PT789754E - Processo de fermentacao de h. pylori - Google Patents

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EPÍGRAFE:

DESCRIÇÃO i “PROCESSO DE FERMENTAÇÃO DE H. PYLORI" ] A presente invenção refere-se a um novo método para o crescimento de Helicobacter pylori e purificação da citotoxina produzida por H. pylori. Em particular, o presente pedido refere-se a um novo meio para a fermentação de H. pylori. H. pylori é uma bactéria microaeróbia, Gram negativa, curva, isolada há aproximadamente dez anos, que está associada à gastrite de tipo B em humanos. H. pylori coloniza a mucosa gástrica humana e estabelece uma infecção crónica que pode resultar em úlceras gástricas e duodenais (Blazer, 1990, Journal of Infeccious Diseases, 161. 629-633), e pode ser um factor de risco no desenvolvimento de carcinoma gástrico (Parsonnet et al, 1991, New England Journal of Medicine, 325. 1127-1131). A descoberta da associação entre o H. pylori e a doença gástrica alterou a abordagem terapêutica de tais doenças: do tratamento dos sintomas com drogas anti-ácidas passou-se à erradicação da infecção bacteriana usando antibióticos (Marshall, 1993, Gastroenterol. Clin. Northam. 22, 183-198).. A longo prazo, a infecção e as doenças ocasionadas deste modo podem ser prevenidas e tratadas por vacinação. O uso de Vac A para produzir anticorpos protectores contra a infecção por H. pylori é descrito no Pedido de Patente Internacional W093/16723 e por Rappuoli et al, 1993 (Eur. J. Gastroenterol. and Hepatol. 5, suplemento 2, S76-S78). Actualmente, vários factores envolvidos na adesão, colonização e virulência bacteriana, têm sido identificados e são sujeitos a investigação quanto à sua adequabilidade como componentes de vacina. Um dos factores mais interessantes é a citotoxina vacuolar (Vac A) que provoca vacuolização massiva em várias linhas celulares de mamíferos (Luenk, 1991, Rev. 1

Infect. Dis. 13 (suplemento 8), S683-S689) e ulceração em ratinhos (Telford et al, J. Exp. Med. 179, 1653-1658). A citotoxina purificada é uma proteína de 87 a 94 KD (Telford et al. op.cit. ; Coverand Blazer, 1992, J. Biol. Chem. 267, 10570-10575) que pode ser purificada em quantidades muito pequenas de sobrenadantes de culturas bacterianas. Kamiya et al, 1994, (Eur. J. Gastroenterol. and Hepatol. 6, suplemento 1, S23-S27) discutem a preparação e caracterização parcial de Vac A, a partir do crescimento de H. pylori, em meio de soro bovino fetal/b rucei la broth. De modo a melhorar a compreensão acerca do mecanismo de acção da Vac A, bem como estudar a sua serologia, o seu papel na doença e a sua utilidade como um antigénio de vacinação, são necessárias grandes quantidades de proteínas. Tais quantidades não podem ser obtidas utilizando métodos correntes de cultura de H. pylori e purificação de citotoxina. O crescimento em laboratório de H. pylori é difícil e normalmente requer meios complexos contendo soro, sangue ou derivados sanguíneos (Shahamat et al, 1991, J. Clin. Microbiol. 29, 2838-2837; Buck et Smith, 1987, J. Clin. Microbiol. 25, 597-599; Morgan et al, 1987, J. Clin. Microbiol.. 25, 2123-2125). Estes meios interferem com os procedimentos de purificação utilizados para isolar a citotoxina.

Recentemente foi demonstrado que a adição de ciclodextrinas ao meio de crescimento pode substituir os aditivos acima identificados e manter o crescimento de uma H. pylori (Olivieri et al, 1993, J. Clin. Microbiol.. 31, 160-162; EP-A-0 540 897). Contudo, o crescimento do microrganismo permanece relativamente lento.

Sabe-se muito pouco acerca dos factores de crescimento essenciais, necessários ao H. pylori, e acerca do seu metabolismo em geral. Por exemplo, embora estudos iniciais baseados na formação de ácidos a partir de açúcares não tenham encontrado qualquer evidência de vias de fermentação sacarina, testemunhos mais recentes indicam que o H. pylori é capaz de catabolizar sacarídeos tais como a glucose. A presença da via de pentoses fosfato e a actividade de glucoquinase foram recentemente demonstradas (Mendz & Hazzel, 1991, FEMS Microbiol.Lett 84, 331-336; Mendz & Hazzel, 1993, Arch. Biochem.

