JPH10500864A

JPH10500864A - Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ発酵プロセス

Info

Publication number: JPH10500864A
Application number: JP8515176A
Authority: JP
Inventors: ロベルトオリビエリ，; リノラプオリ，; ジョンライルドテルフォード，
Original assignee: カイロンエセ．ピー．アー．
Priority date: 1994-11-04
Filing date: 1995-11-06
Publication date: 1998-01-27
Anticipated expiration: 2015-11-06
Also published as: ATE194646T1; EP0990700A1; ES2148571T3; WO1996014393A1; EP0789754B1; GB9422331D0; GR3033866T3; PT789754E; DE69517995D1; JP3145122B2; DE69517995T2; EP0789754A1; DK0789754T3; CA2204276A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、Helicobacter pyloriの培養、およびH．pyloriにより生産されるサイトトキシンの精製のための新規の方法に関する。詳細には、空胞化サイトトキシンを生産させるために、１g/Lを越えるグルコースを含む培地中でH．pyloriを培養する。

Description

【発明の詳細な説明】 H ．Pylori発酵プロセス本発明は、Helicobacter pyloriの培養、およびH．pyloriが生産するサイトトキシンの精製のための新規の方法に関する。詳細には本発明の適用は、H．pylor iの発酵のための新規の培地に関する。 H．pyloriは、湾曲した（curved）グラム陰性の微好気性細菌で、ヒトのＢ型胃炎に関する細菌として約10年前に単離された。H．pyloriはヒトの胃粘膜にコロニーを形成して慢性的な感染を確立し、その結果胃潰瘍および十二指腸潰瘍を起こし得（Blazer，1990、Journal of Infectious diseases，161，629-633）、そして胃癌の発生の危険因子になり得る（Parsonnetら、1991，New England Jou rnal of Medicine，325，1227-1131）。H．pyloriと胃の病気との間の関係の発見により、これらの疾患の治療的アプローチは、抗酸薬による症状の処置から抗生物質を用いた細菌感染の根絶へと変化した（Marshall、1993，Gastroenterol ．Clin．Northam．22，183-198）。長い間、感染およびそれによって引き起こされる疾患はワクチンを接種することによって、予防および処置され得た。現在、細菌の付着、コロニー形成および毒性に関するいくつかの因子が同定されており、そしてワクチンの構成成分としてのこれらの適合の研究が行われている。最も興味深い因子の１つは、空胞化（ vacuolating）サイトトキシン（Vac A）であり、これは何種類かの哺乳類細胞株において大きな塊となった空砲形成を引き起こし（Luenk、1991，Rev．Infect． Dis．13（増刊８），s683-s689）、そしてマウスにおいて潰瘍形成を引き起こす（Telfordら、J．Exp．Med．179，1653-1658）。精製されたサイトトキシンは、 87KDから94KDのタンパク質であり（Telfordら、前出; CoverおよびBlazer，1992 ，J．Biol．Chem．267，10570-10575）、細菌の培養上清から極微量精製され得る。Vac Aの作用機構の理解、ならびにその血清学の研究、その疾患における役割、およびワクチン抗原としてのその実用性を得るためには、大量のタンパク質が必要である。通常用いられているH．pyloriの培養およびサイトトキシン精製の方法を用いて、このような大量のタンパク質を得ることはできない。 H．pyloriの実験室の培養は困難で、そして通常血清、血液、または血液の派生物を含む複合培地を必要とする（Shahamatら、1991，J．