ES2816630T3

ES2816630T3 - Composiciones de flagelina y usos

Info

Publication number: ES2816630T3
Application number: ES15827248T
Authority: ES
Inventors: Vadim Mett
Original assignee: Genome Protection Inc
Current assignee: Genome Protection Inc
Priority date: 2014-07-30
Filing date: 2015-07-29
Publication date: 2021-04-05
Anticipated expiration: 2035-07-29
Also published as: JP2017523180A; US20190315810A1; MX2017001279A; CA2994289C; EA201790273A1; US20180354995A1; AU2015296298B2; US11542306B2; WO2016019134A1; US10202426B2; EA037407B1; ZA201701286B; IL250334B; EP3174552B1; AU2015296555A1; WO2016019134A8; WO2016019034A1; KR20170031251A; JP2021191781A; US20200392190A1

Abstract

Una composición relacionada con la flagelina, comprendiendo la composición una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº: 17 o que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº: 150, en donde la composición relacionada con la flagelina activa la señalización de TLR5 al mismo nivel que el de una SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de flagelina y usos

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos números 62/031.116, presentada el 30 de julio de 2014; 62/110.744, presentada el lunes, 2 de febrero de 2015; y 62/117.366, presentada el 17 de febrero de 2015.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a métodos y composiciones que son útiles para el tratamiento, prevención, y/o diagnóstico, de varias enfermedades, incluyendo el cáncer y las dolencias relacionadas con la radiación.

Descripción del archivo de texto presentado electrónicamente

Una copia en formato legible por ordenador del Listado de secuencias (nombre de archivo: CLE-016PC-SequenceListing.txt; fecha de registro: 28 de julio de 2015; tamaño del archivo: 245 KB).

Antecedentes

Los receptores de tipo Toll (TLR) son glucoproteínas de membrana de tipo I que son receptores clave en la inmunidad innata. Los 10 TLR conocidos en seres humanos reconocen diferentes antígenos microbianos, y cuando se activan por unión al ligando, median en la producción rápida de citocinas y quimiocinas. Además de su papel en la defensa del hospedador, los TLR juegan un papel en la progresión y desarrollo del cáncer y en la protección de las células.

TLR5 se une a la flagelina, una proteína globular que ella misma está dispuesta en un cilindro hueco para formar el filamento en los flagelos bacterianos. La unión de la flagelina a TLR5 inicia una cascada de moléculas pro inflamatorias, especialmente NF-kB y sus dianas. Los agonistas de TLR5 derivados de la flagelina se han desarrollado como terapias para diversas enfermedades. Sin embargo, estas moléculas pueden sufrir limitaciones específicas, incluyendo, por ejemplo, una unión y señalización insatisfactorias. Además, muchos posibles hospedadores ya producen anticuerpos anti-flagelina que también se dirigen a los derivados del agonista de TLR5, despejando de este modo la terapéutica del cuerpo y limitando su eficacia. Además, como proteínas bacterianas intrínsecamente inmunogénicas, los derivados de la flagelina pueden poseer antigenicidad e inmunogenicidad desventajosas, y, por lo, tanto justifican una mejora.

Sumario de la invención

En consecuencia, la presente invención como se define por las reivindicaciones, proporciona composiciones relacionadas con la flagelina y métodos que superan las limitaciones observadas entre este grupo de biológicos.

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que las construcciones minimizadas de composiciones relacionadas con la flagelina pueden exhibir una inmunogenicidad reducida y mejorar la farmacocinética, al tiempo que conservan la capacidad de activar la señalización de TLR5.

En un aspecto, la invención proporciona una composición relacionada con la flagelina que conserva la capacidad para activar la señalización de t LR5. En una realización adicional, la composición relacionada con la flagelina comprende mutaciones que disminuyen la antigenicidad e inmunogenicidad de la construcción. En una realización adicional, la composición relacionada con la flagelina no es reconocida por los anticuerpos neutralizantes de flagelina (FliC). Aún en otra realización, la composición relacionada con la flagelina activa la señalización de TLR5 a un nivel igual o similar al de una composición relacionada con la flagelina de longitud completa. En una realización adicional, la composición relacionada con la flagelina demuestra una farmacocinética mejorada en comparación con una composición relacionada con la flagelina completa. Aún en otra realización, la composición relacionada con la flagelina demuestra una mayor retención en el hospedador.

En algunas realizaciones de la divulgación, la composición relacionada con la flagelina deriva de CBLB502 (SEQ ID NO: 2). En una realización adicional, la composición relacionada con la flagelina comprende un truncamiento en uno o más dominios. En una realización adicional, la composición relacionada con la flagelina comprende una deleción en un dominio N terminal. Aún en otra realización, la composición relacionada con la flagelina comprende una deleción en un dominio ND0. Aún en otra realización, la composición relacionada con la flagelina comprende una deleción en el dominio ND0 entero. En una realización adicional, la composición relacionada con la flagelina comprende una deleción en un dominio C terminal. En otra realización más, la composición relacionada con la flagelina comprende una deleción en un dominio CD0. En otra realización más, la composición relacionada con la flagelina conserva los aminoácidos 470-485 del dominio CD0. En otra realización adicional de la invención, la composición relacionada con la flagelina es CBLB502-S33 (SEQ ID NO: 17).

En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina comprende mutaciones en epítopos reconocidos por anticuerpos neutralizantes anti-CBLB502. En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina comprende una o más mutaciones en los epítopos reconocidos por anticuerpos neutralizantes anti-CBLB502 que inhiben la capacidad de los anticuerpos para neutralizar la composición. Aún en otra realización, la composición relacionada con la flagelina comprende un truncamiento y mutaciones en uno o más epítopos reconocidos por anticuerpos neutralizantes anti-CBLB502. En una realización adicional, las mutaciones comprenden el reemplazo de los restos del epítopo con alanina. En una realización adicional, las mutaciones se seleccionan de una o más de D42A, A45G, N68A, N100A, T102A, S104A, S106A, D107A, S110A, D113A, Q117A, E120A, R124A, N127A, Q128A, F131A, N132A, G133A, Q142A, K144A, D151A, G152A, E153A, T154A, Q439A, N440A, R441A, D443A, S444A, T447A, N448A, N451A, N455A, N457A, R460A, Y468A; A469G; T470A; S473A, y N474Q. En una realización adicional, los epítopos mutados comprenden uno o más de los siguientes restos: E153, S444, T154, N440, Q142, F131, D443, N68, T447, S110, Q117, R124, D113, E120, N127, y Q128. En una realización adicional de la invención, la composición relacionada con la flagelina es CBLB502-S33MX/ "CBLB543" (SEQ ID NO: 150). En otra realización adicional de la divulgación, la composición relacionada con la flagelina es CBLB502-485CT/ "BCLB533" (SEQ ID NO: 71).

En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina comprende una etiqueta. Aún en otra realización, la etiqueta está unida al extremo N terminal de la composición relacionada con la flagelina. En otra realización más, la etiqueta está unida al extremo C terminal o a la composición relacionada con la flagelina.

En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina comprende un conector flexible. En una realización adicional, el conector peptídico comprende la SEQ ID NO: 16. Aún en otra realización, el conector peptídico comprende la SEQ ID NO: 242.

En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina está codificada por una cualquiera de las secuencias de nucleótidos enumeradas en la Tabla 1. En una realización adicional, la composición relacionada con la flagelina comprende uno cualquiera de los polipéptidos enumerados en la Tabla 1.

En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina activa la señalización de TLR5. En una realización adicional, la composición relacionada con la flagelina induce la expresión de NF-kB. Aún en otra realización, la composición relacionada con la flagelina minimizada induce la expresión de una o más citocinas. Aún en otra realización, las citocinas se seleccionan de IL-6, IL-12, quimioatrayente de queratinocitos (KC), IL-10, G-CSF, MCP-1, TNF-a, MIG, y MIP-2.

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el compuesto relacionado con la flagelina de la invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto, la invención proporciona un método para estimular la señalización de TLR5 que comprende administrar una composición relacionada con la flagelina de la invención a un sujeto que la necesita. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En una realización adicional, el tumor expresa TLR5. En una realización adicional, el tumor no expresa TLR5. Aún en otra realización, el cáncer se selecciona de cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de testículos, cáncer del tracto genitourinario, cáncer del sistema linfático, cáncer rectal, cáncer de páncreas, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides, cáncer de piel, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células p, linfoma de linfocitos T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células pilosas, linfoma histiocítico, y linfoma de Burkett, leucemias mielógenas agudas y crónicas, síndrome de mielodisplasia, leucemia mieloide, leucemia promielocítica, astrocitoma, neuroblastoma, glioma, schwanoma, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, osteosarcoma, xeroderma pigmentosa, queratoactantoma, seminoma, cáncer folicular de tiroides, teratocarcinoma, y cánceres del tracto gastrointestinal o de la cavidad abdominopélvica.

En algunas realizaciones, el sujeto sufre daño inducido por radiación. En una realización adicional, el sujeto se ha sometido a una dosis letal de radiación. Aún en otra realización, el sujeto se está sometiendo a radioterapia. En otra realización, la composición relacionada con la flagelina se administra antes de la exposición a la radiación. En otra realización más, la composición relacionada con la flagelina se administra durante la exposición a la radiación. En otra realización más, la composición relacionada con la flagelina se administra después de la exposición a la radiación.

En algunas realizaciones, el sujeto sufre lesión por reperfusión. En una realización adicional la reperfusión es causada por una lesión. En una realización adicional, la lesión es isquemia o hipoxia. En una realización adicional, la composición relacionada con la flagelina se administra antes del suministro de oxígeno. En una realización adicional, la composición relacionada con la flagelina se administra durante el suministro de oxígeno. En una realización adicional, la composición relacionada con la flagelina se administra después del suministro de oxígeno.

En diversas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina se administra conjuntamente con otros agentes terapéuticos y/o tratamientos. En una realización adicional, la composición relacionada con la flagelina se administra conjuntamente con quimioterapia. En una realización adicional, la composición relacionada con la flagelina se administra con radioterapia. En una realización adicional, la composición relacionada con la flagelina se administra conjuntamente con un antioxidante. En una realización adicional, la composición relacionada con la flagelina se administra conjuntamente con amifostina y/o vitamina E. En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina se administra antes de la administración de otros agentes terapéuticos y/o tratamientos. En realizaciones adicionales, la composición relacionada con la flagelina se administra al mismo tiempo que otros agentes terapéuticos y/o tratamientos. Incluso en otras realizaciones adicionales, la composición relacionada con la flagelina se administra después de la administración de otros agentes terapéuticos y/o tratamientos.

En un aspecto, la divulgación proporciona un método para tratar el cáncer que comprende administrar una composición relacionada con la flagelina de la invención a un sujeto que la necesita.

En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar el daño inducido por la radiación que comprende administrar una composición relacionada con la flagelina de la invención a un sujeto que la necesita.

En un aspecto, la divulgación proporciona un método para tratar la lesión por reperfusión que comprende administrar una composición relacionada con la flagelina de la invención a un sujeto que la necesita.

Los detalles de la invención se exponen en la siguiente descripción adjunta. Aunque los métodos y los materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento se pueden usar en la práctica o el ensayo de la presente invención, a continuación, se describen métodos y materiales ilustrativos. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y de las reivindicaciones. En la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular también incluyen las referencias en plural, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención.

Breve descripción de las figuras

Las FIGS. 1A y 1B muestran los 13 aminoácidos conservados de la flagelina que pueden ser importantes para la actividad de t LR5. Las FIGS. 1A y 1B muestran una comparación de las secuencias de aminoácidos conservadas (Fig. 1A) y el extremo carboxi (Fig. 1B) de 21 especies de bacterias. Los 13 aminoácidos conservados importantes para la actividad de TLR5 se muestran sombreados. Las secuencias de aminoácidos se identifican por sus números de registro de TrEMBL (primera letra = Q) o Swiss-Prot (primera letra = P).

La FIG. 2 muestra los primeros datos del análisis de la relación estructura-actividad (SAR) que reflejan la contribución de segmentos individuales y dominios enteros de CBLB502 a la eficacia de la unión y la señalización. Las afinidades relativas de unión y señalización se obtuvieron usando el ensayo bioquímico FP y el ensayo indicador basado en células respectivamente y normalizado para CBLB502. Los análisis se realizaron para una serie de mutaciones dentro de las interfaces de dimerización primarias y secundarias predichas (A), así como para la eliminación de segmentos más grandes o dominios completos D0 o D1 (B) como se muestra esquemáticamente arriba en el gráfico.

La FIG. 3muestra las regiones estructurales implicadas en las interacciones entre el ectodominio de TLR5 y el dominio D1 de CBLB502 (FliC). Obsérvese una contribución de los bucles LRR 7 y 9 (característicos de la familia TLR5) a las interacciones primarias de alta afinidad.

FIG. 4, los paneles A-E muestran la eficacia de la señalización de mutantes de CBLB502 en ratones indicadores de luciferasa NF-kB. Las gráficas muestran la actividad luciferasa NF-kB en ratones indicadores tras la administración subcutánea de las construcciones (A) CBLB502, (B) DIM2, (C) DIM 1, (D) PIM, y (E) SY3. La actividad se midió en el hígado de ratón, bazo, intestino grueso y vejiga.

La FIG. 5 muestra la minimización iterativa de la composición relacionada con la flagelina, CBLB502. Las construcciones S33 y 33ML conservan la actividad de señalización casi completa in vitro. El esquema muestra la organización del dominio incluyendo el espaciador y la etiqueta.

FIG. 6 los paneles A y B muestran que una variante minimizada CBLB502-S33 muestra una actividad de señalización sustancialmente superior in vivo en comparación con CBLB502. Los ratones indicadores de la luciferasa NF-kB se inyectaron (s.c) con 0,1 |jg de CBLB502 (A) o S33 (B) y se tomaron imágenes 3 horas más tarde. Las mediciones en los órganos individuales se ilustran en la FIG. 4.

FIG. 7 los paneles A-H muestran que una variante minimizada CBLB502-S33 muestra una actividad sustancialmente mayor in vivo en comparación con CBLB502, y el efecto fue particularmente fuerte en la vejiga y en el intestino grueso. La eficacia de la señalización de CBLB502 y CBLB502-S33 en ratones indicadores de luciferasa NF-kB (inyección s.c. a dosis indicadas y la recolección de órganos 3 horas más tarde) se estableció mediante el análisis de la actividad de luciferasa en los órganos recolectados.

FIG. 8 los paneles A y B muestran que una variante minimizada CBLB502-S33 muestra una mayor potencia en la protección contra la irradiación letal en ratones, en comparación con CBLB502. Panel A. Gráfica de Kaplan-Meyer que muestra la dinámica de supervivencia en ratones C57/BL6 inyectados con CBLB502 o CBLB502-S33, 30 min antes de la irradiación corporal total a 9,5 Gy (en comparación con el vehículo de control. Panel B. Dependencia de la dosis para el % de supervivencia a los 30 días.

La FIG. 9 muestra que la mayor actividad de señalización y protección radiológica de CBLB502-S33 se correlaciona con una mayor producción de citocinas (análisis FD) en ratones en comparación con CBLB502, incluyendo biomarcadores esencialmente mecánicos G-CSF e IL-6. Los ratones se inyectaron con 1 pg/kg o 2 pg/kg de CBLB502 o S33.

La FIG. 10 muestra que la variante minimizada CBLB502-S33 presenta una mejor FC (mayores niveles en plasma) en ratones en comparación con CBLB502.

La FIG. 11 muestra la supresión de la actividad de la luciferasa en lisados de hígado murino como medida de la neutralización in vivo de CBLB502 por inyección de antisueros y anticuerpos (neutralizantes y no neutralizantes) en ratones indicadores (3 ratones/grupo). Se administró a los ratones por vía intravenosa PBS, suero humano no neutralizante, suero neutralizante (Dl5), el anticuerpo monoclonal no neutralizante 7C, o el anticuerpo monoclonal neutralizante 11D. Una hora después, se administró por vía subcutánea la construcción CBLB502. La cantidad de actividad de luciferasa fue medida tres horas después de la administración de CBLB502. Se recogieron muestras de suero murino antes de la administración de CBLB502. Los sueros humanos se diluyeron 10 veces con PBS para las inyecciones. Ambos anticuerpos monoclonales, 7C y 11D se inyectaron a una concentración de 2 mg/ml en PBS.

FIG. 12 los paneles A y B muestran diagramas esquemáticos de las construcciones (A) 445 (SEQ ID NO: 54) y (B) 467 (SEQ ID NO: 62).

FIG. 13 los paneles A-C muestran ejemplos de epítopos estructurales predichos, sin desear quedar ligado a la teoría, usados para el diseño de derivados de CBLB502.

La FIG. 14 muestra que la construcción CBLB502-33MX demuestra la eliminación sustancial de antigenicidad neutralizante. La gráfica muestra un perfil de CBLB502-33MX frente a CBLB502 y su variante truncada CBLB502-ML sobre un panel de sueros humanos con título apreciable de anticuerpos neutralizantes de CBLB502.

La FIG. 15 muestra la cuantificación de CBLB502 y CBLB502-33MX en muestras de plasma de ratón. BLQ - por debajo del límite de cuantificación. El Panel A muestra los datos brutos mientras que el panel B muestra una representación gráfica de los datos en el panel A. CBLB502-33MX tiene unas propiedades FC muy similares a las de la CBLB502 parental, es decir, se elimina de la circulación a aproximadamente la misma velocidad.

La FIG. 16 muestra el perfil de citocinas para el análisis de las propiedades FD de CBLB502-33MX en comparación con las de CBLB502. CBLB502-33MX tiene un perfil FD muy similar al de la CBLB502 parental.

La FIG. 17 muestra la actividad de luciferasa en órganos de ratones después del tratamiento con CBLB502, CBLB502-S33 y CBLB502-33MX.

La FIG. 18 muestra las puntuaciones de lesión para un intervalo de dosis de 33MX en comparación con una dosis de CBLB502

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de ciertas mutaciones de la flagelina que mejoran las propiedades farmacológicamente relevantes de estos agentes biológicos y relacionados. Dichas mutaciones producen diversas composiciones relacionadas con la flagelina que, a modo de ejemplo no limitante, tienen la antigenicidad y la inmunogenicidad alteradas con respecto a aquellas sin mutaciones. Las composiciones relacionadas con la flagelina conservan la capacidad de activar la señalización de TLR5 a niveles iguales o similares a, los de una composición relacionada con la flagelina de longitud completa.

Composiciones relacionadas con la flagelina

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que las construcciones minimizadas de composiciones relacionadas con la flagelina pueden exhibir inmunogenicidad reducida mientras conservan la capacidad de activar la señalización de TLR5 a niveles iguales o similares a, los de una composición relacionada con la flagelina de longitud completa. La inmunogenicidad reducida permite que la construcción persista en el hospedador más tiempo que las composiciones relacionadas con flagelina de longitud completa. Es posible eliminar al menos la mitad del segmento endógeno C_D0, dejando solo su mitad N terminal (470-485) protegida con la etiqueta His C terminal y seguir conservando la mayor parte de la capacidad de la molécula para activar la señalización de TLR5. La presencia de la caperuza puede ser esencial para la actividad ya que la variante 33-485 pierde aproximadamente el 90 % de la actividad de señalización. Estas observaciones tomadas en conjunto sugieren que el dominio D_0 tiene solo una contribución menor (si la hay) a las interacciones directas con TLR5, y su papel puede ser limitado al mantener la integridad estructural del dominio D1. Por el contrario, el segmento C_D0 residual (470-485) no se puede eliminar ni sustituir por la mitad C terminal de C_D0 (485-504) u otras secuencias.

En diversas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones relacionadas con la flagelina. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones relacionadas con la flagelina que tienen (1) propiedades farmacológicas mejoradas, incluyendo antigenicidad e inmunogenicidad reducidas, que, por ejemplo, permiten su uso en una amplia variedad de estados patológicos y tipos de pacientes y/o (2) propiedades funcionales mejoradas que, por ejemplo, permiten efectos médicos mejorados.

Las composiciones relacionadas con la flagelina pueden ser un polipéptido relacionado con la flagelina. Las composiciones relacionadas con la flagelina pueden proceder de varias fuentes, incluyendo varias especies bacterianas grampositivas y gramnegativas. En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina pueden tener una secuencia de aminoácidos que se deriva de cualquiera de las flagelinas de las especies bacterianas que se muestran en la Figura 7 de la Publicación de Patente de EE. UU. N.° 2003/0044429. Las composiciones relacionadas con la flagelina pueden tener secuencias de nucleótidos relacionadas con aquellas que codifican los polipéptidos de flagelina que se enumeran, en la Figura 7 del documento U.S. 2003/0044429, los cuales están públicamente disponibles de fuentes como la base de datos de Genbank del NCBI.

Las composiciones relacionadas con la flagelina pueden ser el componente principal del flagelo bacteriano. Las composiciones relacionadas con la flagelina pueden estar compuestas por uno, o dos, o tres, o cuatro, o cinco, o seis, o siete dominios o fragmentos del mismo (véase, p. ej. la FIG. 10 de la patente de Estados Unidos 8.324.163.). Los dominios pueden seleccionarse de ND0, ND1, n D2, D3, CD2, CD1, y CD0. Los dominios 0 (D0), 1 (D1), y 2 (D2) pueden ser discontinuos y pueden formarse cuando los restos amino terminal y el extremo carboxilo terminal se yuxtaponen mediante la formación de una estructura en horquilla. El amino y carboxilo terminal que comprende los dominios D1 y D2 pueden en su mayor parte estar conservados, mientras que el dominio hipervariable (D3) puede ser muy variable. El dominio D3 no conservado puede estar en la superficie del filamento flagelar y puede contener los principales epítopos antigénicos. La potente actividad proinflamatoria de la flagelina puede residir en las regiones altamente conservadas ND1, ND2, c D1, y CD2.

Las composiciones relacionadas con la flagelina pueden ser de una especie de Salmonella, ejemplos representativos de las cuales son S. typhimurium y S. dublin (codificadas por el número de registro M84972 de GenBank). El polipéptido relacionado con la flagelina puede ser un fragmento, variante, análogo, homólogo, o derivado de la flagelina de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), o combinación de los mismos. Un fragmento, variante, análogo, homólogo o derivado de la flagelina puede obtenerse por medio de un diseño racional basado en la estructura del dominio de la flagelina y la estructura conservada reconocida por TLR5.