Biophys 300, 522-525) e a utilização da glucose foi demonstrada (Mendz et al., 1993, J. Gen. Microbiol. 139, 3023-3028). Contudo, permanece desconhecido em que medida o H. pylori é capaz de metabolizar a glucose (ver Microbiology 140, (1994) 2179-2180).

Embora tenha sido demonstrado que o H. pylori é capaz de utilizar a glucose, até à data ainda não foi determinado se a glucose é um substracto preferido para este organismo. Adicionalmente, os efeitos da utilização da glucose na H. pylori permanecem desconhecidos e não é claro se a utilização da glucose irá afectar o crescimento das bactérias de um modo positivo ou negativo.

Mostrámos agora que o fornecimento de glucose às culturas de H. pylori resulta numa melhoria substancial na taxa de crescimento do organismo e aumenta a biomassa disponível no final do processo de fermentação. Adicionalmente, a produção da citotoxina vacuolar melhora. Assim, de acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para cultivar H. pylori para produção da citotoxina vacuolar, na qual a H. pylori é cultivada num meio compreendendo mais de 1 grama por litro de glucose.

Preferivelmente, a glucose é D-glucose. Mostrou-se que o uso de glucose no meio de cultura resulta num aumento da densidade óptica do meio, o qual é indicativo do número de células de H. pylori presente, de quase uma ordem de magnitude. Adicionalmente, quadruplica a produção de citotoxina vacuolar.

Vantajosamente, o meio de crescimento que é suplementado com glucose é brucella broth, um meio complexo composto por triptona (10 gramas por litro), peptamina (10 gramas por litro), glucose (1 grama por litro), extracto de levedura (2 gramas por litro), cloreto de sódio (5 gramas por litro) e bissulfito de sódio (0.1 gramas por litro). O meio pode ser suplementado com derivados de sangue como na técnica anterior, mas vantajosamente é suplementado com ciclodextrinas, como previamente descrito (Olivieri et al, Op. Cit.). Preferivelmente, são usados cerca de 2 gramas de ciclo dextrinas por litro de brucella broth. 3

A glucose pode ser adicionada numa única dose no começo do processo de fermentação. Preferivelmente, contudo, a glucose é adicionada em doses múltiplas ou por alimentação contínua, durante a fermentação, num processo de alimentação semi-contínuo. A quantidade de glucose fornecida à cultura deve ser suficiente para manter um nível de glucose no meio, que se situa preferivelmente entre 2 a 6 gramas por litro. Preferivelmente, a concentração de glucose é mantida a ou acima deste nivel ao longo do período de cultura, que dura vantajosamente entre 36 e 96 horas.

De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, é fornecido um método para produzir a citotoxina vacuolar de H. pylori, compreendendo a cultura de H. pylori num meio suplementado com glucose, de acordo com o primeiro aspecto da invenção. A citotoxina vacuolar pode ser isolada do meio de cultura bacteriana, por qualquer método adequado conhecido na técnica. Preferivelmente, contudo, a citotoxina vacuolar é isolada por um método que compreende adsorver as proteínas, numa matriz de sulfato de celulose e eluindo-as, subsequentemente, usando um gradiente de concentração de sal.

Descobriu-se que os métodos previamente descritos na técnica, os quais usam a adsorção em sefarose de fenilo para isolar a citotoxina vacuolar, são insatisfatórios e dão rendimentos muito baixos, na ordem dos 0.5%. Em contraste, uma ligação ao sulfato de celulose é essencialmente quantitativa e são possíveis rendimentos de 15-20%. A invenção fornece ainda um método para a purificação da citotoxina vacuolar de H. pylori o qual compreende os passos de: a) tratar o sobrenadante de uma fermentação de H. pylori, de modo a aí concentrar as proteínas; 4 b) ressuspender as proteínas num tampão compreendendo uma concentração de sal equivalente a 100 mM de NaCI; c) adsorver as proteínas numa coluna de sulfato de celulose; d) eluir as proteínas ligadas através da coluna usando um gradiente de sal equivalente a 0.1 a 1.5M de NaCI num tampão de fosfato a um pH 6.5; e) seleccionar a fracção do eluído que contém a citotoxina vacuolar; f) opcionalmente, concentrar mais a citotoxina e sujeitá-la a separação por tamanhos usando uma matriz de poro controlado. Métodos para concentração de proteínas, como necessários ao passo a) do método acima, são conhecidos na arte. Por exemplo, as proteínas podem ser simplesmente precipitadas em sulfato de amónio, preferivelmente sulfato de amónio saturado a 50%, e subsequentemente ressuspendidas num tampão de 100mM de NaCI. 20mM de fosfato, pH 6.5 no passo b). Alternativamente, as proteínas podem ser concentradas por filtração tangencial e diafiltração (Miniset OMEGA. ‘'cut-off’ 300kDa, Filtron).

