BRPI0609692A2 - processos de fermentação, de fabricação de uma preparação de um antìgeno de c. diphtheriae e de fabricação de uma composição farmacêutica, e, usos do antìgeno, toxina de difteria ou mutante da mesma, e de uma composição farmacêutica - Google Patents
processos de fermentação, de fabricação de uma preparação de um antìgeno de c. diphtheriae e de fabricação de uma composição farmacêutica, e, usos do antìgeno, toxina de difteria ou mutante da mesma, e de uma composição farmacêutica Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0609692A2 BRPI0609692A2 BRPI0609692-1A BRPI0609692A BRPI0609692A2 BR PI0609692 A2 BRPI0609692 A2 BR PI0609692A2 BR PI0609692 A BRPI0609692 A BR PI0609692A BR PI0609692 A2 BRPI0609692 A2 BR PI0609692A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- process according
- fermentation
- antigen
- fermentation step
- diphtheriae
- Prior art date
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 109
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 108
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 title claims abstract description 45
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 41
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 41
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 title claims description 51
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 title claims description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 74
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims abstract description 45
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 22
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 21
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000013019 agitation Methods 0.000 claims abstract description 18
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims abstract description 8
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 claims description 51
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 43
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 32
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 32
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 24
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 19
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 19
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 12
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 10
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 10
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims description 9
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims description 9
- 239000006260 foam Substances 0.000 claims description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 claims description 2
- 159000000014 iron salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 22
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 22
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 13
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 7
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 101710183389 Pneumolysin Proteins 0.000 description 6
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 5
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 4
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 4
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 4
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 4
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 3
- -1 CRM228 Proteins 0.000 description 3
- 102100037840 Dehydrogenase/reductase SDR family member 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001212279 Neisseriales Species 0.000 description 3
- 101710188053 Protein D Proteins 0.000 description 3
- 101710132893 Resolvase Proteins 0.000 description 3
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 3
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010034055 CRM45 fragment of diphtheria toxin Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102100031334 Elongation factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010077519 Peptide Elongation Factor 2 Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710099976 Photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein A1 Proteins 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 2
- 108010031133 Transferrin-Binding Protein A Proteins 0.000 description 2
- 108010031127 Transferrin-Binding Protein B Proteins 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000027326 copulation Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 2
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 2
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XILIYVSXLSWUAI-UHFFFAOYSA-N 2-(diethylamino)ethyl n'-phenylcarbamimidothioate;dihydrobromide Chemical compound Br.Br.CCN(CC)CCSC(N)=NC1=CC=CC=C1 XILIYVSXLSWUAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 6-[3-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperidin-1-yl]-3-oxopropyl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1CCN(CC1)C(CCC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1)=O DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ALEBYBVYXQTORU-UHFFFAOYSA-N 6-hydrazinyl-6-oxohexanoic acid Chemical compound NNC(=O)CCCCC(O)=O ALEBYBVYXQTORU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 101000679617 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) Pertussis toxin subunit 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010053406 CRM 107 Proteins 0.000 description 1
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 1
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 1
- XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N Cyanamide Chemical compound NC#N XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000874355 Escherichia coli (strain K12) Outer membrane protein assembly factor BamA Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 101100406392 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) omp26 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 101000873843 Homo sapiens Sorting and assembly machinery component 50 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000926057 Human herpesvirus 2 (strain G) Envelope glycoprotein C Proteins 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- QVLMCRFQGHWOPM-ZKWNWVNESA-N N-arachidonoyl vanillylamine Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCC1=CC=C(O)C(OC)=C1 QVLMCRFQGHWOPM-ZKWNWVNESA-N 0.000 description 1
- 241001644525 Nastus productus Species 0.000 description 1
- 102100035181 Plastin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100035853 Sorting and assembly machinery component 50 homolog Human genes 0.000 description 1
- 241001505901 Streptococcus sp. 'group A' Species 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000004103 aerobic respiration Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 235000019365 chlortetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 108091016312 choline binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 101150059761 ctrA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004643 cyanate ester Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- SYECJBOWSGTPLU-UHFFFAOYSA-N hexane-1,1-diamine Chemical compound CCCCCC(N)N SYECJBOWSGTPLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229940052778 neisseria meningitidis Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 108010021711 pertactin Proteins 0.000 description 1
- 108010049148 plastin Proteins 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000029219 regulation of pH Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
PROCESSOS DE FERMENTAçãO, DE FABRICAçãO DE UMA PREPARAçãO DE UM ANTìGENO DE C. DIPHTHERIAE E DE FABRICAçãO DE UMA COMPOSIçãO FARMACêUTICA, E, USOS DO ANTìGENO, TOXINA DE DIPTERIA OU MUTANTE DA MESMA, E DE UMA COMPOSIçãO FARMACêUTICA. A presente invenção refere-se a um processo de fermentação compreendendo uma etapa de fermentação de cultivo de uma cepa de Corynebacterium diphtheria em meio em um fermentador sob condições de agitação suficientes para manter uma cultura homogênea e aeração limitada, de modo que o pO2 dentro da cultura cai a menos de 4% na maior parte da etapa de fermentação.
Description
"PROCESSOS DE FERMENTAÇÃO, DE FABRICAÇÃO DE UMAPREPARAÇÃO DE UM ANTÍGENO DE C. DIPHTHERIAE E DEFABRICAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DOANTÍGENO, TOXINA DE DIFTERIA OU MUTANTE DA MESMA, E,MÉTODO DE PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE INFECÇÃOBACTERIANA"
A presente invenção refere-se ao campo de antígenos dedifteria, particularmente toxinas (incluindo formas mutantes de toxina dedifteria, como CRM197) e processos de fermentação para a fabricação deculturas em bruto destes antígenos.
A toxina de difteria é uma exotoxina de proteína produzidapela bactéria Corynebacterium diphtheria. Ela é produzida como umpolipeptídeo único que é prontamente emendado para formar duassubunidades ligadas por uma ponte dissulfeto, fragmento A e fragmento B,como um resultado da clivagem em resíduo 190, 192 ou 193 (Moskaug et alBiol. Chem. 264: 15709-15713, 1989. O fragmento A é a porçãocataliticamente ativa e é uma ADP- ribosiltransferase dependente de NADque especificamente marca um fator EF-2 de síntese de proteína, assiminativando EF-2 e parando a síntese de proteína em uma célula.
A imunidade a uma toxina bacteriana, como toxina de difteria,pode ser adquirida naturalmente durante o curso de infecção, ouartificialmente por injeção de uma forma destoxificada da toxina (toxóide)(Germanier, er, Bacterial Vaccines, Academic Press, Orlando, Fl., 1984). Ostoxóides tem sido tradicionalmente feitos por modificação química de toxinasnativas (Lingood et al Brit. J. Exp. Path. 44, 177, 1963), tornando as mesmasnão tóxicas enquanto retendo uma antigenicidade que protege o animalvacinado sobre desafio subseqüente pela toxina natural. Alternativamente,várias toxinas de difteria mudadas foram descritas que tem toxicidadereduzida. (US4709017, US4950740).CRM197 é uma forma não tóxica da toxina de difteria mas éimunologicamente indistinguível da toxina de difteria. CRM197 é produzidopor C. diphtheriae infectado pela fase não toxigênica P 197tox-, criada pelamutagenese de nitrosoguanidina do carinefago b toxigênico (Uchida et alNature New Biology (1971) 233; 8-11 ). A proteína CRM197 tem o mesmopeso molecular que a toxina de difteria mas difere da mesma por umamudança de fase única no gene estrutural. Isto leva a uma mudança de glicinaem glutamina de aminoácido em posição 52 que torna o fragmento A incapazde ligar NAD e, assim, é não tóxico ((Pappenheimer 1977, Ann Rev,Biochem. 46; 69-94, Rappuoli Applied Environmental Microbiology Set.1983 p560-564).
O toxóide de difteria e uma forma mutante com toxicidadereduzida, CRM197, são componentes em muitas vacinas provendo imunidadecontra Corynebacterium diphtheriae. Várias vacinas de combinação sãoconhecidas as quais podem evitar Bordetella pertussis, Clostridium tetani,Corynebacterium diphtheriae, e opcionalmente vírus de hepatite B e/ouHaemophilus influenzae tipo b (ver, por exemplo, WO 93/24148 e WO97/00697, WO 02/055105).
A toxina de difteria e as formas mutantes incluindo CRM197também foram usadas em vacinas como veículos dependentes de células Tefetivos para sacarídeos. CRM197 é atualmente usado na vacina conjugada deCRM197 oligossacarídeo tipo B de tipo de Haemophilus influenzae (HibTitre®; Lederle Praxis Biologicals, Rochester, N.Y.).
Os métodos de preparação de toxina de difteria (DT) são bemconhecidos na arte. Por exemplo, DT pode ser produzido por purificação datoxina a partir de uma cultura de Corynebacterium diphtheriae seguido pordestoxificação química, ou pode ser feito por purificação de um análogodestoxificado geneticamente, ou recombinante, da toxina (por exemplo,CRM197, ou outros mutantes como descrito em US 4,709,017, US 5,843,711,US 5,601,827, e US 5,917,017). Corynebacterium diphtheriae é cultivado sobcondições aeróbicas. Rappuoli et al (Biotechnology Fevereiro 1985, plól-163) sugeriram que p02 pode ser regulado a 25% por aeração com umamistura de ar e oxigênio que é automaticamente regulada para manter o p02desejado.
A produção de quantidades significantes de toxinas de difteriacomo CRM197 para uso em vacinas foi impedida devido à pequenaabundância de proteína. Este problema foi dirigido previamente porintrodução de outras cópias de um gene codificando toxina de difteria ou umaforma mutante em Corynebacterium diphtheriae (US 4,925,792; US5,614,382). Estes métodos levam a um aumento na produção de cerca de trêsvezes. Os métodos de ainda melhorar os rendimentos de toxina de difteria emum modo reprodutível podem ser de benefício para permitir maiores níveis deprodução destes antígenos valiosos.
Conseqüentemente, o presente pedido prove um processo defermentação melhorado compreendendo uma etapa de fermentação de cultivode uma cepa de Corynebacterium diphtheria em um meio em um fermentadorsob condições de agitação suficientes para manter uma cultura homogênea eaeração limitada como p02 dentro da cultura está a menos de 4% para amaior parte da etapa de fermentação.
A fermentação ocorre sob condições aeróbicas, mas de aeraçãolimitada, como que oxigênio é usado logo que ele entrada na cultura durante amaior parte da fermentação, isto é, após a fase inicial em que a densidade deC. diphtheriae é relativamente baixa e os níveis de p02 podem ser maiores.