Las composiciones relacionadas con la flagelina pueden estar relacionadas con un polipéptido de flagelina de cualquier especie bacteriana grampositiva o gramnegativa incluyendo, pero sin limitación, los polipéptidos de la flagelina divulgados en la Publicación de Patente de EE. UU. 2003/000044429, y los péptidos de la flagelina correspondientes a los números de registro enumerados en los resultados de BLAST mostrados en la Figura 7 (paneles A-F) de la Publicación de Patente de EE. UU. 2003/000044429, o variantes de la misma.

La flagelina y las variantes anteriormente descritas presentan una alta antigenicidad e inmunogenicidad en gran parte, sin desear quedar ligado a la teoría, porque son intrínsecamente proteínas bacterianas inmunogénicas (p. ej. flagelina o "FliC"). Una limitación práctica en las construcciones preexistentes de la flagelina es que muchos sujetos tienen altos títulos de anticuerpos preexistentes capaces de neutralizar la actividad estimulante de TLR5 de estas construcciones. Estos individuos estarían desensibilizados (o serían completamente resistentes) al tratamiento derivado de la flagelina, a veces incluso en el caso de inyecciones únicas y, sin desear quedar ligado a la teoría, más probablemente tras un tratamiento recurrente. Además, el título de dichos anticuerpos preexistentes, incluso si inicialmente están presentes en bajos niveles, pueden aumentar rápidamente por una inyección única derivada de la flagelina, comprometiendo así incluso a un grupo más grande de individuos con el propósito de un régimen de dosis múltiple según lo previsto para aplicaciones médicas. La preexistencia generalizada de anticuerpos anti-FliC (incluyendo Ab neutralizantes) en una población probablemente refleja la exposición permanente de la humanidad a numerosas especies de enterobacterias flageladas (p. ej., Salmonella spp., E. coli) que colonizan (e infectan) el cuerpo humano. En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina actualmente descritas comprenden alteraciones de epítopos de diferentes anticuerpos que neutralizan la actividad de la flagelina.

En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina comprende mutaciones en epítopos reconocidos por anticuerpos neutralizantes anti-CBLB502. La composición relacionada con la flagelina puede comprender una o más mutaciones en los epítopos reconocidos por anticuerpos neutralizantes anti-CBLB502 que inhiben o anulan la capacidad de los anticuerpos para neutralizar la composición. Aún en otra realización, la composición relacionada con la flagelina comprende un truncamiento y mutaciones en uno o más epítopos. En una realización adicional, las mutaciones comprenden el reemplazo de los restos del epítopo con alanina. En una realización adicional, los epítopos mutados comprenden uno o más de los siguientes restos: E153, S444, T154, N440, Q142, F131, D443, N68, T447, S110, Q117, R124, D113, E120, N127, y Q128.

Las composiciones relacionadas con la flagelina pueden comprender inserciones, deleciones, inserciones de transposones, y cambios en uno cualquiera de los dominios D0, D1, D2, y los dominios D3 variables. El dominio D3 puede estar sustituido en parte, o en su totalidad, con un polipéptido bisagra o conector que permite que los dominios D1 y D2 se plieguen adecuadamente de modo que la variante estimule la actividad de t LR5.

En algunas realizaciones, la presente invención se refiere al desarrollo de un núcleo funcional mínimo de una flagelina, por ejemplo, eliminando restos respecto a la molécula CBLB502 ya acortada. En algunas realizaciones, la presente invención se refiere al desarrollo de una composición relacionada con la flagelina que tiene una identidad de aminoácidos alterada con respecto al tipo silvestre, que incluye deleciones, adiciones y sustituciones, que proporcionan una actividad mejorada. En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina deriva de CBLB502 (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina comprende un truncamiento en uno o más dominios. En una realización adicional, la composición relacionada con la flagelina comprende una deleción en un dominio N terminal. Aún en otra realización, la composición relacionada con la flagelina comprende una deleción en un dominio ND0. Aún en otra realización, la composición relacionada con la flagelina comprende una deleción en el dominio ND0 entero. En una realización adicional, la composición relacionada con la flagelina comprende una deleción en un dominio C terminal. En otra realización más, la composición relacionada con la flagelina comprende una deleción en un dominio CD0. En otra realización más, la composición relacionada con la flagelina conserva los aminoácidos 470-485 del dominio CD0. Aún en otra realización, la composición relacionada con la flagelina minimizada es CBLB502-S33 (SEQ ID NO: 17).

Las composiciones relacionadas con la flagelina pueden comprender al menos 10, 11, 12, o 13 de los 13 aminoácidos conservados en la FIG. 1A y la FIG. 1B (posiciones 89, 90, 91, 95, 98, 101, 115, 422, 423, 426, 431, 436 y 452). Las composiciones relacionadas con la flagelina pueden ser al menos 30-99 % idénticas a los aminoácidos 1-174 y 418 505 de la SEQ ID NO: 1.

En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina tienen propiedades funcionales y farmacológicas mejoradas las cuales, por ejemplo, permiten efectos médicos mejorados. En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina tienen una activación de NF-kB y radioprotección mejoradas respecto a CBLB502. En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas que conducen a una respuesta farmacodinámica proporcionalmente más fuerte (detectada, por ejemplo, por ensayos de citocinas).

En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina tienen propiedades farmacológicas mejoradas, incluyendo antigenicidad e inmunogenicidad reducidas, que, por ejemplo, permiten su uso en una amplia variedad de estados patológicos y tipos de pacientes. Una antigenicidad e inmunogenicidad reducidas amplían las aplicaciones médicas para las que se pueden usar las composiciones relacionadas con la flagelina de la invención, incluyendo, por ejemplo, aplicaciones médicas que requieren administración recurrente. En algunas realizaciones, la disminución de la antigenicidad se traduce en una resistencia mejorada contra la acción neutralizante de los anticuerpos humanos preexistentes (p. ej., anti-flagelina), así como aquellos inducidos en respuesta a la inyección de CBLB502. En realizaciones adicionales, las composiciones relacionadas con la flagelina tienen tiempos de retención más largos in vivo. Un tiempo de retención más largo puede permitir que la composición sea efectiva con menos dosis o con dosis más espaciadas.

En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina comprenden o consisten en cualquiera de los polipéptidos o ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos enumerados en la Tabla 1. En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina está codificada por las secuencias de nucleótidos enumeradas en la Tabla 1. En una realización adicional, la composición relacionada con la flagelina comprende los polipéptidos enumerados en la Tabla 1. En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina comprenden o consisten en los polipéptidos codificados por las SEQ ID NOs: 69 o 70. En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina comprenden o consisten en los polipéptidos de SEQ ID NO: 71, "CBLB543". En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina comprenden o consisten en los polipéptidos codificados por las SEQ ID NOs: 149 o 151. En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina comprenden o consisten en los polipéptidos de SEQ ID NO: 150, "CBLB533". En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina pueden ser al menos 30-99 % idénticas a las secuencias enumeradas en la Tabla 1, por ejemplo, aproximadamente 50 %, o aproximadamente 60 %, o aproximadamente 70 %, o aproximadamente 80 %, o aproximadamente 90 %, o aproximadamente 95 %, o aproximadamente 97 %, o aproximadamente 98 %, o aproximadamente 99 %, o aproximadamente 100 % idénticas a las secuencias enumeradas en la Tabla 1

Usos de las composiciones relacionadas con la flagelina

La familia TLR está compuesta por al menos 10 miembros y es esencial para la defensa inmunitaria innata contra los patógenos. El sistema inmunitario innato reconoce los patrones moleculares conservados asociados a patógenos (PAMP). TLR puede reconocer una estructura conservada que es particular de la flagelina bacteriana que puede estar compuesta por un gran grupo de restos que son algo permisivos en cuanto a la variación en el contenido de aminoácidos. Smith et al., Nat. Immunol. 4:1247-53 (2003) han identificado 13 aminoácidos conservados en la flagelina que forman parte de la estructura conservada reconocida por TLR5. Los 13 aminoácidos conservados de la flagelina que pueden ser importantes para la actividad de TLR5 se muestran en las FIGS. 1A y 1B.

En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina activa la señalización de TLR5. En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina activa TLR5 a los mismos niveles, o a niveles similares que, CBLB502. La activación de TLR5 induce la expresión del factor nuclear NF-kB, lo que a su vez activa numerosas citocinas relacionadas con la inflamación. En realizaciones adicionales, las composiciones relacionadas con la flagelina inducen la expresión de citocinas proinflamatorias. En realizaciones adicionales, las composiciones relacionadas con la flagelina inducen la expresión de moléculas antiinflamatorias. En otra realización, las composiciones relacionadas con la flagelina inducen la expresión de moléculas anti-apoptóticas. Aún en otra realización, las composiciones relacionadas con la flagelina inducen la expresión de moléculas antibacterianas. Las dianas de NF-kB, incluyen, pero sin limitación, IL-p, TNF-a, IL-6, IL-8, IL-18, G-CSF, TNFSF13B, quimioatrayente de queratinocitos (KC), BLIMP1/PRDM1, CCL5, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL22, CCL23, CXCL1, CCL28, CXCL11, CXCL10, CXCL3, CXCL1, GRO-beta, GRO-gamma, CXCL1, ICOS, IFNG, IL-1A, IL-1B, IL1RN, IL-2, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-12B, IL-12A, IL-13, IL-15, IL-17, IL-23A, IL-27, EBI3, IFNB1, CXCL5, KC, IiGp1, CXCL5, CXCL6, LTA, LTB, CCL2, CXCL9, MCP-1/JE, CCL3, CCL4, CXCL3, CCL20, CXCL10, CXCL5, CCL5, CCL1, TNFbeta, TNFSF10, TFF3, TNFSF15, CD86, componente del complemento 8a, CCL27, defensina-p3, MIG, MIP-2, y/o NOD2/CARD15.

En algunas realizaciones, la activación de la señalización de TLR5 puede regular la función inmunitaria de los linfocitos T CD4+ aumentando la generación de linfocitos T reguladores (Tregs), disminuyendo la activación de ERK1/2 inducida por LPS, y/o activando los linfocitos T citolíticos naturales (NK).

Enfermedades y métodos de tratamiento/prevención

En diversas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) y los métodos descritos en el presente documento son aplicables a diversos estados patológicos. En un aspecto, la invención proporciona un método para estimular la señalización de TLR5 que comprende administrar una composición relacionada con la flagelina de la invención a un sujeto que la necesita. La activación de la señalización de TLR5 puede tener diversas aplicaciones terapéuticas, incluyendo, pero sin limitación, el tratamiento del cáncer, la protección del daño inducido por radiación o inducido por reperfusión, actuando como adyuvantes en vacunas, o protegiendo a las células de compuestos citotóxicos.

En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina de la invención, o fragmentos de las mismas pueden proporcionarse como adyuvantes de vacunas virales. En una realización, las composiciones relacionadas con la flagelina o fragmentos de las mismas pueden administrarse junto con una vacuna o antígeno contra la gripe para provocar una mayor respuesta inmunitaria del hospedador a los antígenos de la gripe. Aún en otra realización, las composiciones relacionadas con la flagelina de la invención, o fragmentos de las mismas pueden proporcionarse como adyuvantes de vacunas contra parásitos. En una realización, las composiciones relacionadas con la flagelina o fragmentos de las mismas pueden administrarse junto con una vacuna o antígeno contra Plasmodium para provocar una mayor respuesta inmunitaria del hospedador al antígeno de Plasmodium.

En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina o de la invención pueden administrarse para proteger a las células de condiciones tóxicas. En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina pueden evitar la lesión mediada por Fas en las células. Las composiciones relacionadas con la flagelina de la invención pueden provocar una disminución de las enzimas hepáticas en la sangre periférica y la activación de las caspasas.

Cánceres

En diversas realizaciones, la presente divulgación se refiere a cánceres y/o tumores; por ejemplo, el tratamiento o prevención de cánceres y/o tumores. Como se usa en el presente documento, "cáncer" o "tumor" se refiere a un crecimiento incontrolado de células y/o un aumento anormal de la supervivencia celular y/o inhibición de la apoptosis que interfiere con el funcionamiento normal de los órganos y sistemas corporales. Se incluyen los cánceres benignos y malignos, pólipos, hiperplasia, así como los tumores latentes o micrometástasis. También, se incluyen células que tienen una proliferación anormal que no es impedida por el sistema inmunitario (por ejemplo, células infectadas con virus). Un sujeto que tiene un cáncer o un tumor es un sujeto que tiene células cancerosas objetivamente medibles presentes en el cuerpo del sujeto. Los cánceres que migran desde su ubicación original y siembran órganos vitales pueden conducir a la muerte del sujeto a través del deterioro funcional de los órganos afectados. Los cánceres hematopoyéticos, tales como la leucemia, pueden superar a los compartimentos hematopoyéticos normales en un sujeto, lo que conduce a un fallo hematopoyético (en forma de anemia, trombocitopenia y neutropenia) provocando en última instancia la muerte.

El cáncer puede ser un cáncer primario o metastásico. El cáncer primario puede ser un área de células cancerosas en un sitio de origen que se vuelve clínicamente detectable, y puede ser un tumor primario. Por el contrario, el cáncer metastásico puede ser la diseminación de una enfermedad desde un órgano o parte a otro órgano o parte no adyacente. El cáncer metastásico puede ser causado por una célula cancerosa que adquiere la capacidad de penetrar e infiltrarse en los tejidos normales circundantes en un área local, formando un nuevo tumor, que puede ser una metástasis local.

El cáncer también puede ser causado por una célula cancerosa que adquiere la capacidad de penetrar en las paredes de los vasos linfáticos y/o sanguíneos, después de lo cual la célula cancerosa puede circular a través del torrente sanguíneo (siendo así una célula tumoral circulante) a otros sitios y tejidos en el cuerpo. El cáncer puede deberse a un proceso tal como la diseminación linfática o hematógena. El cáncer también puede ser causado por una célula tumoral que reside en otro sitio, vuelve a penetrar a través del vaso o las paredes, continúa multiplicándose y opcionalmente forma otro tumor clínicamente detectable. El cáncer puede ser este nuevo tumor, que puede ser un tumor metastásico (o secundario).

El cáncer puede ser causado por células tumorales que han metastatizado, el cual puede ser un tumor secundario o metastásico. Las células del tumor pueden ser como las del tumor original. Como ejemplo, si un cáncer de mama o cáncer de colon metastatiza en el hígado, el tumor secundario, que está presente en el hígado, está formado por células de mama o colon anormales, no por células hepáticas anormales. Por lo tanto, el tumor en el hígado puede ser un cáncer de mama metastásico o un cáncer de colon metastásico, no un cáncer de hígado.

El cáncer puede tener su origen en cualquier tejido. El cáncer puede originarse a partir de, por ejemplo, melanoma, colon, cáncer, o próstata, y por lo tanto, puede estar constituido por células que eran originalmente de piel, colon, cáncer, o próstata, respectivamente. El cáncer puede ser también un cáncer hematológico, que puede ser linfoma. El cáncer puede invadir un tejido, tal como el hígado, pulmón, vejiga o intestino. El tejido invadido puede expresar un TLR, mientras que el cáncer puede o no expresar un TLR.

En el presente documento también se proporciona un método para reducir la recurrencia del cáncer, que comprende administrar a un mamífero que lo necesite una composición relacionada con la flagelina de la invención. El cáncer puede estar o haber estado presente en un tejido que expresa o no TLR, tal como TLR5. El método también puede prevenir la recurrencia del cáncer. El cáncer puede ser una enfermedad oncológica. El cáncer puede ser un tumor latente, que puede ser el resultado de la metástasis de un cáncer. El tumor latente también puede permanecer tras la extirpación quirúrgica de un tumor. La recurrencia del cáncer puede ser un nuevo crecimiento del tumor, una metástasis pulmonar o una metástasis hepática.

Los cánceres y/o tumores representativos de la presente invención pueden expresar TLR5 o no, y pueden incluir, pero sin limitación, un carcinoma basocelular, cáncer de las vías biliares; cáncer de vejiga; cáncer de hueso; cáncer de cerebro y del sistema nervioso central; cáncer de mama; cáncer de peritoneo; cáncer de cuello de útero; coriocarcinoma; cáncer de colon y recto; cáncer de tejido conjuntivo; cáncer del sistema digestivo; cáncer endometrial; cáncer de esófago; cáncer de ojo; cáncer de cabeza y cuello; cáncer gástrico (incluyendo cáncer gastrointestinal); glioblastoma; carcinoma hepático; hepatoma; neoplasia intraepitelial; cáncer de riñón o renal; cáncer de laringe; leucemia; cáncer de hígado; cáncer de pulmón (p. ej. cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma epidermoide de pulmón); melanoma; mieloma; neuroblastoma; cáncer de la cavidad oral (labio, lengua, boca y faringe); cáncer de ovario; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; cáncer de recto; cáncer del sistema respiratorio; carcinoma de glándulas salivales; sarcoma; cáncer de piel; cáncer de células escamosas; cáncer de estómago; cáncer testicular; cáncer de tiroides; cáncer de útero o de endometrio; cáncer del sistema urinario; cáncer de vulva; linfoma incluyendo linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, así como linfoma de linfocitos B (incluyendo linfoma no Hodgkin (NHL) de grado bajo/folicular; NHL linfocítico de células pequeñas (SL); NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de células no escindidas pequeñas de alto grado; NHL con neoplasia maligna; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (LLC); leucemia linfoblástica aguda (LLA); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; así como otros carcinomas y sarcomas; y trastorno linfoproliferativo posterior a trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales), y síndrome de Meig.

Las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) y los métodos descritos en el presente documento son aplicables a enfermedades metastásicas, incluyendo cánceres y/o tumores. La "metástasis" se refiere a la diseminación del cáncer desde un sitio primario a otros lugares del cuerpo. Las células cancerosas pueden separarse de un tumor primario, penetrar en los vasos linfáticos y sanguíneos, circular a través del torrente sanguíneo y crecer en un foco distante (metastatizar) en tejidos normales en cualquier lugar del cuerpo. La metástasis puede ser local o distante. La metástasis es un proceso secuencial, que depende de que las células tumorales se desprendan del tumor primario, viajen a través del torrente sanguíneo, y se detengan en un sitio distante. En el sitio nuevo, las células establecen su propia irrigación sanguínea y pueden crecer para formar una masa potencialmente mortal. Las vías moleculares estimulantes e inhibitorias dentro de la célula tumoral regulan este comportamiento, y las interacciones entre la célula tumoral y las células del hospedador en el sitio distante también son significativas.

Las metástasis se pueden detectar mediante el uso único o combinado de imágenes de resonancia magnética (MRI), imágenes de tomografía computarizada (CT), recuentos de células sanguíneas y de plaquetas, estudios de la función hepática, radiografías de tórax y gammagrafías óseas además del control de síntomas específicos.

En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a un método para tratar un mamífero que padece un cáncer con activación constitutiva de NF-kB que comprende administrar al mamífero una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que induce la actividad de NF-kB, incluyendo las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) descritos en la presente memoria. El agente que induce la actividad de NF-kB puede administrarse en combinación con un tratamiento contra el cáncer.

En algunas realizaciones, la presente divulgación incluye métodos para el tratamiento de los efectos secundarios del tratamiento del cáncer que comprende administrar la composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, los efectos secundarios del tratamiento del cáncer incluyen alopecia, mielosupresión, toxicidad renal, pérdida de peso, dolor, náuseas, vómitos, diarrea, estreñimiento, anemia, desnutrición, caída del cabello, entumecimiento, alteración del gusto, pérdida de apetito, cabello fino o frágil, úlceras bucales, pérdida de memoria, hemorragia, cardiotoxicidad, hepatotoxicidad, ototoxicidad, y deterioro cognitivo asociado a la quimioterapia.

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a un método para tratar a un mamífero que sufre daño en el tejido normal atribuible al tratamiento del cáncer, incluyendo, pero sin limitación, un cáncer con activación constitutiva de NF-kB, que comprende administrar al mamífero una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento.

Envejecimiento y estrés

En algunas realizaciones, la presente divulgación incluye métodos para la modulación del envejecimiento celular que comprende administrar la composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento.

En algunas realizaciones, la presente divulgación incluye métodos para el tratamiento del estrés que comprende administrar la composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento. Esta divulgación se refiere a un método para tratar a un sujeto que sufre daño en el tejido normal atribuible al estrés, que comprende administrar al mamífero una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales). El estrés puede ser atribuible a cualquier fuente incluyendo, pero sin limitación, radiación, heridas, envenenamiento, infección, y choque térmico.

En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) se puede administrar en cualquier momento antes de la exposición al estrés incluyendo, pero sin limitación, aproximadamente 48 h, aproximadamente 46 h, aproximadamente 44 h, aproximadamente 42 h, aproximadamente 40 h, aproximadamente 38 h, aproximadamente 36 h, aproximadamente 34 h, aproximadamente 32 h, aproximadamente 30 h, aproximadamente 28 h, aproximadamente 26 h, aproximadamente 24 h, aproximadamente 22 h, aproximadamente 20 h, aproximadamente 18 h, aproximadamente 16 h, aproximadamente 14 h, aproximadamente 12 h, aproximadamente 10 h, aproximadamente 8 h, aproximadamente 6 h, aproximadamente 4 h, aproximadamente 3 h, aproximadamente 2 h, o aproximadamente 1 h antes de la exposición. En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina se puede administrar en cualquier momento después de la exposición al estrés incluyendo, pero sin limitación, aproximadamente 1 h, aproximadamente 2 h, aproximadamente 3 h, aproximadamente 4 h, aproximadamente 6 h, aproximadamente 8 h, aproximadamente 10 h, aproximadamente 12 h, aproximadamente 14 h, aproximadamente 16 h, aproximadamente 18 h, aproximadamente 20 h, aproximadamente 22 h, aproximadamente 24 h, aproximadamente 26 h, aproximadamente 28 h, aproximadamente 30 h, aproximadamente 32 h, aproximadamente 34 h, aproximadamente 36 h, aproximadamente 38 h, aproximadamente 40 h, aproximadamente 42 h, aproximadamente 44 h, aproximadamente 46 h, o aproximadamente 48 h después de la exposición.