Preferivelmente, a coluna de sulfato de celulose é uma coluna Matrex™. A eluição da coluna é preferivelmente efectuada com um gradiente salino de entre 0.1 e 1.5M NaCI, num tampão de fosfato pH 6.5. As fracções eluídas a partir da coluna são vantajosamente analisadas para vacA, por Western Blotting, usando um anti-soro especifico para vacA. A VacA pode ser isolada imergindo as fracções que contêm vacA e concentrando a proteína, por exemplo por precipitação com sulfato de amónio, ressuspensão em PBS e subsequente separação por tamanho. Este último passo pode ser efectuado, por exemplo, numa coluna Superose 6 (Pharmacia), equilibrada em PBS.

Preferivelmente, o método compreende ainda o cultivo de H. pylorí num meio suplementado com glucose, como descrito no primeiro aspecto da invenção. 5

A invenção também fornece um método para vacinar um organismo contra a infecção por H. pylori, a qual compreende a preparação de uma amostra de VacA, como acima descrito, e a administração de uma composição compreendendo a VacA preparada deste modo, ou um fragmento ou um derivado desta, a qual retém uma imunogenicidade especifica a H. pylori, ao organismo.

As vacinas, de acordo com a invenção, podem ser formuladas de acordo com qualquer técnica conhecida na arte.

As vacinas, de acordo com a invenção, podem ser, quer profilácticas (para prevenir a infecção) quer terapêuticas (para tratar a doença após a infecção).

Tais vacinas compreendem antigénio ou antigénios, habitualmente em combinação com “transportadores farmaceuticamente aceitáveis”, os quais incluem qualquer transportador que não induz por si só a produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que recebe a composição. Transportadores adequados são tipicamente macromoléculas amplas, metabolizadas lentamente tais como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas), e partículas de vírus inactivas. Tais transportadores são bem conhecidos por especialistas no ramo. Adicionalmente, estes transportadores podem funcionar como agentes imunoestimulantes adicionais (“adjuvantes”).

Além disto, o antigénio pode ser conjugado com um toxoide bacteriano, tal como toxoides dos patogénicos da difteria, tétano, cólera, H. pylori, etc.

As composições imunogénicas (e.g., o antigénio, o transportador farmaceuticamente aceitável, e o adjuvante) irão conter tipicamente diluentes, tais como a água, solução salina, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes humedecedores ou emulsionantes, substâncias tampão de pH, e similares, podem estar presentes em tais veículos. 6 ο

As composições imunogénicas, usadas como vacinas, compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz do adjuvante e um antigénio, bem como qualquer dos componentes acima mencionados, como necessário. Por “quantidade imunologicamente eficaz”, quer-se dizer que a administração dessa quantidade a um indivíduo, quer numa dose única ou como parte de uma série, é eficaz para tratamento ou prevenção. Esta quantidade varia mediante o estado de saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, o grupo taxonómico do indivíduo a ser tratado (e.g., primata não-humano, primata, etc.), a capacidade do sistema imunitário do indivíduo para sintetizar anticorpos, o grau de protecção desejada, a formulação da vacina, a avaliação do médico assistente da situação clínica, e outros factores relevantes. Espera-se que a quantidade caia numa amplitude relativamente grande que possa ser determinada através de avaliações de rotina. A dosagem de tratamento pode ser um programa de dose única ou um programa de dose múltipla. A vacina pode ser administrada em conjugação com outros agentes imunoreguladores.