Os inventores verificaram que a cultura sob estas condições resulta em umaexpressão mais eficiente e/ou consistente de toxina de difteria ou mutantecomparado com os métodos de fermentação realizados em maior p02. Oprocesso da invenção é mais robusto do que a fermentação em níveis maioresde oxigênio, e permite que os rendimentos de toxina de difteria permaneçamelevados mesmo quando o meio de cultura cotem ferro adicionado ou quandomatérias primas complexas de qualidade variável são usadas.
Em um segundo aspecto da invenção, provê-se um processopara a fabricação de uma preparação de toxina de difteria ou seu mutantecompreendendo realizar o processo de fermentação da invenção e isolar atoxina de difteria ou seu mutante da cultura. Apesar da toxina de difteria emutantes serem descritos aqui, visa-se que qualquer antígeno de C.diphtheriae possa ser isolado usando o processo da invenção.
O uso deste método resulta em maiores rendimentos de toxinade difteria ou mutante, por exemplo, CRM197, comparado com quando semantém 5% p02 ou maior, por exemplo 20%.
Em um terceiro aspecto da invenção, provê-se uma toxina dedifteria ou seu mutante isolado pelo processo da invenção.
Em um quarto aspecto da invenção, provê-se uma composiçãofarmacêutica compreendendo a toxina de difteria ou seu mutante da invençãoe um veículo farmaceuticamente aceitável.
Em um outro aspecto da invenção, provê-se uma toxina dedifteria ou seu mutante para uso em terapia, particularmente para o tratamentode prevenção de doença bacteriana como doença causada por C. diphtheriae.
Em um outro aspecto da invenção, provê-se um uso da toxinade difteria ou seu mutante da invenção na preparação de um medicamentopara o tratamento ou prevenção de doença bacteriana, particularmente doençacausada por C. diphtheriae.
Em um outro aspecto da invenção, provê-se um método deprevenção ou tratamento de infecção bacteriana, particularmente infecção porC. diphtheriae compreendendo a administração da composição farmacêuticada invenção a um paciente.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1 - Gráficos mostrando o perfil de oxigenação e seu usona determinação de KLa de uma fermentação. O painel A mostra o curso detempo de oxigenação após uma mudança de nitrogênio para ar. O painel Bmostra um gráfico de In(100-pO2) contra tempo, que permite a avaliação deKLa por determinação do gradiente da linha.
Figura 2 - Esquema de um processo de fermentação para C.diphtheriae.
Figura 3 - Gráfico mostrando a cinética típica de crescimentode uma cultura de C. diphtheriae. A linha com marcadores circulares mostra oOD a 650 nm após vários tempos de cultura. A linha marcada com diamantesmostra o pH da cultura.
Figura 4 - Géis SDS-PAGE dos sobrenadantes de cultura. C.Trilha 1 - marcadores de peso molecular, trilha 2 - lug CRM197 padrão, trilha3 - 0,5ug CRM197 padrão, trilha 4 - 0,25ug CRM197 padrão, trilhas 5-11,sobrenadantes de fermentações de C. diphtheriae. Gel A mostra ossobrenadantes de CDT082 em trilha 5, CDT198 em trilhas 6-8 (osobrenadante foi removido a 22,5 horas para trilha 6, 24 horas para trilha 7 e28 horas para trilha 8), CDT199 em trilhas 9, 10 e 11 (o sobrenadante foiremovido a 22 hora 45 minutos em trilha 9, 24 horas 45 minutos em trilha 10e após subseqüente microfiltração e filtração em trilha 11 ). Gel B mostrasobrenadantes de CDT082 em trilha 5, de CDT205 em trilhas 6-9 (trilha 7após 21 horas 43 minutos de fermentação, trilha 8 após 23 horas fermentação,trilha 9 após 24 horas de fermentação) e de CDT206 em trilhas 10-13 (trilha10 após 22 horas 10 minutos de fermentação, trilha 11 após 23 horas 49minutos de fermentação, trilha 12 após 24 horas 30 minutos de fermentação,trilha 13 após microfiltração e filtração).
Figura 5 - Gráfico mostrando o KLa de um fermentador de 150litros em diferentes velocidades de agitação sob condições de aeração de 23litros por minuto.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃOOs termos "compreendendo", "compreender", "compreende"aqui se destinam pelos inventores a serem opcionalmente substituíveis com ostermos "consistindo de", "consistir de" e consiste de", respectivamente, emcada caso.
Um aspecto da invenção é um processo de fermentaçãocompreendendo uma etapa de fermentação de cultivo de uma cepa deCorynebacterium diphtheria em meio em um fermentador sob condições deagitação suficientes para manter uma cultura homogênea (por exemplosuficiente para produzir um tempo de mistura de menos que 30, 20, 15,10, 9,8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 segundos) e aeração limitada de modo que p02 dentroda cultura está a menos que 5%, 4%, 3%, 1 % ou 0,5% para a maior parte daetapa de fermentação. Em uma forma de realização preferida, o p02 cai parase aproximar de zero, preferivelmente na maior parte da etapa defermentação.
Por exemplo, o p02 com a cultura cai a menos que 5%, 4%,3%, 1% ou 0,5% do tempo quando Corynebacterium diphtheria foi cultivadaa uma densidade suficiente para consumir a maior parte do oxigênio logo queo oxigênio entra na cultura (fase de latência, por exemplo de pelo menos 1,2,3, 4, 5 ou 6 horas após o início de fermentação), até o ponto da fermentaçãoquando a concentração de p02 se eleva novamente, próxima do final da etapade fermentação (por exemplo 16, 18, 20, 22 ou 24 horas após a fase de latência).
A fermentação tipicamente termina e a cultura é colhidaquando p)2 se eleva acima das condições de aeração limitadas. Deve-se notarque sob condições de inoculação diferentes, por exemplo, quando ofermentador é inoculado com uma cultura bem maior de C. diphtheriae, ascondições de aeração limitadas começam desde logo após o início defermentação (por exemplo 1,5, 10, 20, 30, 40 ou 60 minutos após o início defermentação).Um p02 a 100% é a quantidade de oxigênio presente quando omeio (na ausência de uma cultura) é saturado com oxigênio apósborbulhamento de ar comprimido através do meio a 34,5 °C e pressão de 0,5bar. Para um fermentador de 150 litros, a taxa de aeração e velocidade deagitação devem ser ajustadas a 23 litros/ min e 240 rpm, enquanto para umfermentador de 20 litros, a taxa de aeração e velocidade de agitação devem serajustadas a 3 litros/ min e 300 rpm. Isto deve ser fixado como a quantidade deoxigênio presente em um meio de fermentação completamente aerado antesda inoculação.
Uma cultura homogênea é uma cultura em que as bactérias sãouniformemente dispersas em todo o fermentador de modo que pelo menos 3,4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10% das bactérias estão presentes nos 10% superiores omeio de cultura.
Uma etapa de fermentação é definida como a etapa em queCorynebacterium diphtheriae é cultivado dentro do fermentador. A etapa defermentação começa com a introdução da pré-cultura no fermentador etermina quando, sob as condições de aeração limitada aqui descritas, o p02eventualmente aumenta a acima de 10%. A etapa de fermentação tipicamentedura acima de 12, 14, 16, 18, 20 ou 24 horas, por exemplo entre 16 e 40horas, ou por exemplo entre 22 e 28 horas.
A agitação é opcionalmente por agitação da cultura nofermentador mas pode ser qualquer outro meio apropriado, por exemplo poragitação, vibro-misturador e/ou borbulhamento de gás. A agitação é suficientepara produzir um tempo de mistura para a cultura de menos que 20, 15, 10, 8,7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 segundos.
Um tempo de mistura de uma cultura pode ser medido em umfermentador de vidro. Este é o tempo que leva após a introdução de umasolução aquosa colorida para a solução aquosa colorida ser uniformementedispersa em todo o meio de cultura.Um fermentador é um aparelho apropriado para a produçãoindustrial de culturas bacterianas. No entanto, este termo não inclui frascos decultura que são tipicamente usados para crescimento de bactérias em umaescala menor.
A maior parte da etapa de fermentação é definida como umtempo de mais que 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% do comprimento total daetapa de fermentação. A fermentação é tipicamente sob condições de aeraçãolimitada de 12, 14, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 28 horas.
A aeração limitada descreve condições de aeração quepermitem que o C. diphtheriae use respiração aeróbica e ainda limite aquantidade de oxigênio disponível de modo que, após a cultura ter aumentadoem densidade (por exemplo, após pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10horas de fermentação) oxigênio é consumido muito lentamente após entrar nacultura, de modo que o p02 é menor que 5, 4, 3, 2, 1 ou 0,5%. Deve-se notarque por aumento da quantidade de cultura usada para inocular o fermentador,as condições de aeração limitada podem ser obtidas muito perto após ainoculação (por exemplo após 1, 5, 10, 20 ou 30 minutos após o início dafermentação).
Estas condições de aeração limitada levam a uma expressãorobusta de uma toxina, como toxina de difteria ou seus mutantes.
Um p02 caindo a se aproximar de zero é obtido pela taxa deaeração e agitação sendo tais que o oxigênio introduzido na cultura é usadapela cultura para respiração logo após sua introdução na cultura de modo aque, apesar da aeração da cultura, o p02 está pronto como zero ou próximo dezero em um monitor de oxigênio.
Durante a etapa de fermentação, o p02 irá começar em umnível maior para um dado ajuste de agitação e taxa de aeração. Isto é porque adensidade de bactérias na cultura é baixa no início da etapa de fermentação eaumenta durante a etapa de fermentação. Um período de tempo (por exemploaté 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 horas) é tipicamente requerido antes de p02cair a menos que 5%. Deste ponto em diante, o p02 permanece abaixo de 5,4, 3, 2, ou 0,5%, preferivelmente a um nível se aproximando de zero até ficarpróximo do final da etapa de fermentação, por exemplo até a coleta dofermentador.
Opcionalmente, a etapa de fermentação é realizada em umKLa constante em toda a etapa de fermentação. Alternativamente, a etapa defermentação é realizada em um ou mais KLa, de modo que a aeração limitadaé obtida nos valores de KLa presentes durante a maior parte (pelo mesmo50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%) da etapa de fermentação.
KLa é uma medida da taxa em que oxigênio entra na cultura.Quanto maior o KLa, maior a taxa em que oxigênio é introduzido na cultura.Vários fatores incluindo o volume e composição do meio, agitação, aeração,pressão, temperatura e posição e características de partes móveis dofermentador irão influenciar o KLa de uma etapa de fermentação particular.