Clin．Microbiol．29 ，2838-2837; BuckおよびSmith，1987，J．Clin．Microbiol．25，597-599; Mor ganら、1987，J．Clin．Microbiol．25，2123-2125）。これらの培地は、サイトトキシンの単離に用いられる精製手順を防害する。最近、シクロデキストリンの培養培地への添加が、上記に同定された添加物を代用し得、そしてH．pyloriの増殖を維持し得ることが示されている（Olivieri ら、1993，J．Clin．Microbiol．31，160-162）。しかし、生物の増殖は比較的遅いままである。一般に、H．pyloriに必要とされる不可欠な増殖因子およびその代謝については、ほとんど知られていない。例えば、糖からの酸の生成に基づく早期の研究は、糖類の発酵経路についての証拠を見いださなかったが、さらに最近の証拠は、 H．pyloriがグルコースのような糖類を異化代謝し得ることを示す。ペントースリン酸経路およびグルコキナーゼ活性の存在が、最近証明されており（MendzおよびHazzell 1991，FEMS Microlol．Lett．84，331-336; MendzおよびHazzell， 1993，Arch．Biochem．Biophys．300，522-525）、そしてグルコースの利用が証明されている（Mendzら、1993，J．Gen．Microbiol．139，3023-3028）。 H．pyloriがグルコースを利用できることは証明されているが、現在までグルコースがこの生物にとって好ましい基質であるかどうかは決定されていない。さらに、H．pyloriにおけるグルコース利用の効果は未知のままであり、そしてグルコース利用が、細菌の増殖に対して、正または負の方向に影響を与えているかどうかは明らかではない。発明者らはここで、H．pylori培養液へグルコースを流加すること（feeding）により、その結果、この生物の増殖速度の実質的な改善をもたらし、そして発酵プロセスの終了時点で利用可能なバイオマスを増大することを示した。さらに、空胞化サイトトキシンの生産量が改善される。従って、本発明の第１の局面によれば、空胞化サイトトキシンを生産するH．pyloriを培養するための方法を提供する。これは、H．pyloriを１Lあたり１gを超えるグルコースを含有する培地中で培養する方法である。好ましくは、グルコースはＤ-グルコースである。培養培地中にグルコースを用いることにより、その結果、培地の光学密度（これは存在するH．pyloriの細胞数を示す）を、ほぼ一桁増大することが示されている。さらに、空胞化サイトトキシンの生産量は４倍になる。好都合には、グルコースを補充した増殖培地は、brucella broth（トリプトン（１Lあたり10g）、ペプタミン（１Lあたり10g）、グルコース（１Lあたり１g）、酵母抽出物（１Lあたり２g）、塩化ナトリウム（１Lあたり５g）、および重亜硫酸ナトリウム（１Lあたり0.1g）からなる複合培地）である。この培地は、先行技術のように血液の派生物を補充され得るが、好都合には、以前に記載されているように（Olivieriら、前出）、シクロデキストリンで補充される。好ましくは、brucella broth １Lあたり約２gのシクロデキストリンを用いる。グルコースは、発酵プロセスの開始時点で、単回量の添加として添加され得る。しかし好ましくは、グルコースは、複数回、または流加培養プロセス（fed ba tch process）での発酵中の継続的な流加によって添加される。培養液に添加されるグルコース量は、培地中のグルコースレベルを（好ましくは１Lあたり２gから６gの間に）維持するために十分であるべきである。好ましくは、グルコース濃度は、培養期間（好都合には36時間から96時間の間）を通じてこのレベルまたはこれを超えるレベルに保たれる。本発明の第２の局面によれば、H．pylori空胞化サイトトキシンを生産するための方法が提供される。これは、本発明の第１の局面による、グルコース補充培地においてH．pyloriを培養する工程を含む。空胞化サイトトキシンは、当該分野で公知の任意の適切な方法による細菌培養培地から単離され得る。