Numa modalidade particularmente preferida, as vacinas, de acordo com a invenção, são administradas em combinação com um adjuvante mucosal, o qual é vantajosamente um mutante de uma toxina bacteriana ADP-ribosilante, como descrito na nossa patente copendente UK N° 9326174.1, entitulada “Mucosal

Adjuvant A invenção fornece o uso de VacA, preparada de acordo com o primeiro aspecto da invenção na preparação de uma composição para uso como uma vacina. A invenção será agora descrita, com um propósito meramente ilustrativo, nos exemplos que se seguem, com referência às figuras, nas quais: A figura 1 apresenta a cinética de crescimento de H. pylorí CCUG 17874 em brucella broth compreendendo ciclodextrinas 2gl'1 num bioreactor de 7 litros: 7

A Figura 2 apresenta a cinética de uma experiência idêntica à apresentada na Figura 1, exceptuando que é empregue uma alimentação de glucose; A Figura 3 apresenta a concentração de VacA durante o crescimento de H. pylori com alimentação de glucose (A) e sem (B); A Figura 4 apresenta o perfil de eluição de proteínas de uma coluna Matrex (linha a cheio) medida por absorvância a 280mm. O gradiente de NaCI é indicado pela linha a tracejado;

A Figura 5 apresenta o perfil A280 de eluição de uma citotoxina parcialmente purificada derivada de uma coluna Superose 6. A Figura 6 apresenta um gel SDS, corado a azul coomassie, de citotoxina purificada (A), e uma mancha imune do material apresentado em A (B2) e uma preparação similar apresentando os produtos de 37 kDa e 58 kDa (B1) processados; e A Figura 7 apresenta a neutralização da actividade da citotoxina vacuolar por anti-soro criado contra VacA purificada. A Figura 8 apresenta uma curva de crescimento de H. pylori e produção de VacA, numa reacção de escala aumentada (scaled-up) (fermentador 30L), na qual VacA pode ser encontrada no sobrenadante, VacA(s), e associada com o sedimento (pellet), VacA(p). 8

EXEMPLOS

Exemplo 1

Produção de Vac A num meio suplementado com glucose

MATERIAIS E MÉTODOS

Estirpe bacteriana. Foi utilizado Helicobacter pylori CCUG 17874 (estirpe tipo, Culture Collection, Universidade de Goteborg) neste estudo.

Meio e suplementos, foi utilizado como meio sólido para a determinação de CFU o meio de Columbia Blood Agar (Agar de sangue Columbia) (CBA) (Difco), suplementado com os seguintes antibióticos (todos da Sigma): Cefsulodina 6 mg1"1, Vancomicina 5 mgT1. Foi usado, como meio líquido, Brucella Broth (Meio Brucella) (BB) (Difco), suplementado com 2 gl"1 de (2,6-di-o-metil)-B-ciclodextrina (CD) (Teijin Lim. Tokyo, Japão), e os antibióticos acima mencionados.

Conservação. Alíquotas congeladas para inoculação foram preparadas e diluídas de 1:2 com uma solução composta por: glicerol 40%, soro fetal de vitela (HyClone, Logan, Utah) 20% e 0.4% CD. A suspensão obtida foi distribuída em frascos de 1.5 ml e armazenada a - 80 °C.

Crescimento em meio líquido. Culturas iniciais foram executadas em frascos Erlenmyer de 130 ml contendo 30ml de meio líquido. As culturas foram inoculadas com 1 ml de material congelado e incubadas a 36°C, durante 36 horas, com agitação (100 rpm. numa amplitude de 2.5 cm), num ambiente microaeróbico. Os frascos foram colocados dentro de uma jarra de anaerobiose, em que envelopes BBL Campy Pak (Becton Dickinson) foram usados para gerar as condições adequadas. Estas culturas foram então usadas para inocular frascos de 500 ml contendo 150 ml de meio e incubadas sob as mesmas condições acimas mencionadas. Estas culturas foram usadas para inocular os bioreactores. 9

Recipientes de cultura e condições de crescimento. Fermentações em “Batch” foram executadas em bioreactores de 7 litros (MBR Bioreactors AG, 8620 Wetzikon, CH) contendo 5 I de meio. Todas as culturas foram postas a crescer a 36°C. O pH não foi controlado. A tensão de oxigénio dissolvido (DOT) foi mantida automaticamente no nível pré-estabelecido (5%) por um procedimento em dois passos. Primeiro, a taxa de fluxo de ar foi aumentada de 0.1 para 0.5 I T1min'1, para satisfazer a necessidade crescente de 02 da cultura. Se forem necessários aumentos adicionais, eles serão obtidos fornecendo 02 puro até a um máximo de 0.4 I T1 min'1. Um fluxo constante de N2 e C02 foi mantido igual a 0.2 I T1 e 0.02 I 1'1min'1 respectivamente. A velocidade de agitação foi mantida a 130 rpm. O eixo do agitador foi equipado com duas turbinas Rhuston, com um diâmetro de 7cm, e o diâmetro do bioreactor era 17cm.