Tipicamente, oxigênio é introduzido na cultura de fermentaçãopor borbulhamento de ar comprimido através da cultura. Onde diferentesconcentrações de oxigênio estão presentes no ar introduzido na cultura, avazão deve ser adaptada a levar em conta este fato. por exemplo, onde umsuprimento de 100%» de oxigênio é introduzido na cultura, a vazão deve sercorrespondentemente menor. Onde o gás contendo menos oxigênio do que aré introduzido na cultura, uma maior vazão pode ser aplicada.
KLa pode ser medido usando o método descrito no exemplo 1.O método envolve ajustar o fermentador com as condições de volume de meio, temperatura, pressão, agitação e aeração pra as quais KLa deve sermedido, gaseificando por substituição do ar com gás nitrogênio, gaseificandopor restauração da aeração do ar e medindo a taxa em que p02 retorna paraseu nível de estado uniforme.
In(100-pO2) = -KLa.T + CAo traçar em gráfico In (100-pO2) contra tempo, o gradiente(ou coeficiente angular) da linha é - KLa.
O KLa de uma etapa de fermentação é influenciado por váriosfatores, incluindo a quantidade de agitação da cultura e a taxa de aeração dacultura. Um KLa constante pode ser mantido enquanto, por exemplo,diminuindo a agitação da cultura e aumentando a taxa de aeração ou vice-versa. No entanto, em uma forma de realização, tanto a agitação da culturacomo a taxa de aeração são constantes durante a etapa de fermentação.
A etapa de fermentação é realizada, por exemplo, a um KLa deentre 10-200h-l, 10 - 150 h-1, 10 - 100 h-1, 10-80 h-1, 10-50 h-1, 10-40h-l,10-30 h-1, 20-150 h-1, 20-100 h- 1, 20-50 h-1, 20-60 h-1, 20-80 h-1, 20-30 h-1, 20-40 h-1, 30-60 h-1, 60-80 h-1, 60-150 h- 1 ou 60-200 h-1.
O KLa do processo de fermentação da invenção pode diferir,dependendo do tamanho da cultura de fermentação. Para culturas de 10-30litros, um KLa de 10-30 h-1, 15-30, 20-30 ou 22-28 h-1 pode ser usado. Paraculturas de 30-250 litros, um KLa de 30-60 ou 40-50 h-1 pode ser usado. Paraculturas de 250-800 litros, um KLa de 30-50, 40-50, 40-60, 30-60, 30-80 ou60-150 h-1 pode ser usado. Para culturas de 800-3000 litros, um KLa de 30-50, 40-50, 40-60, 30-60, 30- 80, 60-150 ou 60-200 h-1 pode ser usado.
Para uma tamanho de cultura de fermentação e 10-30 litros,um KLa de 10-30 h-1 é obtido, por exemplo usando uma vazão de ar ouaeração de 1-5 litros/ min e uma velocidade de agitação de 200- 400rpm, porexemplo uma taxa de aeração de 2-4 litros/ min e uma velocidade de agitaçãode 250- 350 rpm.
Para uma cultura de fermentação de 30-250 litros, um KLa de30-60 h-1 é obtido, por exemplo usando uma vazão de ar de 15-25 litros/ mine uma velocidade de agitação de 150-250 rpm, por exemplo, usando umavazão de ar de 20-25 litros/ min e uma velocidade de agitação de 200-250rpm, por exemplo usando uma vazão de ar de 15-20 litros/ min e umavelocidade de agitação de 200-250 rpm.
O pH da cultura de C. diphtheriae em meio CY durante a etapade fermentação depende das condições de aeração e agitação da cultura(Nikolajewski et al J. Biological Standardization, 1982, 10; 109-114). Noinício da etapa de fermentação, o pH do meio CY é 7,4. No caso de aeraçãobaixa ou KLa, o PH cai a cerca de 5. No caso de aeração elevada, o pHaumenta a em torno de 8,5. Em uma forma de realização da invenção, o C.diphtheriae é cultivado em meio CY ou meio SOC ((Sambrook J et al 1989,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY) ou meio similar. O pH dentro do fermentadorpode ser mantido entre 7,0 e 7,8, pelo grau de aeração, opcionalmente semrequerer adição de ácido ou base.
O processo da invenção pode ser usado com qualquer cepa deCorynebacterium diphtheriae. Estas cepas podem produzir toxina de difteriade tipo selvagem, proteínas de fusão incluindo toxina de difteria ou seufragmento (por exemplo como descrito em US 5863891) ou formas mutantesou fragmentos de toxina de difteria, preferivelmente os que tem toxicidadereduzida. Os exemplos de toxinas mutantes são CRM 176, CRM 197,CRM228, CRM 45 (Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM9, CRM 45, CRM102, CRM 103 e CRM107 e outras mutações descritas porNicholls e Youle em Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, MareeiDekker Inc, 1992; deleção ou mutação de Glu-148 em Asp, Gln ou Ser e/ouAla 158 em Gly e outras mutações descritas em US 4709017 ou US 4950740;mutação de pelo menos um ou mais resíduos Lys 516, Lys 526, Phe 530 e/ouLys 534 e outras mutações descritas em US 5917017 ou US 6455673; oufragmento descrito em US 5843711. Em uma forma de realização, a cepa deC. diphtheriae produz CRM 197.
Em uma forma de realização, as seguintes cepas de C.diphtheriae são usadas nos processos da invenção; ATCC39255,ATCC39526, ATCC11049, ATCC11050, ATCC11051, ATCC11951,ATCC11952, ATCC13812, ATCC14779, ATCC19409, ATCC27010,ATCC27011, ATCC27012, ATCC296, ATCC43145, ATCC51280 ouATCC51696.
O meio para uso na invenção pode conter um ou mais dosseguintes constituintes : 5-20 g/L, 10-16g/L ou lOg/L ácidos de casamino ouhidrolisado de caseína, 5-20 g/L, 7-15g/L ou 9-12g/L peptona de soja e/ou 10-40g/L, 14-32g/L ou 18-22g/L de extrato de levedura.
Sabe-se que o teor de ferro do meio de crescimento pode afetaro crescimento de C. diphtheriae e influenciar a produção de toxinas (ver WO00/50449). Ferro é essencial para o crescimento bacteriano, no entanto, ferroem grandes concentrações foi demonstrado como inibindo a produção detoxina. Durante o processo da invenção, o teor de ferro do meio tem um nívelmenor do que 10, 50, 75, 100, 120 ou 150 ppb e um limite superior de 200,300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 ou 5000ppb. Por exemplo, concentrações de ferro no meio são: 50-1000 ppb, 100-1000 ppb, 200-1000 ppb, 400-1000 ppb, 500-1500 ppb, 700- 1300 ppb, 50-2000 ppb, 100-2000 ppb, 200-2000 ppb, 400-2000 ppb, 700-2000 ppb, 50-3000 ppb, 100-3000 ppb, 200-3000 ppb, 400-3000 ppb, 700-3000 ppb, 1000-3000 ppb, 1500- 3000 ppb, 1700-3000 ppb, 50-4000 ppb, 100-4000 ppb, 200-4000 ppb, 400-4000 ppb, 700- 4000 ppb, 1000-4000 ppb, 1500-4000 ppb,1700-4000 ppb ou 2000-4000 ppb. O ferro pode estar na forma de Fe2+ e/ouFe3+.
Em uma forma de realização, o processo da invenção ésuficientemente tolerante à presença de sais de ferro no meio de modo quenenhum tratamento do meio para remover ferro é requerido antes do uso.
A etapa de fermentação ocorre a uma temperatura apropriadapara a cultura de C. diphtheriae, por exemplo 25-45 °C, 25 -40 °C, 30-38 °C,ou 34-35 °C.A etapa de fermentação é submetida a uma grande quantidadede produção de espuma. A fim de controlar a formação de espuma, um agenteanti-espumante é opcionalmente adicionado ao fermentador. Opcionalmente,uma sonda de espuma ou rompedor de espuma mecânico é usado nofermentador, por exemplo assim como um agente anti-espumante.
Um segundo aspecto da invenção é um processo para afabricação de uma preparação de um antígeno, por exemplo toxina de difteriaou mutante ou fragmento da mesma, compreendendo as etapas de realizar oprocesso de fermentação da invenção como mencionado acima e isolar oantígeno, por exemplo toxina de difteria ou mutante ou fragmento da mesmada cultura.
Um terceiro aspecto da invenção é uma toxina de difteria oumutante ou fragmento da mesma (por exemplo CRM197) isolada peloprocesso da invenção.
A toxicidade da toxina de difteria é opcionalmente reduzidapor tratamento químico incluindo tratamento com reagentes de reticulaçãopara formar um toxóide. As referências a uma toxina incluem toxóides.
Um outro aspecto da invenção é uma composição farmacêuticacompreendendo a toxina de difteria ou mutante (por exemplo CRM197) ouum fragmento do mesmo da invenção e um veículo farmaceuticamenteaceitável.
A composição farmacêutica da invenção opcionalmente aindacompreende antígenos adicionais em uma vacina de combinação. Em umaforma de realização, antígeno (s) a serem combinados com a toxina dedifteria, mutante ou fragmento da mesma, como descrito acima, inclui(em)um ou mais dos toxóides de tétano, coqueluche de célula completa (Pw),coqueluche acelular(Pa) (como descrito abaixo), antígeno de superfície dehepatite B, vírus de hepatite A, polissacarídeos ou oligossacarídeos deHaemophilus influenzae b, polissacarídeos ou oligossacarídeos neisseriais(por exemplo N. meningitidis), proteínas de serotipo B de N. meningitidis,opcionalmente como parte de uma vesícula de membrana externa,polissacarídeos ou oligossacarídeos pneumococos, proteínas pneumocócicas,ou qualquer um dos antígenos listados abaixo. Os polissacarídeos bacterianospodem ser conjugados a uma proteína veículo. A toxina de difteria ou toxóideou mutantes de toxina de difteria como CRM197 ou fragmentos, por exemplofeitos usando um processo da invenção, podem ser usados como uma proteínaveículo. No entanto, outras proteínas veículo, como toxóide de tétano,fragmento C de toxóide de tétano, pneumolisina, proteína D (US 6342224)também podem ser usados. Uma dada composição farmacêuticaopcionalmente contém polissacarídeos ou oligossacarídeos múltiplosconjugados a diferentes proteínas veículo.
