CN111603555A

CN111603555A - 一种自组装牛副流感病毒3型纳米颗粒样抗原及其应用

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Publication number: CN111603555A
Application number: CN202010322065.3A
Authority: CN
Inventors: 王君伟; 曲哲会; 高明春; 曹翀; 李明珠; 安冉; 于越洋; 李臣锋
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2020-03-23
Filing date: 2020-04-22
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2040-04-22
Also published as: CN111603555B

Abstract

本发明公开了一种自组装牛副流感病毒3型纳米颗粒样抗原及其应用。所述的自组装BPIV3纳米颗粒样抗原是通过Bac‑to‑Bac杆状病毒表达系统表达获得的以Helicobacter pylori的ferritin蛋白作为载体携带BPIV3 HN蛋白的自组装BPIV3纳米颗粒样抗原(命名为HNex‑RFNp)，其中，HN蛋白融合在ferritin的N‑端，所述的HN蛋白为位于BPIV3‑vaccine株HN蛋白氨基端128‑572aa的片段。本发明从体液免疫、细胞免疫和动物保护性试验三方面评价了HNex‑RFNp的免疫效果，结果表明，HNex‑RFNp的免疫效果显著地好于灭活BPIV3蛋白和HNex蛋白。本发明的提出为研制可用于预防BPIV3感染的新型、安全和高效的疫苗奠定了理论基础，提供了技术平台。

Description

一种自组装牛副流感病毒3型纳米颗粒样抗原及其应用

技术领域

本发明涉及一种自组装BPIV3颗粒样抗原及其制备方法和应用，特别涉及一种以Helicobacter pylori的ferritin作为载体携带BPIV3 HNex蛋白的自组装BPIV3纳米颗粒样抗原及其制备方法和应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

牛副流感(Bovine parainfluenza)是由牛副流感病毒3型(Bovineparainfluenza virus type 3,BPIV3)引起的一种急性、接触性传染病。该病往往在运输、气候转变、体质下降、营养不良等应激条件下发病率明显上升，表现严重呼吸困难，食欲下降、精神沉郁，伴有流鼻涕、流泪和咳嗽等临床症状。生产中，该病多发生在经过长途运输的牛，故又称“运输热”。BPIV3感染引起牛渐进性的肺组织损伤和免疫抑制。临床上多见BPIV3与其他常见病原体，如溶血曼氏杆菌、支原体、多杀性巴氏杆菌、牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)等，发生混合感染，引起牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory diseasecomplex，BRDC)，从而导致感染牛发生严重支气管肺炎，发病率和死亡率大幅度提高，给养牛业带来严重的经济损失。

目前，流行病学调查结果显示，我国BPIV3在我国流行广泛，但无特效药进行治疗，疫苗免疫是传染病防控的重要措施之一。因此，我国迫切需要研发有效的BPIV3疫苗，以便可以有效的对BPIV3感染与传播实施防控，以减少BPIV3对养牛业造成危害。虽然已有灭活疫苗和弱毒疫苗的研究报道，但存在散毒、毒力返强等安全风险；也有多种形式的新型疫苗，往往存在诱导的免疫应答不够全面，造成机体不能完全抵抗BPIV3病毒的感染等不足。

树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是目前所知唯一可以激活初始型T细胞，并启动适应性免疫应答的APC。抗原进入机体后，能否有效被提呈给DCs所识别，从而刺激机体产生全面的适应性免疫应答，尤其是细胞免疫反应，是机体获得免疫性保护的关键。

本发明利用杆状病毒表达系统制备自组装BPIV3颗粒样抗原HNex-RFNp，研究了其在诱导DCs成熟与迁移中机制，并在小鼠模型上对其免疫效果进行了评价，为研制可用于预防BPIV3感染的新型、安全和高效的疫苗奠定理论基础和提供技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以ferritin作为载体携带牛副流感病毒3型(Bovineparainfluenza virus type 3,BPIV3)HNex蛋白的自组装BPIV3纳米颗粒样抗原及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明利用软件DNA Star对HN蛋白氨基酸序列的抗原表位和结构域分析后，选择编码氨基酸序列氨基端128-572片段的基因，命名为“HNex”基因。利用融合PCR方法获得融合基因HNex-ferritin基因。通过IFA和western blotting方法鉴定Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达得到融合蛋白HNex-ferritin(HNex蛋白融合在ferritin的N-端)。利用Native-PAGE、TEM和Dot-ELISA方法鉴定纯化的HNex-ferritin。IFA和western blotting结果表明，融合蛋白HNex-ferritin在Sf9细胞中获得正确表达；经亲和层析技术纯化后，Native-PAGE结果证实融合蛋白HNex-ferritin在非变性非还原环境下呈多聚体结构特征，在TEM下观察到直径约19.5nm的近似球形颗粒，并且Dot-ELISA结果可推测HNex蛋白展示在RFNp的表面。

利用间接ELISA检测免疫鼠血清中HNex蛋白抗体和BPIV3抗体水平与变化趋势；HI试验检测血清中HI抗体水平和变化趋势；病毒中和试验检测血清中中和抗体水平与变化趋势。结果表明，HNex-RFNp组的HNex和BPIV3 ELISA抗体水平分别在2w和4w达到最高水平，并维持在较高水平；无论是BPIV3ELISA抗体还是HNex抗体，HNex-RFNp组的抗体水平都明显地高于HNex组；HNex-RFNp组的HNex ELISA抗体水平显著高于灭活BPIV3蛋白组，而BPIV3ELISA抗体水平在0-4w低于灭活BPIV3蛋白的抗体水平，之后BPIV3组的抗体水平明显下降至两者接近水平。HNex-RFNp组HI抗体呈逐渐上升至4w，之后开始缓慢下降趋势，并且HI抗体水平整体显著地高于HNex组，却低于灭活BPIV3蛋白组。HNex-RFNp组和灭活BPIV3蛋白组的VN抗体变化趋势比较一致，均呈逐渐增加趋势，HNex-RFNp组的抗体水平与BPIV3组接近，显著高于HNex组。

利用flow cytometry检测免疫鼠脾淋巴细胞中CD11c⁺MHCⅡ⁺比例，进行各组的mDCs比较分析；检测免疫鼠脾淋巴细胞中表面分子CD4和CD8及胞内INF-γ和IL-4的阳性细胞，分析T细胞增殖与分化。利用CCK8方法评价免疫鼠脾淋巴细胞受到PMA+Ionomycine或灭活BPIV3蛋白刺激后增殖水平。ELISA检测血清中IFN-γ和IL-10浓度，评价T细胞增殖与分化。结果显示，HNex-RFNp可以刺激小鼠机体产生成熟型DCs(Mature DCs，mDCs)在脾脏中显著地增加，并可激活T细胞增殖，主要以CD4⁺T细胞为主，并向Th1和Th2细胞分化。

对HNex-RFNp、HNex、灭活BPIV3蛋白和PBS免疫小鼠进行人工感染BPIV3-Z株，分别从组织病理学变化、组织BPIV3 RNA水平和病毒滴度评价HNex-RFNp对机体保护水平。分别对解剖小鼠肺脏进行眼观观察，然后取肺组织制作切片，经H.E.染色后镜下观察组织病理变化。结果显示，眼观HNex-RFNp免疫鼠肺脏无异常，镜下仅观察轻微毛细血管充血，与未感染鼠相同；其余三组均有不同数量的免疫鼠出现不同程度的眼观和镜检病理变化，利用Quantitative RT-PCR检测肺和气管组织中BPIV3 RNA水平，结果显示，HNex-RFNp组、HNex组和灭活BPIV3蛋白组的BPIV3 RNA水平均显著地低于PBS组，同时，HNex-RFNp组分别显著地低于HNex组和BPIV3组。在MDBK细胞上测定肺组织中BPIV3的滴度。结果显示，HNex-RFNp组和未感染组小鼠肺脏组织在MDBK细胞上均未观察到CPE，并且HNex组和BPIV3组中免疫鼠肺脏中病毒滴度低于PBS组。上述结果表明，免疫小鼠获得了不同程度上保护力，其中HNex-RFNp免疫小鼠获得抵抗BPIV3感染能力显著地高于HNex和BPIV3免疫的小鼠。

