KR101341121B1 - 디프테리아 독소를 생성하기 위한 발효 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 균일한 배양 및 배양물 내의 pO2가 대부분의 발효 단계 동안 4% 미만으로 감소하도록 하는 제한된 통기를 유지시키기에 충분한 교반 조건하에서 발효기 내의 배지 중에서 코리네박테리움 디프테리아 균주를 성장시키는 발효 단계를 포함하는 발효 방법에 관한 것이다.

Description

디프테리아 독소를 생성하기 위한 발효 방법 {FERMENTATION PROCESS FOR THE PRODUCTION OF DIPHTHERIA TOXIN}
본 발명은 디프테리아 항원, 특히 독소 (CRM197과 같은 디프테리아 독소의 돌연변이 형태를 포함함) 및 이러한 항원의 벌크 배양물을 제조하기 위한 발효 방법의 분야에 관한 것이다.
디프테리아 독소는 세균 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheria)에 의해 생성되는 단백질 외독소이다. 이는 용이하게 스플라이싱되어, 잔기 190, 192 또는 193에서의 절단의 결과로서 이황화결합에 의해 연결된 두개의 서브유닛인 단편 A 및 단편 B를 형성하는 단일 폴리펩티드로 생성된다 (Moskaug et al Biol. Chem. 264: 15709-15713, 1989). 단편 A는 촉매적 활성 부분이고, 단백질 합성 인자 EF-2를 특이적으로 표적화하여 EF-2를 불활성화시킴으로써 세포에서의 단백질 합성을 중지시키는 NAD-의존성 ADP-리보실트랜스퍼라아제이다.
세균 독소, 예를들어 디프테리아 독소에 대한 면역성은 감염 과정 동안 자연적으로 획득될 수 있거나, 약독된 형태의 독소 (톡소이드)를 주사함으로써 인공적으로 획득될 수 있다 (Germanier, er, Bacterial Vaccines, Academic Press, Orlando, Fl., 1984). 톡소이드는 전통적으로 천연 독소의 화학적 변형에 의해 제조되어왔으며 (Lingood et al Brit.J. Exp. Path. 44; 177, 1963), 이는 상기 톡소이드를 이후의 천연 독소 접종에 대해 백신화된 동물을 보호하는 항원성을 보유하면서 비독성으로 만든다. 또한, 감소된 독성을 지니는 여러 돌연변이화된 디프테리아 독소가 기재되었다 (US4709017, US4950740).
CRM197은 디프테리아 독소의 비독성 형태이나, 이는 디프테리아 독소와 면역학적으로 구별되지 않는다. CRM197은 독소발생 카리네파아지 (carynephage) b의 니트로소구아니딘 돌연변이유발에 의해 생성된 비독소발생 파아지 β197tox-에 감염된 C. 디프테리아에 의해 생성된다 (Uchida et al Nature New Biology (1971) 233; 8-11). CRM197 단백질은 디프테리아 독소와 동일한 분자량을 지니지만, 구조 유전자 내의 단일 염기 변화에 의해 디프테리아 독소와 구별된다. 이는 위치 52의 글리신을 글루타민으로 아미노산 변화시켜 단편 A가 NAD에 결합하지 못하게 만듦으로써 비독성화시킨다 (Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46; 69-94, Rappuoli Applied and Environmental Microbiology Sept 1983 p560-564).
디프테리아 독소 및 감소된 독성을 지닌 돌연변이 형태인 CRM197은 코리네박테리움 디프테리아에 대한 면역성을 제공하는 다수의 백신의 성분이다. 보르데텔라 백일해 (Bordetella pertussis), 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani), 코리네박테리움 디프테리아, 및 임의로 B형 간염 바이러스 및/또는 헤모필루스 인플루엔자 타입 b를 예방할 수 있는 여러 조합 백신이 공지되어 있다 (참조: WO 93/24148 및 WO 97/00697, WO 02/055105).
디프테리아 독소 및 CRM197을 포함하는 돌연변이 형태가 또한 당류를 위한 안전하고 유효한 T-세포 의존 담체로서 백신에 사용되어 왔다. CRM197은 현재 헤모필루스 인플루엔자 타입 b 올리고당류 CRM197 컨쥬게이트 백신 (HibTitre®; Lederle Praxis Biologicals, Rochester, N.Y.)에 사용된다.
디프테리아 독소 (DT)를 제조하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를들어, DT는 코리네박테리움 디프테리아의 배양물로부터 독소를 정제시킨 후, 화학적 무독화에 의해 생성될 수 있거나, 재조합체 또는 유전적으로 무독화된 독소의 유사체 (예를들어, US 4,709,017, US 5,843,711, US 5,601,827 및 US 5,917,017에 기술된 CRM197 또는 기타 돌연변이)의 정제에 의해 제조될 수 있다. 코리네박테리움 디프테리아는 호기성 조건하에서 배양된다. 라푸올리 등 (Rappuoli et al; Biotechnology February 1985, p161-163)은 요망되는 pO2를 유지시키기 위해 자동적으로 조절되는 공기 및 산소의 혼합물을 이용하는 통기에 의해 pO2가 25%로 조절되어야 한다는 것을 암시한다.
백신에 사용하기 위한 CRM197과 같은 디프테리아 독소의 유의한 양의 생성은 낮은 단백질 양으로 인해 방해되었다. 이러한 문제점은 기존에는 디프테리아 독소를 엔코딩하는 유전자 또는 돌연변이 형태의 추가 카피를 코리네박테리움 디프테리아에 도입시킴으로써 처리하였다 (US 4,925,792; US 5,614,382). 이러한 방법은 생산량을 약 3배 증가시킨다. 재현가능한 방식으로 디프테리아 독소 수율을 추가로 개선시키는 방법은 상기의 가치있는 항원의 생산 수준을 높이는데 이로울 것이다.
따라서, 본 출원은 균일한 배양 및 배양물 내의 pO2가 대부분의 발효 단계 동안 4% 미만으로 감소하도록 하는 제한된 통기를 유지시키기에 충분한 교반 조건하에서 발효기 내의 배지 중에서 코리네박테리움 디프테리아 균주를 성장시키는 발효 단계를 포함하는 개선된 발효 방법을 제공한다.
발효는 호기성이지만, 대부분의 발효 동안 배양물에 주입되고 곧 산소가 소모되는 제한된 통기 조건, 즉 C. 디프테리아의 밀도가 비교적 낮고, pO2 수준이 보다 높을 수 있는 초기 단계 이후에 발생한다. 본 발명자들은 상기 조건하에서의 배양이 보다 높은 pO2에서 수행된 발효 방법에 비해 디프테리아 독소 또는 돌연변이의 보다 효율적이고/이거나 지속적인 발현을 발생시키는 것을 발견하였다. 본 발명의 방법은 보다 높은 수준의 산소에서의 발효보다 더욱 강하고, 이는 배지가 첨가된 철을 함유하거나 다양한 성질의 복합 원료 물질이 사용되는 경우에서도 디프테리아 독소의 수율을 높게 유지시킨다.
본 발명의 두번째 양태에서, 본 발명의 발효 방법을 수행하고, 배양물로부터 디프테리아 독소 또는 이의 돌연변이를 단리시키는 것을 포함하여, 디프테리아 독소 또는 이의 돌연변이 제조물을 제조하는 방법이 제공된다. 비록 디프테리아 독소 및 돌연변이는 본원에 기술되어 있으나, 임의의 C. 디프테리아 항원이 본 발명의 방법을 이용하여 단리될 수 있음이 예상된다.
이러한 방법의 이용은 5% pO2 또는 20%와 같이 보다 높은 pO2가 유지되는 경우에 비해 디프테리아 독소 또는 CRM197과 같은 돌연변이의 높은 수율을 야기시킨다.
본 발명의 세번째 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 단리된 디프테리아 독소 또는 이의 돌연변이가 제공된다.
본 발명의 네번째 양태에서, 본 발명의 디프테리아 독소 또는 이의 돌연변이 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
본 발명의 한 추가 양태에서, 치료, 특히 C. 디프테리아 질환과 같은 세균 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 디프테리아 독소 또는 이의 돌연변이가 제공된다.
본 발명의 한 추가 양태에서, 세균 질환, 특히 C. 디프테리아 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서, 본 발명의 디프테리아 독소 또는 이의 돌연변이의 용도가 제공된다.
본 발명의 한 추가 양태에서, 본 발명의 약제 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 세균 감염, 특히 C. 디프테리아 감염을 예방하거나 치료하는 방법이 제공된다.
도면의 설명
도 1 - 산소공급 프로마일 및 발효의 KLa의 결정에서의 이의 용도를 나타내는 그래프. 패널 A는 질소로부터 공기로의 전환 후 산소공급의 시간 경과를 나타낸다. 패널 B는 선 기울기의 결정에 의한 KLa의 측정을 가능케 하는 시간에 대한 ln(100-pO2)의 플롯을 나타낸다.
도 2 - C. 디프테리아에 대한 발효 방법의 개관.
도 3 - C. 디프테리아 배양물의 성장의 통상적인 동역학을 나타내는 그래프. 원형 마커를 지닌 선은 다양한 배양 시간 후의 650nm에서의 OD를 나타낸다. 다이아몬드를 지닌 선은 배양물의 pH를 나타낸다.