A toxina de difteria, ou seu mutante, por exemplo CRM197,ou seu fragmento feitos usando o processo da invenção podem ser formuladoscom polissacarídeos ou oligossacarídeos capsulares, derivados de um ou maisdentre Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae b, Streptococcuspneumoniae, Grupo A Streptococci, Grupo B Streptococci, Staphylococcusaureus ou Staphylococcus epidermidis. Por exemplo, a composiçãofarmacêutica ou imunogênica pode compreender polissacarídeos capsularesderivados de um ou mais dos sorogrupos A, C, W-135 e Y de Neisseriameningitidis. Por exemplo sorogrupos A e C; A e W, A e Y; C e W, C e Y, We Y; A, C e W; A C e Y; A, W e Y; C, W e Y ou A, C, W e Y podem serformulados com CRM197. Em outro exemplo, a composição imunogênicacompreende polissacarídeos capsulares derivados de Streptococcuspneumoniae. Os antígenos de polissacarídeos capsulares pneumococos sãopreferivelmente selecionados dentre os sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N,9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F (maispreferivelmente os sorotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9Vi 14, 18C, 19F e 23F). Umoutro exemplo deve conter os polissacarídeos capsulares PRP (ouoligossacarídeos) de Haemophilus influenzae tipo b. Um outro exemplo deveconter o tipo 5, Tipo 8, 336, PNAG ou polissacarídeos dPNAG capsulares deStaphylococcus aureus. Um outro exemplo deve conter os polissacarídeoscapsulares Tipo I, Tipo II, Tipo III ou PIA de Staphylococcus epidermidis.Um outro exemplo deve conter os polissacarídeos capsulares de Tipo Ia, TipoIc, Tipo II ou Tipo III de estreptococos de Grupo B. Um outro exemplo deveconter os polissacarídeos capsulares de estreptococos de Grupo A,opcionalmente ainda compreendendo pelo menos uma proteína M e maispreferivelmente tipos múltiplos de proteína M.
Os polissacarídeos bacterianos para uso na invenção podemser de comprimento completo, sendo polissacarídeos nativos purificados.Alternativamente, os polissacarídeos são de tamanho entre 2 e 20 vezes, porexemplo 2-5 vezes, 5-10 vezes, 10-15 vezes ou 15-20 vezes, de modo que ospolissacarídeos são menores em tamanho para um maior controle. Osoligossacarídeos tipicamente contém entre 2 e 20 unidades de repetição.
Estes polissacarídeos capsulares podem ser não conjugados ouconjugados a uma proteína veículo como toxóide de tétano, fragmento C detoxóide de tétano, toxóide de difteria ou CRM197 (ambos por exemplo feitospelo método da invenção), pneumolisina, ou proteína D (US 6342224).Toxina de tétano, toxina de difteria e pneumolisina são destoxificados ou pormutação genética e/ou por tratamento químico.
O conjugado de polissacarídeo ou oligossacarídeo pode serpreparado por qualquer técnica de copulação conhecida. Por exemplo, opolissacarídeo pode ser copulado via uma ligação tioéter. Este método deconjugação se baseia na ativação do polissacarídeo com tetrafluoroborato de1-ciano-4-dimetilamino piridínio (CDAP) para formar um éster cianato. Opolissacarídeo ativado pode assim ser copulado diretamente ou via um grupoespaçador a um grupo amino sobre a proteína veículo. Opcionalmente, o éstercianato é copulado com hexano diamina e o polissacarídeo amino-derivatizado é conjugado a uma proteína veículo usando química deheteroligação envolvendo a formação da ligação tioéter. Estes conjugados sãodescritos no pedido publicado PCT WO 93/15760 Uniformed ServicesUniversity.
Os conjugados também podem ser preparados por métodos deaminação redutiva direta como descrito em US 4365170 (Jennings) e US4673574 (Anderson). Outros métodos são descritos em EP-0-161-188, EP-208375 e EP-0-477508.
Um outro método envolve a copulação de um polissacarídeoativado por brometo de cianogene derivatizado com hidrazida de ácidoadípico (ADH) para o veículo de proteína por condensação de carbodiimida(Chu C. et al Infect. Immunity, (1983) 245; 256).
Em exemplos particulares, a toxina de difteria ou fragmento oumutante da mesma (por exemplo CRM197) é conjugada a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 antígenos adicionais dacomposição farmacêutica. Em uma forma de realização, ela é conjugada acomponente (s) de polissacarídeo, por exemplo polissacarídeos bacterianosincluindo os listados acima.
A composição farmacêutica ou imunogênica da invenção podeainda compreender componentes de proteína adicionais. Ela é opcionalmenteformulada com antígenos proporcionando proteção contra uma ou maisinfecções causadas por Bordetella pertussis. O componente de coqueluchepode ser B. pertussis de célula completa (Pw) ou coqueluche acelular (Pa) quecontém pelo menos um antígeno (preferivelmente dois ou todos os três) dePT, FHA e pertactina 69 kDa. Algumas outras formulações de coquelucheacelular também contém aglutinogenes, como Fi2 e Fim3 e estas vacinas sãotambém contempladas para uso na invenção. Tipicamente, o antígenoprovendo proteção contra tétano é toxóide de tétano que são ou toxinasquimicamente inativas (por exemplo após tratamento com formaldeído) ouinativadas pela introdução de uma ou mais mutação(ões) de pontos.
A composição farmacêutica ou imunogênica da invençãoopcionalmente compreende antígenos de proteínas pneumocócicas, porexemplo as proteínas pneumocócicas que são expostas sobre a superfícieexterna do pneumococo (capaz de ser reconhecido pelo sistema imune dohospedeiro durante pelo menos parte do ciclo de vida do pneumococo), ou sãoproteínas que são secretadas ou liberadas pelo pneumococo. Por exemplo, aproteína pode ser uma toxina, adesina, transdutor de sinal de 2 componentes,ou lipoproteína de Streptococcus pneumoniae ou seus fragmentos. Osexemplos destas proteínas incluem, mas não são limitados a pneumolisina(preferivelmente destoxificada por tratamento químico ou mutação), [Mitchellet al. Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18(13): 4010 "Comparison ofpneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 e2.", Mitchell et al. Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007(1): 67-72"Expression in the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purificationand biological properties.", WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951(Paton et al), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA e suas variantes de deleção detransmembrana (US 5804193 - Briles et al.); PspC e suas variantes de deleçãode transmembrana (WO 97/09994 - Briles et al); PsaA e suas variantes dedeleção de transmembrana (Berry & Paton, Infect lmmun 1996Dec;64(12):5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodaltonputative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae");proteínas de ligação de colina pneumocócica e variantes de deleção detransmembrana das mesmas; CbpA e variantes de deleção de transmembranado mesmo (WO 97/41151; WO 99/51266); Gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (Infect. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA(Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); proteínasemelhante a M, (EP 0837130) e adesina 18627, (EP 0834568). Outrosantígenos de proteína pneumocócica para inclusão na composiçãoimunogênica são os descritos em WO 98/18931, WO 98/18930 ePCT/US99/30390.
Exemplos de proteínas Neisseriais a serem formuladas com acomposição imunogênica da invenção incluem TbpA (WO93/06861;EP586266; WO92/03467; US5912336), TbpB (WO93/06861; EP586266),Hsf (W099/31132), NspA (W096/29412), Hap (PCT/EP99/02766), PorA,PorB, OMP85 (também conhecida com D15) (WO00/23595), PilQ(PCT/EP99/03603), PldA (PCT/EP99/06718), FrpB (W096/31618 ver SEQID NO:38), FrpA ou FrpC ou uma porção conservada em comum a ambos empelo menos 30, 50, 100, 500, 750 aminoácido (WO92/01460), LbpA e/ouLbpB (PCT/EP98/05117; Schryvers et al Med. Microbiol. 1999 32: 1117),FhaB (WO98/02547 SEQ ID NO: 38), HasR (PCT7EP99/05989), Iipo02(PCT/EP99/08315), MItA (WO99/57280) e ctrA (PCT/EP00/00135). Asproteínas neisseriais são opcionalmente adicionadas como proteínaspurificadas ou como parte de uma preparação de membrana externa.
A composição farmacêutica ou imunogênica da invençãoopcionalmente compreende um ou mais antígenos que pode proteger umhospedeiro contra Haemophilus influenzae não tipificável, RSV e/ou um oumais antígenos que podem proteger um hospedeiro contra vírus de influenza.
Os exemplos de antígenos de proteína de H. influenza incluemproteína Fimbrina (US 5766608) e fusões compreendendo peptídeos damesma (por exemplo fusão LB1) (US 5843464 - Ohio State ResearchFoundation), OMP26, P6, proteína D, TbpA, TbpB, Hia, Hmwl, Hmw2, Hap,eD15.
Exemplos de antígenos de vírus de influenza incluem víruscompletos, vivos ou inativados, vírus de influenza divididos, cultivados emovos ou células MDCK, ou células Vero, ou virossomas completos deresinado (como descrito por R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) ou suasproteínas purificadas ou recombinantes, como proteínas HA, NP, NA, ou M,ou suas combinações.
Exemplos de antígenos de RSV (vírus sincicial respiratório)incluem a glicoproteína F, a glicoproteína G, a proteína HN, a proteína M ouseus derivados.
Deve-se notar que as composições antigênicas da invençãopodem compreender um ou mais polissacarídeos capsulares de uma únicaespécie de bactérias. As composições antigênicas podem tambémcompreender polissacarídeos capsulares derivados de uma ou mais espéciesde bactérias.
Um outro aspecto da invenção inclui composiçõesimunogênicas ou vacinas compreendendo a toxina de difteria, fragmento oumutante da mesma, (por exemplo CRM197) feitos pelos processos dainvenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.
Opcionalmente, a composição imunogênica ou vacina contémuma quantidade de um adjuvante suficiente para melhorar a resposta imunedo imunogene. Os adjuvantes apropriados incluem, mas não são limitados asais de alumínio, misturas de esqualeno (SAF-1), muramil peptídeo, derivadosde saponina, preparações de parede celular micobactéria, monofosforil lipídeoA, derivados de ácido micólico, tensoativos de copolímero de bloco nãoiônico, QuilA, subunidade de toxina B de cólera, polfosfazeno e derivados, ecomplexos imunoestimulantes (ISCOMs), como os descritos por Takahashi etal. (1990) Nature 344:873-875. Para uso veterinário e para produção deanticorpos em animais, os componentes mitogênicos de adjuvante de Freundtambém podem ser usados.
Como com todas as composições ou vacinas imunogênicas, asquantidades imunologicamente efetivas dos imunogenes podem serdeterminadas empiricamente. Os fatores a serem considerados incluem aimunogenicidade, seja ou não o imunogene complexado com oucovalentemente fixado a um adjuvante ou proteína veículo ou outro veículo,via de administrações e o número de dosagens imunizantes a seremadministradas. Estes fatores são bem conhecidos na arte de vacinas e deacordo com os conhecimentos dos imunologistas para fazer estasdeterminações sem experimentação indevida.
