JP7195621B2 - 細胞殺傷剤 - Google Patents
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Description
本願は、2018年1月9日に、日本に出願された特願2018-001063号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
[1] 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有する、細胞殺傷剤。
[2] 前記配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが、
全てD-アミノ酸からなるペプチド、
配列番号1で表されるアミノ酸配列のうち、1~14番目のアミノ酸までがD-アミノ酸からなり、15~19番目のアミノ酸までがL-アミノ酸からなるペプチド、
配列番号1で表されるアミノ酸配列のうち、1~14番目のアミノ酸までがL-アミノ酸からなり、15~19番目のアミノ酸までがD-アミノ酸からなるペプチド、又は
全てL-アミノ酸からなるペプチドである、前記[1]の細胞殺傷剤。
[3] 細胞の異常増殖に起因する疾患の治療剤である、前記[1]又は[2]の細胞殺傷剤。
[4] 前記疾患が、癌である、前記[3]の細胞殺傷剤。
[5] 細胞の異常増殖に起因する疾患を発症している動物に対して、有効量の前記[1]~[4]のいずれかの細胞殺傷剤を投与する工程を有する、細胞の異常増殖に起因する疾患の治療方法。
本発明に係る細胞殺傷剤は、配列番号1で表されるアミノ酸配列(KLAKLAKKLAKLAKHLAHL)からなるペプチド(以下、「エフェクターペプチド」ということがある。)を有する。エフェクターペプチドは、アポトーシス誘導活性を有するペプチドとエンドソームエスケープ活性を有するペプチドがタンデムに連結されたペプチドである。本発明に係る細胞殺傷剤は、十分に小さいため、特段の取り込みシステムを介さなくても、標的細胞内へエンドサイトーシスにより取り込まれる。次いで、標的細胞内に取り込まれたエンドソームに内包された細胞殺傷剤は、エンドソームエスケープ活性を有するペプチド部位の作用によってエンドソーム膜が破壊される結果、標的細胞の細胞質へ放出される。細胞質へ放出された細胞殺傷剤は、アポトーシス誘導活性を有するペプチド部位の作用によって、ミトコンドリア膜を障害し、当該標的細胞のアポトーシスを誘導する。
A431細胞(ヒト上皮様細胞癌由来細胞株)に、C末端にmycタグを融合させたヒトCNGB3をコードする遺伝子を導入して強制発現させた形質転換細胞(A431-CNGB3-myc細胞)を、子宮内膜症モデル細胞として調製した。
免疫不全マウス(NOD/ShiJic-scid Jcl系統、日本クレア社より供給)の腹腔に、A431-CNGB3-myc細胞を移植して、子宮内膜症モデルマウスを作製した。
具体的には、凍結保存してあるA431-CNGB3-myc細胞を解凍した後、10cmディッシュ(Lot No. F3BAXQ103:Thermo Fisher Scientific社製)を用いて2回継代した。この細胞を1×106cells/0.5mL/bodyとなるように培養培地を加えて調製した細胞液を、投与液とした。この投与液を、調製後可及的速やかに、7週齢の雌の免疫不全マウスに腹腔内投与することにより、A431-CNGB3-myc細胞を移植した。
マウスに移植する腫瘍組織は、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した卵巣癌細胞株(OVCAR3-Luc細胞、他施設より移譲)を培養したものを用いた。OVCAR3-Luc 細胞の培養は、RPMI medium 1640(11875-093:Gibco社製)に10%の非働化FBS(Corning社製)を含有させた培地を培養培地として、37℃、5容量%二酸化炭素環境下で行った。継代は2~3日ごとに行った。
細胞増殖能が亢進している2種類の癌細胞(A431-CNGB3-myc細胞とOVCAR3-Luc細胞)に対して、それぞれ、各ペプチドの細胞殺傷活性を調べた。使用したペプチドのアミノ酸配列を表1に示す。表1に記載のペプチドのうち、K14D-H5Dペプチドは、全てD-アミノ酸から構成された、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。K14Dペプチドは、全てD-アミノ酸から構成されたKLAKペプチドであり、H5Dペプチドは、全てD-アミノ酸から構成されたHLAHペプチドである。K14D-H5D-Z13ペプチドは、K14D-H5DペプチドのC末端に、L-アミノ酸から構成されたZ13ペプチドを付加したものである。K7D-H18Dペプチドは、全てD-アミノ酸から構成された、配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
各ペプチドの細胞殺傷活性の評価は、CellTiter-Glo(登録商標)アッセイキット(プロメガ社製)を用いて、各ペプチドで処理した細胞のATP量を測定して行った。
300μMのK14D-H5Dペプチドで処理したA431-CNGB3-myc細胞と、ペプチド未処理のA431-CNGB3-myc細胞について、TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)染色を行った。この結果、K14D-H5Dペプチドで処理したA431-CNGB3-myc細胞は、ほぼ全ての細胞の核が褐色に染色されており(TUNEL陽性)、かつ、ペプチド未処理のA431-CNGB3-myc細胞に比べて明らかに細胞が少なかった。これに対して、ペプチド未処理のA431-CNGB3-myc細胞では、核が褐色に染色された細胞はみつからなかった。これらの結果から、K14D-H5Dペプチドは、アポトーシスを誘導し、細胞殺傷効果を示すことが確認された。