在上述研究的基础上，本发明提出了一种自组装牛副流感病毒3型(Bovineparainfluenza virus type 3,BPIV3)纳米颗粒样抗原，所述的自组装BPIV3纳米颗粒样抗原是通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达获得的以Helicobacter pylori的ferritin蛋白作为载体携带BPIV3 HN蛋白的自组装BPIV3纳米颗粒样抗原，其中，HN蛋白融合在ferritin的N-端，所述的HN蛋白为位于BPIV3-vaccine株HN蛋白氨基端128-572aa的片段。

其中，优选的，编码所述的Helicobacter pylori的ferritin蛋白的基因的GenBank登录号为NP_223316，并引入点突变N19Q以消除潜在的N-连接糖基化位点。

其中，优选的，HN蛋白通过“SGG”Linker与ferritin的N-端相连接。

其中，优选的，所述的自组装BPIV3纳米颗粒样抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，本发明还提出了所述的自组装BPIV3纳米颗粒样抗原在制备抗牛副流感病毒3型药物中的应用。

其中，优选的，所述的药物为疫苗。

更进一步的，本发明还提出了一种用于预防牛副流感病毒3型感染的疫苗，其含有本发明所述的自组装BPIV3纳米颗粒样抗原作为有效成分。

本发明利用杆状病毒表达系统制备了自组装BPIV3颗粒样抗原HNex-RFNp，并从体液免疫、细胞免疫和动物保护性试验三方面评价了HNex-RFNp的免疫效果，结果表明，HNex-RFNp的免疫效果显著地好于灭活BPIV3蛋白和HNex蛋白。本发明的提出为研制可用于预防BPIV3感染的新型、安全和高效的疫苗奠定了理论基础，提供了技术平台。

附图说明

图1为BPIV3-5555-9158基因克隆；

其中：A.BPIV3-5555-9158基因的PCR扩增结果M.Trans 2K PlusⅡDNA Marker；1-4.退火温度分别为47.5℃、50.6℃、52.5℃和55.4℃的PCR扩增结果；B.重组克隆质粒pMD-BPIV3-5555-9158的鉴定M.Trans2K PlusⅡDNA Marker；1.PCR鉴定结果；2.Sma I单酶切鉴定结果；3.Sca I单酶切鉴定结果；

图2为重组克隆载体pEASY-HNex的构建；

其中：A.HNex基因PCR扩增结果M.Trans 2K DNA Marker；HNex基因PCR结果；2.空白对照；B.重组克隆载体pEASY-HNex的鉴定M.Trans 2K PlusⅡDNA Marker；1.PCR鉴定结果；2.pEASY-HNex的BamH I+Hind III双酶切鉴定结果；3.pEASY-HNex的BamH I单酶切鉴定结果；

图3为BPIV3 HNex基因进化树分析；

图4为BPIV3 HNex基因同源性分析；

图5为BPIV3 HNex氨基酸序列进化树分析；

图6为BPIV3 HNex氨基酸同源性分析；

图7为重组转移载体pFast-ferritin的鉴定结果；

其中：A.ferritin基因PCR扩增结果.M.Trans2K PlusⅡDNA Marker；

1.ferritin基因PCR扩增结果；2.空白对照；B.重组转移载体pFast-ferritin的鉴定结果；M.Trans2K PlusⅡDNA Marker；1.重组转移载体pFast-ferritin的Xba I单酶切鉴定；2.重组转移载体pFast-ferritin的Xba I和HindⅢ双酶切鉴定；3.重组转移载体pFast-ferritin的PCR鉴定；

图8为重组克隆载体pEASY-HNex-ferritin的鉴定；

其中：A.HNex-ferritin基因的PCR结果；M.Trans 2K DNA Marker；1.ferritin基因；2.HNex基因；3.融合基因HNex-ferritin的PCR结果；B.重组克隆载体pEASY-HNex-ferritin的构建；M.Trans 2K PlusⅡDNA Marker；

1.PCR鉴定结果；2.重组克隆载体pEASY-HNex-ferritin的BamH I+Hind III双酶切鉴定结果；3.重组克隆载体pEASY-HNex-ferritin的BamH I单酶切鉴定结果；

图9为重组转移载体pFast-HNex和pFast-HNex-ferritin的鉴定；

其中：A.重组转移载体pFast-HNex的鉴定；B.重组转移载体pFast-HNex-ferritin的鉴定；M.Trans 2K PlusⅡDNA Marker；1.BamH I单酶切鉴定结果；2.BamH I+Hind III双酶切鉴定结果；3.PCR鉴定结果；

图10为重组杆状病毒rBV-HNex和rBV-HNex-ferritin的鉴定；

其中：A.重组杆粒rB-HNex和rB-HNex-ferritin的PCR鉴定M.Trans2K PlusⅡDNAMarker；1.利用引物pUC/M13Forward/Reverse鉴定重组杆粒rB-N；2.利用引物pUC/M13Forward/Reverse鉴定重组杆粒rB-HNex-ferritin；3.利用引物pUC/M13Forward/Reverse鉴定重组杆粒rB-HNex；B.重组杆状病毒rBV-HNex-ferritin和rBV-HNex感染Sf9细胞的细胞病理变化；C.重组杆状病毒rBV-HNex和rBV-HNex-ferritin的PCR鉴定；M.Trans2KPlusⅡDNA Marker；1.利用引物pUC/M13Forward/Reverse鉴定重组杆状病毒rBV-N；2.利用引物pUC/M13Forward/Reverse鉴定重组杆状病毒rBV-HNex；3.利用引物pUC/M13Forward/Reverse鉴定重组杆状病毒rBV-HNex-ferritin；

图11为重组HNex蛋白和HNex-ferritin表达的IFA鉴定结果；

图12为重组HNex和HNex-ferritin蛋白在Sf9细胞中表达western blotting鉴定；

其中：A.重组HNex蛋白表达的western blotting分析结果；M.Easysee proteinmarker；1.rBV-N感染的Sf9细胞；2.rBV-HNex感染的Sf9细胞；B.重组HNex-ferritin表达的western blotting鉴定结果；M.Easysee protein marker；1.rBV-N感染的Sf9细胞；2.rBV-HNex-ferritin感染的Sf9细胞；

图13为重组蛋白HNex和HNex-ferritin纯化与鉴定；

其中：A-B.纯化的重组蛋白HNex的SDS-PAGE和western blotting结果；M.Pre-stained molecular weight marker page-ruler；1.纯化的重组蛋白HNex；C-D.纯化的重组蛋白HNex-ferritin的SDS-PAGE和western blotting结果；M.Pre-stained molecularweight marker page-ruler；1.纯化的重组蛋白HNex-ferritin；

图14为纯化的重组蛋白HNex-ferritin的Native-PAGE和Dot-ELISA结果；

其中：A-B.纯化的重组蛋白HNex-ferritin的Native-PAGE和western blotting结果；M.Pre-stained molecular weight marker page-ruler；1.纯化的重组蛋白HNex-ferritin；C.纯化的重组HNex-ferritin的Dot-ELISA结果；

图15为纯化的重组蛋白HNex-ferritinTEM结果与粒径分析；

图16为BPIV3特异性抗体水平检测与比较分析；

图17为HNex蛋白特异性抗体水平检测与比较分析；

图18为免疫鼠血清中HI抗体水平检测与比较分析；

图19为免疫鼠血清中VN抗体水平检测与比较分析；

图20为免疫鼠脾淋巴细胞中mDCs的检测与分析；

图21为免疫鼠脾淋巴细胞的增殖与分析；

图22为免疫鼠脾淋巴细胞中CD4⁺和CD8⁺细胞的增殖与分析；

其中：A.CD4⁺和CD8⁺细胞百分比；B.CD4⁺/CD8⁺的比率；

图23为脾脏中T细胞的分化；

图24为血清中IFN-γ和IL-10含量的检测结果；

其中：A.免疫鼠血清中的IFN-γ含量检测；B.免疫鼠血清中的IL-10含量检测；

图25为感染小鼠4d的肺脏器官/组织病理变化；

图26为感染小鼠9d的肺脏器官/组织病理变化；

图27为不同组织中BPIV3 mRNA水平比较分析结果；

其中：A.肺脏中BPIV3 mRNA水平比较分析结果；B.气管中BPIV3 mRNA水平比较分析结果。

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，以下的实施例便于更好的理解本发明，本发明并不限于这些具体的实施例。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。

