ないし1:10000である特
許請求の範囲第5項記載の方法。 7 注射用組成物である特許請求の範囲第1項記
載の免疫用細菌トキソイド。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/358,133 US4428931A (en) | 1982-03-15 | 1982-03-15 | Bacterial toxoids and gram-negative immune globulin therefrom |
US358133 | 1982-03-15 |
Related Child Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4212499A Division JPH05246890A (ja) | 1982-03-15 | 1992-08-10 | グラム陰性菌トキソイドにより得られる免疫グロブリン |
JP4212500A Division JPH05246887A (ja) | 1982-03-15 | 1992-08-10 | グラム陰性菌トキソイド含有抗菌医薬組成物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS58167517A JPS58167517A (ja) | 1983-10-03 |
JPH0545570B2 true JPH0545570B2 (ja) | 1993-07-09 |
Family
ID=23408438
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58041612A Granted JPS58167517A (ja) | 1982-03-15 | 1983-03-15 | 免疫用グラム陰性菌トキソイド |
JP4212499A Pending JPH05246890A (ja) | 1982-03-15 | 1992-08-10 | グラム陰性菌トキソイドにより得られる免疫グロブリン |
JP4212500A Pending JPH05246887A (ja) | 1982-03-15 | 1992-08-10 | グラム陰性菌トキソイド含有抗菌医薬組成物 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4212499A Pending JPH05246890A (ja) | 1982-03-15 | 1992-08-10 | グラム陰性菌トキソイドにより得られる免疫グロブリン |
JP4212500A Pending JPH05246887A (ja) | 1982-03-15 | 1992-08-10 | グラム陰性菌トキソイド含有抗菌医薬組成物 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4428931A (ja) |
EP (1) | EP0089283B1 (ja) |
JP (3) | JPS58167517A (ja) |
DE (1) | DE3363013D1 (ja) |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60248625A (ja) * | 1984-05-25 | 1985-12-09 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 抗緑膿菌モノクロ−ナル抗体、その製法ならびに用途 |
DE3516119A1 (de) * | 1985-05-04 | 1986-11-06 | Biotest Pharma GmbH, 6000 Frankfurt | Polyvalentes hyperimmunglobulin-praeparat |
US4918163A (en) * | 1985-09-27 | 1990-04-17 | Pfizer Inc. | Monoclonal antibodies specific for lipid-A determinants of gram negative bacteria |
US5114712A (en) * | 1985-11-14 | 1992-05-19 | Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. | Common antigen (PSC-A) to Pseudomonas aeruginosa which acts as an agent for protecting Pseudomonas aeruginosa infection |
ES2009365A6 (es) * | 1986-04-24 | 1989-09-16 | Univ California | Procedimiento de otencion de anticuerpos monoclonales para bacterias gram-negativas. |
US4789544A (en) * | 1986-05-23 | 1988-12-06 | Midcon Labs. Inc. | Co-vaccination using non-O-carbohydrate side-chain gram-negative bacteria preparation |
IE66690B1 (en) * | 1986-05-23 | 1996-01-24 | Oread Pharmaceutical Inc | Co-vaccination using non-O-carbohydrate side-chain gram-negative bacteria preparation |
GB9326174D0 (en) * | 1993-12-22 | 1994-02-23 | Biocine Sclavo | Mucosal adjuvant |
US6818222B1 (en) | 1997-03-21 | 2004-11-16 | Chiron Corporation | Detoxified mutants of bacterial ADP-ribosylating toxins as parenteral adjuvants |
US20140234360A1 (en) | 2011-09-30 | 2014-08-21 | The United States of America, as represented by the Secretary, Dept.of Health and Human Services | Influenza vaccine |
US11602559B2 (en) | 2016-10-03 | 2023-03-14 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | HIV-1 Env fusion peptide immunogens and their use |
WO2018081832A1 (en) | 2016-10-31 | 2018-05-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Peptide fragments from filoviruses and their uses |
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