CN102665755A - 与免疫增强剂相连的寡聚流感免疫原性组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于预防流感病毒感染的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物包含流感病毒的免疫原例如血细胞凝集素，以及免疫增强剂例如人IgG的Fc片段，和任选地稳定化序列。所述免疫原与稳定化序列相连，所述稳定化序列进而与免疫增强剂相连。

Description

与免疫增强剂相连的寡聚流感免疫原性组合物
相关申请交叉引用
本申请基于35U.S.C.§119(e)要求2009年10月9日提交的美国临时专利申请No.61/250,442的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本公开文本涉及用于预防流感感染的免疫原性组合物。
发明背景
属于Orthomyxoviridae科的甲型流感病毒能在人、鸟类或驯养的食用动物中导致流感。可基于其表面糖蛋白，血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)，将所述病毒分为不同亚型。在16种已知的HA和九种NA中，有三种HA亚型(H1、H2和H3)和两种NA亚型(N1和N2)最常在人中被发现。H1N1和H3N2是导致人季节性流行性感冒(flu)和流感全球流行的主要亚型。2009年的流感流行是猪源的甲型流感病毒H1N1导致的。其引起了对高度致病性的禽流感(HPAI)H5N1病毒流行潜势的日益增加的关注。因此，为预防流感的未来爆发，迫切需要开发针对不同的甲型流感病毒毒株的有效且安全的疫苗。
发明内容
本文公开了用于预防流感病毒感染的免疫原性组合物。公开的免疫原性组合物是三聚体蛋白，其包含：1)免疫原，例如流感血细胞凝集素序列；2)三聚化或稳定化序列；和3)免疫增强剂序列。这三种序列是连续的，并且作为单个蛋白在哺乳动物表达系统中表达，或者，免疫原和免疫原和免疫增强剂以化学方式相连并被稳定。
在一种实施方式中，本文公开了用于诱导针对流感病毒的免疫应答的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含下述多肽，所述多肽包含免疫原和免疫增强剂。在另一实施方式中，所述多肽还包含稳定化序列。
在其它一些实施方式中，免疫原是流感病毒的血细胞凝集素序列、流感病毒的神经氨酸酶序列或流感病毒的膜蛋白序列。在另一实施方式中，免疫原是所述血细胞凝集素序列的片段，其选自HA1、HA2和RBD构成的组。在另一实施方式中，免疫增强剂选自人IgG、C3d、Onchocercavolvulus ASP-1、clera毒素和胞壁酰肽构成的组。
在另一实施方式中，稳定化序列是折叠子(foldon)或GCN4。
在还一实施方式中，多肽是融合蛋白。在另一实施方式中，多肽是在哺乳动物表达系统中产生的。
在另一实施方式中，多肽选自HA1-hFc、HA-hFc、HA1+3-259-hFc、HA1-Fd-hFc、HA-Fd-hFc、HA2-Fd-hFc、HA-RBD-Fd-hFc和HA1+3-259-Fd-hFc构成的组。
在另一实施方式中，免疫原与所述稳定化序列相连，并且其中，所述稳定化序列与免疫增强剂相连于单条多肽中。在还一实施方式中，免疫原和免疫增强剂通过2，2-联吡啶-5-羧酸(BPY)被化学稳定。
在又一实施方式中，免疫原性组合物还包含佐剂。
本文还公开了诱导针对流感病毒的保护性免疫应答的方法，所述方法包括将权利要求1的免疫原性组合物施用给需要其的宿主，并且其中，所述免疫原性组合物在宿主中诱导针对感染性试剂攻击的保护性免疫应答。在另一实施方式中，免疫原性组合物还包含佐剂。
附图说明
图1示出了甲型流感H5N1病毒的血细胞凝集素(HA)蛋白[A/Anhui/1/2005(H5N1)]的结构，还示出了含有HA1片段(氨基酸[aa]+3-322)的重组HA1-hFc和HA1-Fd-hFc蛋白、以及与人IgG Fc(hFc)融合的、包括H5N1病毒HA的aa+3-259的HA1片段的重组HA-3-259-Fd-hFc蛋白(有或没有Fd序列)的构建。
图2示出了对表达的HA1-hFc和HA1-Fd-hFc蛋白的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(图2a)和Western杂交印迹(图2b)分析。
图3示出了对表达的HA1-hFc和HA1-Fd-hFc蛋白的快速蛋白液相色谱(FPLC)分析。蛋白的分子量示于每个峰上，还示出了对应于经计算的标准蛋白的结构。
图4示出了用重组HA1-hFc、HA-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc蛋白对BALB/c小鼠免疫的示意图，对诱导的抗体和中和活性的检测，用活H5N1病毒对经疫苗接种小鼠的攻击，用于交叉保护评估。
图5示出了在第0天(免疫前)和用重组HA1-hFc和HA1-Fd-hFc蛋白的第一次、第二次和第三次强化之后10天收集的小鼠血清(1∶3000稀释)的结合反应活性。
图6示出了IgG抗体(Ab)与HA1-hFc、HA1-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc融合蛋白结合的能力，这是在用HA1-hFc、HA1-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc蛋白进行最后一次免疫接种后10天收集的小鼠血清中检测的。
图7示出了最后一次免疫接种后10天收集的小鼠血清的平均抗HA1-hFc、抗HA-Fd-hFc和抗HA-3-259-Fd-hFc IgG Ab效价。
图8示出了IgG Ab与没有Fd和Fc的HA1蛋白结合的能力，这是在用HA1-hFc、HA1-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc蛋白进行最后一次免疫接种后10天收集的经系列稀释的小鼠血清中检测的。
图9示出了IgG Ab与A/VietNam/1194/2004(VN/1194)-失活H5N1病毒结合的能力，这是在用HA1-hFc和HA1-Fd-hFc进行最后一次免疫接种后10天收集的经系列稀释的小鼠血清中检测的。
图10示出了IgG1亚型Ab与HA1蛋白结合的能力，这是在用HA1-hFc和HA1-Fd-hFc进行最后一次免疫接种后10天收集的经系列稀释的小鼠血清中检测的。
图11示出了IgG2a亚型Ab与HA1蛋白结合的能力，这是在用HA1-hFc和HA1-Fd-hFc进行最后一次免疫接种后10天收集的经系列稀释的小鼠血清中检测的。
图12示出了对经HA1-hFc和经HA1-Fd-hFc免疫接种的小鼠中IgG1和IgG2a Ab应答的比较。
图13示出了经HA1-hFc每次强化免疫接种后的小鼠血清针对表达XJ-HA、QH-HA、AH-HA和HK-HA的H5N1假病毒的中和Ab效价(NT50)，这是通过假病毒中和检验测量的。
图14示出了经HA1-Fd-hFc每次强化免疫接种后的小鼠血清针对表达XJ-HA、QH-HA、AH-HA和HK-HA的H5N1假病毒的中和Ab效价(NT50)，这是通过假病毒中和检验测量的。
图15示出了经HA1-hFc和HA1-Fd-hFc每次强化免疫接种后的小鼠血清针对表达同源AH-HA的H5N1假病毒的中和Ab效价(NT50)，这是通过假病毒中和检验测量的。
图16示出了针对H5N1假病毒的异源(HK-HA、1194-HA、QH-HA和XJ-HA)和同源(AH-HA)毒株的HA的中和Ab效价(NT50)，这是在用HA1-hFc和HA1-Fd-hFc进行最后一次免疫接种之后10天在小鼠血清中检测的。
图17示出了针对H5N1假病毒的异源(HK-HA、1194-HA)和同源(AH-HA)毒株的HA的中和Ab效价(NT50)，这是在用HA-3-259-Fd-hFc蛋白进行最后一次免疫接种之后10天在小鼠血清中检测的。
图18示出了针对H5N1活病毒的异源毒株A/Hong Kong/156/97(HK/156)、VN/1194和A/Shenzhen/406H/06(SZ/406H)的中和Ab效价(NT50)，这是在用HA1-hFc和HA1-Fd-hFc进行最后一次免疫接种之后10天在小鼠血清中检测的。
图19示出了针对H5N1活病毒的异源毒株(HK/156，VN/1194和SZ/406H)的血细胞凝集素抑制(HI)抗体效价，这是在用HA1-hFc和HA1-Fd-hFc进行最后一次免疫接种之后10天在小鼠血清中检测的。
图20示出了经HA1-hFc和经HA1-Fd-hFc免疫接种的小鼠针对致死性H5N1病毒攻击的交叉保护，这是通过被H5N1活病毒的HK/156毒株(分支0(clade 0))攻击的小鼠的存活率(％)指示的。
图21示出了经HA1-hFc和经HA1-Fd-hFc免疫接种的小鼠针对致死性H5N1病毒攻击的交叉保护，这是通过被H5N1活病毒的VN/1194毒株(分支1)攻击的小鼠的存活率(％)指示的。
图22示出了经HA1-hFc和经HA1-Fd-hFc免疫接种的小鼠针对致死性H5N1病毒攻击的交叉保护，这是通过被H5N1活病毒的SZ/406H毒株(分支2.3.4)攻击的小鼠的存活率(％)指示的。
图23示出了对经H5N1病毒攻击的小鼠肺组织中病毒RNA的定量，这是通过定量逆转录PCR(QRT-PCR)来进行的。在经HA1-hFc和HA1-Fd-hFc蛋白免疫接种的小鼠的肺组织中，测定了H5N1病毒的HK/156、VN/1194和SZ/406H毒株的病毒效价。
图24示出了用H5N1病毒的异源毒株进行致死性攻击后、对经HA1-hFc和经HA1-Fd-hFc免疫接种的小鼠肺组织中的组织病理性改变的评估。来自注射了PBS的小鼠的肺组织和未受感染的小鼠的肺组织分别被用作为阴性和正常对照。肺组织的所有切片用苏木精和曙红(H&E)染色，并在光学显微镜(放大倍率100x)下观察。示出了经H5N1毒株HK/156(a)、VN/1194(b)和SZ/406H(c)攻击的、经免疫接种的小鼠的组织病理学损伤的各幅图像。
术语定义
为帮助对下文的详述、实施例和所附权利要求的理解，参照下述定义可能是有用的。这些定义本身并非限制性的，其仅为读者便利而提供。
基因：“基因”在本文中使用时表示遗传构建体的下述至少一部分，其具有该遗传构建体所需的、或可修饰该遗传构建体的表达的启动子和/或其它调控序列。
宿主：在本文中使用时“宿主”表示本发明的免疫原性组合物的接受体。示例性的宿主是哺乳动物，其包括但不限于灵长类、啮齿类、母牛、马、狗、猫、绵羊、山羊、猪和大象。在本发明的一种实施方式中，宿主是人。就本公开文本的目的而言，宿主与“被免疫接种者”同义。
免疫原：在本文中使用时，术语“免疫原”表示在宿主中引发免疫应答的任何底物。本公开文本的免疫原包括但不限于流感病毒的血细胞凝集素。
免疫原性组合物：在本文中使用时，“免疫原性组合物”表示表达的蛋白或重组载体，其有或没有佐剂，其体内表达和/或分泌免疫原，并且其中，所述免疫原在宿主中引发免疫应答。本文公开的免疫原性组合物可以是或者可以不是免疫保护性的或治疗性的。当免疫原性组合可预防、减轻、缓和或消除患者的疾病时，那么免疫原性组合物可任选地被称为疫苗。但是，术语免疫原性组合物并非意欲被限制为疫苗。
发明详述
为预防流感未来的爆发(尤其是高度致病性禽流感(HPAI)H5N1病毒的不同毒株的流行潜势)，迫切需要开发针对不同的甲型流感病毒的有效且安全的疫苗。本公开文本描述了基于甲型流感病毒的表面血细胞凝集素(HA)蛋白来开发亚单元流感疫苗。该候选疫苗使用了哺乳动物细胞表达的、编码HA的HA1片段的重组蛋白。其在经免疫接种的动物中诱导强烈的免疫应答、有效的中和抗体和广泛的交叉保护免疫力。引发的中和抗体被证实对假型的(pseudotyped)甲型流感病毒分离株的至少五种毒株(代表分支0、1、2.2和2.3)有效，并能针对活H5N1流感病毒的至少三种毒株(覆盖分支0、1和2.3.4)进行中和和交叉保护。
在本文公开的一种实施方式中，提供了亚单元流感疫苗(免疫原性组合物)，其包含流感病毒的血细胞凝集素(HA)、稳定化序列和免疫增强剂。在另一实施方式中，免疫原性组合物被表达于哺乳动物表达系统中。
