KR20010024176A - Ｂ형 간염 바이러스 폴리펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV)의 pre-S1 영역, 또는 그 영역에서 유래된 절편, 및/또는 HBV의 pre-S2 영역, 또는 그 영역에서 유래된 절편과 융합된 파상풍균 독소 절편 C를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 백신 조성물을 제공한다.

Description

Ｂ형 간염 바이러스 폴리펩티드{Hepatitis B Virus Polypeptides}
B형 간염 바이러스(이하, "HBV"라 함)의 감염 및 그로 인한 만성 간질환, 간경화, 간세포암 등의 질병은 전세계에 걸친 중요한 건강 문제이다. 바이러스에 감염될 위험이 있는 사람들에게 체계적인 백신접종은 감염을 예방하는 주된 방법이었다. 최초의 HBV 백신은 만성적 보균자의 혈장에서 얻은 HBV 표면 항원(이하, "HBsAg"라 함)을 정제하여 비활성화시킨 것이었다. 이 후에, 재조합 DNA 기술을 이용하여 HBsAg을 제조하는 방법이 개발되으나, 많은 사람들은 백신 제제속이 있는 HBsAg에 대하여 항체가 생기지 않으므로, 이러한 사람들은 여전히 HBV 감염의 위험에 놓여있는 것으로 간주된고 있다.
발명의 요약
본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV)의 pre-S1 영역, 또는 그 영역에서 유래된 절편 및/또는 HBV의 pre-S2 영역, 또는 그 영역에서 유래된 절편과 융합된 파상풍균 독소(tetanus toxin) 절편(fragment) C, 또는 그것에서 유래된 절편을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
바람직하게는 pre-S1과 pre-S2의 절편은 최소한 5개 이상, 보다 바람직하게는 적어도 6개 이상, 더욱 바람직하게는 10개, 15개 또는 20개의 아미노산을 포함한다.
파상풍균 독소 절편 C, 또는 그것에서 유래된 절편은 경첩 연결 영역(hinge linker region)을 통하여 HBV의 pre-S1 영역, 또는 그 영역에서 유래된 절편, 또는 HBV의 pre-S2 영역, 또는 그 영역에서 유래된 절편에 융합될 수 있다. 유사한 방법으로 HBV의 pre-S1 영역의 절편과 HBV의 pre-S2 영역의 절편이 함께 존재한다면, 그들도 경첩 연결 영역을 통하여 융합될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 조절 유전자(regulatory sequence)에 발현 가능하도록(operably) 연결된, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 보다 바람직하게는 조절 서열은 숙주 세포에서 폴리펩티드의 발현을 가능하게 한다. 전형적으로 숙주세포는 약독화될 수 있는 박테리아, 또는 동물세포, 보다 자람직하게는 영장류와 사람을 포함하는 포유동물의 세포이다.
본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터와 숙주세포는 HBV의 감염의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 더욱 진보된 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터가 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석액에 포함된 백신의 조성물을 제공한다. 백신의 조성물은 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 약독화시킨 박테리아를 포함할 수 있다. 바람직하게는 약의 효능을 높히기 위하여 본 발명의 폴리펩티드를 다른 HBV 백신 조성물의 활성 성분들과 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 백신 조성물은 예를 들면 WO88/10301에서 설명된 HBV 백신의 폴리펩티드 성분들(즉, adw와 ayw 아형의 S, S+pre-S2, 그리고 S+pre-S1의 항원성 구성인자의 20에서 47까지의 아미노산)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 유효량을 사람 또는 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 사람 또는 동물에 있어서 HBV의 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 동물에서 HBV의 pre-S1 및/또는 pre-S2 영역에 존재하는 항원결정부(epitope)를 인식하는 항체를 생산하기 위하여 동물에서 항체반응을 유발하기 위하여 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, HBV의 pre-S1 및/또는 pre-S2 영역에 존재하는 항원결정부를 인식하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 그 결과 생성된 항체는 다세포군 항체(polyclonal antibody)이거나 단세포군 항체(monoclonal antibody), 또는 그들의 절편일 수 있다. 이러한 항체들은 사람 또는 동물에 있어서 HBV의 감염을 치료하는 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 항체는 강력한 치료적 효용뿐만 아니라, HBV 표면 항원(HBsAg)의 pre-S1 및/또는 pre-S2 영역에 존재하는 항원성결정인자(antigenic determinant)를 찾아내는 도구로 사용될 수 있다. 두 영역 모두 바이러스가 간 세포(hepatocyte)에 흡착하지 못하도록 하는 항-HBsAg반응을 유발하는데 중요한 역할을 하며, 세포 면역반응의 유도와 독자적인 S 영역에 대한 유전적 비반응성(genetic non-responsiveness)을 극복하여, 바이러스의 제거에 효과적인 항체를 유도한다고 믿어지고 있다.
본 발명은 B형 간염 바이러스의 표면항원에서 유래된 융합 폴리펩티드와 그의 백신 조성물로서의 용도에 관한 것이다.
도 1은 플라스미드 pTECH3의 클로닝 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2 a)는 절편 C-S△S1/S2()와 절편 C-B△S1/S2()의 정제된 융합 단백질을 투여한 마우스 또는 정상(비-면역시킨) 마우스()의 혈청에서 1차 투여 후 14일째에 채혈해서, 항-절편 C에 대한 총 면역글로블린 반응을 나타낸 그래프이다.