しかし好ましくは、空胞化サイトトキシンは、タンパク質を硫酸セルロースマトリックスに吸着する工程、および続いて塩濃度勾配を用いてそれらを溶出する工程を含む方法により、単離される。当該分野で以前に記載された方法（空胞化サイトトキシンを単離するためにフェニルセファロースへの吸着を用いる方法）は、不十分であり、かつ非常に低い収率（0.5％のオーダー）を得ることがわかっている。これと比較して、硫酸セルロースとの結合は本質的に定量的で、かつ15％から20％の収率が可能である。本発明はさらに、H．pylori空胞化サイトトキシンの精製方法を提供する。これは以下の工程を含む：ａ） H．pylori発酵液の上清中のタンパク質を濃縮するために、H．pylori発酵液の上清を処理する工程；ｂ） 100mM Naclに相当する塩濃度を含有する緩衝液中で、このタンパク質を懸濁する工程；ｃ）このタンパク質を、硫酸セルロースカラムに吸着させる工程；ｄ）リン酸緩衝液（pH6.5））中の0.1〜1.5M Naclに相当する塩濃度勾配を用いて、カラムから結合したタンパク質を溶出する工程；ｅ）空胞化サイトトキシンを含む溶出物の画分を選択する工程；ｆ）必要に応じて、サイトトキシンをさらに濃縮し、そして制御された細孔（ pore）マトリックスを用いて、サイズ分離する工程。上記の方法の工程ａ）に必要とされるようなタンパク質を濃縮する方法は、当該分野で公知である。例えばタンパク質は、硫酸アンモニウム（好ましくは50％の飽和硫酸アンモニウム）中に、容易に沈澱し得、続いて、工程ｂ）において、 100mM NaCl、20mMリン酸緩衝液（pH6.5）中に再懸濁され得る。あるいは、タンパク質は、接線濾過（tangentrial filtration）およびダイアフィルトレーション（Minlset OMEGA，cut-off 300kDa，Filtron）によって濃縮され得る。好ましくは、硫酸セルロースカラムはMatrex^TMカラムである。好ましくは、カラムからの溶出が、リン酸緩衝液（pH6.5）において、0.1Mと1.5Mとの間のNaCl 塩勾配で行われる。カラムから溶出された画分は、好都合には、VacA特異的抗血清を用いたウェスタンブロットによりVacAについてアッセイされる。 VacAは、VacAを含む画分をプールし、そしてこのタンパク質を濃縮することによって単離され得る（例えば、硫酸アンモニウムでの沈澱、PBSへの再懸濁、そしてこれに次ぐサイズ分離による）。この後者の工程は、例えばPBSで平衡化されたSuperose 6（Pharmacia）カラムにおいて行われ得る。好ましくは、この方法は、本発明の第一の局面で記載したような、グルコースを補充した培地においてH．pyloriを培養する工程をさらに包含する。本発明はまた、H．pylori感染に対して生物をワクチン接種するための方法を提供する。この方法は、上記のVacA試料を調製する工程、およびそれによって調製されたVacAを含む組成物、あるいはH．pylori特異的免疫原性を保持するVacA のフラグメントまたは誘導体を生物に投与する工程を含む。本発明のワクチンは、当該分野で公知のいくつかの技術により処方され得る。本発明のワクチンは、予防的（感染を防ぐために）または治療的（感染後の疾患を処置するために）のいずれでもあり得る。このようなワクチンは、単数または複数の抗原を含む。通常は、「薬学的に受容可能なキャリアー」と組み合わせる。この「薬学的に受容可能なキャリアー」には、それ自身では、組成物を受容する個体に有害な抗体生産を誘導しない任意のキャリアーが含まれる。適切なキャリアーは、代表的に大きく、ゆっくりと代謝されるマクロ分子である（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸重合体、アミノ酸共重合体、脂質集合体（aggregates）（例えばオイル小滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子）。このようなキャリアーは当業者において周知である。さらに、これらのキャリアーは、さらなる免疫剌激剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、この抗原は、細菌類毒素（例えば、ジフテリア、破傷風、コレラ、H ．pyloriなどの病原体由来の類毒素）に結合され得る。