JP6613499B2

JP6613499B2 - 細胞殺傷剤

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Publication number: JP6613499B2
Application number: JP2017161556A
Authority: JP
Inventors: 一廣杉原; 尚裕金山; 雄一郎小野寺; 道子福田; 元裕野中
Original assignee: Fujita Health University
Current assignee: Fujita Health University
Priority date: 2017-08-24
Filing date: 2017-08-24
Publication date: 2019-12-04
Anticipated expiration: 2037-08-24
Also published as: CA3073392A1; EP3738601A1; CN111065403A; AU2018322305B2; CN111065403B; US20200289608A1; SG11202001484QA; WO2019039540A1; JP2019038772A; KR20200031670A; CA3073392C; US11357819B2; US20220280596A1; EP3738601A4; AU2018322305A1; KR102427844B1

Description

本発明は、標的の細胞に対して選択的にアポトーシスを誘導し得るペプチド薬剤に関する。

アポトーシスは、多細胞生物の細胞死のうち、増殖制御機構として管理・調節された細胞死である。多細胞生物においては、発生や再生過程で生じた不要な細胞や有害な細胞の排除を、これらの細胞にアポトーシスを誘導することによって行っている。また、アポトーシスを疾患の原因となる細胞に誘導させて排除することにより、病態の改善が期待できることから、アポトーシスを誘導する活性を持つ物質を医薬用途へ利用することも行われている。例えば、癌細胞に対してアポトーシスを誘導させることにより、癌を寛解又は治癒することが期待できる。

アポトーシス誘導を疾患の治療に利用する場合には、アポトーシスを誘導する標的細胞に対する選択性が非常に重要である。標的選択性が低く、標的細胞以外の細胞に対してアポトーシスを誘導してしまうと、副作用が期待される治療効果を上回り、安全性の点から治療薬としては不適当である。標的細胞に対してのみ特異的にアポトーシスを誘導することができれば、副作用が充分に抑制された効果的な治療薬となり得る。

子宮内膜症は、子宮内膜細胞が子宮内腔以外の部位で増殖する疾患である。多くのケースにおいて、骨盤の腹膜や卵巣内で子宮内膜細胞が増殖する。代表的な症状は、月経痛（月経困難症）や不妊症であり、また、激しい疼痛が起こり、失神することもあるほど重篤な場合がある。さらに、子宮内膜症を発生母体として癌が発症する場合もある。子宮内膜細胞は女性ホルモン（エストロゲン）の刺激を受けて増殖するため、子宮内膜症の治療薬としては、エストロゲンの分泌を抑制するようなホルモン剤、例えば、低用量ピル、プロゲステロン受容体に対する選択的なアゴニスト（卵巣機能及び子宮内膜細胞増殖に対する抑制剤）、ＧｎＲＨアゴニスト（卵胞刺激ホルモンの分泌抑制剤）が使用されている。ただし、根治療法は子宮と卵巣を摘出する手術しかなく、子宮内膜症の根治が望める治療薬の開発が求められている。

例えば特許文献１には、子宮内膜症細胞（子宮内膜以外に存在する子宮内膜細胞）の細胞表面に特異的に発現しており、腹膜表面には発現していない分子であるＣＮＧＢ３（cyclic nucleotide-gated channel beta 3）に特異的に結合するＺ１３ペプチドとエンドソームエスケープペプチドとの融合ペプチドと、Ｚ１３ペプチドとアポトーシス誘導ペプチドとの融合ペプチドとを含むペプチド組成物が開示されている。両ペプチドを、Ｚ１３ペプチド部分により子宮内膜症細胞に共に取り込ませることにより、子宮内膜症細胞に対して選択的にアポトーシスを誘導させることができる。実際に、子宮内膜症を発症しているヒヒに、Ｚ１３ペプチドとエンドソームエスケープペプチドとの融合ペプチドと、Ｚ１３ペプチドとアポトーシス誘導ペプチドとの融合ペプチドとを含むペプチド組成物を、腹腔鏡を介して腹膜に投与したところ、子宮内膜症の病変の細胞のみ選択的にアポトーシスが誘導され、隣接するその他の細胞ではアポトーシスは誘導されなかった（非特許文献１参照。）。

米国特許出願公開第２０１６／１４５３０８号明細書

Sugihara，et al.，NATURE COMMUNICATIONS、２０１４年、第５巻、記事番号４４７８．

本発明は、標的の細胞に対して選択的にアポトーシスを誘導し得るペプチド薬剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、Ｚ１３ペプチドとエンドソームエスケープペプチドとの融合ペプチドと、Ｚ１３ペプチドとアポトーシス誘導ペプチドとの融合ペプチドとを含むペプチド組成物よりも、特定のペプチド配列からなるエンドソームエスケープペプチドと特定のペプチド配列からなるアポトーシス誘導ペプチドとＺ１３ペプチドとの融合ペプチドのほうが、より高い選択性で効率よく、ＣＮＧＢ３を発現している子宮内膜細胞に対してアポトーシスを誘導できることを見出した。さらに、ＣＮＧＢ３が、子宮内膜及び網膜のみならず、幾つかの癌細胞でも発現していることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下の細胞殺傷剤を提供するものである。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、標的分子と選択的に結合する部位とが、直接的又はリンカーを介して間接的に連結されている（ただし、前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのＣ末端にアラニンが連結されている場合を除く）、細胞殺傷剤。
［２］前記標的分子が、細胞又は組織表面に存在する分子である、前記［１］の細胞殺傷剤。
［３］前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが、
全てＬ−アミノ酸からなるペプチド、
配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１〜１４番目のアミノ酸までがＤ−アミノ酸からなり、１５〜１９番目のアミノ酸までがＬ−アミノ酸からなるペプチド、
配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１〜１４番目のアミノ酸までがＬ−アミノ酸からなり、１５〜１９番目のアミノ酸までがＤ−アミノ酸からなるペプチド、又は
全てＤ−アミノ酸からなるペプチドである、前記［１］又は［２］の細胞殺傷剤。
［４］前記標的分子と選択的に結合する部位がペプチド又はタンパク質であり、前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと前記標的分子と選択的に結合する部位とが直接的又は間接的に連結されている、前記［１］〜［３］のいずれかの細胞殺傷剤。
［５］前記標的分子が、ＣＮＧＢ３（cyclic nucleotide-gated channel beta 3）又はアネキシンIである、前記［１］〜［４］のいずれかの細胞殺傷剤。
［６］前記標的分子と選択的に結合する部位が、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、
前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの下流に、前記標的分子と選択的に結合する部位が直接的又は間接的に連結されている、前記［１］の細胞殺傷剤。
［７］前記標的分子と選択的に結合する部位が、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、
前記標的分子と選択的に結合する部位の下流に、前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが直接的又は間接的に連結されている、前記［１］の細胞殺傷剤。
［８］細胞の異常増殖に起因する疾患の治療剤である、前記［１］〜［７］のいずれかの細胞殺傷剤。
［９］前記疾患が、子宮内膜症又は癌である、前記［８］の細胞殺傷剤。

本発明に係る細胞殺傷剤は、非常に効率よく標的の細胞に対してアポトーシスを誘導できる。このため、当該細胞殺傷剤は、特に、子宮内膜症や癌等の細胞の異常増殖に起因する疾患の治療剤として有効である。
また、本発明に係る子宮内膜症モデル動物は、子宮内膜症の治療剤候補物質に対する薬効試験等に有用である。