도 2 b)는 절편 C-S△S1/S2()와 절편 C-B△S1/S2()의 정제된 융합 단백질을 투여한 마우스 또는 정상(비-면역시킨) 마우스()의 혈청에서 추가자극 후 7일째에 채혈해서, 항-절편 C에 대한 총 면역글로블린 반응을 나타낸 그래프이다.
도 3 a)는 절편 C-S△S1/S2()와 절편 C-B△S1/S2()의 정제된 융합 단백질을 투여한 마우스 또는 정상(비-면역시킨) 마우스()의 혈청에서 1차 투여 후 14일째에 채혈해서, 항-S1(아미노산 61-81 펩티드)에 대한 총 면역글로블린 반응을 나타낸 그래프이다.
도 3 b)는 절편 C-S△S1/S2()와 절편 C-B△S1/S2()의 정제된 융합 단백질을 투여한 마우스 또는 정상(비-면역시킨) 마우스()의 혈청에서 추가자극 후 7일째에 채혈해서, 항-S1(아미노산 61-81 펩티드)에 대한 총 면역글로블린 반응을 나타낸 그래프이다.
도 4 a)는 절편 C-S△S1/S2()와 절편 C-B△S1/S2()의 정제된 융합 단백질을 투여한 마우스 또는 정상(비-면역시킨) 마우스()의 혈청에서 1차 투여 후 14일째에 채혈해서, 항-S1(아미노산 12-24 펩티드)에 대한 총 면역글로블린 반응을 나타낸 그래프이다.
도 4 b)는 절편 C-S△S1/S2()와 절편 C-B△S1/S2()의 정제된 융합 단백질을 투여한 마우스 또는 정상(비-면역시킨) 마우스()의 혈청에서 추가자극 후 7일째에 채혈해서, 항-S1(아미노산 12-24 펩티드)에 대한 총 면역글로블린 반응을 나타낸 그래프이다.
도 5 a)는 절편 C-S△S1/S2()와 절편 C-B△S1/S2()의 정제된 융합 단백질을 투여한 마우스 또는 정상(비-면역시킨) 마우스()의 혈청에서 1차 투여 후 14일째에 채혈해서, 항-S1(S-pre-S1 조각에 존재하는 아미노산 21-47 펩티드)에 대한 총 면역글로블린 반응을 나타낸 그래프이다.
도 5 b)는 절편 C-S△S1/S2()와 절편 C-B△S1/S2()의 정제된 융합 단백질을 투여한 마우스 또는 정상(비-면역시킨) 마우스()의 혈청에서 추가자극 후 7일째에 채혈해서, 항-S1(S-pre-S1 조각에 존재하는 아미노산 21-47 펩티드)에 대한 총 면역글로블린 반응을 나타낸 그래프이다.
A. 폴리펩티드
본 발명의 폴리펩티드는 B형 간염 바이러스(HBV)의 pre-S1 영역의 절편, 및/또는 HBV의 pre-S2 영역의 절편과 융합된 파상풍균 독소(tetanus toxin) 절편(fragment) C, 또는 그것에서 유래된 절편을 포함하는 항원결정부를 포함한다.
파상풍균 독소의 구조 유전자는 이미 클로닝되고 염기서열이 밝혀졌다(참조: Fairweather et al., J. Bacteriol., 165:21-27, 1986). 절편 C는 파파인(papain) 절단에 의해 생성되는 50kDa의 폴리펩티드이며 C-말단의 451개의 아미노산을 포함하거나, 실제적으로 그에 해당한다. 항원결정부를 포함하는 파상풍균 독소 절편 C의 절편이 본 발명의 폴리펩티드로 사용될 수 있다. 이러한 절편들은 최소한 5개 내지 6개, 보다 바람직하게는 적어도 10개, 더욱 바람직하게는 적어도 15개, 20개, 50개 또는 100개의 아미노산을 포함한다. 더욱 바람직한 절편은 좋은 B-세포 항원결정부인 80 내지 180사이의 아미노산과, 좋은 T-세포 항원결정부인 83 내지 103 및 409 내지 420사이의 아미노산을 포함한다(아미노산의 번호는 파상풍균 독소의 864번 아미노산을 절편 C의 1번 아미노산으로 정하였다).
바람직하게는 pre-S1 영역과 pre-S2 영역의 절편은 최소한 5개의 아미노산, 보다 바람직하게는 최소한 6개의 아미노산, 가장 바람직하게는 10개, 15개 또는 20개의 아미노산을 포함한다. 예를 들면, 절편은 pre-S1의 1 내지 19, 20 내지 39, 40 내지 59, 60 내지 79, 80 내지 99, 및 100 내지 119의 아미노산, 또는 pre-S2의 1 내지 19, 20 내지 39, 40 내지 55의 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 사용될 수 있는 적절한 절편은 실시예에 기술되어 있다. 특히 바람직한 절편들은 pre-S1의 20 또는 21 내지 47의 아미노산(간세포 결합 영역)과 pre-S2의 1 내지 26, 및 14 내지 32의 아미노산을 포함한다.
아울러, 파상풍균 독소 절편 C와 pre-S1 및 pre-S2 영역의 절편의 아미노산 서열은 본 발명의 폴리펩티드를 제공하기 위하여 수식(modification)될 수 있다. 예를 들면, 이러한 수식은 본 발명의 폴리펩티드의 면역유발성(immunogenicity)을 강화시키기 위하여 수행될 수 있다. 수식된 폴리펩티드가 항원결정부를 가지고 있다면, 아미노산의 치환은 예를들면 1개, 2개 또는 3개 내지 10개, 20개 또는 30개가 될 수 있다.
