ES2335133T3

ES2335133T3 - Procedimiento de fermentacion para la produccion de toxina de la difteria.

Info

Publication number: ES2335133T3
Application number: ES06723804T
Authority: ES
Inventors: Phillippe Marc Helene Dehottay; Sandrine Dessoy; Olivier Marc Serge Ghislain Laloux; Marc Roger Fernand Orval
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2005-03-23
Filing date: 2006-03-21
Publication date: 2010-03-22
Anticipated expiration: 2026-03-21
Also published as: DE602006010676D1; EP2174950A1; CA2602143C; BRPI0609692C1; EP1861420B1; WO2006100108A1; RU2394914C2; US20080193475A1; ATE540053T1; CA2602143A1; GB0505996D0; US20140242635A1; AU2006226542B2; AU2006226542A1; BRPI0609692B1; JP4917087B2; CN101180313B; JP2008533980A; EP1861420A1; CN101180313A

Abstract

Un procedimiento de fermentación que comprende una etapa de fermentación de crecimiento de una cepa de Corynebacterium diphtheria en un medio en un fermentador en condiciones de agitación suficiente para mantener un cultivo homogéneo y aireación limitada de manera que la pO2 dentro del cultivo descienda a menos del 4% para la mayoría de la etapa de fermentación en el que la etapa de fermentación tiene lugar en a) un fermentador de 100 a 250 litros a un KLa de 30 a 60 h-1 o b) en un fermentador de 250 a 800 litros a un KLa de 60-150 h-1.

Description

Procedimiento de fermentación para la producción de toxina de la difteria.

La presente invención se refiere al campo de los antígenos de la difteria, en particular toxinas (incluyendo formas mutantes de toxina de la difteria, como CRM197) y al procedimiento de fermentación para la fabricación de cultivos en volumen de dichos antígenos.

La toxina de la difteria es una exotoxina de proteínas producida por la bacteria Corynebacterium diphtheria. Se produce como un polipéptido único que se divide fácilmente para formar dos subunidades ligadas por un enlace de disulfuro, Fragmento A y Fragmento B, como consecuencia de la escisión en el residuo 190, 192 ó 193 (Moskaug y col., Biol. Chem. 264: 15709-15713, 1989). El Fragmento A es la parte catalíticamente activa y es una ADP-ribosiltransferasa dependiente de NAD que se dirige específicamente al factor de síntesis de proteínas EF-2, inactivando con ello EF-2 e impidiendo la síntesis de proteínas en una célula.

La inmunidad a una toxina bacteriana como la toxina de la difteria puede adquirirse naturalmente durante el curso de una infección, o artificialmente por inyección de una forma destoxificada de la toxina (toxoide) (Germanier, er, Bacterial Vaccines, Academic Press, Orlando, Fl., 1984). Los toxoides se han preparado tradicionalmente mediante modificación química de toxinas nativas (Lingood y col., Brit. J. Exp. Path. 44; 177, 1963), haciéndolos no tóxicos a la vez que se conserva la antigenicidad que protege al animal vacunado contra provocación posterior por la toxina natural. Alternativamente, se han descrito varias toxinas de la difteria mutadas que tienen toxicidad reducida (documentos US-4.709.017, US-4.950.740).

CRM197 es una forma no tóxica de la toxina de la difteria pero que es inmunológicamene indistinguible de la toxina de la difteria. CRM197 es producida por C. diphtheriae infectada por la fase no toxígena \beta197tox- creada por mutagénesis de nitrosoguanidina del corynefago toxígeno b (Uchida y col., Nature New Biology (1971) 233; 8-11). La proteína CRM197 tiene el mismo peso molecular que la toxina de la difteria pero difiere de ella por un único cambio de base en el gen estructural. Esto conduce a un cambio de glicina por glutamina de aminoácido en posición 52 que hace el fragmento A incapaz de unirse a NAD y por tanto no tóxico (Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46; 69-94, Rappuoli Applied and Environmental Microbiology Sept 1983 pág. 560-564).

El toxoide de la difteria y una forma mutante con toxicidad reducida, CRM197, son componentes de muchas vacunas para proporcionar inmunidad contra Corynebacterium diphtheriae. Se conocen varias vacunas de combinación que pueden prevenir Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae y opcionalmente virus de Hepatitis B y/o Haemophilus influenzae tipo b (véanse, por ejemplo, los documentos WO-93/24.148 y WO-97/00.697, W0-02/055.105).

También se han usado toxina de la difteria y formas mutantes que incluyen CRM197 en vacunas como vehículos seguros y eficaces dependientes de células T para sacáridos. CRM197 se usa en la actualidad en la vacuna conjugada CRM197 de oligosacárido de Haemophilus influenzae tipo b (HibTitre®; Lederle Praxis Biologicals, Rochester, N.Y.).

Los procedimientos para preparar toxoide de difteria (TD) son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, TD puede producirse por purificación de la toxina a partir de un cultivo de Corynebacterium diphtheriae seguido de destoxificación química, o puede prepararse por purificación de un análogo recombinante, o destoxificado genéticamente de la toxina (por ejemplo, CRM197, u otros mutantes según se describe en los documentos US-4.709.017, US-5.843.711, US-5.601.827 y US-5.917.017). Corynebacterium diphtheriae se cultiva en condiciones aerobias. Rappuoli y col. (Biotechnology febrero 1985, pág. 161-163) sugieren que la pO2 debe regularse al 25% mediante aireación con una mezcla de aire y oxígeno que se regula automáticamente para mantener la pO2 deseada.

La producción de cantidades importantes de toxinas de la difteria como CRM197 para su uso en vacunas se ha visto obstaculizada debido a la baja abundancia de proteínas. Este problema se ha abordado previamente mediante la introducción de copias adicionales de un gen que codifica la toxina de la difteria o una forma mutante en Corynebacterium diphtheriae (documentos US-4.925.792; US-5.614.382). Dichos procedimientos conducen a un aumento en la producción de aproximadamente el triple. Los procedimientos de mejora adicional de rendimientos de toxina de la difteria en una forma reproducible serían beneficiosos para permitir niveles más altos de producción de estos valiosos antígenos.

En consecuencia, la presente solicitud proporciona un procedimiento de fermentación mejorado que comprende una etapa de fermentación de cultivo de una cepa de Corynebacterium diphtheria en medio en un fermentador en condiciones de agitación suficiente para mantener un cultivo homogéneo y aireación limitada de manera que la pO2 dentro del cultivo descienda a menos del 4% para la mayoría de la etapa de fermentación.

La fermentación tiene lugar en condiciones aerobias, aunque de aireación limitada, de manera que se usa oxígeno hasta que entra en el cultivo durante la mayoría de la fermentación, es decir, después de la fase inicial en la que la densidad de C. diphtheriae es relativamente baja y los niveles de pO2 pueden ser más altos. Los autores de la invención encontraron que el cultivo en dichas condiciones produce una expresión más eficaz y/o consistente de toxina de la difteria o mutante en comparación con los procedimientos de fermentación efectuados a pO2 más alta. El procedimiento de la invención es más sólido que la fermentación a niveles más altos de oxígeno, y permite rendimientos de toxina de la difteria que se mantienen altos incluso cuando el medio de cultivo contiene hierro añadido o cuando se usan materias primas complejas de calidad variable.

En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para fabricar una preparación de toxina de la difteria o mutante de la misma que comprende efectuar el procedimiento de fermentación de la invención y aislar la toxina de la difteria o mutante de la misma del cultivo. Aunque la toxina de la difteria y los mutantes se describen en la presente memoria descriptiva, se plantea que puede aislarse cualquier antígeno de C. diphtheríae usando el procedimiento de la invención.