参考例１において、各ペプチドで処理した反応溶液の発光強度（RLU）の測定結果を示した図である。実施例１において、各ペプチドで処理した反応溶液の発光強度（RLU）の測定結果を示した図である。実施例２において、ペプチド８とペプチドＡ１〜Ａ６の各ペプチドで処理した反応溶液の発光強度（RLU）の測定結果を示した図である。実施例２において、ペプチド８とペプチドＢ１〜Ｂ７の各ペプチドで処理した反応溶液の発光強度（RLU）の測定結果を示した図である。実施例３において、各ペプチドで処理した反応溶液の発光強度（RLU）の測定結果を示した図である。実施例４において、ペプチドＡ２で処理したA431-CNGB3-myc細胞の生存細胞数の測定結果を示した図である。実施例４において、ペプチドＡ２で処理したA431-CNGB3-myc細胞に対してApop-Tag assayと核染色を行った染色像である。実施例５において、ペプチドＡ２を腹腔内に単回投与した子宮内膜症モデルマウスの腹膜の発光強度（RLU）の測定結果を示した図である。実施例５において、ペプチドＡ２を腹腔内に複数回投与した子宮内膜症モデルマウスの腹膜の発光強度（RLU）の測定結果を示した図である。実施例６において、各ペプチドで処理したA431-CNGB3-myc細胞の相対ＡＴＰ量（％）の測定結果を示した図である。実施例６において、各ペプチドで処理したishikawa細胞の相対ＡＴＰ量（％）の測定結果を示した図である。実施例６において、各ペプチドで処理したSNG-II細胞の相対ＡＴＰ量（％）の測定結果を示した図である。実施例６において、各ペプチドで処理したHec-1A細胞の相対ＡＴＰ量（％）の測定結果を示した図である。実施例６において、各ペプチドで処理したRL95-2細胞の相対ＡＴＰ量（％）の測定結果を示した図である。実施例８において、ＩＦ７（ＲＲ）−（Ｋ＋Ｈ）ペプチドを投与した担癌マウスのｐｈｏｔｏｎ数の増大率（％）を経時的に測定した結果を示した図である。実施例８において、ＩＦ７（ＲＲ）−（Ｋ＋Ｈ）ペプチドを投与した担癌マウスの腫瘍体積の増大率（％）を経時的に測定した結果を示した図である。

＜細胞殺傷剤＞
本発明に係る細胞殺傷剤は、配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫＨＬＡＨＬ）からなるペプチド（以下、「エフェクターペプチド」ということがある。）と、標的分子と選択的に結合する部位とを有する。エフェクターペプチドは、アポトーシス誘導活性を有するペプチドとエンドソームエスケープ活性を有するペプチドがタンデムに連結されたペプチドである。本発明に係る細胞殺傷剤は、標的分子と選択的に結合する部位を介して標的分子と結合し、標的細胞内へエンドサイトーシスにより取り込まれる。次いで、標的細胞内に取り込まれたエンドソームに内包された細胞殺傷剤は、エンドソームエスケープ活性を有するペプチド部位の作用によってエンドソーム膜が破壊される結果、標的細胞の細胞質へ放出される。細胞質へ放出された細胞殺傷剤は、アポトーシス誘導活性を有するペプチド部位の作用によって、ミトコンドリア膜を障害し当該標的細胞のアポトーシスを誘導する。

本発明に係る細胞殺傷剤は、一分子中に、アポトーシス誘導活性を有するペプチド部分、エンドソームエスケープ活性を有するペプチド部分、及び標的分子と選択的に結合する部位の全てを含む。このため、標的分子と選択的に結合するペプチドとアポトーシス誘導活性を有するペプチドを連結させたペプチドと、標的分子と選択的に結合するペプチドとエンドソームエスケープ活性を有するペプチドを連結させたペプチドとをそれぞれ独立に含むペプチド組成物と比較して、非常に効率よく、標的細胞にアポトーシスを誘導することができる。

なお、本発明及び本願明細書において、「標的細胞」は、アポトーシスを誘導したい対象の細胞である。「標的分子」は、アポトーシスを誘導したい対象の細胞の表面又は当該細胞が存在する組織表面に存在する分子であって、本発明に係る細胞殺傷剤が選択的に結合する分子である。

特許文献１に開示されているように、ＫＬＡＫの４アミノ酸の繰り返しからなるアミノ酸配列（以下、「ＫＬＡＫ配列」ということがある。）からなるペプチド（以下、「ＫＬＡＫペプチド」ということがある。）は、ミトコンドリア膜を障害してアポトーシスを誘導する作用（アポトーシス誘導活性）を有し、ＨＬＡＨの４アミノ酸の繰り返しからなるアミノ酸配列（以下、「ＨＬＡＨ配列」ということがある。）からなるペプチド（以下、「ＨＬＡＨペプチド」ということがある。）は、エンドソームの膜を破壊する作用（エンドソームエスケープ活性）を有する。ＫＬＡＫペプチドとＨＬＡＨペプチドを連結したペプチドは、エンドソームエスケープ活性とアポトーシス誘導活性を有するが、その活性の強さは、それぞれのペプチドのアミノ酸の長さと、連結の順番に影響を受ける。ＫＬＡＫペプチドの下流（Ｃ末端）にＨＬＡＨペプチドを連結したペプチドと、ＨＬＡＨペプチドの下流（Ｃ末端）にＫＬＡＫペプチドを連結したペプチドとは、いずれもエンドソームエスケープ活性とアポトーシス誘導活性を有するが、ＫＬＡＫペプチドの下流（Ｃ末端）にＨＬＡＨペプチドを連結したペプチドのほうが、アポトーシス誘導活性が高い。

配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエフェクターペプチドは、１４アミノ酸からなるＫＬＡＫ配列の下流に、５アミノ酸からなるＨＬＡＨ配列が連結されたペプチドである。すなわち、配列番号１のアミノ酸配列のうち、１〜１４番目のアミノ酸までがアポトーシス誘導活性を有する部位であり、１５〜１９番目のアミノ酸までがエンドソームエスケープ活性を有する部位である。このエフェクターペプチドは、標的細胞にエンドサイトーシスで取り込まれた場合に、最も高いアポトーシス誘導活性が得られるように、ＫＬＡＫ配列の長さ、ＨＬＡＨ配列の長さ、及びＫＬＡＫ配列とＨＬＡＨ配列の連結の順番が最適化されたペプチドである。このエフェクターペプチドを有しているため、本発明に係る細胞殺傷剤は、非常に高いアポトーシス誘導活性を持つ。

本発明に係る細胞殺傷剤が有するエフェクターペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであれば特に限定されるものではなく、Ｌ−アミノ酸からなるペプチドであってもよく、Ｄ−アミノ酸からなるペプチドであってもよく、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸からなるペプチドであってもよい。エンドソーム内における安定性が高く、より高いアポトーシス誘導活性が得られることから、エフェクターペプチドは、少なくとも一部にＤ−アミノ酸を含むペプチドであることが好ましく、ＫＬＡＫ配列（配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１〜１４番目のアミノ酸）とＨＬＡＨ配列の（配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１５〜１９番目のアミノ酸）少なくとも一方がＤ−アミノ酸からなるペプチドであることがより好ましく、全てＤ−アミノ酸からなるペプチドであることが特に好ましい。

本発明に係る細胞殺傷剤において、標的分子と選択的に結合する部位と配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエフェクターペプチドは、直接結合していてもよく、リンカーを介して間接的に結合していてもよい。当該リンカーとしては、特に限定されるものではなく、例えば、１〜２０個のアミノ酸程度のペプチド、糖鎖、ポリエチレングリコール、ポリオレフィン等が挙げられる。合成が比較的容易であることから、本発明に係る細胞殺傷剤としては、標的分子と選択的に結合する部位がペプチド又はタンパク質であり、エフェクターペプチドと直接又は１〜２０個のアミノ酸程度のペプチドを介して結合しているものが好ましい。また、本発明に係る細胞殺傷剤において、標的分子と選択的に結合する部位は、標的分子との結合性が阻害されない限り、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエフェクターペプチドのＮ末端側に連結されていてもよく、Ｃ末端側に連結されていてもよい。

本発明に係る細胞殺傷剤における標的分子と選択的に結合する部位は、特に限定されるものではなく、標的分子に合わせて決定される。当該部位は、ペプチドやタンパク質であってもよく、オリゴヌクレオチドや核酸であってもよく、糖鎖であってもよく、脂質であってもよく、低分子化合物であってもよい。

なお、本発明に係る細胞殺傷剤が選択的に結合する標的分子としては、アポトーシスを誘導する標的細胞又は組織の表面に存在している分子であれば特に限定されるものではなく、タンパク質であってもよく、糖鎖であってもよく、脂質であってもよい。