보존적 치환은 하기 표에 따라 만들어 질 수 있다. 두번째 컬럼 내의 동일한 블록에 있는 아미노산, 바람직하게는 세번째 컬럼의 동일한 줄에 있는 아미노산들은 서로 치환될 수 있다.
지방족 비극성 G A P
I L V
극성-비전하 C S T M
N Q
극성-전하 D E
K R
방향족 H F W Y
파상풍균 독소 절편 C는 경첩(hinge) 연결 영역을 통하여 HBV의 pre-S1 영역의 절편, 또는 HBV의 pre-S2 영역의 절편에 융합될 수 있다. 유사한 방법으로 HBV의 pre-S1 영역의 절편과 HBV의 pre-S2 영역의 절편이 함께 존재한다면, 그들도 경첩 연결 영역을 통하여 융합될 수 있다.
경첩 연결 영역은 파상풍균 독소 절편 C와 pre-S1 영역의 절편과 pre-S2 영역의 절편이 독립적으로 자유롭게 겹쳐질(folding) 수 있도록 하기 위하여 서로 떨어지도록 고안된 영역이다.
경첩 연결 영역은 전형적으로 높은 비율의 프롤린(proline) 및/또는 글라이신(glycine)을 암호화하는 서열이다. 경첩 연결 영역은 전적으로 프롤린 및/또는 글라이신 만으로도 구성될 수 있다. 경첩 연결 영역은 하나 이상의 글라이신-프롤린 디펩티드결합 단위를 포함할 수 있다. 또한, 경첩 연결 영역는 파상풍균 독소 절편 C의 카르복시 말단을 포함할 수도 있다.
경첩 연결 영역은 서로 다른 폴리펩티드 도메인 사이에 유연성을 부여하기 위하여 대략 15개의 아미노산, 적어도 4개 및 바람직하게는 6개 내지 14개의 아미노산을 포함할 수 있다.
하나의 실시예에 따르면, 경첩 영역은 실제적으로 항체 면역글로블린의 경첩 영역에 해당한다. IgG 항체의 경첩 영역은 특히 프롤린이 풍부하며(참조: T.E. Michaelson et al., J. Biol.Chem., 252:883-9, 1977), 이 영역이 항원 결합 영역과 항체 꼬리 사이에 유연한 연결을 제공하는 것으로 여겨지고 있다.
다른 아미노산들도 글라이신, 특히 입체장애가 크지 않은(non-bulky) 곁 사슬을 가지는 알라닌(alanine), 세린(serine), 아스파라긴(asparagine) 및 트레오닌(theronine)으로 치환될 수 있다.
바람직한 경우에는, 경첩 연결 영역는 다음과 같은 서열을 갖는 4개 이상의 사슬이다:
-[X]p-Pro-[Y]q-Pro-[Z]r-
상기 식에서,
Pro는 프롤린을 나타내고:
X와 Y는 각각 글라이신, 또는 입체장애가 크지 않은(non-bulky) 곁 사슬을 가지는 아미노산을 나타내며;
Z는 어떠한 아마노산도 가능하고;
p는 양의 정수를 나타내며;
q는 1 내지 10의 양의 정수를 나타내고; 및,
r은 0 또는 0보다 큰 양의 정수를 나타낸다.
B. 폴리뉴클레오티드 및 벡터
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 서열을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있으며 합성된 또는 수식된 뉴클레오티드를 포함할 수도 있다. 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)에 대한 다양한 종류의 수식이 알려져 있다. 이러한 수식은 메틸포스폰염(methyphosphonate)과 포스포로티오염(phosphonothioate) 골격, 분자의 5'-말단과 3'-말단에서의 아크리딘(acridine) 또는 폴리라이신(polylysine) 사슬의 부가(addition)를 포함한다. 본 발명의 목적을 위하여, 여기에 기술된 폴리뉴클레오티드는 당 업계에서 사용가능한 어떤 방법에 의해서도 수식될 수 있음이 이해되어야 한다. 전기 수식은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체내 활성이나 반감기를 연장시키기 위한 목적으로 시행될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 또한, 전기된 발명의 폴리펩티드의 어느 것이라도 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 당업계의 통상의 지식을 가진 자라면 서로 다른 폴리뉴클레오티드가 유전자 코드의 축퇴(degeneracy)에 의해 같은 폴리펩티드를 암호화할 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 복제가 가능한 재조합 벡터에 삽입될 수도 있다. 이 벡터는 적합한 숙주 세포 안에서 핵산을 복제하는데 사용될 수 있다. 그러므로, 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 복제가 가능한 벡터에 주입시킨 후, 그 벡터를 숙주 세포에 도입하여 벡터의 복제를 유도할 수 있도록 세포를 성장시켜서 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 제공한다. 벡터는 숙주 세포로부터 회수될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 대장균, 효모군, 동물 세포주와 곤충 세포 Sf9 세포와 같은 다른 진핵 세포주를 포함한다.