Mitigación y prevención del daño por radiación

En otras realizaciones adicionales, la presente invención se refiere al tratamiento de las enfermedades o daño relacionados con la radiación. En realizaciones específicas, la presente invención se refiere a la mitigación o prevención y/o protección de enfermedades relacionadas con la radiación.

En una realización, la presente invención se refiere a la protección de las células de los efectos de la exposición a la radiación. En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a un método para proteger a un sujeto de la radiación que comprende administrar una composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la radiación es radiación ionizante. En algunas realizaciones, la radiación ionizante es suficiente para causar un síndrome gastrointestinal o un síndrome hematopoyético. En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento se administra en combinación con un radioprotector (p. ej. amifostina y vitamina E), una citocina (p. ej. un factor de células madre), etc. En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento se administra antes de, junto con, o después de la radiación. En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento se administra en combinación con un factor del crecimiento (p. ej. factor de crecimiento de queratinocitos), un esteroide (p. ej. 5-androstenediol), tricloro(dioxoetilen-O,O')telurato de amonio, agentes protectores del tiroides (p. ej. yoduro potásico (KI)), agentes antináuseas, agentes antidiarreicos, analgésicos, ansiolíticos, sedantes, terapia de citocinas, antibióticos, agentes antifúngicos y/o agentes antivirales.

En algunas realizaciones, la presente divulgación también se refiere a un método de tratamiento y/o mitigación del daño en el tejido mediado por apoptosis en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una composición que comprende una composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento. En algunas realizaciones la apoptosis es atribuible al estrés celular. En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento se administra antes de, junto con, o después del daño en el tejido. En algunas realizaciones, el estrés celular es la radiación. En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) se administra en combinación con un radioprotector (p.ej. un antioxidante (por ejemplo, amifostina y vitamina E), una citocina (p. ej. un factor de células madre), etc.

La lesión y muerte de las células normales por la radiación ionizante es una combinación de un daño directo inducido por la radiación de las células expuestas y una reacción celular activa genéticamente programada al estrés inducido por la radiación que tiene como resultado una muerte suicida o apoptosis. La apoptosis juega un papel clave en la pérdida celular masiva que ocurre en varios órganos radiosensibles (p. ej., sistemas hematopoyético e inmunitario, epitelio del tracto digestivo, etc.), cuyo fallo determina la radiosensibilidad general del organismo. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones relacionadas con la flagelina de la invención a un sujeto que las necesita suprime la apoptosis en las células. En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina de la invención se administran a un sujeto sometido a un tratamiento de radioterapia contra el cáncer para proteger a las células sanas de los efectos dañinos de la radioterapia.

La exposición a la radiación ionizante (IR) puede ser a corto o largo plazo, y/o puede aplicarse como dosis únicas o múltiples y/o puede aplicarse a todo el cuerpo o localmente. La presente invención, en algunas realizaciones, se refiere a accidentes nucleares o ataques militares, que pueden implicar la exposición a una sola dosis alta de irradiación de todo el cuerpo (a veces seguida de una intoxicación a largo plazo con isótopos radiactivos). Esto también se aplica (con un control estricto de la dosis aplicada), por ejemplo, para el pretratamiento de pacientes para trasplante de médula ósea cuando es necesario preparar órganos hematopoyéticos para la médula ósea del donante "limpiándolos" de los precursores hematopoyéticos del hospedador. El tratamiento contra el cáncer puede implicar múltiples dosis de irradiación local que excede en gran medida la dosis letal si se aplicara como irradiación corporal total. El envenenamiento o el tratamiento con isótopos radiactivos da como resultado una exposición local a largo plazo a la radiación de los órganos diana (p. ej., glándula tiroidea en el caso de inhalación de 125I). Además, hay muchas formas físicas de radiación ionizante que difieren significativamente en la gravedad de los efectos biológicos.

A nivel molecular y celular, las partículas de radiación pueden producir rotura y reticulación en el ADN, proteínas, membranas celulares y otras estructuras macromoleculares. La radiación ionizante también induce el daño secundario a los componentes celulares al dar lugar a los radicales libres y las especies reactivas de oxígeno (ROS). Existen múltiples sistemas de reparación que contrarrestan este daño, tales como, varias vías de reparación del ADN que restauran la integridad y fidelidad del ADN, y antioxidantes químicos y enzimas que eliminan los radicales libres y ROS y reducen las proteínas y los lípidos oxidados. Los sistemas de punto de control celular detectan los defectos del ADN y retrasan la progresión del ciclo celular hasta que se repare el daño o se llegue a la decisión de inducir a célula a detener el crecimiento o la muerte celular programada (apoptosis).

La radiación puede causar daño al organismo de los mamíferos, desde efectos mutagénicos y carcinogénicos leves por dosis bajas hasta la muerte casi instantánea por dosis altas. La radiosensibilidad general del organismo está determinada por alteraciones patológicas desarrolladas en varios tejidos sensibles que incluyen el sistema hematopoyético, el sistema reproductivo y diferentes epitelios con una alta tasa de renovación celular.

El resultado patológico agudo de la irradiación gamma que conduce a la muerte es diferente para diferentes dosis y puede determinarse por el fallo de ciertos órganos que definen el umbral de sensibilidad del organismo a cada dosis en particular. Por tanto, la letalidad a dosis más bajas produce, por ejemplo, aplasia de médula ósea, mientras que dosis moderadas destruyen más rápidamente, por ejemplo, induciendo el síndrome gastrointestinal (GI). Dosis muy altas de radiación pueden causar la muerte casi instantánea provocando degeneración neuronal.

Los organismos que sobreviven a un período de toxicidad aguda por radiación pueden sufrir consecuencias remotas a largo plazo que incluyen carcinogénesis y fibrosis inducidas por la radiación que se desarrollan en los órganos expuestos (p. ej., riñón, hígado o pulmones) en los meses y años posteriores a la irradiación.

El ADN celular es una diana principal de la RI que causa diversos tipos de daño en el ADN (estrés genotóxico) por mecanismos directos e indirectos (p.ej. basados en radicales libres). Todos los organismos mantienen un sistema de reparación del ADN capaz de recuperar eficazmente el ADN dañado por radiación; los errores en el proceso de reparación del ADN pueden conducir a mutaciones.

En algunas realizaciones, la exposición a la radiación experimentada por el sujeto es una consecuencia del tratamiento de radioterapia contra el cáncer. Los tumores generalmente son más sensibles a la radiación gamma y pueden tratarse con múltiples dosis locales que causan daños relativamente bajos al tejido normal. No obstante, en algunos casos, el daño de los tejidos normales es un factor limitante en la aplicación de radiación gamma para el tratamiento del cáncer. El uso de irradiación gamma durante la terapia contra el cáncer mediante la administración convencional, tridimensional conformada o incluso más dirigida de BeamCath también tiene toxicidades limitantes de la dosis causadas por el efecto acumulativo de la irradiación e induce el daño de las células madre de renovación rápida de los tejidos normales, tales como la médula ósea y el tracto gastrointestinal (GI). La administración de las composiciones relacionadas con la flagelina de la invención puede proteger a las células sanas del paciente del daño por radiación sin afectar a la radiosensibilidad de las células tumorales.

En algunas realizaciones, el sujeto se ha expuesto a una dosis letal de radiación. A dosis altas, la letalidad inducida por la radiación se asocia con los llamados síndromes hematopoyético y gastrointestinal por radiación. El síndrome hematopoyético se caracteriza por la pérdida de células hematopoyéticas y sus progenitores, lo que imposibilita la regeneración del sistema sanguíneo y linfoide. La muerte generalmente ocurre como consecuencia de una infección (resultado de la inmunosupresión), hemorragia y/o anemia. El síndrome GI es causado por la muerte celular masiva en el epitelio intestinal, predominantemente en el intestino delgado, seguido de la desintegración de la pared intestinal y la muerte por bacteriemia y sepsis. El síndrome hematopoyético generalmente prevalece con las dosis más bajas de radiación y conduce a una muerte más tardía que el síndrome GI.

En el pasado, los radioprotectores eran normalmente antioxidantes, tanto sintéticos como naturales. Más recientemente, se han añadido citocinas y factores de crecimiento a la lista de radioprotectores; se considera que el mecanismo de su radioprotección es el resultado de facilitar los efectos sobre la regeneración de los tejidos sensibles. No existe una distinción funcional clara entre ambos grupos de radioprotectores, sin embargo, algunas citocinas inducen la expresión de las proteínas antioxidantes celulares, tales como la superóxido dismutasa de manganeso (MnSOD) y la metalotioneína.

La medida de protección para un agente particular puede expresarse por el factor de modificación de la dosis (DMF o DRF). El DMF se determina irradiando el sujeto tratado con radioprotector y los sujetos de control no tratados con un intervalo de dosis de radiación y luego comparando la supervivencia u otros criterios de valoración finales. El DMF se calcula comúnmente para una supervivencia de 30 días (LD50/30 tratados con fármaco dividida por LD50/30 tratados con vehículo) y cuantifica la protección del sistema hematopoyético. Para estimar la protección del sistema gastrointestinal, se calculan LD50 y DMF para una supervivencia de 6 o 7 días.

Las composiciones relacionadas con la flagelina descritas en el presente documento poseen una fuerte actividad pro supervivencia a nivel celular y en el organismo en su conjunto. En respuesta a dosis superletales de radiación, las composiciones relacionadas con la flagelina descritas en el presente documento pueden inhibir los síndromes gastrointestinal y hematopoyético, que son las principales causas de muerte por exposición aguda a la radiación. Como resultado de estas propiedades, las composiciones relacionadas con la flagelina descritas en el presente documento pueden usarse para tratar los efectos de los eventos de radiación natural y los accidentes nucleares. Además, las composiciones relacionadas con la flagelina descritas en el presente documento pueden usarse en combinación con otros radioprotectores y, de este modo, aumentando drásticamente la escala de protección contra la radiación ionizante.

A diferencia de los agentes radioprotectores convencionales (p. ej. secuestrantes de radicales libres), los agentes antiapoptóticos pueden no reducir el daño primario mediado por la radiación, pero pueden actuar contra eventos secundarios que implican una reacción celular activa en el daño primario, complementando así las líneas de defensa existentes. La alfa-pifitrina, un inhibidor farmacológico de p53 (un mediador clave de la respuesta a la radiación en las células de mamíferos), es un ejemplo de esta nueva clase de radioprotectores. Sin embargo, la actividad de los inhibidores de p53 se limita a la protección del sistema hematopoyético y no tiene efecto protector en el tracto digestivo (síndrome gastrointestinal), reduciendo así el valor terapéutico de estos compuestos.

Las composiciones relacionadas con la flagelina descritas en el presente documento pueden usarse como un agente radioprotector para ampliar el intervalo de dosis de radiación tolerables aumentando la radiorresistencia de los seres humanos más allá de los niveles alcanzables por las medidas disponibles actualmente (protección y aplicación de agentes bioprotectores existentes) y aumentar drásticamente las posibilidades de supervivencia de la tripulación en caso de accidentes nucleares o eventos de partículas solares a gran escala, por ejemplo.

Las composiciones relacionadas con la flagelina descritas en el presente documento también son útiles para tratar la pérdida celular irremplazable causada por irradiación de baja dosis, por ejemplo, en el sistema nervioso central y los órganos reproductores. Las composiciones relacionadas con la flagelina descritas en el presente documento también pueden usarse durante la quimioterapia contra el cáncer para tratar los efectos secundarios asociados con la quimioterapia, incluyendo alopecia, mielosupresión, toxicidad renal, pérdida de peso, dolor, náuseas, vómitos, diarrea, estreñimiento, anemia, desnutrición, caída del cabello, entumecimiento, alteración del gusto, pérdida de apetito, cabello fino o frágil, úlceras bucales, pérdida de memoria, hemorragia, cardiotoxicidad, hepatotoxicidad, ototoxicidad, y deterioro cognitivo asociado a la quimioterapia.

En una realización, un mamífero se trata por una exposición a la radiación, que comprende administrar al mamífero una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición relacionada con la flagelina. La composición relacionada con la flagelina se puede administrar en combinación con uno o más radioprotectores. El uno o más radioprotectores pueden ser cualquier agente que trate los efectos de la exposición a la radiación, pero sin limitación, antioxidantes, secuestrantes de radicales libres y citocinas.

Las composiciones relacionadas con la flagelina descritas en el presente documento pueden inhibir la muerte celular programada inducida por radiación en respuesta al daño en el ADN y otras estructuras celulares. En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina descritas en el presente documento pueden no tratar el daño a nivel celular y pueden no prevenir mutaciones. Los radicales libres y las especies reactivas de oxígeno (ROS) son la principal causa de mutaciones y otros daños intracelulares. Los antioxidantes y los secuestrantes de radicales libres son efectivos para prevenir el daño de los radicales libres. La combinación de una composición relacionada con la flagelina y un antioxidante o secuestrante de radicales libres puede provocar lesiones menos extensas, una mayor supervivencia y una mejor salud para los mamíferos expuestos a la radiación. Los antioxidantes y los secuestrantes de radicales libres que pueden usarse en la práctica de la invención incluyen, pero sin limitación, tioles, tales como cisteína, cisteamina, glutatión y bilirrubina; amifostina (WR-2721); vitamina A; vitamina C; vitamina E; y flavonoides tales como la albahaca sagrada (Ocimum sanctum), orientina y vicenina.

Las composiciones relacionadas con la flagelina descritas en el presente documento también pueden administrarse en combinación con una serie de citocinas y factores de crecimiento que confieren radioprotección al reponer y/o proteger las poblaciones de células madre radiosensibles. La radioprotección con efectos secundarios mínimos se puede lograr mediante el uso del factor de células madre (SCF, ligando c-kit), ligando Flt-3, y el fragmento IL-1b-rd de interleucina-1. La protección se puede lograr mediante la inducción de la proliferación de células madre (todas las citocinas mencionadas) y la prevención de su apoptosis (SCF). El tratamiento permite la acumulación de leucocitos y sus precursores antes de la irradiación, lo que permite una reconstitución más rápida del sistema inmunitario después de la irradiación. SCF rescata eficazmente ratones irradiados letalmente con DMF en el intervalo 1,3-1,35 y también es eficaz contra el síndrome gastrointestinal. El ligando Flt-3 también proporciona una fuerte protección en ratones y conejos.

Varios factores, aunque no son citocinas por naturaleza, estimulan la proliferación de los inmunocitos y pueden usarse en combinación con las composiciones relacionadas con la flagelina descritas en el presente documento. Por ejemplo, 5-AED (5-androstenediol) es un esteroide que estimula la expresión de citocinas y aumenta la resistencia a las infecciones bacterianas y virales. Los compuestos sintéticos, tales como el tri-cloro(dioxoetilen-O,O'-)telurato de amonio (AS-101), también pueden usarse para inducir la secreción de numerosas citocinas y para la combinación con las composiciones relacionadas con la flagelina descritas en el presente documento.

Los factores de crecimiento y las citocinas también pueden usarse para proporcionar protección contra el síndrome gastrointestinal. El factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) promueve la proliferación y diferenciación en la mucosa intestinal, y aumenta la supervivencia celular posterior a la irradiación en las criptas intestinales. La citocina hematopoyética y el SCF radioprotector también pueden aumentar la supervivencia de las células madre intestinales y la supervivencia de los organismos a corto plazo asociada.

Las composiciones relacionadas con la flagelina descritas en el presente documento pueden ofrecer protección contra los síndromes gastrointestinal (GI) y hematopoyético. Dichas composiciones pueden usarse en combinación con uno o más inhibidores del síndrome GI (incluyendo, pero sin limitación, citocinas tales como SCF y KGF).

La composición relacionada con la flagelina se puede administrar en cualquier momento antes de la exposición a la radiación incluyendo, pero sin limitación, aproximadamente 48 h, aproximadamente 46 h, aproximadamente 44 h, aproximadamente 42 h, aproximadamente 40 h, aproximadamente 38 h, aproximadamente 36 h, aproximadamente 34 h, aproximadamente 32 h, aproximadamente 30 h, aproximadamente 28 h, aproximadamente 26 h, aproximadamente 24 h, aproximadamente 22 h, aproximadamente 20 h, aproximadamente 18 h, aproximadamente 16 h, aproximadamente 14 h, aproximadamente 12 h, aproximadamente 10 h, aproximadamente 8 h, aproximadamente 6 h, aproximadamente 4 h, aproximadamente 3 h, aproximadamente 2 h, o aproximadamente 1 h antes de la exposición. La composición relacionada con la flagelina se puede administrar en cualquier momento después de la exposición a la radiación incluyendo, pero sin limitación, aproximadamente 1 h, aproximadamente 2 h, aproximadamente 3 h, aproximadamente 4 h, aproximadamente 6 h, aproximadamente 8 h, aproximadamente 10 h, aproximadamente 12 h, aproximadamente 14 h, aproximadamente 16 h, aproximadamente 18 h, aproximadamente 20 h, aproximadamente 22 h, aproximadamente 24 h, aproximadamente 26 h, aproximadamente 28 h, aproximadamente 30 h, aproximadamente 32 h, aproximadamente 34 h, aproximadamente 36 h, aproximadamente 38 h, aproximadamente 40 h, aproximadamente 42 h, aproximadamente 44 h, aproximadamente 46 h, o aproximadamente 48 h después de la exposición a la radiación.

En diversas realizaciones, los presentes métodos y composiciones proporcionan tratamiento o prevención de trastornos relacionados con la radiación, tales como el ARS (síndrome de irradiación aguda). En diversas realizaciones, los tratamientos descritos en el presente documento reducen la morbilidad o mortalidad de una población de pacientes humanos expuesta o acelera la recuperación de los síntomas del ARS. El ARS a menudo se presenta como una secuencia de síntomas escalonados, que pueden variar con la sensibilidad a la radiación individual, el tipo de radiación y la dosis de radiación absorbida. Generalmente, sin desear quedar ligado a la teoría, la magnitud de los síntomas aumentará y la duración de cada fase se acortará al aumentar la dosis de radiación. El ARS se puede dividir en tres fases: fase prodrómica (también conocida como etapa N-V-D), período latente y enfermedad manifiesta. En diversas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales), como se describe en el presente documento, se pueden administrar a un paciente humano en una cualquiera de estas tres etapas (es decir, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) pueden administrarse a un paciente humano en la fase prodrómica, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) pueden administrarse a un paciente humano en un período latente, o las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) pueden administrarse a un paciente humano en estado de enfermedad manifiesta).

En la fase prodrómica a menudo hay un inicio relativamente rápido de náuseas, vómitos y malestar. El uso de antieméticos, (p. ej. antieméticos profilácticos orales) tales como granisetrón (KYTRIL), ondansetrón (ZOFRAN) y bloqueadores de 5-HT3 con o sin dexametasona, puede estar indicado en situaciones en las que se ha producido, es probable, o es inevitable una exposición radiológica a altas dosis. En consecuencia, en diversas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) pueden administrarse a un paciente humano que recibe un agente antiemético o CBLB502 puede administrarse a un paciente humano en combinación con un agente antiemético. Por ejemplo, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) también se pueden agregar a los siguientes regímenes antieméticos: Ondansetrón: inicialmente 0,15 mg/kg IV; una opción de dosis IV continua consiste en 8 mg seguido de 1 mg/h durante las siguientes 24 horas. La dosis oral es de 8 mg cada 8 horas según sea necesario o Granisetrón (forma farmacéutica oral): la dosis inicial es habitualmente 1 mg, a continuación se repite 12 horas después de la primera dosis. Como alternativa, se pueden tomar 2 mg como una dosis. La dosis IV se basa en el peso corporal; normalmente 10 pg/kg (4,5 pg/lb) de peso corporal.

En el periodo latente, un paciente humano puede estar relativamente libre de síntomas. La duración de esta fase varía con la dosis. La fase latente es la más larga y precede a la depresión de la médula ósea del síndrome hematopoyético y puede variar entre aproximadamente 2 y 6 semanas. El período latente es algo más corto antes del síndrome gastrointestinal, y dura de unos pocos días a una semana. El más corto de todos es el que precede al síndrome neurovascular, y dura solo unas pocas horas. Estos tiempos son variables y pueden modificarse por la presencia de otra enfermedad o lesión. La enfermedad manifiesta se presenta con los síntomas clínicos asociados con el sistema de órganos principales lesionado (médula, intestinal, neurovascular).

En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a la mitigación de, o protección de las células de, los efectos de la exposición a la radiación. En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a un método para mitigar y/o proteger a un paciente humano de la radiación que comprende administrar las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales). En algunas realizaciones, la radiación es radiación ionizante. En algunas realizaciones, la radiación ionizante es suficiente para causar un síndrome gastrointestinal o un síndrome hematopoyético.

En algunas realizaciones, el ARS comprende uno de más de síndrome gastrointestinal; síndrome hematopoyético; síndrome neurovascular; daño en el tejido mediado por apoptosis, en donde la apoptosis es opcionalmente atribuible al estrés celular; y daño en el tejido por apoptosis inducida por radiación ionizante.

El síndrome hematopoyético (también conocido como síndrome de la médula ósea) se caracteriza por la pérdida de células hematopoyéticas y sus progenitores, lo que imposibilita la regeneración del sistema sanguíneo y linfoide. Este síndrome a menudo se caracteriza por una disminución del número de células sanguíneas, es decir, anemia aplásica. Esto puede provocar infecciones (p.ej. infecciones oportunistas) debido a un número bajo de glóbulos blancos, hemorragia debido a la falta de plaquetas y anemia debido a un número pequeño de glóbulos rojos en la circulación. Estos cambios pueden detectarse mediante análisis de sangre después de recibir una dosis aguda en todo el cuerpo. El traumatismo convencional y las quemaduras resultantes de la explosión de una bomba se complican por la mala cicatrización de la herida causada por el síndrome hematopoyético, aumentando la mortalidad. La muerte puede ocurrir como consecuencia de una infección (resultado de la inmunosupresión), hemorragia y/o anemia. El síndrome hematopoyético generalmente prevalece con las dosis más bajas de radiación y conduce a una muerte más tardía que el síndrome GI.