本発明に係る細胞殺傷剤の選択性が高くなり、各種疾患の治療剤として使用した場合に副作用を低減させられる。このことから、本発明に係る細胞殺傷剤が選択的に結合する標的分子としては、標的細胞の表面又は当該標的細胞を含む組織の表面における発現量が、その他の多くの細胞及び組織における発現量と比較して顕著に多い分子であることが好ましく、標的細胞の表面又は当該標的細胞を含む組織の表面に特異的に発現している分子がより好ましい。

例えば、ＣＮＧＢ３は、正常組織では、子宮内膜と網膜においてのみ発現している膜タンパク質である。このため、本発明に係る細胞殺傷剤のうち標的分子をＣＮＧＢ３としたものは、子宮内膜や網膜の細胞に対して特異的にアポトーシスを誘導できる細胞殺傷剤であり、子宮内膜や網膜の疾患に対する治療薬として有用である。特に、腹腔や骨盤における正常細胞にはアポトーシスを誘導せず、子宮内膜症細胞に対して選択的にアポトーシスを誘導できるため、子宮内膜症の治療薬として非常に好適である。

また、ＣＮＧＢ３は、様々な癌細胞でも発現している。このため、本発明に係る細胞殺傷剤のうち標的分子をＣＮＧＢ３としたものは、ＣＮＧＢ３を発現している癌細胞に対する選択性が高く、副作用が抑えられた抗癌剤として有用である。ＣＮＧＢ３を発現している癌としては、例えば、子宮癌、子宮頸癌、骨盤腔癌、卵巣癌、乳癌、腹壁腫瘍、大網腫瘍、食道癌、胃癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、盲腸癌、胆嚢癌、膵臓癌、肝臓癌、脾臓癌、腎臓癌、舌癌、咽頭癌、鼻癌、耳下腺癌、甲状腺癌、悪性リンパ腫、骨腫瘍、皮膚癌、肺癌、縦隔癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、脳腫瘍等が挙げられる。同種の組織に由来する癌細胞であっても、ＣＮＧＢ３が発現している癌細胞と発現していない癌細胞がある。このため、本発明に係る細胞殺傷剤のうち標的分子をＣＮＧＢ３としたものを抗癌剤として使用する場合には、予め、生検等により、標的とする癌細胞がＣＮＧＢ３を発現している細胞であることを確認するほうが好ましい。

ＣＮＧＢ３を標的分子とする場合、標的分子と選択的に結合する部位としては、例えば、配列番号２（ＶＲＲＡＸＮＸＰＧ；Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸を表す。）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるペプチド（以下、これらのペプチドを「ＣＮＧＢ３結合性ペプチド」ということがある。）が挙げられる（特許文献１）。配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるペプチドとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１個、２個、又は３個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつＣＮＧＢ３に対する結合能を保持しているペプチドや、配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上の配列同一性を有しており、かつＣＮＧＢ３に対する結合能を保持しているペプチドが挙げられる。ＣＮＧＢ３結合性ペプチドとしては、具体的には、配列番号３（ＶＲＲＡＤＮＲＰＧ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｚ１３ペプチド」ということがある。）、配列番号４（ＶＲＲＡＥＮＲＰＧ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号５（ＶＲＲＡＮＮＬＰＧ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号６（ＶＲＲＡＮＮＲＰＧ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。

ＣＮＧＢ３を発現している細胞に対してより強いアポトーシス誘導活性を有するため、標的分子をＣＮＧＢ３とした細胞殺傷剤としては、Ｚ１３ペプチドと前記エフェクターペプチドが直接又はリンカーを介して間接的に連結されたものが好ましく、Ｚ１３ペプチドと前記エフェクターペプチドが直接又は１〜２０個のアミノ酸からなるペプチドを介して連結されたペプチドであることがより好ましく、前記エフェクターペプチドのＣ末端にＺ１３ペプチドが直接又は１〜２０個のアミノ酸からなるペプチドを介して連結されたペプチドであることがさらに好ましく、前記エフェクターペプチドのＣ末端がＺ１３ペプチドのＮ末端と直接連結したペプチド（配列番号２６：ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫＨＬＡＨＬＶＲＲＡＤＮＲＰＧ）であることがよりさらに好ましく、全てＤ−アミノ酸からなる前記エフェクターペプチドのＣ末端が全てＬ−アミノ酸からなるＺ１３ペプチドのＮ末端と直接連結したペプチドであることが特に好ましい。

また、アネキシンＩは、正常血管内皮細胞では細胞質に発現しているが、悪性腫瘍組織では新生された血管（腫瘍新生血管）の血管内皮細胞の血流側に特異的に発現している膜タンパク質である。生体内に投与されたアネキシンＩと選択的に結合する分子は、悪性腫瘍組織では、腫瘍新生血管の血流側に発現しているアネキシンＩとの結合を介して、腫瘍新生血管の血管内皮細胞に取り込まれる。血管内皮細胞に取り込まれた分子は、小胞輸送によりapical側からbasal側へ運ばれて間質へ排出される。排出された分子は、間質中を拡散して腫瘍細胞内へ取り込まれ得る。このため、本発明に係る細胞殺傷剤のうち標的分子をアネキシンＩとしたものは、癌細胞に対してアポトーシスを誘導できる細胞殺傷剤であり、抗癌剤として有用である。標的分子をアネキシンＩとした細胞殺傷剤は、腫瘍新生血管の血管内皮細胞に特異的に取り込まれ、血管内皮細胞内における小胞輸送の過程において、若しくは取り込まれた腫瘍細胞内における小胞輸送の過程において、ＨＬＡＨペプチド部分の機能によりエンドソームの膜を破壊して細胞質に放出される。その後ＫＬＡＫペプチドペプチド部分の機能により、当該細胞殺傷剤を取り込んだ細胞は殺傷される。標的分子をアネキシンＩとした細胞殺傷剤を抗癌剤として使用する場合、治療対象とする癌種は特に限定されるものではなく、前記で列挙されているものと同様の癌に対して使用することができる。

アネキシンＩを標的分子とする場合、標的分子と選択的に結合する部位としては、例えば、配列番号７（ＩＦＬＬＷＱＲ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「ＩＦ７ペプチド」ということがある。）、及び配列番号７で表されるアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるペプチド（以下、これらのペプチドを「アネキシンＩ結合性ペプチド」ということがある。）が挙げられる。配列番号７で表されるアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるペプチドとしては、配列番号７で表されるアミノ酸配列の１個、２個、又は３個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつアネキシンＩに対する結合能を保持しているペプチドや、配列番号７で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８５％以上の配列同一性を有しており、かつアネキシンＩに対する結合能を保持しているペプチドが挙げられる。

癌細胞に対してより強いアポトーシス誘導活性を有するため、標的分子をアネキシンＩとした細胞殺傷剤としては、ＩＦ７ペプチドと前記エフェクターペプチドが直接又はリンカーを介して間接的に連結されたものが好ましく、ＩＦ７ペプチドと前記エフェクターペプチドが直接又は１〜２０個のアミノ酸からなるペプチドを介して連結されたペプチドであることがより好ましく、ＩＦ７ペプチドのＣ末端に前記エフェクターペプチドが直接又は１〜２０個のアミノ酸からなるペプチドを介して連結されたペプチドであることがさらに好ましく、ＩＦ７ペプチドのＣ末端に前記エフェクターペプチドが１〜５個のアミノ酸からなるペプチドを介して連結されたペプチドであることがよりさらに好ましく、全てＬ−アミノ酸からなるＩＦ７ペプチドのＣ末端が全てＤ−アミノ酸からなる前記エフェクターペプチドのＮ末端と１〜５個のＬ−アミノ酸からなるペプチドを介して連結したペプチドであることが特に好ましい。ＩＦ７ペプチドのＣ末端が前記エフェクターペプチドのＮ末端と１〜５個のアミノ酸からなるペプチドを介して連結したペプチドとしては、例えば、配列番号４０で表されるアミノ酸配列（ＩＦＬＬＷＱＲＲＲＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫＨＬＡＨＬ）からなるペプチドが挙げられる。