免疫原性の組成物（例えば、抗原、薬学的に受容可能なキャリアー、およびアジュバント）は、代表的には希釈液（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含む。さらに、補助的物質（例えば、湿潤剤、または乳化剤、pH緩衝化剤など）が、このようなビヒクル中に存在し得る。ワクチンとして用いられる免疫原性の組成物は、免疫学的に有効な量のアジュバントおよび抗原、ならびに必要な場合、任意の他の上記の成分を含む。「免疫学的に有効な量」によって、単回用量でまたはシリーズの一部としてのいずれかでの個体への免疫学的に有効な量の投与は、処置または予防に効果的であることが意味される。この量は、以下に依存して変化する：処置されるべき個体の健康状態および肉体状態、処置されるべき個体の分類学的グループ（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系の抗体合成能、所望される防御の程度、ワクチンの処方物、処置している医者の医学的状態の評価、および他の関連因子。この量は、日常の試験により決定され得る相対的に広い範囲内に入ることが期待される。投薬処置は、単回用量計画または複数回用量計画により行われ得る。ワクチンは、他の免疫調節剤と共に投与され得る。特定の好ましい実施態様において、本発明によるワクチンは粘膜アジュバント（mucosal adjuvant）との組み合わせで投与される。この粘膜アジュバントは、好都合には、本発明者らの同時係属中の英国特許出願第9326174.1号で「粘膜アジュバント」と命名された、細菌のADP-リボシル化（ribosylating）毒素の変異体である。本発明は、ワクチンとして用いるための組成物の調製について本発明の第一の局面に記載に従って調製されたVacAの使用を提供する。ここで本発明を、単に例示する目的のために、以下の図の参照と共に以下の実施例において記載する。図１は、７Lのバイオリアクター中に２g/Lシクロデキストリンを含むbrucella broth培地中のH．pylori CCUG 17874の生育の速度論を示す；図２は、グルコースの流加が使用された以外は、図１で示された実験と同一の実験の生育の速度論を示す。図３は、グルコースを流加する（Ａ）、および流加しない（Ｂ）H．pyloriの増殖中のVacA濃度を示す。図４は、吸光度280mmで測定したMatrexカラム（実線）からのタンパク質の溶出プロフィールを示す。Nacl濃度勾配を点線で示す。図５は、Superose６カラムから部分的に精製されたサイトトキシン溶出物の、Ａ₂₈₀のプロフィールを示す。図６は、精製されたサイトトキシンのSDSゲルのクマシーブルーでの染色（Ａ）、およびＡで示された材料のイムノブロット（Ｂ２）、ならびにプロセスされた37kDaおよび58kDa産物示す同様の調製物（Ｂ１）を示す；および図７は、サイトトキシンの空胞化活性の、精製されたVacAに対して惹起した抗血清による中和を示す。図８は、スケールアップ（30L発酵槽）反応における、H.pyloriの増殖曲線およびVacA生産を示す。ここでVacAは上清中（VacA(s)）、およびペレットと結合して（VacA(p)）見い出され得る。実施例実施例１グルコース補充培地におけるVacA生産材料および方法細菌株 Helicobacter pylori CCUG 17874（型株、培養物コレクション、Univ ersity of Goteborg）が、本研究で用いられた。培地および補充物以下の抗生物質（全てSigmaによる）によって補充されたC olumbia blood agar（CBA）（Difco）：セフスロジン６mg/L、バンコマイシン５ mg/Lが、CFU決定のための固形培地として用いられた。２g/L（2,6 ジ-o-メチル）-β-シクロデキストリン（CD）（Teijin Lim．Tokyo，Japan）および上記抗生物質を補充されたBrucella Broth（BB）（Difco）を、液体培地として使用した。保存接種源のための凍結アリコートが調製され、そして、溶液（グリセロール40％、ウシ胎児血清（HyClone，Logan，Utah）20％、および0.4％ CD）により１：２に希釈された。得られた懸濁物は、1.5mlのバイアルに分注され、-80℃で保存された。液体培地での増殖最初の培養は、液体培地30mlを入れた130mlの三角フラスコ中で行った。