El síndrome gastrointestinal está causado por la muerte celular masiva en el epitelio intestinal, predominantemente en el intestino delgado, seguido de la desintegración de la pared intestinal y la muerte por bacteriemia y sepsis. Los síntomas de esta forma de lesión por radiación incluyen náuseas, vómitos, pérdida de apetito, pérdida de capacidad de absorción, hemorragia en áreas desnudas, y dolor abdominal. Los efectos sistémicos ilustrativos del síndrome gastrointestinal incluyen desnutrición, deshidratación, insuficiencia renal, anemia, sepsis, etc. Sin tratamiento (incluyendo, por ejemplo, trasplante de médula ósea), la muerte es frecuente (p. ej. por una infección por bacterias intestinales). En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales), se pueden usarse en combinación con trasplante de médula ósea. En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales), pueden usarse en combinación con uno o más inhibidores del síndrome GI y/o cualquiera de los agentes adicionales descritos en el presente documento.

El síndrome neurovascular se presenta con síntomas neurológicos como mareos, dolor de cabeza o disminución del nivel de consciencia, que se produce en cuestión de minutos a unas pocas horas y con ausencia de vómitos. Los síntomas adicionales incluyen nerviosismo extremo y confusión; náuseas severas, vómitos y diarrea acuosa; pérdida de consciencia; y sensaciones de ardor en la piel. El síndrome neurovascular es frecuentemente fatal.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para reducir el riesgo de muerte después de la exposición a la irradiación que comprende administrar una cantidad eficaz de las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales). En algunas realizaciones, la radiación es potencialmente letal y, opcionalmente, ocurre como resultado de un desastre por radiación. En diversas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) se administran aproximadamente 25 horas después de la exposición a la radiación. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para reducir el riesgo de muerte después de la exposición a irradiación potencialmente letal que se produce como resultado de un desastre por radiación, que comprende administrar las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) aproximadamente 25 horas después de la exposición a la radiación.

En diversas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) se administran a un paciente que ha estado expuesto a una dosis alta de radiación, concretamente una dosis en el cuerpo entero. En diversas realizaciones, la dosis alta de radiación puede no ser uniforme. En diversas realizaciones, el ARS es el resultado de una alta dosis de radiación. En diversas realizaciones, la alta dosis de radiación es de aproximadamente 2,0 Gy, o aproximadamente 2,5 Gy, o aproximadamente 3,0 Gy, o aproximadamente 3,5 Gy, o aproximadamente 4,0 Gy, o aproximadamente 4,5 Gy, o aproximadamente 5 Gy, o aproximadamente 10 Gy, o aproximadamente 15 Gy, o aproximadamente 20 Gy, o aproximadamente 25 Gy, o aproximadamente 30 Gy. En diversas realizaciones, la dosis alta de radiación es de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 Gy, o de aproximadamente 10 a 25 Gy, o de aproximadamente 15 a 20 Gy. En algunas realizaciones, la dosis alta de radiación se evalúa mediante uno o más de dosimetría física y/o dosimetría biológica (p. ej. evaluaciones de dosis multiparamétricas), análisis citogénico (p.ej. análisis cromosómico para, por ejemplo, muestras de sangre (incluyendo, mediante un ejemplo no limitativo, análisis dicéntrico). En diversas realizaciones, las dosis de radiación de todo el cuerpo se pueden dividir en subletal (<2 Gy), potencialmente letal (2-10 Gy) y supraletal (> 10 Gy).

Lesiones por reperfusión

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a un método de tratamiento de los efectos de la reperfusión en un tejido del sujeto que comprende administrar las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) descritas en el presente documento. Las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) descritas en el presente documento se pueden administrar en combinación con un antioxidante, tales como, por ejemplo, amifostina y vitamina E.

La reperfusión puede estar causada por una lesión, la cual puede ser isquemia o hipoxia. La isquemia puede ser el resultado de una afección, tal como, por ejemplo, taquicardia, infarto, hipotensión, embolia, tromboembolismo (coágulo de sangre), enfermedad de células falciformes, presión localizada en las extremidades del cuerpo, y tumores. La hipoxia puede seleccionarse de hipoxia hipoxémica (envenenamiento por monóxido de carbono; apnea del sueño, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, parada respiratoria; derivaciones), hipoxia anémica (bajo contenido de O²), hipoxia hipoxémica, e hipoxia histotóxica. La presión localizada puede deberse a un torniquete.

Las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) descritas en el presente documento pueden administrarse antes de, junto con, o después del suministro de oxígeno. El tejido puede ser por ejemplo, el tracto GI, pulmón, riñón, hígado, el sistema cardiovascular, endotelio de los vasos sanguíneos, sistema nervioso central, sistema nervioso periférico, músculo, hueso y folículo piloso.

La reperfusión puede dañar un componente del cuerpo cuando la irrigación sanguínea vuelve al componente del cuerpo después de la lesión. Los efectos de la reperfusión pueden ser más dañinos para el componente del cuerpo que la propia lesión. Existen varios mecanismos y mediadores de la reperfusión incluyendo, por ejemplo, radicales libres de oxígeno, sobrecarga intracelular de calcio y disfunción endotelial. Las cantidades excesivas de especies reactivas de oxígeno, cuando se reintroducen en un componente corporal previamente lesionado, sufren una reducción secuencial que conduce a la formación de radicales libres de oxígeno. Los radicales oxidantes potentes, tal como el anión superóxido, el radical hidroxilo y el peroxinitrito pueden producirse en los primeros minutos de reflujo al componente corporal y pueden desempeñar un papel crucial en el desarrollo de la lesión por reperfusión. Los radicales libres de oxígeno también pueden generarse a partir de fuentes distintas a la reducción de oxígeno molecular. Estas fuentes incluyen enzimas, tales como, por ejemplo, xantina oxidasa, citocromo oxidasa y ciclooxigenasa, y la oxidación de catecolaminas.

La reperfusión también es un potente estímulo para la activación y acumulación de neutrófilos, que a su vez sirven como potentes estímulos para la producción de especies reactivas de oxígeno. En concreto, los principales productos del estallido respiratorio de neutrófilos son agentes oxidantes fuertes que incluyen peróxido de hidrógeno, radicales libres de oxígeno e hipoclorito. Los neutrófilos son el tipo de fagocito más abundante, normalmente representan del 50 al 60 % de los leucocitos circulantes totales, y generalmente son las primeras células en llegar al sitio del componente corporal lesionado. Los radicales libres derivados del oxígeno producen daños al reaccionar con ácidos grasos poliinsaturados, lo que da como resultado la formación de peróxidos e hidroperóxidos lipídicos que dañan el componente del cuerpo y deterioran la función de los sistemas enzimáticos unidos a la membrana. Los radicales libres estimulan la liberación endotelial del factor activador de plaquetas y las quimiocinas como el factor activador de neutrófilos, el ligando 1 de quimiocina (motivo C-X-C) y el ligando 1 de quimiocina (motivo CXC) que atrae más neutrófilos y amplifica la producción de radicales oxidantes y el grado de lesión por reperfusión. Las especies reactivas de oxígeno también inactivan el óxido nítrico, exacerbando la lesión endotelial y la disfunción de las células del tejido. Además de una mayor producción, también hay una deficiencia relativa en las enzimas secuestrantes de oxidantes endógenos, lo que exacerba aún más la disfunción cardíaca mediada por radicales libres.

La reperfusión puede tener como resultado una marcada disfunción de las células endoteliales. La disfunción endotelial facilita la expresión de un fenotipo protrombótico caracterizado por la activación de plaquetas y neutrófilos, mediadores importantes de la reperfusión. Una vez que los neutrófilos entran en contacto con el endotelio disfuncional, se activan y, en una serie de etapas bien definidas (rodadura, adherencia firme y transmigración) migran a áreas de lesión tisular a través de uniones de células endoteliales como parte de la respuesta inmunitaria innata.

Los cambios en la homeostasis del calcio intracelular juegan un papel importante en el desarrollo de la reperfusión. La reperfusión puede estar asociada con un aumento de calcio intracelular; este efecto puede estar relacionado con una mayor entrada de calcio sarcolemal a través de canales de calcio tipo L o puede ser secundario a alteraciones en el ciclo del calcio en el retículo sarcoplásmico. Además de la carga de calcio intracelular, se han asociado a la reperfusión las alteraciones en la sensibilidad de los miofilamentos al calcio. Se ha sugerido que la activación de proteasas dependientes de calcio (calpaína I) con la proteólisis de miofibrillas resultante refuerza la lesión por reperfusión, al igual que la proteólisis de troponina.

La reperfusión de células de tejido sometidas a una lesión está asociada a un metabolismo celular alterado, lo que a su vez puede contribuir al retraso en la recuperación funcional. Por ejemplo, una lesión puede inducir el metabolismo anaerobio en la célula con una producción neta de lactato. La liberación de lactato persiste durante la reperfusión, lo que sugiere un retraso en la recuperación del metabolismo aerobio normal. Igualmente, la actividad de la piruvato deshidrogenasa mitocondrial (PDH) puede inhibirse hasta en un 40 % después de una lesión y puede permanecer deprimida hasta 30 minutos después de la reperfusión.

Cada uno de estos eventos durante la reperfusión puede provocar estrés en las células del tejido y la muerte celular programada (apoptosis) y necrosis de las células del tejido. La apoptosis normalmente funciona para "limpiar" los tejidos de las células heridas y dañadas genéticamente, mientras que las citocinas sirven para movilizar el sistema de defensa del organismo contra el patógeno. Sin embargo, en condiciones de lesiones graves, ambos mecanismos de respuesta al estrés pueden por sí mismos actuar como causas de muerte.

En diversas realizaciones, los efectos de la reperfusión pueden ser causados por una lesión en el cuerpo. La lesión puede deberse a isquemia, hipoxia, un infarto, o una embolia. El tratamiento de la lesión puede conducir a reperfusión y daño adicional al componente del cuerpo.

La isquemia puede ser una ausencia absoluta o relativa de irrigación sanguínea a un componente del cuerpo. La ausencia relativa puede ser un desajuste, por pequeño que sea, de irrigación sanguínea (suministro de oxígeno) a un componente del cuerpo frente a la sangre requerida por un componente del cuerpo para la oxigenación adecuada. La isquemia también puede ser un flujo inadecuado de sangre a una parte del cuerpo debido a una constricción o bloqueo de los vasos sanguíneos que lo irrigan y puede afectar a cualquier componente del cuerpo. Una irrigación insuficiente de sangre hace que los componentes del cuerpo se vuelvan hipóxicos o, si no se suministra oxígeno en absoluto, anóxicos. Esto puede causar necrosis. Los mecanismos de la isquemia pueden variar mucho. Por ejemplo, La isquemia a cualquier componente del cuerpo puede deberse a taquicardia (latidos anormalmente rápidos del corazón), aterosclerosis (placa cargada de lípidos que obstruye la luz de las arterias), hipotensión (presión arterial baja en choque séptico, insuficiencia cardíaca), tromboembolismo (coágulos de sangre), compresión externa de los vasos sanguíneos (tumor), embolias (cuerpos extraños en la circulación, p. ej., embolia del fluido amniótico), enfermedad de células falciformes (hemoglobina de forma anormal), infartos, fuerzas g inducidas que restringen el flujo sanguíneo y fuerzan la sangre a las extremidades del cuerpo, frío extremo localizado debido a congelación, hielo, terapia de compresión de frío inadecuada y cualquier otra fuerza que restrinja el flujo de sangre a las extremidades, tal como un torniquete. La fuerza para restringir el flujo de sangre a las extremidades puede ser necesaria debido a laceraciones severas, incisiones, punciones como apuñalamiento, lesiones por aplastamiento debido a un traumatismo por fuerza contundente y traumatismos balísticos debido a heridas de bala o de metralla. La isquemia puede ser una característica de enfermedades cardíacas, colitis isquémica, episodios isquémicos transitorios, accidentes cerebrovasculares, lesión renal aguda, malformaciones arteriovenosas rotas y enfermedad oclusiva de la arteria periférica.

La hipoxia puede ser una privación del suministro adecuado de oxígeno. La hipoxia puede ser una afección patológica en la cual el cuerpo como un todo (hipoxia generalizada) o una región del cuerpo (hipoxia tisular) se ve privado de un suministro adecuado de oxígeno. Una variación en los niveles de oxígeno arterial puede deberse a un desajuste entre el suministro y la demanda de oxígeno por parte de los componentes del cuerpo. Una privación completa del suministro de oxígeno es la anoxia. La hipoxia puede ser hipoxia hipoxémica, hipoxia anémica, hipoxia hipoxémica, hipoxia histotóxica, hipoxia histotóxica, e hipoxia isquémica.

La hipoxia hipoxémica puede ser un suministro inadecuado de oxígeno al cuerpo en su conjunto causado por la baja presión parcial de oxígeno en la sangre arterial. La hipoxia hipoxémica puede deberse a una presión parcial baja de oxígeno atmosférico, tal como sucede a grandes altitudes, al reemplazo de oxígeno en la mezcla respiratoria de una atmósfera modificada, tal como en una alcantarilla, al reemplazo de oxígeno intencionalmente como en el uso recreativo de óxido nitroso, a una disminución de la saturación de oxígeno de la sangre debido a la apnea del sueño o hipopnea, a una ventilación pulmonar inadecuada tal como enfermedad pulmonar obstructiva crónica o parada respiratoria, derivaciones anatómicas o mecánicas en la circulación pulmonar o una derivación de derecha a izquierda en el corazón y el pulmón. Las derivaciones pueden causar alvéolos colapsados que todavía están perfundidos o un bloqueo en la ventilación a un área del pulmón. Las derivaciones pueden presentar sangre destinada a que el sistema pulmonar no se ventile y evitar el intercambio de gases porque los vasos sanguíneos se vacían en el ventrículo izquierdo y la circulación bronquial, que suministra oxígeno a los bronquios.

En la anemia por hipoxia puede ser que el contenido total de oxígeno se reduzca, pero la presión arterial de oxígeno sea normal. La hipoxia hipoxémica puede ocurrir cuando la sangre no puede suministrar oxígeno a los componentes del cuerpo diana. La hipoxia hipoxémica puede ser causada por el envenenamiento por monóxido de carbono que inhibe la capacidad de la hemoglobina para liberar el oxígeno unido a ella, o metahemoglobinemia, una hemoglobina anormal que se acumula en la sangre. La hipoxia histotóxica puede deberse a la incapacidad de utilizar eficazmente el oxígeno debido a la desactivación de las enzimas de la fosforilación oxidativa.

El infarto es un tipo de afección patológica que puede causar isquemia. El infarto puede ser un área macroscópica de tejido necrótico que provocó la pérdida de una irrigación sanguínea adecuada debido a una oclusión. El infarto puede ser un infarto blanco compuesto de plaquetas y causar necrosis en tejidos orgánicos tales como el corazón, el bazo y los riñones. El infarto puede ser un infarto rojo compuesto de glóbulos rojos y hebras de fibrina en los tejidos orgánicos del pulmón. La enfermedad asociada con el infarto puede incluir infarto de miocardio, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular (ictus), insuficiencia renal aguda, enfermedad oclusiva de la arteria periférica (por ejemplo, gangrena), síndrome antifosfolípido, sepsis, artritis de células gigantes, hernia y vólvulo.

La embolia es un tipo de afección patológica que puede causar isquemia. La embolia puede ser un objeto que migra de una parte del cuerpo y causa una oclusión o bloqueo de un vaso sanguíneo en otra parte del cuerpo. Una embolia puede ser tromboembolismo, embolia grasa, embolia gaseosa, embolia séptica, embolia tisular, embolia por cuerpo extraño, embolia de líquido amniótico. El tromboembolismo puede ser un coágulo de sangre que se separa total o parcialmente del sitio de la trombosis. La embolia grasa puede ser tejido graso endógeno que escapa a la circulación sanguínea. La fractura de huesos es un ejemplo de una fuga de tejido adiposo en los vasos y arterias rotas. La embolia gaseosa puede ser una ruptura de alvéolos y aire inhalado que se filtra a los vasos sanguíneos. La punción de la vena subclavia o la terapia intravenosa son ejemplos de fugas de aire en los vasos sanguíneos. Una embolia gaseosa puede deberse a gases tales como el nitrógeno y el helio debido a que son insolubles y forman pequeñas burbujas en la sangre.

Sales y excipientes farmacéuticamente aceptables

Las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) descritas en el presente documento pueden poseer un grupo suficientemente básico, que puede reaccionar con un ácido inorgánico u orgánico, o un grupo carboxilo, que puede reaccionar con una base inorgánica u orgánica, para formar una sal farmacéuticamente aceptable. Una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable se forma a partir de un ácido farmacéuticamente aceptable, como se sabe bien en la técnica. Dichas sales incluyen las sales farmacéuticamente aceptables citadas en, por ejemplo, Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19 (1977) y The Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection, and Use. P. H. Stahl and C. G. Wermuth (eds.), Verlag, Zurich (Suiza) 2002.

Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, a modo de ejemplo no limitante, sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato de ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato de ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, ptoluenosulfonato, alcanforsulfonato, pamoato, fenilacetato, trifluoroacetato, acrilato, clorobenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, metilbenzoato, o-acetoxibenzoato, naftalen-2-benzoato, isobutirato, fenilbutirato, ahidroxibutirato, butin-1,4-dicarboxilato, hexin-1,4-dicarboxilato, caprato, caprilato, cinamato, glicolato, heptanoato, hipurato, malato, hidroximaleato, malonato, mandelato, mesilato, nicotinato, ftalato, tereftalato, propiolato, propionato, fenilpropionato, sebacato, suberato, p-bromobencenosulfonato, clorobencenosulfonato, etilsulfonato, 2-hidroxietilsulfonato, metilsulfonato, naftalen-1-sulfonato, naftalen-2-sulfonato, naftalen-1,5-sulfonato, xilensulfonato, y tartrato.

La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" también se refiere a una sal de las composiciones de la presente invención que tiene un grupo funcional ácido, tal como un grupo funcional ácido carboxílico, y una base. Las bases adecuadas incluyen, pero sin limitación, hidróxidos de metales alcalinos, tales como sodio, potasio y litio; hidróxidos de metal alcalinotérreo, tales como calcio y magnesio; hidróxidos de otros metales, tales como aluminio y cinc; amoniaco y aminas orgánicas, tales como mono-, di-, o tri-alquilaminas sustituidas con hidroxi, diciclohexilamina; tributilamina; piridina; N-metilamina, N-etilamina; dietilamina; trietilamina; mono-, bis-, o tris-(2-OH-alquilaminas inferiores), tales como mono-; bis- o tris-(2-hidroxietil)amina, 2-hidroxi-ferc-butilamina, o tris-(hidroximetil)metilamina, N,N-di-alquil inferior-N-(hidroxil-alquil inferior)-aminas, tales como N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)amina o tri- (2-hidroxietil)amina; N-metil-D-glucamina; y aminoácidos, tales como arginina, lisina, y similares.

En algunas realizaciones, los compuestos descritos en el presente documento están en forma de una sal farmacéuticamente aceptable.

Además, cualquier composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento se puede administrar como un componente de una composición que comprende un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden comprender opcionalmente una cantidad adecuada de un excipiente farmacéuticamente aceptable para proporcionar la forma de administración adecuada.

Los excipientes farmacéuticos pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, incluidos aquellos de origen en el petróleo, animal, vegetal, o de origen sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Los excipientes farmacéuticos pueden ser, por ejemplo, solución salina, goma arábiga, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea y similares. Además, se pueden usar agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. En una realización, los excipientes farmacéuticamente aceptables son estériles cuando se administran a un sujeto. El agua es un excipiente útil cuando cualquier agente descrito en el presente documento se administra por vía intravenosa. Se pueden emplear también soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como excipientes líquidos, específicamente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados también incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Cualquier agente descrito en el presente documento, si se desea, también puede comprender cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH.

Formulaciones, administración, dosificación y regímenes de tratamiento

La presente invención incluye las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) descritas en diversas formulaciones. Cualquier composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento puede adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, gotas, comprimidos, píldoras, microgránulos, cápsulas, cápsulas que contienen líquidos, polvos, formulaciones de liberación continua, supositorios, emulsiones, aerosoles, pulverizaciones, suspensiones, o cualquier otra forma adecuada para su uso. En una realización, la composición está en forma de una cápsula (véase, p. ej., la Patente de EE. UU. N.° 5.698.155). Otros ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 1447 1676 (Alfonso R. Gennaro eds., 19th ed. 1995).

Cuando sea necesario, la composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) también incluye un agente solubilizante. También, los agentes pueden administrarse con un vehículo o dispositivo de administración adecuado como se conoce en la técnica. Las terapias combinadas descritas en el presente documento pueden administrarse conjuntamente en un solo vehículo de administración o dispositivo de administración. Las composiciones para administración pueden incluir opcionalmente un anestésico local tal como, por ejemplo, lignocaína para disminuir el dolor en el sitio de la inyección.

Las formulaciones que comprenden las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) de la presente invención pueden presentarse convenientemente en formas farmacéuticas unitarias y pueden prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Tales métodos generalmente incluyen la etapa de asociar los agentes terapéuticos con un vehículo, que constituye uno o más ingredientes accesorios. Normalmente, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima el agente terapéutico con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido o ambos, y después, si fuera necesario, moldeando el producto en formas farmacéuticas de la formulación deseada (p. ej., granulación en húmedo o en seco, mezclas de polvo, etc., seguido de la formación de comprimidos usando métodos convencionales conocidos en la técnica)

En una realización, cualquier composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición adaptada para un modo de administración descrito en el presente documento.

Las vías de administración incluyen, por ejemplo: intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, oral, sublingual, intranasal, intracerebral, intravaginal, transdérmica, rectal, por inhalación o por vía tópica, particularmente en los oídos, la nariz, los ojos, o la piel. En algunas realizaciones, la administración se realiza por vía oral o por inyección parenteral. El modo de administración puede dejarse a discreción del profesional y depende en parte del sitio de la afección médica. En la mayoría de los casos, la administración da como resultado la liberación de cualquier agente descrito en el presente documento en el torrente sanguíneo.

Cualquier composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento puede administrarse por vía oral. Dichas composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) también se pueden administrar por cualquier otra vía conveniente, por ejemplo, por infusión intravenosa o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (p. ej., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otro agente biológicamente activo. La administración puede ser sistémica o local. Se conocen varios sistemas de administración, p.ej., encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, cápsulas, etc., y se pueden usar para la administración.

En realizaciones específicas, puede ser deseable administrar localmente en el área que necesita tratamiento.