El uso de dicho procedimiento produce rendimientos más elevados de toxina de la difteria o mutante, por ejemplo CRM197, en comparación con cuando se mantiene la pO2 al 5% o superior, por ejemplo el 20%.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona un uso de la toxina de la difteria o mutante de la misma de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedad bacteriana, en particular enfermedad por C. diphtheriae.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona un procedimiento para prevenir o tratar infección bacteriana, en particular infección por C. diphtheriae que comprende la administración de la composición farmacéutica de la invención a un paciente.

Descripción de las figuras

Fig. 1 Gráficos que muestran el perfil de oxigenación y su uso para determinar el KLa de una fermentación. El cuadro A muestra el curso temporal de la oxigenación después de un cambio de nitrógeno a aire. El cuadro B muestra una representación de ln(100-pO2) con respecto al tiempo que permite la evaluación de KLa mediante la determinación del gradiente de la línea.

Fig. 2 Visión general de un procedimiento de fermentación para C. diphtheriae.

Fig. 3 Gráfico que muestra la cinética típica de crecimiento de un cultivo de C. diphtheriae. La línea con marcadores circulares muestra la DO a 650 nm después de varios tiempos de cultivo. La línea marcada con rombos muestra el pH del cultivo.

Fig. 4 Geles SDS-PAGE de sobrenadantes de cultivo. Trayectoria 1 - marcadores de peso molecular, trayectoria 2-1 \mug de CRM197 estándar, trayectoria 3-0,5 \mug de CRM197 estándar, trayectoria 4-0,25 \mug de CRM197 estándar, trayectorias 5-11, sobrenadantes de fermentaciones de C. diphtheriae. El Gel A muestra los sobrenadantes de CDT082 en trayectoria 5, CDT198 en trayectorias 6-8 (el sobrenadante se retiró a 22,5 horas para trayectoria 6, 24 horas para trayectoria 7 y 28 horas para trayectoria 8), CDT199 en trayectorias 9, 10 y 11 (el sobrenadante se retiró a 22 horas 45 minutos en trayectoria 9, 24 horas 45 minutos en trayectoria 10 y después de posterior microfiltración y filtración en trayectoria 11). El Gel B muestra sobrenadantes de CDT082 en trayectoria 5, de CDT205 en trayectorias 6-9 (trayectoria 7 después de 21 horas 43 min de fermentación, trayectoria 8 después de 23 horas de fermentación, trayectoria 9 después de 24 horas de fermentación) y de CDT206 en trayectorias 10-13 (trayectoria 10 después de 22 horas 10 min de fermentación, trayectoria 11 después de 23 horas 49 minutos de fermentación, trayectoria 12 después de 24 horas 30 min de fermentación, trayectoria 13 después de microfiltración y filtración).

Fig. 5 Gráfico que muestra el KLa de un fermentador de 150 litros a diferentes velocidades de agitación en condiciones de aireación de 23 litros por minuto.

Descripción detallada de la invención

Los términos "comprendiendo", "comprenden" y "comprende" en la presente memoria descriptiva pretenden según los autores de la invención ser sustituibles opcionalmente por los términos "consistente en", "consisten en" y "consiste en", respectivamente, en todos los casos.

Un aspecto de la invención es un procedimiento de fermentación que comprende una etapa de fermentación de cultivo de una cepa de Corynebacterium diphtheria en medio en un fermentador en condiciones de agitación suficiente para mantener un cultivo homogéneo (por ejemplo suficiente para producir un tiempo de mezclado inferior a 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 segundos) y aireación limitada de manera que la pO2 dentro del cultivo descienda a menos del 5%, 4%, 3%, 1% o 0,5% para la mayoría de la etapa de fermentación. En una forma de realización preferida, la pO2 desciende a aproximadamente cero, preferentemente para la mayoría de la etapa de fermentación.

Por ejemplo, la pO2 dentro del cultivo desciende a menos del 5%, 4%, 3%, 1% o 0,5% desde el momento en que la Corynebacterium diphtheria se ha cultivado a una densidad suficiente para que consuma la mayor parte del oxígeno en cuanto el oxígeno entra en el cultivo (la fase de latencia, por ejemplo de al menos 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 horas después del inicio de la fermentación), hasta el punto en la fermentación en que la concentración de pO2 vuelve a aumentar, cerca del final de la etapa de fermentación (por ejemplo 16, 18, 20, 22 ó 24 horas después de la fase de latencia).

\newpage

La fermentación termina normalmente y el cultivo se recoge cuando la pO2 aumenta por encima de las condiciones de aireación limitada. Debe observarse que en diferentes condiciones de inoculación, por ejemplo cuando se inocula el fermentador con un cultivo mucho mayor de C. diphtheriae, las condiciones de aireación limitada comienzan inmediatamente después del inicio de la de fermentación (por ejemplo, 1, 5, 10, 20, 30, 40 ó 60 minutos después del inicio de la fermentación).

Una pO2 al 100% es la cantidad de oxígeno presente cuando el medio (en ausencia de un cultivo) se satura con oxígeno después de burbujeo de aire comprimido a través del medio a 34,5ºC y presión de 0,5 bar. Para un fermentador de 150 litros, la tasa de aireación y la velocidad de agitación debe ajustarse a 23 litros/min y 240 rpm, mientras que para un fermentador de 20 litros, la tasa de aireación y la velocidad de agitación debe ajustarse a 3 litros/min y 300 rpm. Puede ajustarse como la cantidad de oxígeno presente en un medio de fermentación totalmente aireado antes de inoculación.

Un cultivo homogéneo es un cultivo en el que las bacterias están dispersas uniformemente por todo el fermentador de manera que al menos el 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10% de las bacterias están presentes en el 10% superior del medio de cultivo.

Una etapa de fermentación se define como la etapa en la que se cultiva Corynebacterium diphtheriae dentro del fermentador. La etapa de fermentación comienza con la introducción del precultivo en el fermentador y termina cuando, en las condiciones de aireación limitada descritas en la presente memoria descriptiva, la pO2 aumenta eventualmente hasta más del 10%. La etapa de fermentación dura normalmente más de 12, 14, 16, 18, 20 ó 24 horas, por ejemplo entre 16 y 40 horas, o por ejemplo entre 22 y 28 horas.

La agitación se hace opcionalmente mediante movimiento del cultivo en el fermentador pero puede realizarse por cualquier otro medio adecuado, por ejemplo por agitación, vibromezclador y/o burbujeo de gas. La agitación es suficiente para producir un tiempo de mezclado para el cultivo de menos de 20, 15, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 segundos.

Puede medirse el tiempo de mezclado de un cultivo en un fermentador de vidrio. Es el tiempo transcurrido después de la introducción de una solución acuosa coloreada para que la solución acuosa coloreada se disperse uniformemente en todo el medio de cultivo.

Un fermentador es cualquier aparato adecuado para la producción industrial de cultivos bacterianos. Sin embargo, este término no incluye matraces de cultivo que se usan normalmente para crecimiento de bacterias a menor escala.

La mayoría de la etapa de fermentación se define como un tiempo de más del 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de la duración total de la etapa de fermentación. La fermentación es normalmente en condiciones de aireación limitada durante 12, 14, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ó 28 horas.

La aireación limitada describe las condiciones de aireación que permiten a C. diphtheriae usar respiración aerobia y limita así la cantidad de oxígeno disponible de manera que, después de que el cultivo haya aumentado en densidad (por ejemplo después de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 horas de fermentación) el oxígeno se consume en muy breve tiempo después de entrar en el cultivo de manera que la pO2 es inferior al 5, 4, 3, 2, 1 ó 0,5%. Debe observarse que al aumentar la cantidad de cultivo usado para inocular el fermentador, las condiciones de aireación limitada podrían conseguirse muy brevemente después de la inoculación (por ejemplo después de 1, 5, 10, 20 ó 30 minutos después del inicio de la fermentación).

Dichas condiciones de aireación limitada conducen a una sólida expresión de una toxina como toxina de la difteria o mutantes de la misma.