바람직하게는, 벡터에 있는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 의한 암호 영역의 발현을 제공하는 조절유전자에 발현 가능하도록(operably) 연결되어 있다; 즉, 벡터는 발현 벡터이다. 발현 가능하도록 연결되어 있다는 용어는 전기의 구성요소들이 각각의 기능을 수행하는데 적합한 관계로 배열되어 있음을 뜻한다. 조절 유전자가 암호화 염기서열과 발현 가능하도록 연결되어 있다는 용어는 암호화 염기서열의 발현이 적당한 조건에서 이루어짐을 뜻한다.
전기 벡터는 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기 위하여 전기의 적합한 숙주 세포로 형질전환(transformation) 또는 트랜스펙션(transfection)의 과정을 통해 도입될 수 있다. 이러한 과정은 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 가지는 벡터에 의한 발현을 가능하게 하는 조건 하에서, 전기의 발현 벡터로 형질전환된 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 발현된 폴리펩티드는 실험실조건에서(in vitro) 수거될 수 있다. 폴리펩티드의 지속적인 발현을 위해 형질전환된 숙주 세포는 생체내에서(in vivo) 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하기 위하여 형질전환된 박테리아를 약독화시킨 숙주세포는 백신으로 사용될 수 있다. 전기의 약독화(attenuation)된 박테리아는 살모넬라(Salmonella), 보르데텔라(Bordetella), 비브리오(Vibrio), 해모필루스(Haemophilus), 나이세리아(Neisseria), 여시니아(Yersinia) 등에서 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는 약독화된 박테리아는 대장균 또는 살모넬라(S.typhis, S.typhimurium, 또는 S.enteritidis)와 같은 장내세균이 좋다.
벡터는 예를 들면, 복제 기점(origin of replication), 부가적으로(optionally) 전기 폴리뉴클레오티드의 발현에 대한 촉진자(promoter), 부가적으로 촉진자에 대한 조절자(regulator)를 가지는 플라스미드 또는 바이러스 벡터가 될 수 있다. 벡터는 하나이상의 선택 표지 유전자(selectable marker gene)를 가질 수 있으며, 예를 들어 박테리아 플라스미드의 경우는 앰피실린 저항 유전자(ampicillin resistant gene), 동물세포에 사용되는 벡터의 경우에는 네오마이신 저항 유전자(neomycin resistance gene)가 사용된다. 벡터는 예를 들면, RNA의 생성을 위해 실험실조건에서 사용될 수 있으며, 또는 숙주 세포의 형질전환이나 트랜스펙션을 위해 사용될 수 있다. 벡터는 또한 예를 들면 유전자 치료법의 경우에서와 같이 생체내에서 사용될 수 있다.
촉진자/증폭자(promoter/enhancer)와 다른 발현 조절 신호들은 발현 벡터가 고안된 숙주 세포에 적합하도록 선택될 수 있다. 예를 들면, 원핵 촉진자(prokaryotic promoter)는 특히 대장균(예를 들면, E.coli HB101)에서 사용하기에 적합하도록 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 촉진자는 혐기성 조건과 같은, 환경의 변화에 따라 활동도가 유도되는 것을 사용되었다. 바람직하게는 htrA 또는 nirB 촉진자가 사용될 수 있다. 특히, 이러한 촉진자들은 예를 들면 백신의 용도로 사용되는 약독화된 박테리아에서 폴리펩티드를 발현하고자 할 때 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 발현이, 실험실조건에서이건 또는 생체내에서이건 간에, 동물 세포에서 이루어 질 때에는, 포유형 촉진자(mammalian promoter)를 사용할 수 있다. 예를 들면, 간세포 특이적 촉진자와 같은 조직 특이적 촉진자도 사용될 수 있다. MMLV LTR(Moloney murine leukaemia virus long terminal repeat) 촉진자, 라우스 육종 바이러스(rous sarcoma virus) 촉진자, 사람 세포거대바이러스(human cytomegalovirus) 극초기(IE)촉진자, 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus) 촉진자 또는 아데노바이러스 촉진자와 같은 바이러스에서 유래된 촉진자도 사용될 수 있다. 모든 이러한 촉진자들은 당업계의 통상적인 기술범위에서 사용 가능하다.
C. 투여
본 발명의 폴리펩티드는 직접 주사에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 약학적으로 하용가능한 담체 또는 희석액과 혼합되어 약학적 조성물로 제조된다. 적합한 담체와 희석액은, 예를 들면 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)과 같은 등장 식염액을 포함한다. 전기 조성물은 장관외(parenteral), 근육내(intramuscular), 정맥(intravenous), 비강(intranasal), 피하(subcutaneous), 안구(intraocular) 또는 경피(transdermal) 투여를 위해 제제화될 수 있다. 전형적으로, 각각의 폴리펩티드는 체중 1 kg당 0.01 내지 30 ㎍, 바람직하게는 0.1 내지 10㎍, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1㎍의 용량으로 투여된다. 하기와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 이용하여 만든 항체는 HBV 감염의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. HBV 항원에 대한 특이성을 가지는 중화항체(neutralizing antibody) 또는 그것으로부터 유래한 절편은 본 발명의 폴리펩티드와 같은 양식으로 투여될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 핵산 그 자체의 형태로, 바람직하게는 숙주 세포의 유전체와 상동성을 갖는 염기서열을 양끝에 가지는 모습으로, 직접 투여될 수 있다. 핵산만을 가지는 형태로 발현 카세트(expression cassette)가 투여되었을 때에는, 핵산의 양은 1 ㎍ 내지 10㎎, 바람직하게는 100㎍ 내지 1㎎의 범위로 투여된다.