实施例1自组装BPIV3纳米颗粒样抗原的制备

方法：

1、牛BPIV3 HN膜外区(HNex)基因克隆

(1)BPIV3(5555-9258)基因片段克隆

①引物设计，根据Genbank中BPIV3基因组序列同源性比较，以BPIV3 NM09株基因序列为参考，在HN基因两端保守区域，利用生物软件Primer 5设计克隆引物，即BPIV3-5555(5’-TCTGTAGGTAATCTAATTGTTGC-3’)和BPIV3-9158(5’-GGTTATACCATTTGTCTGATTGA-3’)，由新海基因生物科技有限公司合成。

②BPIV3基因组RNA提取与反转录，按照

试剂说明书操作提取BPIV3基因组RNA，并进行反转录，BPIV3-9158为反转录引物，反转录产物cDNA命名“BPIV3-cDNA9158”。

③BPIV3(5555-9258)基因的PCR扩增，PCR反应体系(20μL)，具体如下：

PCR反应程序：94℃5min；94℃45s，52℃45s，72℃3min；72℃10min。经1％琼脂糖凝胶电泳后，观察结果。

④连接与转化，利用胶回收试剂盒回收约3600bp条带，然后与克隆载体pMD18-T连接。16℃连接过夜。连接产物转化至感受态细胞E.coli DH5α。

⑤重组质粒鉴定与测序，挑取单克隆菌落后大量培养，利用质粒提取试剂盒提取质粒，经Sma I、Sac I单酶切和PCR鉴定正确后(命名为“pMD-BPIV3-5555-9158”)，送北京华大六合生物科技有限公司测序。

(2)BPIV3 HNex基因片段克隆

利用软件DNA Star对HN蛋白氨基酸序列的抗原表位和结构域分析后，选择编码氨基酸序列氨基端128-572片段的基因，命名为“HNex”基因。

①引物设计，以BPIV3(5555-9158)基因序列为参考，利用生物软件Primer 5设计HNex基因克隆引物HNex-S(5’-CGCGGATCCGGCTGTCAAGATATAG-3’，BamH I)和HNex-A(5’-GGGAAGCTTTTATATGCATCCGTCTGGG-3’，Hind III)，由新海基因合成。

②HNex基因PCR扩增，以质粒pMD-BPIV3-5555-9158为模板，扩增HNex基因。

反应体系(20μL)如下

反应程序：98℃4min；98℃15s，50℃30s，72℃1min；72℃10min。经1％琼脂糖凝胶电泳后，观察结果。

④连接与转化，利用胶回收试剂盒回收约1200bp条带，然后与克隆载体pEASY-Blunt Simple连接。室温连接15min。连接产物转化至感受态细胞E.coli DH5α。

⑤重组质粒鉴定与测序，挑取单克隆菌落后大量培养，利用质粒提取试剂盒提取质粒，经BamH I单酶切、BamH I+Hind III双酶切和PCR鉴定，正确后(命名为“pEASY-HNex”)，送北京华大六合生物科技有限公司测序。

利用分子生物学软件DNA star的Meglign进行HNex的DNA序列和氨基酸序列与Genbank中16株参考序列进行进化树分析和同源性比较，以评价HNex DNA序列和氨基酸序列在不同基因型的毒株中保守性。具体参考序列见表1。

表1参考序列

2、ferritin基因合成

Helicobacter pylori的ferritin基因(GenBank accession no.NP_223316)由北京华大六合生物技术有限公司合成，其两端含有为限制内切酶Xba I和HindⅢ序列。其点突变(N19Q)以消除潜在的N-连接糖基化位点。

重组转移质粒pFast-ferritin的构建：

将ferritin基因和转移质粒pFast Bac^TMHT B分别用限制内切酶Xba I和Hind Ⅲ进行酶切。利用胶回收试剂盒纯化酶切后ferritin基因和载体pFast Bac^TMHT B片段，把两者进行连接，获得重组转移载体pFast-ferritin。通过Xba I单酶切，Xba I和HindⅢ双酶切和PCR方法进行重组质粒鉴定。

用于PCR鉴定引物为：Ferritin-S(5’-GCTCTAGAGACATCATCAAGCTGCTGA-3’，Xba I)和Ferritin-A(5’-GGGAAGCTTTCACGACTTGCGCGACTTC-3’，Hind III)。

酶切产物和PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行结果观察。鉴定阳性的重组转移质粒pFast-ferritin送往北京华大六合生物技术有限公司进行序列测定。

3、融合基因HNex-ferritin的克隆

通过融合PCR方法，将HNex基因与ferritin基因融合，中间由“SGG”Linker相连接。

(1)融合引物设计与合成，参考HNex和ferritin基因序列，设计融合PCR引物HNex-Fe-S(5’-CCCAGACGGATGCATATCCGGAGGCGACATCATCAAGCTGC-3’，Linker)和HNex-Fe-A(5’-AGCAGCTTGATGATGTCGCCTCCGGATATGCATCCGTCTGGG-3’，Linker)，由新海基因合成。

(2)PCR扩增

第一轮PCR分别扩增HNex基因。反应体系(50μL)如下：

第一轮PCR分别扩增ferritin基因。反应体系(50μL)如下：

反应程序：98℃4min；98℃15s，50℃30s，7 2℃1min；72℃10min。经1％琼脂糖凝胶电泳后，观察结果。

利用胶回收试剂盒回收HNex基因和ferritin基因。

第二轮PCR，融合HNex基因与ferritin基因，命名为“HNex-ferritin”。反应体系(50μL)如下：

反应程序：98℃4min；98℃15s，50℃30s，72℃1min；72℃10min。经1％琼脂糖凝胶电泳后，观察结果。利用胶回收试剂盒回收HNex-ferritin基因。

将HNex-ferritin基因连接隆载体pEASY-Blunt Simple连接，转化至感受态细胞E.coli DH5α。挑取单克隆菌落后大量培养，利用质粒提取试剂盒提取质粒，经BamH I单酶切、BamH I+Hind III双酶切和PCR鉴定。鉴定正确质粒(命名为“pEASY-HNex-ferritin”)送北京华大六合生物科技有限公司测序。

4、重组转移载体pFast-HNex-ferritin和pFast-HNex构建

将重组质粒pEASY-HNex-ferritin、pEASY-HNex和转移载体pFast Bac^TMHT B进行BamH I+Hind III双酶切。

酶切体系(100μL)如下：

37℃水浴3h。

利用胶回收试剂盒回收酶切后的HNex基因、ferritin基因和载体pFast Bac^TMHTB。在T4 DNA ligase的作用下，HNex基因和HNex-ferritin基因分别与载体pFast Bac^TMHT B连接。连接产物转化至感受态细胞E.coli DH5α。挑取单克隆菌落后大量培养，利用质粒提取试剂盒提取质粒，经BamH I单酶切、BamH I+Hind III双酶切和PCR鉴定，分别命名为“pFast-HNex”和“pFast-HNex-ferritin”。

5、重组杆粒rB-HNex-ferritin和rB-HNex的制备

将重组转移质粒pFast-HNex和pFast-HNex-ferritin分别转化至感受态E.coliDH10 Bac中，经过蓝白菌落筛选和PCR鉴定，获得重组杆粒rB-HNex和rB-HNex-ferritin，并进行大量制备与纯化，-20℃保存备用。

6、重组杆状病毒rBV-HNex-ferritin和rBV-HNex的制备

将重组杆粒rB-HNex和rB-HNex-ferritin分别转染Sf9昆虫细胞，收获P1代，并经过盲传至P3代，获得P3代重组杆状病毒，命名为“rBV-HNex”和“rBV-HNex-ferritin”。通过PCR方法对重组杆状病毒进行鉴定。利用病毒蚀斑试验测定P3代重组杆状病毒的病毒滴度(pfu/mL)。

7、重组融合蛋白HNex-RFNp和HNex的表达与鉴定

将P3代rBV-HNex”和“rBV-HNex-ferritin”分别按照MOI 5接种Sf9细胞，作用2h后，更换培养液继续培养72h。通过IFA和western blotting进行鉴定表达的HNex蛋白和HNex-ferritin蛋白。其中，一抗为鼠抗BPIV3多克隆抗体(IFA为1:200，Western blotting为1:500)，二抗分别为FITC-标记山羊抗鼠IgG(1:200)和HRP-标记山羊抗鼠IgG(1:5000)。