Una pO2 que desciende aproximadamente a cero se consigue haciendo la tasa de aireación y agitación de manera que el oxígeno introducido en el cultivo sea consumido por el cultivo para respiración inmediatamente después de su introducción en el cultivo de manera que a pesar de la aireación del cultivo, la pO2 se lee como cero o cercana a cero en un monitor de oxígeno.

Durante la etapa de fermentación, la pO2 empezará en un nivel superior para un ajuste dado de agitación y tasa de aireación. Esto se debe a que la densidad de bacterias en el cultivo es baja al inicio de la etapa de fermentación y aumenta durante la etapa de fermentación. Se requiere normalmente un periodo de tiempo (por ejemplo, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 horas) antes de que la pO2 descienda a menos del 5%. Desde este punto en adelante, la pO2 permanece por debajo del 5, 4, 3, 2, 1 ó 0,5%, preferentemente en un nivel de aproximadamente cero hasta cerca del fin de la etapa de fermentación, por ejemplo hasta la recogida del fermentador.

Opcionalmente, la etapa de fermentación se efectúa a KLa constante durante toda la etapa de fermentación. Alternativamente, la etapa de fermentación se efectúa a uno o más KLa de manera que la aireación limitada se consiga a los valores de KLa presentes durante la mayoría (al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%) de la etapa de fermentación.

KLa es una medida de la tasa a la que el oxígeno entra en el cultivo. Cuanto más alto es el KLa, mayor es la tasa a la que se introduce oxígeno en el cultivo. Varios factores, como el volumen y la composición, la agitación, la aireación, la presión, la temperatura y la posición del medio y las características de las partes móviles del fermentador influirán en el KLa de una etapa de fermentación en particular.

Normalmente, el oxígeno se introduce en el cultivo de fermentación haciendo burbujear aire comprimido a través del cultivo. Cuando hay diferentes concentraciones de oxígeno presentes en el aire introducido en el cultivo, la tasa de flujo debe adaptarse para tener esto en cuenta. Por ejemplo, cuando se introduce un suministro de oxígeno al 100% en el cultivo, la tasa de flujo será consiguientemente más baja. Cuando se introduce gas que contiene menos oxígeno que el aire en el cultivo, podría aplicarse una tasa de flujo más alta.

El KLa puede medirse usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. El procedimiento implica el ajuste del fermentador con las condiciones de volumen, temperatura, presión, agitación y aireación del medio para el que se va a medir KLa, expulsión de gas por sustitución del aire por gas nitrógeno, introducción de gas por restauración de aireación con aire y medida de la tasa a la que la pO2 recupera su nivel de estado estacionario.

ln(100-pO2) = -KLa \cdot T + C

Al representar ln (100-p02) con respecto al tiempo, el gradiente (o coeficiente angular) de la línea es - KLa.

En el valor de KLa de una etapa de fermentación influyen varios factores como la magnitud de agitación del cultivo y la tasa de aireación del cultivo. Puede mantenerse un KLa constante mientras, por ejemplo, se reduce la agitación del cultivo y se incrementa la tasa de aireación o viceversa. Sin embargo, en una forma de realización, la agitación del cultivo y la tasa de aireación son constantes durante la etapa de fermentación.

La etapa de fermentación se efectúa, por ejemplo, a un KLa de entre 10-200 h-1, 10-150 h-1, 10-100 h-1, 10-80 h-1, 10-50 h-1, 10-40 h-1, 10-30 h-1, 20-150 h-1, 20-100 h-1, 20-50 h-1, 20-60 h-1, 20-80 h-1, 20-30 h-1, 20-40 h-1, 30-60 h-1, 60-80 h-1, 60-150 h-1 ó 60-200 h-1.

El KLa del procedimiento de fermentación de la invención puede diferir, dependiendo del tamaño del cultivo de fermentación. Para cultivos de 10-30 litros, puede usarse un KLa de 10-30 h-1, 15-30, 20-30 o 22-28 h-1. Para cultivos de 30-250 litros, puede usarse un KLa de 30-60 o 40-50 h-1. Para cultivos de 250-800 litros puede usarse un KLa de 30-50, 40-50, 40-60, 30-60, 30-80 ó 60-150 h-1. Para cultivos de 800-3.000 litros puede usarse un KLa de 30-50, 40-50, 40-60, 30-60, 30-80, 60-150 ó 60-200 h-1.

Para un tamaño de cultivo de fermentación de 10 a 30 litros, se consigue un KLa de 10-30 h-1 usando por ejemplo un flujo de aire o tasa de aireación de 1 a 5 litros/min y una velocidad de agitación de 200 a 400 rpm, por ejemplo una tasa de aireación de 2 a 4 litros/min y una velocidad de agitación de 250 a 350 rpm.

Para un cultivo de fermentación de 30 a 250 litros, se consigue un KLa de 30 a 60 h-1 usando por ejemplo una tasa de flujo de aire de 15 a 25 litros/min y una velocidad de agitación de 150 a 250 rpm, por ejemplo usando una tasa de flujo de aire de 20 a 25 litros/min y una velocidad de agitación de 200 a 250 rpm, por ejemplo usando una tasa de flujo de aire de 15 a 20 litros/min y una velocidad de agitación de 200 a 250 rpm.

El pH del cultivo de C. diphtheriae en medio CY durante la etapa de fermentación depende de las condiciones de aireación y agitación del cultivo (Nikolajewski y col., J. Biological Standardization, 1982, 10; 109-114). En el inicio de la etapa de fermentación, el pH del medio CY es 7,4. En el caso de baja aireación o KLa, el pH desciende a aproximadamente 5. En el caso de alta aireación, el pH aumenta hasta aproximadamente 8,5. En una forma de realización de la invención, la C. diphtheriae se cultiva en medio CY o medio SOC (Sambrook J y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) o medios similares. El pH en el fermentador puede mantenerse entre 7,0 y 7,8, por el grado de aireación, sin requerir opcionalmente adición de ácido o base.

El procedimiento de la invención puede usarse con cualquier cepa de Corynebacterium diphtheriae. Dichas cepas pueden producir toxina de la difteria de tipo salvaje, proteínas de fusión que incluyen toxina de la difteria o fragmento de la misma (por ejemplo las desveladas en el documento US-5.863.891) o formas mutantes o fragmentos de toxina de la difteria, preferentemente los que tienen toxicidad reducida. Algunos ejemplos de dichas toxinas mutantes son CRM176, CRM 197, CRM228, CRM 45 (Uchida y col., J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 y CRM107 y otras mutaciones descritas por Nicholls y Youle en Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Marcel Dekker Inc, 1992; deleción o mutación de Glu-148 a Asp, Gln o Ser y/o Ala 158 a Gly y otras mutaciones desveladas en los documentos US-4.709.017 o US-4.950.740; mutación de al menos uno o más residuos Lys 516, Lys 526, Phe 530 y/o Lys 534 y otras mutaciones desveladas en los documentos US-5.917.017 o US-6.455.673; o fragmento desvelado en el documento US-5.843.711. En una forma de realización, la cepa de C. diphtheriae produce CRM197.

En una forma de realización, se usan las siguientes cepas de C. diphtheriae en el procedimiento de la invención; ATCC39255, ATCC39526, ATCC11049, ATCC11050, ATCC11051, ATCC11951, ATCC11952, ATCC13812, ATCC14779, ATCC19409, ATCC27010, ATCC27011, ATCC27012, ATCC296, ATCC43145, ATCC51280 o
ATCC51696.

El medio para su uso en la invención puede contener uno o más de los siguientes constituyentes: 5-20 g/L, 10-16 g/L o 10 g/L de casaminoácidos o hidrolizado de caseína, 5-20 g/L, 7-15 g/L o 9-12 g/L de peptona de soja y/o 10-40 g/L, 14-32 g/L o 18-22 g/L de extracto de levadura.