能提供异亚型(heterosubtypic)免疫力的通用流感疫苗对公共健康来说将是极大的进步。本文公开了候选流感疫苗，其中使用哺乳动物293T细胞表达的融合蛋白，该蛋白编码甲型流感H5N1病毒[A/Anhui/1/2005(H5N1)]的HA1片段(分别为残基+3-322，SEQ ID NO.2和残基+3-259，SEQ ID NO.30)。表达的重组蛋白与折叠子(Fd)序列(SEQ ID No.6)和人IgG1的Fc片段(SEQ ID NO.7)(hFc)融合，其意图于维持天然HA蛋白的三聚体结构以及增加稳定性和免疫原性。折叠子是来自T4噬菌体纤维蛋白(fibritin)的三聚化或寡聚化模体(motif)。HA是同源三聚体嵌膜糖蛋白。其形状像圆柱体，长大约13.5纳米。构成HA的三个相同单体被构建为中央α螺旋；三个球形头含有唾液酸结合位点。HA单体作为前体被合成，前体再被糖基化，并被切割成两个较小的多肽：HA1和HA2亚单元。每个HA单体由通过HA2锚定在膜中的长螺旋链构成，并且顶部有大的HA1球体。
在一种实施方式中，免疫增强剂是免疫球蛋白Fc片段。免疫球蛋白分子由通过二硫键保持在一起的两条轻(L)链和两条重(H)链构成，使得这些链形成Y型。Y的底部(重链的羧基端)在对免疫细胞活性的调节中具有作用。该区域被称为Fc(片段，可结晶)区域，由两条重链组成，取决于抗体的类型，该两条重链贡献两个或三个恒定结构域。通过与特定的蛋白结合，Fc区域确保每个抗体都产生针对给定抗原的合适免疫应答。Fc区域还与多种细胞受体(例如Fc受体)和其它免疫分子(例如补体蛋白)结合。由此其介导不同的生理效果，包括调理化(opsonization)，细胞裂解和肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的脱粒。
本文公开的免疫原性组合物在测试动物中对有效免疫应答的诱导中具有高效力。它们能引发高度有效的中和抗体，所述抗体在基于细胞培养物的假病毒中和检验中，不仅能中和表达HA蛋白的H5N1病毒的同源A/Anhui/1/2005(AH，分支2.3)毒株，还能中和异源A/HongKong/156/97(HK，分支0)、A/VietNam/1194/2004(1194，分支1)、A/Xinjiang/1/2006(XJ，分支2.2)和A/Qinghai/59/05(QH，分支2.2)毒株。此外，本文公开的免疫原性组合物能针对H5N1活病毒的至少三种不同毒株进行高度中和和完全交叉保护，所述毒株包括：分支0：A/HongKong/156/97(HK/156)，分支1：A/VietNam/1194/2004(VN/1194)和分支2.3.4：A/Shenzhen/406H/06(SZ/406H)。上述特征显示，表达的融合蛋白具有被开发为用于预防未来的流感暴发的通用流感疫苗的高度潜力。
此前设计的基于流感HA的疫苗不能在宿主中诱导高度有效和广泛的中和应答，这最可能是因为这些疫苗不能正确维持稳定和可溶的三聚体构象，或者它们缺乏高效的免疫原性来诱导高水平的中和抗体。而本发明描述的免疫原性组合物解决了这些问题，这是通过下述方式解决的：1)向HA1添加Fd，三聚化模体，令HA1正确维持稳定和可溶的三聚体构象；以及2)IgG的Fc片段与HA1-Fd的融合，其导致HA1-三聚体的免疫原性增强以诱导高水平的中和抗体，以及产生针对广谱流感病毒的交叉保护。此外，Fc片段具有通过其二硫键形成非共价二聚体的趋势，这可令融合蛋白形成二聚体、六聚体或其它寡聚体形式，产生更具免疫原性的分子。
诱导针对特定病毒的不同毒株的抗体的能力将能解决对所有流行性感冒疫苗生产商来说是显著阻碍的一种毒株-一种疫苗的问题。此外，描述的配方不利用鸡蛋来培育病毒——这是重大优点，不仅显著降低生产时间和成本，还令孕妇和对鸡蛋的蛋白过敏的人也能接受疫苗。
表1可用于设计与免疫增强剂相连的寡聚流感疫苗的组分
Figure BPA00001534839300081
*包括不同的亚型
在一种实施方式中，本发明的免疫原性组合物的流感病毒组分可包含选自下组的序列，所述组由流感病毒H5N1的HA序列；流感病毒H1N1的HA序列；流感病毒H3N2的HA序列；流感病毒H5N1的HA1序列；流感病毒H1N1的HA1序列；流感病毒H3N2的HA1序列；流感病毒H5N1的HA2序列；流感病毒H1N1的HA2序列；流感病毒H3N2的HA2序列；流感病毒H5N1的NA序列；流感病毒H1N1的NA序列；流感病毒H3N2的NA序列；流感病毒H5N1的M1/M2序列；流感病毒H1N1的M1/M2序列；流感病毒H3N2的M1/M2序列；流感病毒H5N1的HA-NA序列；流感病毒H1N1的HA-NA序列；流感病毒H3N2的HA-NA序列；流感病毒H5N1的HA-M1/M2序列；流感病毒H1N1的HA-M1/M2序列；流感病毒H3N2的HA-M1/M2序列；流感病毒H5N1的HA-NA-M1/M2序列；流感病毒H1N1的HA-NA-M1/M2序列；流感病毒H3N2的HA-NA-M1/M2序列构成。上述每个结构域的氨基酸和核酸序列可在流感研究数据库(Influenza Research Database)中找到。
表2与免疫增强剂相连的寡聚流感免疫原性组合物的氨基酸和DNA序列(注意：SEQ ID No.4和42-48是DNA序列，其它是氨基酸序列)
SEQ ID NO.1[A/Anhui/1/2005(H5N1)HA]
MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILE
KTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEK
ANPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSS
ACPYQGTPSFFRNVVWLIKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSN
DAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFW
TILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIVKSEVEYGNCNTKCQT
PIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRRKRGL
FGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVT
NKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAE
LLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKC
DNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVA
SSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO.2[A/Anhui/1/2005(H5N1)HA1+3-322]
ICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLI
LRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYE
ELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWL
IKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISV
GTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAP
EYAYKIVKKGDSAIVKSEVEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGE
CPKYVKSNKLVLATGLRNSPL
SEQ ID NO.3[A/Anhui/1/2005(H5N1)HA2]
GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDG
VTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYN
AELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHK
CDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTV
ASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO.4[A/Anhui/1/2005(H5N1)HA-RBD]
LSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWLIKKNN
TYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTL
NQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAY
KIVKK
SEQ ID NO.5[IL2ss 信号肽]
MYRMQLLSCIALSLALVTNS
SEQ ID NO.6[折叠子(Fd)，还见SEQ ID NO.36]
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO.7[人IgG Fc(hFc)]
RSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH
EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN
GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS
LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.8[HA-Fd]
MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILE
KTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEK
ANPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSS
ACPYQGTPSFFRNVVWLIKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSN
DAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFW
TILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIVKSEVEYGNCNTKCQT
PIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRRKRGL
FGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVT
NKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAE
LLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKC
DNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVA
SSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICIGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWV
LLSTFL
SEQ ID NO.9[HA1-Fd]
ICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLI
LRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYE
ELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWL
IKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISV
GTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAP
EYAYKIVKKGDSAIVKSEVEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGE
CPKYVKSNKLVLATGLRNSPL-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO.10[HA2-Fd]
GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDG
VTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYN
AELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHK
CDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTV
ASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI-GYIPEAPRDGQAYVRKDGE
WVLLSTFL
SEQ ID NO.11[HA-RBD-Fd]
LSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWLIKKNN
TYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTL
NQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAY
KIVKK-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO.12[HA-hFc]
MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILE
KTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEK
ANPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSS
ACPYQGTPSFFRNVVWLIKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSN
DAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFW
TILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIVKSEVEYGNCNTKCQT
PIGAINS SMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRRKRGL
FGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVT
NKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAE
LLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKC
DNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVA
SSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI-RSDKTHTCPPCPAPELLGGPS
VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI
SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH
NHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.13[HA1-hFc]
ICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLI
LRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYE
ELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWL
IKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISV
GTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAP
EYAYKIVKKGDSAIVKSEVEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGE
CPKYVKSNKLVLATGLRNSPL-RSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK
PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE
QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ
PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY
KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK
SEQ ID NO.14[HA2-hFc]
GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDG
VTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYN
AELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHK
CDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTV
ASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI-RSDKTHTCPPCPAPELLGGP
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK
TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN
GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL
HNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.15[HA-RBD-hFc]
LSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWLIKKNN
TYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTL
NQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAY
KIVKK-RSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH
QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS
KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.16[HA-Fd-hFc]
MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILE
KTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEK
ANPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSS
ACPYQGTPSFFRNVVWLIKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSN
DAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFW
TILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIVKSEVEYGNCNTKCQT
PIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRRKRGL
FGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVT
NKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAE
LLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKC
DNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVA
SSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEW
VLLSTFL-RSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC
VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV
LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE
MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.17[HA1-Fd-hFc]
ICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLI
LRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYE
ELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWL
IKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISV
GTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAP
EYAYKIVKKGDSAIVKSEVEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGE
CPKYVKSNKLVLATGLRNSPL-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
-RSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL
NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV
SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.18[HA2-Fd-hFc]
GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDG
VTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYN
AELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHK
CDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTV
ASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI-GYIPEAPRDGQAYVRKDGE
WVLLSTFL-RSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT
CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT
VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE
EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF
LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.19[HA-RBD-Fd-hFc]
LSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWLIKKNN
TYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTL
NQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAY
KIVKK-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL-RSDKTHTCPPCPAPEL
LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE
VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM
HEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.20[小鼠IgG Fc(mFc)]
RSPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVD
VSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDW
MSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQ
VTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKL
RVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO.21[HA-Fd-mFc]
MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILE
KTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEK
ANPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSS
ACPYQGTPSFFRNVVWLIKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSN
DAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFW
TILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIVKSEVEYGNCNTKCQT
PIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRRKRGL
FGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVT
NKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAE
LLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKC
DNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVA
SSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEW
VLLSTFL-RSPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPI
VTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSAL
PIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEE
EMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGS
YFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO.22[HA1-Fd-mFc]
ICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLI
LRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYE
ELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWL
IKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISV
GTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAP
EYAYKIVKKGDSAIVKSEVEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGE
CPKYVKSNKLVLATGLRNSPL-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
-RSPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVV
DVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQD
WMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKK
QVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSK
LRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO.23[HA2-Fd-mFc]
GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDG
VTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYN
AELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHK
CDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTV
ASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI-GYIPEAPRDGQAYVRKDGE
WVLLSTFL-RSPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLS
PIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVS
ALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPP
PEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSD
GSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO.24[HA-RBD-Fd-mFc]
LSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWLI KKNN
TYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTL
NQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAY
KIVKK-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL-RSPRGPTIKPCPPCKC
PAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVN
NVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKD
LPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDI
YVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYS
CSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO.25[兔IgG Fc(rFc)]
RSSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEV
QFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCK
VHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGF
YPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRG
DVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK
SEQ ID NO.26[HA-Fd-rFc]
MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILE
KTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEK
ANPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSS
ACPYQGTPSFFRNVVWLIKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSN
DAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFW
TILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIVKSEVEYGNCNTKCQT
PIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPLRERRRKRGL
FGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVT
NKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAE
LLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKC
DNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVA
SSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEW
VLLSTFL-RSSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLR
GKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSL
TCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPT
SEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK
SEQ ID NO.27[HA1-Fd-rFc]
ICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLI
LRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYE
ELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWL
IKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISV
GTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAP
EYAYKIVKKGDSAIVKSEVEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGE
CPKYVKSNKLVLATGLRNSPL-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
-RSSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPE
VQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKC
KVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMING
FYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRG
DVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK
SEQ ID NO.28[HA2-Fd-rFc]
GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDG
VTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYN
AELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHK
CDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTV
ASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI-GYIPEAPRDGQAYVRKDGE
WVLLSTFL-RSSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV
DVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDW
LRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSV
SLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSV
PTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK
SEQ ID NO.29[HA-RBD-Fd-rFc]
LSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWLIKKNN
TYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTL
NQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAY
KIVKK-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL-RSSKPTCPPPELLGGP
SVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTAR
PPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISK
ARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKA
EDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNH
YTQKSISRSPGK
SEQ ID NO.30[A/Anhui/1/2005(H5N1)HA1+3-259]
ICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLI
LRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYE
ELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWL
IKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISV
GTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAP
EYAYKIVKK
SEQ ID NO.31[HA1+3-259-Fd]
ICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLI
LRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYE
ELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWL
IKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISV
GTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAP
EYAYKIVKK-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO.32[HA1+3-259-hFc]
ICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLI
LRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYE
ELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWL
IKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISV
GTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAP
EYAYKIVKK-RSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV
TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL
TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR
EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF
FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.33[HA1+3-259-Fd-hFc]
ICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLI
LRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYE
ELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWL
IKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISV
GTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAP
EYAYKIVKK-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL-RSDKTHTCPPC
PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN
KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS
CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.34[HA1+3-259-Fd-mFc]
ICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLI
LRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYE
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SEQ ID NO.35[HA1+3-259-Fd-rFc]
ICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLI
LRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYE
ELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWL
IKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISV
GTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAP
EYAYKIVKK-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL-RSSKPTCPPPEL
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GKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEAL
HNHYTQKSISRSPGK
在一种实施方式中，稳定化序列包含对三聚体或寡聚体构型中的HA序列加以稳定的序列。在本文中使用时，术语稳定化序列、三聚体模体或三聚化序列可互换使用并且是等同的。合适的稳定化序列包括但不限于：折叠子，这是T4纤维蛋白(fibritin)的C末端结构域中27个氨基酸的区域(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL，SEQ ID NO：6或GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL，SEQ ID NO：36)；GCN4(MKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEV；SEQ ID NO.37)；IQ(RMKQIEDKIEEIES KQKKIENEIARIKK；SEQ ID NO.38)或IZ(IKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEK；SEQ ID NO.39)。其它合适的稳定化方法包括但不限于2，2-联吡啶-5-羧酸(BPY)、二硫键和简易连接。