동물세포에 의한 핵산 그 자체의 섭취는 예를 들면, 트랜스펙션 작용제(transfection agent)의 사용과 같은, 몇몇의 알려진 트랜스펙션 기술에 의해 증가될 수 있다. 이러한 작용제에는 양이온 작용제(예를 들면, 칼슘 포스페이트(calcium phosphate) 및 DEAE-덱스트란(dextran)) 및 리포펙턴트(lipofectant)(예를 들면, lipofectam™ 및 transfectam™)가 포함된다. 전형적으로 핵산은 조성물을 제조하기 위하여 트랜스펙션 작용제와 혼합된다.
바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 약학적인 조성물을 제조하기 위하여 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석액과 혼합된다. 적합한 담체와 희석액은, 예를 들면 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)과 같은 등장 식염액을 포함한다. 전기 조성물은 장관외(parenteral), 근육내(intramuscular), 정맥 (intravenous), 비강(intranasal), 피하(subcutaneous), 안구(intraocular) 또는 경피(transdermal) 투여를 위해 제제화될 수 있다.
각각의 환자와 조건에 맞는 최적의 투여 경로와 용량은 숙련된 의사에 의해 쉽게 결정될 수 있으므로, 전술된 투여의 경로와 용량은 단지 지침으로서 제시되었다.
D. 백신의 조제
백신은 본 발명의 적어도 하나 이상의 폴리펩티드에 의하여 조제될 수 있다. 백신은 당업계에서 알려진, 적어도 하나 이상의 면역원성 HBV 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 그러므로 본 발명의 백신은 본 발명의 폴리펩티드와 부가적으로, HBV S, pre-S1, pre-S2와 그것들에서 유래된 면역원성 절편로부터 선택된 적어도 하나 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 백신 속에 중성 또는 염의 형태로 포함될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 펩티드의 자유아미노산기와 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 초산, 옥살산(oxalic acid), 타르타르산(tartaric acid), 또는 말레인산(maleic acid)와 같은 유기산에서 형성된 산 추가 염(acid addition salt)을 포함한다. 자유 카르복시기에서 형성된 염은 예를 들면, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화철 등과 같은 무기염기, 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘 또는 프로캐인 등과 같은 유기염기와 함께 만들어 질 수 있다.
활성 성분(active ingredient)으로 면역원성 폴리펩티드를 함유하는 백신의 조제는 당업계의 통상의 지식을 가진 사람에게 알려져 있다. 전형적으로, 그러한 백신들은 주사로 주입 가능한 용액이나 현탁액(suspension)의 형태로, 또는 주사전에 용액이나 현탁액에 용해될 수 있는 고체의 형태로 조제된다. 조제물는 유화(emulsion)될 수도 있고, 단백질은 리포좀(liposome)속에 함유될 수도 있다.
백신은 본 발명의 폴리펩티드를 발현할 수 있는, 약독화된 박테리아를 포함할 수 있다.
활성 면역원성 성분은 약학적으로 허용가능한 부형제(excipient)와 혼합될 수 있다. 적당한 부형제로는 예를 들면, 물, 염수(saline), 포도당, 글리세롤, 에탄올, 또는 그들을 조합한 것이 있다.
뿐만 아니라, 만일 원한다면, 백신은 보습제 또는 유화제, pH 완충제(pH buffering agent) 및/또는 백신의 효능을 증대시키기 위한 보조약(adjuvant)과 같은 소량의 보조 물질(auxiliary substance)을 함유할 수 있다. 효과적일 수 있는 보조약의 예는 다음과 같은 것들이 있으나 이것에만 한정되는 것은 아니다: 수산화알루미늄, N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine: thr-MDP), N-아세틸-노뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine: CGP 11637, nor-MDP라고 일컬어짐), N-아세틸뮤라밀-L-알라닌-D-이소글루타미닐-L-알라닐-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민(N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryl oxy)-ethylamine: CGP 19835A, MTP-PE라고 일컫어짐)와 2％ 스쿠알렌/트윈80 유화액(squalene/Tween 80 emulsion)속에 박테리아에서 추출된 세 개의 성분, 즉 단인산지방(monophosphoryl lipid) A, 트리할로스 디미콜릭산 염(trehalose dimycolate)와 세포벽 골격(MPL+TDM+CWS)를 함유하는 RIBI. 보조약의 효능은 HBV 항원 서열을 포함하는 면역원성 폴리펩티드에 대한 항체로서, 백신의 투여 후에 생성된 항체의 양을 측정함으로서 결정될 수 있다.
백신은 통상적으로 피하 또는 근육 주사와 같은 장관외의 방법으로 투여된다. 다른 투여 방법에 적합한 부가적 조성물은 좌약 또는 비강투여 등에 적합한 조성물을 포함한다. 특히, 약독화 박테리아의 경우에는 구강 투여를 위한 조성물이 제공될 수 있다. 좌약을 위해서는, 폴리알킬렌 글리콜(polyalkylene glycol) 또는 트리글리세리드(triglyceride) 등과 같은 통상적인 결합제(binder)와 담체를 포함할 수 있다; 전기 좌약은 활성 성분을 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1% 내지 2%,의 범위에서 활성성분을 포함하는 혼합물로부터 제조될 수 있다. 구강 투여를 위한 제조에는 만니톨(mannitol), 락토스(lactose), 전분(starch), 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 소디움 사카린(sodium saccharine), 셀룰로오스 (cellulose), 탄산마그네슘(magnesium carbonate) 등과 같은 약학적 용법으로 일반적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이러한 조성물은 용액, 현탁화제, 정제(tablet), 알약(pill), 캡슐(capsule), 서방성제제(sustained release formulation), 또는 분말(powder)의 형태로 제제화 할 수 있으며, 10% 내지 95%, 바람직하게는 25% 내지 70%의 활성 성분을 함유하고 있다.