凍結保存物１mlを培養物に接種し、微好気条件で、36℃で36時間振盪培養（100rpm、2.5cm幅（throw））した。フラスコを、BBL Campy Pak enve lope（Becton Dickinson）を用いて適切な条件にした好気的ジャー（jar）に置いた。次いでこれらの培養物を用いて、150mlの培地を入れた500mlフラスコに接種し、そして上記と同じ条件下で培養した。これらの培養物を用いて、バイオリアクターに接種した。培養器および増殖条件回分発酵は、５Lの培地を含む７Lのバイオリアクター（MBRバイオリアクターAG,8620 Wetzikon，CH）で行った。全ての培養物は、3 6℃で増殖した。pHの制御は行われなかった。溶存酸素圧力（tension）（DOT）は、２段階の方法によりプレセット（pre-set）レベル（５％）に、自動的に保たれた。最初に、空気流速を、培地のO₂要求の増大を満たすために、0.1L/L・分から0.5 L/L・分まで増大した。さらに増大が必要な場合は、純粋なO₂を最大0.4 L/L・分まで供給することによって得たN₂およびCO₂の一定流量は、それぞれ0.2L/ Lおよび0.02 L/L・分と同等に保たれた。攪拌速度は、130rpmに保たれた。攪拌器シャフトは、直径７cmを有する２本のRhustonタービンを備え、そして、バイオリアクターの直径は17cmであった。グルコースの流加 50％のグルコース溶液を用いた。バイオマスの決定増殖を、CFU決定法および水のブランクに対する590nmでの光路１cmの光学密度（PerKin Elmer 35分光光度計）によりモニターした。試料の純度のチェックは、グラム染色および試料をCBAプレート上で二次培養（通常の大気中で37℃、24時間インキュベートした）することにより行った。 VacA タンパク質の定量分析条件発酵中の決定された時間点において、培養試料を、8300×gで10分間の遠心分離（Biofuge A,Heareus）を行った。上清をトリクロロ酢酸で沈殿し、そしてBioRad Mini Protean II装置を用いて、９％SDS-PAGEを行った。タンパク質を、ニトロセルロースフィルター（Schlel che & Schuell）に移し、次いで、VacAタンパク質に対して惹起したポリクローナル抗血清（Telfordら；前出）と共に、一晩インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Sigma）と共に２時間インキュベートした後、免疫反応性のバンドを、４-クロロナフトール染色によって可視化した。各イムノブロットについて、培養上清中のシクロトキシンの量を、既知の量の精製されたVacAタンパク質により得られた標準曲線を用いて評価した。定量的評価を、Im age Master Desk Top Scanner（Pharmacia）を用いて、1D反射率方式で超スキャナー（Ultrascanner）濃度計により行った。グルコースアッセイ Glu-cinet、グルコース試験（Sclavo S.p.A.,Italy）を使用した。結果図１に示すように、H．pyloriの増殖は、グルコースを流加しない場合には、培地中にグルコースが存在する限り、指数関数的であり、そして、これらの条件下での倍加時間は、7.5時間であると見積もられた。定常期は、培地のO.D.が約2 .5の値に到達した時に、結果として起こる。本発明者らは、CFUの測定も、増殖中の様々な時期の間に行った（図１）。明らかに示されているように、CFU曲線は、グルコースが涸渇されない限り、O.D.曲線によく相関していた。本明細書中に記載された培養条件において、本発明者らは、培地のpH値の低下（33時間の増殖後には6.9から6.7に）を観察した。pH値は次いで、増殖期の最後には7.4の値に到達し、そして定常期の終わりには7.9の値に到達した。broth中のVacAの蓄積を、図３(Ａ)に報告する。VacAの最大濃度（5mg/L）は、65時間で到達し、そして少なくとも10時間一定のまま保たれることが観察され得る。これらの最初の結果より、生産されるVacA量が、蓄積された全細胞量に関係し得ることが推測された。この仮説を証明するために、グルコースの流加を用い、この炭素源およびエネルギー源が常に培地中に存在することを確実にした。図２は、これらの条件下で増殖が、7.7O.Dユニットの値および３×10⁹/mlのCFUに達することを示す。