在另一实施方式中，免疫增强剂包含增强免疫原性组合物的免疫原性的序列。合适的免疫增强剂包括但不限于：人IgG的Fc片段、C3d(促进抗体形成的补体片段，与抗原结合，增强树突细胞和B细胞对它们的摄入)、ASP-1(活化相关分泌基因家族的Onchocerca volvulus同源体)(见US 200690039921，其关于ASP-1佐剂的所有公开内容通过引用并入本文)、clera毒素、胞壁酰肽和细胞因子。
在一种实施方式中，可使用重叠引物来构建所要求保护的融合蛋白。在另一实施方式中，首先合成编码Fd的DNA序列(GGCTATATTCCGGAAGCGCCGCGTGATGGCCAGGCGTATGTGCGTAAAGATGGCGAATGGGTGCTG CTGTCTACCTTTCTG；SEQ ID NO：40)。产生HA1和HA-3-259和Fd各自的PCR产物，使用HA1或HA-3-259正向引物和Fd反向引物，用HA1和Fd DNA(PCR产物)作为模板，通过一轮PCR扩增HA1-Fd和HA-3-259-Fd融合片段。然后将扩增出的HA1-Fd和HA-3-259-Fd PCR产物插入hFc载体，产生分别编码HA1-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc融合蛋白的HA1-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc重组质粒。
在一种实施方式中，使用pFUSE-hIgG1-Fc(人Fc，hFc)、pFUSE-mIgG2a-Fc2(鼠Fc，mFc)或pFUSE-rIgG2-Fc2(兔Fc，rFc)载体来构建本文公开的融合蛋白。在另一实施方式中，融合蛋白可从其它哺乳动物细胞表达载体表达，所述载体包括但不限于pcDNA3.1，pcDNA6-His，PEE13.1，PEE1.41，pCMV-NEO-BAM，pSV2和pCMV1、2、3、4、5、6。在另一实施方式中，融合蛋白可从昆虫细胞表达载体表达，所述载体包括但不限于pAcGP67、pFastBac Dual和pMT/V5-His-TOPO。在还一实施方式中，融合蛋白可从E.coli表达载体表达，所述载体包括但不限于pET、pET-SUMO和具有GST的pGEX载体。
下述表达系统适用于表达本文公开的融合蛋白：哺乳动物细胞表达系统，例如但不限于，pcDNA和GS基因表达系统；昆虫细胞表达系统，例如但不限于Bac-to-Bac、杆状病毒和DES表达系统；和E.coli表达系统，包括但不限于，pET、pSUMO和GST表达系统。
在哺乳动物细胞表达系统中表达的蛋白的优点包括下述这些。哺乳动物细胞表达系统是用于表达重组蛋白的相对成熟的真核系统。其更可能获得具有正确糖基化的准确折叠的可溶蛋白，使得表达的蛋白维持其天然构象，并且保持足够的生物活性。该系统可瞬时或稳定表达重组抗原，并且促进信号合成。以这种方式表达的重组蛋白可保持良好的抗原性和免疫原性。但是，昆虫和细菌表达系统二者均能提供不昂贵并且高效的蛋白表达，这在某些条件下可能是合适的。
纯化系统取决于标签是否与HA蛋白相连或融合。当融合蛋白与IgGFc载体融合时，蛋白A或蛋白G亲和色谱被用于纯化。如果融合蛋白与GST蛋白融合，将使用GST柱进行纯化。如果融合蛋白与6xHis标签在N-或C-末端相连，则使用His标签柱来纯化表达的蛋白。如果没有标签与重组蛋白相连，则可使用快速蛋白液相色谱(FPLC)、高效液相色谱(HPLC)或其它色谱来纯化表达的蛋白。
在某些实施方式中，免疫原性组合物还包含佐剂或与佐剂一起施用。适合在动物中使用的佐剂包括但不限于Freund’s完全或不完全佐剂、Sigma佐剂系统(SAS)以及Ribi佐剂。适用于人的佐剂包括但不限于MF59(水包油乳液佐剂)，Montanide ISA 51或720(基于矿物油的或基于可代谢的油的佐剂)，氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝，HAVLOGEN
Figure BPA00001534839300241
(基于丙烯酸聚合物的佐剂，Intervet Inc.，Millsboro，DE)，聚丙烯酸，基于矿物油(例如BAYOLTM或MARCOLTM(Esso Imperial Oil Limited，Canada))或植物油(例如维生素E乙酸酯)的水包油或油包水乳液、皂角苷和活化相关蛋白-1(ASP-1)(见US 200690039921，其关于ASP-1佐剂的所有公开内容通过引用并入本文)。但是，具有佐剂活性的组分是广为人知的，并且通常可使用对疫苗和/或免疫原性组合物的效力或安全性没有负面干扰的任何佐剂。
根据本文公开的多种实施方式的疫苗和免疫原性组合物可以以液体、冷冻悬浮液或以冻干的形式被制备和/或市售。典型地，根据本发明公开制备的疫苗和/或免疫原性组合物含有惯常用于此类组合物的可药用载剂或稀释剂。载剂包括但不限于：稳定剂、防腐剂和缓冲剂。合适的稳定剂例如是SPGA、Tween组合物(例如可从A.G.Scientific，Inc.，San Diego，Calif.获得的)、碳水化合物(例如山梨糖醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、右旋糖苷、谷氨酸盐/酯或葡萄糖)、蛋白质(例如干燥的乳清、清蛋白或酪蛋白)或其降解产物。合适的缓冲剂的非限制性例子包括碱金属磷酸盐。合适的防腐剂是硫汞撒、硫柳汞和庆大霉素。稀释剂包括水、水性缓冲剂(例如经缓冲盐水)、醇类和多元醇(例如甘油)。
本文还公开了使用本文公开的融合蛋白来诱导针对流感病毒的免疫应答的方法。通常，疫苗或免疫原性组合物可以以有效量以皮下、皮内、粘膜下或肌内方式施用，以预防目的流感病毒感染和/或治疗流感病毒感染。有效量被定义为将在被免疫接种的动物中诱导出针对致命性病毒的攻击的免疫力的免疫性融合蛋白的量。免疫力在本文中被定义为在免疫接种后动物群中诱导出相对未受免疫接种的组而言显著更高的保护水平。
此外，在疫苗和/或免疫原性组合物的多种配方中，可添加合适的赋形剂、稳定性等等。
实施例
实施例1 H5N1病毒的重组HA蛋白的构建和表达
构建编码HA1-hFc、HA1-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc的重组质粒。使用含有经密码子优化的、甲型流感H5N1病毒[A/Anhui/1/2005(H5N1)，GenBank检录号ABD28180.1)]的全长HA(SEQ ID NO.1)的质粒作为模板，通过PCR扩增编码含有H5N1HA蛋白的HA1片段的320个氨基酸(aa)(+3-322)的片段的基因，并将其按符合读码框的方式融合进pFUSE-hIgG1-Fc2(人IgG Fc，hFc)表达载体(InvivoGen，San Diego，CA)。由此将构建的重组质粒命名为pHA1-hFc。使用覆盖Fd的重叠引物，通过PCR在3’端添加Fd序列，接着插入进上述的hFc表达载体，其被命名为pHA1-Fd-hFc。通过将编码含有H5N1HA蛋白的上述HA1片段(SEQ ID NO.2)的残基+3-259的片段的基因加上述Fd序列插入上述hFc表达载体，构建编码HA-3-259-Fd-hFc(SEQ ID NO：33)的质粒。通过序列分析来验证构建的重组质粒。H5N1HA蛋白、Fd和hFc片段的aa序列列于表1中。
A/Anhui/1/2005(H5N1)病毒的HA蛋白含有信号肽(SP)、HA1(+1-329aa)和HA2(+330-551aa)的片段，它们被HA1和HA2之间的蛋白酶切割位点RERRRKR(SEQ ID NO：41)的特定序列所跨接。在对重组HA1-hFc质粒的构建中，H5N1病毒的HA蛋白的原始信号肽被IL2ss信号序列(SEQ ID NO：5)所代替，其之后是融合进上述hFc载体的H5N1的HA1片段(+3-322aa)。将Fd序列插入HA1和hFc之间，成为HA1-Fd-hFc(SEQ ID NO：17)。HA-3-259-Fd-hFc含有H5N1的上述HA1片段的+3-259aa加Fd序列，它们融合进上述hFc载体。
重组HA1-hFc、HA1-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc蛋白的表达、纯化和表征。按照以前所述来表达重组HA1-hFc、HA1-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc蛋白(Du L et al.Biochem Biophys Res Commun 384，486-490，2009)。简言之，使用磷酸钙方法，将编码HA1-hFc、HA1-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc蛋白的重组质粒转染进在转染之前24小时接种的哺乳动物293T细胞(ATCC，Manassas，VA)。10小时之后，用新鲜的OPTI-MEM IReduced-Serum培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)替换培养基，翻译后(post-translation)72小时收集上清液。通过蛋白A亲和色谱(GEHealthcare，Piscataway，NJ)纯化上清液中的重组HA1-hFc、HA1-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc蛋白。对HA1-hFc、HA1-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc蛋白的构象和表征分析通过FPLC来进行，这按照厂商方案(GE HealthcareLife Sciences)，使用AKTApurifier Core系统和Unicon 5.11软件来进行。
通过SDS-PAGE和Western杂交印迹来检测蛋白表达。按照我们之前描述过的方案(Du L et al.Virology.393，144-150，2009)，使用HA特异性单克隆抗体(mAbs)，通过SDS-PAGE和Western杂交印迹，来分析纯化的蛋白。简言之，通过10-20％Tricine SDS-PAGE凝胶(Invitrogen)来分离10μg纯化的蛋白，并将其转移至硝酸纤维素膜(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)。在4℃封闭过夜后，用HA特异性mAb以1∶1000的稀释度在室温下对杂交印迹孵育1小时。用含有0.1％Tween-20的PBS(PBST)洗三次后，然后将杂交印迹与马辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠IgG(1∶5,000，Zymed，Carlsbad，CA)在室温下孵育1小时。用ECL Western杂交印迹底物试剂和Amersham Hyperfilm(GEHealthcare)来呈现信号。
如图2所示，重组HA1-hFc和HA1-Fd-hFc蛋白可以以非常高的水平、以分泌的形式表达于经转染的293T细胞的培养物上清液中，并且以高纯度被纯化(图2a)。通过Western杂交印迹进行检测，通过针对H5N1病毒的HA部分的构象特异性mAb来识别它们，这表示：这些蛋白对甲型流感H5N1病毒的HA是特异性的，这提示这些融合蛋白维持了H5N1病毒蛋白HA的正确构象的抗原性。通过FPLC分析对这些蛋白的进一步表征证实，与Fc融合的HA1蛋白(HA1-hFc)的大部分主要形成分子量为～440kDa的三聚体，而与Fd和Fc融合的HA1蛋白(HA1-Fd-hFc)主要构成具有～669kDa的更高分子量的寡聚体结构(图3)。
实施例2重组HA融合蛋白诱导的体液免疫应答
在存在Sigma佐剂系统(SAS，Sigma)的情况下，用重悬于PBS中的经纯化HA融合蛋白以20μg/小鼠对4-6周龄的雌性BALB/c小鼠的组进行免疫接种，并以大约3周的间隔按10μg/小鼠用含有SAS的免疫原强化三次。PBS加SAS被用作为阴性对照。在免疫之前和每次免疫接种后10天收集血清样品，以使用ELISA检测HA特异性的和/或H5N1病毒特异性的IgG抗体和亚型的产生。免疫方案如下表2和图4所示。