8、重组融合蛋白HNex-RFNp和HNex的纯化与鉴定

(1)重组融合蛋白HNex-RFNp和HNex的纯化：将P3代rBV-HNex-ferritin按照MOI 5接种Sf9细胞，72h后收集细胞，经昆虫细胞裂解液处理后，4℃5000r/m离心15min，取上清备用。利用Ni Sepharose TM 6Fast Flow进行纯化重组HNex-ferritin。具体步骤如下：将样品与镍柱等体积在4℃条件下结合2h，然后依次用20mM和40mM洗脱液按照4mL/次洗脱5次，然后用150mM和200mM咪唑洗脱液各洗脱20mL，PBS透析后，超滤浓缩。经超滤管超滤浓缩后，将多次浓缩的样品，重新利用Ni Sepharose ^TM 6Fast Flow进行纯化与超滤浓缩，SDS-PAGE电泳后，观察纯化的HNex-ferritin蛋白。BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)测定最终纯化HNex-ferritin浓度。

(2)SDS-PAGE与western blotting鉴定：通过western blotting方法鉴定纯化的重组蛋白HNex-ferritin和HNex。其中，一抗为鼠抗BPIV3多克隆抗体(1:1000)，酶标抗体为HRP-山羊抗兔IgG(1:5000)。

(3)Native-PAGE和western blotting：利用Native-PAGE鉴定重组HNex-ferritin的多聚体结构，配制6％分离胶和4％浓缩胶。纯化的重组HNex-ferritin与2×Loadingbuffer(0.1M Tris-HCL，20％甘油和0.2％溴酚蓝，pH 6.8)。电泳结束后，考马斯亮蓝染色液染色30min，脱色后观察结果。另外，相同样品经电泳结束后，半干转印NC膜，按照上述western blotting过程进行操作。其中一抗分别为鼠抗BPIV3多克隆抗体(1:1000)，酶标抗体为HRP-山羊抗鼠IgG(1:5000)。

(4)透射电镜(TEM)观察：将铜网覆盖至样品滴上，吸附5min；用滤纸吸干液体；将铜网覆盖至醋酸双氧铀染色液上，染色5min；用滤纸吸干液体，透射电镜观察重组ferritin形态。重组HNex-ferritin命名为“HNex-RFNp”。利用软件Image J和Origin 8.0分析颗粒直径与统计分析。

(5)Dot-ELISA：分别取0.5μg和0.2μg的纯化的HNex-ferritin蛋白滴加至NC膜上，自然晾干后，用5％脱脂乳封闭，室温2h，PBST洗涤5次；用兔抗ferritin多克隆抗体(1:5000)、His Mouse mAb(1:5000)或鼠抗BPIV3多克隆抗体(1:1000)，室温孵育1h，PBST洗涤5次；用HRP-山羊抗鼠IgG(1:5000)或HRP-山羊抗兔IgG(1:5000)，室温孵育1h，PBST洗涤5次。利用ECL-STAR发光液(A液和B液等体积混合)进行曝光显色。

结果：

1、HNex基因、ferritin基因与HNex-ferritin融合基因的克隆

提取BPIV3-Vaccine株的总RNA，经反转录后获得cDNA。以引物BPIV3-555/BPIV3-9158进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，在不同退火温度条件下，约3600bp位置均有预期相符条带出现，将其胶回收后连接克隆载体pMD18-T，重组质粒分别进行PCR鉴定和Sma I、Sca I单酶切鉴定，PCR结果显示，扩增出与预计相符的约3600bp条带；Sma I、ScaI单酶切后，均获得2条带，且每组2条带相加约6300bp，与预期相符。将重组质粒送往公司测序，结果证实BPIV3(5555-9158)基因克隆成功。

利用Primer star DNA聚合酶，以引物BPIV3-5555/BPIV3-9158的PCR产物为模板，利用引物HNex-S/HNex-A进行PCR扩增，凝胶电泳结果如图2所示，在约1300bp位置出现特异条带，将其胶回收后连接至克隆载体pEASY-Blunt Simple，构建重组质粒“pEASY-HNex”，经过酶切和PCR鉴定，结果如图2所示BamH I单酶切出现约5000bp条带；BamH I+Hind III双酶切后出现3800bp和1300bp条带；PCR反应扩增出约1300bp条带，上述结果与预期相符，证实克隆质粒pEASY-HNex构建成功，测序后证实BPIV3 HNex基因克隆成功。

经过序列测定，将BPIV3-vaccine株HNex基因序列与Genbank中16个参考序列进行同源性和进化树分析。进化树分析结果如图3所示，所有HNex基因DNA序列可以清楚地分成3个群，分别是基因型A型、B型和C型，其中BPIV3-vaccine株的HNex基因属于A型。同源性分析结果如图4所示，BPIV3-vaccine株的HNex基因与C基因型参考毒株同源性分别为82.1％、82.3％、82.1％和82.3％；与B基因型的同源性分别为83.2％、83.0％、83.3％、82.9％和83.6％；与A基因型同源性分别为92.1％、91.9％、98.4％、99.3％、92.1％、93.0％和92.2％。氨基酸序列进化树分析结果如图5所示，所有氨基酸序列同样可以清楚地划分成三个群，分别是基因型A型、B型和C型，其中BPIV3-vaccine株的HNex基因属于A型。氨基酸序列同源性分析如图6所示，PIV3-vaccine株的HNex的氨基酸序列与C基因型参考序列同源性分别为91.0％、91.0％、91.0％和90.8％；与B基因型参考序列同源性分别为92.1％、92.1％、92.3％、91.9％和92.1％；与A基因型参考序列同源性分别为96.4％、98.9％、98.6％、96.6％、96.2％和96.8％。由此可见，BPIV3-vaccine株的HNex基因虽然属于A基因型，但与B基因型和C基因型序列的氨基酸序列同源性还是比较高，在理论上，可推测HNex蛋白免疫动物不仅可以预防A基因型BPIV3感染，也可以预防B基因型和C基因型BPIV3病毒感染。

将ferritin基因连接至重组转移载体pFast Bac^TMHT B，经限制性内切酶消化和PCR方法进行重组质粒鉴定。经0.8％琼脂糖凝胶电泳结果如图7所示，经Xba I单酶切后出现特异的约5300bp条带；Xba I和HindⅢ双酶切后，出现4800bp和500bp条带；PCR扩增出现特异的500bp条带。上述结果均与预期一致，初步认为重组转移载体pFast-ferritin构建成功。将重组质粒送往公司测序后，经序列分析证实ferritin基因连接至转移载体pFastBac^TMHT B上。

利用融合PCR方法将HNex基因与ferritin基因进行融合，结果如图8所示，获得与预期相符的约1800bp条带，获得融合基因“HNex-ferritin”。将HNex-ferritin基因连接至克隆载体pEASY-Blunt Simple，构建重组质粒“pEASY-HNex-ferritin”，经过酶切和PCR鉴定，结果所示BamH I单酶切出现约5500bp条带；BamH I+Hind III双酶切后出现3800bp和1800bp条带；PCR反应扩增出约1800bp条带，上述结果与预期相符，证实克隆质粒pEASY-HNex-ferritin构建成功，测序后证实融合基因HNex-ferritin克隆成功。

2、重组转移载体pFast-HNex和pFast-HNex-ferritin构建

利用限制性内切酶BamH I和Hind III对重组质粒pEASY-HNex-ferritin、pEASY-HNex和重组转移载体pFast Bac^TMHT B进行酶切，然后在T4 DNA ligease作用下，酶切回收的HNex-ferritin和HNex基因分别与酶切回收的重组转移载体pFast Bac^TMHT B进行连接，构建重组质粒pFast-HNex和pFast-HNex-ferritin，经BamH I单酶切、BamH I+Hind III双酶切和PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果如图9所示，重组质粒pFast-HNex被BamH I单酶切后，出现约6000bp条带，BamH I+Hind III双酶切后出现约4800bp和1300bp条带，PCR扩增出现约1300bp条带，上述结果与预期相符，表明重组转移质粒pFast-HNex构建成功；重组质粒pFast-HNex-ferritin经BamH I单酶切后出现约6500bp条带，BamH I+Hind III双酶切后出现约4800bp和1800bp，PCR扩增出现约1800bp条带，上述结果与预期相符，表明重组转移质粒pFast-HNex-ferritin构建成功。