Fornecimento de glucose. Foi usada uma solução de 50% em glucose.

Determinação da biomassa. O crescimento foi monitorizado pela determinação de CFU e por densidade óptica a 590 nm contra um branco de água (espectofotómetro Perkin Elmer 35), percurso de luz de 1cm. Confirmações da pureza das amostras foram efectuadas por coloração Gram e subcultivando amostras em placas CBA, as quais foram incubadas numa atmosfera normal a 37°C durante 24 horas.

Análise quantitativa da proteína VacA. Em determinados pontos durante a fermentação, as amostras de cultura foram centrifugadas (Biofuge A, Heareus) a 8300 x g durante 10 minutos.

Os sobrenadantes foram precipitados com ácido ticloroacético e sujeitos a um SDS-Page a 9%, usando um aparelho BioRad Mini Potean II. As proteínas foram transferidas para filtros de nitrocelulose (Schleicher & Schuell) e então incubadas, de um dia para o outro, com anti-soro policlonal criado contra a proteína de VacA (Telford et al.; Op. Cit.). Após a incubação durante 2 horas com um anticorpo secundário conjugado de peroxidase da armorácea (Sigma), as bandas imunoreactivas foram visualizadas por coloração com 4-cloro-naftol. Para cada mancha imune, a quantidade de citotoxina nos sobrenadantes de cultura foi estimada usando uma curva de calibração obtida com quantidades conhecidas de proteína de VacA purificada. Foi realizada uma estimativa quantitativa, por densiometria de ultrascanner, usando o Image Master Desk Top Scanner (Pharmacia), em modo de reflectância 1D.

Ensaio de glucose. Foi usada glu-cinet, teste de glucose (Sclavo S.p.A., Itália).

RESULTADOS

Como ilustrado na Figura 1, na ausência de fornecimento de glucose, o crescimento de H. pylori foi exponencial desde que a glucose estivesse presente no meio, e, sob estas condições, o tempo de duplicação foi estimado em 7.5 horas. Quando a D.O. da cultura atingiu o valor de cerca de 2.5 seguiu-se a fase estacionária. Também foram medidas as CFU durante as várias fases do crescimento (Fig. 1). Como indicado claramente, a curva de CFU correlacionou-se bem com a curva de D.O., desde que a glucose não se esgotasse. Nas condições de cultura aqui descritas, observámos uma diminuição do valor do pH do meio de 6.9 para 6.7, após 33 horas de crescimento, o qual então atingiu o valor de 7.4 no final da fase de crescimento, e um valor de 7.9 no final da fase estacionária. A acumulação de VacA no meio é relatada na Fig. 3 (A). Pode observar-se que a concentração máxima de VacA (5mg T1) é atingida às 65 horas e permanece constante na fase estacionária durante, pelo menos, 10 horas. A partir destes estudos iniciais inferiu-se que a quantidade de VacA produzida pode estar relacionada com a massa celular total acumulada.

Para verificar esta hipótese, foram utilizados fornecimentos de glucose para garantir que esta fonte de carbono e energia estivesse sempre presente no meio. A Fig. 2 mostra que sob estas condições, o crescimento atingiu um valor de 7.7 unidades D.O. e uma CFU de 3 x 109ml'1. Ao contrário dos resultados obtidos quando a glucose foi completamente metabolizada (Fig. 1), neste caso a curva de CFU versus tempo está mais relacionada com a obtida usando os valores D.O.. Isto ocorre mesmo quando os valores de pH diferem significativamente na fase 11 estacionária, relativamente a fermentações sem fornecimento de glucose (Fig. 1). Neste tipo de fermentação, a presença de glucose aumentou a potência de tampão do meio, devido à produção de C02, e evitou a lise das células. Os valores de pH finais foram 7.6 contra 7.9 das fermentações sem fornecimento de glucose. Quando o H. pylori foi cultivado na presença de glucose a concentração de VacA no meio atingiu o valor muito promissor de 19mg Γ1. EXEMPLO 2