도 4 - 배양물 상층액의 SDS-PAGE 젤. 레인 1 - 분자량 마커, 레인 2 - 1μg의 CRM197 표준, 레인 3 - 0.5μg의 CRM197 표준, 레인 4 - 0.25μg의 CRM197 표준, 레인 5-11 - C. 디프테리아 발효로부터의 상층액. 젤 A는 레인 5의 CDT082, 레인 6-8의 CDT198 (레인 6에 대해서는 상층액을 22.5시간에 분리시키고, 레인 7에 대해서는 24시간에 분리시키고, 레인 8에 대해서는 28시간에 분리시켰다), 레인 9, 10 및 11의 CDT199 (레인 9에 대해서는 상층액을 22시간 45분에 분리시키고, 레인 10에 대해서는 24시간 45분에 분리시키고, 레인 11에 대해서는 이후의 미세여과 및 여과 후에 분리시켰다)로부터의 상층액을 나타낸다. 젤 B는 레인 5의 CDT082, 레인 6-9의 CDT205 (레인 7은 발효 21시간 43분 후, 레인 8은 발효 23시간 후, 레인 9는 발효 24시간 후이다) 및 레인 10-13의 CDT206 (레인 10은 발효 22시간 10분 후, 레인 11은 발효 23시간 49분 후, 레인 12는 발효 24시간 30분 후, 레인 13은 미세여과 및 여과 후이다)로부터의 상층액을 나타낸다.
도 5 - 분당 23 리터의 호기 조건하에서의 다양한 교반 속도에서의 150 리터 발효기의 KLa를 나타내는 그래프.
발명의 상세한 설명
본원의 용어 "포함하는", "포함하다" 및 "(들을) 포함하다"는 모든 경우에 용어 "구성되는", "구성되다" 및 "(들로) 구성되다"로 각각 대용될 수 있다.
본 발명의 한 양태는 균일한 배양 (예를들어, 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1초 미만의 혼합 시간을 발생시키기에 충분한 배양) 및 배양물 내의 pO2가 대부분의 발효 단계 동안 5%, 4%, 3%, 1% 또는 0.5% 미만으로 감소하도록 하는 제한된 통기를 유지시키기에 충분한 교반 조건하에서 발효기 내의 배지 중에서 코리네박테리움 디프테리아 균주를 성장시키는 발효 단계를 포함하는 발효 방법이다. 한 바람직한 구체예에서, pO2는 바람직하게는 대부분의 발효 단계 동안 0에 가깝게 감소한다.
예를들어, 배양물 내의 pO2는 코리네박테리움 디프테리아가 배양물 내로 산소가 공급되고 곧 대부분의 산소를 소모하기에 충분한 밀도로 상기 코리네박테리움 디프테리아가 성장하는 시간 (잠복기, 예를들어 발효 시작후 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간 이상)으로부터 발효 단계의 종료에 가까운 pO2 농도가 다시 상승하는 발효 시점 (예를들어, 잠복기 후 16, 18, 20, 22 또는 24시간)까지 5%, 4%, 3%, 1% 또는 05% 미만으로 감소한다.
pO2가 상기 제한된 통기 조건으로 상승하는 경우 발효가 통상적으로 종료되고, 배양물이 수거된다. 다양한 접종 조건하에서, 예를들어 발효기가 C. 디프테리아의 매우 많은 배양물로 접종되는 경우, 제한된 통기 조건은 발효의 개시 후에 곧 (예를들어, 발효 시작후 1, 5, 10, 20, 30, 40 또는 60분 후) 개시되는 것을 인지해야 한다.
100% pO2는 배지 (배양물의 부재하)가 34.5℃ 및 0.5 바 (bar)의 압력에서 배지를 통해 압축공기를 버블링시킨 후에 산소로 포화되는 경우에 존재하는 산소의 양이다. 150 리터의 발효기에서 통기율 및 교반 속도는 23 리터/분 및 240rpm으로 세팅되어야 하는 반면, 20리터의 발효기의 통기율 및 교반 속도는 3 리터/분 및 300rpm으로 세팅되어야 한다. 이는 접종에 앞서 완전히 통기되는 발효 배지에 존재하는 산소의 양으로 세팅될 수 있다.
균일 배양은 세균의 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10% 이상이 배지의 최고 10%로 존재하도록 발효기 전체에 걸쳐 세균이 균일하게 분산되도록 하는 배양이다.
발효 단계는 코리네박테리움 디프테리아가 발효기 내에서 배양되는 단계로 정의된다. 발효 단계는 발효기로의 예비배양의 도입과 함께 개시되고, 본원에 기술된 제한된 통기 조건하에서 pO2가 종국적으로 10% 이상으로 증가하는 경우에 종료된다. 발효 단계는 통상적으로 12, 14, 16, 18, 20 또는 24 시간, 예를들어 16 내지 40시간, 또는 예를들어 22 내지 28시간에 걸쳐 지속된다.
교반은 임의로 발효기 내에서 배양물을 교반시킴으로써 이루어지나, 임의의 기타 적절한 수단, 예를들어 교반, 바이브로믹서 (vibromixer) 및/또는 가스 버블링에 의해 이루어질 수 있다. 교반은 배양물에 대해 20, 15, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1초 미만의 혼합 시간을 생성시키는 것으로 충분하다.
배양물의 혼합 시간은 유리 발효기에서 측정될 수 있다. 이는 착색된 수용액이 배지 전체에 균일하게 분산되는, 착색된 수용액의 도입후에 획득된 시간이다.
발효기는 세균 배양의 산업적 생산에 적절한 임의의 장치이다. 그러나, 이 용어는 보다 작은 규모로 세균을 성장시키는데 통상적으로 사용되는 배양 플라스크를 포함하지 않는다.
대부분의 발효 단계는 발효 단계의 전체 길이의 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 초과하는 시간으로 정의된다. 발효는 통상적으로 12, 14, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 28 시간 동안 제한된 통기하에서 이루어진다.
제한된 통기는 C. 디프테리아가 호기성 호흡을 이용하는 것을 가능케 하나, 배양물의 밀도가 증가한 후 (예를들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10시간 이상의 발효 후)에 산소가 배양물에 공급된 후 매우 빠르게 소모되어 pO2가 5, 4, 3, 2, 1 또는 0.5% 미만이 되도록 이용가능한 산소의 양을 제한하는 통기 조건을 의미한다. 발효기에 접종시키기 위해 사용되는 배양물의 양을 증가시킴으로써 제한된 통기 조건이 접종 후에 매우 빠르게 (예를들어, 발효 시작 1, 5, 10, 20 또는 30분 후) 달성될 수 있음이 인지되어야 한다.
이러한 제한된 통기 조건은 독소, 예를들어 디프테리아 독소 또는 이의 돌연변이의 강한 발현을 야기시킨다.
0으로 감소하는 pO2는 배양물 내로 도입되는 산소가 배양물로의 도입 후에 곧 호흡을 위해 배양물에 의해 이용되어, 배양물의 통기에도 불구하고 pO2가 산소 모니터에서 0 또는 0에 근접하는 것으로 판독되는 통기 및 교반 속도에 의해 달성된다.
발효 단계 동안, pO2는 제공된 교반 세팅 및 통기율 보다 높은 수준에서 시작할 것이다. 이는 배양물 내의 세균의 밀도가 발효 시작시 낮고, 발효 단계 동안 증가하기 때문이다. 기간 (예를들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10시간 이하)은 통상적으로 pO2가 5% 미만으로 감소하기 전에 요구된다. 이 시점 이후, pO2는 발효 단계의 종료에 근접, 예를들어 발효기의 수거까지 5, 4, 3, 2, 1 또는 0.5% 미만, 바람직하게는 0에 근접하는 수준으로 유지된다.
임의로, 발효 단계는 발효 단계 전체에 걸쳐 일정한 KLa에서 수행된다. 대안적으로, 발효 단계는 제한된 통기가 대부분 (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상)의 발효 단계 동안 존재하는 KLa 값에서 달성되도록 하나 이상의 KLa에서 수행된다.
KLa는 산소가 배양물로 공급되는 속도의 척도이다. KLa가 높을수록, 배양물 내로 도입되는 산소의 속도가 높다. 배지 및 조성물의 부피, 교반, 통기, 압력, 온도 및 발효기의 이동부의 위치 및 특성을 포함하는 여러 요인이 특정 발효 단계의 KLa에 영향을 미칠 것이다.
통상적으로, 산소는 배양물 전체에 걸쳐 압축 공기를 버블링시킴으로써 발효 배양물로 도입된다. 배양물로 도입되는 공기에 다양한 농도의 산소가 존재하는 경우, 이를 고려하여 유속이 적합화되어야 한다. 예를들어, 100% 산소의 공급이 배양물로 도입되는 경우, 유속은 이에 대응하여 낮을 것이다. 공기 보다 적은 산소를 함유하는 가스가 배양물로 도입되는 경우, 보다 높은 유속이 적용될 것이다.