3、重组杆状病毒rBV-HNex和rBV-HNex-ferritin的制备

重组转移质粒pFast-HNex和pFast-HNex-ferritin转化感受态细胞E.coliDH10Bac后，经过蓝白菌落筛选和PCR鉴定，结果如图10A所示，蓝色菌落经PCR扩增出约300bp条带，作为阴性对照，命名为“rB-N”；重组质粒rBV-HNex-ferritin转化后白色菌落质粒经PCR扩增出约4200bp条带；重组转移质粒pFast-HNex转化后白色菌落质粒经PCR扩增出约3700bp条带。上述PCR鉴定结果均与预期相符，获得重组杆粒rB-HNex和rB-HNex-ferritin。

重组杆粒rB-HNex、rB-HNex-ferritin和rB-N分别大量提取与纯化后，转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒rBV-HNex和rBV-HNex-ferritin，并传代至P3代，感染Sf9细胞出现以细胞体积膨大、变形、折光性差、胞内出现颗粒、脱离瓶壁和裂解等CPE现象。以细胞上清提取的DNA为模板，利用PCR方法进行鉴定，结果如图10B和C所示，重组杆状病毒rBV-HNex扩增出约3700bp条带，重组杆状病毒rBV-HNex-ferritin扩增出约4200bp条带，作为阴性对照，rBV-N扩增出约300bp条带。上述结果均与预期相符，证实已成功获得重组杆状病毒rBV-HNex和rBV-HNex-ferritin。经病毒蚀斑试验测定P3代rBV-HNex和rBV-HNex-ferritin的病毒滴度(pfu/mL)分别为1.67×10⁸和2.86×10⁸。

4、HNex与HNex-ferritin在Sf9细胞中表达与鉴定

P3代rBV-HNex和rBV-HNex-ferritin分别按照MOI 5感染Sf9细胞，72h后进行IFA检测，结果如图11所示，以鼠抗BPIV3多克隆抗体作为一抗，rBV-HNex和rBV-HNex-ferritin感染的Sf9细胞均可以观察到荧光信号，而rBV-N感染Sf9细胞未见荧光信号。

同时，收集细胞进行western blotting分析，结果如图12所示，rBV-HNex和rBV-HNex-ferritin感染Sf9细胞，分别在约58kDa和75kDa位置出现可以与鼠抗BPIV3多克隆抗体发生免疫反应的特异性蛋白带，两者均比预期分子量要大。由于BPIV3 HN蛋白为糖基化蛋白，推测由于糖基化作用，导致两者分子量偏大。综合上述结果表明，HNex蛋白和HNex-ferritin蛋白均在Sf9细胞中获得表达。

5、重组HNex和HNex-ferritin蛋白纯化与鉴定

HNex和HNex-ferritin蛋白分别经亲和层析技术纯化，获得产物经超滤浓缩后，结果如图13所示：SDS-PAGE结果显示，HNex和HNex-ferritin的纯化产物分别在约58kDa和75kDa位置出现与预期分子量一致的特异条带，并且均可以与鼠抗BPIV3多克隆抗体发生免疫反应，表明获得纯化的HNex蛋白和HNex-ferritin蛋白，其中HNex-ferritin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

利用Native-PAGE研究HNex-ferritin的多聚体结构，结果如图14A和B所示，在非变性非还原的条件下，HNex-ferritin样品在大于180kDa位置出现特异蛋白带，明显大于变性条件下75kDa，并且该蛋白可以与BPIV3多克隆抗体发生免疫反应。Dot-ELISA结果如图14C所示，在天然状态下，该蛋白可以分别可以与ferritin多克隆抗体、His单克隆抗体和BPIV3多克隆抗体发生免疫反应。纯化的重组HNex-ferritin蛋白在TEM下观察结果如图15所示，HNex-ferritin呈近似球形颗粒样形态，平均直径为19.5nm。综合上述结果，融合蛋白HNex-ferritin可以自组装呈近似球形的纳米颗粒，命名为“HNex-RFNp”。

实施例2 BPIV3 HNex-RFNp的免疫效果实验

方法：

1、动物分组与免疫

C57 BL/6小鼠，6-8周龄，随机分成5组。分别为HNex-RFNp(100μg/只)、HNex-RFNp(50μg/只)、HNex(50μg/只)、灭活BPIV3(50μg/只)和PBS(200μL)组。在第0w和1w，每只鼠接种200μL相对应抗原。免疫前和免疫后(6w)每周断尾采血，分离血清，-70℃保存。

2、体液免疫检测

(1)BPIV3与HNex的ELISA抗体

分别用BPIV3和HNex作为抗原，按照50ng/well包被ELISA板，利用I-ELISA方法检测收集血清中BPIV3 ELISA抗体和HNex ELISA抗体含量，明确抗体消长规律，并各组间抗体水平进行比较分析。

(2)HI抗体检测

利用血凝(HA)试验测定BPIV3细胞毒的凝集效价。具体步骤为，在微量血凝板中，1-12孔中每孔中加入25μL生理盐水，取25μL BPIV3细胞毒加入第1孔，反复混匀后取25μL加入第2孔，依次做连续2倍倍比稀释至第11孔，最后孔中弃掉30μL。12孔为阴性对照。每孔加入1％豚鼠红细胞悬液25μL。振荡混匀后，室温静置30min，观察结果，测出凝集效价。

利用血凝抑制(HI)试验测定检测收集血清的HI抗体效价，明确HI抗体消长规律，并在各组间进行比较分析。具体操作过程如下，每孔加入25μL生理盐水，取个组中血清25μL，从第1孔开始，作连续2倍倍比稀释至第10孔。每孔加入4个凝集单位的BPIV3细胞毒25μL，为1-11孔。室温静置30min。每孔加入1％豚鼠红细胞悬液25μL。振荡混匀后，室温静置30min，观察结果，测出血清HI抗体效价。其中11孔为BPIV3凝集红细胞对照，12孔为空白对照。部分血清HI抗体效价大于1:2¹⁰，则重新测定，将第1孔血清稀释倍数更改为1:2⁶开始,稀释至1:2¹⁵。

(3)病毒中和抗体滴度测定

取各组不同时间点血清，于56℃水浴，灭活30min，用于检测病毒中和(Virus-neutralizing，VN)抗体水平。具体过程如下：将MDBK细胞按照2×10⁴个/孔接种于96孔板；将每份血清做2倍倍比稀释(2^-1～2^-20)，然后分别与100TCID₅₀的BPIV3-Z株等体积混合，37℃作用1h；待细胞完全贴壁后，弃去培养液，PBS洗涤1次；将血清与BPIV3混合物加入至MDBK细胞上，37℃作用2h；弃去上清，按照100μL/孔加入维持液(2％FBS的DMEM培养液)，37℃、5％CO₂条件下继续培养。同时设定BPIV3阳性血清对照、100TCID₅₀ BPIV3感染细胞对照和空细胞对照。判断标准：以少于50％细胞不发生CPE孔血清稀释度为该血清的VN抗体滴度。

3、细胞免疫相关指标检测

(1)脾淋巴细胞中mDCs检测

每组取4只3w小鼠，利用脾淋巴细胞分离试剂盒制备脾淋巴细胞。脾淋巴细胞1×10⁶个，用100μL PBS重悬，同时加入anti-CD11c-FITC(0.5μL/test)和anti-MHCⅡ-PE(2μL/test)、anti-CD11c-FITC(0.5μL/test)和anti-CD40-PE(2μL/test)、anti-CD11c-FITC(0.5μL/test)和anti-CD80-PE(0.3μL/test)、anti-CD11c-FITC(0.5μL/test)和anti-CD86-PE(0.625μL/test)，4℃避光染色45min，PBS洗涤2次后，上机检测CD11c⁺MHCⅡ⁺、CD11c⁺CD40⁺、CD11c⁺CD80⁺、CD11c⁺CD86⁺细胞百分比。

(2)T细胞增殖与分化分析

将上述制备的脾淋巴细胞按照1×10⁴个/孔接种96孔板中，分别用非特异性的PMA(500ng/mL)+Ionomycine(50ng/mL)和特异性BPIV3(1μg/mL)刺激脾淋巴细胞24h，然后每孔加入10μL CCK8溶液，分别在0、0.5、1、2、3、4和12h测定OD₄₅₀值。

按照1×10⁶个/孔在6孔板中培养，分别用PMA+Ionomycine和BPIV3刺激脾淋巴细胞24h。利用flow cytometry检测脾淋巴细胞中表面分子CD4⁺、CD8⁺和胞内的IL-4⁺、IFN-γ⁺阳性细胞百分比，分析T细胞分化方向。