グルコースが完全に代謝された時（図１）に得られた結果とは逆に、この場合時間に対するCFU曲線が、O.D.値を用いて得られた曲線と、より関係している。グルコースの流加なしの発酵（図１）については、定常期におけるpH値でさえ、明らかに異なる。この型の発酵においては、グルコースの存在は、培地の緩衝能力（CO₂ 生産能力により）が増大し、そして細胞容菌を回避した。最終的なpH値は、グルコースを流加しない発酵の7.9に対し7.6であった。H．pyloriをグルコース存在下で培養した場合、培地中のVacA濃度は、19mg/Lという非常に期待できる値に到達した。実施例２スケールアップ 15Lの培地（トリプトン 10g/L、Y.E．５g/L、NaCl ５g/L、シクロデキストリン２g/L、グルコース５g/L（本培地は、BBの単純化したものである）からなる）を入れた30Lの発酵槽中で、H．pyloriのスケールアップ培養を行った。表面の曝気は、酸素および攪拌によりDOTを５％に保つことにより行った。５g/Lのグルコースの流加を、OD反応が約３に到達した時供給した。倍加時間は、５時間であった。pHの制御は行わなかった。得られた増殖曲線およびVacA生産を、図８に示す。VacAは上清中（VacA(s)）、およびペレットと結合して（VacA(p)）見い出され得る。実施例３ VacA の精製 Helicobacter pylori CCUG 17874株（実施例１）の約５Lの培養物から得たバイオマスを、11000×g、20分間の遠心分離で除去し、そして上清液（約４L）を、固体の硫酸アンモニウムを加えることにより、50％飽和にした。この懸濁物を、11000×gで20分間遠心分離し、そして、沈澱したタンパク質を、100mM NaCl、 20mM リン酸塩 pH6.5（緩衝液Ａ）に再懸濁した。このようにして得られた懸濁物を、緩衝液Ａに対して大規模に透析した。透析物は、250mLの容量に調節し、そして流速2.5mL/分で、緩衝液Ａで平衡化したMatrex^TM（硫酸セルロース、Amicon，Danver，Mass.）を含む2.5×11cmカラム（Econo column，Bio Rad）にアプライした。緩衝液Ａで大規模に洗浄した後、カラムから20mMリン酸緩衝液（pH6.5）中のNacl濃度勾配（0.1M〜1.5M）により、タンパク質を溶出し、そして、280nmにおける吸光度によってモニターした（図４）。0.5Mと0.8M Naclとの間の溶出物（VacAタンパク質を含む）を回収し、そして硫酸アンモニウムによって50％飽和にした。この懸濁物を11000×gで20 分間遠心分離し、そしてペレット化したタンパク質を3.5mLのPBSに再懸濁した。不溶性物質を、85000×gで30分間の遠心分離によって除去し、そして、透明な溶液を、Superose 6（Pharmacia，Uppsala，Sweden）を充填した16mm×81mmカラムにアプライした。タンパク質を、14mL/時間の流速でPBSにより溶出し、そして28 0nmの吸光度によってモニターした（図５）。カラムからのピーク２（図５）に対応する画分は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクマシーブルー染色による分析においては、その顕著な94kDa のポリペプチドを含む（図６Ａ）。特異的ウサギ抗VacA抗血清を用いたこれらの産物のイムノブロッティングにより、94kDaのポリペプチドが、VacAタンパク質であることが明らかにされた（図６Ｂ）。時折、37kDaおよび58kDaのポリペプチドの跡がイムノブロットにおいて検出され得た。これは、Telfordら（J.Exp.M ed.，179:1653，1994）により既に述べられたように、プロセスされた分子に対応する。精製された画分中のタンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準として用いたMicro BCAタンパク質アッセイ試薬キット（Pierce，Rockford,Ill）を用いて測定した。１Lの培養物あたり約１gのタンパク質が得られ、これは全毒素の15％の収率に相当した。ウサギを、アジュバントとして1mg/ml水酸化アルミニウム溶液1ml中に、精製した毒素各25μgを、７日の間隔をあけて４用量を皮内に注入することにより免疫した。