KLa는 실시예 1에 기술된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 상기 방법은 발효기를 배지 부피, 온도, 압력, 교반 및 측정되는 KLa에 대한 통기의 조건을 이용하여 세팅시키고, 공기를 질소 가스로 대체시킴으로써 가스를 배출시키고, 공기 통기를 회복시킴으로써 가스를 유입시키고, pO2가 이의 정류 상태 수준으로 복귀하는 속도를 측정하는 것을 포함한다.
ln (100-pO2) = -KLa. T + C
시간에 대해 ln (100-pO2)를 작도함으로써, 선의 기울기 (또는 각 계수)가 - KLa가 된다.
발효 단계의 KLa는 배양물의 교반의 양 및 배양물의 통기율을 포함하는 다수의 요인에 의해 영향을 받는다. 예를들어 배양물의 교반을 감소시키고 통기율을 증가시키거나 이의 반대로 교반을 증가시키고 통기율을 감소시키면서 일정한 KLa가 유지될 수 있다. 그러나, 한 구체예에서, 배양물의 교반 속도 및 통기율 둘 모두는 발효 단계에서 일정하다.
발효 단계는 예를들어 10-200 h-1 , 10-150 h-1, 10-100 h-1, 10-80 h-1, 10-50 h-1, 10-40 h-1, 10-30 h-1, 20-150 h-1, 20-100 h-1, 20-50 h-1, 20-60 h-1, 20-80 h-1, 20-30 h-1, 20-40 h-1, 30-60 h-1, 60-80 h-1, 60-150 h-1 또는 60-200 h-1 사이의 KLa에서 수행된다.
본 발명의 발효 방법의 KLa는 발효 배양물의 크기에 따라 다양할 수 있다. 10-30 리터의 배양물에 대해, 10-30 h-1, 15-30, 20-30 또는 22-28 h-1의 KLa가 사용될 수 있다. 30-250 리터의 배양물에 대해, 30-60 또는 40-50 h-1의 KLa가 사용될 수 있다. 250-800 리터의 배양물에 대해, 30-50, 40-50, 40-60, 30-60, 30-80 또는 60-150 h-1의 KLa가 사용될 수 있다. 800-3000 리터의 배양물에 대해, 30-50, 40-50, 40-60, 30-60, 30-80, 60-150 또는 60-200 h-1의 KLa가 사용될 수 있다.
10-30 리터의 발효 배양물 크기에 대해, 10-30 h-1의 KLa가, 예를들어 1-5 리터/분의 기류 또는 통기율 및 200-400rpm의 교반 속도, 예를들어 2-4 리터/분의 통기율 및 250-350rpm의 교반 속도를 이용함으로써 달성된다.
30-250 리터의 발효 배양물에 대해, 30-60 h-1의 KLa가, 예를들어 15-25 리터/분의 통기율 및 150-250 rpm의 교반 속도, 예를들어 20-25 리터/분의 통기율 및 200-250 rpm의 교반 속도, 예를들어 15-20 리터/분의 통기율 및 200-250 rpm의 교반 속도를 이용함으로써 달성된다.
발효 단계 동안 CY 배지 중의 C. 디프테리아의 배양물의 pH는 배양물의 통기 및 교반의 조건에 좌우된다 (Nikolajewski et al J. Biological Standardization, 1982, 10; 109-114). 발효 단계의 시작시, CY 배지의 pH는 7.4이다. 낮은 통기 또는 KLa의 경우, pH는 약 5로 하락한다. 높은 통기의 경우, pH는 약 8.5로 증가한다. 본 발명의 한 구체예에서, C. 디프테리아는 CY 배지 또는 SOC 배지 (Sambrook J et al 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) 또는 유사 배지에서 배양된다. 발효기 내의 pH는 임의로 산 또는 염기의 첨가를 필요로 하지 않고 통기의 정도에 따라 7.0 내지 7.8로 유지될 수 있다.
본 발명의 방법은 임의의 코리네박테리움 디프테리아 균주를 사용하여 이용될 수 있다. 이러한 균주는 야생형 디프테리아 독소, 디프테리아 독소 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질 (예를들어 US 5863891에 기술된 것) 또는 디프테리아 독소의 돌연변이 형태 또는 단편, 바람직하게는 감소된 독성을 지니는 것을 생성할 수 있다. 이러한 돌연변이 독소의 예는 CRM176, CRM197, CRM228, CRM45 (Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 및 CRM107 및 문헌[Nicholls and Youle in Geneticaly Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992]에 기술된 기타 돌연변이; Glu-148의 결실 또는 Asp, Gln 또는 Ser으로의 돌연변이 및/또는 Ala 158의 결실 또는 Gly로의 돌연변이, 및 US 4709017 또는 US 4950740에 기술된 기타 돌연변이; Lys 516, Lys 526, Phe 530 및/또는 Lys 534중 하나 이상의 잔기의 돌연변이 및 US 5917017 또는 US 6455673에 기술된 기타 돌연변이; 또는 US 5843711에 기술된 단편이다. 한 구체예에서, C. 디프테리아 균주는 CRM197을 생성한다.
한 구체예에서, C. 디프테리아의 하기 균주가 본 발명의 방법에 사용된다: ATCC39255, ATCC39526, ATCC11049, ATCC11050, ATCC11051, ATCC11951, ATCC11952, ATCC13812, ATCC14779, ATCC19409, ATCC27010, ATCC27011, ATCC27012, ATCC296, ATCC43145, ATCC51280 또는 ATCC51696.
본 발명에 사용하기 위한 배지는 하기 성분중 하나 이상을 함유할 수 있다: 5-20g/L, 10-16g/L 또는 10g/L의 카사미노산 또는 카세인 가수분해물, 5-20g/L, 7-15g/L 또는 9-12g/L의 콩 펩톤 및/또는 10-40g/L, 14-32g/L 또는 18-22g/L의 효모 추출물.
성장 배지의 철 함량은 C. 디프테리아의 성장에 영향을 줄 수 있고, 독소 생성에 영향을 미칠 수 있다 (WO 00/50449 참조). 철은 세균 성장에 필수적이나, 높은 농도의 철은 독소의 생성을 방해하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 방법 동안, 배지의 철 함량은 10, 50, 75, 100, 120 또는 150 ppb의 낮은 수준 및 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 또는 5000ppb의 상한을 지닌다. 예를들어, 배지 내의 철 농도는 50-1000ppb, 100-1000ppb, 200-1000ppb, 400-1000ppb, 500-1500ppb, 700-1300ppb, 50-2000ppb, 100-2000ppb, 200-2000ppb, 400-2000ppb, 700-2000ppb, 50-3000ppb, 100-3000ppb, 200-3000ppb, 400-3000ppb, 700-3000ppb, 1000-3000ppb, 1500-3000ppb, 1700-3000ppb, 50-4000ppb, 100-4000ppb, 200-4000ppb, 400-4000ppb, 700-4000ppb, 1000-4000ppb, 1500-4000ppb, 1700-4000ppb 또는 2000-4000ppb이다. 철은 Fe2+ 및/또는 Fe3+의 형태일 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 방법은 배지 내의 철 염의 존재에 대해 충분히 내성이 있으므로, 사용전에 철을 제거하기 위한 배지 처리가 필요하지 않다.
발효 단계는 C. 디프테리아의 배양에 적합한 온도, 예를들어 25-45℃, 25-40℃, 30-38℃, 또는 34-35℃에서 발생한다.
발효 단계는 다량의 포움 (foam) 생성물을 생성시키기 쉽다. 포움 생성물을 제어하기 위해, 소포제가 임의로 발효기에 첨가된다. 임의로, 예를들어 소포제 뿐만 아니라 포움 프로브 또는 기계적 포움 제거제가 발효기에서 사용된다.
본 발명의 두번째 양태는 상기 기술된 바와 같이 본 발명의 발효 방법을 수행하는 단계, 및 항원, 예를들어 디프테리아 독소 또는 이의 돌연변이 또는 단편을 배양물로부터 단리시키는 단계를 포함하여, 항원, 예를들어 디프테리아 독소 또는 이의 돌연변이 또는 단편의 제조물을 제조하는 방법이다.
본 발명의 세번째 양태는 본 발명의 방법에 의해 단리된 디프테리아 독소 또는 이의 돌연변이 또는 단편 (예를들어 CRM197)이다.
디프테리아 독소의 독성은 임의로 가교제로 처리하여 톡소이드를 형성시키는 것을 포함하는 화학적 처리에 의해 감소된다. 독소는 톡소이드를 포함한다.
본 발명의 추가 양태는 본 발명의 디프테리아 독소 또는 이의 돌연변이 (예를들어 CRM197) 또는 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물이다.