本発明に係る細胞殺傷剤を医薬として使用する場合、投与経路は特に限定されるものではなく、標的細胞及びそれを含む組織に応じて適宜決定される。例えば、本発明に係る細胞殺傷剤の投与経路としては、経口投与、経静脈投与、腹腔内投与、注腸投与等が挙げられる。

本発明に係る細胞殺傷剤は、通常の方法によって、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チュアブル剤、徐放剤などの経口用固形剤、溶液剤、シロップ剤などの経口用液剤、注射剤、注腸剤、スプレー剤、貼付剤、軟膏剤などに製剤化することができる。

本発明に係る細胞殺傷剤は、製剤上の必要に応じて、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、流動化剤、溶剤、溶解補助剤、緩衝剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤等を配合して製剤化される。

賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトールなどの糖類、デンプン、結晶セルロースなどのセルロース類、エリスリトール、ソルビトール、キシリトールなどの糖アルコール類、リン酸二カルシウム、炭酸カルシウム、カオリンなどが挙げられる。結合剤としては、α化デンプン、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、トレハロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、タルク、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤としては、クロスポビドン（架橋ポリビニルピロリドン）、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウムなどが挙げられる。流動化剤としては、ケイ酸、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム化合物、酸化アルミニウム、水酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウムなどが挙げられる。溶剤としては、精製水、生理的食塩水などが挙げられる。溶解補助剤としては、デキストラン、ポリビニルピロリドン、安息香酸ナトリウム、エチレンジアミン、サリチル酸アミド、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体などが挙げられる。緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム水和物、酢酸ナトリウム水和物、炭酸水素ナトリウム、トロメタモール、ホウ酸、ホウ砂、リン酸水素ナトリウム水和物、リン酸二水素ナトリウムなどが挙げられる。懸濁化剤あるいは乳化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。等張化剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトールなどの糖類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、尿素などが挙げられる。安定化剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどが挙げられる。防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、クロロクレゾール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。抗酸化剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。矯味矯臭剤としては、医薬及び食品分野において通常に使用される甘味料、香料などが挙げられる。着色剤としては、医薬及び食品分野において通常に使用される着色料が挙げられる。

本発明に係る細胞殺傷剤は、そのまま使用してもよく、その他の成分も含む医薬用組成物として使用することもできる。当該医薬用組成物に含まれるその他の成分としては、例えば、前記の賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、流動化剤、溶剤、溶解補助剤、緩衝剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤等が挙げられる。また、当該医薬用組成物は、本発明に係る細胞殺傷剤以外の他の有効成分を含有していてもよい。

本発明に係る細胞殺傷剤は、哺乳動物に投与されるものであることが好ましく、ヒトや、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、サル、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、ロバ、イヌ、ネコ等の家畜や実験動物に投与されるものであることがより好ましく、ヒトに投与されるものであることがさらに好ましい。

＜子宮内膜症モデル動物＞
子宮内膜症細胞は、ＣＮＧＢ３を発現している。また、多くの子宮内膜症においては、子宮内膜症細胞は腹腔内において増殖する。このため、ＣＮＧＢ３を過剰発現させた細胞が腹腔内に移植されている動物を、子宮内膜症モデル動物とすることができる。

過剰発現させるＣＮＧＢ３としては、子宮内膜細胞において発現している野生型のヒトＣＮＧＢ３（ＮＣＢＩのＧｅｎｅＩＤ：５４７１４）と同じ機能を奏するタンパク質であれば特に限定されるものではない。例えば、ヒト以外の動物に由来するヒトＣＮＧＢ３のホモログタンパク質であってもよく、ヒトＣＮＧＢ３又はそのホモログの改変体であって、ヒトＣＮＧＢ３と同じ機能を保持するタンパク質であってもよい。

前記改変体としては、例えば、ヒトＣＮＧＢ３又はそのホモログのアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列からなり、かつＣＮＧＢ３としての機能を保持しているタンパク質が挙げられる。欠失等するアミノ酸の数は、１〜５０個が好ましく、１〜３０個がより好ましく、１〜２０個がさらに好ましく、１〜１０個がよりさらに好ましい。ヒトＣＮＧＢ３又はそのホモログのＮ末端又はＣ末端に付加するアミノ酸としては、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ等のタグペプチドが挙げられる。また、前記改変体としては、例えば、ヒトＣＮＧＢ３又はそのホモログのアミノ酸配列との配列同一性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつＣＮＧＢ３としての機能を保持しているタンパク質も挙げられる。

なお、本発明及び本願明細書において、「タンパク質においてアミノ酸が欠失する」とは、タンパク質を構成しているアミノ酸の一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「タンパク質においてアミノ酸が置換する」とは、タンパク質を構成しているアミノ酸が別のアミノ酸に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「タンパク質においてアミノ酸が付加される」とは、タンパク質中に新たなアミノ酸が挿入されることを意味する。

ＣＮＧＢ３過剰発現細胞を調製するために、ＣＮＧＢ３をコードする遺伝子（ＣＮＧＢ３遺伝子）を導入する細胞（宿主細胞）としては、特に限定されるものではなく、子宮内皮細胞であってもよく、動物の組織から採取された子宮内皮細胞以外の細胞の初代培養細胞であってもよく、培養細胞株であってもよい。また、ＣＮＧＢ３遺伝子を導入する宿主細胞は、ヒト由来の細胞であってもよく、ヒト以外の動物由来の細胞であってもよい。

ＣＮＧＢ３過剰発現細胞は、宿主細胞に、ＣＮＧＢ３遺伝子を発現可能な状態で導入することによって得られる。具体的には、ＣＮＧＢ３を発現させるために必要なＤＮＡの組み合わせからなる発現カセットを組み込んだ発現ベクターを、宿主細胞に導入する。発現カセットは、発現させるタンパク質をコードする遺伝子と、当該遺伝子の発現を制御するプロモーターとを備える。発現カセットは、さらに、ターミネーター、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。好ましい発現カセットは、タンパク質をコードする遺伝子配列、プロモーター、ターミネーター、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域を全て含む発現カセットである。宿主細胞に導入するＣＮＧＢ３遺伝子は、目的のアミノ酸配列からなるＣＮＧＢ３をコードする塩基配列からなるものであればよく、宿主細胞のコドン頻度に応じて改変してもよい。

プロモーターとターミネーターは、宿主細胞内で機能するものであればよい。宿主細胞内で機能するプロモーター及びターミネーターとしては、宿主細胞が本来有するものであってもよく、宿主細胞が本来有していないものであってもよい。

ＣＮＧＢ３遺伝子の発現カセットを組み込んで発現ベクターを作製するためのベクターは、宿主細胞への導入に通常用いられる任意のベクターを用いることができる。当該ベクターは、環状のプラスミドベクターであってもよく、直鎖状のベクターであってもよく、アデノウイルス等のウイルスベクターであってもよい。市販されている哺乳細胞発現用ベクターのクローニングサイトにＣＮＧＢ３遺伝子を組込むことによっても、発現ベクターを作製することができる。

ＣＮＧＢ３過剰発現細胞は、ＣＮＧＢ３遺伝子の発現カセットが、宿主細胞の細胞内で染色体外遺伝子として保持される形質転換体であってもよく、宿主細胞の染色体中に組み込まれた形質転換体であってもよい。また、発現ベクターを宿主となる哺乳細胞へ導入する形質転換方法は、リポフェクション法、リン酸カルシウム沈殿法、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法等の公知の形質転換方法の中から適宜選択して行うことができる。得られたＣＮＧＢ３過剰発現細胞は、宿主とした哺乳細胞と同様の条件で培養することができる。

ＣＮＧＢ３過剰発現細胞を腹腔内に移植する非ヒト動物の生物種は特に限定されるものではない。本発明に係る子宮内膜症モデル動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、サル、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、ロバ、イヌ、ネコ等の家畜や実験動物が好ましい。ＣＮＧＢ３過剰発現細胞の腹腔内への移植は常法により行うことができる。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

＜子宮内膜症モデル細胞（A431-CNGB3-myc細胞）＞
A431細胞（ヒト上皮様細胞癌由来細胞株）に、Ｃ末端にｍｙｃタグを融合させたヒトＣＮＧＢ３をコードする遺伝子を導入して強制発現させた形質転換細胞（A431-CNGB3-myc細胞）を、子宮内膜症モデル細胞として調製した。