利用ELISA试剂盒检测4w和6w各组血清中IL-10和IFN-γ的含量，分析CD4⁺T细胞分化方向。具体操作参照试剂盒说明书进行。

4、攻毒保护性试验

(1)动物分组、免疫与攻毒

6-8周雌性C57 BL/6小鼠，分5组，分别为HNex-RFNp、HNex、灭活BPIV3、PBS和未攻毒组。每只鼠皮下免疫50μg/200μL，PBS组注射200μL，间隔1周后加强免疫1次。二免3w后，HNex-RFNp、HNex、BPIV3和PBS组小鼠分别气管注射TCID₅₀为10^6.8/0.1mL的BPIV3分离毒(BPIV3-Z株)50μL。

(2)病料的采集

观察攻毒鼠在感染后临床表现，并在感染后4d和9d，解剖小鼠，采集气管和肺脏。取少量肺组织，4％多聚甲醛浸泡后室温保存，用于制作病理切片；取部分肺脏和气管，加入少许液氮后研磨粉碎，用1mL Trizol重悬裂解组织，-70℃保存，用于提取基因组RNA，检测组织BPIV3的RNA水平；取部分肺脏经组织研磨器研磨后，1200r/m离心5min，取上清，经0.22μm滤器过滤除菌后，-70℃保存，用于测定组织BPIV3病毒的TCID₅₀。

(3)病理变化观察

观察肺脏病理变化。10％甲醛固定液浸泡保存的肺组织，制作病理切片和苏木精-伊红(H.E.)染色，观察眼观和镜检下的组织病理变化。

(4)Quantitative RT-PCR检测组织中BPIV3基因水平

为了比较分析组中小鼠肺脏和器官组织中BPIV3的RNA差异，按照

试剂说明书提取组织总RNA，其中氯仿抽提蛋白2次。以RT Primer Mix作为反转录引物，通过M-MLV作用将RNA反转录为cDNA，具体过程同2.2.2.6。之后，利用Quantitative RT-PCR方法相对定量检测组织中BPIV3的RNA，其中提取的cDNA为模板，BPIV3-S/BPIV3-A作为检测引物，以GAPDH作为内参基因。反应体系与程序参照Takara公司

Premix Ex TaqⅡ试剂盒说明书。检测引物序列如下：BPIV3-S(5’-AGGTGGAAACGGTGATGATGG-3’)和BPIV3-A(5’-GGTGTTGATTGGTGTCTTCTTGG-3’),BoGAPDH-S(5’-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3’)和BoGAPDH-A(5’-ACATACTCAGCACCAGCATCAC-3’)。比较各组小鼠肺和气管组织中BPIV3的RNA相对含量。

(5)肺组织BPIV3 TCID₅₀测定

将MDBK细胞按照2×10⁴/孔接种于96孔板；待细胞完全贴壁后，弃去培养液，PBS洗涤1次，依次加入用无血清DMEM做10倍倍比稀释(10^-1～10^-10)的各组的组织液，每个稀释度设8个重复，37℃继续培养2h；弃去上清，按照100μL/well加入维持液(2％FBS的DMEM培养液)，37℃、5％CO₂条件下继续培养；同时设定BPIV3对照组和细胞对照组。待病毒对照组有50％出现CPE时，按照Reed-Muench法统计数据。TCID₅₀按照如下公式计算。

距离比＝(大于50％的百分比-50％)/(50％-小于50％的百分比)

TCID₅₀＝高于50％的病毒稀释度的对数-距离比×稀释的对数

5、统计学分析

采用软件GraphPad Prism software version 7.0对各组数据进行统计学比较分析与统计图绘制，数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示，P>0.05表示差异不显著(nosignificant difference,ns)，*P<0.05,**p<0.01,***p<0.001.

结果：

1、体液免疫分析

1)ELISA抗体变化规律分析

分别以BPIV3和HNex蛋白按照50ng孔包被ELISA板，根据I-ELISA过程检测各组鼠血清中抗体量，观察其变化规律。

(1)以灭活BPIV3蛋白作为抗原，结果如图16所示，在抗体变化趋势方面，HNex-RFNp(50μg)组抗体水平在二免后呈逐渐上升趋势；HNex组和BPIV3抗体在二免后到4w呈逐渐上升，之后开始下降；灭活BPIV3蛋白组抗体水平在1w就迅速上升，二免后迅速到达最高水平并维持至4w，之后呈下降趋势，在各个时间点各组抗体水平比较发现，HNex组在各个时间点的抗体水平均显著地低于HNex-RFNp(50ng)；在2w、3w和4w时，灭活BPIV3蛋白组显著高于HNex-RFNp(50μg)组，在5w时，两者差异不显著；在6w时，显著地低于HNex-RFNp(50μg)组。

(2)以HNex蛋白作为抗原，结果如图17所示，抗体变化趋势方面，HNex-RFNp(50μg)组抗体在2w时到达最高水平，并持续维持到6w；HNex组抗体在2w时也达到最高水平，之后到5w呈现缓慢下降趋势，6w抗体水平表现缓慢升高；灭活BPIV3蛋白组在2w到达最高水平，之后开始缓慢下降趋势。各时间点抗体水平比较发现，灭活BPIV3蛋白组和HNex组在2w至6w的抗体水平均显著地低于HNex-RFNp(50μg)组。

此外，HNex-RFNp(100μg)组和HNex-RFNp(50μg)抗体变化趋势相似，并且HNex-RFNp(100μg)组的抗体水平在各个时间点都显著高于HNex-RFNp(50μg)，表明HNex-RFNp免疫小鼠产生抗体水平呈抗原剂量依赖性。

2)HI抗体变化规律分析

HI抗体变化规律如图18所示，HNex-RFNp(50μg)组HI抗体呈逐渐上升至4w，之后开始缓慢下降趋势；HNex组HI抗体在2w后稳定维持抗体效价在3左右；BPIV3抗体在首免后就迅速升高，在3w使达到最高水平，在4w出现小幅度下降后表现出缓慢上升趋势。在抗体水平比较方面，HNex组都显著低于HNex-RFNp(50μg)组，BPIV3组在2w时显著高于HNex-RFNp(50μg)组，随着灭活BPIV3蛋白组抗体水平小幅下降，HNex-RFNp(50μg)组的缓慢上升，在4w时灭活BPIV3蛋白组抗体水与HNex-RFNp(50μg)组差异不显著，而在6w时又显著地高于HNex-RFNp(50μg)组。此外，HNex-RFNp(100μg)组HI抗体水平与HNex-RFNp(50μg)组的趋势与效价水平都非常接近，差异不显著。

3)病毒中和抗体变化规律分析

如图19所示，HNex-RFNp(100μg)、HNex-RFNp(50μg)、HNex组和灭活BPIV3蛋白组的VN抗体变化趋势比较一致，均呈逐渐增加趋势。通过抗体水平比较发现，灭活BPIV3蛋白组与HNex-RFNp(50μg)组的抗体水平接近，差异不显著；HNex组的抗体水平显著低于HNex-RFNp(50μg)组；HNex-RFNp(100μg)的抗体水平与HNex-RFNp(50μg)组相接近，差异不显著。上述结果表明：在细胞保护水平上，HNex-RFNp刺激动物产生中和抗体水平与灭活的BPIV3相近，而显著地高于HNex蛋白。

2、细胞免疫相关指标分析结果

1)脾淋巴细胞中mDCs分析

为了比较HNex-RFNp(100μg)、H Nex-RFNp(50μg)、HNex、灭活BPIV3蛋白和PBS诱导小鼠体内mDCs数量，本研究利用flow cytometry检测各组脾淋巴细胞中CD11c⁺MHC⁺、CD11c⁺CD40⁺、CD11c⁺CD80⁺、CD11c⁺CD86⁺细胞百分比。结果如图20所示，HNex-RFNp(50μg)组的CD11c⁺CD80⁺、CD11c⁺CD86⁺和CD11c⁺MHCⅡ⁺细胞数都显著地高于HNex组、BPIV3组和PBS组。而HNex-RFNp(50μg)组的CD11c⁺CD40⁺细胞数与HNex组、BPIV3组和PBS组相接近，差异不显著。BPIV3组只有CD11c⁺CD86⁺细胞高于PBS组，其余细胞均与PBS组差异不显著。HNex组的CD11c⁺CD40⁺、CD11c⁺CD80⁺、CD11c⁺CD86⁺和CD11c⁺MHCⅡ⁺均与PBS组差异不显著。此外，HNex-RFNp(100μg)组的CD11c⁺CD40⁺数量显著地高于HNex-RFNp(50μg)组，而CD11c⁺CD80⁺、CD11c⁺CD86⁺和CD11c⁺MHCⅡ⁺的细胞数均与HNex-RFNp(50μg)组差异不显著。上述结果表明：HNex-RFNp可以诱导小鼠机体产生的mDCs显著地增加，而且显著地高于HNex和灭活BPIV3蛋白。