본 발명의 약제 조성물은 임의로 조합 백신 내에 추가의 항원을 추가로 포함한다. 한 구체예에서, 상기 기술된 디프테리아 독소, 또는 이의 돌연변이 또는 단편과 조합되는 항원(들)은 파상풍 톡소이드, 전체세포 백일해 (Pw), 무세포 백일해 (Pa) (하기 기술되어 있음), B형 간염 표면 항원, A형 간염 바이러스, 헤모필루스 인플루엔자 b 다당류 또는 올리고당류, 나이세리아 (예를들어. N. 메닌지티디스) 다당류 또는 올리고당류, 임의로 외막 비히클의 일부로서 N. 메닌지티디스 혈청형 B 단백질, 폐렴구균 다당류 또는 올리고당류, 폐렴구균 단백질 또는 하기 기술되는 임의의 항원을 포함한다. 세균 다당류는 담체 단백질에 컨쥬게이팅될 수 있다. 디프테리아 독소 또는 디프테리아 독소의 톡소이드 또는 돌연변이, 예를들어 CRM197 또는 이의 단편, 예를들어 본 발명의 방법을 이용하여 제조된 CRM197 또는 이의 단편이 담체 단백질로 사용될 수 있다. 그러나, 기타 담체 단백질, 예를들어 파상풍 톡소이드, 파상풍 톡소이드 단편 C, 폐렴구균 용혈독소, 단백질 D (US6342224)가 또한 사용될 수 있다. 제공된 약제 조성물은 임의로 다양한 담체 단백질에 컨쥬게이션된 다중 다당류 또는 올리고당류를 함유한다.
본 발명의 방법을 이용하여 제조된 디프테리아 독소, 또는 이의 돌연변이, 예를들어 CRM197 또는 이의 단편은 나이세리아 메닌지티디스 (Neisseria meningitidis), 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) b, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae), 그룹 A 스트렙토코쿠스, 그룹 B 스트렙토코쿠스, 스태필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 또는 스태필로코쿠스 에피더미스 (Staphylococcus epidermidis)중 하나 이상으로부터 유래된 캡슐 다당류 또는 올리고당류로 포뮬레이팅된다. 예를들어, 약제 조성물 또는 면역원성 조성물은 나이세리아 메닌지티디스의 혈청군 A, C, W-135 및 Y중 하나 이상으로부터 유래된 캡슐 다당류를 포함할 수 있다. 예를들어, 혈청군 A 및 C; A 및 W, A 및 Y; C 및 W, C 및 Y, W 및 Y; A, C 및 W; A C 및 Y; A, W 및 Y; C, W 및 Y 또는 A, C, W 및 Y가 CRM197과 함께 포뮬레이팅될 수 있다. 또 다른 예에서, 면역원성 조성물은 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터 유래된 캡슐 다당류를 포함한다. 폐렴구균 캡슐 다당류 항원은 바람직하게는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F (가장 바람직하게는 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F)으로부터 선택된다. 한 추가 예는 헤모필루스 인플루엔자 타입 b의 PRP 캡슐 다당류 (또는 올리고당류)를 함유한다. 한 추가 예는 스태필로코쿠스 아우레우스의 타입 5, 타입 8, 336, PNAG 또는 dPNAG 캡슐 다당류를 함유한다. 한 추가 예는 스태필로코쿠스 에피더미스의 타입 I, 타입 II, 타입 III 또는 PIA 캡슐 다당류를 함유한다. 한 추가 예는 그룹 B 스트렙토코쿠스의 타입 Ia, 타입 Ic, 타입 II 또는 타입 III 캡슐 다당류를 함유한다. 한 추가 예는 임의로 하나 이상의 M 단백질, 더욱 바람직하게는 M 단백질의 다중 형태를 추가로 포함하는, 그룹 A 스트렙토코쿠스의 캡슐 다당류를 함유한다.
본 발명에 사용하기 위한 세균 다당류는 정제된 천연 다당류의 전체 길이일 수 있다. 대안적으로, 다당류는 2 내지 20배, 예를들어 2-5배, 5-10배, 10-15배 또는 15-20배의 크기로, 이러한 다당류는 보다 용이한 취급 용이성의 크기보다 작다. 올리고당류는 통상적으로 2 내지 20개의 반복 단위를 함유한다.
이러한 캡슐 다당류는 담체 단백질, 예를들어 파상풍 톡소이드, 파상풍 톡소이드 단편 C, 디프테리아 독소 또는 CRM197 (둘 모두는 예를들어 본 발명의 방법에 의해 제조됨), 폐렴구균 용혈독소, 또는 단백질 D (US6342224)에 컨쥬게이팅되거나 컨쥬게이팅되지 않을 수 있다. 파상풍 독소, 디프테리아 독소 및 폐렴구균 용혈독소는 유전적 돌연변이 및/또는 화학적 처리에 의해 약독화된다.
다당류 또는 올리고당류 컨쥬게이트는 임의의 공지된 커플링 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를들어, 다당류는 티오에테르 결합을 통해 커플링될 수 있다. 이러한 컨쥬게이션 방법은 다당류와 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP)의 활성화에 의한 시아네이트 에스테르의 형성에 의존한다. 따라서, 활성화된 다당류는 직접적으로 또는 스페이서 (spacer) 기를 통해 담체 단백질 상의 아미노기에 커플링될 수 있다. 임의로, 시아네이트 에스테르는 헥산 디아민과 커플링되고, 아미노 유래 다당류는 티에에테르 결합의 형성을 포함하는 헤테로라이게이션 (heteroligation) 화학을 이용하여 담체 단백질에 컨쥬게이팅된다. 이러한 컨쥬게이트는 PCT 공개 출원번호 WO93/15760 (Uniformed Services University)에 기술되어 있다.
컨쥬게이트는 또한 US 4365170 (Jennings) 및 US 4673574 (Anderson)에 기술된 직접 환원 아미노화 방법에 의해 제조될 수 있다. 기타 방법은 EP-0-161-188, EP-208375 및 EP-0-477508에 기술되어 있다.
추가 방법은 카르보디이미드 축합에 의해 아디프산 히드라지드 (ADH)를 이용하여 유래된 시아노겐 브로마이드 활성화된 다당류를 단백질 담체에 커플링시키는 것을 포함한다 (Chu C. et al Infect. Immunity, (1983) 245; 256).
특정 예에서, 디프테리아 독소 또는 이의 단편 또는 돌연변이 (예를들어, CRM197)은 약제 조성물의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 추가 항원에 컨쥬게이팅된다. 한 구체예에서, 이는 다당류 성분(들), 예를들어 상기 기술된 것을 포함하는 세균 다당류에 컨쥬게이팅된다.
본 발명의 약제 조성물 또는 면역원성 조성물은 추가 단백질 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이는 임의로 파상풍 및 보르데텔라 백일해 감염중 하나 이상에 대한 보호를 제공하는 항원과 포뮬레이팅된다. 백일해 성분은 PT, FHA 및 69kDa 퍼탁틴 (pertactin)으로부터의 하나 이상의 항원 (바람직하게는 2개 또는 3개 모두)을 함유하는 사멸된 전체 세포 B. 백일해 (Pw) 또는 무세포 백일해 (Pa)일 수 있다. 특정 기타 무세포 백일해 포뮬레이션은 또한 응집원, 예를들어 Fim 2 및 Fim 3을 함유하고, 이러한 백신이 또한 본 발명에 사용하는 것이 고려된다. 통상적으로, 파상풍에 대한 보호를 제공하는 항원은 화학적으로 비활성화된 독소 (예를들어, 포름알데히드로 처리된 후의 독소)이거나 하나 이상의 점 돌연변이(들)의 도입에 의해 비활성화된 파상풍 독소이다.
본 발명의 약제 조성물 또는 면역원성 조성물은 임의로 폐렴구균 단백질 항원, 예를들어 폐렴구균의 외부 표면에 노출된 폐렴구균 단백질 (폐렴구균의 생명 주기중 일부 또는 전부 동안 숙주의 면역계에 의해 인지될 수 있음)을 포함하거나, 폐렴구균에 의해 분비되거나 방출되는 단백질이다. 예를들어, 단백질은 독소, 부착소, 2-성분의 신호전달인자, 또는 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 지질단백질, 또는 이들의 단편이다. 이러한 단백질의 예는 폐렴구균 용혈독소 (바람직하게는 화학적 처리 또는 돌연변이에 의해 약독화된 것) [Mitchell et al. Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18(13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell et al. Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007(1): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties.", WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton et al), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA 및 이의 트랜스멤브레인 결실 변이체 (US 5804193 - Briles et al.); PspC 및 이의 트랜스멤브레인 결실 변이체 (WO 97/09994 - Briles et al); PsaA 및 이의 트랜스멤브레인 결실 변이체 (Berry & Paton, Infect lmmun 1996 Dec;64(12):5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"); 폐렴구균 콜린 결합 단백질 및 이의 트랜스멤브레인 결실 변이체; CbpA 및 이의 트랜스멤브레인 결실 변이체 (WO 97/41151; WO 99/51266); 글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나아제 (Infect. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); M 유사 단백질, (EP 0837130) 및 부착소 18627, (EP 0834568)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 면역원성 조성물에 포함되는 추가의 폐렴구균 단백질 항원은 WO 98/18931, WO 98/18930 및 PCT/US99/30390에 기술된 것이다.
본 발명의 면역원성 조성물과 함께 포뮬레이팅되는 나이세리아 단백질의 예는 TbpA (WO93/06861; EP586266; WO92/03467; US5912336), TbpB (WO93/06861; EP586266), Hsf (WO99/31132), NspA (WO96/29412), Hap (PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85 (D15로도 공지됨) (WO00/23595), PilQ (PCT/EP99/03603), PldA (PCT/EP99/06718), FrpB (WO96/31618 SEQ ID NO:38 참조), FrpA 또는 FrpC 또는 30, 50, 100, 500, 750개 이상의 아미노산에 공통적인 보존된 부분 (WO92/01460), LbpA 및/또는 LbpB (PCT/EP98/05117; Schryvers et al Med. Microbiol. 1999 32: 1117), FhaB (WO98/02547 SEQ ID NO: 38), HasR (PCT/EP99/05989), lipo02 (PCT/EP99/08315), MltA (WO99/57280) 및 ctrA (PCT/EPOO/00135)를 포함한다. 나이세리아 단백질은 정제된 단백질로 첨가되거나 외막 제조물의 일부로 첨가된다.