Se sabe que el contenido de hierro del medio de crecimiento puede afectar al crecimiento de C. diphtheriae e influir en la producción de toxinas (veáse documento WO-00/50.449). El hierro es esencial para crecimiento bacteriano, sin embargo, se ha demostrado que el hierro en grandes concentraciones inhibe la producción de toxina. Durante el procedimiento de la invención, el contenido de hierro del medio tiene un nivel inferior de 10, 50, 75, 100, 120 ó 150 ppb y un límite superior de 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 4.000 ó 5.000 ppb. Por ejemplo, las concentraciones de hierro en el medio son: 50-1.000 ppb, 100-1.000 ppb, 200-1.000 ppb, 400-1.000 ppb, 500-1.500 ppb, 700-1.300 ppb, 50-2.000 ppb, 100-2.000 ppb, 200-2.000 ppb, 400-2.000 ppb, 700-2.000 ppb, 50-3.000 ppb, 100-3.000 ppb, 200-3.000 ppb, 400-3.000 ppb, 700-3.000 ppb, 1.000-3.000 ppb, 1.500-3.000 ppb, 1.700-3.000 ppb, 50-4.000 ppb, 100-4.000 ppb, 200-4.000 ppb, 400-4.000 ppb, 700-4.000 ppb, 1.000-4.000 ppb, 1.500-4.000 ppb, 1.700-4.000 ppb o 2.000-4.000 ppb. El hierro puede estar en la forma de Fe2+ y/o Fe3+.

En una forma de realización, el procedimiento de la invención es suficientemente tolerante a la presencia de sales de hierro en el medio de manera que no se requiere tratamiento del medio para eliminar el hierro antes del uso.

La etapa de fermentación tiene lugar a una temperatura adecuada para el cultivo de C. diphtheriae, por ejemplo 25-45ºC, 25-40ºC, 30-38ºC o 34-35ºC.

La etapa de fermentación está sujeta a una gran cantidad de producción de espuma. Para controlar la formación de espuma se añade opcionalmente un agente antiespumante al fermentador. Opcionalmente se usa una sonda de espuma o un dispositivo mecánico de ruptura de espuma en el fermentador, por ejemplo, así como el agente antiespumante.

Un segundo aspecto de la invención es un procedimiento para fabricar una preparación de un antígeno, por ejemplo, toxina de la difteria o mutante o fragmento de la misma que comprende las etapas de efectuar el procedimiento de fermentación de la invención según se describe anteriormente y aislar el antígeno, por ejemplo, toxina de la difteria o mutante o fragmento de la misma del cultivo.

La toxicidad de la toxina de la difteria se reduce opcionalmente mediante tratamiento químico que incluye tratamiento con reactivos de reticulación para formar un toxoide. Las referencias a una toxina incluyen toxoides.

La composición farmacéutica de la invención comprende además opcionalmente antígenos adicionales en una vacuna de combinación. En una forma de realización, el o los antígenos que se combinarán con la toxina de la difteria, mutante o fragmento de la misma según se describe anteriormente incluyen uno o más entre toxoide del tétanos, pertussis de células enteras (Pw), pertussis acelular (Pa) (según se describe más adelante), antígeno de superficie de Hepatitis B, virus de Hepatitis A, polisacáridos u oligosacáridos de Haemophilus influenzae b, polisacáridos u oligosacáridos de Neisseria (por ejemplo N. meningitidis), proteínas B de serotipos de N. meningitidis, opcionalmente como parte de una vesícula de membrana externa, polisacáridos u oligosacáridos neumocócicos, proteínas neumocócicas o cualquiera de los antígenos enumerados a continuación. Los polisacáridos bacterianos pueden conjugarse con una proteína portadora. La toxina de la difteria o toxoide o mutantes de toxina de la difteria como CRM197 o fragmentos, por ejemplo preparados usando un procedimiento de la invención, pueden usarse como proteína portadora. Sin embargo, también pueden usarse otras proteínas portadoras como toxoide del tétanos, fragmento C de toxoide del tétanos, neumolisina, Proteína D (documento US-6.342.224). Una composición farmacéutica dada contiene opcionalmente múltiples polisacáridos u oligosacáridos conjugados con diferentes proteínas portadoras.

La toxina de la difteria, o mutante de la misma, por ejemplo CRM197, o fragmento de la misma preparado usando el procedimiento de la invención puede formularse con polisacáridos u oligosacáridos capsulares obtenidos de uno o más de Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, estreptococos del Grupo A, estreptococos del Grupo B, Staphylococcus aureus o Staphylococcus epidermidis. Por ejemplo, la composición farmacéutica o inmunógena puede comprender polisacáridos capsulares obtenidos de uno o más de los serogrupos A, C, W-135 e Y de Neisseria meningitidis. Por ejemplo los serogrupos A y C; A y W, A e Y; C y W, C e Y, W e Y; A, C y W; A C e Y; A, W e Y; C, W e Y o A, C, W e Y pueden formularse con CRM197. En otro ejemplo, la composición inmunógena comprende polisacáridos capsulares obtenidos de Streptococcus pneumoniae. Los antígenos de polisacáridos capsulares neumocócicos se seleccionan preferentemente entre serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F (con la máxima preferencia de serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F). Un ejemplo adicional contendría los polisacáridos (u oligosacáridos) capsulares PRP de Haemophilus influenzae tipo b. Un ejemplo adicional contendría polisacáridos capsulares de Tipo 5, Tipo 8, 336, PNAG o dPNAG de Staphylococcus aureus. Un ejemplo adicional contendría los polisacáridos capsulares de Tipo I, Tipo II, Tipo III o PIA de Staphylococcus epidermidis. Un ejemplo adicional contendría los polisacáridos capsulares de Tipo Ia, Tipo Ic, Tipo II o Tipo III de estreptococos del Grupo B. Un ejemplo adicional contendría los polisacáridos capsulares de estreptococos del Grupo A, comprendiendo opcionalmente además al menos una proteína M y más preferentemente múltiples tipos de proteína M.

Los polisacáridos bacterianos para su uso en la invención pueden ser de longitud completa, siendo polisacáridos nativos purificados. Alternativamente, los polisacáridos están dimensionados entre 2 y 20 veces, por ejemplo de 2 a 5 veces, de 5 a 10 veces, de 10 a 15 veces o de 15 a 20 veces, de manera que los polisacáridos son menores en tamaño para mayor manejabilidad. Los oligosacáridos contienen normalmente entre 2 y 20 unidades de repetición.

Dichos polisacáridos capsulares pueden ser no conjugados o conjugados para una proteína portadora como toxoide del tétanos, fragmento C de toxoide del tétanos, toxoide de la difteria o CRM197 (ambos preparados, por ejemplo, por el procedimiento de la invención), neumolisina o Proteína D (documento US-6.342.224). La toxina tetánica, la toxina de la difteria y la neumolisina se destoxifican por mutación genética y/o por tratamiento químico.

El conjugado de polisacáridos u oligosacáridos puede prepararse por cualquier técnica de acoplamiento conocida. Por ejemplo el polisacárido puede acoplarse por medio de una unión de tioéter. Este procedimiento de conjugación se basa en la activación del polisacárido con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridinio (CDAP) para formar un éster de cianato. El polisacárido activado puede acoplarse así directamente o por medio de un grupo separador a un grupo amino en la proteína portadora. Opcionalmente, el éster de cianato se acopla con hexanodiamina y el polisacárido derivado de amino se conjuga con la proteína portadora usando química de heteroligación que implica la formación de la unión de tioéter. Dichos conjugados se describen en la solicitud publicada PCT W0-93/15.760 de Uniformed Services University.

Los conjugados pueden prepararse también por procedimientos de aminación reductora directa según se describe en los documentos US-4.365.170 (Jennings) y US-4.673.574 (Anderson). Otros procedimientos se describen en los documentos EP-0.161.188, EP-208.375 y EP-0.477.508.