En una realización, cualquier composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición adaptada para un modo de administración oral a seres humanos. Las composiciones para la administración oral pueden estar en la forma de comprimidos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleaginosas, gránulos, polvos, emulsiones, cápsulas, jarabes o elixires, por ejemplo. Las composiciones administradas por vía oral pueden comprender uno o más agentes, por ejemplo, agentes edulcorantes tales como fructosa, aspartamo o sacarina; agentes aromatizantes tales como menta piperita, aceite de gaulteria o cereza; agentes colorantes; y agentes conservantes, para proporcionar una preparación farmacéutica agradable al paladar. Además, cuando están en forma de comprimido o píldora, las composiciones pueden revestirse para retrasar la disgregación y la absorción en el tracto gastrointestinal proporcionando por tanto una acción sostenida durante un periodo prolongado de tiempo. Las membranas selectivamente permeables circundantes con actividad osmótica que impulsa cualquier composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento también son adecuadas para composiciones administradas por vía oral. En estas últimas plataformas, el fluido del entorno que rodea la cápsula se absorbe por el compuesto impulsor, que se hincha para desplazar el agente o composición de agente a través de una apertura. Estas plataformas de administración pueden proporcionar un perfil de liberación de orden prácticamente cero en oposición a los perfiles enriquecidos de las formulaciones de liberación inmediata. También pueden ser útil un material de retraso en el tiempo tal como monoestearato de glicerol o estearato de glicerol. Las composiciones orales pueden incluir excipientes convencionales tales como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, y carbonato de magnesio. En una realización, los excipientes son de calidad farmacéutica. Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión tales como, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar, tragacanto, etc., y mezclas de los mismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para administración parenteral (p. ej. intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea e inyección intra-articular e infusión) incluyen, por ejemplo, soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones y similares. También se pueden fabricar en forma de composiciones estériles sólidas (p. ej. composición liofilizada), que se pueden disolver o suspender en un medio inyectable estéril inmediatamente antes de su uso. Pueden contener, por ejemplo, agentes de suspensión o dispersantes conocidos en la técnica.

La dosificación de cualquier composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento, así como el esquema posológico pueden depender de varios parámetros, incluyendo, pero sin limitación, la enfermedad que se está tratando, la salud general del sujeto, y a discreción del médico responsable de la administración. Cualquier agente descrito en el presente documento, puede administrarse antes de (p. ej., aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas, aproximadamente 96 horas, aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, o aproximadamente 12 semanas antes), simultáneamente con, o posteriormente a (p. ej., aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas, aproximadamente 96 horas, aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, o aproximadamente 12 semanas después de) la administración de un agente terapéutico adicional, a un sujeto que lo necesite. En diversas realizaciones, cualquier agente descrito en el presente documento se administra con aproximadamente 1 minuto de diferencia, aproximadamente 10 minutos de diferencia, aproximadamente 30 minutos de diferencia, menos de aproximadamente 1 hora de diferencia, aproximadamente 1 hora de diferencia, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas de diferencia, de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas de diferencia, de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas de diferencia, de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas de diferencia, de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas de diferencia, de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas de diferencia, de aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas de diferencia, de aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas de diferencia, de aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas de diferencia, de aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas de diferencia, de aproximadamente 11 horas a aproximadamente 12 horas de diferencia, no más de aproximadamente 24 horas de diferencia o no más de 48 horas de diferencia.

La cantidad de cualquier composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento que se mezcla con los materiales vehículo para producir una dosis única puede variar dependiendo del sujeto a tratar y el modo particular de administración. Se pueden utilizar ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos.

En general, las dosis útiles son conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, las dosis pueden determinarse con referencia a Physicians' Desk Reference, 66a Edición, PDR Network; Edición 2012 (27 de diciembre de 2011).

La dosificación de cualquier composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento puede depender de varios factores, incluyendo la gravedad de la afección, si la dolencia se va a tratar o evitar, y la edad, el peso, y la salud del sujeto que se va a tratar. Además, la información farmacogenómica (el efecto del genotipo sobre la farmacocinética, farmacodinámica o perfil de eficacia de un agente terapéutico) acerca de un paciente concreto puede alterar la dosificación utilizada. Asimismo, las dosificaciones individuales exactas se pueden ajustar de alguna manera dependiendo de varios factores, incluyendo la combinación específica de los agentes que se administran, el tiempo de administración, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la velocidad de excreción, la enfermedad particular que se trate, la gravedad del trastorno y la localización anatómica del trastorno. Se pueden esperar algunas variaciones en la dosis.

Generalmente, cuando se administra por vía oral a un mamífero, la dosis de cualquier composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento puede ser de aproximadamente 0,001 mg/kg/día a aproximadamente 100 mg/kg/día, de aproximadamente 0,01 mg/kg/día a aproximadamente 50 mg/kg/día o de aproximadamente 0,1 mg/kg/día a aproximadamente 10 mg/kg/día. Cuando se administra por vía oral a un ser humano, la dosis de cualquier agente descrito en el presente documento es normalmente de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 1000 mg por día, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 600 mg por día, o de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 30 mg por día.

Para la administración de cualquier composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento por inyección parenteral, la dosis es normalmente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 250 mg por día, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg por día, o de aproximadamente 3 mg a aproximadamente 5 mg por día. Las inyecciones se pueden administrar hasta cuatro veces al día. Generalmente, cuando se administra por vía oral o parenteral, la dosis de cualquier agente descrito en el presente documento es normalmente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 1500 mg por día, o de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 10 mg por día, o de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 5 mg por día. Se puede administrar una dosis de hasta aproximadamente 3000 mg por día.

En otra realización, la administración puede ser en una vesícula, en particular un liposoma (véanse Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, pág. 353-365 (1989).

Cualquier composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento puede administrarse por medios de liberación controlada o de liberación sostenida o por dispositivos de administración que son bien conocidos por los expertos habituales en la materia. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, los descritos en las patentes de EE. UU. números 3.845.770; 3.916.899; 3.536.809; 3.598.123; 4.008.719; 5.674.533; 5.059.595; 5.591.767; 5.120.548; 5.073.543; 5.639.476; 5.354.556; y 5.733.556. Dichas formas farmacéuticas pueden ser útiles para proporcionar la liberación controlada o sostenida de uno o más principios activos usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa, otras matrices poliméricas, geles, membranas permeables, sistemas osmóticos, recubrimientos multicapa, micropartículas, liposomas, microesferas o una combinación de los mismos para proporcionar el perfil de liberación deseado en proporciones variables. Las formulaciones adecuadas de liberación controlada o sostenida conocidas por los expertos en la materia, incluidas las descritas en el presente documento, pueden seleccionarse fácilmente para su uso con los principios activos de los agentes descritos en el presente documento. Por lo tanto, la invención proporciona formas farmacéuticas unitarias adecuadas para administración oral, tales como, pero sin limitación, comprimidos, cápsulas, cápsula de gelatina, y cápsulas oblongas que están adaptadas para la liberación controlada o sostenida.

La liberación controlada o sostenida de un principio activo se puede estimular mediante diversas condiciones, incluyendo, pero sin limitación, cambios en el pH, cambios en la temperatura, estimulación por una longitud de onda de luz apropiada, concentración o disponibilidad de enzimas, concentración o disponibilidad de agua, u otras condiciones fisiológicas o compuestos.

En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos (véanse Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), c Rc Pres., Boca Ratón, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; véase también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105).

En otra realización, se puede colocar un sistema de liberación controlada próximo al área diana a tratar, siendo necesaria, por tanto, solo una fracción de la dosis sistémica (véase, p. ej., Goodson, en "Medical Applications of Controlled Release", supra, vol. 2, pág. 115-138 (1984)). Se pueden usar otros sistemas de liberación controlada descritos en la revisión de Langer, 1990, Science 249:1527-1533).

La administración de cualquier composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento puede, independientemente, ser de una a cuatro veces al día o de una a cuatro veces al mes o de una a seis veces al año o de una vez cada dos, tres, cuatro o cinco años. La administración puede tener una duración de aproximadamente un día o aproximadamente un mes, aproximadamente dos meses, aproximadamente tres meses, aproximadamente seis meses, aproximadamente un año, aproximadamente dos años, aproximadamente tres años, y puede incluso ser de por vida para el sujeto. La administración crónica, a largo plazo, estará indicada en muchos casos. La dosificación se puede administrar como una dosis única o dividida en dosis múltiples. En general, la dosis deseada debe administrarse a intervalos establecidos durante un período prolongado, habitualmente al menos durante varias semanas o meses, aunque pueden ser necesarios períodos de administración más largos de varios meses o años o más.

El régimen posológico que utiliza cualquier composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento puede seleccionarse de acuerdo con varios factores incluyendo tipo, la especie, la edad, el peso, el sexo y el estado médico del sujeto; la gravedad de la afección a tratar; la ruta de administración; la función renal o hepática del sujeto; la constitución farmacogenómica del individuo; y el compuesto específico de la invención empleado. Cualquier composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento se puede administrar en una dosis diaria única, o la dosis diaria total se puede administrar en dosis divididas de dos, tres o cuatro veces al día. Asimismo, cualquier composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) descrita en el presente documento se puede administrar de forma continua en lugar de intermitente a lo largo del régimen posológico.

Terapias combinadas y conjugación

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona composiciones y métodos relacionados con la flagelina que comprenden además administrar un agente adicional a un sujeto. En algunas realizaciones, la invención se refiere a la administración conjunta y/o la formulación conjunta. Cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento puede formularse conjuntamente y/o administrarse conjuntamente.

En algunas realizaciones, cualquier composición relacionada con la flagelina descrita en el presente documento actúa sinérgicamente cuando se administra conjuntamente con otro agente y se administra a dosis que son más bajas que las dosis comúnmente empleadas cuando tales agentes se usan en monoterapia. En diversas realizaciones, cualquier agente al que se haga referencia en el presente documento puede usarse en combinación con cualquiera de las composiciones relacionadas con la flagelina descritas en el presente documento.

En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a agentes quimioterápicos como agentes adicionales.

Los ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen, pero sin limitación, agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida CYTOXAN; alquilsulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilmelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (p. ej., bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos, adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (p. ej., criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CB 1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos, tales como los antibióticos de enediina (p.ej., calicheamicina, especialmente calicheamicina gamma ll y calicheamicina omega ll (véase, p. ej., Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tal como clodronato; una esperamicina; así como cromóforo de neocarcinostatina y cromóforos de antibióticos de enediina relacionados con cromoproteína), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN doxorrubicina (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolodoxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor del ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidracida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (p. ej., toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, p. ej., paclitaxel TAXOL (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE sin Cremophor, formulación de nanopartículas de paclitaxel diseñadas por ingeniería con albúmina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, 111) y doxetaxel TAXOTERE (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina GEMZAR; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecán (Camptosar, CPT-11) (incluyendo el régimen de tratamiento de irinotecán con 5-FU y leucovorina); inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; combretastatina; leucovorina (LV); oxaliplatino, incluyendo el régimen de tratamiento de oxaliplatino (FOLFOX); lapatinib (Tykerb); inhibidores de la PKC-a , Raf, H-Ras, EGFR (p. ej. erlotinib (Tarceva)) and VEGF-A que reducen la proliferación celular y las sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. Además, los métodos de tratamiento pueden incluir además el uso de radiación. Además, los métodos de tratamiento pueden incluir además el uso de terapia fotodinámica.

En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) descritas en la presente memoria, incluyen derivados que se modifican, es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula a la composición, de tal forma que dicha unión covalente no impide la actividad de la composición. Por ejemplo, aunque sin limitación, los derivados incluyen composiciones que han sido modificadas por, entre otros, glucosilación, lipidación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Se pueden llevar a cabo cualquiera de numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas, incluyendo, aunque no de forma limitativa, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no convencionales.

En otras realizaciones adicionales, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) descritas en el presente documento también incluyen un agente citotóxico, que comprende, en realizaciones ilustrativas, una toxina, un agente quimioterápico, un radioisótopo, y un agente que provoca la apoptosis o muerte celular. Dichos agentes se pueden conjugar con una composición descrita en el presente documento.

Las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) descritas en el presente documento se pueden por lo tanto modificar postraducionalmente para añadir restos efectores, tales como conectores químicos, restos detectables, tales como por ejemplo tintes fluorescentes, enzimas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, y restos quimioluminiscentes, o restos funcionales, tales como por ejemplo estreptavidina, avidina, biotina, una citotoxina, un agente citotóxico, y materiales radiactivos.

Los agentes citotóxicos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, metotrexato, aminopterina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina; agentes alquilantes tales como mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), mitomicina C, lomustina (CCNU), 1-metilnitrosourea, ciclofosfamida, mecloretamina, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino y carboplatino (paraplatino); antraciclinas que incluyen daunorubicina (anteriormente daunomicina), doxorrubicina (adriamicina), detorubicina, carminomicina, idarubicina, epirubicina, mitoxantrona y bisantreno; antibióticos incluido dactinomicina (actinomicina D), bleomicina, calicheamicina, mitramicina, y antramicina (AMC); y agentes antimicóticos tales como alcaloides de la vinca, vincristina y vinblastina. Otros agentes citotóxicos incluyen paclitaxel (taxol), ricina, exotoxina de Pseudomonas, gemcitabina, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, etopósido, tenopósido, colchicina, dihidroxiantracindiona, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, procarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, corticoesteroides, mitotano (O,P'-(DDD)), interferones, y mezclas de estos agentes citotóxicos.

Otros agentes citotóxicos incluyen, pero sin limitación, agentes quimioterápicos, tales como carboplatino, cisplatino, paclitaxel, gemcitabina, calicheamicina, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, mitomicina C, actinomicina D, ciclofosfamida, vincristina, bleomicina, antagonistas de VEGF, antagonistas de EGFR, platinos, taxoles, irinotecán, 5-fluorouracilo, gemcitabina, leucovorina, esteroides, ciclofosfamida, melfalán, alcaloides de la vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina), mustinas, inhibidores de tirosina quinasa, radioterapia, antagonistas de hormonas sexuales, moduladores selectivos del receptor de andrógenos, moduladores selectivos del receptor de estrógenos, antagonistas de PDGF, antagonistas de TNF, antagonistas de IL-1, interleucinas (p. ej. IL-12 o IL-2), antagonistas de IL-12R, Anticuerpos monoclonales conjugados con toxina, anticuerpos monoclonales específicos de antígenos tumorales, Erbitux, Avastina, Pertuzumab, anticuerpos anti-CD20, Rituxan, ocrelizumab, ofatumumab, DXL625, HERCEPTIN®, o cualquier combinación de los mismos. Las enzimas tóxicas de plantas y bacterias como la ricina, la toxina de la difteria y la toxina de Pseudomonas pueden conjugarse con los agentes terapéuticos (p. ej. anticuerpos) para generar reactivos destructores específicos del tipo celular (Youle, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5483 (1980); Gilliland, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980); Krolick, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5419 (1980)).

Otros agentes citotóxicos incluyen ribonucleasas citotóxicas como lo describe Goldenberg en la patente de EE. UU. N. ° 6.653.104. Las realizaciones de la invención también se refieren a radioinmunoconjugados donde un radionúclido que emite partículas alfa o beta está acoplado de manera estable al anticuerpo, o fragmentos de unión del mismo, con o sin el uso de un agente formador de complejos. Dichos radionúclidos incluyen emisores beta tales como Fósforo-32, Escandio-47, Cobre-67, Galio-67, Itrio-88, Itrio-90, Yodo-125, Yodo-131, Samario-153, Lutecio-177, Renio-186 o Renio-188, y emisores alfa tales como Astatina-211, Plomo-212, Bismuto-212, Bismuto-213 o Actinio-225.

Los ejemplos de restos detectables incluyen además, pero sin limitación, peroxidasa de rábano picante, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa y luciferasa. Los ejemplos adicionales de materiales fluorescentes incluyen, pero sin limitación, rodamina, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, umbeliferona, diclorotriazinilamina, ficoeritrina y cloruro de dansilo. Los ejemplos adicionales de restos quimioluminiscentes incluyen, pero sin limitación, luminol. Los ejemplos adicionales de materiales bioluminiscentes incluyen, pero sin limitación, luciferina y aecuorina. Los ejemplos adicionales de materiales radiactivos incluyen, pero sin limitación, Yodo-125, Carbono-14, Azufre-35, Tritio y fósforo-32.

En diversas realizaciones, los agentes adicionales de la presente invención incluyen uno o más hemoderivados, factores estimulantes de colonias, citocinas y/o factores de crecimiento, antibióticos, agentes diluyentes y/o bloqueantes, agentes movilizantes o quelantes, trasplantes de células madre, antioxidantes o radicales libres y radioprotectores.

En algunas realizaciones, el hemoderivado es uno o más de factores de crecimiento hematopoyéticos, tales como filgrastim (p. ej. NEUPOGEN), un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), que puede estar opcionalmente pegilado (p. ej. NEULASTA); sargramostim (LEUKINE); y un factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) y un KSF.

En algunas realizaciones, el agente adicional es una o más citocinas y/o factores de crecimiento que pueden conferir radioprotección al reponer y/o proteger las poblaciones de células madre radiosensibles. La radioprotección con efectos secundarios mínimos se puede lograr mediante el uso del factor de células madre (SCF, ligando c-kit), ligando Flt-3, y el fragmento IL-1b-rd de interleucina-1. La protección se puede lograr mediante la inducción de la proliferación de células madre (p. ej. mediante todas las citocinas mencionadas) y la prevención de su apoptosis (p. ej. mediante SCF). El tratamiento permite la acumulación de leucocitos y sus precursores antes de la irradiación, lo que permite una reconstitución más rápida del sistema inmunitario después de la irradiación. SCF rescata eficazmente ratones irradiados letalmente con un factor modificador de la dosis (DMF) en el intervalo 1,3-1,35 y también es eficaz contra el síndrome gastrointestinal. El ligando Flt-3 también proporciona una fuerte protección en ratones y conejos.

Varios factores, aunque no son citocinas por naturaleza, estimulan la proliferación de los inmunocitos y pueden usarse en combinación con las composiciones relacionadas con la flagelina en las dosis y regímenes descritos en el presente documento. Por ejemplo, 5-AED (5-androstenediol) es un esteroide que estimula la expresión de citocinas y aumenta la resistencia a las infecciones bacterianas y virales. Los compuestos sintéticos, tales como el tri-cloro(dioxoetilen-O, O'-)telurato de amonio (AS-101), también pueden usarse para inducir la secreción de numerosas citocinas y para la combinación con las composiciones relacionadas con la flagelina. Los factores de crecimiento y las citocinas también pueden usarse para proporcionar protección contra el síndrome gastrointestinal. El factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) promueve la proliferación y diferenciación en la mucosa intestinal, y aumenta la supervivencia celular posterior a la irradiación en las criptas intestinales. La citocina hematopoyética y el SCF radioprotector también pueden aumentar la supervivencia de las células madre intestinales y la supervivencia de los organismos a corto plazo asociada.

En ciertas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina se pueden añadir a un régimen de citocinas (p. ej. para FILGRASTIM (G-CSF) 2,5-5 pg/kg/d QD s.c. (100-200 pg/m2/d); para SARGRAMOSTIM (GM-CSF) 5 10 pg/kg/d QD s.c. (200-400 pg/m2/d); y/o para PEGFILGrAs TIM (pegG-CSF) 6 mg una vez s.c.).

En algunas realizaciones, el antibiótico es uno o más de un agente antibacteriano (agentes anti-grampositivos y antigramnegativos) y/o antifúngicos y/o antivíricos. A modo de ejemplo no limitante, en algunas realizaciones, el antibiótico puede ser una quinolona, p. ej. ciprofloxacino, levofloxacino, una cefalosporina de tercera o cuarta generación con cobertura de Pseudomonas: p. ej., cefepima, ceftazidima, o un aminoglucósido: p. ej. gentamicina, amikacina, penicilina o amoxicilina, aciclovir, vancomicina. En diversas realizaciones, el antibiótico se dirige a Pseudomonas aeruginosa.

En algunas realizaciones, el agente adicional es un agente diluyente y/o bloqueante. Por ejemplo, se pueden usar compuestos de yodo estable (p. ej. líquidos (ThyroShield) y el comprimido de KI (Iosat) (NUKEPILLS), Rad Block, I.A.A.A.M., NoRad, Life Extension (Le F), KI4U, NukeProtect, ProKI)). Se puede usar una dosis diaria de 130 mg de yoduro de potasio (KI) oral junto con las composiciones relacionadas con la flagelina.

En algunas realizaciones, el agente adicional es un agente movilizante o quelante. Los agentes movilizantes ilustrativos incluyen propiltiouracilo y metimazol, que pueden reducir la retención de tiroides de compuestos radiactivos. Además, las composiciones relacionadas con la flagelina pueden usarse junto con el aumento de fluidos orales a un paciente humano para promover la excreción. Los agentes quelantes ilustrativos son solubles en agua y se excretan en la orina. Los agentes quelantes ilustrativos incluyen DTPa y EDTA. El dimercaprol forma quelatos estables con mercurio, plomo, arsénico, oro, bismuto, cromo y níquel y, por lo tanto, puede considerarse para el tratamiento de la contaminación interna con los radioisótopos de estos elementos. La penicilamina forma quelatos con el cobre, hierro, mercurio, plomo, oro, y posiblemente otros metales pesados.

En algunas realizaciones, el agente adicional es un trasplante de células madre (p.ej. trasplante de médula ósea, PBSCT, MSCT). En algunas realizaciones el trasplante de células madre es Remestemcel-L (Osiris) de CLT -008 (Cellerant).

En algunas realizaciones, el agente adicional es un antioxidante o radical libre. Los antioxidantes y los secuestrantes de radicales libres que pueden usarse en la práctica de la invención incluyen, pero sin limitación, tioles, tales como cisteína, cisteamina, glutatión y bilirrubina; amifostina (WR-2721); vitamina A; vitamina C; vitamina E; y flavonoides tales como la albahaca sagrada (Ocimum sanctum), orientina y vicenina.