본 발명의 약제 조성물 또는 면역원성 조성물은 임의로 유형분류되지 않은 헤모필루스 인플루엔자 및 RSV에 대해 숙주를 보호할 수 있는 하나 이상의 항원 및/또는 인플루엔자 바이러스에 대해 숙주를 보호할 수 있는 하나 이상의 항원을 포함한다.
유형분류되지 않은 H. 인플루엔자 단백질 항원의 예는 핌브린 단백질 (US 5766608) 및 이로부터의 펩티드를 포함하는 융합체 (예를들어, LB1 융합체) (US 5843464 - Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, 단백질 D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Hap 및 D15를 포함한다.
인플루엔자 바이러스 항원의 예는 난세포 또는 MDCK 세포 또는 베로 (Vero) 세포에서 성장한 전체 생 또는 비활성화된 바이러스, 분할 인플루엔자 바이러스, 또는 전체 플루 (flu) 바이로솜 (R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920에 기재된 것) 또는 이의 정제 단백질 또는 재조합 단백질, 예를들어 HA, NP, NA 또는 M 단백질 또는 이들의 조합물을 포함한다.
RSV (호흡기 세포융합 바이러스) 항원의 예는 F 당단백질, G 당단백질, HN 단백질, M 단백질 또는 이들의 유도체를 포함한다.
본 발명의 항원성 조성물은 단일종의 세균으로부터의 하나 이상의 캡슐 다당류를 포함할 수 있다. 항원성 조성물은 또한 하나 이상의 종의 세균으로부터 유래된 캡슐 다당류를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 양태는 본 발명의 방법에 의해 제조된 디프테리아 독소, 또는 이의 단편 또는 돌연변이 (예를들어, CRM197) 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 포함한다.
임의로, 면역원성 조성물 또는 백신은 면역원에 대한 면역 반응을 향상시키기에 충분한 양의 애쥬번트를 함유한다. 적절한 애쥬번트는 알루미늄염, 스쿠알렌 혼합물 (SAF-1), 뮤라밀 펩티드, 사포닌 유도체, 미코박테리아 세포벽 제조물, 모노포스포릴 지질 A, 미콜산 유도체, 비이온성 블록 공중합체 계면활성제, Quil A, 콜레라 독소 B 서브유닛, 폴포스파젠 및 유도체, 및 문헌[Takahashi et al. (1990) Nature 344:873-875]에 기술된 것과 같은 면역자극 복합체 (ISCOM)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 수의학적 용도 및 동물에서의 항체의 생성을 위해, 프로인트 애쥬번트 (Freund's adjuvant)의 분열촉진 성분이 사용될 수 있다.
모든 면역원성 조성물 또는 백신과 같이, 면역학적 유효량의 면역원이 실험적으로 결정되어야 한다. 고려되는 요인은 면역원이 애쥬번트 또는 담체 단백질 또는 기타 담체와 복합체를 이루거나, 이에 공유적으로 부착되거나 그렇지 않은지 간에 면역원성, 투여 경로 및 투여되는 면역 투여 횟수를 포함한다. 이러한 요인은 백신 분야에 공지되어 있고, 면역학자가 과도한 실험 없이도 상기 결정을 가능하게 하도록 확립되어 있다.
활성제가 본 발명의 약제 조성물 또는 백신에 다양한 농도로 존재할 수 있다. 통상적으로, 상기 물질의 최소 농도는 이의 사용 목적을 달성하기에 필요한 양인 반면, 최대 농도는 용액 내에 남아 있거나 최초 혼합물 내에서 균일하게 현탁되는 최대량이다. 예를들어, 치료제의 최소량은 바람직하게는 단일한 치료 효과 투여량을 제공하는 것이다. 생활성 물질에 대해, 최소 농도는 재구성 후에 생활성에 필요한 양이고, 최대 농도는 균일한 현탁액이 유지될 수 없는 지점이다. 단일 투여 유닛의 경우, 상기량은 단일 치료 적용량이다. 일반적으로, 각각의 용량은 1-100μg의 단백질 항원, 바람직하게는 5-50μg, 가장 바람직하게는 5-25μg을 포함할 것이다. 세균 다당류의 바람직한 용량은 10-20μg, 10-5μg, 5-2.5μg 또는 2.5-1μg이다. 상기 물질의 바람직한 양은 물질마다 다양하지만, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
본 발명의 백신 제조물은 상기 백신을 전신 또는 점막 경로를 통해 투여함으로써 감염에 민감한 포유동물 (예를들어, 인간 환자)을 보호하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 투여는 근내, 복막내, 피내 도는 경피 경로; 또는 경구/식사, 호흡기, 비뇨생식관으로의 점막 투여를 통한 주입을 포함할 수 있다. 본 발명의 백신은 단일 투여로 투여될 수 있으나, 이의 성분은 또한 동시에 또는 상이한 시간 (예를들어, 다당류가 백신에 존재하는 경우, 이들은 서로에 대해 면역 반응의 최적 협동을 위해 세균 단백질 조합물의 투여와 동시에 또는 이의 1-2주 후에 개별적으로 투여될 수 있음)에 함께 공동투여될 수 있다. 또한, 단일 투여 경로, 2개의 상이한 투여 경로가 사용될 수 있다. 예를들어, 바이러스 항원은 ID (피내) 투여될 수 있는 반면, 세균 단백질은 IM (근내) 또는 IN (비내) 투여될 수 있다. 다당류가 존재하는 경우, 이들은 IM (또는 ID) 투여될 수 있고, 세균 단백질은 IN (또는 ID) 투여될 수 있다. 또한, 본 발병의 백신은 초회량에 대해 IM 투여되고, 추가 접종량에 대해 IN투여될 수 있다.
백신 제조물은 일반적으로 문헌[Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York)]에 기술되어 있다. 리포솜 내에서의 캡슐화는 풀러톤 (Fullerton)의 US 특허 제4,235,877호에 기술되어 있다.
본 발명의 한 추가 양태는 본 발명의 발효 방법을 이용하여 디프테리아 독소 또는 이의 단편 또는 돌연변이 (예를들어, CRM197)을 제조하는 단계, 및 이를 약학적으로 허용되는 담체와 조합시키는 단계, 및 임의로 상기 언급된 추가 항원중 임의의 것을 첨가하는 단계를 포함하여 약제 조성물을 제조하는 방법이다.
이러한 방법은 디프테리아 독소 또는 이의 단편 또는 돌연변이 (예를들어, CRM197)를 약제 조성물의 하나 이상의 추가 성분, 바람직하게는 상기 기술된 세균 다당류 또는 올리고당류에 컨쥬게이팅시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 한 추가 양태는 세균 질환, 특히 C. 디프테리아 질환을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서, 본 발명의 디프테리아 독소 또는 이의 단편 또는 돌연변이 (예를들어, CRM197)의 용도이다.
본 발명의 한 추가 양태는 본 발명의 약제 조성물, 면역원성 조성물 또는 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 세균 감염, 특히 C. 디프테리아 감염을 예방하거나 치료하는 방법이다.
본 특허 명세서에 인용된 모든 참고문헌 또는 특허 출원은 참조로서 본원에 포함되어 있다.
본 발명은 하기 실시예에서 예시된다. 하기 실시예는 달리 상세히 기술되는 것을 제외하고는, 당업자에게 널리 공지되고 통상적인 표준 기술을 이용하여 수행된다. 실시예는 예시로서, 본 발명을 제한하지는 않는다.
실시예
실시예 1 : KLa의 측정
발효 단계의 KLa를 측정하기 위해, 발효기를 요망되는 부피의 물로 충전시키고, 발효 파라미터 (예를들어, 온도, 압력, 교반 및 통기)를 적용시키고, 상기 시스템을 정류 단계에 도달하도록 두었다. pO2 프로브를 100%로 조정하였다.
동일한 유속을 유지시키면서 통기를 질소 가스로 신속하게 전환시켰다. pO2가 5% 미만으로 감소할때까지 pO2를 지속시켰다. 이러한 시점에 도달하는 경우, 동일한 유속을 유지시키면서 통기를 공기로 신속하게 전환시켰다. pO2 수준을 지속시키고, 여러 시점에서 본래의 정류 상태 100% 수준의 백분율로 기록하였다.
KLa를 시간에 대한 로그 (100-pO2%)를 작도함으로써 계산하였다. 그래프의 직선 부분의 각 계수가 KLa에 해당한다. 통상적으로, 20% 내지 80% pO2 사이의 데이터만을 고려하였다.
결과
다양한 시점에서의 pO2 판독을 하기 표 1에 나타내었다.
표 1
Figure 112007074938125-pct00001
상기 결과를 작도하여 도 1에 나타내었고, 도 1B의 선의 각 계수로부터 KLa를 결정하였다.