Un procedimiento adicional implica el acoplamiento de un polisacárido activado con bromuro de cianógeno derivado con ácido adípico hidrazida (ADH) para la proteína portadora por mediante condensación de carbodiimida (Chu C. y col., Infect. Immunity, (1983) 245; 256).

En ejemplos particulares la toxina de la difteria o fragmento de mutante de la misma (por ejemplo CRM197) se conjuga con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 antígenos adicionales de la composición farmacéutica. En una forma de realización, se conjuga con componente(s) de polisacáridos, por ejemplo polisacáridos bacterianos que incluyen los enumerados anteriormente.

La composición farmacéutica o inmunógena de la invención puede comprender además componentes adicionales de proteínas. Se formula opcionalmente con antígenos que proporcionan protección contra una o más entre infecciones por tétanos y Bordetella pertussis. El componente de pertussis puede destruir B. pertussis (Pw) de células enteras o pertussis acelular (Pa) que contiene al menos un antígeno (preferentemente dos o los tres) de PT, FHA y pertactina de 69 kDa. Algunas otras formulaciones de pertussis acelular contienen aglutinógenos como Fim 2 y Fim 3 y estas vacunas se contemplan también para su uso en la invención. Normalmente, el antígeno que proporciona protección contra tétanos es toxoide del tétanos que es o bien toxinas inactivadas químicamente (por ejemplo, después de tratamiento con formaldehído) o bien inactivadas por la introducción de una o más mutaciones puntuales.

La composición farmacéutica o inmunógena de la invención comprende opcionalmente antígenos de proteínas neumocócicas, por ejemplo aquellas proteínas neumocócicas que están expuestas a la superficie externa del neumococo (susceptibles de ser reconocidas por el sistema inmunitario de un hospedador durante al menos parte del ciclo vital del neumococo), o son proteínas que son secretadas o liberadas por el neumococo. Por ejemplo, la proteína puede ser una toxina, adhesina, transductor de señales de 2 componentes o lipoproteína de Streptococcus pneumoniae, o fragmentos de la misma. Los ejemplos de dichas proteínas incluyen, pero no se limitan a: neumolisina (preferentemente destoxificada por tratamiento químico o mutación) [Mitchell y col., Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18(13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 y 2", Mitchell y col., Biochim Biophys Acta 1989 Ene 23; 1007(1): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties", documento WO-96/05.859 (A. Cyanamid), documento WO 90/06.951 (Paton y col.), documento WO-99/03.884 (NAVA)]; PspA y variantes de deleción de transmembrana de la misma (documento US-5.804.193-Briles y col.); PspC y variantes de deleción de transmembrana de la misma (documento WO-97/09.994-Briles y col.); PsaA y variantes de deleción de transmembrana de la misma (Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dic; 64(12):5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"); proteínas de unión a colinas neumocócicas y variantes de deleción de transmembrana de la misma; CbpA y variantes de deleción de transmembrana de la misma (documentos WO-97.141.151; WO-99/51.266); Gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (Infect. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (documento WO-96/40.928); PcpA (Sanchez-Beato y col., FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); proteína tipo M (documento EP-0.837.130) y adhesina 18627 (documento EP-0.834.568). Se desvelan antígenos de proteínas neumocócicas para inclusión en la composición inmunógena en los documentos WO-98/18.931, WO-98/18.930 y PCT/US99/30.390.

Los ejemplos de proteínas de Neisseria que se formularán con la composición inmunógena de la invención incluyen TbpA (documentos WO-93/0686, EP-586.266; WO-92/03.467; US-5.912.336), TbpB (documentos WO-93/06.861; EP-586.266), Hsf (documento WO-99/31.132), NspA (documento WO-96/29.412) Hap (documento PCT/EP99/
02.766), PorA, PorB, OMP85 (también conocido como D15) (documento WO-00/23.595), PilQ (documento PCT/EP
99/03.603), PldA (documento PCT/EP99/06.718), FrpB (documento WO-96/31.618 véase ID SEC Nº 38), FrpA o FrpC o una parte conservada en común para dos de al menos 30, 50, 100, 500, 750 aminoácidos (documento WO-92/01.460), LbpA y/o LbpB (documento PCT/EP98/05.117; Schryvers y col., Med. Microbiol. 1999 32: 1117), FhaB (documento WO-98/02.547 ID. SEC. Nº 38), HasR (documento PCT/EP99/05.989), lipo02 (documento PCT/EP99/08.315), MltA (documento WO-99/57.280) y ctrA (documento PCT/EP00/00.135). Las proteínas de Neisseria se añaden opcionalmente como proteínas purificadas o como parte de una preparación de membrana exterior.

La composición farmacéutica o inmunógena de la invención comprende opcionalmente uno o más antígenos que pueden proteger a un hospedador contra Haemophilus influenzae no tipificables, VSR y/o uno o más antígenos que pueden proteger a un hospedador contra virus de la gripe.

Los ejemplos de antígenos de proteínas H. influenzae no tipificables incluyen proteína Fimbrina (documento US-5.766.608) y fusiones que comprenden péptidos de la misma (por ejemplo, Fusión LB1) (documento US-5.843.464-Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, proteína D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Hap y D15.

Los ejemplos de antígenos de virus de la gripe incluyen virus enteros, vivos o inactivados, virus de la gripe divididos, cultivados en huevos o células MDCK, o células Vero o virosomas de la gripe enteros (según describe R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) o proteínas purificadas o recombinantes de los mismos, como HA, NP, NA o proteínas M, o combinaciones de los mismos.

Los ejemplos de antígenos de VSR (Virus Sincitial Respiratorio) incluyen la glucoproteína F, la glucoproteína G, la proteína HN, la proteína M o derivados de las mismas.

Debe observarse que las composiciones antigénicas de la invención pueden comprender uno o más polisacáridos capsulares de una sola especie de bacterias. Las composiciones antigénicas también pueden comprender polisacáridos capsulares obtenidos de una o más especie de bacterias.

Opcionalmente, la composición inmunógena o vacuna contiene una cantidad de un adyuvante suficiente para potenciar la respuesta inmunitaria al inmunógeno. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, sales de aluminio, mezclas de escualeno (SAF-1), péptido de muramilo, derivados de saponina, preparaciones de paredes celulares de micobacteria, lípido A monofosforílico, derivados de ácido micólico, tensioactivos de copolímeros de bloque no iónicos, Quil A, subunidad de toxina B del cólera, polifosfaceno y derivados, y complejos inmunoestimulantes (ISCOM) como los descritos por Takahashi y col., (1990) Nature 344:873-875. Para uso veterinario y para producción de anticuerpos en animales, pueden usarse componentes mitógenos de adyuvante de Freund.

Como con todas las composiciones inmunógenas o vacunas, las cantidades inmunológicamente eficaces de los inmunógenos deben determinarse empíricamente. Los factores que deben considerarse incluyen la inmunogenicidad, forme o no el inmunógeno complejo con o unido covalentemente a un adyuvante o proteína portadora u otro vehículo, ruta de administraciones y el número de dosis de inmunización que se administrará. Dichos factores son conocidos en la técnica de las vacunas y se sitúa bien dentro de la técnica de los inmunólogos preparar dichas determinaciones sin experimentación innecesaria.