A431-CNGB3-myc細胞の培養は、DMEM High Glucose培地（GIBCO社製）に１０％の非働化ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Corning社製）と１％のpenicillin-streptomycin（Invitrogen社製）を含有させた培地を培養培地として、３７℃、５容量％二酸化炭素環境下で行った。継代は２〜３日ごとに行った。

＜子宮内膜症モデルマウス＞
免疫不全マウス（NOD/ShiJic-scid Jcl系統、日本クレア社より供給）の腹腔にA431-CNGB3-myc細胞を移植して子宮内膜症モデルマウスを作製した。
具体的には、凍結保存してあるA431-CNGB3-myc細胞を解凍した後、１０ｃｍディッシュ（Thermo Fisher Scientific社製、Lot No. F3BAXQ103）を用いて２回継代した細胞を1×10⁷cells/0.5 mL/body となるように培養培地を加えて調製した細胞液を投与液とした。この投与液を、調製後可及的速やかに、７週齢の雌の免疫不全マウスに腹腔内投与することにより、A431-CNGB3-myc細胞を移植した。

なお、マウスは、ポリカーボネートケージ（W×D×H＝270×440×187（mm））内で５〜１０匹／ケージを、１９．８〜２７．１℃、湿度３２〜７５％、１２時間照明の環境下で飼育した。飼料（滅菌済CRF-１（固型）、オリエンタル酵母工業社製）と飲料水（滅菌済水道水）は自由摂取させた。

モデル作製の確認は、腹膜腫瘤の観察及び採材によって行った。A431-CNGB3-myc細胞移植から１〜３週間後に、各週２匹ずつに対して剖検を行い、腹膜に腫瘤（１mm程度の粒状）が認められるかを目視で確認し、写真撮影を行った。その後、腹膜を採材し、４カ所（腹部・背部の各左右）を切り出してそれぞれ１０％中性緩衝ホルマリンに浸漬して固定し、冷蔵保存した。ホルマリン固定後の腹膜に対して、抗c-myc抗体を用いて免疫組織化学染色し、播種の状態を調べた。

A431-CNGB3-myc細胞移植後のマウスの目視確認の結果、１回目の実験では、移植から１週間後では、目視で腫瘤が確認されたものの、腹膜播種は見られなかったが、移植から２又は３週間後には、目視で腫瘤及び腹膜播種が確認された。２回目の実験では、移植から１週間後でも、目視で腹膜播種が確認された。また、移植後マウスの腹膜組織片のc-myc染色の結果、移植から１週間後には既に腹膜播種していることが確認された。

［参考例１］
ＫＬＡＫペプチドとＨＬＡＨペプチドとＣＮＧＢ３結合性ペプチドとが連結されたペプチドについて、ＣＮＧＢ３結合性ペプチドのアミノ酸配列の種類と子宮内膜症細胞に対する細胞障害性の強さに対する影響を調べた。

具体的には、表２に示すアミノ酸配列からなる２種類のペプチドを合成し、A431-CNGB3-myc細胞に対する細胞障害性を比較した。これらの２種類のペプチドは、ＫＬＡＫ配列とＨＬＡＨ配列部分をＤ−アミノ酸から、ＣＮＧＢ３結合性ペプチド部分をＬ−アミノ酸で合成した。

＜細胞殺傷活性の評価＞
各ペプチドの細胞殺傷活性の評価は、CellTiter-Glo（登録商標）アッセイキット（プロメガ社製）を用いて、各ペプチドで処理したA431-CNGB3-myc細胞のＡＴＰ量を測定して行った。

具体的には、まず、２回継代後のA431-CNGB3-myc細胞を、９６ウェルプレート（Corning/Costar社製、Lot No. 00515003）に、１×１０^４cells/wellになるように細胞の濃度を調製して播種した。播種から２日間培養した後、各ウェルに、各ペプチドをそれぞれ、終濃度が３５．５、７５、又は１５０μＭになるよう添加し、２４時間培養した。その後、各ウェルから培養上清を除去し、残った細胞にCellTiter-Glo bufferを加えてホモジナイズした後、遠心により上清を回収し、これをライセートとした。このライセートに２倍量のＰＢＳ及びライセートと同量の２×CellTiter Glo Reagentを加えて撹拌したものを反応溶液とし、この反応溶液を１０分間室温で静置した。室温静置後の反応溶液の発光強度（Luminescence）（RLU：RELATIVE LIGHT UNITS）を、Synergy H1 ハイブリッドマルチモードマイクロプレートリーダー（BioTek社製）を用いて測定した。反応溶液の発光強度はＡＴＰ量の指標である。反応溶液の発光強度が小さいほど、ＡＴＰ量が少なく、投与されたペプチドの細胞殺傷活性が強いことを示す。全ての試行はtriplicateで測定し、その平均を各ペプチドの濃度の細胞殺傷活性として評価した。

各ペプチドのA431-CNGB3-myc細胞に対する細胞殺傷活性の評価において、各反応溶液の発光強度（RLU）の測定結果を図１に示す。図１中、「ＷＴ」が表１のペプチドＷＴの結果を、「Ｄ５Ｅ」が表１のペプチドＤ５Ｅの結果を、それぞれ示す。両ペプチドは共に濃度依存的に細胞殺傷活性作用を示した。ＣＮＧＢ３結合性ペプチドがＺ１３ペプチドであるペプチドＷＴのほうが、ＣＮＧＢ３結合性ペプチドが配列番号４のペプチドであるペプチドＤ５Ｅよりも強い細胞殺傷活性作用を示した。

［実施例１］
ＫＬＡＫペプチドとＨＬＡＨペプチドとＺ１３ペプチドとが連結されたペプチドについて、ＫＬＡＫ配列とＨＬＡＨ配列の長さを、子宮内膜症細胞に対する細胞障害性の強さが最大となるように最適化した。

具体的には、表２に示すアミノ酸配列からなる１６種類のペプチドを合成し、A431-CNGB3-myc細胞に対する細胞障害性を比較した。これらの１６種類のペプチドは、ＫＬＡＫ配列とＨＬＡＨ配列部分をＤ−アミノ酸から、Ｚ１３ペプチド部分をＬ−アミノ酸で合成した。

９６ウェルプレートに播いたA431-CNGB3-myc細胞に添加する各ペプチドの終濃度を、２．３４、４．６９、９．３８、１８．８、３７．５、７５、又は１５０μＭとし、かつペプチド添加後の培養時間を２０時間とした以外は、参考例１と同様にして、各ペプチドの細胞殺傷活性を評価した。各ペプチドのA431-CNGB3-myc細胞に対する細胞殺傷活性の評価において、各反応溶液の発光強度（RLU）の測定結果を図２に示す。図中、「１」〜「１６」は、それぞれ、表２のペプチド１〜１６を添加した反応溶液の結果を示す。いずれも、ペプチド添加から２０時間後には濃度依存的に細胞殺傷活性作用を示した。ＫＬＡＫ配列のペプチドの下流にＨＬＡＨ配列のペプチドが連結されたペプチド１〜８のほうが、ＨＬＡＨ配列のペプチドの下流にＫＬＡＫ配列のペプチドが連結されたペプチド９〜１６よりも強い細胞殺傷活性作用を示した。さらに、ペプチド１〜８の中では最短であるペプチド８は、最長であるペプチド１よりも細胞殺傷活性が強く、ペプチド９〜１６の中では最短であるペプチド１６は、最長であるペプチド９よりも細胞殺傷活性が強かった。

［実施例２］
実施例１において最も強い細胞殺傷活性作用を示したペプチド８をさらに短くし、子宮内膜症細胞に対する細胞障害性の強さが最大となるように最適化した。

具体的には、表３に示すアミノ酸配列からなる１４種類のペプチドを合成し、A431-CNGB3-myc細胞に対する細胞障害性を比較した。これらの１４種類のペプチドは、ＫＬＡＫ配列とＨＬＡＨ配列部分をＤ−アミノ酸から、Ｚ１３ペプチド部分をＬ−アミノ酸で合成した。