실시예 2 : 150리터 규모의 C. 디프테리아 균주 ATCC 39255의 발효
CRM197 (교차 반응 물질)의 제조에 사용된 세균은 A. 파펜하이머 (A. Pappenheimer)의 문헌[Nature New Biol. 233:8-11, 1971]의 방법에 따른 니트로소구아니딘 처리에 의해 수득된 코리네박테리움 디프테리아의 돌연변이 균주이다. 이는 약독화된 디프테리아 독소 (aa 52: 글리신에서 글루탐산으로의 돌연변이)를 발현한다. 이는 39255로 기탁된 ATCC로부터 수득하였다. 발효 방법의 일반적 개요를 도 2에 나타내었다. 1.1 x 1010 cfu/ml를 함유하는 작용 시드 (seed)를 냉동장치 (-70℃)로부터 회수하고, 실온에서 해동시켰다. 해동 직후, 바이얼을 볼텍스시키고, 250 μl의 시드를 바늘을 지닌 1ml 주사기에 채웠다.
상기량을 100ml의 멸균 염수 (0.9%)에 주입하였다. 플라스크를 교반시켰다. 2ml의 현탁액을 바늘을 지닌 2ml 주사기에 채우고, 500 ml의 US4,925,792에 기술된 배지를 함유하는 3-L 에를렌마이어에 접종시키기 위해 사용하였다. 최적 밀도 (650 nm)가 4.0 내지 6.0에 도달할 때 (16 내지 19시간의 인큐베이션 후)까지 250 rpm의 교반 속도로 34.5℃±0.5℃에서 인큐베이션시켰다.
150 리터의 발효기를 멸균시키고, 100L의 배지를 발효기로 무균 상태로 이동시켰다. 산성 병을 500 mL의 H3PO4 25% (V/V)로 채웠고; 배지의 pH는 최초에 약 7.4였고, 조정하지 않았다.
발효기를 접종 하루 전에 제조하고, 접종때까지 16-20시간 동안 34.5℃의 온도, 0.5 바의 압력, 공간 부분에서의 23N L/분의 기류 및 50rpm의 교반 속도의 대기 상태로 유지시켰다.
접종 전에, 발효기를 34.5℃의 온도, 0.5 바의 압력, 배지 내에서 살포된 23 N L/분의 기류 및 240 rpm의 교반 속도의 배양 조건으로 설정하였다. 240 rpm의 교반은 1.76 m/s의 말단 속도 (tip speed) 및 3.9초의 이론적 혼합 시간을 발생시킨다. 용해 산소는 조절하지 않고 단지 모니터링만 했으며, 포움 제어 시스템의 스위치를 키고, pH가 7.8에 도달하도록 한 후, H3PO4를 첨가하여 유지시켰다. 접종 전에, pO2 프로브를 100%로 설정하였다.
교반 속도를 1.76 m/s의 주변 속도 (peripheral speed)에 해당하는 240 rpm으로 설정하였다. 23 L/분의 통기율과 조합된 240 rpm의 교반 속도는 42 h-1으로 예측되는 KLa (20-80%, 물 30℃, 0.5 바)를 발생시켰다 (도 6 참조).
발효기를 400 ml의 상기 기술된 시드 배양물과 함께 접종물 포트를 통해 접종시켰다.
하기의 두 조건이 충족될때까지 발효를 지속시켰다. 20시간의 발효 경과후, 용해 산소 수준은 10%로 증가하였다. 전체 발효 지속기간은 일반적으로 22 내지 28시간이다.
발효 종료시, 온도를 20℃의 설정으로 변경시키고, pH 조절을 중지시키고, 포움 형성을 제한하기 위해 기류를 공간 부분으로 전환시키고, 포움 제어 시스템을 중지시키고, 기타 파라미터는 변경하지 않았다.
미세여과 시스템을 발효기에 연결시키고, 현탁액의 온도가 21℃에 도달하는 경우, 미세여과를 시작하였다. 미세여과를 농축 및 여과작용의 두개의 단계로 수행하였다. 농축 단계 동안, 파라미터는 다음과 같았다: 0.6바의 압력, ~0.1바의 프레셔 아웃 (pressure out), 조정된 연동 펌프를 이용하여 2L/분으로 일정하게 유지된 투과 유동 (투과액 압력은 약 0.3 바였다). 현탁액을 하기 사건중 하나가 처음 발생할때까지 농축시켰다: 유입구 압력이 0.9바에 도달하거나 75리터의 투과액이 회수됨.
여과작용 단계 동안, 하기 파라미터를 이용하였다: 농축 단계의 종료시에 도달된 압력으로 유지되는 압력 (최대 0.9 바); 2리터/분의 물 첨가; 첨가된 전체 물은 보전물의 3배.
보전물을 0.22 μm 막에서 여과시키고, +4℃에서 보관하였다. 상기 현탁액에서의 CRM197의 안정성을 +4℃ 또는 실온 (+20℃<RT<23℃)에서의 보관후 4일 이내에 시험하였다. ELISA 정량 또는 SDS-PAGE에 의해 분해 및 차이점이 관찰되지 않았다. 성장 부재의 확인을 위한 시험을 36℃에서 인큐베이션된 BAB 아가에서 수행하였다.
결과
150L 규모의 두개의 발효를 상기 기술된 발효 프로토콜을 이용하여 수행하였다 (CDT 199 및 CDT 206). 예비배양 및 배양 조건을 표 2 및 3에 나타내었고, CRM197의 수율을 표 4에 나타내었다. 도 3은 예비배양의 성장의 통상적인 동역학의 그래프를 나타낸다. O.D. (650 nm)가 4.0 내지 6.0인 경우, 배양물은 명백하게 지수성장기였고, pH는 단지 약간 변화하였다.
표 2: 예비배양 조건
Figure 112007074938125-pct00002
표 3 : 배양 조건
Figure 112007074938125-pct00003
표 4 : CRM197 측정
Figure 112007074938125-pct00004
발효 동안, 다양한 단계가 관찰되었다.
첫번째 단계는 용해 산소가 0%에 도달할때까지 (약 6-7시간의 지속기간) 감소하는 것을 특징으로 하였다. 이러한 단계 동안, pH는 안정되게 유지되거나 약간 감소 (약 0.1 pH 단위)하였다.
두번째 단계 동안, pH는 증가하여 약 pH 7.8의 안정기에 도달하였다. 이러한 수준에서, pH 조절이 트리거링되지만, 종종 이 발효 조건하에서 산이 전혀 첨가되지 않는다. 이러한 pH의 안정기 동안, 용해 산소 수준은 약 0% 이상으로 증가한 후, 0%로 하강하는 것이 관찰되었다.
세번째 단계는 약 7.4로의 pH의 감소를 특징으로 하였다.
최종적으로, 발효의 22 내지 24시간 사이에서 pO2의 증가가 관찰되었다. 이는 수거의 신호이다.
발효기의 소모된 가스를 질량분광계로 분석하였다. CO2 생성의 통상적인 프로파일이 관찰되었다.
두개의 발효를 CRM197 생성의 동역학을 측정하기 위해 수거 신호 후까지 연장시켰다. 본 발명자들은 CRM197 수준이 수거 신호에 도달한 후에도 증가하지 않았으나, 포움 생성은 증가하였음을 발견하였다. 소포제 소모를 제한하기 위해, 수거 신호에서 발효를 중지시키는 것이 바람직하다. 그러나, CRM197은 과량의 포움 형성에 의해 영향을 받지 않는 듯 하고, 분해가 발생하지 않는 듯 하다.
미세여과
CDT 206의 미세여과에 대한 데이터를 나타내었다. 유입구 압력이 0.9 바에 도달하는 경우에 74.3 L의 투과액을 수거하였다. 배출구 압력은 농축 단계 동안 0.15 내지 0.10 바였다. 투과액 압력은 농축 단계 동안 0.3 내지 0.4 바였고, 농축 단계는 36분 동안 지속시켰다.
여과작용 단계에 대해, 동일한 유속에서 투과액을 추출하면서 75 L의 물을 점진적으로 첨가 (2 L/분)하였다. 유입구 압력은 여과작용 시작시에 0.9바였고, 여과작용 종료시에 0.7 바로 하강하였다. 배출구 압력은 0.1 바에서 안정적이었다. 여과작용 단계의 지속기간은 39분이었다.
CRM197 정량화
낮은 통기 조건하에서의 CRM197의 발현 수준은 일반적으로 pO2가 발효 동안 5% 또는 이 이상으로 유지되는 높은 통기 조건하에서 달성되는 것보다 2-4배 더 높았다.
배양 상층액의 염색된 SDS PAGE
SDS-PAGE 젤 (도 4)에서 환원 조건하에서 배양 상층액을 영동시켜, 임의의 분해 밴드를 검출하는 것을 가능케 하였다 (클리핑 (clipping) 후, 각각의 35 및 23 kD의 2개의 서브유닛이 검출되었다). 이후, 이들을 쿠마시 블루로 염색시켰다.