예를 들어 약독화된 박테리아를 함유하는 백신은 환자에게 구강 투여가 가능한 캡슐 속에, 동결 건조된 형태로 편리하게 제공될 수 있다. 환자에게 구강 투여를 하기 위한 전기 캡슐, 정제, 알약 등은 유드라지트(Eudragit) S, 유드라지트 L, 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate), 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(cellulose acetate phthalate) 또는 히드록시프로필메틸 셀룰로오스(hydroxypropylmethyl cellulose)와 같은 장내 코팅물질(enteric coating)과 함께 제공될 수 있다. 이러한 캡슐, 또는 동결 건조된 물질은 투약전에 현탁액 등과 같은 형태로 재구성될 수 있다. 재구성은 생물체의 생존력(viability)를 보장하기 위한 적당한 pH의 완충용액으로 편리하게 이루어질 수 있다. 약독화된 박테리아와 백신을 위의 산성(gastric acidity)으로부터 보호하기 위하여, 백신의 투여 전에 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate)을 편리하게 투여할 수 있다.
E. 백신의 용량과 투여
백신은 용량에 적합한 방법과 예방적 및 치료적 효과를 나타내는 용량에 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 일반적으로 1회에 5㎍ 내지 250㎍의 범위를 갖는 투여의 양은, 치료의 대상, 항체를 형성하는 면역체계의 능력과 원하는 예방의 정도에 따라 달라질 수 있다. 활성 성분의 정확한 투여의 용량은 의사의 판단과 개개의 경우에 따라 결정될 수 있다.
백신은 단일 용법(single dose schedule)으로 주어질 수도 있고 다중 용법(multiple dose schedule)의 일환으로 주어질 수도 있다. 다중 용법은 1에서 10번의 독립적 용량의 1차 백신투여 후에, 예를 들면 1 내지 4개월 후에 면역반응을 유지하고 강화하기 위한 투여를 하고 원한다면 몇 개월 후에 다시 투여하는 것을 말한다. 용법은 적어도 영역적으로는, 개인의 필요와 의사의 판단에 따라 결정될 수 있다.
아울러, 면역원성 HBV 항원을 포함하는 백신은 면역글로블린(immunoglobulin)과 같은 면역조절 인자와 함께 투여될 수 있다.
F. 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체의 조제
전술된 바와 같이 제조된 면역원성 폴리펩티드는 다세포군(polyclonal)과 단세포군(monoclonal) 항체를 만들기 위해 사용될 수 있다. 만일 다세포군 항체를 원한다면, 선택된 포유동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 말 등)을 HBV의 항원결정부를 갖는 면역원성 폴리펩티드로 면역시킨다. 면역된 동물로부터의 혈청을 수집하여 알려진 방법에 따라 처리한다. 만일 HBV 항원결정부에 대한 다세포군 항체를 포함하는 혈정이 다른 항원에 대한 항체를 포함한다면, 다세포군 항체를 면역친화(immunoaffinity) 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있다. 다세포군 항혈청을 만들고 처리하는 기술은 당업계에 알려져 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 있는 HBV 항원결정부에 대한 단세포군 항체는 당업계에서 널리 알려진 기술에 의해 제조될 수 있다. 하이브리도마(hybridoma)를 이용하여 단세포군 항체를 만드는 일반적인 방법은 잘 알려져 있다. 불멸의 항체-생성 세포주는 세포 융합, 발암성 DNA로 B 세포를 직접 형질전환 시키는 방법, 또는 엡스테인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus)를 트랜스펙션(transfection)시키는 방법 등에 의해 만들어 질 수 있다. HBV 항원결정부에 대한 단세포군 항체를 형성하는 세포는 방사선 동위원소와 항원결정부 친화성 등의 다양한 특성에 따라 가려낼 수 있다.
HBV의 항원결정부에 대한 단세포군과 다세포군 항체는 특히 진단에 유용하며, 중화항체는 수동 면역법(passive immunotherapy)에 유용하다. 단세포군 항체는 특히 항-유전인자형(anti-idiotype) 항체를 만드는데 사용될 수 있다. 항-유전형 항체는 예방이 요구되는 감염성 물질의 항원의 내부 형상(internal image)을 가지고 있는 면역글로불린이다.
항-유전형 항체를 만드는 기술을 당업계에 알려져 있다. 이러한 항-유전인자형 항체는 HBV 항원의 면역원성 영역의 규명 뿐만아니라, HBV의 치료에 유용할 수 있다.
Fab 절편과 같이, 위에서 기술된 항원의 절편을 사용하는 것도 가능하다.
