CZ2000978A3 - Polypeptidy viru Hepatitidy B - Google Patents
Polypeptidy viru Hepatitidy B Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2000978A3 CZ2000978A3 CZ2000978A CZ2000978A CZ2000978A3 CZ 2000978 A3 CZ2000978 A3 CZ 2000978A3 CZ 2000978 A CZ2000978 A CZ 2000978A CZ 2000978 A CZ2000978 A CZ 2000978A CZ 2000978 A3 CZ2000978 A3 CZ 2000978A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- fragment
- polypeptide
- hbv
- polypeptides
- vector
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 81
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 74
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 73
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 title abstract description 38
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 64
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 19
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 30
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 29
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 29
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 9
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 claims description 9
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 claims description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 8
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 6
- XFTWUNOVBCHBJR-UHFFFAOYSA-N Aspergillomarasmine A Chemical group OC(=O)C(N)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O XFTWUNOVBCHBJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 101150018266 degP gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108010004164 hepatitis B surface antigen presurface protein 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101150007310 htrA gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108010044241 tetanus toxin fragment C Proteins 0.000 abstract description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 29
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 230000004044 response Effects 0.000 description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 11
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 11
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 11
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Natural products OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N almurtide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CO[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 2
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N Ethylamine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 108700015872 N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical group C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- -1 glycine amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- YHQZWWDVLJPRIF-JLHRHDQISA-N (4R)-4-[[(2S,3R)-2-[acetyl-[(3R,4R,5S,6R)-3-amino-4-[(1R)-1-carboxyethoxy]-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-5-amino-5-oxopentanoic acid Chemical compound C(C)(=O)N([C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](CCC(=O)O)C(N)=O)C1[C@H](N)[C@@H](O[C@@H](C(=O)O)C)[C@H](O)[C@H](O1)CO YHQZWWDVLJPRIF-JLHRHDQISA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 1-(2-azaniumylacetyl)pyrrolidine-2-carboxylate Chemical compound NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 2-(ethylamino)ethanol Chemical compound CCNCCO MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 101100111953 Arabidopsis thaliana CYP734A1 gene Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 101150100308 BAS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100404144 Bacillus subtilis (strain 168) nasD gene Proteins 0.000 description 1
- 101100165166 Barbarea vulgaris LUP5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108010039939 Cell Wall Skeleton Proteins 0.000 description 1
- 229920000623 Cellulose acetate phthalate Polymers 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 229920003136 Eudragit® L polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920003137 Eudragit® S polymer Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229940124872 Hepatitis B virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108700020354 N-acetylmuramyl-threonyl-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Chemical group 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 1
- 101150075200 S-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002096 anti-tetanic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940087373 calcium oxide Drugs 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000004520 cell wall skeleton Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 229940081734 cellulose acetate phthalate Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 description 1
- 238000009505 enteric coating Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004887 ferric hydroxide Drugs 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 230000008642 heat stress Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- IEECXTSVVFWGSE-UHFFFAOYSA-M iron(3+);oxygen(2-);hydroxide Chemical compound [OH-].[O-2].[Fe+3] IEECXTSVVFWGSE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical group CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N mifamurtide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)COP(O)(=O)OCCNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)OC(O)[C@@H]1NC(C)=O JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N 0.000 description 1
- 229960005225 mifamurtide Drugs 0.000 description 1
- 108700007621 mifamurtide Proteins 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 101150044129 nirB gene Proteins 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 125000005642 phosphothioate group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Chemical group 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- XETCRXVKJHBPMK-MJSODCSWSA-N trehalose 6,6'-dimycolate Chemical compound C([C@@H]1[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COC(=O)C(CCCCCCCCCCC3C(C3)CCCCCCCCCCCCCCCCCC)C(O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC)O2)O)O1)O)OC(=O)C(C(O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC)CCCCCCCCCCC1CC1CCCCCCCCCCCCCCCCCC XETCRXVKJHBPMK-MJSODCSWSA-N 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Oblast techniky
Poskytnutý vynález se vztahuje k odvozených z povrchového antigenu viru použití ve vakcinových přípravcích.
Dosavadní stav techniky
Infekce hepatitidou B a následné zahrnují chronickou jaterní nemoc, cirhosu a hepatocelulární karcinom představují velký zdravotní problém na celém světě. Systematická vakcinace jednotlivců s nebezpečím virové expozice představuje hlavní způsob kontoly infekce. První vakcína proti viru hepatitidy B (HBV) byla připravena čistěním a inaktivací povrchového antigenu HBV (HBsAg), získaného z plasmy chronických nositelů. Tento postup byl brzy následován přípravou HBsAg za použití technik rekombinantní DNA. Nicméně u významné části jedinců nedochází k zahájení tvorby protilátek vůči HBsAg přítomnému ve vakcinových přípravcích. Předpokládá se, že tito jedinci zůstávají citliví na infekci HBV.
Podstata vynálezu
Vynález poskytuje polypeptid obsahující fragment C tetanového toxinu nebo jeho fragment, fúzovaný s oblastí pre-Sl viru hepatitidy B (HBV) nebo jeho fragmentem, a/nebo s jeho oblastí pre-S2 nebo jeho fragmentem.
Výhodně fragment oblasti pre-Sl a oblasti pre-S2 obsahuje nejméně 5 aminokyselin, výhodněji nejméně 6 aminokyselin a nejvýhodněji 10, 15 nebo 20 aminokyseLin.
• 9 · 9 9 • «9 · • 9 9 9 · 9 · • 9 9 ·
Fragment C tetanového toxinu nebo jeho fragment se může fúzovat s oblastí pre-Sl viru hepatitidy B (HBV) nebo jejím fragmentem, nebo s oblastí pre-S2 HBV nebo jejím fragmentem, cestou zavěšení spojovací oblasti. Obdobně jestliže jsou přítomny jak fragment oblasti pre-Sl, tak fragment oblasti pre-S2, lze je spojit dohromady cestou zavěšení spojovací oblasti.
Vynález dále poskytuje kódování polynukleotid kódující pro polypeptid podle tohoto vynálezu.
Vynález rovněž poskytuje vektory obsahující polynukleotid kódující pro polypeptid podle vynálezu řízené spojené s regulační sekvencí. Regulační sekvence výhodně umožňuje expresi polypeptidu v buňce hostitele. Hostitelskou buňkou je typicky bakterie, která může být oslabena, nebo buňka zvířecí, výhodněji savčí, včetně buňky primátů a lidské.
Polypeptidy, polynukleotidy a vektory a hostitelské buňky podle tohoto vynálezu se mohou použít v prevenci nebo léčbě infekcí virem hepatitidy B. Takto je dalším aspektem vynálezu poskytnutí vakcínových přípravků, obsahujících polypeptidy, polynukleotidy nebo vektory podle tohoto vynálezu spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem. Vakcinové přípravky mohou obsahovat oslabenou bakterii přeměněnou polynukleotidem podle tohoto vynálezu. Může být preferováno použití polypeptidů podle vynálezu v kombinaci s aktivními složkami jiných HBV vakcínových přípravků, aby se zvýšila jejich účinnost. Takto vakcinový přípravek podle tohoto vynálezu výhodně dále obsahuje například polypeptidové složky HBV vakciny, popsané ve W 0 88/10301 (to jest S,S+pre-S2 a S+ aminokyseliny 20 až 47 pre-Sl antigenní složky jak subtypů adw, tak ayw).