実施例１と同様にして、各ペプチドの細胞殺傷活性を評価した。各ペプチドのA431-CNGB3-myc細胞に対する細胞殺傷活性の評価において、ペプチド８とペプチドＡ１〜Ａ６で処理した反応溶液の発光強度（RLU）の測定結果を図３に、ペプチド８とペプチドＢ１〜Ｂ７で処理した反応溶液の発光強度（RLU）の測定結果を図４に示す。図中、「＃８」は表３のペプチド８を添加した反応溶液の結果を示し、「Ａ１」〜「Ａ６」及び「Ｂ１」〜「Ｂ６」は、それぞれ、表３のペプチドＡ１〜Ａ６、Ｂ１〜Ｂ６を添加した反応溶液の結果を示す。ＫＬＡＫ配列が１４アミノ酸からなるペプチドＡ１〜Ａ６のうち、ＨＬＡＨ配列が４アミノ酸以下のペプチドＡ３〜６は、ペプチド終濃度が７５μＭでもほとんど細胞殺傷活性を示さなかった（図３）。また、ＨＬＡＨ配列が７アミノ酸からなるペプチドＢ１〜Ｂ７のうち、ＫＬＡＫ配列が１１アミノ酸以下のペプチドＢ３〜Ｂ７は、ペプチド終濃度が７５μＭでもほとんど細胞殺傷活性を示さなかった（図４）。また、ペプチドＡ２のみが、ペプチド８よりも強い細胞殺傷活性を示した。これらの結果から、エフェクターペプチドとしては、ＫＬＡＫ配列が１４アミノ酸からなるペプチドとＨＬＡＨ配列が５アミノ酸からなるペプチドとを連結させたペプチドが、最も高い細胞殺傷活性を示すことがわかった。

［実施例３］
ＫＬＡＫペプチドとＨＬＡＨペプチドとＺ１３ペプチドを連結したペプチドにおいて、構成するアミノ酸をＤ−アミノ酸とした場合とＬ−アミノ酸とした場合の細胞殺傷活性の強さを調べた。

具体的には、表３に記載のペプチドＡ２（１４アミノ酸からなるＫＬＡＫ配列と５アミノ酸からなるＨＬＡＨ配列の両方がＤ−アミノ酸からなる。ペプチド（１４Ｄ＋５Ｄ）ともいう。）と、ペプチド８のアミノ酸のうち、１４アミノ酸からなるＫＬＡＫ配列がＤ−アミノ酸からなり、５アミノ酸からなるＨＬＡＨ配列がＬ−アミノ酸からなるペプチド（１４Ｄ＋５Ｌ）、ペプチド８のアミノ酸のうち、１４アミノ酸からなるＫＬＡＫ配列がＬ−アミノ酸からなり、５アミノ酸からなるＨＬＡＨ配列がＤ−アミノ酸からなるペプチド（１４Ｌ＋５Ｄ）、ペプチド８のアミノ酸の全てがＬ−アミノ酸からなるペプチド（１４Ｌ＋５Ｌ）の細胞殺傷活性の強さを、実施例１と同様にして調べた。なお、これらのペプチドのＺ１３ペプチド部分はいずれもＬ−アミノ酸のみからなる。

各ペプチドのA431-CNGB3-myc細胞に対する細胞殺傷活性の評価において、各ペプチドで処理した反応溶液の発光強度（RLU）の測定結果を図５に示す。エスケープペプチドの全てがＬ−アミノ酸からなるペプチド（１４Ｌ＋５Ｌ）の細胞殺傷活性が最も小さく、エスケープペプチドの全てがＤ−アミノ酸からなるペプチドＡ２（ペプチド（１４Ｄ＋５Ｄ））の細胞殺傷活性が最も大きかった。これは、Ｄ−アミノ酸からなるペプチドのほうが、Ｌ−アミノ酸からなるペプチドよりもエンドソーム内や細胞質内で消化され難く、エンドソームエスケープ活性とアポトーシス誘導活性が充分に発揮されるためと推察された。

［実施例４］
実施例２及び３で最も細胞殺傷活性が高かったペプチドＡ２の細胞殺傷活性について調べた。

＜生存細胞の定量的解析＞
細胞培養用マルチディッシュに置いたカバーグラスに播いたA431-CNGB3-myc細胞に、ペプチドＡ２を終濃度が０（コントロール）、３７．５、７５、又は１５０μＭとなるように添加して培養した。ペプチド添加から２４、４８又は７２時間後に、カバーグラスに接着しスプレッドしている細胞（生存細胞）数をカウントした。一視野当たりの生存細胞数（Ｃｅｌｌｓ／ｖｉｅｗ）の測定結果を図６に示す。この結果、A431-CNGB3-myc細胞の生存細胞数は、添加したペプチドＡ２の濃度依存的かつ経時的に減少することが判明した。

＜アポトーシス誘導活性の解析＞
細胞培養用マルチディッシュに置いたカバーグラスに播いたA431-CNGB3-myc細胞に、ペプチドＡ２を終濃度が０（コントロール）、３７．５、７５、又は１５０μＭとなるように添加して培養した。ペプチド添加から２４、４８又は７２時間後に、ApopTag（登録商標） Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kitを用いてアポトーシスを検出した。図７に、ペプチド添加から４８時間経過後の細胞に対してApop-Tag assayを行った結果を示す。図中、「Ｈｏｅｃｈｓｔ」は、Hoechst 33342 solutionによる核染色の結果を示す。この結果、添加したペプチドＡ２の濃度依存的に、Apop-Tag染色された細胞数が多くなっており、ペプチドＡ２によりアポトーシスが誘導されたことが確認された。

［実施例５］
子宮内膜症モデルマウスに、実施例２及び３で最も細胞殺傷活性が高かったペプチドＡ２を投与し、子宮内膜症に対する治療効果を調べた。

＜ペプチドの腹腔内への単回投与＞
A431-CNGB3-myc細胞を腹腔内に移植してから７日後の子宮内膜症モデルマウスに対して、イソフルラン麻酔下で、腹腔内に、３７℃に温めた生理的食塩液０．５ｍＬを入れてマッサージした直後に、ペプチドＡ２を生理食塩水に溶解させた溶液を腹腔内投与した。ペプチドＡ２は、マウスの体重当たりの投与量が０ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇ（対照）、５ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇとなるように投与した（ｎ＝３）。

＜ペプチドの腹腔内への複数回投与＞
A431-CNGB3-myc細胞を腹腔内に移植してから７日後の子宮内膜症モデルマウスに対して、イソフルラン麻酔下で、腹腔内に、３７℃に温めた生理的食塩液０．５ｍＬを入れてマッサージした直後に、ペプチドＡ２を生理食塩水に溶解させた溶液を腹腔内投与した（１回目投与）。その後、A431-CNGB3-myc細胞を腹腔内に移植してから８日後と９日後に、同様にしてペプチドＡ２溶液を投与した。つまり、ペプチドＡ２溶液を１日１回、合計３回投与した。ペプチドＡ２は、マウスの体重当たりの投与量が０ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇ（対照）、２．５ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇ、５．０ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇ、又は７．５ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇとなるように投与した（ｎ＝３）。

＜腹膜の採取（採材）＞
ペプチドＡ２を投与した子宮内膜症モデルマウスは、最終投与から２４時間後又は４８時間後に、イソフルラン麻酔下で放血死させ、腹膜を採取した。ＡＴＰ測定用腹膜は、液体窒素で凍結後、測定までディープフリーザで保管した。病理標本作製用腹膜は、１０％中性緩衝ホルマリンに浸漬して固定した後、冷蔵で保管した。