Aumento de escala (scale-up)

Num fermentador 30 I, contendo 15 I de meio composto por triptona 10 g/l, Y. E. 5 g/l, NaCI 5 g/l, ciclodextrina 2 g/l, glucose 5 g/l, (este meio é uma versão simplificada de BB) é efectuada uma cultura de escala aumentada de H. pylori. Arejamento de superfície foi executado mantendo o DOT a 5%, com oxigénio e agitação. Um fornecimento de glucose de 5g/l foi fornecido quando a reacção OD atingiu cerca de 3. O tempo de duplicação foi de 5 horas. O pH não foi controlado. A curva de crescimento e a produção de VacA obtidas são apresentadas na Figura 8, onde se mostra que se pode encontrar VacA no sobrenadante, VacA(s), e associada com o pellet, VacA(p). EXEMPLO 3

Purificação de VacA

Biomassa de uma cultura de 5 I de estirpe de Helicobacter pylori CCUG 17874 (Exemplo 1) foi removida por centrifugação a 11000 x g durante 20 minutos e o sobrenadante líquido (aprox. 4I) foi levado a uma saturação de 50%, por adição de sulfato de amónio sólido. A suspensão foi centrifugada a 11000 x g, durante 20 minutos, e as proteínas precipitadas foram ressuspensas em 100 mM de NaCI, 20 mM fosfato pH 6.5 (tampão A). A suspensão resultante foi dialisada extensivamente contra o tampão A. O dialisado foi ajustado a um volume de 250ml e aplicado a uma velocidade de fluxo de 2.5ml/minuto, numa coluna de 2.5 x 11cm (Econo column, Bio Rad) contendo Matrex™ (sulfato de celulose, Amicon, Danver, Mass.), equilibrada com 12 tampão A. Após lavagem extensiva com tampão A, as proteínas foram eluídas da coluna usando um gradiente de NaCI entre 0.1-1,5M em 20mM de tampão de fosfato de pH 6.5, e monitorizadas por absorvância a 280 nm (Figura 4). O eluído entre 0.5 e 0.8 M de NaCI, contendo proteína de VacA, foi recolhida e levado a uma saturação de 50% com sulfato de amónio. A suspensão foi centrifugada a 11000 x g durante 20 minutos e as proteínas sedimentadas foram ressuspensas em 3.5ml de PBS. Material insolúvel foi removido por centrifugação a 85000 x g, durante 30 minutos, e a solução purificada foi aplicada a uma coluna de enchimento 16 x 81 mm com Superose 6 (Pharmacia, Uppsala, Sweden). As proteínas foram eluídas com PBS, a uma velocidade de fluxo de 14 ml/hora, e monitorizadas por absorvância a 280 nm (Figura 5).

Fracções da coluna correspondendo ao pico 2 (Figura 5) continham um polipéptido 94kDa predominante, quando analisado através da desnaturação da electroforese de gel de poliacrilamida e corado com azul Coomassie (Figura 6A). Provocando-se manchas imunes com estes productos, usando anti-soro anti-VacA de coelho específico, revelou-se que o polipéptido 94kDa era a proteína de VacA (Figura 6B). Traços ocasionais dos polipéptidos 37kDa e 58kDa podiam ser cletectadas em manchas imunes de toxina purificada, que correspondem a moléculas processadas, como foi previamente descrito por Telford et ai (J.Exp. Med.. 179:1653,1994). A concentração de proteína, nas fracções purificadas, foi medida usando o conjunto reagente de ensaio de proteína Micro BCA (Pierce, Rockford, III), usando albumina de soro bovino como padrão. Aproximadamente 1 mg de proteína/l de cultura foi obtido correspondendo a um rendimento de 15% da toxina total. Os coelhos foram imunizados através da injecção intradérmica de 4 doses espaçadas em 7 dias, de 25 pg cada, de toxina purificada em 1 ml de uma solução de 1 mg/ml de hidróxido de alumínio, como adjuvante. As imunoglobulinas foram purificadas usando sefarose de proteína G e testadas quanto à sua capacidade para neutralizar a actividade da citotoxina de VacA, num ensaio de vacuolação in vitro (Papini et ai Mol. Microbiol. 7:323,1993). Diluições em série da fracção Ig purificada foram 13 incubadas com 1.85 pg, de toxina purificada em 100 pg de meio de cultura, antes de serem adicionadas às células. Os anticorpos foram capazes de neutralização completa da actividade da citotoxina numa diluição de 1:100 (Figura 7). EXEMPLO 4