O agente ativo pode estar presente em concentrações variadasna composição farmacêutica ou vacina da invenção. Tipicamente, aconcentração mínima da substância é uma quantidade necessária para obterseu uso pretendido, enquanto a concentração máxima é a quantidade máximaque irá permanecer em solução ou colocada homogeneamente em suspensãodentro da mistura inicial. Por exemplo, a quantidade mínima de uma agenteterapêutico é preferivelmente um que irá prover uma dosagemterapeuticamente efetiva única. Para substâncias bioativas, a concentraçãomínima é uma quantidade necessária para bioatividade quando dareconstituição e a concentração máxima é a no ponto em que uma suspensãohomogênea não pode ser mantida. No caso de unidades de dose única, aquantidade é a de uma aplicação terapêutica única. Geralmente, espera-se quecada dose irá compreender l-100u.g de antígeno de proteína, preferivelmente5-50ug e mais preferivelmente 5-25ug. As doses preferidas de polissacarídeosbacterianos são de 10-20ug, 10-5ug, 5-2,5ug ou 2,5-1 ug. A quantidadepreferida da substância varia de substância a substância mas é facilmentedeterminável por um versado na arte.
As preparações de vacina da presente invenção podem serusadas para proteger ou tratar um mamífero (por exemplo um pacientehumano) susceptível a infecção, por meio da administração de referida vacinaatravés de uma via sistêmica ou mucosal. Estas administrações podem incluirinjeção através das vias intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ousubcutânea, ou através de administração mucosal para os tratos oral/alimentar, respiratório, genitourinário. Apesar da vacina da invenção poderser administrada como uma dose única, os seus componentes também podemser co-administrados juntos ao mesmo tempo ou em tempos diferentes (porexemplo, se polissacarídeos estão presentes em uma vacina, estes podem seradministrados separadamente ao mesmo tempo ou 1-2 semanas após aadministração da combinação de proteína bacteriana para coordenação ótimadas respostas imunes com relação uma à outra). Além de uma via deadministração única, 2 vias diferentes de administração podem ser usadas. Porexemplo, os antígenos virais podem ser administrados ID (intradérmica),enquanto as proteínas bacterianas podem ser administradas IM(intramuscular) ou IN (intranasal). Se polissacarídeos estão presentes, elespodem ser administrados IM (ou ID) e proteínas bacterianas podem seradministradas IN (ou ID). Além disso, as vacinas da invenção podem seradministradas IM para doses de iniciação e IN para doses de reforço.
A preparação de vacina é geralmente descrita em VaccineDesign ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F. & NewmanMJ.) (1995) Plenum Press New York). Encapsulação dentro de lipossomas édescrita por Fullerton, Patente US 4.235.877.
Um outro aspecto da invenção é um processo para a fabricaçãode uma composição farmacêutica, compreendendo uma etapa de fazer atoxina de difteria ou fragmento ou mutante da mesma (por exemplo CRM197)usando o processo de fermentação da invenção e combinando a mesma comum veículo farmaceuticamente aceitável e opcionalmente adicionandoqualquer um dos antígenos adicionais acima mencionados.
Este processo pode ainda compreender uma etapa de conjugara toxina de difteria ou fragmento ou mutante da mesma (por exemploCRM197) a um ou mais componentes adicionais da composição farmacêutica,preferivelmente polissacarídeos ou oligossacarídeos bacterianos comodescrito acima.
Um outro aspecto da invenção é o uso de toxina de difteria oufragmento ou mutante da mesma (por exemplo CRM197) da invenção napreparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doençabacteriana, particularmente doença C. diphtheriae.
Um outro aspecto da invenção é um método de prevenção outratamento de infecção bacteriana, particularmente infecção por C.diphtheriae, compreendendo a administração da composição farmacêutica,composição imunogênica ou vacina da invenção a um paciente.
Todas as referências ou pedidos de patentes citados nesterelatório de patente são incorporadas aqui por referência.
A invenção é ilustrada nos exemplos anexos. Os exemplosabaixo são realizados usando técnicas padrões, que são bem conhecidas erotineiras para os versados na arte, exceto onde de outra forma descrito emdetalhes. Os exemplos são ilustrativos, mas não limitam a invenção.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Medições de KLa
A fim de medir o KLa de uma etapa de fermentação, ofermentador foi carregado com o volume desejado de água e os parâmetros defermentação (por exemplo, temperatura, pressão, agitação e aeração) foramaplicados e o sistema deixado alcançar um estado estável. A sonda de p02 foicalibrada a 100%.
A aeração foi deslocada rapidamente em gás nitrogênio,enquanto mantendo a mesma vazão. O p02 foi acompanhado até p02 cair amenos do que 5%. Quando este ponto foi alcançado, a aeração foi deslocadarapidamente em ar enquanto mantendo a mesma vazão. O nível de p02 foiacompanhado e registrado em vários pontos de tempo como uma porcentagemdo nível de 100% do estado estável original.
KLa foi calculado traçando em gráfico o log (100-pO2%)contra tempo. O coeficiente angular da parte linear do gráfico corresponde a -Kla. Tipicamente, somente os dados entre 20% e 80% de p02 são considerados.Resultados
As leituras de p02 em vários pontos de tempo são mostradasna tabela 1 abaixo.
Tabela 1
<table>table see original document page 24</column></row><table>
Os resultados foram traçados em gráfico como mostrado nafigura 1 e o KLa determinado a partir do coeficiente angular da linha na figura1B.
Exemplo 2: Fermentação da cepa ATCC39255 de C. diphtheriae na escalade 150 litros
A bactéria usada na preparação de CRM197 (Material deReação Cruzada) é uma cepa mutante de Corynebacterium diphtheriae obtidapor tratamento com nitrosoguanidina de acordo com o método de A.Pappenheimer (Nature New Biol. 233: 8-11, 1971). Ela expressa uma toxinade difteria destoxificada (aa 52: mutação de glicina em ácido glutâmico). Elafoi obtida a partir de ATCC onde é referida como 39255. O esquema geral doprocesso de fermentação é mostrado na figura 2.
Uma semente de trabalho contendo 1,1 x 1010 cfu/ml foiretirada do congelador (-70°C) e descongelada em temperatura ambiente.Imediatamente após descongelar, o frasco foi submetido a vórtice e 250 ul dasemente são retirados com uma seringa com agulha de 1 ml.
Este volume foi injetado em 100 ml de solução salina estéril(0,9%). O frasco foi agitado. Dois ml da suspensão foram retirados com umaseringa de 2 ml com agulha e usados para inocular um frasco erlenmeyer de 31 contendo 500 ml do meio descrito em US 4.925.792. O frasco foi incubadoem 34,5°C ± 0,05°C em velocidade de agitação de 250 rpm até a densidadeóptica (650 nm) alcançar 4,0 a 6,0 (após 16 a 19 h de incubação).
Um fermentador de 150 litros foi esterilizado e 100 L do meiode cultura foram transferidos assepticamente para o fermentador. O frascocom ácido foi carregado com 500 ml de H3PO4 a 25% (v/v); o pH do meio erainicialmente cerca de 7,4 e não foi ajustado.
O fermentador foi preparado no dia anterior à inoculação emantido em condições de reserva de 34,5°C de temperatura, pressãomanométrica de 0,5 bar, vazão de 23 N l/min no espaço superior e velocidadede agitação de 50 rpm durante 16-20 h, até inoculação.
Antes da inoculação, o fermentador foi ajustado nas condiçõesde cultura de 34,5°C de temperatura, pressão de 0,5 bar, vazão de 23 N l/minaspergida no meio e velocidade de agitação de 240 rpm. Uma agitação de 240rpm dá uma velocidade de ponta de 1,76 m/s e um tempo de misturaçãoteórico de 3,9 s. O oxigênio dissolvido não é regulado, somente monitorado, osistema de controle de espuma foi comutado e o pH deixado alcançar 7,8 edepois mantido por adição de H3PO4. Antes da inoculação, a sonda de p02 foiajustada a 100%.
A velocidade de agitação foi ajustada a 240 rpm,correspondente a uma velocidade periférica de 1,76 m/s. A velocidade deagitação de 240 rpm combinada com uma taxa de aeração de 23-L/minresultou em um KLa (20-80%, água 30°C, 0,5 bar) estimado em 42 h-1 (verfigura 6).
O fermentador foi inoculado através da abertura de inóculocom 400 ml da cultura de semente descrita acima.
A fermentação continuou até ambas as seguintes condiçõesserem alcançadas. 20 h de fermentação são decorridas e o nível de oxigêniodissolvido aumentou até 10%. A duração de fermentação total estavageralmente entre 22 e 28 h.Ao término da fermentação, a temperatura foi mudada para umajuste de 20°C, a regulagem de pH foi desligada, o fluxo de ar foi deslocadono espaço superior a fim de limitar a formação de espuma, o sistema decontrole de espuma foi desligado, os outros parâmetros não foram trocados.
O sistema de microfiltração foi conectado ao fermentador e,quando a temperatura da suspensão alcançou 21°C, a microfiltração foiiniciada. A microfiltração foi operada em duas fases: uma concentração e umadiafiltração. Durante a fase de concentração, os parâmetros foram: pressãointerna: 0,6 bar, pressão externa: ~ 0,1 bar, fluxo de permeado: mantidoconstante em 2 l/min usando uma bomba peristáltica calibrada (a pressão dopermeado era cerca de 0,3 bar). A suspensão foi concentrada até um dosseguintes eventos acontecerem primeiramente. Ou a pressão de entradaalcançou 0,9 bar ou 75 litros de permeado foram recuperados.
Durante a fase de destilação, os seguintes parâmetros foramusados: a pressão interna foi mantida na pressão alcançada ao término daetapa de concentração (máximo de 0,9 bar); água foi adicionada em 2 l/min; ototal de água adicionado foi 3 volumes de retido.
O retido foi filtrado em uma membrana de 0,22 um earmazenado a +4°C. A estabilidade do CRM 197 nesta suspensão foi testadaapós até 4 dias de armazenagem tanto a +4°C como em temperatura ambiente(+20°C<RT<23°C). Nenhuma degradação e nenhuma diferença foramobservadas tanto por quantificação ELISA como SDS-page. Um teste paraconfirmação de ausência de crescimento foi feito em agar DAB incubado a 36°C.