El agente activo puede estar presente en concentraciones variables en la composición farmacéutica o vacuna de la invención. Normalmente, la concentración mínima de la sustancia es una cantidad necesaria para lograr su uso pretendido, mientras que la concentración máxima es la cantidad máxima que permanecerá en solución o suspendida homogéneamente dentro de la mezcla inicial. Por ejemplo, la cantidad mínima de un agente terapéutico es preferentemente una que proporcionará una dosis única terapéuticamente eficaz. Para sustancias bioactivas, la concentración mínima es una cantidad necesaria para bioactividad sobre reconstitución y la concentración máxima está en el punto en el que no puede mantenerse una suspensión homogénea. En el caso de unidades de dosis única, la cantidad es la de una sola aplicación terapéutica. Generalmente, se espera que cada dosis comprenderá de 1 a 100 \mug de antígeno de proteína, preferentemente de 5 a 50 \mug y con la máxima preferencia de 5 a 25 \mug. Las dosis preferidas de polisacáridos bacterianos son de 10 a 20 \mug, de 10 a 5 \mug, de 5 a 2,5 \mug o de 2,5 a 1 \mug. La cantidad preferida de la sustancia varía de una sustancia a otra pero puede determinarse fácilmente por un experto en la materia.

Las preparaciones de vacunas de la presente invención pueden usarse para proteger o tratar a un mamífero (por ejemplo, un paciente humano) susceptible de infección, por medio de la administración de dicha vacuna a través de una ruta sistémica o mucosa. Estas administraciones pueden incluir inyección por las rutas intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o por administración mucosa a los tractos oral/alimentario, respiratorio, genitourinario. Aunque la vacuna de la invención puede administrarse como una sola dosis, los componentes de la misma también pueden coadministrarse conjuntamente al mismo tiempo o en momentos diferentes (por ejemplo, si están presentes polisacáridos en una vacuna, podrían administrarse por separado al mismo tiempo o de 1 a 2 semanas después de la administración de la combinación de proteínas bacterianas para coordinación óptima de las respuestas inmunitarias con respecto a las demás). Además de una sola ruta de administración, pueden usarse 2 rutas de administración diferentes. Por ejemplo, los antígenos virales pueden administrarse ID (intradérmicos), mientras que las proteínas bacterianas pueden administrarse IM (intramusculares) o IN (intranasales). Si están presentes polisacáridos, pueden administrarse IM (o ID) y las proteínas bacterianas pueden administrarse IN (o ID). Además, las vacunas de la invención pueden administrarse IM para dosis iniciales e IN para dosis de recuerdo.

La preparación de vacunas se describe generalmente en Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (ed. Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). La encapsulación en liposomas es descrita por Fullerton, patente de EE.UU. 4.235.877.

Un aspecto adicional de la invención es un procedimiento para fabricar una composición farmacéutica que comprende una etapa de preparación de la toxina de la difteria o fragmento o mutante de la misma (por ejemplo CRM197) usando el procedimiento de fermentación de la invención y combinándola con un vehículo farmacéuticamente aceptable y añadiendo opcionalmente cualquiera de los antígenos adicionales mencionados anteriormente.

Dicho procedimiento puede comprender además una etapa de conjugación de la toxina de la difteria o fragmento o mutante de la misma (por ejemplo CRM197) a uno o más componentes adicionales de la composición farmacéutica, preferentemente polisacáridos u oligosacáridos bacterianos según se describe anteriormente.

Un aspecto adicional de la invención es el uso de la toxina de la difteria o fragmento o mutante de la misma (por ejemplo CRM197) de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedad bacteriana, en particular enfermedad por C. diphtheriae.

Un aspecto adicional de la invención es un procedimiento de prevención o tratamiento de infección bacteriana, en particular infección por C. diphtheriae, que comprende la administración de la composición farmacéutica, la composición inmunógena o la vacuna de la invención a un paciente.

La invención se ilustra en los ejemplos adjuntos. Los ejemplos mostrados a continuación se efectúan usando técnicas estándar, que son bien conocidas y rutinarias para los expertos en la materia, excepto cuando en caso contrario se describen en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

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Ejemplos Ejemplo 1 Medida de KLa

Con el fin de medir KLa de una etapa de fermentación, se llenó el fermentador con el volumen deseado de agua y se aplicaron los parámetros de fermentación (por ejemplo temperatura, presión, agitación y aireación) y se dejó que el sistema alcanzara un estado estacionario. La sonda de pO2 se calibró al 100%.

Se cambió rápidamente la aireación a gas nitrógeno, mientras se mantenía la misma tasa de flujo. La pO2 se siguió hasta que la pO2 cayó a menos del 5%. Cuando se alcanzó este punto, se cambió la aireación rápidamente a aire mientras se mantenía la misma tasa de flujo. Se siguió el nivel de pO2 y se registró en varios puntos de tiempo como un porcentaje del nivel al 100% del estado estacionario original.

Se calculó KLa representando gráficamente el log (100-pO2%) con respecto al tiempo. El coeficiente angular de la parte lineal del gráfico corresponde a -Kla. Normalmente, sólo se consideran los datos entre el 20% y el 80% de la pO2.

Resultados

En la Tabla 1 a continuación se muestran las lecturas de la pO2 en varios puntos de tiempo.

TABLA 1

1

Los resultados se representaron gráficamente según se muestra en la fig. 1 y se determinó KLa a partir del coeficiente angular de la línea en la fig. 1B.

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Ejemplo 2 Fermentación de cepa ATCC 39255 de C. diphtheriae a escala de 150 litros

La bacteria usada en la preparación de CRM197 (Material de Reacción Cruzada) es una cepa mutante de Corynebacterium diphtheriae obtenida por tratamiento con nitrosoguanidina según el procedimiento de A. Pappenheimer (Nature New Biol. 233:8-11, 1971). Expresa una toxina diftérica destoxificada (aa 52: mutación de glicina a ácido glutámico). Se obtuvo de ATCC en la que tiene la referencia 39255. El esquema general del procedimiento de fermentación se muestra en la fig. 2. Se retiró una semilla de trabajo que contenía 1,1 x 10^{10} ufc/m) del congelador (-70ºC) y se descongeló a temperatura ambiente. Inmediatamente después de la descongelación, se centrifugó el vial y se recogieron 250 \mul de la semilla con una jeringuilla de 1 ml con aguja.

Este volumen se inyectó en 100 ml de solución salina estéril (0,9%). Se agitó el matraz. Se tomaron 2 ml de la suspensión con una jeringuilla de 2 ml con aguja y se usó para inocular un erlenmeyer de 3 L que contenía 500 mL del medio descrito en el documento US-4.925.792. Se incubó el matraz a 34,5ºC \pm 0,5ºC a velocidad de agitación de 250 rpm hasta que la densidad óptica (650 nm) alcanzó de 4,0 a 6,0 (después de 16 a 19 h de incubación).

Se esterilizó un fermentador de 150 litros y se transfirieron asépticamente 100 L de medio de cultivo en el fermentador. Se llenó el frasco de ácido con 500 mL de H_{3}PO_{4} al 25% (V/V); el pH del medio era inicialmente de aproximadamente 7,4 y no se ajustó.

Se preparó el fermentador un día antes de la inoculación y se guardó en condiciones de espera de 34,5ºC de temperatura, 0,5 bar de presión, flujo de aire de 23 N Umin en el espacio delantero y velocidad de agitación de 50 rpm durante 16 a 20 h, hasta inoculación.

Antes de la inoculación, se ajustó el fermentador a las condiciones de cultivo de 34,5ºC de temperatura, 0,5 bar de presión, flujo de aire de 23 N Umin insuflado en el medio y velocidad de agitación de 240 rpm. Una agitación de 240 rpm da una velocidad de extremo de 1,76 m/s y un tiempo teórico de mezcla de 3,9 segundos. El oxígeno disuelto no se regula, sólo se monitoriza, se activó el sistema de control de espuma y se dejó que el pH alcanzara 7,8 y posteriormente se mantuvo mediante adición de H_{3}PO_{4}. Antes de inoculación, se ajustó la sonda de pO2
al 100%.

La velocidad de agitación se ajustó a 240 rpm, correspondiente a la velocidad periférica de 1,76 m/s. La velocidad de agitación de 240 rpm combinada con una tasa de aireación de 23-L/min produjo un KLa (20-80%, agua a 30ºC, 0,5 bar) estimado de 42 h-1 (véase fig. 6).