按照以前所述(Du L et al.Vaccine 25，2832-2838，2007；Du L et al.Virology 393：144-150，2009)，使用酶联免疫吸附检验(ELISA)来评估HA蛋白诱导的IgG抗体应答和亚型。简言之，分别用重组HA1-hFc、HA1-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc蛋白、没有Fd和hFc的HA1蛋白和/或失活的H5N1病毒A/VietNam/1194/2004(VN/1194)在4℃对96孔微滴定板进行过夜预涂布，并用2％无脂奶于37℃封闭2小时。将经系列稀释的小鼠血清加入到板中，于37℃孵育1小时，接着用PBST洗四次。然后将结合的抗体与HRP-缀合的山羊抗小鼠IgG(Zymed)、IgG1(Invitrogen)和/或IgG2a(Bethyl Laboratories，Montgomery，TX)于37℃反应1小时。洗四次后，向板中加入底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)(Zymed)，通过加入1N H2SO4来停止反应。通过ELISA平板读数仪(Tecan，SanJose，CA)来测量450nm处的吸光度(A450)。
通过ELISA针对HA融合蛋白来检测HA1-hFc、HA1-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc蛋白诱导的抗体水平。如图5所示，HA1-hFc和HA1-Fd-hFc蛋白都诱导了对经纯化的HA1-hFc和HA1-Fd-hFc蛋白特异性的IgG抗体应答，其在第一次强化免疫接种之后很快达到高水平，然后每次强化后抗体结合稍有增加(血清以1∶3000的稀释度来被测试)，而在从免疫之前(prior immunization)(免疫前(pre-immune))收集的血清和来自PBS对照的那些中仅检测到背景水平的抗体应答。在最后一次强化后10天时收集的小鼠血清中检测到了1∶2.1×108的平均终点抗体效价(图6)。在用HA1-hFc、HA1-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc免疫的小鼠中，最后一次强化后收集的血清中IgG抗体的平均效价分别达到1∶3.9x107±2.2x107、1∶1.5×108±8.6x107和1∶2.1×105(图7)。图5-7的数据表示为平均值±标准差(SD)。
通过ELISA针对没有Fd和hFc的HA1蛋白进一步检测抗体水平，以消除融合标签Fd和/或hFc可能诱导的抗体应答，以及还针对失活的异源H5N1病毒(VN/1194)检测抗体水平。如图8所示，用这些HA融合蛋白(特别是HA1-Fd-hFc)免疫接种的小鼠的血清与没有Fd和/或hFc的HA1蛋白强烈反应，达到1∶1.3×107的终点效价，这提示了抗体应答对HA1蛋白的高度特异性。还显示，诱导的IgG抗体还可与失活的H5N1病毒(VN/1194)反应，达到1∶1.3×107的类似终点效价(图9)。但是，在用PBS注射的对照小鼠血清中检测不到IgG抗体应答(图8和9)。
对HA1-hFc和HA1-Fd-hFc蛋白诱导的IgG亚型的评估显示：在最后一次免疫接种后10天时收集的小鼠血清中可检测到IgG1和IgG2a。HA1-Fc和HA1-Fd-hFc蛋白两者都引发了相似水平的特异于HA1蛋白的IgG1(Th2相关，图10)和IgG2a(Th1相关，图11)抗体应答，达到了1∶2.1×108的终点效价。图12还示明，IgG2a抗体效价显著高于IgG1(P＜0.05)，这提示：HA1-hFc和HA1-Fd-hFc融合蛋白二者都具有刺激Th1相关的抗体应答的趋势。但是，在PBS对照小鼠的血清中没有发现IgG1或IgG2a抗体应答(图10-12)。
上述数据提示，表达的HA1-hFc、HA1-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc蛋白能引发特异于同源和/或异源H5N1病毒HA1蛋白的高效价抗体应答，暗示了它们在经免疫接种的小鼠中刺激高度有效的体液免疫应答的强免疫原性。图8-12表示为平均值±SD。
表2用于检测抗体应答的重组HA融合蛋白的免疫方案*
Figure BPA00001534839300291
*所有免疫都以200μL总体积进行；SAS＝Sigma佐剂系统(Sigma)。在第0天(免疫前)和每次强化后10天收集血样用于对抗体应答的检测。
实施例3使用H5N1假病毒中和检验，检测重组HA融合蛋白诱导 的中和抗体活性
然后基于假型中和检验，就针对高度致病性禽流感(HPAI)H5N1病毒的中和抗体的产生，对融合蛋白HA1-hFc和HA1-Fd-hFc进行评估。在免疫前和每次免疫接种后10天收集血清。就针对表达五种分离株的HA的H5N1假病毒的中和抗体活性的产生，对从组12A(HA1-hFc)、组12B(HA1-Fd-hFc)和组19C(HA-3-259-Fd-hFc)收集的血清进行测试，所述五种分离株覆盖四个分支，包括同源毒株A/Anhui/1/2005(AH-HA，分支2.3)和异源毒株，例如，A/Hong Kong/156/97(HK-HA，分支0)、A/VietNam/1194/2004(1194-HA，分支1)、A/Qinghai/59/05(QH-HA，分支2.2)和A/Xinjiang/1/2006(XJ-HA，分支2.2)。
H5N1假病毒生产。按照之前所述(Du L et al.Virology.393：144-150，2009；Du L et al.Biochem Biophys Res Commun 384：486-490，2009；Du L et al.Biochem Biophys Res Commun 397：580-585，2010)，稍加改动，来产生H5N1假病毒。简言之，用编码甲型流感病毒H5N1分离株HK、1194、QH、XJ和AH的HA的质粒和编码Env-缺陷型、表达荧光酶素的HIV-1基因组(pNL4-3.luc.RE)的质粒，使用磷酸钙方法，对293T细胞进行共转染。10小时候后更换培养基——含有10％胎牛血清(FBS)的Delbecco’s改良Eagle培养基(DMEM)，在转染后26和50小时向培养基中以0.5-5μg/ml的浓度加入神经氨酸酶(NA)(Sigma)。转染后72小时收获上清液，将其用于对293T细胞的单周期感染(single-cycleinfection)。
通过H5N1假病毒检测中和抗体活性。在对经免疫接种的小鼠血清的中和活性的检测中，在56℃对所有血清样品加热失活30分钟，并对其进行系列稀释。向每个孔中加入等体积的样品和H5N1假病毒，在37℃孵育1小时。然后向提前6-8小时涂有293T细胞的96孔组织培养板的每个孔中加入100μL该混合物。24小时后，向孔中加入80μL/孔的含有10％FBS的新鲜DMEM，72小时后检测荧光酶素活性。使用细胞裂解缓冲液(Promega，Madison，WI)裂解细胞。添加荧光酶素底物(Promega)之后，在Ultra 384光度计(Tecan)中测定相对荧光酶素活性。使用Calcusyn程序(Chou，T.C.Pharmacol Rev 58：621-681，2006)来计算50％中和抗体效价(NT50)。
用于检测针对H5N1假病毒的中和活性的实验结果显示，这些融合蛋白能诱导高度有效的具有针对H5N1假病毒的中和活性的特异性IgG抗体。从第一次强化免疫接种后10天起，在用HA1-hFc(图13)和HA1-Fd-hFc(图14)二者免疫接种的小鼠血清中均检测到中和抗体。在免疫接种前的小鼠血清中检测不到或检测到较低(NT50≤1∶50)水平的中和抗体(图13和14)。这些中和抗体的血清水平在每次强化免疫接种后迅速增加，在最后一次免疫接种后10天达到最高水平(图15)。图13-15的数据以平均值±SD表示。
以上诱导的中和抗体高效价不仅能中和AH-HA的同源抗体(图15)，其还中和了异源的HK-HA、1194-HA、XJ-HA以及甚至QH-HA毒株(图13、14和16)，这提示了它们诱导针对不同H5N1的交叉保护的潜在能力。通常，与hIgG1的Fc融合的两种蛋白(HA1-hFc和HA-Fd-hFc)能在293T细胞中诱导针对H5N1假病毒感染的中和抗体(图14-16，表3)，这提示IgG Fc可能在HA蛋白寡聚体结构的形成和对融合蛋白的免疫原性的增强中具有关键作用。此外，具有Fd序列的融合蛋白HA1-Fd-hFc能比没有Fd的HA1-hFc蛋白诱导更高效价的假病毒中和抗体，显示了针对1194-HA、QH-HA、XJ-HA和AH-HA H5N1的感染的显著更高水平的抑制(图16，P＜0.05)。还在HA-3-259-Fd-hFc蛋白最后一次免疫接种后10天收集的小鼠血清中检测到了对针对HK-HA、1194-HA和AH-HA H5N1假病毒的中和抗体高效价的诱导(图17)，这进一步验证了Fd序列在诱导针对H5N1假病毒的不同毒株的高度有效的中和抗体中的重要性。Fd序列可能有助于形成HA蛋白的三聚体结构，由此增加中和能力。上述结果还提示，除含有残基+3-322的HA1片段之外，覆盖残基+3-259的更短的H5N1的HA1片段含有重要的中和表位，其能诱导针对H5N1病毒的多个毒株的高度有效的中和抗体。相反，PBS对照组仅引发背景水平的针对测试用H5N1假病毒的中和抗体效价(图16)。图16和17中的数据表示为平均值±SD。
表3用HA融合蛋白免疫接种的小鼠血清中的假病毒中和抗体效价(NT50)*
*样品来自最后一次免疫接种后10天收集的小鼠血清。数据表示为每组三至五只小鼠的平均值±SD。
实施例4使用H5N1活病毒中和检验和血细胞凝集素抑制检验，检 测重组HA融合蛋白诱导的中和抗体活性和抑制
基于活病毒中和检验和血细胞凝集素抑制，就针对高度致病性的H5N1病毒的中和抗体的产生，进一步评估融合蛋白HA1-hFc和HA1-Fd-hFc。应用最后一次免疫接种后10天从组12A(HA1-hFc)和组12B(HA1-Fd-hFc)收集的血清来检测针对H5N1活病毒的中和抗体活性。
H5N1病毒中和检验。通过活中和检验，进一步检测经免疫接种的小鼠的中和抗体效价。简言之，将系列两倍稀释的小鼠血清与分支0：A/Hong Kong/156/97(HK/156)、分支1：A/VietNam/1194/2004(VN/1194)和分支2.3.4：A/Shenzhen/406H/06(SZ/406H)(H5N1)的20个斑形成单位(PFU)混合，并在37℃孵育1小时，之后加入至Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞。1小时后用新鲜的DMEM替换培养基，在37℃对细胞培养物继续培养72小时。每天观察病毒细胞病变效果(CPE)，在感染后第三天进行记录。基于每种血清的最高稀释来测定中和抗体效价，其在＞50％的孔中完全遏制了病毒诱导的CPE。
血细胞凝集素抑制(HI)检验。该检验如下进行。简言之，将最后一次免疫接种后10天的小鼠血清系列稀释液与等体积的HK/156、VN/1194和/或SZ/406H H5N1病毒一起在室温下孵育1小时，接着添加等体积的0.5％鸡血红细胞，室温下保持30分钟。HI抗体效价表示为完全抑制了血细胞凝集素活性的最高血清稀释比。
用于检测针对H5N1活病毒的中和活性的实验结果显示，诱导的抗体能中和至少三种异源毒株的感染，所述毒株覆盖H5N1活病毒的三个分支，例如HK/156(分支0)、VN/1194(分支1)和SZ/406H(分支2.3.4)(图18)。此外，抗体能抑制这三种H5N1活病毒的血细胞凝集素，平均HI效价≥1∶1.0×103(图19)。显著地，HA1-Fd-hFc诱导的中和抗体通常要比HA1-hFc诱导的那些更强大。相反，在测试的H5N1活病毒中，PBS对照组仅引发了背景水平的中和和HI抗体效价(图18和19)。图18和19的数据表示为平均值±SD。
实施例5 H5N1病毒攻击和针对H5N1病毒的不同毒株的重组HA融 合蛋白诱导的交叉保护评估