G. 면역학적 분석(Immunoassay)
본 발명의 폴리펩티드와 그를 이용한 항체 모두, 예를 들면 HBV 항체를 포함하는 혈정과 면역학적으로 반응시키거나, 또는 혈액이나 혈청 등과 같은 생물학적 시료 속에 존재하는 HBV 항체나 바이러스 항원의 존재를 검사하는 면역학적 분석의 방법에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 폴리펩티드와 항체는 HBsAg의 pre-S1과 pre-S2 영역에 존재하는 매우 면역원성이 높은 영역의 위치를 찾아내는데 사용될 수 있다. 면역학적 분석의 고안은 매우 다양하며 이러한 다양한 면역학적 분석에 대해서는 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, 면역학적 분석은 본 발명의 폴리펩티드와 같은 바이러스 항원 중에 하나만을 사용할 수도 있고, 그들의 조합을 사용할 수도 있다. 또한 본 발명에서 제시된 방법을 이용한 항체나, 하나 또는 다수의 바이러스 항원에 대한 항체의 조합을 사용할 수도 있다. 실험방법은 경쟁적 또는 직접 반응법, 또는 샌드위치(sandwich) 타입 분석 등의 방법에 기초할 수 있다. 면역학적 분석의 실험방법은 고체 지지체를 사용하거나 또는 면역침전법을 사용할 수 있다. 대부분의 분석법은 표지된 항체 또는 폴리펩티드의 사용을 포함한다; 표지자는 형광체, 화학발광체, 방사선 동위원소, 또는 염색 분자 등이다. 탐침(probe)으로 부터의 신호를 증폭시키는 분석의 방법 역시 잘 알려져 있다; 예를 들면, 비오틴(biotin)과 아비딘(avidin)을 사용한 것, 또는 효소 결합 면역흡착검사법(ELISA) 등과 같은 효소-표지 및 매개 면역학적 분석법 등이다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하지 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 자명할 것이다.
실시예 1: 발현 벡터의 제조
본 실시예에서 사용되는 기본 발현 벡터인 플라스미드 pTECH-3은 도 1에서 보듯이, 본 발명자들의 이전 특허출원 PCT/GB95/00196에 기술된 바와 같이, pTECH-2와 pTEThtrA-1로부터 제조되었다. pTECH-3은 파상풍균 독소 절편 C와 htr A 촉진자에 발현 가능하도록(operably) 연결되어 있는 경첩 연결 영역의 유전자를 암호화하는 염기 서열을 포함한다.
하기 표1에 나타난 플라스미드들은 다음과 같이 제조되었다.
플라스미드 B형 간염 바이러스의 염기서열
pTECH3/S1 pre S1ayw21-47 아미노산
pTECH3/S2 pre S2ayw1-55 아미노산
pTECH3/S1/S2 pre S1ayw21-47/pre S2ayw1-55 아미노산
pTECH3/SB Sayw120-147아미노산
pTECH3/S△S1/S2 pre S1adw21-119/S2adw1-55 아미노산
pTECH3/B△S1/S2 pre S1adw42-119/S2adw1-55 아미노산
pTECH3/WS1/S2 pre S1adw1-119/ S2adw1-55 아미노산
플라스미드 pMBdS1RN/44(ayw HBV pre-S1(20-47)/S 유전자를 포함)는 pTECH3/S1, pTECH3/SB와 pTECH3/S1/S2를 제조하기 위한 주형으로 사용되었다. pMByS2/8(ayw HBV pre-S2(1-55)/S 유전자를 포함)는 pTECH3/S2와 pTECH3/S1/S2를 제조하기 위한 주형으로 사용되었고, pRIT12793(pBR322 속에 완전한 adw HBV pre-S1/S2 유전자를 포함)은 pTECH3/S△S1/S2, pTECH3/B△S1/S2와 pTECH3/WS1/S2를 제조하기 위한 주형으로 사용되었다.
다음의 프라이머들이 HBV pre-S1/S2 염기서열을 pTECH3 벡터에 삽입하기 위한 표준형의 PCR 반응에 사용되었다.
프라이머 염기서열
MGR178(SB) ACTCTAGATGCAAAACCTGC
MGR179(SB) TAACTAGTAATACAGGTGCA
MGR104(S1과 S1/S2) ATGTCTAGAAATCCTCTGGGATTC
MGR238(S1과 S1/S2) AAGCTTATGCAGTGGAATTCCAGA
MGR105(S1) CGAACTAGTGTTGGGATTGAAGTC
MGR106(S2) AGGGTCACTAGTCCTCGAGAAGAT
MGR252(S△S1/S2) TCTGTTGCTAGCCCTCTGGGATTC
MGR254(B△S1/S2) TCAAACGCTAGCGATTGGGACTTC
MGR243(S△와 B△S1/S2) TTGCTAGCGTTCAGCGCAGGGTCC
MGR250(WS1/S2) CCCGCTAGCATGGGAGGTTGGTCA
각각의 PCR 절편를 제한효소로 절단하고, 겔로 정제한 후, 3.76 kbp의 pTECH3 절편에 연결시켰다. 최초의 네 개의 플라스미드를 만들기 위하여, pTECH3 벡터를 XbaI/SpeI/CIAP로 처리하여 3.76 kbp의 절편을 수득하였다. 적당한 HBV PCR 절편을 NheI으로 미리 절단한 후, 3.76 kbp의 절편에 연결하였다. 마지막 두개의 플라스미드는 pTECH3 벡터를 XbaI/CIAP로 처리하여 3.76 kbp의 절편을 얻은 후, NheI으로 미리 절단한 적당한 HBV PCR 절편과 연결하였다.