En algunas realizaciones, el agente adicional puede ser un radioprotector, p. ej. un antioxidante (p.ej. amifostina y vitamina E, gamma tocotrienol (un resto de vitamina E) y genisteína (un subproducto de la soja)), una citocina (p. ej. un factor de células madre), un factor de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento de queratinocitos), un esteroide (p. ej. 5-androstenediol), tricloro(dioxoetilen-O,O')telurato de amonio, agentes protectores del tiroides (p. ej. yoduro potásico (KI) o yodato potásico (KIO³) (p. ej. líquidos (ThyroShield) y el comprimido de KI (Iosat) (NUKEPILLS), Rad Block, I.A.A.A.M., No-Rad, Life Extension (LEF), KI4U, NukeProtect, ProKI)), agentes antináuseas, agentes antidiarreicos, antieméticos ((p. ej. antieméticos profilácticos orales) tales como granisetrón (KYTRIL), ondansetrón (ZOFRAN) y bloqueadores de 5-HT3 con o sin ) dexametasona, analgésicos, ansiolíticos, sedantes, terapia de citocinas, y antibióticos.

El lavado gástrico y los eméticos, que se pueden usar como agentes adicionales, se pueden usar para vaciar el estómago de manera rápida y completa después de la ingestión de materiales tóxicos. Los purgantes, laxantes y enemas, que también se pueden usar como agentes adicionales, pueden reducir el tiempo de residencia de los materiales radiactivos en el colon. Otros agentes adicionales incluyen resinas de intercambio iónico que pueden limitar la absorción gastrointestinal de radionucleidos ingeridos o inhalados, ferrocianuro férrico (azul de Prusia) y alginatos, que se han utilizado en seres humanos para acelerar la excreción fecal de cesio-137.

En otras realizaciones adicionales, el agente adicional puede ser un agente usado para tratar trastornos relacionados con la radiación, tales como, por ejemplo, 5-AED (Humanetics), Ex-RAD (Onconova), Dipropionato de beclometasona (Soligenix), endotoxina destoxificada, EA-230 (Exponential Biotherapies), ON-01210.Na (Onconova), Sotrombomodulina alfa (PAION), Remestemcel-L (Osiris), BIO-100, BIO-200, BIO-300, BIO-400, BIO-500 (Humanetics), CLT-008 (Cellerant), EDL-2000 (RxBio), Homspera (ImmuneRegen), MnDTEIP (Aeolus Pharmaceuticals), RLIP-76 (Terapio), y RX-100 y RX 101 (RxBio).

Además, en algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) se pueden usar en combinación con protección; reducción del tiempo de exposición a la radiación; y uso de los agentes para reducir la exposición corporal (p. ej. usos de guantes, mascarilla facial, visera, ropa protectora (p. ej. trajes anticontaminación tales como Ty Ve K ANTI-C SUITS o MOPP-4)).

Vectores virales que codifican agentes terapéuticos y células que los expresan

En diversas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) de la presente invención se expresan por vectores virales y células transformadas. Por ejemplo, los vectores virales y las células humanas transformadas descritas en el presente documento pueden expresar las presentes composiciones. En una realización, el vector viral o las células humanas que expresan el agente terapéutico son capaces de expresar el agente en la proximidad de un tumor. Las células se pueden modificar in vivo, o como alternativa las células modificadas ex vivo se pueden administrar a un paciente mediante métodos, tal como mediante inyección.

En una realización, la célula es una célula tumoral. Para la transformación ex vivo, dichas células tumorales se pueden irradiar para eliminar la capacidad de la célula para replicarse, como se sabe en la técnica, manteniendo la expresión transitoria del agente terapéutico después de la administración. Para la transformación in vivo, se pueden preferir los vectores de expresión no integrativos.

En ciertas realizaciones, la célula tumoral es autóloga o endógena. En el primer caso, la célula tumoral se extrae de un paciente, se transfecta o transduce con una construcción que codifica el agente terapéutico y se reintroduce en el paciente, por ejemplo después de irradiación. En el último caso, la célula tumoral se transforma in vivo por administración local de una construcción apropiada como se describe en el presente documento.

En una realización alternativa, la célula tumoral modificada es alogénica. La célula tumoral alogénica se puede mantener por lo tanto en una línea celular. En este caso, la célula puede seleccionarse de la línea celular, irradiarse e introducirse en el paciente.

Las células humanas modificadas capaces de producir las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) pueden prepararse transfectando o transduciendo las células con un vector de expresión que codifica el agente terapéutico. Los vectores de expresión para la expresión de las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales), o una combinación de agentes terapéuticos se pueden preparar por métodos bien conocidos en la técnica.

En diversas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) se pueden administrar a un paciente en forma de una o más construcciones de ácido nucleico.

En una realización, la construcción comprende un vector retroviral. Los vectores retrovirales son capaces de integrar permanentemente ADN que codifica composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) en el genoma celular. Por tanto, en el caso de la manipulación ex vivo de células autólogas o alogénicas, se pueden preparar líneas celulares estables que producen constitutivamente las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales). En una realización, las células se irradian antes de la administración a un paciente. Las células irradiadas producen las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) durante un período limitado de tiempo.

En una realización, la construcción de expresión comprende un vector SFV, que demuestra altos niveles de expresión transitoria en células de mamífero. El vector SFV se describe, por ejemplo, en Lundstrom, Expert Opin. Biol. Ther.

3:771-777 (2003). Por tanto, en el caso de la manipulación in vivo de células endógenas en un paciente, se puede lograr la expresión transitoria de altos niveles de las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales).

Los sistemas capaces de expresar la proteína recombinante in vivo se conocen en la técnica. A modo de ejemplo, el sistema puede usar el sistema de expresión de anticuerpos mediada por 2A divulgado en Fang et al., Nature Biotech.

23(5): 584-590 (2005) y la publicación de patente de EE. UU. N.° 2005/0003506. Se contemplan otros sistemas conocidos en la técnica, y también se pueden adaptar para producir las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) in vivo tal como se describe en el presente documento.

En diversas realizaciones, la administración de la composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) que expresa las células divulgadas en el presente documento o los agentes de la invención divulgados en el presente documento se pueden combinar con la administración de citocinas que estimulan las células presentadoras de antígeno tales como el factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrófagos factor (GM-CSF), el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), la interleucina 3 (IL-3), la interleucina 12 (IL-12), interferón, etc., o vacunas celulares capaces de expresar tales citocinas. En algunas realizaciones, la composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) que expresa células se modifican adicionalmente para expresar tales citocinas. Se pueden emplear proteínas y/o citocinas adicionales que se sabe que aumentan la proliferación y secreción de linfocitos T, tales como IL-1, IL-2, B7, anti-CD3 y anti-CD28 de forma simultánea o secuencial con las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) de la invención para aumentar la respuesta inmunitaria y/o estimular vías coestimuladoras y/o inducir la activación/proliferación de linfocitos T efectores.

Vectores y métodos de transformación

Los vectores de expresión que codifican las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) pueden ser virales o no virales. Se prefieren los vectores virales para uso in vivo. Los vectores de expresión de la invención comprenden un ácido nucleico que codifica las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales), o un complemento de las mismas, unidos operativamente a una región de control de la expresión, o complemento de la misma, que es funcional en una célula de mamífero. La región de control de la expresión es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico que codifica el agente bloqueante y/o estimulante unido operativamente de manera que el agente bloqueante y/o estimulante se produce en una célula humana transformada con el vector de expresión.

Las regiones de control de la expresión son polinucleótidos reguladores (a veces referidos aquí como elementos), tales como promotores y potenciadores, que influyen en la expresión de un ácido nucleico unido operativamente.

Una región de control de la expresión de un vector de expresión de la invención es capaz de expresar ácido nucleico codificante unido operativamente en una célula humana. En una realización, la célula es una célula tumoral. En otra realización, la célula es una célula no tumoral.

En una realización, la región de control de la expresión confiere expresión regulable a un ácido nucleico unido operativamente. Una señal (a veces denominada estímulo) puede aumentar o disminuir la expresión de un ácido nucleico unido operativamente a dicha región de control de la expresión. Dichas regiones de control de la expresión que aumentan la expresión en respuesta a una señal a menudo se denominan inducibles. Dichas regiones de control de la expresión que disminuyen la expresión en respuesta a una señal a menudo se denominan reprimibles. Normalmente, la cantidad de aumento o disminución conferida por tales elementos es proporcional a la cantidad de señal presente; cuanto mayor es la cantidad de señal, mayor es el aumento o disminución de la expresión.

En una realización, la presente invención contempla el uso de promotores inducibles capaces de efectuar un alto nivel de expresión de forma transitoria en respuesta a una señal. Cuando está en la proximidad de una célula tumoral, una célula transformada con un vector de expresión para las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) que comprenden dicha secuencia de control de la expresión es inducida para producir transitoriamente un alto nivel del agente exponiendo la célula transformada a una señal adecuada. Los ejemplos de regiones de control de la expresión inducibles incluyen aquellos que comprenden un promotor inducible que se estimula con una señal tal como un compuesto químico de molécula pequeña. Se pueden encontrar ejemplos particulares, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. números 5.989.910, 5.935.934, 6.015.709, y 6.004.491.

Las regiones de control de la expresión incluyen secuencias promotoras de longitud completa, tales como elementos promotores y potenciadores nativos, así como subsecuencias o variantes de polinucleótidos que conservan toda o parte de la función de longitud completa o no variante. Como se usa en el presente documento, el término "funcional" y las variantes gramaticales del mismo, cuando se usa en referencia a una secuencia de ácido nucleico, subsecuencia o fragmento, significa que la secuencia tiene una o más funciones de secuencia de ácido nucleico nativo (por ejemplo, secuencia no variante o no modificada).

Como se usa en el presente documento, "operativamente unido" se refiere a una yuxtaposición física de los componentes descritos de esta manera de forma que se les permite funcionar en su manera prevista. En el ejemplo de un elemento de control de la expresión en un enlace operable con un ácido nucleico, la relación es tal que el elemento de control modula la expresión del ácido nucleico. Normalmente, una región de control de la expresión que modula la transcripción se yuxtapone cerca del extremo 5' del ácido nucleico transcrito (es decir., "en dirección 5'"). Las regiones de control de la expresión también se pueden localizar en el extremo 3' de la secuencia transcrita (es decir, "en dirección 3'") o dentro del transcrito (p. ej., en un intrón). Los elementos de control de la expresión pueden localizarse a una distancia de la secuencia transcrita (p. ej., de 100 a 500, 500 a 1000, 2000 a 5000, o más nucleótidos del ácido nucleico). Un ejemplo específico de un elemento de control de la expresión es un promotor, que generalmente se encuentra en 5' de la secuencia transcrita. Otro ejemplo específico de un elemento de control de la expresión es un potenciador, que puede estar localizado en 5' o 3' de la secuencia transcrita, o dentro de la secuencia transcrita.

Los sistemas de expresión funcionales en células humanas son bien conocidos en la técnica e incluyen sistemas virales. Generalmente, un promotor funcional en una célula humana es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa de mamífero e iniciar la transcripción en dirección 3' de una secuencia codificante del ligando B7-H4 en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción, que generalmente está situada proximalmente al extremo 5' de la secuencia codificante, y normalmente una caja TATA localizada a 25-30 pares de bases en dirección 5' del sitio de inicio de la transcripción. Se cree que la caja TATA dirige la ARN polimerasa II para comenzar la síntesis de ARN en el sitio correcto. Un promotor también contendrá normalmente un elemento promotor en dirección 5' (elemento potenciador), normalmente localizado a 100 a 200 pares de bases en dirección 5' de la caja TATA. Un elemento promotor en dirección 5' determina la velocidad a la que se inicia la transcripción y puede actuar en cualquier orientación. De uso particular como promotores son los promotores de genes virales de mamíferos, ya que los genes virales a menudo están altamente expresados y tienen una amplia variedad de hospedadores. Los ejemplos incluyen el promotor temprano SV40, el promotor LTR del virus de tumor mamario de ratón, el promotor tardío principal de adenovirus, el promotor del virus del herpes simple y el promotor CMV.

Normalmente, la terminación de la transcripción y las secuencias de poliadenilación reconocidas por las células de mamífero son regiones reguladoras localizadas en 3' del codón de parada de la traducción y, por lo tanto, junto con los elementos promotores, flanquean la secuencia codificante. El extremo 3' del ARNm maduro está formado por la escisión post-traduccional específica de sitio y poliadenilación. Los ejemplos de señales de terminación de la transcripción y de poliadenilación incluyen las derivadas de SV40. Los intrones también pueden incluirse en construcciones de expresión.

Hay diversas técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico a células de mamíferos in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, sistemas poliméricos, DEAE-dextrano, transducción viral, el método de precipitación con fosfato de calcio, etc. Para la transferencia génica in vivo, también se pueden usar una serie de técnicas y reactivos, incluyendo liposomas; vehículos de administración a base de polímeros naturales, tales como quitosano y gelatina; los vectores virales también se prefieren para la transducción in vivo. En algunas situaciones, es deseable proporcionar un agente de direccionamiento, tal como un anticuerpo o ligando específico de una proteína de membrana de la superficie de la célula tumoral. Cuando se emplean liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de la membrana de la superficie celular asociada con la endocitosis se pueden usar para dirigir y/o para facilitar la captación, p. ej., proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas trópicas para un tipo de célula particular, anticuerpos contra proteínas que experimentan internalización en ciclos, proteínas que se dirigen a la localización intracelular y refuerzan la semivida intracelular. La técnica de la endocitosis mediada por receptores se describe, por ejemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990).

Cuando sea adecuado, también se pueden emplear agentes de administración de genes, tales como, p.ej., secuencias de integración. Numerosas secuencias de integración son conocidas en la técnica (véase, p. ej., Nunes-Duby et al., Nucleic Acids Res. 26:391-406, 1998; Sadwoski, J. Bacteriol., 165:341-357, 1986; Bestor, Cell, 122(3):322-325, 2005; Plasterk et al., TIG 15:326-332, 1999; Kootstra et al., Ann. Rev. Pharm. Toxicol., 43:413-439, 2003). Estas incluyen recombinasas y transposasas. Los ejemplos incluyen Cre (Sternberg and Hamilton, J. Mol. Biol., 150:467-486, 1981), lambda (Nash, Nature, 247, 543-545, 1974), Flp (Broach, et al., Cell, 29:227-234, 1982), R (Matsuzaki, et al., J. Bacteriology, 172:610-618, 1990), cpC31 (véase, e.g., Groth et al., J. Mol. Biol. 335:667-678, 2004), la bella durmiente, transposasas de la familia mariner (Plasterk et al., supra), y componentes para integrar virus tales como AAV, retrovirus y antivirus que tienen componentes que proporcionan la integración del virus tales como las secuencias LTR de retrovirus o lentivirus y las secuencias ITR de AAV (Kootstra et al., Ann. Rev. Pharm. Toxicol., 43:413-439, 2003).

Vectores virales

En un aspecto, la divulgación proporciona vectores de expresión para la expresión de las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) que son vectores virales. Se conocen muchos vectores virales útiles para la terapia génica (véase, p. ej., Lundstrom, Trends Biotechnol., 21: 117, 122, 2003.

Los ejemplos de vectores virales incluyen aquellos seleccionados de (LV), retrovirus (RV), adenovirus (AV), virus adenoasociados (VAA) y a virus, aunque también se pueden usar otros muchos vectores virales. Para los usos in vivo, se prefieren los vectores virales que no se integran en el genoma del hospedador, tales como los a virus y los adenovirus, prefiriéndose especialmente los a virus. Tipos de ejemplos de a virus incluyen el virus Sindbis, el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) y el virus Semliki Forest (SFV), prefiriéndose especialmente el SFV. Para los usos in vitro, se prefieren los vectores virales que se integran en el genoma del hospedador, tales como los retrovirus, AAV, y antivirus.

En una realización, el vector viral proporciona una expresión transitoria de alto nivel en una célula humana transducida.

En una realización, el vector viral no proporciona la integración del ácido nucleico que codifica la composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) en el genoma de una célula humana transducida.

En otra realización, el vector viral proporciona la integración del ácido nucleico que codifica las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) en el genoma de una célula humana transducida.

En una realización, la divulgación proporciona métodos de transducción de una célula humana in vivo, que comprende poner en contacto un tumor sólido in vivo con un vector viral de la invención.

En otra realización, la divulgación proporciona métodos de transducción de una célula humana ex vivo, que comprende poner en contacto una célula humana ex vivo con el vector viral de la invención. En una realización, la célula humana es una célula tumoral. En una realización, la célula humana es alogénica. En una realización, la célula tumoral precede del paciente. En una realización, la célula humana es una célula no tumoral, tales como, p. ej., una célula presentadora de antígeno (APC), o un linfocito T.

Las cubiertas de las partículas de virus pueden modificarse para alterar la especificidad y mejorar el direccionamiento a la célula/tejido, como se sabe bien en la técnica. Los vectores virales también se pueden administrar en otros vehículos, por ejemplo, liposomas. Los liposomas también pueden tener restos de direccionamiento unidos a su superficie para mejorar el direccionamiento a células/tejidos.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona células humanas que expresan el agente terapéutico de la invención. En diversas realizaciones, las células humanas expresan el agente proximal a una célula tumoral de, por ejemplo, un paciente.

Métodos diagnósticos y predictivos

En algunos aspectos, la divulgación proporciona un método para identificar a un sujeto que puede responder al tratamiento con un agonista de TLR5. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para determinar si el tumor de un paciente expresa TLR5.

La expresión de TLR5 puede ser un marcador predictivo para determinar el grado y/o progresión del tumor o displasia de un paciente. En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) descritas en el presente documento son útiles para determinar un grado y/o etapa tumoral de un cáncer particular.

El grado tumoral es un sistema utilizado para clasificar las células cancerosas en términos de en qué medida tienen un aspecto anormal en un microscopio y con qué rapidez es probable que el tumor crezca y se disemine. Al determinar el grado del tumor, se consideran muchos factores, incluyendo la estructura y el patrón de crecimiento de las células. Los factores específicos utilizados para determinar el grado del tumor pueden variar con cada tipo de cáncer y son conocidos en la técnica.

El grado histológico, también llamado diferenciación, se refiere al grado en el que se parecen las células tumorales a las células normales del mismo tipo de tejido. El grado nuclear se refiere al tamaño y la forma del núcleo en las células tumorales y el porcentaje de células tumorales que se están dividiendo.

Basándose en la apariencia microscópica de las células cancerosas, los patólogos comúnmente describen el grado del tumor en cuatro grados de gravedad: Grados 1, 2, 3 y 4. Las células de los tumores de Grado 1 se parecen a las células normales y tienden a crecer y multiplicarse lentamente. Los tumores de grado 1 generalmente se consideran los menos agresivos en el comportamiento. Por el contrario, las células de los tumores de grado 3 o grado 4 no se ven como células normales del mismo tipo. los tumores de grado 3 y 4 tienden a crecer rápidamente y diseminarse más rápido que los tumores con un grado más bajo. El Comité Estadounidense Conjunto sobre el Cáncer recomienda las siguientes directrices para clasificar los tumores: grado GX-no se puede evaluar el grado (grado indeterminado); G1-bien diferenciado (grado bajo); G2-moderadamente diferenciado (grado intermedio); G3-mal diferenciado (grado alto); y G4-indiferenciado (grado alto).

Los sistemas de clasificación son diferentes para cada tipo de cáncer. Por ejemplo, los patólogos usan el sistema Gleason para describir el grado de diferenciación de las células de cáncer de próstata. El sistema Gleason utiliza puntuaciones que van del grado 2 al grado 10. Las puntuaciones más bajas de Gleason describen tumores bien diferenciados, menos agresivos. Las puntuaciones más altas describen tumores mal diferenciados, más agresivos. Otros sistemas de clasificación incluyen, por ejemplo, el sistema Bloom-Richardson para el cáncer de mama y el sistema Fuhrman para el cáncer de riñón.

Las tasas de supervivencia al cáncer o las estadísticas de supervivencia pueden referirse al porcentaje de personas que sobreviven a un determinado tipo de cáncer durante un período de tiempo específico. Las estadísticas de cáncer a menudo usan una tasa de supervivencia global de cinco años. Por ejemplo, la tasa global de supervivencia a cinco años para el cáncer de vejiga es del 80 por ciento, 80 de cada 100 personas diagnosticadas con cáncer de vejiga vivían cinco años después del diagnóstico y 20 de cada 100 murieron en los cinco años siguientes al diagnóstico de cáncer de vejiga. Se pueden usar otros tipos de tasas de supervivencia, por ejemplo: la tasa de supervivencia libre de enfermedad (número de personas con cáncer que logran la remisión) y la tasa de supervivencia libre de progresión. (número de personas que todavía tienen cáncer, pero su enfermedad no progresa).

En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) descritas en el presente documento son útiles para establecer un grado tumoral para el diagnóstico o pronóstico de un cáncer particular, incluyendo el pronóstico de la tasa de supervivencia, la tasa de supervivencia libre de enfermedad y/o la tasa de supervivencia libre de progresión antes, durante y/o después de la administración de una composición relacionada con la flagelina (y/o agentes adicionales) divulgada en el presente documento y/o antes, durante y/o después de la administración de un agente o terapia contra el cáncer.

En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) descritas en el presente documento se usan como parte de un método de puntuación de grados tumorales para facilitar la selección y/o predecir el resultado del tratamiento. Por ejemplo, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) descritas en el presente documento pueden usarse para diagnosticar o identificar el cáncer de un paciente como estadio I (p.ej. no localmente avanzado) prediciendo la necesidad de un tratamiento menos agresivo. Como alternativa, el agente terapéutico descrito en el presente documento puede usarse para diagnosticar o identificar el cáncer de un paciente como estadio II o III, (p.ej. el cáncer puede estar localmente avanzado) prediciendo la necesidad de un tratamiento más agresivo. De forma similar, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) descritas en el presente documento pueden usarse para diagnosticar o identificar el cáncer de un paciente como estadio IV, o si es metastásico, prediciendo la necesidad de un tratamiento muy agresivo.

En algunas realizaciones, el cáncer no es resecable. Un cáncer no resecable es una neoplasia maligna que no se puede extirpar quirúrgicamente, ya sea por el número de focos metastásicos o porque se encuentra en una zona de peligro quirúrgico. En algunas realizaciones, el agente terapéutico descrito en el presente documento se usa como parte de un método de tratamiento de tumores para facilitar la selección de la naturaleza y/o el momento/administración del tratamiento incluyendo, por ejemplo, administrando agentes anticancerosos que reducen el volumen tumoral, antes de la quimioterapia y/o tratamiento con radiación, y/o aumentar o disminuir la dosis de quimioterapia o radiación administrada a un paciente.