なお、各マウスは放血死させる前に体重を測定した。ペプチドＡ２の投与量や投与回数にかかわらず、各マウスの体重に特に変化はなかった。

＜ＡＴＰ量測定＞
ＡＴＰ量測定は、CellTiter-Glo（登録商標）アッセイキット（プロメガ社製）を用いて行った。凍結した腹膜の重量を測定し、凍結組織の１０倍量のCellTiter-Glo bufferを加えてホモジナイズした後、遠心により上清を回収し、これをライセートとした。このライセートに２倍量のＰＢＳ及びライセートと同量の２×CellTiter Glo Reagentを加えて撹拌したものを反応溶液とし、この反応溶液を１０分間室温で静置した。室温静置後の反応溶液の発光強度（RLU）を、Synergy H1 ハイブリッドマルチモードマイクロプレートリーダー（BioTek社製）を用いて測定した。反応溶液の発光強度はＡＴＰ量の指標であり、発光強度が小さいほど、ＡＴＰ量が少なく、投与されたペプチドの細胞殺傷活性が強いことを示す。全ての試行はtriplicate（ｎ＝３）で測定し、その平均を各ペプチドの細胞殺傷活性として評価した。

ペプチドＡ２を単回投与した子宮内膜症モデルマウスの腹膜の発光強度（RLU）の測定結果を図８に示す。また、ペプチドＡ２を３回繰り返し投与した子宮内膜症モデルマウスの腹膜の発光強度（RLU）の測定結果を図９に示す。図８及び図９に示す通り、単回投与と複数回投与のいずれのマウスにおいても、投与したペプチドＡ２の量依存的に腹膜の発光強度（RLU）が低下しており、腹膜のＡＴＰ量が低下したことが確認された。腹膜のＡＴＰ量の低下は、腹膜に移植されたA431-CNGB3-myc細胞の生存細胞数の減少を意味する。これらの結果から、ペプチドＡ２により、腹腔内のA431-CNGB3-myc細胞が殺傷されること、すなわち、ペプチドＡ２は、生体内環境において細胞殺傷効果を発揮することができ、特に子宮内膜症に対する治療薬として有用であること、がいえる。

＜ＴＵＮＥＬ染色＞
１０％中性緩衝ホルマリンで固定した病理標本作製用腹膜に対して、ＨＥ染色及びＴＵＮＥＬ染色を行った。この結果、ペプチドＡ２投与群では、ＴＵＮＥＬ法（TdT-mediated dUTP nick end labeling）陽性であり（図示せず。）、ペプチドＡ２はアポトーシスを誘導し、細胞殺傷効果を示すことが確認された。

［実施例６］
A431-CNGB3-myc細胞及び各種の子宮癌細胞に由来する細胞株に対する、ペプチドＡ２（ペプチド（１４Ｄ＋５Ｄ））の細胞殺傷活性作用を調べた。
癌細胞由来細胞株としては、ヒト子宮内膜腺癌由来のishikawa細胞、ヒト子宮内膜癌由来のSNG-II細胞、ヒト子宮体癌由来のHec-1A細胞、ヒト子宮内膜癌由来のRL95-2細胞を用いた。これらの細胞はA431-CNGB3-myc細胞と同様にして培養した。

各細胞を処理するペプチドとしては、表４に示すアミノ酸配列からなる３種類のペプチドを用いた。これらの３種類のペプチドは、ＫＬＡＫ配列とＨＬＡＨ配列部分をＤ−アミノ酸から、Ｚ１３ペプチド部分をＬ−アミノ酸で合成した。

９６ウェルプレートに播いた各細胞に添加する各ペプチドの終濃度を、０（ペプチド無添加）、２．３４、４．６９、９．３８、１８．８、３７．５、７５．０、１５０．０、又は３００．０μＭとした以外は実施例１と同様にして、各ペプチドの細胞殺傷活性を評価した。ペプチド無添加の反応溶液の発光強度（RLU）を１００％とした場合の各反応溶液の相対発光強度（％）を相対ＡＴＰ量（％）として算出した。算出結果を図１０〜１４に示す。図中、「１４Ｄ−Ｚ１３＋５Ｄ−Ｚ１３」は、ペプチドＡ２−１とペプチドＡ２−２の両方を添加した反応溶液の相対ＡＴＰ量を、「１４Ｄ−Ｚ１３」は、ペプチドＡ２−１のみを添加した反応溶液の相対ＡＴＰ量を、「５Ｄ−Ｚ１３」は、ペプチドＡ２−２のみを添加した反応溶液の相対ＡＴＰ量を、「１４Ｄ−５Ｄ−Ｚ１３」は、ペプチドＡ２のみを添加した反応溶液の相対ＡＴＰ量（％）を、それぞれ示す。図１０〜１４に示すように、ペプチドＡ２はA431-CNGB3-myc細胞のみならず、子宮癌細胞に由来する様々な細胞株に対しても細胞殺傷活性作用を有していることが確認された。また、ＫＬＡＫペプチドとＺ１３ペプチドの連結ペプチドとＨＬＡＨペプチドとＺ１３ペプチドの連結ペプチドの両方で処理した細胞では、ＫＬＡＫペプチドとＺ１３ペプチドの連結ペプチドのみで処理した細胞及びＨＬＡＨペプチドとＺ１３ペプチドの連結ペプチドのみで処理した細胞と同様に細胞殺傷活性作用はほとんど観察されないか、非常に弱かった。

［実施例７］
A431細胞はヒト上皮様細胞癌由来の細胞株であることから、A431-CNGB3-myc細胞が腹腔に移植された子宮内膜症モデルマウスは、担癌マウスでもある。そこで、子宮内膜症モデルマウスの腹腔に、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるエフェクターペプチドとＩＦ７ペプチドを連結したペプチド（IFLLWQR-RR-KLAKLAK-KLAKLAK-HLAHL、配列番号４０）（以下、「ＩＦ７（ＲＲ）−（Ｋ＋Ｈ）ペプチド」ということがある。）を投与し、癌細胞に対する細胞殺傷活性作用を調べた。ＩＦ７（ＲＲ）−（Ｋ＋Ｈ）ペプチドは、ＫＬＡＫ配列とＨＬＡＨ配列部分をＤ−アミノ酸から、その他のペプチド部分をＬ−アミノ酸で合成した。

＜ペプチドの経尾静脈投与＞
A431-CNGB3-myc細胞を腹腔内に移植してから１４日後の子宮内膜症モデルマウスに対して、１日１回、６日間連続して、ＩＦ７（ＲＲ）−（Ｋ＋Ｈ）ペプチドを生理食塩水に溶解させた溶液５０μＬを尾静脈から投与した。ＩＦ７（ＲＲ）−（Ｋ＋Ｈ）ペプチドは、マウスの体重当たりの投与量が０μｇ／ｂｏｄｙ（対照）、１０μｇ／ｂｏｄｙ、又は５０μｇ／ｂｏｄｙとなるように投与した。

この結果、ペプチドを投与していない対照群（ｎ＝８）では、A431-CNGB3-myc細胞を腹腔内に移植してから２４日後までにおける死亡個体数は１であり、生存率は８８．９％であった。これに対して、ＩＦ７（ＲＲ）−（Ｋ＋Ｈ）ペプチドを１０μｇ／ｂｏｄｙ／ｄａｙ又は５０μｇ／ｂｏｄｙとなるように投与した群（ｎ＝６）では、生存率は１００％であった。また、試験終了時点において全てのマウスの腹腔の癌細胞（A431-CNGB3-myc細胞）の広がりを調べたところ、対照群では癌細胞は腹膜全体に広がっていたが、ＩＦ７（ＲＲ）−（Ｋ＋Ｈ）ペプチドを投与した群では、多くのマウスにおいて、癌細胞の広がりは比較的限局的であった。なお、各マウスの体重は、ＩＦ７（ＲＲ）−（Ｋ＋Ｈ）ペプチドの投与量や投与回数にかかわらず、特に変化はなかった。これらの結果から、経静脈投与されたＩＦ７（ＲＲ）−（Ｋ＋Ｈ）ペプチドは、癌細胞に対する細胞殺傷活性作用を有し、抗癌剤として有用であることがわかった。

［実施例８］
背中に腫瘤を形成させた担癌マウスに対して、実施例７で用いたＩＦ７（ＲＲ）−（Ｋ＋Ｈ）ペプチドを経静脈投与し、癌細胞に対する細胞殺傷活性作用を調べた。

＜ルシフェラーゼ遺伝子導入卵巣がん担癌皮下腫瘍マウス（OVCAR3-Lucマウス）＞
マウスに移植する腫瘍組織は、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した卵巣がん細胞株（OVCAR3-Luc細胞、他施設より移譲）を培養したものを用いた。OVCAR3-Luc 細胞の培養は、RPMI medium 1640（11875-093、gibe by life technologies）を培養培地として、３７℃、５容量％二酸化炭素環境下で行った。