子宮内膜症モデルマウスに、実施例1で用いたK14D-H5Dペプチドを投与し、子宮内膜細胞に対する細胞殺傷活性を調べた。
A431-CNGB3-myc細胞を腹腔内に移植してから7日後の子宮内膜症モデルマウスに対して、イソフルラン麻酔下で、腹腔内に、37℃に温めた生理的食塩液0.5mLを入れてマッサージした直後に、K14D-H5Dペプチドを生理食塩水に溶解させた溶液を腹腔内投与した。K14D-H5Dペプチドは、マウスの体重当たりの投与量が0mg/10mL/kg(対照)(n=7)、5mg/10mL/kg(n=8)、又は10mg/10mL/kg(n=8)となるように投与した。
K14D-H5Dペプチドを投与した子宮内膜症モデルマウスは、ペプチド投与から24時間後に、イソフルラン麻酔下で放血死させ、腹膜を採取した。ATP測定用腹膜は、液体窒素で凍結後、測定までディープフリーザで保管した。病理標本作製用腹膜は、10%中性緩衝ホルマリンに浸漬して固定した後、冷蔵で保管した。
各マウスは、A431-CNGB3-myc細胞を腹腔内に移植してから7日後のK14D-H5Dペプチド投与前と放血死させる前に、体重を測定した。
ATP量測定は、CellTiter-Glo(登録商標)アッセイキット(プロメガ社製)を用いて行った。凍結した腹膜の重量を測定し、凍結組織の10倍量のCellTiter-Glo bufferを加えてホモジナイズした後、遠心により上清を回収し、これをライセートとした。このライセートに2倍量のPBS及びライセートと同量の2×CellTiterGlo Reagentを加えて撹拌したものを反応溶液とし、この反応溶液を10分間室温で静置した。室温静置後の反応溶液の発光強度(RLU)を、Synergy H1 ハイブリッドマルチモードマイクロプレートリーダー(BioTek社製)を用いて測定した。全ての試行はtriplicate(n=3)で測定し、その平均を各反応溶液の発光強度(RLU)の測定値とした。
OVCAR3-Lucマウスに対して、実施例1で用いたK14D-H5Dペプチドを経静脈投与し、癌細胞に対する細胞殺傷活性作用を調べた。
OVCAR3-Luc細胞を皮下移植してから14日後のOVCAR3-Lucマウスに対して、1日1回、6日間連続して、K14D-H5Dペプチドを生理食塩水に溶解させた溶液50μLを尾静脈から投与した。K14D-H5Dペプチドは、マウスの体重当たりの投与量が0μmol/kg/day(対照)、又は1.17μmol/kg/dayとなるように投与した。
各マウスに対して発光イメージング検査を行い、背中の腫瘤のphoton数と腫瘍組織の大きさを経時的に測定した。
ルシフェリン-ルシフェラーゼ発光機構を利用し、in vivo発光イメージング装置を用いて測定した。まず、OVCAR3-Lucマウスをイソフルラン吸入麻酔にて沈静化させた後、腹腔内に、100μLのD-ルシフェリンカリウム溶解液(D-ルシフェリンカリウム(126-05116:和光純薬工業社製)を終濃度30mg/mLとなるようにPBSに溶解させた溶液)を投与した。投与から15分後に、当該マウスをin vivo発光イメージング装置で測定し、Photon数を計測した。in vivo発光イメージング装置としては、超高感度冷却CCDカメラによる光定量化in vivoイメージング機器であるIVIS Imaging System(IVIS200:住商ファーマインターナショナル社製)を用いた。
各OVCAR3-Lucマウスの背部の推定腫瘍体積(mm3)は、腫瘍の長径と短径から、下記式により求めた。なお、腫瘍の長径(mm)と短径(mm)は、ノギスを用いて測定した。
ペプチド投与前日の測定値を比較対象とした場合のPhoton数測定による腫瘍増大が、10倍又は20倍に達した場合を安楽死条件として、各マウスの生存率の算出を行った。観察は20日間行い、生存曲線は、カプランマイヤー法により分析した。
Claims (5)
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有する(ただし、前記配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのC末端がアラニンと結合するものを除く)、細胞殺傷剤。
- 前記配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが、
全てD-アミノ酸からなるペプチド、
配列番号1で表されるアミノ酸配列のうち、1~14番目のアミノ酸までがD-アミノ酸からなり、15~19番目のアミノ酸までがL-アミノ酸からなるペプチド、
配列番号1で表されるアミノ酸配列のうち、1~14番目のアミノ酸までがL-アミノ酸からなり、15~19番目のアミノ酸までがD-アミノ酸からなるペプチド、又は
全てL-アミノ酸からなるペプチドである、請求項1に記載の細胞殺傷剤。 - 細胞の異常増殖に起因する疾患の治療剤である、請求項1又は2に記載の細胞殺傷剤。
- 前記疾患が、癌である、請求項3に記載の細胞殺傷剤。
- 細胞の異常増殖に起因する疾患を発症している動物(ただし、ひとを除く)に対して、有効量の請求項1~4のいずれか一項に記載の細胞殺傷剤を投与する工程を有する、細胞の異常増殖に起因する疾患の治療方法。
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