결과
두 발효로부터의 샘플의 쿠마시 염색된 젤을 도 4A (CDT 199) 및 4B (CDT 206)에 나타내었다. CRM197이 예상 분자량 (이론적 MW: 58.4 kD)으로 나타났다. 발효 종료의 신호 후에 수득된 샘플에서 패턴 변화가 관찰되지 않았으므로 CRM197은 분해되지 않았다 (도 4A, 레인 9 및 10). 도 4A의 레인 9 및 11은 CRM197과 동등량을 나타내므로 CRM197의 양은 미세여과 및 0.22μM에서의 최종 여과에 의해 영향을 받지 않았다.
온도는 CRM 안정성에 부정적 영향을 지닐 수 있다 (도 4B 레인 12). 샘플 밸브를 가온시키면서 상기 샘플을 수득하였고, 이러한 샘플에 존재하는 CRM197의 양은 감소하였다.
실시예 3 : 20리터 규모의 C. 디프테리아 균주 ATCC 39255의 발효
20리터의 발효기를 사용한 것을 제외하고 C. 디프테리아를 발효시키기 위해 실시예 2에 기술된 것과 유사한 방법을 이용하였다. 배양물을 300rpm에서 교반시키고, 기류를 3리터/분으로 설정하였다. 발효 동안 pH는 중성 근처로 유지되므로 발효 동안 산 또는 염기의 첨가는 필요가 없었다.
배양물을 18.3의 최종 OD (650 nm)으로 성장시켰다. CRM197의 수율은 염색된 젤의 농도 계측기로 측정시 103 mg/리터였다.
실시예 4 : 다양한 규모의 C. 디프테리아 균주 ATCC 39255의 발효
일정한 KLa의 조건하에서 성장하는 C. 디프테리아의 발효 방법은 기타 크기 및 다양한 디자인의 발효기에 사용하기 위해 적합화시킬 수 있다. 표 5에 나타낸 발효기 크기, 기류 및 교반 속도의 조건에 따라 CRM197 생성의 우수한 수율을 달성하였다. 세개의 150L 규모의 발효를 다양한 디자인의 발효기에서 수행하였다.
표 5
Figure 112007074938125-pct00005
표 5에 나타난 바와 같이, KLa는 특정 선택의 기류 및 교반 속도 조건보다 중요하다. 따라서, 낮은 기류는 보다 높은 교반 속도에 의해 보충될 수 있고, 이는 유사한 KLa 및 CRM197의 우수한 수율을 여전히 달성시킬 수 있다. 교반 속도는 균일한 현탁액을 생성시키기에 충분해야 하고, 통기는 낮은 pO2로 유지되도록 제한되어야 한다 (주의). 20 리터의 발효에 대해 다양한 발효기를 사용하였다. 다양한 발효기의 다양한 외형은 표 5에 나타낸 KLa 값의 범위를 발생시켰다.
그러나, 다양한 KLa 조건을 다양한 규모의 발효에 대해 최적화시켰다. 따라서, 20 리터의 발효기에서의 발효에 대해 22-28 h-1의 낮은 KLa가 최적이었다.
최적 KLa 조건은 배양물 내에서의 pO2가 낮은 수준으로 감소하도록 하는 제한된 통기를 가능케 하는 조건이다. 당업자는 발효기의 특정 크기 및 형태에 대해 상기 조건을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
실시예 5 : 다양한 pO2에서의 발효의 수율에 대한 철 농도의 효과
C. 디프테리아 균주 ATCC 39255의 일련의 발효를 대부분의 발효 동안 pO2를 낮게 유지시키거나 5%의 pO2의 일정한 세팅으로 유지시키는 실시예 3에 기술된 방법에 따라 20리터 규모로 수행하였다. 존재하는 Fe3+의 양은 Fe3+ 무첨가, Fe3+의 250ppb 첨가, 500 ppb의 Fe3+ 첨가 및 500 ppb의 Fe2+ 첨가로 다양하였다. 발효의 종료시에 CRM197의 수율을 SDS-PAGE 젤의 농도계측으로 측정하였다. 이러한 방법은 ELISA에 의해 달성된 것보다 약 20% 낮은 결과를 발생시키는 경향이 있다.
결과
표 6
Figure 112007074938125-pct00006
표 6에 나타난 바와 같이, C. 디프테리아가 5% pO2에서 발효되는 경우, 철의 첨가는 수율을 감소시켰다. 그러나, pO2의 수준이 감소되고, 발효가 실시예 3에 기술된 바와 같이 일정한 KLa에서 낮은 pO2의 조건하에서 수행되는 경우, 보다 높은 수율이 달성되었고, 이러한 수율은 Fe3+의 첨가에 의해 영향을 받지 않았다.
실시예 6 : 낮은 통기 조건하에서 DT 또는 CRM197의 수율에 대한 철 농도의 영향
CRM197의 발현에 영향을 주지 않는 철 농도의 범위를 마이크로플레이트에서 결정하였다. 마이크로플레이트는 본 발명의 발효 방법에 존재하는 제한된 통기 조건을 모의실험한다.
마이크로플레이트에서의 배양을 상기 기술된 발효에서 사용된 것과 동일한 배지에서 수행하였다 (CY 배지와 유사한 배지). 1 g/l Fe3+ 이온에서 FeCl3.6H2O의 스톡 용액으로부터 Fe3+를 첨가하였다.
미세역가 플레이트의 웰을 배지로 충전시키고, 8 E5 bact/mL로 접종시켰다. 미세역가 플레이트를 CRM197을 발현하는 코리네박테리움 디프테리아 및 디프테리아 독소를 발현하는 코리네박테리움 디프테리아 둘 모두의 경우에서 46시간 동안 250 rpm의 교반하에서 34.5℃에서 인큐베이션시켰다.
샘플을 0.22 μm 필터를 통해 여과시켰다.
쿠마시 블루 (피어스(Pierce)사의 젤코드 블루 (Gelcode blue) 염색)로 염색된 SDS PAGE (바이오래드 (BioRad)사의 XT 표준 4-12% 비스 트리스)에서의 농도 계측 방법으로 발현을 측정하였다. 정량화에 사용된 참고는 젤에 다양한 농도로 도입된 리스트 바이올로지컬 래버러터리 인코퍼레이티드 (List Biological Laboratories INC) 사의 디프테리아 독소 CRM 돌연변이였다.
결과
표 7은 미세역가 웰의 제한된 통기 조건하에서 성장한 C. 디프테리아에 대한 다양한 철 농도하에서의 CRM197의 발현을 나타낸다. CRM197 발현은 Fe3+에 의한 억제에 덜 민감하였고, 1ppm 또는 2ppm의 Fe3+의 첨가에 의해 유의하게 영향을 받지 않았다. CRM197 발현의 유의한 감소는 3ppm에서만 발생하였다. 이러한 Fe3+의 수준에서도, CRM197의 발현은 Fe3+를 첨가하지 않고 달성된 수준의 79%였다.
표 7 : CRM197을 발현하는 코리네박테리움 디프테리아
Figure 112007074938125-pct00007
CRM1997 수율을 여분의 Fe3+를 첨가하지 않고 달성된 수율의 백분율로 나타내었다.
DT 발현 결과를 지정된 조건하에서 미세역가 웰에서 성장한 C. 디프테리아에 대해 표 8에 나타내었다. 제한된 통기 조건하에서의 DT 생성은 또한 Fe3+에 의한 억제에 덜 민감하였다. 700 ppb에서 달성된 최대 DT 생성과 함께 Fe3+ 농도가 증감함에 따라 DT 발현이 증가하였다. Fe3+의 농도가 3 ppm으로 증가하는 경우에만 DT의 발현이 감소하기 시작하였다.
표 8 : 디프테리아 독소를 발현하는 코리네박테리움 디프테리아
Figure 112007074938125-pct00008
DT 수율을 여분의 Fe3+를 첨가하지 않고 달성된 수율의 백분율로 나타내었다.

Claims (35)

  1. 발효기 내의 배지 중에서 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheria) 균주를 성장시키는 발효 단계를 포함하는 발효 방법으로서,
    30초 미만의 혼합 시간을 발생시키기에 충분한 교반 및 배양물 내의 pO2가 발효 단계의 전체 기간 중 50%를 초과하는 시간 동안 4% 미만으로 감소하도록 하는 제한된 통기 조건 하에 수행되는 것인 방법.