８週齢メスのSCIDマウス（C.B-17/Icr-scid/scid Jcl系統、日本クレア社より供給）の背部に、OVCAR3-Luc 細胞約１×1０^６個を移植して、OVCAR3-Lucマウスを作製した。

＜ペプチドの経尾静脈投与＞
実施例７と同様にして、OVCAR3-Lucマウスに、１日１回、６日間連続して、ＩＦ７（ＲＲ）−（Ｋ＋Ｈ）ペプチドを生理食塩水に溶解させた溶液５０μＬを尾静脈から投与した。ＩＦ７（ＲＲ）−（Ｋ＋Ｈ）ペプチドは、マウスの体重当たりの投与量が０μｇ／ｂｏｄｙ（対照）又は１０μｇ／ｂｏｄｙとなるように投与した。

＜腫瘍組織の大きさの測定＞
各マウスに対して発光イメージング検査を行い、背中の腫瘤のｐｈｏｔｏｎ数と腫瘍組織の大きさを経時的に測定した。

（１）Ｐｈｏｔｏｎ数の測定
ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光機構を利用し、in vivo発光イメージング装置（Xenogen IVIS-200、Caliper Corporation製）を用いて測定した。まず、OVCAR3-Lucマウスの腹腔内に、３０ｍｇ／ｍＬのＤ−ルシフェリンカリウム（126-05116、和光純薬工業社製）溶液１００μＬを投与した。投与から１５分後に、当該マウスをin vivo発光イメージング装置で測定し、Ｐｈｏｔｏｎ数を計測した。

（２）腫瘍体積の測定
各OVCAR3-Lucマウスの背部の推定腫瘍体積（ｍｍ^３）は、腫瘍の長径と短径から、下記式により求めた。なお、腫瘍の長径（ｍｍ）と短径（ｍｍ）は、ノギスを用いて測定した。

［推定腫瘍体積(mm³)］＝［長径(mm)］×［短径(mm)］×［短径(mm)］×１／２

図１５に、各マウスの背中の腫瘤のｐｈｏｔｏｎ数の増大率（％）の経時的変化を示し、図１６に、各マウスの背中の腫瘍体積（ｍｍ^３）の増大率（％）の経時的変化を示す。ｐｈｏｔｏｎ数の増大率及び腫瘍体積の増大率はいずれも、ペプチド溶液を投与開始日の前日の値を基準（１００％）とした。図中、「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」は、ペプチド溶液を経静脈投与した処理期間を示す。図１５に示すように、ＩＦ７（ＲＲ）−（Ｋ＋Ｈ）ペプチドを投与したマウスでは、ペプチド処理期間には、ｐｈｏｔｏｎ数がほとんど増大せず、また、ペプチド処理期間後の増大率も、対照群（Saline）よりも小さかった。また、腫瘍体積は、ペプチド処理期間には、対照群とＩＦ７（ＲＲ）−（Ｋ＋Ｈ）ペプチド投与群に差はないが、当該処理期間経過後の増大率は、ＩＦ７（ＲＲ）−（Ｋ＋Ｈ）ペプチド投与群のほうが明らかに小さかった。これらの結果から、ＩＦ７（ＲＲ）−（Ｋ＋Ｈ）ペプチドの投与により、生体内の腫瘍組織を殺傷することができ、当該ペプチドは抗癌剤として有用であるといえる。

［参考例２］
各種臓器の癌組織のパラフィン包埋切片を、抗ＣＮＧＢ３抗体で免疫染色し、ＣＮＧＢ３の発現の有無を調べた。
組織切片は、市販されているヒトの卵巣癌組織アレイ（Ovary cancer tissue array）（US Biomax社製）４種のうちの２種類（OV20811及びOV2088）と、各種臓器の癌組織アレイ（Multiple organ tumor tissue array）のうちの２種類（FDA800a及びMC964a）を用いた。また、抗ＣＮＧＢ３抗体は、市販されている抗体のうち、Biorbyt（Catalog No.orb156415BRT 100UG）（以下、「抗体orb」ということがある。）及びOsenses（Code; OSC00253W）（以下、「抗体253W」ということがある。）の２種類を用いた。

組織切片の免疫染色は以下の通りにして行った。まず、パラフィン包埋組織切片を、液状免疫実験用ブロッキング剤（イムノブロック、DSファーマバイオメディカル社製）で３０分間反応させて非特異的反応をブロッキングした後、ＴＢＳＴ（Tween 20含有トリス緩衝生理食塩水）による５分間の洗浄処理を２回行った。次いで、当該組織切片を、０．３％の過酸化水素水に浸漬させて５分間反応させ、内在性ペルオキシダーゼ活性のブロッキング処理を行った後、ＴＢＳＴによる５分間の洗浄処理を２回行った。続いて、当該組織切片を、抗ＣＮＧＢ３抗体をREAL Antibody Diluent（Code S2022、Dako社製）で１００倍に希釈した一次抗体溶液に浸漬させて室温で３０分間反応させた後、ＴＢＳＴによる５分間の洗浄処理を２回行った。さらに、当該組織切片を、標識二次抗体（EnVision+System-HRP 標識 Polymer 抗ウサギ抗体、Dako社製）と室温で３０分間反応させた後、ＴＢＳＴによる５分間の洗浄処理を２回行った。その後、当該組織切片を、ＤＡＢ発色試薬［DAB + Liquid （ラージサイズ）、RUO（K3468）、Dako社製］で５分間処理して発色させた。ＤＡＢ発色後の組織切片は、水洗した後、マイヤーヘマトキシリンで２分間処理して核を染色した後、封入した。

ヒトの卵巣癌組織アレイのうちのOV20811の染色結果を表５〜１０に、OV2088の染色結果を表１１〜１６に、それぞれ示す。各種臓器の癌組織アレイのうちのFDA800aの染色結果を表１７、１８に、MC964aの染色結果を表１９〜２１に、それぞれ示す。表中、各抗ＣＮＧＢ３抗体の欄が「＋」は当該抗体で免疫染色された結果を、「−」は当該抗体で免疫染色されなかった結果を、それぞれ意味する。大部分の組織切片が抗ＣＮＧＢ３抗体による免疫染色されており、ＣＮＧＢ３が発現していることがわかった。

Claims

配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、標的分子と選択的に結合する部位とが、直接的又はリンカーを介して間接的に連結されている（ただし、前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのＣ末端にアラニンが連結されている場合を除く）、細胞殺傷剤。
前記標的分子が、細胞又は組織表面に存在する分子である、請求項１に記載の細胞殺傷剤。
前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが、
全てＬ−アミノ酸からなるペプチド、
配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１〜１４番目のアミノ酸までがＤ−アミノ酸からなり、１５〜１９番目のアミノ酸までがＬ−アミノ酸からなるペプチド、
配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１〜１４番目のアミノ酸までがＬ−アミノ酸からなり、１５〜１９番目のアミノ酸までがＤ−アミノ酸からなるペプチド、又は
全てＤ−アミノ酸からなるペプチドである、請求項１又は２に記載の細胞殺傷剤。
前記標的分子と選択的に結合する部位がペプチド又はタンパク質であり、前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと前記標的分子と選択的に結合する部位とが直接的又は間接的に連結されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞殺傷剤。
前記標的分子が、ＣＮＧＢ３（cyclic nucleotide-gated channel beta 3）又はアネキシンIである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞殺傷剤。
前記標的分子と選択的に結合する部位が、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、
前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの下流に、前記標的分子と選択的に結合する部位が直接的又は間接的に連結されている、請求項１に記載の細胞殺傷剤。
前記標的分子と選択的に結合する部位が、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、
前記標的分子と選択的に結合する部位の下流に、前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが直接的又は間接的に連結されている、請求項１に記載の細胞殺傷剤。
細胞の異常増殖に起因する疾患の治療剤である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞殺傷剤。
前記疾患が、子宮内膜症又は癌である、請求項８に記載の細胞殺傷剤。