2)T淋巴细胞增殖

为了比较HNex-RFNp(100μg)、HNex-RFNp(50μg)、HNex和BPIV3激活小鼠体内T细胞能力，本研究分别利用PMA(500ng/mL)+Ionomycine(50ng/mL)和特异性灭活BPIV3蛋白(1μg/mL)刺激各组小鼠的脾淋巴细胞。结果如图21所示，在PMA(500ng/mL)+Ionomycine(50ng/mL)刺激条件下，HNex-RFNp(100μg)和HNex-RFNp(50μg)组T细胞数呈逐渐增加趋势，灭活BPIV3蛋白组T细胞数3h后表现出缓慢增加趋势，HNex组和PBST组T细胞增殖趋势不明显；在3h时，HNex-RFNp(50μg)SI值均显著高于HNex组；在4h和12h时，HNex-RFNp(50μg)SI值分别显著地高于HNex组和灭活BPIV3蛋白组；在灭活BPIV3蛋白(1μg/mL)刺激条件下，HNex-RFNp(100μg)组和HNex-RFNp(50μg)组T细胞数呈逐渐增加趋势，而HNex组和灭活BPIV3蛋白组的增加趋势不明显；在4h和12h时，HNex-RFNp(50μg)组的SI值都显著地高于HNex组和灭活BPIV3蛋白组。无论PMA(500ng/mL)+Ionomycine(50ng/mL)还是灭活BPIV3蛋白(1μg/mL)刺激，HNex-RFNp(100μg)组T细胞增值趋势与HNex-RFNp(50μg)，各个时间点SI值都差异不显著。上述结果表明HNex-RFNp可以激活小鼠T细胞的能力强于灭活BPIV3蛋白和HNex蛋白。

利用flow cytometry检测脾淋巴细胞中CD4⁺和CD8⁺T细胞百分比。结果如图22所示，HNex-RFNp(50μg)组CD4+T细胞数量显著高于HNex组、灭活BPIV3蛋白组和PBS组，HNex组和灭活BPIV3蛋白组的CD4⁺T细胞数量与PBS组差异不显著；HNex-RFNp(50μg)组CD8⁺T细胞数量与HNex组、灭活BPIV3蛋白组和PBS组差异不显著，HNex组和灭活BPIV3蛋白组的CD8⁺T细胞数量也与PBS组差异不显著；HNex-RFNp(50μg)组CD4⁺/CD8⁺显著地高于HNex组和PBS组，高于灭活BPIV3蛋白组，但差异不显著，HNex组和灭活BPIV3蛋白组的CD4⁺/CD8⁺与PBS组差异不显著。HNex-RFNp(100μg)组的CD4⁺和CD8⁺T细胞百分比，以及CD4⁺/CD8⁺都与HNex-RFNp(50μg)相接近，差异不显著。上述结果表明：HNex-RFNp可促进小鼠体内CD4⁺T细胞增殖。

综合上述结果表明，与HNex和BPIV3免疫小鼠相比，HNex-RFNp可以免疫刺激小鼠产生更为显著地T细胞增殖反应，并且以CD4⁺T细胞增殖为主。

3、T细胞分化方向

为了进一步研究T细胞分化方向，利用flow cytometry检测各组脾淋巴细胞中CD4⁺IL-4⁺、CD4⁺IFN-γ⁺、CD8⁺IL-4⁺和CD8⁺IFN-γ⁺阳性细胞百分比，结果如图23所示，HNex-RFNp组CD4⁺IL-4⁺、CD4⁺IFN-γ⁺和CD8⁺IFN-γ⁺细胞数显著地高于PBS组，CD8⁺IL-4⁺细胞数与PBS差异不显著；HNex组和灭活BPIV3蛋白组都只有CD8⁺IFN-γ⁺细胞数高于PBS组，CD4⁺IL-4⁺、CD4⁺IFN-γ⁺和CD8⁺IL-4⁺细胞数其余均与PBS组差异不显著。上述结果表明，HNex-RFNp可以刺激小鼠体内T细胞向Th1和Th2细胞分化。

同时，利用ELISA方法对免疫鼠3w和5w的血清中IFN-γ(Th1)和IL-10(Th2)含量进行检测，结果如图24所示：HNex-RFNp组3w和5w的小鼠血清中IFN-γ的含量均显著地高于HNex组、灭活BPIV3蛋白组和PBS组，而HNex组的小鼠血清中IFN-γ的含量在3w略高于PBS组，5w与PBS组差异不显著，灭活BPIV3蛋白组的小鼠血清中IFN-γ的含量3w和5w都与PBS组差异不显著；HNex-RFNp组、HNex组和灭活BPIV3蛋白的3w和5w的小鼠血清中IL-10的含量均显著地高于PBS组，而且HNex-RFNp组的3w和5w的小鼠血清中IL-10的含量均显著地高于HNex组和灭活BPIV3蛋白组。上述结果表明：HNex-RFNp可刺激小鼠机体T细胞分化为Th1和Th2细胞，而HNex和灭活BPIV3蛋白只能刺激机体T细胞分化为Th2细胞。

综合上述结果，HNex-RFNp可以刺激机体CD4⁺T细胞分化为Th1和Th2亚型细胞，同时还可以激活可分泌IFN-γ的CD8⁺T细胞分化。

4、动物保护性试验结果

1)组织病理学观察

为评价HNex-RFNp作为抗原对免疫鼠的保护水平，对分别被HNex-RFNp、HNex、灭活BPIV3蛋白和PBS二免3w鼠进行肺内攻毒BPIV3-Z株，在4d和9d解剖小鼠，观察肺脏病理变化，同时制作组织切片，经HE染色后镜检。具体每组鼠肺脏眼观及镜检观察的统计结果见表2。

表2 BPIV3-Z株感染小鼠肺脏器官/组织病理变化统计结果

当感染BPIV3-Z株4d时，如图25所示，HNex-RFNp组和Uninfected组小鼠的肺脏均无肉眼可见病理变化，镜下可见肺泡间隔毛细血管轻度充血。HNex组有1只鼠肺脏轻度充血，有向外隆凸的肺小叶；3只小鼠的肺脏组织镜下可观察到不同程度的肺泡上皮增生，肺泡间隔增厚、毛细血管充血，肺泡及其间隔内有巨噬细胞和淋巴细胞浸润(间质性肺炎)。灭活BPIV3蛋白组1只鼠肺脏肿大充血，表面可见出血点；2只鼠肺脏组织在镜下可观察到不同程度的肺泡上皮增生，肺泡间隔毛细血管充血，肺泡及其间隔内有巨噬细胞和淋巴细胞浸润，细支气管(右下)周围有大量淋巴细胞浸润(间质性肺炎)。PBS组2只小鼠肺脏不同程度肿大与表面出血斑，1只鼠肺脏有充血；4只鼠的肺组织在镜下可观察到不同程度局部肺泡上皮增生，细支气管扩张，上皮变性、坏死，有少量脱落，其中2只鼠出现肺泡和细支气管官腔内可见大量红细胞。

如图26所示，当感染BPIV3-Z株9d时，HNex-RFNp组和Uninfected组小鼠的肺脏均无无肉眼可见病理变化，镜下可观察到肺泡间隔毛细血管轻度充血。HNex组3只鼠的肺脏表面有不同程度的肿大与出血斑；5只鼠的肺脏组织在镜下可观察到不同程度的肺泡间隔毛细血管破裂，细支气管内有红细胞及炎性细胞，其中3只严重鼠的肺泡间隔及肺泡内有大量红细胞浸润。灭活BPIV3蛋白组2只小鼠的肺脏不同程度的肿大充血及出血点。3只鼠肺脏组织在镜下可观察到不同程度肺泡上皮增生，肺泡及其间隔内有巨噬细胞和淋巴细胞浸润，其中2只严重鼠的肺泡间隔毛细血管充血。PBS组4只小鼠的肺脏表现出不同程度的肿大与出血斑；5只鼠的肺组织在镜下可观察到不同程度的肺泡上皮增生，肺泡间隔毛细血管充血，肺泡及其间隔内有巨噬细胞和淋巴细胞浸润，细支气管扩张，上皮变性、坏死，有少量脱落，管腔内有红细胞及炎性细胞。