En algunas realizaciones, el cáncer es resistente a múltiples fármacos. Por ejemplo, el paciente puede haberse sometido a uno o más ciclos de quimioterapia, sin una respuesta sustancial. Como alternativa o además, el tumor tiene uno o más marcadores de resistencia a múltiples fármacos. Por tanto, como se usa en el presente documento, el término resistente a múltiples fármacos significa un cáncer que no responde a al menos un ciclo de quimioterapia combinada, o como alternativa, se ha clasificado (por diagnóstico) como resistente a al menos dos de (incluido el agente comparable a) docetaxel, paclitaxel, doxorrubicina, epirubicina, carboplatino, cisplatino, vinblastina, vincristina, oxaliplatino, carmustina, fluorouracilo, gemcitabina, ciclofosfamida, ifosfamida, topotecán, erlotinib, etopósido, y mitomicina. En algunas realizaciones, los agentes terapéuticos descritos en el presente documento son útiles para establecer si el tumor responde a uno o más quimioterápicos, radioterapia y/u otra terapia contra el cáncer.

En otras realizaciones, el cáncer es una recurrencia después de la quimioterapia convencional de un cáncer inicial. Con frecuencia, el cáncer recurrente ha desarrollado resistencia a los medicamentos y, por lo tanto, es particularmente difícil de tratar y, a menudo, tiene un pronóstico desfavorable en cuanto a la supervivencia.

En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) descritas en el presente documento se usan como parte de un método de evaluación tumoral que equivale a un estado funcional. El estado funcional puede cuantificarse utilizando cualquier sistema y método para calificar el estado funcional de un paciente que se conoce en la técnica. La medida a menudo se usa para determinar si un paciente puede recibir quimioterapia, ajustarse la dosis y/o para determinar la intensidad de los cuidados paliativos. Existen varios sistemas de puntuación, incluida la puntuación de Karnofsky y la puntuación de Zubrod. Los sistemas de puntuación paralela incluyen la puntuación de la Evaluación Global del Funcionamiento (GAF), que se ha incorporado como el quinto eje del Manual de Diagnóstico y Estadística (DSM) de psiquiatría.

Un estado funcional mayor (p. ej., de al menos aproximadamente el 80 %, o de al menos aproximadamente el 70 % utilizando el sistema de puntuación de Karnofsky) puede indicar el tratamiento para prevenir la progresión del estado de la enfermedad y mejorar la capacidad del paciente para aceptar la quimioterapia y/o la radioterapia. Por ejemplo, cuando el agente terapéutico descrito en el presente documento indica un estado funcional mayor, el paciente es ambulatorio y capaz de autocuidado. En otras realizaciones, cuando el agente terapéutico descrito en el presente documento indica un estado funcional bajo (p. ej., menos de aproximadamente el 50 %, menos de aproximadamente el 30 %, o menos de aproximadamente el 20 % usando el sistema de puntuación de Karnofsky), el paciente está confinado en gran medida en una cama o en una silla y está discapacitado incluso para el autocuidado.

La puntuación de Karnofsky va de 100 a 0, donde 100 es salud "perfecta" y 0 es muerte. La puntuación puede emplearse a intervalos de 10, donde: aproximadamente el 100 % es normal, sin quejas, sin signos de enfermedad; aproximadamente 90 % es capaz de llevar una actividad normal, pocos síntomas o signos de enfermedad, aproximadamente 80 % es actividad normal con alguna dificultad, algunos síntomas o signos; aproximadamente 70 % es capaz de realizar el cuidado personal, no es capaz de realizar actividades o trabajos normales; aproximadamente 60 % requiere algo de ayuda, puede encargarse de la mayoría de los requisitos personales; aproximadamente 50 % requiere ayuda a menudo, requiere atención médica frecuente; aproximadamente 40 % está discapacitado, requiere cuidados y ayuda especiales; aproximadamente 30 % está gravemente discapacitado, se indica el ingreso hospitalario pero no hay riesgo de muerte; aproximadamente 20 % está muy enfermo, requiere ingreso urgente, requiere medidas de apoyo o tratamiento; y aproximadamente 10 % está moribundo, procesos de enfermedad mortal de rápida progresión.

El sistema de puntuación de Zubrod para el estado funcional incluye: 0, totalmente activo, capaz de llevar a cabo todas las funciones previas a la enfermedad sin limitación; 1, limitado en la actividad física extenuante pero ambulatorio y capaz de realizar trabajos de naturaleza ligera o sedentaria, p. ej., trabajos domésticos ligeros, trabajo de oficina; 2, ambulatorio y capaz de todos los cuidados personales, pero no puede realizar ninguna actividad laboral, más de aproximadamente el 50 % de las horas de vigilia; 3, capaz solo de cuidados personales limitados, confinado en la cama o silla más de aproximadamente el 50 % de las horas de vigilia; 4, totalmente discapacitado, no puede realizar ningún tipo de cuidado personal, totalmente confinado en la cama o silla; 5, muerte.

En algunas realizaciones, las muestras histológicas de tumores se clasifican usando el agente terapéutico descrito en el presente documento de acuerdo con Elston & Ellis, Histopathology, 1991, 19:403-10. En algunas realizaciones, el agente terapéutico descrito en el presente documento es útil para establecer un grado tumoral para el diagnóstico o pronóstico de un cáncer particular.

En algunas realizaciones, las composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) descritas en el presente documento son útiles para evaluar un sujeto y/o una muestra de un sujeto (p.ej. un paciente con cáncer). En algunas realizaciones, la evaluación es uno o más de diagnóstico, pronóstico y/o respuesta al tratamiento.

El diagnóstico se refiere al proceso de intentar determinar o identificar una posible enfermedad o trastorno, tal como, por ejemplo, cáncer. El pronóstico se refiere a la predicción de un resultado probable de una enfermedad o trastorno, tal como, por ejemplo, cáncer. Un pronóstico completo a menudo incluye la duración esperada, la función y una descripción de la evolución de la enfermedad, tal como el deterioro progresivo, crisis intermitente, o crisis súbita, impredecible. La respuesta al tratamiento es una predicción del resultado médico de un paciente cuando recibe un tratamiento. Las respuestas al tratamiento pueden ser, a modo de ejemplo no limitante, respuesta patológica completa, supervivencia y probabilidad de recurrencia.

En diversas realizaciones, los métodos de diagnóstico y predicción descritos en el presente documento comprenden evaluar una presencia, ausencia o nivel de una proteína. En otra realización, los métodos descritos en el presente documento comprenden evaluar una presencia, ausencia o nivel de expresión de un ácido nucleico. Las composiciones descritas en el presente documento pueden usarse para estas mediciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento comprenden poner en contacto una muestra del tumor o células cultivadas del tumor con un agente terapéutico como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, la presente divulgación incluye la medición de una muestra de tumor, incluyendo muestras de biopsia o muestras quirúrgicas. En algunas realizaciones, la biopsia es una biopsia humana. En diversas realizaciones, la biopsia es cualquiera de una muestra de tejido tumoral congelado, células cultivadas, células tumorales circulantes y una muestra de tejido tumoral embebida en parafina y fijada con formalina. En algunas realizaciones, la muestra de tumor puede ser una muestra de biopsia, tal como una muestra de tejido tumoral congelado (criosección). Como se conoce en la técnica, una criosección puede emplear un criostato, que comprende un microtomo dentro de un congelador. La muestra quirúrgica se coloca en un disco de tejido metálico que luego se asegura en un portabrocas y se congela rápidamente a aproximadamente -20 °C a aproximadamente -30 °C. La muestra está embebida en un medio similar a un gel que consiste en, por ejemplo, polietilenglicol y poli(alcohol vinílico). El tejido congelado se corta congelado con la porción de microtomo del criostato, y el corte se recoge opcionalmente en un portaobjetos de vidrio y se tiñe. En algunas realizaciones, la muestra de tumor puede ser una muestra de biopsia, tal como células cultivadas. Estas células pueden procesarse usando las técnicas habituales de cultivo celular que se conocen en la técnica. Estas células pueden ser células tumorales circulantes. En algunas realizaciones, la muestra de tumor puede ser una muestra de biopsia, tal como una muestra de tejido tumoral fijada en formalina y embebida en parafina (FFPE). Como se conoce en la técnica, se puede colocar una muestra de biopsia en un recipiente con formalina (una mezcla de agua y formaldehído) o algún otro líquido para convservarla. La muestra de tejido se puede colocar en un molde con cera de parafina caliente. La cera se enfría para formar un bloque sólido que protege el tejido. Este bloque de cera de parafina con el tejido embebido se coloca en un microtomo, que corta rebanadas muy finas del tejido. En ciertas realizaciones, la muestra de tumor contiene menos de aproximadamente 100 mg de tejido, o en ciertas realizaciones, contiene aproximadamente 50 mg de tejido o menos. La muestra de tumor (o biopsia) puede contener de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 50 mg de tejido, tal como aproximadamente 35 mg de tejido. El tejido se puede obtener, por ejemplo, como una o más (p. ej., 1, 2, 3, 4, o 5) biopsias con aguja (p. ej., usando una aguja de calibre 14 o de otro tamaño adecuado). En algunas realizaciones, la biopsia es una aspiración con aguja fina en la que se inserta una aguja larga y delgada en un área sospechosa y se usa una jeringa para extraer líquido y células para el análisis. En algunas realizaciones, la biopsia es una biopsia con aguja gruesa en la que se usa una aguja grande con una punta de corte durante la biopsia con aguja gruesa para extraer una columna de tejido de un área sospechosa. En algunas realizaciones, la biopsia es una biopsia asistida por vacío en la que un dispositivo de succión aumenta la cantidad de líquido y células que se extraen a través de la aguja. En algunas realizaciones, la biopsia es una biopsia guiada por imagen en la que se combina una biopsia con aguja con un procedimiento de imagen, tal como, por ejemplo, rayos X, tomografía computarizada (CT), resonancia magnética (MRI) o ecografía. En otras realizaciones, la muestra puede obtenerse mediante un dispositivo tal como el sistema de biopsia MAMMOTOME®, que es un sistema de biopsia guiado por láser, asistido por vacío para la biopsia de mama.

En algunas realizaciones, los métodos y/o evaluación diagnósticos y predictivos pueden dirigir el tratamiento (incluido el tratamiento con los agentes terapéuticos descritos en el presente documento). En una realización, la evaluación puede dirigir el uso o mantener la terapia adyuvante para después de la resección. La terapia adyuvante, también llamada tratamiento adyuvante, es un tratamiento que se administra además del tratamiento primario, principal o inicial. A modo de ejemplo no limitante, la terapia adyuvante puede ser un tratamiento adicional generalmente administrado después de la cirugía donde se ha eliminado toda la enfermedad detectable, pero donde sigue habiendo un riesgo estadístico de recidiva debido a una enfermedad oculta. En algunas realizaciones, los agentes terapéuticos descritos en el presente documento se usan como terapia adyuvante en el tratamiento de un cáncer. En algunas realizaciones, los agentes terapéuticos descritos en el presente documento se usan como la única terapia adyuvante en el tratamiento de un cáncer. En algunas realizaciones, los agentes terapéuticos descritos en el presente documento se mantienen como terapia adyuvante en el tratamiento de un cáncer. Por ejemplo, si es poco probable que un paciente responda a un agente terapéutico descrito en el presente documento o que tenga una respuesta mínima, el tratamiento puede no administrarse en interés de la calidad de vida y para evitar la toxicidad innecesaria de quimioterapias ineficaces. En estos casos, se pueden usar los cuidados paliativos.

los agentes terapéuticos descritos en el presente documento se administran como una terapia neoadyuvante antes de la resección. En ciertas realizaciones, la terapia neoadyuvante se refiere a la terapia para reducir y/o degradar el tumor antes de cualquier cirugía. En algunas realizaciones, la terapia neoadyuvante significa quimioterapia administrada a pacientes con cáncer antes de la cirugía. En algunas realizaciones, terapia neoadyuvante significa un agente terapéutico descrito en el presente documento que se administra a pacientes con cáncer antes de la cirugía. Los tipos de cáncer para los que comúnmente se considera la quimioterapia neoadyuvante incluyen, por ejemplo, mama, colorrectal, ovárico, del cuello uterino, vejiga, y pulmón. En algunas realizaciones, los agentes terapéuticos

descritos en el presente documento se usan como terapia adyuvante en el tratamiento de un cáncer. En algunas realizaciones, el uso es previo a la resección. En algunas realizaciones, los agentes terapéuticos descritos en el presente documento se mantienen como terapia neoadyuvante en el tratamiento de un cáncer. Por ejemplo, si es poco probable que un paciente responda a un agente terapéutico descrito en el presente documento o que tenga una respuesta mínima, el tratamiento puede no administrarse en interés de la calidad de vida y para evitar la toxicidad innecesaria de quimioterapias ineficaces. En estos casos, se pueden usar los cuidados paliativos.

Sujetos y/o animales

En algunas realizaciones, el sujeto y/o animal es un mamífero, p. ej., un ser humano, ratón, rata, cobaya, perros, gato, caballo, vaca, cerdo, conejo, oveja, o primate no humano, tal como un mono, chimpancé,o babuino. En otras realizaciones, el sujeto y/o animal no es un mamífero, tal como, por ejemplo, un pez cebra. En algunas realizaciones, el sujeto y/o el animal pueden comprender células marcadas con fluorescencia (con, por ejemplo, GFP). En algunas realizaciones, el sujeto y/o animal es un animal transgénico que comprende una célula fluorescente.

En algunas realizaciones, el sujeto y/o animal es un ser humano. En algunas realizaciones, el ser humano es un ser humano pediátrico. En otras realizaciones, el ser humano es un ser humano adulto. En otras realizaciones, el ser humano es un ser humano geriátrico. En otras realizaciones, el ser humano se puede denominar como un paciente.

En ciertas realizaciones, el ser humano tiene una edad en el intervalo de aproximadamente 0 meses a aproximadamente 6 meses de edad, de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 meses de edad, de aproximadamente 6 a aproximadamente 18 meses de edad, de aproximadamente 18 a aproximadamente 36 meses de edad, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 años de edad, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 años de edad, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15 años de edad, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 años de edad, de aproximadamente 20 a aproximadamente 25 años de edad, de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 años de edad, de aproximadamente 30 a aproximadamente 35 años de edad, de aproximadamente 35 a aproximadamente 40 años de edad, de aproximadamente 40 a aproximadamente 45 años de edad, de aproximadamente 45 a aproximadamente 50 años de edad, de aproximadamente 50 a aproximadamente 55 años de edad, de aproximadamente 55 a aproximadamente 60 años de edad, de aproximadamente 60 a aproximadamente 65 años de edad, de aproximadamente 65 a aproximadamente 70 años de edad, de aproximadamente 70 a aproximadamente 75 años de edad, de aproximadamente 75 a aproximadamente 80 años de edad, de aproximadamente 80 a aproximadamente 85 años de edad, de aproximadamente 85 a aproximadamente 90 años de edad, de aproximadamente 90 a aproximadamente 95 años de edad o de aproximadamente 95 a aproximadamente 100 años de edad.

En otras realizaciones, el sujeto es un animal no humano y, por lo tanto, la invención se refiere al uso veterinario. En una realización específica, el animal no humano es una mascota doméstica. En otra realización específica, el animal no humano es un animal de ganado.

Kits

La divulgación proporciona kits que pueden simplificar la administración de cualquier agente descrito en el presente documento. Un ejemplo de kit de la invención comprende cualquier composición descrita en el presente documento en forma de forma farmacéutica. En una realización, la forma farmacéutica unitaria es un envase, tal como una jeringa precargada, que puede ser estéril, conteniendo cualquier agente descrito en el presente documento y un vehículo, diluyente, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. El kit puede comprender además una etiqueta o instrucciones impresas que instruyen sobre el uso de cualquier agente descrito en el presente documento. El kit también puede incluir un espéculo de tapa, anestésico tópico y un agente de limpieza para el lugar de administración. El kit también puede comprender además uno o más agentes adicionales descritos en el presente documento. En una realización, el kit comprende un envase que contiene una cantidad eficaz de una composición de la invención y una cantidad eficaz de otra composición, tal como la descrita en el presente documento.

Definiciones

Las siguientes definiciones se usan en relación con la invención divulgada en el presente documento. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.

Como se usa en el presente documento, "un", "uno", "uno/a", o "el/la" puede significar uno o más de uno.

Además, el término "aproximadamente" cuando se usa en relación con una indicación numérica referenciada significa la indicación numérica referenciada más o menos hasta 10 % de esa indicación numérica referenciada. Por ejemplo, la expresión "aproximadamente 50" cubre el intervalo de 45 a 55.

Una "cantidad eficaz", cuando se usa en relación con usos médicos, es una cantidad que es eficaz para proporcionar un tratamiento, prevención o reducción medible en la tasa de patogénesis de una enfermedad de interés.

Como se usa en el presente documento, algo "disminuye" si una lectura de actividad y/o efecto se reduce en una cantidad significativa, tal como en al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o más, hasta e incluyendo al menos aproximadamente el 100 %, en presencia de un agente o estímulo en relación con la ausencia de dicha modulación. Como entenderá un experto en la materia, en algunas realizaciones, la actividad disminuye y algunas lecturas posteriores disminuirán pero otras pueden aumentar.

Por el contrario, la actividad "aumenta" si una lectura de actividad y/o efecto aumenta en una cantidad significativa, por ejemplo en al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o más, hasta e incluyendo al menos aproximadamente el 100 % o más, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces, en presencia de un agente o estímulo, respecto a la ausencia de dicho agente o estímulo.

Como se cita en el presente documento, todos los porcentajes composicionales son en peso de la composición total, a menos que se especifique de otro modo. Como se usa en el presente documento, el término "incluir" y sus variantes, está destinado a ser no limitativo, de tal modo que citar artículos en una lista no excluya otros artículos similares que también pueden ser útiles en las composiciones y métodos de esta tecnología. De forma similar, los términos "puede" y "podría" y sus variantes están destinados a ser no limitativos, de tal modo que citar que una realización puede o podría comprender ciertos elementos o características no excluye otras realizaciones de la presente tecnología que no contienen esos elementos o características.

Aunque el término abierto "que comprende" como sinónimo de términos tales como que incluye, que contiene o que tiene, se usa en el presente documento para describir y reivindicar la invención, la presente invención, o realizaciones de la misma, puede describirse como alternativa usando términos alternativos tales como "que consiste en" o "que consiste esencialmente en".

Como se usa en el presente documento, las palabras "preferido" y "preferentemente" se refieren a realizaciones de la tecnología que ofrecen ciertos beneficios, en ciertas circunstancias. Sin embargo, también pueden ser preferentes otras realizaciones, en las mismas circunstancias u otras. Asimismo, citar una o más realizaciones preferentes no implica que otras realizaciones no sean útiles, y no pretende excluir otras realizaciones del ámbito de la invención.

La cantidad de composiciones descritas en el presente documento necesarias para lograr un efecto terapéutico puede determinarse empíricamente de acuerdo con procedimientos convencionales para el propósito particular. Generalmente, para la administración de los agentes terapéuticos (p.ej. composiciones relacionadas con la flagelina (y/o agentes adicionales) descritas en el presente documento) para fines terapéuticos, los agentes terapéuticos se administran a una dosis farmacológicamente eficaz. Una "cantidad farmacológicamente eficaz", "dosis farmacológicamente eficaz", "cantidad terapéuticamente eficaz", o "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para producir el efecto fisiológico deseado o una cantidad capaz de lograr el resultado deseado, particularmente para tratar el trastorno o enfermedad. Una cantidad eficaz como se usa en el presente documento incluiría una cantidad suficiente para, por ejemplo, retrasar el desarrollo de un síntoma del trastorno o enfermedad, alterar el curso de un síntoma del trastorno o enfermedad (p. ej., ralentizar la progresión de un síntoma de la enfermedad), reducir o eliminar uno o más síntomas o manifestaciones del trastorno o enfermedad, y revertir un síntoma de un trastorno o enfermedad. Por ejemplo, la administración de agentes terapéuticos a un paciente que padece cáncer proporciona un beneficio terapéutico no solo cuando la afección subyacente se erradica o mejora, sino también cuando el paciente refiere una disminución en la gravedad o duración de los síntomas asociados con la enfermedad, p. ej., una disminución en la masa tumoral, una disminución en las células tumorales circulantes, un aumento en la supervivencia libre de progresión. El beneficio terapéutico también incluye detener o ralentizar la progresión de la enfermedad o trastorno subyacente, independientemente de si produce una mejoría.

Las cantidades eficaces, la toxicidad y la eficacia terapéutica se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o en animales experimentales, p.ej., para determinar la DL50 (la dosis letal para aproximadamente el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en aproximadamente el 50 % de la población). La dosificación puede variar dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada. La relación de la dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción DL50/DE50. En algunas realizaciones, se prefieren composiciones y métodos que exhiben índices terapéuticos grandes. Una dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro, incluyendo, por ejemplo, ensayos de cultivo celular. También, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante que incluye la CI50 determinada en cultivo celular, o en un modelo en animales apropiado. Los niveles de las composiciones descritas en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento. Los efectos de cualquier dosis particular se pueden controlar mediante un bioensayo adecuado. La dosis puede ser determinada por un médico y ajustada, según sea necesario, para adaptarse a los efectos observados del tratamiento.

En ciertas realizaciones, el efecto dará como resultado un cambio cuantificable de al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 70 % o al menos aproximadamente el 90 %. En algunas realizaciones, el efecto dará como resultado un cambio cuantificable de aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 70 %, o incluso aproximadamente el 90 % o más. El beneficio terapéutico también incluye detener o ralentizar la progresión de la enfermedad o trastorno subyacente, independientemente de si produce una mejoría.

En ciertas realizaciones, una cantidad farmacológicamente eficaz que tratará el cáncer modulará los síntomas normalmente en al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 % o al menos aproximadamente el 50 %. En realizaciones ilustrativas, dichas modulaciones tendrán como resultado, por ejemplo, cambios estadísticamente significativos y cuantificables en los números de células cancerosas.

Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Diseño de composiciones relacionadas con la flagelina con eficacia mejorada respecto a CBLB502.

a. Análisis de la relación estructura-actividad (SAR):

Los resultados del análisis, que incluyeron una combinación de mutagénesis dirigidas al sitio y deleciones se ilustran en la FIG. 2. Las variantes resultantes de CBLB502 se expresaron en E. coli, se purificaron y caracterizaron por: (i) afinidad de la unión relativa en un sistema libre de células mediante un ensayo de polarización fluorescente (FP) basado en la competencia con un fragmento purificado recombinante de ectodominio de TLR5 de origen de pez y (ii) eficacia de la señalización relativa mediante un ensayo de indicador de luciferasa basado en células utilizando CBLB502 de tipo silvestre como referencia (como se describe en Yoon et al. (2012)). Este análisis confirmó el papel de los segmentos de aminoácidos y ciertos restos del dominio D1 en la formación de interfaces primarias y secundarias predichas a partir de la estructura 3d (FIG.3). También reveló la importancia del dominio D0 para la señalización (pero no la unión primaria) aunque el papel real de este dominio seguía siendo desconocido. Este análisis también reveló que solo el segmento C terminal de D0 (C_D0) es esencial, mientras que el segmento N terminal se puede eliminar sin pérdida de actividad de señalización (como en, por ejemplo, la variante de deleción S33 (SEQ ID NO: 17)).

El ensayo in vivo de la actividad de señalización de los mutantes en la interfaz primaria y secundaria, así como la variante de deleción delta-DO de CBLB502 revelaron una correlación con los datos de señalización in vitro. Esto se estableció mediante la inyección de dosis variables de los mutantes respectivos (proteínas recombinantes purificadas y destoxificadas) en ratones informadores de NF-KB-luciferasa y la medición de la actividad de luciferasa en varios órganos (Véase FIG. 4, paneles A-E).

Brevemente, los ratones indicadores de NF-kB luciferasa se inyectaron s.c. con mutantes de CBLB502 (tres ratones por grupo) tal como se indicó. Las cantidades relativas de inyección utilizadas se basaron en su eficacia de señalización en ensayos de indicador de NF-kB basados en células. Los órganos se recolectaron 3 horas después de la inyección y se congelaron rápidamente en hielo seco. Los homogeneizados de tejidos se prepararon por pulverización de órganos seguido de lisis usando tampón RIPA suplementado con inhibidores de la proteasa. Para los ensayos de luciferasa, se mezclaron 20 pl de cada lisado con 30 pl de reactivo de luciferina (sistema de ensayo de luciferasa Bright-Glo, Promega Inc.) y la actividad de luciferasa se cuantificó usando un luminómetro. La actividad de luciferasa se normalizó en función de la concentración de proteína medida con el ensayo de Bradford. Los resultados demuestran que si bien la respuesta en el hígado observada para el mutante S33 aumentó moderadamente aproximadamente 3 veces, este mutante mostró un aumento mucho más fuerte (> 10 veces con la misma dosis de 0,3 pg) observada en la vejiga y en el intestino grueso.

Durante el SAR sistemático adicional, se generó un gran número de variantes truncadas y se caracterizaron principalmente por la actividad de señalización (usando un ensayo de bioactividad CBLB502 basado en luciferasa o estándar usando el sistema indicador LacZ). Estas deleciones (parcialmente ilustradas por diagramas en la FIG. 5) permitió refinar los límites del núcleo esencial mínimo y abordar una posible relevancia de la longitud (de 33 aa a 12 aa) y la posición de la etiqueta (terminal N frente a C terminal), así como probar la posibilidad de minimizar una región conector (como en la construcción "33ML" (SEQ ID NO: 35)).

En la Tabla 2 se proporciona una lista de variantes de CBLB502 que comprende un análisis SAR extenso. Entre las observaciones más importantes, sin desear quedar ligado a la teoría, se encuentra en principio la posibilidad de eliminar al menos la mitad del segmento C_D0 nativo, dejando solo su mitad N terminal (470-485) protegida por la etiqueta His C terminal (la presencia de la caperuza es esencial para la actividad ya que la variante 33-485 pierde aproximadamente el 90 % de la actividad de señalización, véase la Tabla 2). Estas observaciones tomadas en conjunto sugieren, sin desear quedar ligado a la teoría, que el dominio D0 tiene solo una contribución menor (si la hay) a las interacciones directas con TLR5, y su papel puede estar limitado al mantener la integridad estructural del dominio D1. Por otro lado, el segmento residual C_D0 (470-485) no se puede eliminar ni reemplazar por la mitad C terminal de C_D0 (485-504) u otras secuencias (p. ej. fragmento de GFP como en CGD1 o el segmento N-DO como en una nueva construcción MF233 (SEQ ID NO: 123), véase a continuación la Tabla 2). Al mismo tiempo, algunos de los restos polares podrían ser reemplazados por alanina en este segmento sin una pérdida apreciable de actividad (véase la Tabla 2).

Tabla 2: Deleción/variantes de fusión de CBLB502

continuación

(continuación)

ID de C om o s ic ió n CE50 re la tiva fre n te a 502

Ghosh I Hamilton ADS Reqan, L. Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: application to the green fluorescent protein. J. Am. Chem. Soc. 122, 5668-5659 (2000)._____________________________________ Jeong, J. et al. Monitoring of conformational change in maltose binding protein using split green fluorescent protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 339, 647-651. (2006).

Latz E, Verma A, Visintin A, Gong M, Sirois CM, et al. (2007) Ligand-induced conformational changes allosterically activate Toll-like receptor 9. Nature. Immunology 8: 772-779.

En resumen, la variante CBLB502-485CT ("CBLB533" (SEQ ID NO: 71)) representa el resultado de la minimización final de CBLB502 sin pérdida de actividad de señalización (al menos in vitro). Esta variante (233 aa de longitud) es 30 % más corta que CBLB502 (329 aa). (Véase la FIG. 5).

La caracterización in vivo se realizó para el intermedio clave en la minimización: - CBLB502-S33 (SEQ ID NO: 17) sin segmento N_D0 eliminado y la etiqueta N terminal de 33aa original (FIG. 5). La proteína purificada recombinante respectiva mostró una actividad de señalización casi completa in vitro (Tabla 2). Sorprendentemente, los primeros resultados del ensayo in vivo en ratones indicadores de NF-kB-Luc realizados conjuntamente con CBLB502 revelaron una potencia sustancialmente mayor de CBLB502-S33 in vivo (FIG.6) basado en la imagen de Xenogen. Un análisis más cuantitativo de la actividad de luciferasa en órganos individuales mostró que si bien la respuesta en el hígado aumentó moderadamente, aproximadamente 3 veces, se observó una mejora mucho más fuerte (> 10 veces, con la misma dosis de 0,3 |jg) en la vejiga y en el intestino grueso (FIG.7).

Es importante destacar que, también se observó una respuesta mayor a nivel de potencia de radioprotección (FIG.8).

Esta observación sugiere, sin desear quedar ligado a la teoría, que una variante minimizada de CBLB502 puede usarse eficazmente para indicaciones contra el síndrome de radiación aguda (ARS) a dosis más bajas. Esta mayor potencia también puede manifestarse en modo de radiomitigación (administración posterior a la exposición). Esta expectativa está corroborada por la fuerte respuesta de citocinas observada (FIG.9) incluyendo las citocinas clave (G-CSF e IL-6) seleccionadas como biomarcadores FD de CBLB502 y que han demostrado ser mecánicamente esenciales para su actividad de radiomitigación (Burdelya et al. 2008).

Una razón aparente del aumento correlacionado de la actividad de CBLB502-S33 in vivo a nivel de la señalización de NF-kB, radioprotección y producción de citocinas (FD) es una FC sustancialmente mejorada (FIG.10). La persistencia mejorada de CBLB502-S33 en plasma podría reflejar una mayor estabilidad a la proteólisis o, lo más probable, una "captura" menos eficiente en ciertos órganos/tejidos (p.ej. en el hígado) y una eliminación más lenta de la circulación, lo que aumenta la exposición de otros tejidos. La última interpretación proporciona evidencia adicional de la contribución de tales tejidos (p.ej. células de sangre periférica) al mecanismo de acción del fármaco.

A modo de resumen no limitante, la caracterización de CBLB502-S33 mostró que el análisis SAR y la minimización iterativa proporcionan variantes de proteínas biológicamente activas con propiedades farmacológicas mejoradas. Esta información se utilizó para diseñar, manipular y caracterizar el diseño definitivo de CBLB533.

Los resultados SAR sugieren el diseño definitivo de CBLB533 basado en la variante CBLB502-485CT (con o sin mutaciones adicionales). Esta proteína se puede producir en cantidad suficiente y ser caracterizada in vivo de forma similar al análisis realizado para el candidato principal intermedio CBLB502-S33 expandido adicionalmente mediante el ensayo de las propiedades de radiomitigación. Es importante destacar que, proporcionaron un andamio óptimo para diseñar el candidato a fármaco Nextgen desinmunizado CBLB543.

Ejemplo 2: Diseño de composiciones relacionadas con la flagelina con antigenicidad reducida respecto a CBLB502.

Los anticuerpos anti-CBLB502 (preexistentes y/o provocados por el tratamiento con CBLB502) que muestran actividad neutralizante in vitro también deberían neutralizar su actividad de señalización de NF-kB (y, por lo tanto, terapéutica). Esto se confirmó en experimentos directos en ratones (FIG. 11). De hecho, la inyección de sueros humanos neutralizantes de CBLB502 o anticuerpos monoclonales en ratones indicadores de luciferasa NF-kB anula completamente la actividad luciferasa en lisados de órganos (vivos).

En este experimento, cinco grupos de ratones indicadores de NF-kB (3 por grupo) fueron inyectados por vía intravenosa con (1) PBS (2) suero no neutralizante, (3) suero neutralizante (sangrado del día 15) (4) mAb 7C (5) mAb 11D y los animales se desangraron después de 45 minutos. Los anticuerpos monoclonales se usaron a la dosis de 100 |jg por ratón. Se inyectó CBLB502 (1 |jg) por vía subcutánea a todos los ratones una hora después de la inyección inicial de anticuerpos. Se tomaron imágenes de los animales tres horas después de la inyección de CBLB502 y se extrajo el hígado para la preparación de lisados. Los resultados de este estudio se muestran en la Tabla 3.

La actividad específica de la luciferasa se midió según el siguiente protocolo. Se usó un bio-pulverizador para triturar las muestras de hígado en el hielo seco. Se añadieron 750 j l de 1x tampón de lisis indicador (Promega N.° cat E397A) 1x cóctel de inhibidor de proteasa (PIC, sigma P8340) y la mezcla homogeneizada se centrifugó a 13.000 rpm a 4 °C durante 30 minutos. El sobrenadante se recogió en un tubo Eppendorf limpio y se midió la concentración de proteína del sobrenadante. Se añadieron 20 j l de sobrenadante y 20 j l de tampón de luciferasa (Promega E2620). Todo se normalizó a la muestra de proteína más baja y se agregó en consecuencia, y el volumen del sobrenadante se ajustó usando el tampón de lisis con PIC. La actividad de luciferasa se midió en un lector de placas.

Tabla 3: Neutralización in vivo de CBLB502 por inyección de antisueros y anticuerpos (neutralizantes y no neutralizantes) en ratones indicadores.

A continuación se proporciona un breve resumen (y se ilustra en las Tablas 4, y 5 y FIG. 12).

Tabla 4: Cartografía de epítopos de CBLB502 y desinmunización

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Tabla 5: Antigenicidad de las variantes de deleción de CBLB502 por valoración de anticuerpos (ELISA) con múltiples antisueros humanos

Los estudios iniciales se basaron en la predicción computacional de epítopos lineales, un análisis comparativo de antigenicidad (evaluado por ELISA con una serie de muestras de suero humano) para una serie de variantes truncadas, y la observación de que la variante de deleción 445 (véase en la Tabla 2 la composición) perdió significativamente la antigenicidad, lo que apunta a la existencia del epítopo principal dentro de un segmento de aminoácidos bastante corto (440 - 470). Sin embargo, el análisis de la antigenicidad en varios mutantes generados basado en esta premisa no confirmó estas predicciones (véase la FIG. 12).

Basándose en estas observaciones, en el siguiente trabajo, el enfoque se ajustó al uso de epítopos estructurales (potencialmente no contiguos) predichos (FIG. 13), probando en mutantes intermedios la "antigenicidad neutralizante" evaluada por el grado de inhibición neutralizando Abs en el ensayo de señalización. Hemos avanzado desde el uso de un andamio de CBLB502 de tamaño completo hasta al primer prototipo truncado CBLB502-S33 (véase en la Tabla 2 la composición), y su modificación adicional S33MX (SEQ ID NO: 150).

En la primera serie de mutantes diseñados, se logró un progreso sustancial en la disminución de la sensibilidad a los anticuerpos monoclonales neutralizantes y los antisueros neutralizantes producidos contra CBLB502. Se observó una mejora en una serie de sueros humanos normales que contenían un título apreciable no inducido de anticuerpos neutralizantes.

Para abordar este problema, se diseñó y caracterizó una serie adicional de mutantes.

Como resultado de estas iteraciones, la mayoría de los epítopos neutralizantes se cartografiaron y eliminaron sin pérdida de actividad de señalización (véase la Tabla 4).

Para diseñar la primera generación del candidato a prototipo de CBLB502 "desinmunizado" completamente activo (CBLB543), se realizó lo siguiente.

Los datos de la cartografía de epítopos obtenidos como se describe anteriormente (véase la Tabla 5) proporcionaron la base para el diseño definitivo del candidato a prototipo CBLB543 desinmunizado (CBLB502-S33Mx (Se Q ID NO: 150)). Esta proteína fue diseñada y caracterizada por la actividad de señalización (sin cambios) y la antigenicidad neutralizante. Como se ilustra en la FIG. 14 (véase en la Tabla 4 los datos individuales), en esta proteína la antigenicidad neutralizante se redujo sustancialmente en comparación con CBLB502. La comparación adicional con CBLB502-S33ML (SEQ ID NO: 35), un andamio truncado utilizado para el diseño del prototipo muestra que este efecto se debe a una combinación de mutaciones y no a un tamaño reducido.

Ejemplo 3: Potencia y propiedades farmacológicas de las variantes desinmunizadas (CBLB502-33MX y CBLB502-S33).

Se llevaron a cabo estudios para evaluar las propiedades FC/FD de las composiciones relacionadas con flagelina seleccionadas. Específicamente, las propiedades Fc /FD de la proteína parcialmente desinmunizada CBLB502-33MX se compararon con las de CBLB502. En consecuencia, este estudio estableció las características funcionales y farmacológicas de la nueva variante diseñada CBLB502-33MX con "antigenicidad neutralizante" sustancialmente reducida y, por lo tanto, resistente a la neutralización por anticuerpos neutralizantes humanos en el ensayo de señalización in vitro.

Fase en vivo del estudio FC/FD: se utilizaron 320 ratones C57BI6 para el experimento en grupos de 10 ratones. Se inyectó por vía intravenosa CBLB502 (1 y 2 pg/kg) y 33MX (1 y 2 pg/kg). Los animales se sacrificaron después de 5 min, 15 min, 30 min, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas y 24 horas después del tratamiento, y se recogieron muestras de plasma.

Mediciones FC: la concentración de CBLB502 y 33MX en las muestras de plasma se midió de acuerdo con el protocolo estándar basado en ELISA utilizando curvas de calibración de CBLB502 y 33MX.

Los resultados de las mediciones FC se ilustran en la FIG. 15. FIG. 15, los paneles A y B muestran la cuantificación de CBLB502 y 33MX en muestras de plasma de ratón. (BLQ - por debajo del límite de cuantificación). Por lo tanto, CBLB502-33MX tiene propiedades FC muy similares a las de la CBLB502 original, es decir, se elimina de la circulación a aproximadamente la misma velocidad. En consecuencia, las características FC de CBLB502 no se anulan por las mutaciones que fueron diseñadas para desinmunizar la construcción (p.ej. en el contexto de CBLB502-33MX).

Se utilizaron las mismas 320 muestras de plasma para el perfil de citocinas para el análisis de las propiedades FD de 33MX en comparación con CBLB502. Los datos (FIG. 16) muestran que CBLB502-33MX tiene un perfil FD muy similar al de la CBLB502 original. En consecuencia, las características FD de CBLB502 tampoco se anulan por las mutaciones que fueron diseñadas para desinmunizar la construcción (p.ej. en el contexto de CBLB502-33MX).

La señalización in vivo de la CBLB502 original se comparó con una variante intermedia CBLB502-S33 (minimizada, antes de la desinmunización) y CBLB502-33MX, el producto final de la desinmunización de la Fase I. Se usó un ensayo de indicador de NF-KB-luciferasa en ratones y se inyectó a los ratones una de las siguientes proteínas: CBLB502 (en dosis de 0,1 pg, 0,3 pg, 1 pg y 3 pg); CBLB502-S33 (en dosis de 0,1 pg, 0,3 pg, 1 pg y 3 pg); y CBLB502-33MX (en dosis de 0,1 pg, 0,3 pg, 1 pg y 3 pg). 3 horas después del tratamiento, los ratones fueron sacrificados y se extrajeron los siguientes órganos y se congelaron a -80 °C: hígado, vejiga, intestino delgado e intestino grueso, corazón, bazo, pulmones, cerebro y riñones. La actividad de luciferasa en lisados de órganos se midió usando la solución Bright-Glo Luciferase Assay (Promega) y se presentó como actividad de luciferasa específica (RLU/mg de proteína /- EEM).

Los resultados del experimento mostrados en la FIG. 17 demuestran que la capacidad de activación de NF-kB del candidato 33MX desinmunizado es similar a S33 y CBLB502 y en algunos órganos (por ejemplo, intestino grueso y pulmones) incluso excede la actividad de estas proteínas en algunos órganos.

Por lo tanto, entre otros, este ejemplo muestra que esta variante desinmunizada CBLB502-33MX conservó o excedió completamente en algunos parámetros la actividad biológica y las características farmacológicas de la CBLB502 original.

Ejemplo 4: Eficacia in vivo de 33MX en un modelo murino de irradiación local de cabeza y cuello.

Los efectos in vivo de 33MX en el contexto de la irradiación se evaluaron en varias dosis en comparación con CBLB502. El tratamiento se inyectó 1 h después de cada irradiación, evitando daños y acelerando la recuperación del tejido después de la irradiación fraccionada de H&N.

Se evaluaron seis grupos de 8 ratones y se enumeran en el orden en que se presentan los datos en la FIG. 18 (en serie para 8 tipos de tejido, las barras identificadas de izquierda a derecha para cada tipo de tejido): Grupo 1 (vehículo): 6 Gy x 5 veces con un intervalo de 24 h (30 Gy total), inyección PBS-Tween 1 h después de cada IR, Grupo 6 (33MX, 0,03 pg): 6 Gy x 5 veces con un intervalo de 24 h (30 Gy total), inyección 0,03 pg 33MX 1 h después de cada IR, Grupo 5 (33MX, 0,1 pg): 6 Gy x 5 veces con un intervalo de 24 h (30 Gy total), inyección 0,1 pg 33MX 1 h después de cada IR, Grupo 4 (33Mx , 0,3 pg): 6 Gy x 5 veces con un intervalo de 24 h (30 Gy total), inyección 0,3 pg 33MX 1 h después de cada IR, Grupo 3 (33MX, 1 pg): 6 Gy x 5 veces con un intervalo de 24 h (30 Gy total), inyección 1 pg 33MX 1 h después de cada IR, y Grupo 2 (CBLB502, 0,1 pg): 6 Gy x 5 veces con un intervalo de 24 h (30 Gy total), inyección 0,1 pg de CBLB502 1 h después de cada IR (se determinó que esta dosis era particularmente eficaz en un estudio independiente).

Se hizo un análisis histopatológico de todos los ratones del epitelio, lengua, esófago superior, glándulas salivares y

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición relacionada con la flagelina, comprendiendo la composición una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 17 o que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 150, en donde la composición relacionada con la flagelina activa la señalización de TLR5 al mismo nivel que el de una SEQ ID NO: 2.

2. La composición relacionada con la flagelina de la reivindicación 1, en donde la composición tiene antigenicidad e inmunogenicidad reducidas en comparación con la SEQ ID NO: 2.

3. La composición relacionada con la flagelina de la reivindicación 1, en donde la composición relacionada con la flagelina demuestra una farmacocinética mejorada en comparación con la SEQ ID NO: 2.

4. La composición relacionada con la flagelina de la reivindicación 1, en donde la composición relacionada con la flagelina demuestra una retención in vivo mayor en comparación con la SEQ ID NO:2.

5. La composición relacionada con la flagelina de la reivindicación 1, que además comprende una etiqueta N terminal.

6. La composición relacionada con la flagelina de la reivindicación 1, que además comprende una etiqueta C terminal.

7. La composición relacionada con la flagelina de la reivindicación 1, en donde la composición relacionada con la flagelina induce la expresión mediada por NF-kB de una o más de las citocinas seleccionadas de IL-6, IL-12, quimioatrayente de queratinocitos (KC), IL-10, G-CSF, MCP-1, TNF-a, MIG, y MIP-2.

8. Una composición farmacéutica que comprende la composición relacionada con la flagelina de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. Una composición relacionada con la flagelina para usar en la estimulación de la señalización de TLR5 en sujeto que lo necesita, en donde la composición relacionada con la flagelina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 17 o que tiene al menos un 95 % identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 150, en donde la composición relacionada con la flagelina activa la señalización de TLR5 a un nivel igual al de una SEQ ID NO: 2.

10. La composición para el uso de la reivindicación 9, en donde el sujeto sufre daño inducido por radiación.

11. La composición para el uso de la reivindicación 10, en donde el sujeto ha sido sometido a una dosis letal de radiación.

12. La composición para el uso de la reivindicación 10, en donde el sujeto está siendo sometiendo a radioterapia.

13. La composición para el uso de la reivindicación 9, en donde la composición relacionada con la flagelina es para ser administrada antes de la exposición a la radiación.

14. La composición para el uso de la reivindicación 10, en donde la composición relacionada con la flagelina es para ser administrada durante la exposición a la radiación.

15. La composición para el uso de la reivindicación 10, en donde la composición relacionada con la flagelina es para ser administrada después de la exposición a la radiación.

16. La composición para el uso de la reivindicación 10, en donde la composición relacionada con la flagelina tiene una antigenicidad y una inmunogenicidad reducidas en comparación con la SEQ ID NO:2.