실시예 2: 폴리펩티드의 발현과 웨스턴 블랏팅(Western Blotting)
플라스미드를 표준적인 기술을 이용하여 대장균(E.coli HB101)에 형질전환시켰다. 융합 단백질의 발현은 37℃에서 열 자극(heat stress)에 의하여 유도되었다. 발현은 대장균 세포 추출액을 항-파상풍균 독소 절편 C 항체와 각각의 삽입된 염기서열에 대한 특이 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅의 방법으로 검출하였다(참조: 표 2)
웨스턴 블랏
웨스턴 블랏
플라스미드 HBV 서열 절편C(a) S1(20-47)(b) S1(61-81)(c) S2(d) S(e)
pTECH3/S1 preS1ayw21-47 아미노산 + + ND ND ND
pTECH3/S2 preS2ayw1-55 아미노산 + ND ND + ND
pTECH3/S1/S2 preS1ayw21-47/preS2ayw1-55아미노산 + ND ND + ND
pTECH3/SB Sayw120-147 아미노산 + + ND ND +
pTECH3/S△S1/S2 preS1adw21-119/S2adw1-55아미노산 + + + + ND
pTECH3/B△S1/S2 preS1adw42-119/S2adw1-55아미노산 + + + + ND
pTECH3/WS1/S2 preS1adw1-119/S2adw1-55아미노산 + + + ND
(a) 다세포군 토끼 항-절편 C 혈청 AB96-05 14／3／97 1:100
(b) 단세포군 마우스 항-S1(20-47) 18/7/97(Speke으로부터 받음) 1:1000
(c) 다세포군 토끼 항-S1(60-80) RA2138 토끼9393 27／7／87 1:400
(d) 단세포군 마우스 항-S2 1-901 세포부유액 수거. 20／11／97.
동결. 26／11／97. 1:10
(e) 다세포군 마우스(SWR/J) 항-HB147(VRU, Imperial College) 1:50
ND=수행되지 않음
실시예 3: 폴리펩티드에 대한 다세포군 항체의 제조
실시예 2에서 pTECH3/S△S1/S2와 pTECH3/B△S1/S2 플라스미드로부터 제조된 융합 폴리펩티드를 대장균 세포추출액으로부터, 항-파상풍균 독소 절편 C을 세파로즈 4B 컬럼에 고착시킨 리간드를 이용한 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 정제된 단백질은 표준적인 방법과 아래에 설명된 방법으로 마우스(B10, 암컷, 6-8 주령)에게 주사하여 투여하기 위하여 조제되었다.
계획
그룹 1 정제된 절편 C-S△S1/S2 융합단백질 5㎍을 복강내주사로
면역시킨 마우스(1차 용량), 1차 접종 14일 후에 채혈
정제된 절편C-S△S1/S2 융합단백질 5㎍을 복강내주사로
면역시킨 마우스(추가자극),
1차 접종 21일에 추가자극 후, 7일 후에 채혈
그룹 2 정제된 절편C-B△S1/S2 융합단백질 5㎍을 복강내주사로
면역시킨 마우스(1차 용량), 1차 접종 14일 후에 채혈
정제된 절편C-B△S1/S2 융합단백질 5㎍을 복강내주사로
면역시킨 마우스(추가자극),
1차 접종 21일에 추가자극 후, 7일 후에 채혈
모든 항체 반응은 정제된 절편 C, pre-S1(61 내지 81의 아미노산), pre-S2(12 내지 24의 아미노산) 펩티드와 S-S1 부위에 포함된 pre-S1(21 내지 47의 아미노산)에 대한 효소 결합 면역흡착검사법(ELISA)으로 측정되었는 바, 도 2, 3, 4 및 5에 각각 나타내었다. 결과를 요약하면, 반응은 융합 단백질의 pre-S와 pre-S2 구성부와 절편 C 담체 단백질 모두에 대하여 검출되었다.

Claims (11)

  1. B형 간염 바이러스(HBV)의 pre-S1 영역, 또는 그 영역에서 유래된 절편 및/또는 HBV의 pre-S2 영역, 또는 그 영역에서 유래된 절편과 융합된 파상풍균 독소(tetanus toxin) 절편 C, 또는 그것에서 유래된 절편을 포함하는 폴리펩티드.
  2. 제 1항의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 조절 유전자(regulatory sequence)에 발현 가능하도록(operably) 연결된, 제 2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  4. 제 3항에 있어서,
    전기 조절 유전자가 htrA 촉진자를 포함하는 것을 특징으로 하는
    벡터.
  5. 제 3 또는 4항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  6. 제 5항에 있어서,
    박테리아인 것을 특징으로 하는
    숙주세포.
  7. 제 1항의 폴리펩티드, 제 2항의 폴리뉴클레오티드, 또는 제 3 또는 4항의 벡터를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석액을 포함하는 백신 조성물.
  8. 제 1항의 폴리펩티드, 제 2항의 폴리뉴클레오티드, 또는 제 3 또는 4항의 벡터의 유효량을 사람 또는 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 사람 또는 동물에 있어서 HBV의 감염을 치료하거나 예방하는 방법.
  9. 제 1항의 폴리펩티드, 제 2항의 폴리뉴클레오티드, 또는 제 3 또는 4항의 벡터를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, HBV의 pre-S1 및/또는 pre-S2 영역에 존재하는 항원결정부를 인식하는 항체를 제조하는 방법.
  10. 제 9항의 방법에 의해 제조된 항체.
  11. 제 10항의 항체의 유효량을 사람 또는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 사람 또는 동물에 있어서 HBV 감염을 치료하는 방법.
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