Protecção dos sujeitos imunizados com VacA

Ratinhos (6 semanas de idade CD1/SPF) e BALB/C (Charles River, Calco, Itália)) foram injectados com isolados frescos de H. pylori, como descrito no pedido de patente do Reino Unido correspondente 9419661.5 da requerente.

De modo a avaliar a possibilidade de proteger os ratinhos contra a infecção por H. pylori através da imunização, a VacA purificada, obtida de acordo com a invenção, foi administrada oralmente em combinação com um adjuvante mucosal LT, nos dias 1, 14 e 21, sendo administrados em cada dose 100 mg de VacA de H. pylori e 10Omg LT.

Nos dias 28, 30 e 32 os ratinhos imunizados foram confrontados com H. pylori. de acordo com o protocolo de infecção acima referido. No dia 42, os ratinhos foram mortos e foi avaliada a colonização da mucosa gástrica por H. pylori. Os resultados estão presentes na tabela 1:

Tabela 1-protecção por vacinação com VacA

Tratamento Infectados % de protecção Solução salina 5/5 0 LT 3Á 25 VacA 3Á 25 VacA + LT 1/3 77

Lisboa,

R A C [\l a

O AGENTE CriClAL DA PRQPRSavX fCGSTKlAI 14

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um método para cultivar H. py/ori de modo a produzir um citotoxina vacuolar, caracterizado pelo facto de H. pylori ser cultivada num meio compreendendo mais de 1 gl'1 de glucose.
2. 2. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o meio ser um meio de Brucella Broth, suplementado com glucose, e derivados sanguíneos.
3. 3. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o meio ser um meio de Brucella Broth, suplementado com glucose, e uma ciclodextrina.
4. 4. Um método, conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a glucose ser fornecida por injecções múltiplas ou abastecimento contínuo num processo de alimentação semi-contínuo.
5. 5. Um método, conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a concentração de glucose do meio ser mantida entre 2 e 6 gl'1, ao longo do período de cultura.
6. 6. Um método para produzir a citotoxina vacuolar do H. pylori, caracterizado pelo facto de compreender o cultivo de H. pylori num meio suplementado com glucose, conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
7. 7. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto de compreender ainda a purificação da citotoxina por adsorção numa matriz de sulfato de celulose e sua subsequente eluição utilizando um gradiente de concentrações em sal.
8. 8. Um método para a purificação da citotoxina vacuolar de H. pylori, caracterizado pelo facto de compreender os passos de: a) tratar o sobrenadante de uma fermentação de H. pylori, cultivada de acordo com o método de qualquer uma das reivindicações precedentes, de modo a concentrar aí as proteínas; b) colocar as proteínas em suspensão num tampão compreendendo uma concentração de sal equivalente a 100mM de NaCI; c) adsorver as proteínas numa coluna de sulfato de celulose; d) eluir as proteínas ligadas na coluna usando um gradiente de sal equivalente a 0.1 a1 5M de NaCI num tampão de fosfato de pH 6.5; e) seleccionar a fracção de eluído que contém a citotoxina vacuolar; f) opcionalmente, concentrar ainda mais a citotoxina e sujeitá-la a separação por tamanhos, usando uma matriz de porosidade controlada.
9. 9. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o passo a) compreender precipitação em sulfato de amónio.
10. 10. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto de os passos a) e b) compreenderem filtragem tangencial e diafiltragem da amostra.
11. 11. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto de a purificação da citotoxina ser executada conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 8 a 10.
12. 12. Um processo para manufactura de um medicamento para uso como uma vacina, caracterizado pelo facto de compreender os passos de a) cultivar H. pylori para produzir uma citotoxina vacuolar usando o método, conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e b) conduzir a dita citotoxina vacuolar à associação com um excepiente farmacêutico adequado. Lisboa, 2 2 SET. 2000 O.,AGENTE OrtOAL DA PSCPREDAD:

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