免疫グロブリンを、プロテインＧセファロースを用いて精製し、そして、インビトロの空胞形成アッセイにおいて、そのVacAサイトトキシン活性を中和する能力をテストした（Papiniら、Mol．Microbiol 7:323，1993 ）。精製したIg画分の連続的な希釈物を、細胞に加える前に、培養培地100μｇ中の精製毒素1.85μgと共にインキュベートした。1:100に希釈した場合において、抗体は、完全にサイトトキシン活性を中和し得た（図７）。実施例４ VacA を用いた免疫化による被験体の予防マウス（６週齢CD1/SPFおよびBALB/C（Charles River，Calco Italy)）に、単離した新鮮なH．pylori（本発明らの対応する英国特許出願第9419661.5号において記載された。本明細書中に参考として援用される）を注入した。マウスの、H．pylori感染の免疫化による予防の可能性を評価するために、本発明により得られた精製されたVacAを、１日、14日、および21日でH．pylori 10 0mgのVacAとLT粘膜アジュバントとを組み合わせて経口投与し、そしてLT 100mg を各用量で投与した。 28日、30日、および32日目において免疫したマウスに、上記の感染手順に従って、H．pyloriをチャレンジした。42日目に、マウスを屠殺し、H．pyloriによる胃粘膜のコロニー形成を評価した。この結果を表１に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】１．空胞化サイトトキシンを生産するためにH．pyloriを培養するための方法であって、１g/Lを越えるグルコースを含む培地においてH．pyloriを培養する、方法。２．前記培地が、グルコースおよび血液産物を補充したBrucella Broth培地である、請求項１に記載の方法。３．前記培地が、グルコースおよびシクロデキストリンを補充したBrucella B roth培地である、請求項１に記載の方法。４．前記グルコースが、複数回または流加培養プロセスにおいて連続的に流加することによって供給される、前記請求項のいずれかに記載の方法。５．前記培地の前記グルコース濃度が、培養期間を通じて２g/Lと６g/Lとの間に維持される、前記請求項のいずれかに記載の方法。６．H．pylori空胞化サイトトキシンを生産するための方法であって、請求項１〜５のいずれか１つに記載のグルコース補充培地において、H．pyloriを培養する工程を包含する、方法。７．前記サイトトキシンを硫酸セルロースマトリックスに吸着し、およびその後、塩濃度勾配を用いてそれを溶出することにより、該サイトトキシンを精製する工程をさらに包含する、請求項６に記載の方法。８．H．pylori空胞化サイトトキシンを精製するための方法であって、以下の工程：ａ）H．pyloriの発酵液の上清中のタンパク質を濃縮するために、該上清を処理する工程；ｂ）100mM NaClに相当する塩濃度を含有する緩衝液中に、該タンパク質を懸濁する工程；ｃ）硫酸セルロースカラムに該タンパク質を吸着させる工程；ｄ）リン酸緩衝液pH6.5中の0.1Mから1.5MのNaClに相当する塩濃度勾配を用いて、カラムから結合した該タンパク質を溶出する工程；ｅ）該空胞化サイトトキシンを含む溶出物の画分を選択する工程；ｆ）必要に応じて、該サイトトキシンをさらに濃縮し、そして制御された細孔マトリックスを用いて該濃縮物をサイズ分離する工程、を包含する、方法。９．工程ａ）が、硫酸アンモニウム中の沈澱反応を包含する、請求項８に記載の方法。１０．工程ａ）およびｂ）が、試料の接線濾過およびダイアフィルトレーションを含む、請求項８に記載の方法。１１．前記サイトトキシンの精製が、請求項８〜１０のいずれか１つに記載のように行われる、請求項７に記載の方法。１２．ワクチンとして使用するための組成物の調製において、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の方法により調製される場合の、H．pylori空胞化サイトトキシンの使用。１３．H．pylori感染に対して生物をワクチン接種するための方法であって、請求項１〜１１のいずれか１つに記載のように、H．pylori空胞化サイトトキシン試料を調製する工程、および、該サイトトキシンを含む組成物を該生物に投与する工程を包含する、方法。