  2. 제 1항에 있어서, pO2가 발효 단계의 전체 기간의 50%를 초과하는 시간 동안 0에 가깝게 감소함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 4% 미만의 pO2가, 코리네박테리움 디프테리아가 신속한 산소 소모로 인해 pO2가 4% 미만으로 감소하기에 충분한 밀도로 성장하는 시간으로부터 발효 단계가 완료될때까지 유지됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 발효 단계가 일정한 KLa에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 발효 단계가 일정한 교반 속도 및 통기율에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 발효 단계가 10-50 h-1의 KLa에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 발효 단계가 10-30 리터의 발효기에서 10-30 h-1의 KLa에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 발효 단계가 100-250 리터의 발효기에서 30-60 h-1의 KLa에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 발효 단계가 250-800 리터의 발효기에서 60-150 h-1의 KLa에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7항에 있어서, 발효 단계가 1-5 L/분의 압축 공기의 기류 및 200-400 rpm의 교반 속도로 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8항에 있어서, 발효 단계가 15-25 L/분의 압축 공기의 기류 및 150-250 rpm의 교반 속도로 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 코리네박테리움 디프테리아 균주가 디프테리아 독소 또는 이의 돌연변이를 생성함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 코리네박테리움 디프테리아 균주가 ATCC39255임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 배지가 10-4000 ppb의 철을 함유함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항의 발효 방법을 수행하는 단계 및 배양물로부터 C. 디프테리아로부터의 항원을 단리시키는 단계를 포함하여, C. 디프테리아로부터의 항원을 포함하는 제조물을 제조하는 방법으로, 상기 C. 디프테리아로부터의 항원이 디프테리아 독소 또는 이의 단편 또는 돌연변이임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 하나 이상의 추가 항원(들)을 C. 디프테리아로부터의 항원에 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 추가 항원(들)은 하나 이상의 파상풍 톡소이드, 전세포 백일해 (whole cell pertussis, Pw), 무세포 백일해 (acellular pertussis, Pa), B형 간염 표면 항원, A형 간염 바이러스, 헤모필루스 인플루엔자 b 다당류 또는 올리고당류, 나이세리아 다당류 또는 올리고당류, N. 메닌지티디스 혈청형 B 단백질, 폐렴구균 다당류 또는 올리고당류 또는 폐렴구균 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 디프테리아 독소 또는 이의 단편 또는 돌연변이를 하나의 추가 항원에 컨쥬게이팅시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2660594T3 (es) * 2008-07-21 2018-03-23 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Métodos y composiciones relacionados con oligosacáridos sintéticos de beta-1,6 glucosamina
IT1398927B1 (it) 2009-06-25 2013-03-28 Consorzio Interuniversitario Per Lo Sviluppo Dei Sistemi A Grande Interfase Csgi Espressione batterica di un gene artificiale per la produzione di crm197 e derivati.
WO2013191225A1 (ja) 2012-06-20 2013-12-27 国立大学法人 東京大学 粘膜免疫賦活化剤及びｈｐｖ感染症治療用経口医薬組成物
CN103627758B (zh) * 2012-08-28 2018-04-27 天士力医药集团股份有限公司 一种crm197蛋白的生产方法
US20140193451A1 (en) * 2012-10-17 2014-07-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
UY35418A (es) 2013-03-15 2014-10-31 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna que proporciona protección frente a diferentes Picornavirus humanos.
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
WO2018156465A1 (en) * 2017-02-24 2018-08-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Polysaccharide-protein conjugates utilizing diphtheria toxin fragment b as a carrier
UA127497C2 (uk) * 2017-04-22 2023-09-13 Байолоджикал Е Лімітед СПОСІБ ВЕЛИКОМАСШТАБНОГО ВИРОБНИЦТВА CRM<sub>197</sub>
EP3699263A1 (en) 2019-02-22 2020-08-26 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Fermentation process
CN110452838B (zh) * 2019-07-18 2020-12-29 艾美卫信生物药业（浙江）有限公司 一种crm197菌种培养基、配制方法及发酵培养方法
WO2021176409A1 (en) 2020-03-05 2021-09-10 Sanofi Healthcare India Private Limited Preservative combination for vaccine composition
CN114806973B (zh) * 2022-06-08 2024-02-23 艾美坚持生物制药有限公司 一种提高crm197蛋白产量的生长因子及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993025210A1 (en) 1992-06-18 1993-12-23 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines
EP0594950A1 (en) * 1992-10-27 1994-05-04 American Cyanamid Company Combination pediatric vaccine with enhanced immunogenicity of each vaccine component
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
DE3071552D1 (en) 1979-09-21 1986-05-22 Hitachi Ltd Semiconductor switch
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
CH660375A5 (it) 1983-02-08 1987-04-15 Sclavo Spa Procedimento per la produzione di proteine correlate alla tossina difterica.
US4695624A (en) 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
IT1187753B (it) 1985-07-05 1987-12-23 Sclavo Spa Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente
US4950740A (en) 1987-03-17 1990-08-21 Cetus Corporation Recombinant diphtheria vaccines
ES2160570T3 (es) 1988-12-16 2001-11-16 Nederlanden Staat Mutantes de neumolisina y vacunas de neumococos fabricadas a partir de los mismos.
CA2076678C (en) 1990-03-02 1999-09-28 Diane Williams Improved chimeric toxins
EP0539492B1 (en) 1990-07-16 2003-06-11 University Of North Carolina At Chapel Hill Antigenic iron repressible proteins from n. meningitidis related to the hemolysin family of toxins
US5912336A (en) 1990-08-23 1999-06-15 University Of North Carolina At Chapel Hill Isolated nucleic acid molecules encoding transferrin binding proteins from Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis
ES2329979T3 (es) 1990-08-23 2009-12-03 The University Of North Carolina At Chapel Hill Proteinas de union de transferencia de neisseria gonorrhoeae y neisseria meningitis. su uso como vacuna.
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
FR2682041B1 (fr) 1991-10-03 1994-01-14 Pasteur Merieux Serums Vaccins Vaccin contre les infections a neisseria meningitidis.
NZ249704A (en) 1992-02-11 1996-11-26 Jackson H M Found Military Med A two carrier immunogenic construct comprising a 70+ kd molecule conjugated to at least 1 t-dependent antigen, preparation, compositions containing the construct
CA2135052A1 (en) 1992-05-06 1993-11-11 R. John Collier Diphtheria toxin receptor-binding region
EP0642355B1 (en) 1992-05-23 1998-07-15 SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. Combined vaccines comprising hepatitis b surface antigen and other antigens
FR2692592B1 (fr) 1992-06-19 1995-03-31 Pasteur Merieux Serums Vacc Fragments d'ADN codant pour les sous-unités du récepteur de la transferrine de Neisseria meningitidis et procédés les exprimant.
EP0616034B1 (en) 1993-03-05 2004-10-20 Wyeth Holdings Corporation Plasmid for production of CRM protein and diphtheria toxin
DE69431624T2 (de) 1993-05-18 2003-07-10 Univ Ohio State Res Found Impfstoff gegen mittelohrentzündung
US6455673B1 (en) 1994-06-08 2002-09-24 President And Fellows Of Harvard College Multi-mutant diphtheria toxin vaccines
US5565204A (en) 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
IL117483A (en) 1995-03-17 2008-03-20 Bernard Brodeur MENINGITIDIS NEISSERIA shell protein is resistant to proteinase K.
US6265567B1 (en) 1995-04-07 2001-07-24 University Of North Carolina At Chapel Hill Isolated FrpB nucleic acid molecule
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
EP0832238A1 (en) 1995-06-07 1998-04-01 Biochem Vaccines Inc. Streptococcal heat shock proteins members of the hsp70 family
PL184872B1 (pl) 1995-06-23 2003-01-31 Smithkline Beecham Biolog Kombinowana szczepionkaĆ zestaw do przygotowania kombinowanej szczepionkiĆ sposób wytwarzania kombinowanej szczepionki i jej zastosowanie
ATE323721T1 (de) 1996-05-01 2006-05-15 Univ Rockefeller Cholin-bindendes protein, welches als gegen pneumokokken gerichtetes vakzin verwendet wird
FR2751000B1 (fr) 1996-07-12 1998-10-30 Inst Nat Sante Rech Med Adn specifiques des bacteries de l'espece neisseria meningitidis, leurs procedes d'obtention et leurs applications biologiques
US5882871A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation Saliva binding protein
US5882896A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation M protein
WO1998018930A2 (en) 1996-10-31 1998-05-07 Human Genome Sciences, Inc. Streptococcus pneumoniae antigens and vaccines
KR100619350B1 (ko) 1997-07-21 2006-09-05 박스터 헬쓰케어 에스.에이. 변형 면역성 뉴멀리신 백신조성물
GB9717953D0 (en) 1997-08-22 1997-10-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9726398D0 (en) 1997-12-12 1998-02-11 Isis Innovation Polypeptide and coding sequences
JP2002510649A (ja) 1998-04-07 2002-04-09 メディミューン，インコーポレイテッド 肺炎球菌コリン結合タンパク質誘導体を利用するワクチンと抗体
US7576176B1 (en) 1998-05-01 2009-08-18 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Neisseria meningitidis antigens and compositions
EP1123403A1 (en) 1998-10-22 2001-08-16 The University Of Montana OMP85 PROTEINS OF $i(NEISSERIA GONORRHOEAE) AND $i(NEISSERIA MENINGITIDIS), COMPOSITIONS CONTAINING SAME AND METHODS OF USE THEREOF
GB9904582D0 (en) 1999-02-26 1999-04-21 Nycomed Imaging As Process
KR100401423B1 (ko) 2001-01-10 2003-10-17 주식회사 엘지생명과학 혼합 백신의 제조 방법
WO2006042542A2 (en) * 2004-10-19 2006-04-27 Statens Serum Institut Production of tetanus, diphtheria, and pertussis toxins and toxoids using fermentation media containing no components of animal or soy origin
US9473463B2 (en) 2014-07-29 2016-10-18 Combined Conditional Access Development & Support, LLC Control word and associated entitlement control message caching and reuse

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993025210A1 (en) 1992-06-18 1993-12-23 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines
EP0594950A1 (en) * 1992-10-27 1994-05-04 American Cyanamid Company Combination pediatric vaccine with enhanced immunogenicity of each vaccine component
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain

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