Resultados
Duas fermentações na escala de 150 1 foram realizadas usandoo protocolo de fermentação descrito acima (CDT 199 e CDT 206). Ascondições de pré-cultura e cultura são mostradas nas tabelas 2 e 3 erendimentos de CRM197 são mostrados na tabela 4. A figura 3 mostra umgráfico das cinéticas típicas de crescimento de uma pré-cultura. Quando oO.D. (650 nm) estava entre 4,0 e 6,0, a cultura estava claramente em uma faseexponencial de crescimento e o pH mudou apenas um pouco.
<table>table see original document page 27</column></row><table>
Tabela 3. Condições de Culturas
<table>table see original document page 27</column></row><table>
Tabela 4. Estimativa de CRM 197
<table>table see original document page 27</column></row><table>
Durante a fermentação, foram observadas fases diferentes.
A primeira fase foi caracterizada por um decréscimo dooxigênio dissolvido até 0% ser alcançado (duração de cerca de 6-7 h).Durante esta fase, o pH permanece estável ou diminui levemente (em unidadede pH de cerca de 0,1).
Durante a segunda fase, o pH diminuiu e alcançou um patamarde cerca de pH 7,8. Neste nível, a regulagem do pH foi acionada, no entanto,freqüentemente, nenhum ácido no todo devia ser adicionado nestas condiçõesde fermentação. Durante este patamar de pH, foi observado um aumento donível de oxigênio dissolvido acima de 0%, seguido por uma queda de 0%.
A terceira fase foi caracterizada por um decréscimo do pH em cerca de 7,4.
Finalmente, um aumento de p02 foi observado entre 22 e 24 hde fermentação. Isto é o sinal para colheita.
Os gases de exaustão do fermentador foram analisados porespectrômetro de massa. Um perfil típico de produção de C02 foi observado.As duas fermentações apresentadas foram prolongadas após osinal de colheita a fim de estimar as cinéticas de produção de CRM 197. Osrequerentes observaram que o nível de CRM 197 não aumenta após o sinal decolheita ser alcançado, mas houve um aumento na produção de espuma. A fimde limitar o consumo de antiespumante, é preferível interromper afermentação ao sinal de colheita. No entanto, o CRM 197 parece não afetadopor formação de espuma excessiva e nenhuma degradação ocorreu.
Microfiltração
Os dados são mostrados para a microfiltração de CDT206.74,3 L de permeado foram coletados quando a pressão deentrada alcançou 0,9 bar. A pressão de saída estava entre 0,15 e 0,10 bar portoda a etapa de concentração. A pressão do permeado foi 0,3-0,4 bar por todaa etapa de concentração e a etapa de concentração durou 36 minutos.
Para a fase de diafiltração, 75 L de água foramprogressivamente adicionados (2 l/min) enquanto o permeado foi extraído namesma vazão. A pressão de entrada foi 0,9 bar no início e caiu para 0,7 bar aotérmino da diafiltração. A pressão de saída foi estável em 0,1 bar. A duraçãoda etapa de diafiltração foi 39 min.
Quantificação de CRM 197
O nível de expressão de CRM 197 em condições de baixaaeração foi geralmente 2-4 vezes mais alto do que o obtido em condições deaeração mais alta onde p02 foi mantido em 5% ou mais alto durante toda afermentação.
SDS-page colorido de sobrenadantes de culturaGéis de SDS-PAGE (figura 4) foram ciclados dossobrenadantes de cultura em condição redutora de modo que foi possíveldetectar quaisquer bandas de degradação (após recorte, 2 subunidades derespectivamente 35 e 23 kD podem ser detectadas). Eles foramsubseqüentemente coloridos com Azul Coomassie.Resultados
Os géis coloridos com coomassie de amostras de duasfermentações são mostrados na figura 4A (CDT 199) e 4B (CDT 206). OCRM 197 apareceu no peso molecular esperado (Mw teórico: 58,4 kD). OCRM 197 não foi degradado uma vez que nenhuma mudança padrão foinotada nas amostras tomadas após o sinal do término de fermentação (figura4A, trilhas 9 e 10). A quantidade de CRM 197 não foi afetada pelamicrofiltração e filtração final em 0,22 uM uma vez que as trilhas 9 e 11 dafigura 4A não mostram quantidades equivalentes de CRM197.
A temperatura pode ter um efeito negativo sobre a estabilidadede CRM (figura 4B trilha 12). Esta amostra foi tomada enquanto a válvula daamostra estava quente e a quantidade de CRM 197 presente nesta amostra éreduzida.
Exemplo 3: Fermentação da cepa ATCC 39255 de C. diphtheriae naescala de 20 litros
Um método similar ao descrito no exemplo 2 foi usado parafermentar C. diphtheriae exceto que um fermentador de 20 1 foi usado. Acultura foi agitada em 300 rpm e o fluxo de ar fixado em 3 l/min. Nenhumaadição de ácido ou base foi requerida durante a fermentação uma vez que opH permaneceu quase neutro por toda a fermentação.
A cultura cresceu em um OD final (650 nm) de 18,3.Verificou-se que o rendimento de CRM 197 foi 103 mg/l como avaliado pordensitometria em um gel colorido.
Exemplo 4: Fermentação da cepa ATCC 39255 de C. diphtheriae emescalas diferentes
O processo de fermentação de C. diphtheriae em crescimentosob condições de KLa constantes pode ser adaptado para uso emfermentadores de outros tamanhos e desenhos diferentes. Bons resultados deprodução de CRM 197 foram obtidos seguindo as condições de tamanho dofermentador, vazão e velocidade de agitação indicadas na tabela 5. As trêsfermentações na escala de 150 1 foram realizadas em fermentadores dedesenho diferente.
Tabela 5
<table>table see original document page 30</column></row><table>
Como mostrado na tabela 5, o KLa foi importante em vez deuma escolha específica de condições de fluxo de ar e de velocidade deagitação. Assim, um fluxo de ar mais baixo pode ser compensado por umavelocidade de agitação mais elevada, de modo a resultar em um KLa similar ebons rendimentos de CRM197 foram ainda obtidos. A velocidade de agitaçãodeve ser suficiente para produzir uma suspensão homogênea e a aeração élimitada para manter um p02 baixo. Diferentes fermentadores foram usadospara as fermentações de 20 litros. As diferentes geometrias dos diferentesfermentadores levam à faixa de valores de KLa mostrados na tabela 5.
No entanto, diferentes condições de KLa foram ótimas paradiferentes escalas de fermentação. Assim, para fermentação em umfermentador de 20 litros, um KLa mais baixo de 22-28 h-1 foi consideradoótimo.
Condições de KLa ótimas são as que permitem uma aeraçãolimitada de modo que o p02 na cultura está em níveis baixos. Um versado naarte deve, facilmente, ser capaz de determinar estas condições para umtamanho e geometria particulares do fermentador.
Exemplo 5: Efeito da concentração de ferro sobre o rendimento defermentações em p02 diferente.
Uma série de fermentações de C. diphtheriae cepa ATCC39255 foi realizada na escala de 20 litros seguindo o método descrito noexemplo 3, de modo que p02 foi baixo durante a maior parte da fermentaçãoou em um ajuste constante de p02 a 5%. A quantidade de Fe3+ presentevariou entre nenhuma adição de Fe3+, adição de Fe3+ 250 ppb, adição deFe3+ 500 ppb e adição de Fe2+ 500 ppb. O rendimento de CRM197 aotérmino da fermentação foi medido por densitometria de um gel SDS-PAGE.Este método tende a dar resultados aproximadamente 20% mais baixos do queos obtidos por ELISA.
Resultados
Tabela 6
<table>table see original document page 31</column></row><table>
Como mostrado na tabela 6, quando C. diphtheriae éfermentado em p02 a 5%, a adição de ferro leva a uma redução derendimento. No entanto, quando o nível de p02 é reduzido e a fermentação érealizada em condições de p02 baixo em KLa constante, como descrito noexemplo 3, rendimentos mais elevados foram obtidos e o rendimento não foiafetado pela adição de Fe3+.
Exemplo 6: Efeito da concentração de ferro sobre o rendimento de DT ouCRM197 em condições de baixa aeração
A faixa de concentração de ferro que não impacta a expressãode CRM197 foi determinada em microplacas. As microplacas simulam ascondições de aeração limitadas existentes no processo de fermentação dainvenção.
A cultura em microplacas foi realizada no mesmo meio comofoi usado nas fermentações descritas acima (em um meio similar a meio CY).Fe3+ foi adicionado de uma solução de carga de FeC13.6H20 em 1 g/l de íon Fe3+.As cavidades das placas de microtitulação foram carregadascom o meio e foram inoculadas em 8 E5 bact/ml.
As placas de microtitulação foram inoculadas em 34,5°C comagitação de 250 rpm durante 46 h no caso de ambos Corynebacteriumdiphtheriae expressando CRM197 e Corynebacterium diphtheriaeexpressando toxina de difteria.
As amostras foram filtradas através de um filtro de 0,22 um.
A expressão foi medida pelo método de densitometria emSDS-page (XT Criterion 4-12% bis tris de BioRad) colorido com azulCoomassie (coloração Gelcode blue de Pierce). A referência usada para aquantificação foi o mutante CRM de toxina de difteria do List BiologicalLaboratories INC, introduzido em diferentes concentrações no gel.
Resultados
A tabela 7 mostra a expressão de CRM 197 em diferentes15 concentrações de ferro para C. diphtheriae cultivado em condições de aeraçãolimitadas em cavidades de microtitulação. A expressão de CRM 197 foifracamente sensível à repressão por Fe3+ e não foi significativamente afetadapela adição de Fe3+ 1 ppm ou 2 ppm. Somente em 3 ppm ocorreu uma quedasignificativa da expressão de CRM197. Mesmo neste nível de Fe3+, aexpressão de CRM197 foi ainda 79% da obtida sem adição de Fe3+.
Tabela 7. Corynebacterium diphtheriae expressando CRM197
<table>table see original document page 32</column></row><table>Os rendimentos de CRM197 são expressados como umaporcentagem do rendimento obtido sem adição de Fe3+ extra.
Os resultados da expressão de DT são mostrados na tabela 8para C. diphtheriae cultivado em cavidades de microtitulação nas condiçõesindicadas. A produção de DT em condições de aeração limitadas também foifracamente sensível à repressão por Fe3+. A expressão de DT aumentou coma concentração de Fe3+ aumentando com a produção de DT máxima obtidaem 700 ppb. A expressão de DT começou a cair somente quando aconcentração de Fe3+ foi aumentada para 3 ppm.