Se inoculó el fermentador a través del orificio de entrada del inóculo con 400 ml del cultivo de semillas descrito anteriormente.

La fermentación continuó hasta que se cumplieron las dos condiciones siguientes. Transcurrieron 20 horas de fermentación y el nivel de oxígeno disuelto había aumentado al 10%. La duración de fermentación total estuvo generalmente entre 22 y 28 h.

Al final de la fermentación, se cambió la temperatura a un ajuste de 20ºC, se desactivó la regulación del pH regulación, se cambió el flujo de aire en el espacio delantero con el fin de limitar la formación de espuma, se desactivó el sistema de control de espuma, y los demás parámetros no se cambiaron.

Se conectó el sistema de microfiltración al fermentador y cuando la temperatura de la suspensión alcanzó 21ºC, comenzó la microfiltración. La microfiltración se realizó en dos fases: una concentración y una diafiltración. Durante la fase de concentración, los parámetros fueron: presión de entrada: 0,6 bar, presión de salida: -0,1 bar, flujo de permeado: mantenido constante a 2 L/min usando una bomba peristáltica calibrada (la presión del permeado fue de aproximadamente 0,3 bar). Se concentró la suspensión hasta que sucedió primero uno de los siguientes eventos. O bien la presión de entrada alcanzó 0,9 bar o bien se recuperaron 75 litros de permeado.

Durante la fase de diafiltración, se usaron los siguientes parámetros: la presión de entrada se mantuvo en la presión alcanzada al final de la etapa de concentración (0,9 bar máximo); se añadió agua a 2 litros/min; el agua total añadida fue de 3 volúmenes de retenido.

Se filtró el retenido en una membrana de 0,22 \mum y se almacenó a +4ºC. Se probó la estabilidad del CRM 197 en dicha suspensión después de hasta 4 días de almacenamiento a +4ºC o a temperatura ambiente (+20ºC < TA < 23ºC). No se observó degradación ni diferencias mediante cuantificación por ELlSA o en SDS-page. Se realizó una prueba para confirmación de ausencia de crecimiento en agar BAB incubado a 36ºC.

Resultados

Se realizaron dos fermentaciones en escala de 150 L usando el protocolo de fermentación descrito anteriormente (CDT 199 y CDT 206). Las condiciones de precultivo y cultivo se muestran en las Tablas 2 y 3 y los rendimientos de CRM197 se muestran en la Tabla 4. La fig. 3 muestra un gráfico de la cinética de crecimiento típica de un precultivo. Cuando la D.O. (650 nm) estaba entre 4,0 y 6,0, el cultivo estaba claramente en una fase exponencial de crecimiento y el pH cambió sólo ligeramente.

TABLA 2 Condiciones de precultivos

2

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TABLA 3 Condiciones de cultivos

3

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TABLA 4 Estimación de CRM 197

4

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Durante la fermentación, se observaron diferentes fases.

La primera fase se caracterizó por una disminución del oxígeno disuelto hasta que se alcanzó el 0% (duración de aproximadamente 6 a 7 h). Durante esta fase, el pH permanece estable o disminuye ligeramente (aproximadamente 0,1 unidades de pH).

Durante la segunda fase el pH aumentó y alcanzó una meseta a aproximadamente pH 7,8. En este nivel, se activó la regulación del pH, sin embargo a menudo no hubo que añadir ningún ácido en estas condiciones de fermentación. Durante esta meseta de pH, se observó un aumento del nivel de oxígeno disuelto por encima del 0% seguido por una caída al 0%.

La tercera fase se caracterizó por una disminución del pH a aproximadamente 7,4.

Finalmente se observó un aumento de pO2 entre 22 y 24 h de fermentación. Ésta es la señal para la recogida.

Se analizaron los gases de escape del fermentador por espectrómetro de masas. Se observó un perfil típico de producción de CO_{2}.

Las dos fermentaciones presentadas se prolongaron después de la señal de recogida con el fin de estimar la cinética de producción de CRM 197. Observamos que el nivel de CRM 197 no aumenta después de que se alcanzara la señal de recogida pero hubo un aumento en la producción de espuma. Con el fin de limitar el consumo de antiespumante, es preferible detener la fermentación en la señal de recogida. Sin embargo, el CRM 197 no parece afectado por formación de espuma excesiva y no se produjo degradación.

Microfiltración

Se muestran datos para la microfiltración de CDT206.

Se recogieron 74,3 L de permeado cuando la presión de entrada alcanzó 0,9 bares. La presión de salida estuvo entre 0,15 y 0,10 bares durante toda la etapa de concentración. La presión del permeado fue de 0,3 a 0,4 bares durante toda la etapa de concentración y la etapa de concentración duró 36 minutos.

Para la fase de diafiltración, se añadieron progresivamente 75 L de agua (2 Umin) mientras que se extrajo el permeado con la misma tasa de flujo. La presión de entrada fue de 0,9 bar al comienzo y cayó a 0,7 bar al final de la diafiltración. La presión de salida fue estable a 0,1 bar. La duración de la etapa de diafiltración fue de 39 min.

Cuantificación de CRM197

El nivel de expresión de CRM197 en condiciones de baja aireación fue generalmente de 2 a 4 veces superior al conseguido en condiciones de mayor aireación cuando la pO2 se mantuvo en el 5% o superior durante toda la fermentación.

SDS-page con tinción para sobrenadantes de cultivos

Se aplicaron geles de SDS-PAGE (fig. 4) de los sobrenadantes del cultivo en condición de reducción de manera que fue posible detectar posibles bandas de degradación (después de recorte, pueden detectarse 2 subunidades de 35 y 23 kD respectivamente). Posteriormente se sometieron a tinción con azul de Coomassie.

Resultados

En la fig. 4A se muestran los geles teñidos con coomassie de muestras de las dos fermentaciones (CDT 199) y 4B (CDT 206). El CRM 197 apareció en el peso molecular esperado (PM teórico: 58,4 kD). El CRM 197 no se degradó ya que no se observó ningún cambio en el patrón en las muestras tomadas después de la señal de fin de fermentación (Fig. 4A, trayectorias 9 y 10). La cantidad de CRM 197 no estuvo afectada por la microfiltración y la filtración final en 0,22 \muM ya que las trayectorias 9 y 11 de la fig. 4A muestran cantidades equivalentes de CRM197.

La temperatura puede tener un efecto negativo en la estabilidad de CRM (fig. 4B trayectoria 12). Esta muestra se tomó mientras la válvula de muestra estaba caliente y se redujo la cantidad de CRM197 presente en esta muestra.

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Ejemplo 3 Fermentación de cepa ATCC 39255 de C. diphtheriae a escala de 20 litros

Se usó un procedimiento similar al descrito en el ejemplo 2 para fermentar C. diphtheriae con la salvedad de que se usó un fermentador de 20 litros. Se agitó el cultivo a 300 rpm y se ajustó el flujo de aire a 3 litros/minuto. No se requirió adición de ácido o base durante la fermentación ya que el pH se mantuvo aproximadamente neutro durante toda la fermentación.

El cultivo creció hasta una DO final (650 nm) de 18,3. Se encontró que el rendimiento de CRM197 fue de 103 mg/litro según evaluación por densitometría sobre gel con tinción.

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Ejemplo 4 Fermentación de cepa ATCC 39255 C. diphtheriae a diferentes escalas

El procedimiento de fermentación de cultivo de C. diphtheriae en condiciones de KLa constante puede adaptarse para uso en fermentadores de otros tamaños y diferentes diseños. Se consiguieron buenos rendimientos de producción de CRM197 siguiendo las condiciones de tamaño del fermentador, flujo de aire y velocidad de agitación indicadas en la Tabla 5. Las tres fermentaciones de escala de 150 L se efectuaron en fermentadores de diferente diseño.