Vynález rovněž poskytuje způsob léčby nebo prevence • 4
· · · · · · • 4 44 infekce HBV u lidí nebo zvířat, zahrnující podávání účinného množství polypeptidu, polynukleotidu nebo vektoru vynálezu lidem nebo zvířatům.
Polypeptidy podle tohoto vynálezu mohou být rovněž použity k indukci protilátkové odpovědi u zvířat za účelem produkce protilátek, které rozpoznají epitopy v rámci oblastí pre-Sl a/nebo pre-S2 HBV. Tímto vynález poskytuje způsob produkce protilátek, které rozpoznají epitopy v rámci oblastí pre-Sl a/nebo pre-S2 HBV, který zahrnuje podání polypeptidu, polynukleotidu nebo vektoru podle vynálezu savci. Vzniklé protilátky mohou být polyklonální nebo monoklonální protilátky nebo jejich fragmenty. Tyto protilátky mohou být použity jako způsob léčby HBV infekce u lidí nebo zvířat.
Kromě potenciálního léčebného použití polypeptidů, polynukleotidů, vektorů a protilátek podle vynálezu, tyto mohou být rovněž použity jako nástroj určení například antigenních determinant v rámci oblastí pre-Sl a/nebo pre-S2 HBV povrchového antigenu (HBsAg). Lze se důvodně domnívat, že obě oblasti hrají významnou roli ve zvětšení anti-HBsAg odpovědí, které zabraňují nasednutí viru na hepatocyty a vyvolávají protilátky, které jsou účinné při odstranění virů, zvýšení buněčné imunitní odpovědi a obejití genetické absence odpovědi na samotnou S oblast.
Podrobný popis vynálezu
A. Polypeptidy
Polypeptidy podle tohoto vynálezu zahrnují fragment C tetanového toxinu nebo epitop obsahující tento fragment fúzovaný s fragmentem oblasti pre-Sl viru hepatitidy B (HBV) a/nebo s fragmentem oblasti pre-S2 HBV.
Strukturní gen tetanového toxinu byl klonován a secerován [Fairweather a kol., J.Bacteriol., 165, 21 - 27 (1986)]. Fragment C je 50kDa polypeptid vytvořený štěpením papainem a obsahující nebo zásadně odpovídající 451 aminokyselinám na C konci řetězce. Fragmenty C fragmentu tetanového toxinu, které obsahují epitopy mohou být rovněž použity v polypeptidech podle tohoto vynálezu. Tyto fragmenty budou obsahovat nejméně 5 nebo 6 aminokyselin, výhodně nejméně 10 aminokyselin a výhodněji nejméně 15, 20, 50 nebo 100 aminokyselin. Zvláště výhodné fragmenty obsahují aminokyseliny od 80 do 180, což je vyhovující epitop B-buněk a aminokyseliny asi od 83 do 103 a od 409 do 420, což jsou vyhovující epitopy T-buněk (počítání vychází z toho, že aminokyselina 1 fragmentu C je aminokyselina 864 celého tetanového toxinu).
Výhodně fragment oblasti pre-Sl a oblasti pre-S2 obsahuje nejméně 5 aminokyselin, výhodněji nejméně 6 aminokyselin a nejvýhodněji 10, 15 nebo 20 aminokyselin. Fragment může například obsahovat aminokyseliny od 1 do 19, od 20 do 39, od 40 do 59, od 60 do 79, od 80 do 99, nebo od 100 do 119 pre-Sl nebo od 1 do 19, od 20 do 39 nebo od 40 do 55 pre-S2. Vhodné fragmenty, které se mohou použít v polypeptidech podle tohoto vynálezu, jsou popsány v příkladech. Zvláště výhodné fragmenty obsahují aminokyseliny 20 nebo 21 až 47 pre-Sl (místo vážící hepatocyty) a aminokyseliny 1 až 26 a 14 až 32 pre-S2.
Dále sekvence aminokyselin fragmentu C tetanového toxinu a fragmentů oblastí pre-Sl a pre-S2 lze modifikovat, aby poskytly polypeptidy podle vynálezu. Například to lze provést, aby se zvýšila imunogenicita polypeptidů podle vynálezu. Substituce aminokyselin může být provedena například od 1, 2 nebo 3 do 10, 20 nebo 30 substituci za předpokladu, že modifikované polypeptidy si ponechají
epitopy.
Konzervativní substituce lze provést například podle tabulky uvedené níže. Aminokyseliny ve stejné části ve druhém sloupci a výhodně ve stejné řádce ve třetím sloupci se mohou nahradit jedna za druhou:
i r
I I
ALIFATICKÉ | Nepolární |
Polární - bez náboje|
Polární - s nábojem
AROMATICKÉ
GAP
I L V —
C S T M
N Q
D E
K R
H F W Y
Fragment C tetanového toxinu může být fúzován s fragmentem oblasti pre-Sl viru hepatitidy B (HBV) nebo s fragmentem oblasti pre-S2 HBV cestou zavěšení spojovací oblasti. Obdobně jestliže jsou přítomny jak fragment oblasti pre-Sl, tak fragment oblasti pre-S2, lze je spojit dohromady cestou zavěšení spojovací oblasti.
Zavěšená spojovací oblast je oblast určená ke vzniku samostatného složení jak fragmentu C tetanového toxinu, tak fragmentu oblasti pre-Sl a fragmentu oblasti pre-S2 poskytnutím jak prostorového tak časového oddělení mezi • · · • · · • · · doménami.
Zavěšená oblast je typicky sekvence kódující vysoký podíl aminokyselin prolinu a/nebo glycinu. Zavěšená oblast může být složena výhradně z aminokyselin prolinu a/nebo glycinu. Zavěšená oblast může obsahovat jednu nebo více dipeptidových jednotek glycin-prolin. Zavěšená oblast může alternativně obsahovat karboxylové zakončení fragmentu C tetanového toxinu.
Zavěšená oblast může například obsahovat až asi 15 aminokyselin, například nejméně 4 a výhodně od 6 do 14 aminokyselin, počet aminokyselin tak dodává flexibilitu mezi rozdílnými polypeptidovými doménami.
V jednom ztělesnění zavěšená oblast může významně odpovídat zavěšené doméně imunoglobulinu protilátky.
Zavěšené oblasti IgG protilátek jsou zvláště bohaté na prolin [Michelson T.E. a kol., J. Biol. Chem. 252, 883 až 889 (1977)], což, jak se předpokládá, poskytuje flexibilní spojení mezi vážícím antigenem a koncovými doménami.
Jiné aminokyseliny lze substituovat glycinem, zejména ty, které jsou bez objemného postranního řetězce, jako je alanin, serin, asparagin a threonin.
V jednom výhodném ztělesnění zavěšená oblast je řetězec čtyř nebo více aminokyselin určující sekvenci:
-[X]p-Pro-[Y]q-Pro-[Z]rve které
Pro je prolin,
X a Y jsou každý z nich glycin nebo aminokyselina majrcí neobjemný postranní řetězec,
Z je jakákoli aminokyselina, φ φ • · · · • φ φ · φ · φ φ ρ je kladné celé číslo, q je celé kladné číslo od 1 do 10 a r je nula nebo kladné celé číslo větší než nula.
B. Polynukleotidy a vektory
Polynukleotidy podle tohoto vynálezu zahrnují sekvence nukleových kyselin kódující pro polypeptidy podle vynálezu. Polynukleotidy podle tohoto vynálezu mohou zahrnovat DNA nebo RNA. Mohou být rovněž polynukleotidy, které obsahují mezi sebou syntetické nebo modifikované nukleotidy. Řada různých druhů modifikací oligonukleotidů je známa v oboru. Zahrnují methylfosfonátový a fosfothioatový hlavní řetězec, adici akridinových nebo polylysinových řetězců na 3' a/nebo 5' koncích molekuly. Pro účely poskytnutého vynálezu je třeba pochopit, že polynukleotidy zde popsané mohou být modifikovány kterýmkoli způsobem známým v oboru. Takové modifikace lze provést s cílem zvýšit aktivitu za podmínek in vivo nebo životnosti polynukleotidů podle vynálezu.
Výhodné polynukleotidy podle tohoto vynálezu rovněž obsahují polynukleotidy kódující pro jakékoli polypeptidy podle vynálezu popsané výše. Kvalifikovaná osoba bude vědět, že řada různých polynukleotidů může kódovat pro stejný polypeptid, což je důsledek degenerace genetického kódu.
Polynukleotidy zahrnuté ve vynálezu se mohou začlenit do rekombinantního replikovatelného vektoru. Vektor se může použít k replikaci nukleových kyselin v kompatibilních hostitelských buňkách. Takto v dalším ztělesnění poskytuje vynález způsob přípravy polynukleotidů podle vynálezu zavedením polynukleotidu podle tohoto vynálezu do replikovatelného vektoru, zavedením vektoru do kompatibilní hostitelské buňky a pěstováním hostitelské buňky za podmínek, při kterých dochází k replikaci vektoru. Vektor lze znovu získat z hostitelské buňky. Vhodné hostitelské ♦ «*· *· · * ♦ ·· • · te
Λ · » · • · te • te *·· • 9 te· te · · · te · · * • · · · » • · te · ·· ·· buňky zahrnují bakterie, jako je E. coli, kvasinky, savčí buněčné linie a jiné eukaryotické buněčné linie, například hmyzí Sf9 buňky.
Výhodně je polynukleotid podle vynálezu ve vektoru řízené spojen s regulační sekvencí, která je schopna zajistit expresi kódující pro sekvenci hostitelskou buňkou, tedy že vektorem je vektor exprese. Výraz řízené spojen se vztahuje k postavení vedle sebe, kde popsané složky jsou ve vztahu, umožňujícím jim působit zamýšleným způsobem. Regulační sekvence řízené spojená s kódující sekvencí je spojena takovým způsobem, že exprese kódující pro sekvenci se dosáhne za podmínek kompatibilních s kontrolní sekvencí.
Takové vektory lze změnit nebo převést do vhodných hostitelských buněk způsobem uvedeným výše, aby se dosáhlo exprese polypeptidů podle vynálezu. Tento postup může zahrnovat pěstování hostitelské buňky změněné expresí vektoru, jak bylo popsáno výše, za podmínek zajištujících expresi vektorem té kódující sekvence, která kóduje pro polypeptidy. Exprimované polypeptidy lze získat za podmínek in vitro. Hostitelské buňky změněné, aby poskytly stálou expresi polypeptidů, lze rovněž použít in vivo. Například jako vakcínu lze použít hostitelskou buňku, jako je oslabená bakterie, změněnou, aby expresovala polypeptid podle tohoto vynálezu. Oslabenou bakterii lze vybrat ze Salmonely,
Bordetely, Vibria, Haemofila, Neisserie a Jersinie.
Výhodněji oslabená bakterie je enterobakterie, jako je E. coli nebo Salmonela, například S. tyfi, S. tyfimurium nebo S. enteritidis.
Vektory mohou být například plasmidy nebo virové vektory poskytnuté s původcem replikace, popřípadě promotor exprese zmíněného polynukleotidu a popřípadě regulátor promotoru. Vektory mohou obsahovat jeden nebo více volitelných kontrolních (značících) genů, například gen « · • · fc · • · ·· • · · tf « · « · · • · · * · rezistence na ampicillin v případě bakteriálních plasmidů nebo gen rezistence na neomycin u savčích vektorů.
Vektory lze použít in vitro, například pro tvorbu RNA nebo pro změnu či přenos do hostitelských buněk. Vektory lze rovněž adaptovat na použití in vivo, například při metodě genové terapie.
Promotory/enhancery a jiné signály regulace exprese lze vybrat, aby byly kompatibilní s hostitelskou buňkou, pro kterou je vektor exprese určen. Například lze použít prokaryotické promotory, zejména ty, které jsou vhodné pro užití u kmenů E. coli (jako je E. coli HB 101). Ve zvláště vhodném ztělesnění tohoto vynálezu se použije promotor, jehož aktivita je indukována v odpovědi na změnu okolního prostředí, jako anaerobních podmínek. Vhodně lze použít promotory htrA nebo nirB. Tyto promotory lze použít zejména k expresi polypeptidů oslabených bakterií například k použití jako vakcína. Když se uskuteční exprese polypeptidů podle vynálezu na savčích buňkách, jak in vitro, tak in vivo, lze použít savčích promotorů. Lze rovněž použít tkáňově specifické promotory, například specifické promotory buněk hepatocytů. Také je možno použít virových promotorů, například virus Moloneyho myší leukemie s dlouhými koncovými opakujícími se skupinami (MMLV LTR), promotor rouš sarcoma viru RSV LTR, promotor SV40, IE promotor lidského cytomegaloviru (CMV), promotory viru herpes simplex nebo promotory adenoviru. Všechny tyto promotory jsou přímo dostupné v oboru.
C. Podání
Polypeptidy podle tohoto vynálezu lze podat přímo injekčně. Vhodně jsou polypeptidy kombinovány s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem, aby vznikl farmaceutický přípravek. Vhodné nosiče nebo ředidla představují izotonické roztoky solí, například fyziologický roztok pufrovaný fosfátem. Přípravky mohou být připraveny pro parenterální, intramuskulární, intravenózní, intranasální, subkutánní, intraokulární nebo transdermální podání. Obvykle se každý polypeptid podává v dávce od 0,01 do 30 μ9 na kg tělesné hmotnosti, výhodně od 0,1 do 10 μ9 na kg, výhodněji od 0,1 do 1 μg na kg tělesné hmotnosti. Rovněž je možné použít protilátky připravené použitím polypetidů podle tohoto vynálezu, způsobem popsaným výše, v léčbě nebo prevenci HBV infekce. Neutralizující protilátky nebo jejich fragmenty, které si zachovávají specificitu pro HBV antigeny, lze podat podobným způsobem jako polypeptidy podle tohoto vynálezu.
Polynukleotidy podle tohoto vynálezu mohou být podány přímo jako neizolovaný konstrukt nukleových kyselin, výhodně dále obsahující přimykající se sekvence homologní genomu hostitelské buňky. Když se podá expresní kazeta ve formě neizolovaných nukleových kyselin, množství nukleových kyselin je obvykle v rozmezí od 1 μg do 10 mg, výhodně od 100 μg do 1 mg.
Zpětné vychytávání neizolovaného konstruktu nukleových kyselin savčími buňkami se zvyšuje několika známými způsoby přenosu, například těmi, které zahrnují přenosové látky. Příklady těchto látek zahrnují kationické látky (například fosforečnan vápenatý a DEAE-dextran) a lipofektanty (například lipofectamXii a transfectairr11). Obvykle jsou konstrukty nukleových kyselin smíchány s přenosovými látkami, aby vznikl přípravek.
Výhodně se polynukleotid nebo vektor podle tohoto vynálezu kombinuje s farmaceuticky vhodným nosičem nebo ředidlem, aby vznikl farmaceutický přípravek. Vhodné nosiče nebo ředidla zahrnují fyziologické roztoky, například fyziologický roztok pufrovaný fosfátem. Přípravek může být připraven pro parenterální, intramuskulární, intravenózní, subkutánní, intraokulární nebo transdermální podání.
Popsaný způsob podání a dávky jsou zamýšleny pouze jako návod, protože kvalifikovaný praktik bude schopen určit přímo nejvhodnější způsob podání a dávku pro každého jednotlivého pacienta v konkrétních podmínkách.
D. Příprava vakcín
Vakcíny lze připravit z jednoho nebo více polypeptidů podle tohoto vynálezu. Mohou rovněž obsahovat jeden nebo více imunogenních HBV polypeptidů, například imunogenní HBV polypeptidy známé v oboru. Takto mohou vakcíny podle tohoto vynálezu zahrnovat jeden nebo více polypeptidů podle tohoto vynálezu a popřípadě jeden nebo více polypeptidů zvolených z polypeptidů HBV S, pre-Sl, pre-S2 a jejich imunogenních fragmentů.
Polypeptidy podle tohoto vynálezu mohou být zpracovány do vakcíny jako neutrální nebo ve formě soli. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují adiční soli s kyselinou (tvořené s volnou aminoskupinou peptidu), které jsou vytvořeny s anorganickou kyselinou, například s kyselinou chlorovodíkovou nebo fosforečnou, nebo s organickou kyselinou, například s kyselinou octovou, oxalovou, vinnou nebo maleinovou. Soli vytvořené s volnou karboxylovou skupinou mohou být rovněž odvozeny z anorganických baží, například z hydoxidu sodného, draselného, amonného, vápenatého nebo železitého a z takových organických baží, jako je isopropylamin, trimethylamin, 2-ethylaminoethanol, histidin a prokain.
Příprava vakcín, které obsahují imunogenní polypetid(y) jako účinnou látku (účinné látky) je známa osobě se znalostmi v oboru. Obvykle se takové vakcíny připravují jako injekční přípravky, buď jako kapalné roztoky « · • * · · · tt '·· ·· · » · · nebo suspenze; pevné formy jsou vhodné pro roztoky nebo suspenze, kdy kapalná forma může být rovněž připravena před injekcí. Přípravek může být také emulzifikován nebo protein enkapsulován do liposomů.
Vakcíny mohou obsahovat oslabenou bakterii schopnou exprese polypeptidů podle tohoto vynálezu.
Účinné imunogenní látky se často smíchávají s pomocnými látkami, které jsou farmaceuticky přijatelné a kompatibilní s účinnou látkou. Vhodné pomocné látky jsou například voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol, ethanol nebo podobně a jejich kombinace.
Navíc pokud je to žádoucí, mohou vakcíny obsahovat malé množství pomocných látek jako jsou zvlhčovadla nebo emulzifikující látky, látky pufrující pH a/nebo přídatné látky, které zvyšují účinnost vakcíny. Příklady přídatných látek, které mohou být účinné, zahrnují hydroxid hlinitý, N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (CGP 11637, označovaný jako nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1’,2’-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)ethylamin (CGP 19835A, označovaný jako MTP-PE) a RIBI, který obsahuje tři složky extrahované z bakterií, monofosforyl lipid A, dimykolat trehalosy a skelet buněčné stěny (MPL+TDM+CWS) ve 2% emulzi skvalenu ve Tweenu 80, ale nejsou tímto výčtem omezeny. Účinnost přídatných látek lze určit měřením množství protilátek zaměřených proti imunogenním polypeptidům obsahujícím HBV antigenní sekvence, vznikající podáním tohoto polypeptidu ve vakcínách, které rovněž obsahují různé přídatné látky.
Vakcíny jsou obvykle podávány parenterálně, injekčně, například buď subkutánně nebo intramuskulárně. Další přípravky, které jsou vhodné pro jiné způsoby podání,
• · 4 4 · · · t ř · ··«»··· • · · 4 · · 4
4 4 · 4 4 4 · 4 »* 4* zahrnují čípky a intranasální přípravky. Orální přípravky lze poskytnout, zejména pro podání oslabených bakterií.
V případě čípků mohou tradiční pojivá a nosiče zahrnovat například polyalkylenglykoly nebo triglyceridy; takové čípky lze vyrobit ze směsí obsahujících účinnou látku v rozsahu 0,5 % až 10 %, výhodně 1 % až 2 %. Orální přípravky obsahují takové běžně používané pomocné látky, jako například farmaceutickou jakost mannitolu, laktózy, škrobu, stearátu hořečnatého, sodné soli sacharinu, celulózy, uhličitanu hořečnatého a podobně. Tyto směsi mohou mít formu roztoků, suspenzí, tablet, pilulek, kapslí, přípravků s řízeným uvolňováním nebo prášku a obsahují 10 % až 95 % účinné látky, výhodně 25 % až 70 %.
Vakcínu, obsahující například oslabenou bakterii, lze s výhodou připravit v lyofilizované formě, například ve formě kapslí, pro orální podání pacientovi. Takové kapsle, tablety nebo pilulky pro orální podání pacientovi lze připravit s enterickým potahem, například obsahujícím Eudragit S, Eudragit L, acetát celulózy, acetát ftalát celulózy nebo hydroxypropylmethylcelulózu. Tyto kapsle lze použít jako takové nebo případně lyofilizovaná látka může být rekonstituována před podáním, například jako suspenze. Rekonstituci lze s výhodou uskutečnit v pufru o vhodném pH, aby se zajistila životaschopnost organismu. S cílem ochránit oslabenou bakterii a vakcínu před žaludeční kyselostí lze s výhodou podat přípravek s hydrogenuhličitanem sodným před každým podáním vakcíny.
E. Dávka a podání vakcín
Vakcíny se podávají způsobem slučitelným s dávkou přípravku a v množství, které je profylakticky a/nebo léčebně účinné. Množství, které se má podat a které je všeobecně v rozmezí 5 μ9 až 250 gg antigenu na dávku, závisí na léčené osobě, schponosti jejího imunitního systému «· ·· .ί vytvářet protilátky a na požadovaném stupni ochrany. Přesné množství účinné látky, které se vyžaduje k podání, může záležet na posouzení praktického lékaře a může být individuální pro každého jedince.
Vakcíny lze podat v jednodávkovém schématu, nebo výhodně ve vícedávkovém schématu. Schéma vícedávkové je takové, ve kterém základní trvání vakcinace může být v rozsahu 1 až 10 jednotlivých dávek, následované jinými dávkami podávanými v časových intervalech nutných k zachování nebo obnovení imunitní odpovědi, například v intervalech 1 až 4 měsíce pro druhou dávku a, pokud je zapotřebí, následované další dávkou (dalšími dávkami) po několika měsících. Dávkové schéma bude rovněž, alespoň z části, určeno potřebami daného jedince a záleží na posouzení praktického lékaře.
Kromě toho vakcíny obsahující imunogenní HBV antigen (antigeny) lze podat ve spojení s dalšími látkami regulujícími imunitu, například imunoglobuliny.
F. Příprava protilátek proti polypeptidům podle tohoto vynálezu
Imunogenní polypeptidy, připravené způsobem popsaným výše, lze použít k přípravě protilátek, a to jak polyklonálních, tak monoklonálních. Pokud se požadují polyklonální protilátky, imunizuje se vybraný savec (například myš, králík, koza, kůň atd.) imunogenním polypeptidem, nesoucím HBV epitop (epitopy). Sérum imunizovaného zvířete se sbírá a zpracovává známými způsoby. Pokud sérum obsahující polyklonální protilátky proti HBV epitopu obsahuje protilátky proti jiným antigenům, lze polyklonální protilátky čistit imunoafinitní chromatografíí. Způsoby produkce a zpracování polyklonálních antiser jsou známy v oboru.
β ·
Monoklonální protilátky zaměřené proti HBV epitopům v polypeptidech podle tohoto vynálezu může rovněž přímo vyrábět osoba se znalostmi v oboru. Obecná metodologie přípravy monoklonálních protilátek pomocí hybridomů je dobře známa. Linie imortálních buněk vytvářejících protilátky lze vytvořit buněčnou fúzí a rovněž jinými způsoby, jako je přímá transformace B lymfocytů s onkogenní DNA nebo přenosem s Epstein-Barrovým virem. Panely monoklonálních protilátek vytvářených proti HBV epitopům lze třídit podle různých vlastností, to znamená podle isotypu nebo afinity k epitopům.
Protilátky, jak monoklonální tak polyklonální, které jsou zaměřeny proti HBV epitopům, jsou zvláště užitečné v diagnóze, a ty, které jsou neutralizující, jsou užitečné v pasivní imunoterapii. Zejména monoklonální protilátky lze použít k získání anti-idiotypových protilátek.
Anti-idiotypové protilátky jsou imunoglobuliny, které nesou vnitřní obraz antigenu infekčního agens, proti němuž je žádána ochrana.
Způsoby získání anti-idiotypových protilátek jsou známy v oboru. Tyto anti-idiotypové protilátky mohou být rovněž užitečné v léčbě HBV, stejně jako pro objasnění imunogenních oblastí HBV antigenů.
Je rovněž možno použít fragmenty protilátek popsaných výše, například Fab fragmenty.
G. Zkoušky imunity
Jak polypeptidy podle tohoto vynálezu, tak protilátky vytvářené za použití polypeptidů podle tohoto vynálezu lze použít při metodách zkoušení imunity, například těch, které reagují imunologicky se sérem, obsahujícím HBV protilátky, • ·
W · · · • · 4 9
4 4 4 • * 44 například k detekci přítomnosti HBV protilátek nebo přítomnosti virových antigenů v biologických vzorcích, zahrnujících například vzorky krve nebo séra. Zejména lze polypeptidy a protilátky podle tohoto vynálezu použít k mapování vysoce imunogenních oblastí v rámci pre-Sl a pre-S2 oblastí HBsAg. Provedení zkoušek imunity u subjektů je ve značném rozsahu předmětem obměn a v oboru je známa celá řada těchto zkoušek imunity. Zkoušky imunity mohou například využívat jeden virový antigen, například polypeptid podle tohoto vynálezu, nebo volitelně mohou zkoušky imunity využívat kombinace virových antigenů zahrnujících polypeptidy podle tohoto vynálezu. Rovněž mohou využívat například protilátky získané použitím způsobu podle tohoto vynálezu nebo kombinace těchto protilátek zaměřených na jeden nebo několik virových antigenů. Postupy mohou být založeny například na soutěži, přímé reakci nebo na zkouškách sendvičového typu. Postupy použitých zkoušek imunity mohou rovněž například používat pevnou fázi nebo mohou být imunoprecipitační. Většina zkoušek zahrnuje použití značené protilátky nebo polypeptidu, značení může být například fluorescenční, chemiluminiscenční, radioaktivní nebo barvícími molekulami. Rovněž jsou známy zkoušky, které amplifikují signály ze sondy. Jako jejich příklad je možno uvést zkoušky, které využívají biotin a avidin a enzymaticky značené a zprostředkované zkoušky imunity, jako je zkouška ELISA.
Vynález bude popsán s odkazem na následující příklady, které jsou zamýšleny pouze k ilustraci a nikoli jako omezení. Příklady se vztahují k obrázkům. Odkazujíce na obrázky se uvádí podrobněji:
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 ukazuje klonovací schéma pro plasmid pTECH3.
• ·
Obr. 2
a) Celková imunoglobulinová odpověď, anti-fragment C, 14 dní po úvodní dávce s čištěnými proteiny fuze () fragmentu C-S/\S1/S2 a (·) fragmentu C-B/\S1/S2. Normální odpověď myšího séra (neimunizovaného) (A).
b) Celková imunoglobulinová odpověď, anti-fragment C, 7 dní po zvětšené dávce s čištěnými proteiny fuze (·) fragmentu C-S/\ S1/S2 a (·) fragmentu C-B/\S1/S2. Normální odpověď myšího séra (neimunizovaného) (a).
Obr. 3
a) Celková imunoglobulinová odpověď, anti-Sl (peptid aa61-81), 14 dní po úvodní dávce s čištěnými proteiny fuze (fl) fragmentu C-S/XS1/S2 a (·) fragmentu C-B/\S1/S2. Normální odpověď myšího séra (neimunizovaného) (A).
b) Celková imunoglobulinová odpověď, anti-Sl (peptid aa61-81), 7 dní po zvětšené dávce s čištěnými proteiny fuze () a (0) fragmentu C-B/\S1/S2. Normální odpověď myšího séra (neimunizovaného) (A).
Obr. 4
a) Celková imunoglobulinová odpověď, anti-Sl (peptid aal2-24), 14 dní po úvodní dávce s čištěnými proteiny fuze () fragmentu C-S/\S1/S2 a (·) fragmentu C-B/\S1/S2. Normální odpověď myšího séra (neimunizovaného) (A).
b) Celková imunoglobulinová odpověď, anti-Sl (peptid aal2-24), 7 dní po zvětšené dávce s čištěnými proteiny fuze («) fragmentu C-S/\S1/S2 a (·) fragmentu C-B/\Sl/S2. Normální odpověď myšího séra (neimunizovaného) (A).
Obr. 5
a) Celková imunoglobulinová odpověď, anti-Sl (peptid aa21-47, přítomný v S-pre-Sl částicích), 14 dní po úvodní dávce s čištěnými proteiny fuze () fragmentu C-S/\S1/S2 a (·) fragmentu C-B/\S1/S2. Normální odpověď myšího séra
(ne imun i z ováného) (A) .
b) Celková imunoglobulinová odpověď, anti-Sl (peptid aa21-47, přítomný v S-pre-Sl částicích), 7 dní po zvětšené dávce s čištěnými proteiny fuze () fragmentu C-S/\S1/S2 a (·) fragmentu C-B/\S1/S2. Normální odpověď myšího séra (neimunizovaného) (A).
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava konstruktů exprese
Plasmid pTECH-3, základní vektor exprese používaný v těchto příkladech, se připraví postupem zobrazeným v obr.
z pTECH-2 a pTEThtrA-1, jak je popsáno v naší dřívější přihlášce PCT/GB95/00196. pTECH-3 zahrnuje sekvenci kódující pro fragment C tetanového toxinu a obsahuje zavěšenou oblast, řízené spojenou s promotorem htrA.
Konstrukty zaznamenané v tabulce uvedené níže se připraví následujícím způsobem:
Tabulka 1
Konstrukt Sekvence hepatitidy B
| pIBEM | pře Sl ^2M7aa |
| jjteS2^w l-5Saa | |
| pTEefozsw | pre SI 21 -47/preS2 1-SSaa |
| pTECWSB | : S ww 120-147aa |
| pTBCH3/SaS1/S2 | pre 81^21-139/32^1-55^ |
| PT£CH3/BaS1/S2 | pře Sl 42-119/S2 l-55aa |
| pTBCH3AVSI/S2 | pře Sl 1-119/S2 w 3-SSas |
Plasmid pMBdSlRN/44 (obsahující gen pre-Sl(20-47)/S ayw hepatitidy B) se použije jako vzor pro přípravu pTECH3/Sl, pTECH3/SB a pTECH3/Sl/S2. pMByS2/8 (obsahující gen pre-S2(1-55)/S ayv hepatitidy B) se použije jako vzor pro přípravu pTECH3/S2, pTECH3/Sl/S2 a pRIT12793 (obsahující celý gen pre-Sl/S2 adw hepatitidy B v pBR322) se použije pro pTECH3/S/\Sl/S2, pTECH3/BASl/s2 a pTECH3/WSl/S2.
Následující páry primerů se použijí k PCR klonu za standardních podmínek, sekvence pre-Sl/S2 hepatitidy B pro vložení do pTECH3:
| Primer | Sekvence |
| MTCTASATGCAAAACCTGC | |
| TAACTAGTAATACAffiTGCA | |
| M©R10<SI | ATGTCTAGAAATCCTCTGGSATTC |
| MOR238(52sfl<m®) | AAGCHATGCAGTGGMTTCCAGA |
| MGR105(51) | C6MCTAGTGTTGGGATTGM6TC |
| MU 06(52) | AGGGTCACTAGTCCTCGtóAAGAT |
| TCTGTTGCTAGCCCTCTGBGATTC | |
| MGR254(BzxSl/S2) | TCAAACGCTAGCGA.TT'GGSACTTC |
| MGR243(S&žmd «&5Ι/82) | TTGClAGCGTTCAGCGCAGSGTCC |
| HGR250ÍW31/52) | CCCGCTAGCATGGGAGGTTGGTCA |
Každý PCR fragment se digeruje restrikcními enzymy, gel se čistí a naváže na 3,76 kbp fragment pTECH3. První čtyři konstrukty se připraví digescí plasmidu pTECH3s Xbal/Spel/CIAP, aby vznikl 3,76 kbp fragment. Vhodný HBV PCR fragment, který byl předštěpen pomocí Nhel, se potom naváže na 3,76 kbp fragment. Poslední dva konstrukty se připraví digescí plasmidu pTECH3 s Xbal/CIAP, aby vsnikl 3,76 kbp fragment, který se potom naváže na vhodný HBV PCR ·· ·· ♦ · 1
I Φ ♦ 1 φ φ »
Φ Φ 4 produkt, který byl předštěpen pomocí Nhel.
Příklad 2
Exprese polypeptidů a Western blotting
Plasmidy se transformují do kmenu HB101 E. coli za použití standardních způsobů. Exprese fúzovaných polypeptidů se indukuje tepelným stresem při 37 °C. Exprese se testuje pomocí western blotting buněčných extraků E. coli s protilátkou proti fragmentu C protilátky proti tetanovému toxinu a specifickými protilátkami pro každou vloženou sekvenci (viz tabulka 2).
Příklad 3
Příprava polyklonálních protilátek proti polypeptidovým konstruktům
Fúzované polypeptídy, vytvořené v příkladu 2 z plasmidů pTECH3/s/\Sl/S2 a pTECH3/B/\Sl/S2 se pročistí od buněčných extraktů E. coli afinitní chromatografií za použití fragmentu C anti-tetanového toxinu jako ligandu imobilizovaného na sloupci 4B sefarosy. Čištěné proteiny se připraví pro injekci a podají myši (BIO, samička, 6 až 8 týdnů stará) za použití standardních postupů, jak je podrobněji popsáno dále.
Rozvrh
Skupina 1 Imunizace myši (úvodní dávka) intraperitoneálně (I/P), 5 gg čištěného fuzního proteinu Frag C-SZ\S1/S2.
Vzorek krve 14 dnů po úvodní dávce.
Imunizace myši (pokračovací dávka), I/P, 5 gg čištěného fuzního proteinu Frag C-S/\S1/S2 , 21 dnů po úvodní dávce.
Vzorek krve 7 dnů po pokračovací dávce.
Skupina 2 Imunizace myši (úvodní dávka) intraperitoneálně (I/P), 5 čištěného proteinu fuze Frag C-B/\S1/S2.
Vzorek krve 14 dnů po úvodní dávce.
Imunizace myši (pokračovací dávka), I/P, 5 μ5 čištěného fuzního proteinu Frag C-B/\S1/S2 21 dnů po úvodní dávce.
Vzorek krve 7 dnů po pokračovací dávce.
Celkové protilátkové odpovědi se určí metodou ELISA proti čištěnému fragmentu C, peptidům pre-Sl (aa61-81), pre-S2 (aal2-24) a pre-Sl (aa21-47) obsaženém v rámci S-Sl částic. Odpovědi jsou ilustrovány na obr. 2,
3, 4 a 5.
Shrnuto, odpovědi se detekují jak pro složky pre-Sl, tak pre-S2 fuzních proteinů a protein fragmentu C nosiče.
ω
4J
O i-4
Λ β
β
0)
-P ω
0) &
OJ (0 rH
Λ (ΰ Ε-ι
Western blot
| $ | ' Q X | a % | -F | G Z | g z | a . z' | |
| ©· .ígr «3 | £3 Z | a z | 4- | k | X | ||
| $ | |||||||
| βφ | |||||||
| WÍ( | |||||||
| V» | |||||||
| Vi* | O | a | a | Q. | a | ||
| EO | z | z | z | Z | k | k | z |
| s | |||||||
| «r | |||||||
| o a- | £5: Z | : O | 4 | ||||
| 4- | ; gr | X | 4- | k | |||
| $ Ϋ | k' | X | k | 4- | ' k . | 4- | |
| CQ S | § | a a ΟΊ | |||||
| Vi | VS | s | |||||
| Ό | ilIlTií | u*s | Vi | Vi Vi | |||
| 1 | < | ||||||
| U | « | £ | sř | w | |||
| •H 4-> | 04 OQ | i n | Ol | á *S3 | |||
| (0 | b | 05 | 03 | ot | |||
| dl tt) X! | «X t**k | es ' es | .& r- | tó | Q% | eš | i |
| tt | to | ra | tfUM« | *** | |||
| tt) O Č tt) | 1 <M 1- | Ά 1 í «? | t (3 J_ | r- iř w*. i & <N | 04 i >*» | i | i i |
| > 44 tt) W | 05 t Cu | 05 £ o* | ' 05 s Cm | » . s eo | 05 £ Rh | 09 cl? | $3 B. ' Sk |
| -P 44 | oi | : 04 : 82 | CM | ||||
| β 5-1 j_j | 04 05 | <52 05 | *TÍ- <β. <3 | ' 05 | |||
| (fl β | • s | OJ 82 | w* ea r*>. | ,{33 m | «3 8? ťk | . i | cň |
| 0 K | U | Γ“·* Q | g | pXt u | *k u | . a o | z O |
| a | í ω | U3 | a | ||||
| r* C. | . r* ÍX | k* ‘o. | : Z Cl» | ,fa. | ÍX |
| ΓΟ σ> | |||||
| o | η | ||||
| cn | X—% | Ch | |||
| v | <υ | ||||
| n | 44 | 44 | |||
| α) | Ή | ||||
| a | Η | ||||
| i-4 | 05 | '(0 | |||
| 54 | |||||
| in | Ό | Μ | |||
| o | ο | ||||
| 1 | C0 | ||||
| to | η | ||||
| Ch | Ρ' | ι—1 | |||
| m | Ch | (Μ | |||
| < | \ | á | |||
| ο- | α | ||||
| u | ν | ||||
| tn | C0 | . | |||
| (0 | ι—Ι | Ο | |||
| 54 | C0 | ||||
| &4 | 1 | ||||
| 1 | Γ- | ο | |||
| •rl | Μ1 | νθ | |||
| +) | 1 | -—· | |||
| c | ο | ||||
| (0 | 04 | γ-4 | |||
| 05 | |||||
| 6 | 1 | ||||
| β | Η | ·γ4 | |||
| 54 | 05 | 4-1 | |||
| '0) | 1 | β | |||
| (fl | ·γ4 | β | |||
| 4-> | |||||
| Ή | β | Ή | |||
| >0 | β | >Ο | |||
| •r4 | •Η | ||||
| i—1 | Ή | I—ί | |||
| '(« | >ω | 'β | |||
| Ρ | >1 | β | |||
| 44 | β | 44 | |||
| Kr4 | Ή | Ή | |||
| β | β | β | |||
| r-4 | Η | γ-4 | |||
| '(ϋ | 'ίΰ | '<0 | ο | ||
| β | β | β | ο | ||
| 0 | 0 | 0 | sř | ||
| I—I | r-4 | ι-Η | • · | ||
| 44 | 44 | 44 | (—ι | ||
| >1 | 0 | 5ο | |||
| γ-Ι | β | γΗ | > | ||
| 0 | 0 | ο | 0 | C0 | |
| a | ο | S | ο | (β | |
| ο | ο | ||||
| s~\ | Η | —. | Η | ||
| β | • · | η | ·· | ϋ | |
| rH | γΗ | — | 04 |
(d) Monoklonální myší anti-S2 1-901 buněčný supernatant Harv. 20/11/97. Fre 26/11/97 1:10 (e) Polyklonální myší (SWR/J) anti-HB 147 (VRU, Imperiál College) 1:50
Claims (14)
- PATENTOVÉ NÁ1. Polypeptid, který zahrnuje (i) fragment C tetanového toxinu nebo jeho fragment alespoň 6 aminokyselin, fúzovaný (ii) s pre-Sl oblastí viru hepatitidy B (HBV) nebo jejím fragmentem alespoň 6 aminokyselin a/nebo s oblastí pre-S2 HBV nebo jejím fragmentem alespoň 6 aminokyselin, kde polypeptid zahrnuje protilátku, která rozpoznává oblasti pre-Sl nebo pre-S2 HBV.
- 2. Polypeptid podle nároku 1, který obsahuje fragment C tetanového toxinu o alespoň 100 aminokyselinách.
- 3. Polypeptid podle nároku 1, který obsahuje fragment C plné délky.
- 4. Polypeptid podle nároku 1, 2 nebo 3, který obsahuje fragment oblasti pre-Sl o alespoň 20 aminokyselinách a/nebo fragment oblasti pre-S2 o alespoň 20 aminokyselinách.
- 5. Polynukleotid, který kóduje pro polypeptid podle některého z předcházejících nároků.
- 6. Vektor, který zahrnuje polynukleotid podle nároku 5, řízené spojený s regulační sekvencí.
- 7. Vektor podle nároku 6, kde uvedená regulační «I · *• « · · • · · (náhradní strana) sekvence zahrnuje htrA sekvenci promotoru.
- 8. Hostitelská buňka, která obsahuje vektor podle nároku 6 nebo 7.
- 9. Hostitelská buňka podle nároku 8, kterou je bakterie.
- 10. Vakcinový přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle některého z nároků 1 až 4, polynukleotid podle nároku 5 nebo vektor podle nároku 6 nebo 7, dohromady s farmaceuticky vhodným nosičem nebo ředidlem.
- 11. Způsob léčby nebo prevence HBV infekce u lidí nebo zvířat, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání účinného množství polypeptidů podle některého z nároků 1 až 4, polynukleotidu podle nároku 5 nebo vektoru podle nároku 6 nebo 7 člověku nebo zvířeti.
- 12. Způsob přípravy protilátek, které rozpoznávají epitopy v rámci oblastí pre-Sl nebo pre-S2 HBV, v y z n a čující se tím, že zahrnuje podávání polypeptidů podle některého z nároků 1 až 4, polynukleotidu podle nároku 5 nebo vektoru podle nároku 6 nebo 7 savci.
- 13. Protilátka připravená způsobem podle nároku 12.
- 14. Způsob léčby HBV infekce u lidí nebo zvířat, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání účinného množství protilátky podle nároku 13 člověku nebo zvířeti.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9720033.1A GB9720033D0 (en) | 1997-09-19 | 1997-09-19 | Hepatitis B virus polypeptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2000978A3 true CZ2000978A3 (cs) | 2001-01-17 |
| CZ297131B6 CZ297131B6 (cs) | 2006-09-13 |
Family
ID=10819394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20000978A CZ297131B6 (cs) | 1997-09-19 | 1998-09-21 | Polypeptid, polynukleotid jej kódující, vektor s obsahem tohoto polynukleotidu, hostitelská bunka avakcínový prípravek |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040258709A1 (cs) |
| EP (1) | EP1015593B1 (cs) |
| JP (1) | JP2001517447A (cs) |
| KR (1) | KR100637282B1 (cs) |
| AT (1) | ATE241013T1 (cs) |
| AU (1) | AU751646B2 (cs) |
| CA (1) | CA2304255C (cs) |
| CZ (1) | CZ297131B6 (cs) |
| DE (1) | DE69814884T2 (cs) |
| ES (1) | ES2199460T3 (cs) |
| GB (1) | GB9720033D0 (cs) |
| HU (1) | HUP0003511A3 (cs) |
| NO (1) | NO20001397L (cs) |
| PL (1) | PL195242B1 (cs) |
| WO (1) | WO1999015671A1 (cs) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0009470D0 (en) * | 2000-04-17 | 2000-06-07 | Univ Southampton | Materials and methods relating to immune responses to fusion proteins |
| EP1281761A1 (en) * | 2001-07-27 | 2003-02-05 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Hepatitis B virus pre-S1 derived synthetic polypeptides and their use thereof. |
| JP4764820B2 (ja) * | 2003-06-23 | 2011-09-07 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド | ワクチン用担体タンパク質 |
| CN100537762C (zh) * | 2004-06-24 | 2009-09-09 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 一种嵌合型病毒样颗粒疫苗载体蛋白及其制备方法与应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10299017I2 (de) * | 1987-06-22 | 2005-05-25 | Medeva Holdings Bv | Hepatitis-B-Oberfl{chenantigen enthaltendes Peptid. |
| EP0389983A3 (en) * | 1989-03-31 | 1991-01-16 | Abbott Laboratories | Monoclonal antibodies to pres2 and pres1 polypeptides of the hepatitis b viral envelope |
| WO1994001132A1 (en) * | 1992-07-07 | 1994-01-20 | Merck & Co., Inc. | VACCINE COMPRISING MIXED preS1+preS2+S AND CORE PARTICLE |
| CA2141427C (en) * | 1992-07-31 | 2008-07-22 | Mohammed Anjam Khan | Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria |
| EP0712442B1 (en) * | 1993-07-30 | 2002-03-27 | Medeva Holdings B.V. | Vaccine compositions |
| GB9401795D0 (en) * | 1994-01-31 | 1994-03-23 | Medeva Holdings Bv | Vaccines |
-
1997
- 1997-09-19 GB GBGB9720033.1A patent/GB9720033D0/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-09-21 CZ CZ20000978A patent/CZ297131B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-09-21 KR KR1020007002945A patent/KR100637282B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-09-21 PL PL98339366A patent/PL195242B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-09-21 CA CA002304255A patent/CA2304255C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-21 WO PCT/GB1998/002852 patent/WO1999015671A1/en active IP Right Grant
- 1998-09-21 EP EP98944071A patent/EP1015593B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-21 HU HU0003511A patent/HUP0003511A3/hu unknown
- 1998-09-21 ES ES98944071T patent/ES2199460T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-21 JP JP2000512962A patent/JP2001517447A/ja active Pending
- 1998-09-21 AT AT98944071T patent/ATE241013T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-09-21 AU AU91744/98A patent/AU751646B2/en not_active Ceased
- 1998-09-21 DE DE69814884T patent/DE69814884T2/de not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-03-17 NO NO20001397A patent/NO20001397L/no not_active Application Discontinuation
-
2004
- 2004-07-15 US US10/892,018 patent/US20040258709A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1999015671A1 (en) | 1999-04-01 |
| EP1015593B1 (en) | 2003-05-21 |
| AU751646B2 (en) | 2002-08-22 |
| NO20001397L (no) | 2000-05-05 |
| AU9174498A (en) | 1999-04-12 |
| CA2304255C (en) | 2009-07-07 |
| PL195242B1 (pl) | 2007-08-31 |
| PL339366A1 (en) | 2000-12-18 |
| ATE241013T1 (de) | 2003-06-15 |
| US20040258709A1 (en) | 2004-12-23 |
| EP1015593A1 (en) | 2000-07-05 |
| CZ297131B6 (cs) | 2006-09-13 |
| GB9720033D0 (en) | 1997-11-19 |
| HUP0003511A3 (en) | 2003-08-28 |
| CA2304255A1 (en) | 1999-04-01 |
| KR20010024176A (ko) | 2001-03-26 |
| DE69814884T2 (de) | 2004-03-11 |
| HUP0003511A2 (hu) | 2001-02-28 |
| JP2001517447A (ja) | 2001-10-09 |
| KR100637282B1 (ko) | 2006-10-24 |
| NO20001397D0 (no) | 2000-03-17 |
| ES2199460T3 (es) | 2004-02-16 |
| DE69814884D1 (de) | 2003-06-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Thanavala et al. | Immunogenicity of transgenic plant-derived hepatitis B surface antigen. | |
| Wu et al. | Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. | |
| KR100208129B1 (ko) | B형 간염 백신 | |
| JPH03502687A (ja) | レスピラトリイ・シンシチアル・ウイルス：ワクチンおよび診断法 | |
| HU229222B1 (en) | Hbv core antigen particles with multiple immunogenic components attached via peptide ligands | |
| AU4704899A (en) | Antigenic complex comprising immunostimulatory peptide, cd4, and chemokine receptor domain for hiv treatment and immune disorders | |
| US11352416B2 (en) | Mosaic chimeric viral vaccine particle | |
| CZ284616B6 (cs) | Očkovací látka, antigen, kódová rekombinantní DNA pro tento antigen, rekombinantní vektor a způsob výroby antigenu | |
| JPH07501707A (ja) | キメラ免疫原 | |
| EP0291636A1 (en) | Immune response to viruses induced by anti-idiotype antibodies | |
| IE60671B1 (en) | Monoclonal antiobodies to HIV and related peptides | |
| KR0165115B1 (ko) | 콕시듐증 백신 | |
| Hui et al. | Immunization with a plasmid encoding a modified hepatitis B surface antigen carrying the receptor binding site for hepatocytes | |
| PT85137B (pt) | Processo de preparacao de um polipeptido de composito imunogenico, de melhoramento da imunogenicidade de um imunogenio e de atenuacao da falta de capacidade de resposta a uma vacina do virus da hepatite b | |
| CZ2000978A3 (cs) | Polypeptidy viru Hepatitidy B | |
| JPH02211881A (ja) | ＨＩＶに対する中和抗体を誘発するかまたはかかる抗体によって認識され得る免疫原配列を含むＨＢｓＡｇ抗原の形態学的特徴を有する組換えハイブリッドＨＢｓＡｇ粒子、かかる粒子をコードするヌクレオチド配列及び核粒子を含むワクチン | |
| Zuckerman | New hepatitis B vaccines. | |
| Hillman et al. | A polymer containing a repeating peptide sequence can stimulate T-cell-independent IgG antibody production in vivo | |
| Zuckerman | Subunit, recombinant and synthetic hepatitis B vaccines | |
| EP0370090B1 (en) | Immunogens and biologically active peptides derived from shared sequences from antigens and anti-idiotypic antibodies or antibodies specific for cellular receptors of the antigens | |
| MXPA00002577A (en) | Hepatitis b virus polypeptides | |
| WO1991017768A1 (en) | Epitopes of the pre-s region of hepatitis b virus surface antigen | |
| Yu et al. | Induction of High Levels of Epitope‐Specific Antibodies by Epitope/Peptide Candidate Vaccines against Human Immunodeficiency Virus Type‐1 (HIV‐1) | |
| CN114891120A (zh) | 一种二价禽腺病毒特异性抗原融合蛋白 | |
| Thanavala | An idiotype approach for a vaccine against Hepatitis B surface antigen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20090921 |