Tabela 8. Corvnebacterium diphtheriae expressando toxina de difteria
<table>table see original document page 33</column></row><table>
Os rendimentos de DT são expressados como umaporcentagem do rendimento obtido sem adição de Fe3+ extra.
Claims (35)
1. Processo de fermentação, caracterizado pelo fato decompreender uma etapa de fermentação de cultivo de uma cepa deCorynebacterium diphtheria em meio em um fermentador sob condições deagitação suficientes para manter uma cultura homogênea e aeração limitada,de modo que p02 dentro da cultura cai a menos de 4% na maior parte daetapa de fermentação.
2. Processo de fermentação de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o p02 cai até se aproximar de zero durante amaior parte da etapa de fermentação.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que o p02 de menos de 4% é mantido desde omomento quando a Corynebacterium diphtheria foi cultivada até umadensidade suficiente para p02 cair a menos de 4% devido a um consumorápido de oxigênio, até a etapa de fermentação estar completada.
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--3, caracterizado pelo fato de que a etapa de fermentação é realizada em KLaconstante.
5. Processo de acordo com qualquer reivindicação precedente,caracterizado pelo fato de que a etapa de fermentação é realizada a umavelocidade de agitação e taxa de aeração constantes.
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--3, caracterizado pelo fato de que a etapa de fermentação é realizada sobcondições de KLa variáveis.
7. Processo de acordo com qualquer reivindicação precedente,caracterizado pelo fato de que a etapa de fermentação é realizada a um KLade 10-50 h-1.
8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--7, caracterizado pelo fato de que a etapa de fermentação ocorre em umfermentador de 10-30 litros e em um KLa de 10-30 h-1.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizado pelo fato de que a etapa de fermentação ocorre em umfermentador de 100-250 litros a um KLa de 30-60 h-1.
10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado pelo fato de que a etapa de fermentação ocorre em umfermentador de 250-800 litros a um KLa de 60-150 h-1.
11. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que a etapa de fermentação ocorre com um fluxo de ar de arcomprimido de 1-5 L/min e uma velocidade de agitação de 200-400 rpm.
12. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que a etapa de fermentação ocorre com um fluxo de ar de arcomprimido de 15-25 L/min e uma velocidade de agitação de 150-250 rpm.
13. Processo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de que o meio é CY, SOC ou meio similare pH dentro do fermentador é mantido entre 7,0 e 7,8 pelo grau de aeraçãosem requerer adição de ácido ou base.
14. Processo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de que a cepa de Corynebacteriumdiphtheria produz toxina de difteria ou um mutante da mesma,particularmente CRM197.
15. Processo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de que a cepa de Corynebacteriumdiphtheria é ATCC39255.
16. Processo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de que o processo é suficientementetolerante à presença de sais de ferro no meio, de modo que nenhumtratamento do meio para remover ferro é requerido antes do uso.
17. Processo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de que o meio contém entre 10 - 4000 ppbde ferro.
18. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que o meio contém entre 100- 3000 ppb ou 1700- 3000 ppb deferro.
19. Processo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de que o meio contém 5-20 g/L de ácidosde casamino ou hidrolisado de caseína.
20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-1-18, caracterizado pelo fato de que o meio contém 5-20 g/L de peptona desoja ou outra peptona vegetal.
21. Processo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de que o meio contém extrato de leveduraa 10-30 g/L.
22. Processo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de que a etapa de fermentação ocorre auma temperatura de 25-40°C.
23. Processo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de que o agente anti-espumante éadicionado ao fermentador.
24. Processo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de que a sonda de espuma ou rompedormecânico de espuma é usado no fermentador.
25. Processo de fabricação de uma preparação de um antígenode C. diphtheriae, caracterizado pelo fato de compreender as etapas derealizar o processo de fermentação como definido em qualquer uma dasreivindicações 1-24 e isolar o antígeno de C. diphtheriae da cultura.
26. Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizadopelo fato de que o antígeno de C. diphtheriae é toxina de difteria ou umfragmento ou mutante da mesma.
27. Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que o antígeno é CRM197.
28. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 25-27, caracterizado pelo fato de compreender uma etapa de adicionar um oumais antígeno (s) adicional (ais) ao antígeno de C. diphtheriae.
29. Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de ainda compreender a etapa de conjugar a toxina de difteria oufragmento ou mutante da mesma a um ou mais antígeno (s) adicional (ais).
30. Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que um ou mais antígeno (s) adicional (ais) compreende umpolissacarídeo ou oligossacarídeo bacteriano.
31. Processo de fabricação de uma composição farmacêutica,caracterizado pelo fato de compreender uma etapa de misturar o antígeno outoxina de difteria ou mutante do mesmo (ou conjugado ou não conjugado)feito pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 25-30com um veículo farmaceuticamente aceitável.
32. Uso do antígeno, toxina de difteria ou mutante da mesma,feitos pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 25-31, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para otratamento ou prevenção de doença bacteriana.
33. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que a doença bacteriana é doença causada por C. diphtheriae.
34. Método de prevenção ou tratamento de infecçãobacteriana, caracterizado pelo fato de compreender a administração de umacomposição farmacêutica feita pelo processo como definição na reivindicação 31a um paciente.
35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que a infecção bacteriana é infecção causada por C. diphtheriae.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB0505996.9A GB0505996D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-03-23 | Fermentation process |
| GB0505996.9 | 2005-03-23 | ||
| PCT/EP2006/002835 WO2006100108A1 (en) | 2005-03-23 | 2006-03-21 | Fermentation process for the production of diphtheria toxin |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0609692A2 true BRPI0609692A2 (pt) | 2010-04-20 |
| BRPI0609692B1 BRPI0609692B1 (pt) | 2019-02-12 |
| BRPI0609692B8 BRPI0609692B8 (pt) | 2020-01-21 |
| BRPI0609692C1 BRPI0609692C1 (pt) | 2021-05-25 |
Family
ID=34531759
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0609692A BRPI0609692C1 (pt) | 2005-03-23 | 2006-03-21 | processos de fermentação e de fabricação de uma preparação de um antígeno de c. diphtheriae |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20080193475A1 (pt) |
| EP (2) | EP1861420B1 (pt) |
| JP (1) | JP4917087B2 (pt) |
| KR (1) | KR101341121B1 (pt) |
| CN (1) | CN101180313B (pt) |
| AT (2) | ATE449788T1 (pt) |
| AU (1) | AU2006226542B2 (pt) |
| BR (1) | BRPI0609692C1 (pt) |
| CA (1) | CA2602143C (pt) |
| DE (1) | DE602006010676D1 (pt) |
| ES (2) | ES2335133T3 (pt) |
| GB (1) | GB0505996D0 (pt) |
| RU (1) | RU2394914C2 (pt) |
| WO (1) | WO2006100108A1 (pt) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2532911C2 (ru) * | 2008-07-21 | 2014-11-20 | Дзе Брихэм Энд Уимен'З Хоспитал, Инк. | Способы и композиции, относящиеся к синтетическим бета-1,6-глюкозаминолигосахаридам |
| IT1398927B1 (it) | 2009-06-25 | 2013-03-28 | Consorzio Interuniversitario Per Lo Sviluppo Dei Sistemi A Grande Interfase Csgi | Espressione batterica di un gene artificiale per la produzione di crm197 e derivati. |
| EP2865390B1 (en) | 2012-06-20 | 2019-08-21 | The University of Tokyo | Mucosal immunity-stimulating agent, and oral pharmaceutical composition for treating hpv infection |
| CN103627758B (zh) * | 2012-08-28 | 2018-04-27 | 天士力医药集团股份有限公司 | 一种crm197蛋白的生产方法 |
| US20140193451A1 (en) * | 2012-10-17 | 2014-07-10 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Immunogenic composition |
| BE1022174B1 (fr) | 2013-03-15 | 2016-02-24 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccin |
| WO2018126229A2 (en) | 2016-12-30 | 2018-07-05 | Sutrovax, Inc. | Polypeptide-antigen conjugates with non-natural amino acids |
| US11951165B2 (en) | 2016-12-30 | 2024-04-09 | Vaxcyte, Inc. | Conjugated vaccine carrier proteins |
| US11219680B2 (en) | 2017-02-24 | 2022-01-11 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Polysaccharide-protein conjugates utilizing diphtheria toxin fragment B as a carrier |
| HUE059629T2 (hu) * | 2017-04-22 | 2022-12-28 | Biological E Ltd | Javított eljárás CRM nagy mennyiségben történõ elõállítására |
| EP3699263A1 (en) | 2019-02-22 | 2020-08-26 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Fermentation process |
| CN110452838B (zh) * | 2019-07-18 | 2020-12-29 | 艾美卫信生物药业（浙江）有限公司 | 一种crm197菌种培养基、配制方法及发酵培养方法 |
| WO2021176409A1 (en) | 2020-03-05 | 2021-09-10 | Sanofi Healthcare India Private Limited | Preservative combination for vaccine composition |
| CN114806973B (zh) * | 2022-06-08 | 2024-02-23 | 艾美坚持生物制药有限公司 | 一种提高crm197蛋白产量的生长因子及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (48)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4235877A (en) | 1979-06-27 | 1980-11-25 | Merck & Co., Inc. | Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit |
| DE3071552D1 (en) | 1979-09-21 | 1986-05-22 | Hitachi Ltd | Semiconductor switch |
| US4673574A (en) | 1981-08-31 | 1987-06-16 | Anderson Porter W | Immunogenic conjugates |
| CH660375A5 (it) | 1983-02-08 | 1987-04-15 | Sclavo Spa | Procedimento per la produzione di proteine correlate alla tossina difterica. |