TABLA 5

5

Según se muestra en la tabla 5, el KLa fue importante antes que la elección específica de las condiciones de flujo de aire y velocidad de agitación. Así, un flujo de aire menor podría compensarse con una velocidad de agitación mayor para producir un KLa similar y seguían consiguiéndose los buenos rendimientos de CRM197. La velocidad de agitación debe ser suficiente para producir una suspensión homogénea y la aireación se limita para mantener una pO2 baja. N.B. Se usaron diferentes fermentadores para las fermentaciones de 20 litros. Las diferentes geometrías de los diferentes fermentadores condujeron al intervalo de valores de kLa mostrado en la tabla 5.

Sin embargo, diferentes condiciones de KLa fueron óptimas para diferentes escalas de fermentación. De ahí que para fermentación en un fermentador de 20 litros fuera óptimo un KLa menor de 22 a 28 h-1.

Las condiciones óptimas de KLa son las que permiten aireación limitada de manera que la pO2 dentro del cultivo descienda a niveles bajos. Un experto en la materia debe ser capaz fácilmente de determinar dichas condiciones para un tamaño y una geometría concretos del fermentador.

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Ejemplo 5 Efecto de la concentración de hierro en el rendimiento de las fermentaciones a diferentes pO2

Se realizó una serie de fermentaciones de cepa ATCC 39255 de C. diphtheriae en escala de 20 litros siguiendo el procedimiento expuesto en el Ejemplo 3 de manera que la pO2 fue baja durante la mayoría de la fermentación o a un ajuste constante de la pO2 al 5%. La cantidad de Fe3+ presente se modificó entre ausencia de adición de Fe3+, 250 ppb de adición de Fe3+, 500 ppb de adición de Fe3+ y 500 ppb de adición de Fe2+. El rendimiento de CRM197 al final de la fermentación se midió por densitometría de un gel de SDS-PAGE. Este procedimiento suele dar resultados aproximadamente un 20% inferiores a los obtenidos ELISA.

Resultados TABLA 6

6

Como se muestra en la tabla 6, cuando se fermenta C. diphtheriae en pO2 al 5%, la adición de hierro conduce a una reducción del rendimiento. Sin embargo, cuando se reduce el nivel de pO2 y la fermentación se efectúa en las condiciones de pO2 baja a Kla constante según se describe en el ejemplo 3, se consiguieron rendimientos más altos y en el rendimiento no influyó la adición de Fe3+.

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Ejemplo 6 Efecto de la concentración de hierro en el rendimiento de TD o CRM197 en condiciones de baja aireación

El intervalo de concentración de hierro que no influye en la expresión de CRM197 se determinó en microplacas. Las microplacas estimulan las condiciones de aireación limitada que existen en el procedimiento de fermentación de la invención.

El cultivo en microplacas se realizó en el mismo medio que se usó en las fermentaciones descritas anteriormente (en un medio similar a medio CY). Se añadió Fe3+ a partir de una solución de reserva de FeCl_{3},6H_{2}O a 1 g/l de ion Fe3+.

Los pocillos de las placas de microvaloración se llenaron con el medio y se inocularon a 8 E5 bact/mL.

Las placas de microvaloración se incubaron a 34,5ºC en agitación de 250 rpm durante 46 h en el caso de Corynebacterium diphtheriae que expresa CRM197 y Corynebacterium diphtheriae que expresa Toxina de la difteria.

Las muestras se filtraron a través de un filtro de 0,22 \mum.

La expresión se midió por procedimiento de densitometría en SDS-page (XT Criterion 4-12% bis tris de BioRad) coloreada con azul de Coomassie (tinción de azul Gelcode de Pierce). La referencia usada para la cuantificación fue el mutante CRM de toxina de la difteria de List Biological Laboratories INC, introducido en diferentes concentraciones en el gel.

Resultados

La Tabla 7 muestra la expresión de CRM197 en diferentes concentraciones de hierro para C. diphtheriae cultivada en condiciones de aireación limitada en pocillos de microvaloración. La expresión de CRM197 fue escasamente sensible a represión por Fe3+ y no se vio afectada significativamente por la adición de 1 ppm o 2 ppm de Fe3+. Sólo a 3 ppm se produjo una caída significativa en la expresión de CRM197. Incluso en este nivel de Fe3+, la expresión de CRM197 siguió siendo del 79% de la conseguida sin adición de Fe3+.

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TABLA 7 Corynebacterium diphtheriae que expresa CRM197

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Los rendimientos de CRM197 se expresan como un porcentaje del rendimiento obtenido sin adición de Fe3+ extraordinario.

Los resultados de la expresión de TD se muestran en la Tabla 8 para C. diphtheriae cultivada en pocillos de microvaloración en las condiciones indicadas. La producción de TD en condiciones de aireación limitada fue también escasamente sensible a la represión por Fe3+. La expresión de TD aumentó al aumentar la concentración de Fe3+ con una producción máxima de TD conseguida a 700 ppb. La expresión de TD empezó a descender sólo cuando la concentración de Fe3+ se aumentó a 3 ppm.

TABLA 8 Corynebacterium diphtheriae que expresa Toxina de la difteria

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Los rendimientos de TD se expresan como un porcentaje del rendimiento alcanzado sin adición de Fe3+ extraordinario.

Claims

1. Un procedimiento de fermentación que comprende una etapa de fermentación de crecimiento de una cepa de Corynebacterium diphtheria en un medio en un fermentador en condiciones de agitación suficiente para mantener un cultivo homogéneo y aireación limitada de manera que la pO2 dentro del cultivo descienda a menos del 4% para la mayoría de la etapa de fermentación en el que la etapa de fermentación tiene lugar en a) un fermentador de 100 a 250 litros a un KLa de 30 a 60 h-1 o b) en un fermentador de 250 a 800 litros a un KLa de 60-150 h-1.

2. El procedimiento de fermentación según la reivindicación 1 en el que la pO2 desciende aproximadamente a cero durante la mayoría de la etapa de fermentación.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2 en el que la pO2 de menos del 4% se mantiene desde el momento en que la Corynebacterium diphtheria se ha desarrollado hasta una densidad suficiente para que la pO2 descienda a menos del 4% debido al rápido consumo de oxígeno, hasta que se completa la etapa de fermentación.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que la etapa de fermentación se efectúa a KLa constante.

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la etapa de fermentación se efectúa a velocidad de agitación y tasa de aireación constantes.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que la etapa de fermentación se efectúa en condiciones variables de kLa.

7. El procedimiento según las reivindicaciones 1 a 6 en el que la etapa de fermentación tiene lugar con un flujo de aire de aire comprimido de 15 a 25 Umin y una velocidad de agitación de 150 a 250 rpm.

8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el medio es CY, SOC o medio similar y el pH dentro del fermentador se encuentra entre 7,0 y 7,8 por el grado de aireación sin requerir la adición de ácido o base.

9. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la cepa de Corynebacterium diphtheria produce toxina de la difteria o un mutante de la misma, en particular CRM197.

10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la cepa de Corynebacterium diphtheria es ATCC39255.

11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el medio contiene entre 10 y 4.000 ppb de hierro.

12. Un procedimiento para fabricación de una preparación de un antígeno de C. diphtheriae que comprende las etapas de efectuar el procedimiento de fermentación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y aislar el antígeno de C. diphtheriae a partir del cultivo.

13. El procedimiento según la reivindicación 12 en el que el antígeno de C. diphtheriae es toxina de la difteria o un fragmento o un mutante de la misma (por ejemplo CRM197).

14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12 que comprende una etapa de adición de uno o más antígenos adicionales al antígeno de C. diphtheriae.

15. El procedimiento según la reivindicación 14 que comprende además una etapa de conjugación de la toxina de la difteria o un fragmento o mutante de la misma para uno o más antígenos adicionales.