然后通过观察H5N1病毒攻击后动物的存活率，以及检测病毒攻击后第5天从小鼠收集的肺组织中的病毒负载和组织病理学改变，就诱导针对高度致病性H5N1病毒的交叉保护性免疫力的方面，来评估融合蛋白HA1-hFc和HA1-Fd-hFc。
H5N1活病毒攻击和样品收集。6-8周龄的BALB/c雌性小鼠被保持在生物安全水平-3(BSL-3)的居所中，并能自由获得标准团块状饲料和水。所有实验方案遵照经许可的BSL-3动物设施的标准操作流程来进行，并且是动物伦理协会(Animal Ethics Committee)许可的。在存在SAS的情况下，用重悬于PBS中的经纯化HA1-hFc或HA1-Fd-hFc(20μg/小鼠)对小鼠(45只小鼠/组)皮下(s.c.)首次免疫接种，以三周的间隔按10μg/小鼠用含有SAS的免疫原对小鼠强化两次。对照小鼠被皮下注射同样体积的PBS-SAS。最后一次免疫接种后10-12天时，分别用10LD50(50％致死剂量)的H5N1病毒的三种分支之一(即，分支0：HK/156，分支1：VN/1194和分支2.3.4：SZ/406H)来对小鼠进行鼻内攻击(15只小鼠/组)。对受感染的小鼠进行每日观察，持续21天或者直到小鼠死亡，以进行存活率检测。在攻击后第5天处死五只小鼠/组，收集肺样品，用于病毒学和组织病理学检测。免疫和病毒攻击方案如表4和图4所示。
表4重组HA融合蛋白的免疫方案，用于检测交叉保护免疫力
病毒学测试。按照之前所述(Zheng BJ et al.Proc Natl Acad Sci U S A105：8091-8096.2008)，通过Q-RT-PCR来定量肺组织中的病毒RNA。简言之，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)提取经细胞裂解的肺组织中的总RNA，并使用SuperScript II逆转录酶(Invitrogen)将其逆转录为cDNA。使用Uni12引物(AGCAAAAGC；SEQ ID NO：42)，通过Superscript RT II(Invitrogen)合成病毒cDNA。在LightCycler 480系统(Roche Applied Sciences)上使用SYBR Green I Master(Roche)进行实时PCR，其中使用靶向H5N1病毒不同毒株的基因特异性引物对(对HK/156而言，正向引物：5’-TGTCAAGAAAGGAGACTCAGC-3’[SEQ IDNO：43]，反向引物：5’-ACCATCTACCATTCCCTGC-3’[SEQ ID NO：44]；对VN/1194而言，正向引物：5’-ATACACCCTCTCACCATCGG-3’[SEQID NO：45]，反向引物：5’-ACCATCTACCATTCCCTGCC-3’[SEQ IDNO：46]；对SZ/406H而言，正向引物：5’-ATACACCCTCTCACCATCGG-3’[SEQ ID NO：47]，反向引物：5’-ACCATCTACCATTCCCTGC-3’[SEQID NO：48])。含有病毒的克隆的H1基因的pcDNA3.1质粒被用作为标准。
组织病理学分析。将被攻击的小鼠的肺组织迅速固定于10％经缓冲福尔马林中，并包埋在石蜡中。制作厚度4-6μm的切片，放置于载片上。通过H&E染色来检查H5N1病毒感染导致的组织病理学改变，并按照之前所述(Du L et al.J Immunol 180：948-956.2008；Zheng BJ et al.Proc NatlAcad Sci U S A 105：8091-8096.2008)在光学显微镜下观看。
用于评估重组HA融合蛋白针对H5N1活病毒诱导的交叉保护的实验结果显示，所有经免疫接种的小鼠都在用HK/156(分支0，图20)和SZ/406H(分支2.3.4，图22)攻击时都存活下来了，这提示这两种蛋白可完全保护小鼠抵挡H5N1病毒的不同分支的攻击。经HA1-Fd-hFc免疫接种的所有小鼠都在被VN/1194(分支1)攻击时存活下来了，而经HA1-hFc免疫接种的小鼠有大约10％没有幸免于该病毒的攻击(图21)。相反，用PBS注射的对照小鼠没有任何在HK/156、VN/1194和SZ/406HH5N1病毒的攻击下存活(图20-22)。这些结果显示，用这些融合蛋白(特别是HA1-Fd-hFc)的免疫接种能提供针对H5N1病毒感染的不同毒株的交叉-分支保护。
用于评估重组HA融合蛋白针对H5N1活病毒诱导的交叉保护的实验结果还示明，在经HA1-hFc免疫接种和经HA1-Fd-hFc免疫接种的、被VN/1194病毒攻击的小鼠中没有检测到病毒RNA，但在用PBS注射的对照小鼠中则检测到高水平的病毒RNA(8.6×108拷贝)。在分别用HK/156和SZ/406H病毒攻击后，经HA1-hFc免疫接种和经HA1-Fd-hFc免疫接种的小鼠的肺组织还展示出比PBS对照组显著更低的病毒RNA水平(P＜0.05)(图23)。图23中的数据表示为平均值±SD。
对来自经病毒攻击的小鼠的H&E染色肺组织的检查揭示，所有用PBS注射的对照小鼠都发展出了高度的组织病理学损害，包括严重的间质性肺炎和显著的炎症，其特征在于广泛性淋巴细胞浸润、上皮细胞变性、扩大的间质空隙、肺血管扩张和阻塞以及病灶出血和渗出。相反，获得HA1-hFc和HA-Fd-hFc免疫接种的小鼠在覆盖了不同分支的全部三种H5N1病毒攻击后既没有发展出肺部损伤，也没有严重的炎症，显示出与正常小鼠近似的肺部结构(图24)。这些结果提示，重组HA融合蛋白诱导的免疫力能高度遏制经免疫接种的小鼠肺部的病毒复制，这表明，HA1-hFc和HA1-Fd-hFc蛋白的免疫接种降低了病毒复制，限制了被H5N1病毒的不同毒株感染的小鼠中的肺部损害。
上述结果表明了上述被测试的候选流感疫苗发展为抵挡不同流感病毒的通用流行性感冒疫苗的潜力，提示了其预防未来流行性感冒爆发的能力。
除非另有指明，本文说明书和权利要求中表示成分的量、性质(例如分子量)、反应条件等等的所有数字应当被理解为在所有情况下都被术语“约”所修饰。因此，除非有相反指明，本说明书和所附权利要求中示出的数值参数是约数，它们可有所变动，这取决于想要通过本发明获得的期待性质。至少不并且不企图限制等同原则对权利要求范围的适用，每个数值参数应当至少考虑报道的有效数字位数以及应用平常的凑整法来解释。尽管示出本发明宽广范围的数值范围和参数是约数，但具体实施例中示出的数值是尽可能精确地被报道的。但是，任何数值固有地含有其各自测试测量中存在的标准差所必然导致的一定误差。
在描述本发明的上下文中(尤其是在所附权利要求的上下文中)使用的术语“一个/种”、“这个/种”(“a”、“an”、“the”)及相似用法应当被解释为覆盖了单数和复数，除非另有指明或上下文明显矛盾。本文中提及数值范围仅意欲用作为个别提到落在该范围内的每个单独的值的速记法。除非本文另有指明，每个个别的值也被包括进本说明书，就像它们被个别提到一样。本文描述的所有方法均可以任何合适的顺序进行，除非本文另有指明或者上下文明显矛盾。本文中提到的任何和全部例子或者示例性的语言(例如，“例如”)仅意欲用于更好地阐述本发明，而并不对要求保护的本发明的范围造成任何限制。说明书中没有任何语言将被解释为表示本发明的实践所必需的、权利要求未涉及的任何要素。
本文公开的本发明的替代性元件或实施方式的分组并不被理解为限制。每组成员可被单独提到或要求保护，或者可与该组其它成员或本文中的其它元件以任何组合方式被提到或要求保护。应考虑到，可由于方便和/或可专利性的原因，将组的一个或多个成员包括进组或从组中删除。但任何此类包括或删除发生时，本说明书应被视为含有修改过的组，由此满足用于所附权利要求中所有马库什组的书面描述。
本发明的某些实施方式在本文中被描述，包括发明人已知用于实施本发明的最佳模式。当然，对本领域普通技术人员而言，阅读前文描述后，这些描述的实施方式的变动是明显的。发明人预计，本领域技术人员能适当地利用此类变动，并且发明人意欲使得本发明按照并非本文所特意描述的方式那样被实践。因此，在适用的法律允许的情况下，本发明包括本文所附权利要求中提到的主体的所有改变和等同方式。此外，上述元件在其所有可能的变动方面的任何组合都被包括在本发明内，除非本文另有指明或上下文明显矛盾。
在权利要求中，可使用“由……构成”或“基本上由……构成”的语言对本文公开的特定实施方式加以进一步限制。当用于权利要求中时，无论是提交的或根据修改增加的，术语“由……构成”排除了权利要求中没有明确指出的任何要素、步骤或成分。术语“基本上由……构成”将权利要求的范围限制为明确指出的材料或步骤以及不会实质上影响到基本和新颖的特征的那些材料和步骤。要求保护的本发明的实施方式被固有地或明确地描述于本文中，并且能够实现。
此外，本说明书通篇中数次引用了专利和印刷的公开文本。上述参考文献和印刷的公开文本中的每篇都通过引用各自整体并入本文。
最后，应当理解，本文公开的本发明的实施方式是用于阐述本发明的宗旨的。可利用的其它改变也在本发明的范围内。因此，举例而言，而非限制，根据本文教导，可利用本发明的替代性构造。因此，本发明并不限于精确所示和所描述的那些。
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Claims (17)

1.用于诱导针对流感病毒的免疫应答的免疫原性组合物，所述组合物包含下述多肽，所述多肽包含：
免疫原；和
免疫增强剂。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述多肽还包含稳定化序列。
3.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述免疫原是所述流感病毒的血细胞凝集素序列。
4.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述免疫原是所述流感病毒的神经氨酸酶序列。
5.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述免疫原是所述流感病毒的膜蛋白序列。
6.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述免疫增强剂选自人IgG的Fc片段、C3d、Onchocerca volvulus ASP-1、clera毒素和胞壁酰肽构成的组。
7.权利要求2的免疫原性组合物，其中所述稳定化序列是折叠子或GCN4。
8.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述多肽是融合蛋白。
9.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述多肽在哺乳动物表达系统中产生。
10.权利要求3的免疫原性组合物，其中所述免疫原是选自HA1、HA2和RBD构成的组的所述血细胞凝集素序列的片段。
11.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述多肽选自HA1-Fc、HA-hFc和HA1+3-259-hFc构成的组。
12.权利要求2的免疫原性组合物，其中所述多肽选自HA1-Fd-hFc、HA-Fd-hFc、HA2-Fd-hFc、HA-RBD-Fd-hFc和HA1+3-259-Fd-hFc构成的组。
13.权利要求2的免疫原性组合物，其中所述免疫原与所述稳定化序列相连，并且其中所述稳定化序列与所述免疫增强剂在单个多肽中相连。
14.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述免疫原和所述免疫增强剂通过2，2-联吡啶-5-羧酸(BPY)以化学方式被稳定。
15.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包含佐剂。
16.诱导针对流感病毒的保护性免疫应答的方法，所述方法包括：
将权利要求1的免疫原性组合物施用给需要其的宿主；
以及，其中，所述免疫原性组合物在所述宿主中诱导针对感染性试剂攻击的保护性免疫应答。
17.根据权利要求16的方法，其中所述免疫原性组合物还包含佐剂。
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