上述结果表明，与PBS组相比较，HNex-RFNp、HNex和灭活BPIV3蛋白免疫小鼠均获得不同程度的保护力；其中HNex-RFNp的保护水平显著地好于灭活BPIV3蛋白和HNex蛋白。

5、组织中BPIV3 mRNA水平比较分析

为评价HNex-RFNp免疫对小鼠机体保护水平，利用Quantitative RT-PCR方法检测了各组采集肺脏和气管组织中灭活BPIV3蛋白的RNA水平。结果如图27所示，无论是肺脏还是气管组织，在感染4d和9d组织中，HNex-RFNp组、HNex组和灭活BPIV3蛋白组的BPIV3 RNA水平均显著地低于PBS组，同时HNex-RFNp组分别显著地低于HNex组和灭活BPIV3蛋白组，并且HNex-RFNp组感染4d和9d肺脏组织BPIV3 RNA水平无显著差异。上述结果表明，当攻毒BPIV3感染小鼠，HNex-RFNp、HNex和灭活BPIV3蛋白免疫小鼠可以在一定程度上抑制体内BPIV3的增殖，HNex-RFNp的效果显著地优于HNex和BPIV3。

6、肺组织BPIV3病毒滴度比较分析

为进一步评价HNex-RFNp免疫对小鼠的保护水平，本研究测定采集感染鼠4d和9d肺脏中病毒的滴度(TCID₅₀)，结果如表3所示，HNex-RFNp组和Uninfected组所有小鼠肺脏组织在MDBK细胞上均未观察到CPE；HNex组中感染小鼠4d和9d的肺脏组织中分别有4份和5份样品在MDBK细胞上观察到CPE，平均病毒滴度分别为10^1.95TCID₅₀/0.1mL和10^3.36TCID₅₀/0.1mL；灭活BPIV3蛋白组感染小鼠4d和9d的肺脏组织中都有3份样品在MDBK细胞上观察到CPE，平均病毒滴度分别为10^1.7TCID₅₀/0.1mL和10^2.83TCID₅₀/0.1mL；PBS组中感染小鼠4d和9d的肺组织都有5份样品在MDBK细胞上观察到CPE，平均病毒滴度分别为10^3.34TCID₅₀/0.1mL和10^4.76TCID₅₀/0.1mL。HNex-RFNp组、HNex组和BPIV3组中免疫鼠肺脏中病毒滴度低于PBS组，表明免疫小鼠获得了一定程度上保护力，其中HNex-RFNp免疫小鼠获得保护力要高于HNex和灭活BPIV3蛋白免疫的小鼠。

表3感染鼠的肺组织BPIV3病毒滴度的统计结果(TCID₅₀/0.1mL)

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种自组装牛副流感病毒3型纳米颗粒样抗原及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 610

<212> PRT

<213> Salmonella abortus equi

<400> 1

Thr Asn Lys Arg Glu His Gln Glu Val Pro Ile Gln Arg Met Thr His

1 5 10 15

Asp Arg Gly Ile Glu Pro Leu Asn Pro Asp Asn Phe Trp Arg Cys Thr

20 25 30

Ser Gly Asn Pro Ser Leu Thr Ser Ser Pro Lys Ile Arg Leu Ile Pro

35 40 45

Gly Pro Gly Leu Leu Ala Thr Ser Thr Thr Val Ala Gly Cys Ile Arg

50 55 60

Ile Pro Ser Phe Val Ile Asn Asn Leu Ile Tyr Ala Tyr Thr Ser Asn

65 70 75 80

Leu Ile Thr Gln Gly Cys Gln Asp Ile Gly Lys Ser Tyr Gln Val Leu

85 90 95

Gln Ile Gly Ile Ile Thr Ile Asn Ser Asp Leu Val Pro Asp Leu Asn

100 105 110

Pro Arg Val Thr His Thr Phe Asn Ile Asp Asp Asn Arg Lys Ser Cys

115 120 125

Ser Leu Ala Leu Leu Asn Thr Asp Val Tyr Gln Leu Cys Ser Thr Pro

130 135 140

Lys Val Asp Glu Arg Ser Asp Tyr Ala Ser Thr Gly Ile Glu Asp Ile

145 150 155 160

Val Leu Asp Val Val Thr Asn Asn Gly Leu Ile Ile Thr Thr Arg Phe

165 170 175

Thr Asn Asn Asn Ile Thr Phe Asp Lys Pro Tyr Ala Ala Leu Tyr Pro

180 185 190

Ser Val Gly Pro Gly Ile Tyr Tyr Lys Gly Lys Val Ile Phe Leu Gly

195 200 205

Cys Gly Gly Leu Glu His Glu Glu Asn Gly Asp Val Ile Cys Asn Thr

210 215 220

Thr Gly Cys Pro Gly Lys Thr Gln Arg Asp Cys Asn Gln Ala Ser Tyr

225 230 235 240

Ser Pro Trp Phe Ser Asn Arg Arg Met Val Asn Ser Ile Ile Val Val

245 250 255

Asp Lys Gly Ile Asp Thr Thr Phe Ser Leu Arg Val Trp Thr Ile Pro

260 265 270

Arg Arg Gln Asn Tyr Trp Gly Ser Glu Gly Arg Leu Leu Leu Leu Gly

275 280 285

Asp Arg Ile Tyr Ile Tyr Thr Arg Ser Thr Ser Trp His Ser Lys Leu

290 295 300

Gln Leu Gly Val Ile Asp Ile Ser Asp Tyr Asn Asn Ile Arg Ile Asn

305 310 315 320

Trp Thr Trp His Asn Val Leu Ser Arg Pro Gly Asn Asp Glu Cys Pro

325 330 335

Trp Gly His Ser Cys Pro Asp Gly Cys Ile Thr Gly Val Tyr Thr Asp

340 345 350

Ala Tyr Pro Leu Asn Pro Ser Gly Ser Ile Val Ser Ser Val Thr Leu

355 360 365

Asp Ser Gln Lys Ser Arg Glu Asn Pro Ile Ile Thr Tyr Ser Thr Ala

370 375 380

Thr Asn Arg Val Asn Glu Leu Ala Ile Tyr Asn Arg Thr Leu Pro Ala

385 390 395 400

Ala Tyr Thr Thr Thr Asn Cys Ile Thr His Tyr Asp Lys Gly Tyr Cys

405 410 415

Phe His Ile Val Glu Ile Asn His Arg Ser Leu Asn Thr Phe Gln Pro

420 425 430

Met Leu Phe Lys Thr Gly Val Pro Lys Asn Cys Ser Ser Gly Gly Asp

435 440 445

Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser

450 455 460

Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu Asp

465 470 475 480

Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His

485 490 495

Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln

500 505 510

Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln

515 520 525

Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile

530 535 540

Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe

545 550 555 560

Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu

565 570 575

Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His

580 585 590

Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg

595 600 605

Lys Ser

610

Claims

1.一种自组装牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)纳米颗粒样抗原，其特征在于，所述的自组装BPIV3纳米颗粒样抗原是通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达获得的以Helicobacter pylori的ferritin蛋白作为载体携带BPIV3 HN蛋白的自组装BPIV3纳米颗粒样抗原，其中，HN蛋白融合在ferritin的N-端，所述的HN蛋白为位于BPIV3-vaccine株HN蛋白氨基端128-572aa的片段。

2.如权利要求1所述的自组装BPIV3纳米颗粒样抗原，其特征在于，编码所述的ferritin蛋白的基因的GenBank登录号为NP_223316，并引入点突变N19Q以消除潜在的N-连接糖基化位点。

3.如权利要求1所述的自组装BPIV3纳米颗粒样抗原，其特征在于，HN蛋白通过“SGG”Linker与ferritin的N-端相连接。

4.如权利要求1所述的自组装BPIV3纳米颗粒样抗原，其特征在于，所述的自组装BPIV3纳米颗粒样抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.权利要求1-4任一项所述的自组装BPIV3纳米颗粒样抗原在制备抗牛副流感病毒3型药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的药物为疫苗。

7.一种用于预防牛副流感病毒3型感染的疫苗，其特征在于，含有权利要求1-4任一项所述的自组装BPIV3纳米颗粒样抗原作为有效成分。