| US4695624A (en) | 1984-05-10 | 1987-09-22 | Merck & Co., Inc. | Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency |
| US4709017A (en) | 1985-06-07 | 1987-11-24 | President And Fellows Of Harvard College | Modified toxic vaccines |
| IT1187753B (it) | 1985-07-05 | 1987-12-23 | Sclavo Spa | Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente |
| US4950740A (en) | 1987-03-17 | 1990-08-21 | Cetus Corporation | Recombinant diphtheria vaccines |
| JP3237842B2 (ja) | 1988-12-16 | 2001-12-10 | オランダ国 | ニューモリシンミュータント及びそれから製造されたニューモコッカルワクチン |
| ATE200493T1 (de) | 1990-03-02 | 2001-04-15 | Boston Medical Ct Corp | Verbesserte chimäre toxine |
| DE69133276T2 (de) | 1990-07-16 | 2003-11-27 | Univ North Carolina | Mit der familie der hämolysin-toxine verwandte antigene eisen-ubnterdrückende proteine des n. meningitis |
| DE69133334T2 (de) | 1990-08-23 | 2004-05-13 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Transferrin bindende proteine aus neisseria-gonorrhoeae und neisseria-meningitidis |
| US5912336A (en) | 1990-08-23 | 1999-06-15 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Isolated nucleic acid molecules encoding transferrin binding proteins from Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis |
| US5153312A (en) | 1990-09-28 | 1992-10-06 | American Cyanamid Company | Oligosaccharide conjugate vaccines |
| US6592876B1 (en) | 1993-04-20 | 2003-07-15 | Uab Research Foundation | Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products |
| US5476929A (en) | 1991-02-15 | 1995-12-19 | Uab Research Foundation | Structural gene of pneumococcal protein |
| FR2682041B1 (fr) | 1991-10-03 | 1994-01-14 | Pasteur Merieux Serums Vaccins | Vaccin contre les infections a neisseria meningitidis. |
| CA2129899C (en) | 1992-02-11 | 2011-01-04 | James J. Mond | Dual carrier immunogenic construct |
| AU4230493A (en) | 1992-05-06 | 1993-11-29 | President And Fellows Of Harvard College | Diphtheria toxin receptor-binding region |
| EP0835663B1 (en) | 1992-05-23 | 2009-09-30 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Combined vaccines comprising Hepatitis B surface antigen and other antigens |
| JP3428646B2 (ja) | 1992-06-18 | 2003-07-22 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバードカレッジ | ジフテリア毒素ワクチン |
| FR2692592B1 (fr) | 1992-06-19 | 1995-03-31 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Fragments d'ADN codant pour les sous-unités du récepteur de la transferrine de Neisseria meningitidis et procédés les exprimant. |
| DE69323264D1 (de) * | 1992-10-27 | 1999-03-11 | American Cyanamid Co | Pädiatrische Kombinationsvakzine mit verbesserter Immunogenizität jeder Vakzine komponente |
| ES2231770T3 (es) | 1993-03-05 | 2005-05-16 | Wyeth Holdings Corporation | Nuevos plasmidos para la produccion de proteina crm y toxina difterica. |
| EP1300156A3 (en) | 1993-05-18 | 2003-05-07 | The Ohio State University Research Foundation | Otitis media vaccine |
| US6455673B1 (en) | 1994-06-08 | 2002-09-24 | President And Fellows Of Harvard College | Multi-mutant diphtheria toxin vaccines |
| US5917017A (en) | 1994-06-08 | 1999-06-29 | President And Fellows Of Harvard College | Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain |
| US5565204A (en) | 1994-08-24 | 1996-10-15 | American Cyanamid Company | Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections |
| IL117483A (en) | 1995-03-17 | 2008-03-20 | Bernard Brodeur | MENINGITIDIS NEISSERIA shell protein is resistant to proteinase K. |
| CA2222455C (en) | 1995-03-22 | 2013-05-28 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | A vaccine composition comprising a polysaccharide conjugate antigen adsorbed onto aluminium phosphate |
| US6265567B1 (en) | 1995-04-07 | 2001-07-24 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Isolated FrpB nucleic acid molecule |
| US5843464A (en) | 1995-06-02 | 1998-12-01 | The Ohio State University | Synthetic chimeric fimbrin peptides |
| JPH11507214A (ja) | 1995-06-07 | 1999-06-29 | バイオケム ヴァシーンズ インク． | Ｈｓｐ７０ファミリーに属する連鎖球菌の熱ショック蛋白質メンバー |
| ATE323721T1 (de) | 1996-05-01 | 2006-05-15 | Univ Rockefeller | Cholin-bindendes protein, welches als gegen pneumokokken gerichtetes vakzin verwendet wird |
| FR2751000B1 (fr) | 1996-07-12 | 1998-10-30 | Inst Nat Sante Rech Med | Adn specifiques des bacteries de l'espece neisseria meningitidis, leurs procedes d'obtention et leurs applications biologiques |
| US5882871A (en) | 1996-09-24 | 1999-03-16 | Smithkline Beecham Corporation | Saliva binding protein |
| US5882896A (en) | 1996-09-24 | 1999-03-16 | Smithkline Beecham Corporation | M protein |
| EP0941335A2 (en) | 1996-10-31 | 1999-09-15 | Human Genome Sciences | Streptococcus pneumoniae polynucleotides and sequences |
| KR100619350B1 (ko) | 1997-07-21 | 2006-09-05 | 박스터 헬쓰케어 에스.에이. | 변형 면역성 뉴멀리신 백신조성물 |
| GB9717953D0 (en) | 1997-08-22 | 1997-10-29 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| GB9726398D0 (en) | 1997-12-12 | 1998-02-11 | Isis Innovation | Polypeptide and coding sequences |
| EP1067962B1 (en) | 1998-04-07 | 2010-03-24 | MedImmune, LLC | Derivatives of pneumococcal choline binding proteins for vaccines |
| BR9910089A (pt) | 1998-05-01 | 2004-06-08 | Chiron Corp | Composições e antìgenos de neisseria meningitidis |
| CA2347849C (en) | 1998-10-22 | 2013-06-25 | The University Of Montana | Omp85 proteins of neisseria gonorrhoeae and neisseria meningitidis, compositions containing same and methods of use thereof |
| GB9904582D0 (en) | 1999-02-26 | 1999-04-21 | Nycomed Imaging As | Process |
| KR100401423B1 (ko) | 2001-01-10 | 2003-10-17 | 주식회사 엘지생명과학 | 혼합 백신의 제조 방법 |
| WO2006042542A2 (en) * | 2004-10-19 | 2006-04-27 | Statens Serum Institut | Production of tetanus, diphtheria, and pertussis toxins and toxoids using fermentation media containing no components of animal or soy origin |
| US9473463B2 (en) | 2014-07-29 | 2016-10-18 | Combined Conditional Access Development & Support, LLC | Control word and associated entitlement control message caching and reuse |
-
2005
- 2005-03-23 GB GBGB0505996.9A patent/GB0505996D0/en not_active Ceased
-
2006
- 2006-03-21 RU RU2007135122/13A patent/RU2394914C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-03-21 US US11/909,100 patent/US20080193475A1/en not_active Abandoned
- 2006-03-21 AT AT06723804T patent/ATE449788T1/de not_active IP Right Cessation
- 2006-03-21 WO PCT/EP2006/002835 patent/WO2006100108A1/en active Application Filing
- 2006-03-21 ES ES06723804T patent/ES2335133T3/es active Active
- 2006-03-21 AT AT09176267T patent/ATE540053T1/de active
- 2006-03-21 BR BRPI0609692A patent/BRPI0609692C1/pt active IP Right Grant
- 2006-03-21 EP EP06723804A patent/EP1861420B1/en active Active
- 2006-03-21 KR KR1020077024097A patent/KR101341121B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2006-03-21 JP JP2008502343A patent/JP4917087B2/ja active Active
- 2006-03-21 CN CN2006800177931A patent/CN101180313B/zh active Active
- 2006-03-21 AU AU2006226542A patent/AU2006226542B2/en not_active Ceased
- 2006-03-21 DE DE602006010676T patent/DE602006010676D1/de active Active
- 2006-03-21 CA CA2602143A patent/CA2602143C/en active Active
- 2006-03-21 ES ES09176267T patent/ES2378193T3/es active Active
- 2006-03-21 EP EP09176267A patent/EP2174950B1/en active Active
-
2014
- 2014-03-14 US US14/210,626 patent/US20140242635A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE602006010676D1 (de) | 2010-01-07 |
| EP2174950A1 (en) | 2010-04-14 |
| CA2602143C (en) | 2016-08-09 |
| BRPI0609692C1 (pt) | 2021-05-25 |
| EP1861420B1 (en) | 2009-11-25 |
| WO2006100108A1 (en) | 2006-09-28 |
| RU2394914C2 (ru) | 2010-07-20 |
| US20080193475A1 (en) | 2008-08-14 |
| ATE540053T1 (de) | 2012-01-15 |
| CA2602143A1 (en) | 2006-09-28 |
| GB0505996D0 (en) | 2005-04-27 |
| US20140242635A1 (en) | 2014-08-28 |
| AU2006226542B2 (en) | 2012-02-09 |
| AU2006226542A1 (en) | 2006-09-28 |
| BRPI0609692B1 (pt) | 2019-02-12 |
| JP4917087B2 (ja) | 2012-04-18 |
| ES2335133T3 (es) | 2010-03-22 |
| CN101180313B (zh) | 2012-10-03 |
| JP2008533980A (ja) | 2008-08-28 |
| EP1861420A1 (en) | 2007-12-05 |
| CN101180313A (zh) | 2008-05-14 |
| KR101341121B1 (ko) | 2013-12-12 |
| KR20070116132A (ko) | 2007-12-06 |
| RU2007135122A (ru) | 2009-04-27 |
| ES2378193T3 (es) | 2012-04-09 |
| EP2174950B1 (en) | 2012-01-04 |
| BRPI0609692B8 (pt) | 2020-01-21 |
| ATE449788T1 (de) | 2009-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2602143C (en) | Fermentation process for the production of diphtheria toxin | |
| US10336794B2 (en) | Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins | |
| JP4827196B2 (ja) | 髄膜炎菌類タンパク質ｎｍｂ１８７０のドメインおよびエピトープ | |
| EP1756265B1 (en) | Soy peptone as a nitrogen source in preparing meningococcal conjugates | |
| EP0914153B1 (en) | Multivalent dtp-polio vaccines | |
| JP2017031221A (ja) | 髄膜炎菌のｎｍｂ１８７０のキメラ、ハイブリッドおよびタンデムポリペプチド | |
| JP6582020B2 (ja) | 発酵方法 | |
| KR20150087434A (ko) | 인간 백신 용도로 적합한 디프테리아 톡소이드 생산을 위한 동물 유래 성분을 함유하지 않는 발효 배지 | |
| JP7394065B2 (ja) | ボルデテラ属種を培養する方法 | |
| NZ314987A (en) | Live attenuated Pasteurellaceae bacteria producing non-activated RTX toxin, use in vaccines | |
| PT789754E (pt) | Processo de fermentacao de h. pylori |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B08F | Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE A 6A ANUIDADE. |
|
| B08H | Application fees: decision cancelled [chapter 8.8 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE AO DESPACHO 8.6 NA RPI 2161 EM 05/06/2012 |
|
| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] | ||
| B07E | Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette] |
Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI |
|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 12/02/2019, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. (CO) 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 12/02/2019, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS |
|
| B16C | Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette] |
Free format text: REF. RPI 2510 DE 12/02/2019 QUANTO AO INVENTOR. |
|
| B16C | Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 21/03/2006 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF |