CN101605558A

CN101605558A - 流感重组亚单位疫苗

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Publication number: CN101605558A
Application number: CNA2006800384611A
Authority: CN
Inventors: C·威克斯-勒维; D·E·克莱门茨; S·A·奥加塔
Original assignee: Hawaii Biotech Inc
Current assignee: Hawaii Biotech Inc
Priority date: 2005-08-16
Filing date: 2006-08-16
Publication date: 2009-12-16
Also published as: US20070042001A1; AU2006279323A1; CA2656705A1; AU2006279323B2; US20070042002A1; WO2007022425A3; WO2007022425A9; WO2007022425A2; US20080008725A1; EP1945250A2; EP1945250A4

Abstract

本发明提供了流感蛋白，包括亚单位蛋白和用作抵御动物模型和人体中流感传染的疫苗的免疫原性组合物，其含或不含佐剂。从转化的昆虫细胞表达重组蛋白，该昆虫细胞在其基因组中含有整合的合适表达盒的拷贝。本发明使用黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)表达系统来提供高产量的具有天然样构象的重组亚单位蛋白。

Description

流感重组亚单位疫苗

相关申请

本申请要求2005年8月16日提交的美国临时专利申请US60/708,988的权益，该在先申请的公开内容和附图在此以其整体引入作为参考。

序列表的引入

序列表文件在光盘上以ST.25格式附加于本申请并通过引用完全并入到本文中。以计算机可读形式记载的序列表信息与书面的序列表相同(按WIPO ST.25 para.39，此形式上记载的信息与书面的序列表相同)。关于所附的光盘，格式是ISO 9660；操作系统兼容性是MS-Windows；每张光盘所含的单个文件命名为“FLU.S2.ADJ.04.ST25.txt”并且是由PatentIn 3.3软件生成的文本文件；文件大小以字节计是35KB；文件生成日期是2006年8月16日。这里提交的两张光盘的内容是相同的。

发明背景

技术领域

本发明涉及设计用以抵御流感的疫苗制剂。特别是，疫苗制剂包括来源于流感病毒的重组亚单位蛋白，和任选包括一种或多种佐剂。“亚单位蛋白”在此定义为来源于完整有机体或独立于其所来源的完整有机体表达的任何蛋白。此外，亚单位蛋白可以表现为全长天然蛋白序列或全长天然蛋白序列的任何区段。此外，亚单位蛋白可以含有除全长或部分蛋白序列之外的一个或多个序列，其可以含有与初级序列来源的有机体同源或异源的序列。此定义明显宽于亚单位蛋白作为与其它蛋白分子共同装配形成多聚或低聚蛋白的单一蛋白分子的概念。本发明的亚单位蛋白通过重组DNA方法在细胞生产系统中生产并且纯化后配成疫苗。

每年估计20％的美国人口患流感。感染的那些人中大约150,000人入院治疗(Schoenbaum，Am，J，Med.(1987)82(Suppl 6A)：26-30；Simonsen等，Arch.Intern.Med.(1998)158：1923-1928)。可预测平均每年36,000人死于此疾病(Simonsen等，Am.J.Pub.Health(1997)87：1944-1950)而大范围流行年间死亡人数攀升至100,000人(Ghendon，World Health Stat Q(1992)45：306.)。1918年，近100年中最致命流行的一年，仅美国就超过500,000人死亡(Taubenberger，Avian Diseases(2003)47(Suppl 3)：789-791)。老年人(大于65岁)和幼儿最易患流感病毒的并发症(CDC，MMWR，(2001)50(RR-04)：1-63；Neuzil等，JAMA(1999)281：901-907)。1993年期间美国为流感疾病负担的费用预计是146亿美元(Kennedy，Nurse Pract.(1998)23：17-28)。

流感病毒是含有8个单链RNA区段的正粘病毒。8个区段编码以下蛋白：HA(血凝素)、NA(神经氨酸酶)、M1(基质)、M2(跨膜)、NP(核蛋白)、PB2(聚合酶)、PB1(聚合酶)、PA(聚合酶)、NEP(病毒装配)和NS1(干扰素拮抗剂)(Harper等，Clin.Med.Lab.(2002)22：863-882；Hilleman，Vaccine(2002)20：3068-3087；Cox等，Scandanavian J.of Immun.(2003)59：1-15)。病毒表面最丰富的蛋白是HA蛋白。HA蛋白负责病毒附着于宿主细胞表面含唾液酸的受体以及病毒与内体膜的融合从而释放病毒核糖核苷酸NP(RNP)复合体进入宿主细胞的细胞质中(Cox等，Scandanavian J.of Immun.(2003)59：1-15)。NA也在表面上但比HA拷贝数低。NA蛋白分解唾液酸并在病毒入侵和释放中起重要作用。M2蛋白也存在于病毒表面(97个氨基酸的蛋白中的24个氨基酸)但比HA或NA少很多。

存在三种类型的流感病毒，A、B和C(类型基于NP蛋白和M1蛋白的序列)。流感C型导致轻微呼吸疾病并且不包括在当前流感疫苗制剂中。B型病毒在人群中广泛传播并且包括在每年生产的当前流感制剂中。B型病毒没有亚型，因为它们只含有一种类型的HA蛋白和NA蛋白。另一方面，A型病毒含有多种类型的序列不同的HA蛋白和NA蛋白；并且因此基于这两种蛋白的组成，以亚型命名A型病毒。就A型病毒而言，有16种HA亚型和9种NA亚型。16种HA亚型中仅5种以及9种NA亚型中仅2种在人群中有感染性，分别是H1、H2、H3、H5、H9和N1、N2(Cox等，Scandanavian J.of Immun.(2003)59：1-15)。

流感病毒的血凝素(HA)蛋白是病毒表面最丰富的蛋白并主要负责感染时对抗病毒的体液免疫应答。因此，HA是流感亚单位疫苗中内含物的首要候选者。针对表面蛋白HA的抗体应答是保护性免疫应答中的关键组成，同时认为针对流感病毒的各种构建体蛋白及非构建体蛋白的细胞免疫应答也有助于保护。

在63名志愿者中进行临床试验以评价细胞毒素T-细胞免疫性在治疗感染个体的流感疾病中的重要性(McMichael等，Engl.J.Med.(1983)309：13-17)。在英国索尔兹伯里的医学研究理事会公共感冒组，将志愿者感染流感，并隔离和评价10天。在10天评价期中测量志愿者的细胞毒素T-细胞活性。作者得出结论：研究期间得到的数据支持细胞毒素T-细胞淋巴细胞对流感感染的恢复有影响和具有刺激T-细胞免疫性延长潜能的疫苗证明有用的假设。

已经非常确定细胞免疫为鼠模型中病毒清除的关键机制(KarzonDT，Semin Virol.(1996)7：265-271)。病毒内部蛋白如M1蛋白可用于诱发细胞免疫应答的目的。使用HA蛋白和内部流感蛋白，同时使用或不使用合适的佐剂，可以获得体液和细胞水平上的免疫应答。

如前所述，流感HA蛋白是在病毒表面发现的主要蛋白。病毒表面发现的HA是三聚体的形式。该三聚体通过三个单体每个的羧基端上的跨膜跨越序列锚定于病毒膜上。流感疫苗的主要保护功效归结于HA蛋白刺激的抗血凝素抗体；抗HA抗体抑制病毒附着于细胞(Virelizier JL，J.Immunol.(1975)115：434-439)。保护个体不受感染或不患严重疾病的病毒附着抑制依赖于接种疫苗刺激的抗血凝素滴度。流感病毒与宿主细胞的融合取决于HA分子的构建体。复制循环过程中的病毒成熟过程中，HA蛋白就在N-端与融合蛋白分裂。HAO与HA1的这种分裂和HA2对于融合的发生是必需的(Steinhauer DA，Virology(1999)258：1-20)。融合过程中另一个必要步骤是HA发生三聚作用(Danieli等，J.Cell Biol.(1996)133：559-569)。因此，此病毒处理的抑制作用非常依赖于HA分子及其三聚体的固有构象抗原决定部位和互补位与那些抗原决定部位的结合。这突出了引发针对构象相关HA蛋白的免疫应答的重要性。

HA是现有流感疫苗制剂和研发中的流感疫苗中的主要蛋白，此蛋白在疫苗中的使用受到甲型流感病毒中HA性质的混淆，这是最关注的。A型病毒随着时间经历“抗原性漂移”，同时HA中的序列发生细微变化，导致需要每年替换疫苗中更新的流感病毒株以跟上当前循环菌株的变化(美国食品药品管理局(“FDA”)每年都推荐包含于美国管理的流感疫苗中的菌株)。互相漂移的菌株含有共同的抗原性质，因此保留相同的HA亚型，然而，变化足够显著而导致抗原性质的差异。因此，FDA推荐将病毒菌株与替换的菌株一起加到当前年份的疫苗中，以与HA漂移保持一致，来提供最大限度的免疫后保护。A型病毒组成中更实质的由循环菌株重组产生的变化被称为“抗原性转变”。这些转移主要在HA基因中并导致新菌株形成。因为这些新菌株没有预先存在的免疫性，它们经常与流感流行联系在一起(Nicholson等，Lancet(2003)362：1733-1745)。抗原性转变和漂移的存在对现有疫苗技术制备流感疫苗和任何设计用来生产改进流感疫苗的新技术造成重大挑战。

美国销售的流感疫苗通常在含胚胎的鸡蛋中生产。在活性病毒灭活和病毒蛋白纯化后，灭活疫苗主要含有血凝素(“HA”)蛋白。HA结合于待感染的细胞上的唾液酸残基。HA的名称来源于蛋白附着红血球及诱导它们凝集或一起形成凝块的能力。病毒的灭活通过使用如福尔马林的试剂来完成，已知其是一种交联蛋白并损害抗原决定部位的化合物。流感生产程序(使用含胚胎的鸡蛋)本质上限制了能在每年流感季之前生产的流感疫苗的数量。另外，灭活疫苗中的杂质和疫苗所加的防腐剂会在使用这些疫苗的那些人身上导致不利的情况。

一般而言，灭活的“裂片”(用溶解病毒包膜的化学制品如Tween80分解的纯化病毒)流感疫苗制剂在人类受试者内有良好的耐药力；在注射部位的轻微疼痛是最普遍的身体不适(Margolis等，JAMA(1990)264：1139-1141；Nichol等，Arch.Intern.Med.(1996)156：1546-1550)。灭活流感疫苗的制造商警告对鸡蛋敏感的个体避免接种该产物，但是即刻的超敏性反应似乎是微弱的(James等，J.Pediatr.(1998)133：624-628)。灭活流感疫苗非常罕有与严重的不利副作用相关。Guillain-Barré综合症与流感疫苗接种相关的比率是百万分之一(Lasky等N.Engl.J.Med.(1998)339：1797-1802)。

灭活流感疫苗在防止发病率和死亡率中60％至100％有效，但是在幼儿和老年人身上观察到效率较低。另外，公众中功效降低发生在疫苗菌株与循环菌株抗原相配差的年份(Beyer等，Vaccine(2002)20：1340-1353)。

免疫系统的体液或细胞介导的分支的抑制或损伤会导致由感染剂诱导的疾病的易感性和严重性增加(例如，机会感染)。在“免疫受抑”个体中，免疫应答受到防止或削弱(例如，通过给予辐射、抗代谢物、抗淋巴细胞血清、或特异性抗体)。“无免疫应答”或“免疫缺陷”个体的免疫系统被削弱(例如，因营养失调、辐射、细胞毒素化学疗法、或如癌症或爱滋病的疾病、或因初级免疫缺陷)。理解衰老和免疫学的新进展提示老年受试者也显示出减弱的免疫应答，有时称为免疫衰老(Pawelec，Biogerontology(2003)4：167-70；Mishto等，Ageing Res.Rev.(2003)2：419-32；McElhaney，Conn.Med.(2003)67：469-74；Pawelec等，Front.Biosci.(2002)7：d1056-183；Katz等，Immunol.Res.(2004)29：113-24)。还认为老年和婴儿受试者(尤其是非哺乳期的婴儿)更易得与免疫系统受损或发育不全相关的传染疾病(例如，流感感染-Katz等，上文)。许多传染疾病对于免疫受抑、无免疫应答、免疫衰老、和非哺乳期婴儿的群体(统称为，“免疫缺陷群体”)而言特别危险，但伴随的是对减毒活病毒疫苗的返祖或突变的影响太敏感，因此是疫苗研发的重要目标听众。然而，免疫缺陷群体的成员具有一定程度的免疫损伤的事实为特别困难的免疫缺陷群体研发免疫原性和保护性疫苗形成了挑战。

流感疫苗的制造方法本质上限制了为即将到来的流感季及时制造的疫苗数量。美国的流感疫苗的两个主要供应商是Aventis

和Chiron两家公司在含胚胎的鸡蛋中生产流感病毒(每年使用9千万含胚胎的鸡蛋用来制造)。将病毒收获、灭活(分别为甲醛、和β丙内酯)、过滤和通过连续区带离心来纯化。通过HA含量来标准化所得到的产物并且所含的每种HA抗原亚型为15μg。疫苗还含有各种其它的更低且不同量的流感蛋白。灭活步骤易于损害抗原抗原决定部位，其随后需要使用更多的蛋白来提供适当的免疫应答。当前的灭活疫苗制剂无佐剂。

在BSL-3水平条件下培育病毒菌株的要求使制造全国流行流感菌株的灭活病毒疫苗进一步复杂化。另外，流感的禽系菌株对小鸡晶胚是致命的，使得需要使用反向遗传学的能用于在含胚胎的鸡蛋中制造的合适菌株的构建体(Wood，Vaccine(2002)20：B40-B44)。

关于流感疫苗，如果个体测定抗血凝素滴度≥1∶40时认为达到保护性免疫；如果滴度达到四倍增长时认为出现流感免疫菌株的血清转化。限制病毒传播所需的抗NA抗体的水平还未被定义(Ada和Jones，Curr.Topics Microbiol.Immunol.(1986)128：1-54；Aymard-Henry等，Bull WHO(1973)48：199-202；Beran等，Centr.Eur.J.Pub.Health(1998)4：269-273；Bridges等，JAMA(2000)284：1655-1663和Brydak，Influenza and its Prophylaxis(1998)1^st ed.SpringerPWN，Warsaw)。Protein Sciences(Meriden，CT)生产杆状病毒表达的HA和NA流感蛋白。已经在动物模型和人类临床试验中测试了这些蛋白并获得了有限的成功(以下讨论)。

Protein Sciences未许可使用这些蛋白的流感疫苗。杆状病毒表达系统(“BES”)有许多生物和纯化步骤的限制(Farrell等，Biotechand Bioeng.(1998)60(6)：656-663)。一个主要的制造难题是用携带待表达基因的杆状病毒感染昆虫细胞，导致感染过程中的细胞裂解。此方法为纯化提供了挑战因为昆虫细胞蛋白与表达蛋白一起被纯化并且能降解所要蛋白产物的细胞酶被释放出。

MedImmune的

是最近得到许可的活性减毒疫苗，其通过对年龄5岁至49岁之间的病人鼻部喷射来给药。此新疫苗不被许可用于“危险”群体。MedImmune为2003年流感季生产了约4百万剂量的

疫苗。此疫苗也在含胚胎的鸡蛋中培育。此疫苗是活性减毒制剂其通过鼻部喷射来被提供。除每年能制的药剂数量的限制之外，疫苗不被许可用于最需要防流感的幼年和老年群体。

抗病毒化合物用于抗流感感染；然而，它们在使用上有限制(Williams等，Kaohsiung J.Med.Sci(2002)18：421-434)。金刚胺和金刚乙胺对流感感染的预防和治疗有效；然而，它们仅对A型病毒有效。抗药病毒菌株也从使用这些化合物治疗的个体上分离出(Englund等，Clin.Infec.Dis.(1998)26：1418-1424)。这些药也有非所要求的副作用(Dolin等，N.Engl.J. Med.(1982)307：580-584)。更新的抗病毒试剂如zanamivir(鼻部喷射)和oseltamivir(口服)阻断(通过过渡状态类似物抑制)流感A和B酶NA。这些药如果预防能预防疾病和如果在感染48小时内能减少症状持续时间。zanamivir和oseltamivir副作用较少但比金刚胺和金刚乙胺贵。Oseltamivir(商标，)由Roche Holding AG销售，其建立了新的专用于生产oseltamivir的生产工厂。对全国流行流感的恐惧和政府如英国对流感治疗药品的储存部分推动了oseltamivir的需求。当然优选通过使人口免疫来减少储存流感疗法的需要。

当前生产流感疫苗的方法无疑限制了每年需要更多药剂的增长需求和改进在特定部分人口上的免疫原性和功效的增长需求。因此，非常需要改进制造流感疫苗的技术其将为流感疫苗的药剂数量的增长作准备，该流感疫苗可被快速制造及无需BSL-3水平遏制或含胚胎的鸡蛋。也需要改进疫苗的免疫原性和可能的交叉预防以有效提供对季节流行病应答和针对潜在全国流行的疫苗。

为了努力减少当前所制流感疫苗的缺点，当前正在发展一些可选的生产疫苗的方法。细胞培养基系统的使用可能是本领域最被研究的。这些系统基于可选的用来在培养中生产流感疫苗病毒菌株的细胞培养基的使用。两个主要的被试验的细胞培养系是MDCK(Palache等，Dev.Biol.Stand.(1999)98：115-125)和Vero(Halperin等，Vaccine(2002)20(7-8)：1240-1247，和Nicolson，Vaccine(2005)22：2943-2952)。用于处理在这些细胞中培养的用于疫苗的病毒的方法与用生产病毒的鸡蛋的方法相同。因此，病毒还用能损害抗原抗原决定部位的化学制剂来灭活。这些细胞培养方法的使用避免了使用含胚胎的鸡蛋的同时，有新的管理障碍(外来试剂的清除)及由于方法的相似之处还有传统生产的鸡蛋疫苗的限制。

编码HA和NP基因的DNA疫苗在鼠激发模型中被评价(Williams等，Kaohsiung J.Med.Sci.(2002)18：421-434；Kemble和Greenberg，Vaccine(2003)21：1789-1795)。用编码NP基因的DNA接种导致抵御异源流感菌株的激发(Montgomery等，DNA Cell Biol.(1993)12：777-783)。在鼠身上用编码HA的DNA接种后实现抵御异源病毒激发。用DNA接种诱导的抗体应答导致鼠的长期滴定(Ulmer等，Science(1993)259：1745-1749)。即使DNA接种的结果相当鼓舞人心，但是安全问题将继续是此接种方法的难题。

编码流感HA、M2和NP基因的DNA疫苗作为可选流感疫苗被评价。此方法显然不依赖于鸡蛋或哺乳动物细胞培养。大部分研究仅在鼠上出现鼓舞人心的结果(Montgomery等，1993；Ulmer等，Science(1993)259：1745-1749；和Williams等，Kaohsiung J. Med.Sci.(2002)18：421-434)。很难在较大动物上发现有希望的结果的报告。作为实施例，鼠上适用的M2-NP DNA在猪模型的激发后似乎加重了疾病(Heinen等，J.Gen.Virol.(2002)82(Pt 11)：2697-2707)。流感DNA疫苗存在潜能的同时，安全问题仍将继续是此接种方法的难题。

重组亚单位蛋白疫苗已被计划作为许多不同疫苗的解决方案。此技术基础也已被为流感疫苗而研究。已利用了基于大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、和哺乳动物细胞的系统。重组亚单位流感疫苗的发展是具有吸引力的选择因为排除了培育病毒的需要。已报道了许多关于动物模型上试验重组亚单位疫苗选择物的研究并且仅有一些已在人类临床试验上试验。两个主要的难题妨碍了流感重组蛋白的发展。它们不能表达天然样蛋白并且表达低表达水平。例如，HA，流感疫苗的主要组分已证明是难以表达为重组体的蛋白。已报道了在Pichia上表达膜无锚HA分子(Saelens等，Eur.J.Biochem.(1999)260(1)：166-175)。当表达的HA蛋白具有基于抗体结合并在用于使鼠免疫时导致部分保护的合适构建体时，产物实际上不完全一致。由于可变的处理，N-端是可变的，糖基化模式也是不同的。尽管陈述了Pichia表达的HA蛋白能作为疫苗选择物，但没有继续在人身上试验此成果的迹象。

杆状病毒表达系统(BES)也作为一个生产重组流感亚单位的系统被研究。早期关于使用BES表达全长HA的报告导致HA在昆虫细胞表面定位(Kuroda等，EMBO J.(1986)6：1359-1365)。关于来自BES的可溶HA表达的进一步研究被报道(Valandschoot等，Arch Virol.(1996)141：1715-1726)。关于可溶杆状病毒表达的HA如毕赤氏酵母表达的HA的报道确定了蛋白具有一些天然样特征，但大部分聚集并当在鼠模型上试验时不提供任何保护。Protein Sciences公司(PSCMeriden，CT)发展的杆状病毒表达的重组HA蛋白代表至今最先进的重组流感疫苗。PSC表达的HA表现全长分子并导致在宿主昆虫细胞上的定位。在膜提取后通过一系列步骤纯化HA。基于此方法论的H5 HA疫苗已在人类临床试验上被评价(Treanor等，Vaccine(2001)19：1732-1737)。147个健康成人被随机分配接受每次25μg、45μg或90μg的两次肌肉注射，一剂90μg再一剂10μg的两次肌肉注射，或两剂安慰剂的两次肌肉注射；间隔21天、28天或42天给药剂。疫苗不含佐剂。临床试验证明了一些接受单剂90μg(23％)或两剂90μg(52％)的个体身上达到≥1∶80的中和抗体滴度。本文作者推断疫苗免疫原性需要改进。

已报道了利用BES生产含流感蛋白的病毒样颗粒(VLP)(Latham和Galarza，J.Virol.(2001)75(13)：6154-6165)。此方法论是当前Novavax(Malvern，PA)推行的。由HA蛋白、NA蛋白和M1蛋白组成的VLP已被生产并正被发展用作疫苗(Pushko等，Vaccine(2005)23(50)：5751-5759)。VLP显示流感病毒的功能特征并在接种的Balb/c鼠的激发后显示抑制流感病毒复制。VLP用于流感疫苗接种似乎有希望的；但是作者提到制造问题，其需要被解决以发展能用于满足生产需要的可升级制造方法。

不管重组流感疫苗发展至今的进展，一个尚存的关键问题是生产高质量免疫免疫原的能力，该免疫原将增强整体血清保护免疫应答，特别在免疫缺陷群体中的老年人和其它群体身上。另外，生产系统必须发展至能生产足够的疫苗药剂，甚至临时通知的情况下，也能够覆盖需要它们的人群。

重要的是重组表达系统能生产高质量产物和高产量的所需产物。为了满足这些标准，如下定义的果蝇表达系统被发明者选来表达流感重组亚单位蛋白。此系统显示能表达保留天然样生物构建体和功能的异源蛋白(Bin等，Biochem J.(1996)313：57-64和Incardona和Rosenberry，Mol.Biol.of the Cell(1996)7：595-611)。果蝇表达系统也能生产高产量产物。有效重组表达系统的使用将最终降低每剂疫苗的成本和提高产物的商业潜力。根据发明者的知识，使用Drosophila表达系统生产流感HA蛋白和M1蛋白是新颖的。

最近，与哈佛医学院合作的工作显示果蝇表达系统能生产具有如X射线结晶研究测定的天然样构象的蛋白(Modis等，PNAS USA(2003)100：6986-6991；Modis等，Nature(2004)427(6972)313-319；和Modis等，J.Virol.(2005)79(2)：1223-1231)。除了生产高质量抗原之外，发明者已改进了虑及不损害蛋白质量的纯化蛋白的纯化方法。高质量果蝇S2-细胞表达抗原的使用意味着：1)需要更少的蛋白来产生增强的免疫应答，2)提高了免疫应答的质量，和3)改进了亚单位疫苗的功效。

显然需要新技术能用于快速应答流感爆发和全国流行，用于为所有人口(包括免疫缺陷群体)生产高质安全疫苗的有效药剂，和用于生产具有增加的免疫原性和功效的改进疫苗制剂。一些有待解决的技术问题是工程化用于免疫和保护性抗原决定部位的核苷酸序列，通过能扩大至商业生产的方法表达和纯化由核苷酸序列编码的亚单位蛋白，和测定哪些佐剂(如果有的话)应包括在含有亚单位蛋白的疫苗制剂中。本文公开的发明满足发展新流感疫苗生产方法的需要和解决有关的技术问题。

发明概述

本发明提供了重组流感亚单位蛋白和免疫原性组合物，该组合物可用作抵御动物模型和人体中流感的疫苗。从稳定转化的昆虫细胞表达本发明的重组亚单位蛋白，该昆虫细胞在其基因组中含有整合的合适表达盒的拷贝。昆虫细胞表达系统提供高产量的具有天然样构象的重组亚单位蛋白。本发明的重组亚单位蛋白表示全长或截断形式的天然流感蛋白。此外，已经产生了一些重组亚单位蛋白的多聚体形式。特别地，亚单位来自流感的HA蛋白和M1蛋白。更特别地，从转化昆虫细胞中分泌出亚单位蛋白，然后在除去宿主细胞后从培养基中纯化。避免通过病毒手段或物理手段溶解宿主细胞而简化了纯化，提高了产量，和避免了目标蛋白的潜在降解。

本发明还提供了使用佐剂作为与纯化蛋白相容的免疫原性组合物的组分以增强接种产生的免疫应答。一种或多种优选的佐剂选自皂角苷(如GP-0100)，或其衍生物，单独的乳剂或结合碳水化合物或皂角苷，和铝基佐剂(共同地，“矾”或“矾基佐剂”)，如氢氧化铝、磷酸铝、或其混合物。氢氧化铝(商标为“Alhydrogel”)用作实施例中的矾。皂角苷是任何有皂化反应能被消化产生糖和皂苷配基糖苷配基的植物糖苷。皂苷配基是皂角苷中的无糖部分。它通常通过水解获得，它具有复合萜类化合物或构建类固醇激素合成可行起点的类固醇构建体。发明的皂角苷可以是上述的任何皂角苷或具有疏水区段的类皂角苷衍生物，特别是强极性皂角苷，主要是极性三萜类皂角苷例如极性酸性bisdesmoside，例如来自Quillsjabark Araloside A、Chikosetsusaponin IV、Calendula-Glycoside C、ChikosetsusaponinV、Achyranthes-Saponin B、Calendula-Glycoside A、Araloside B、Araloside C、Putranjia-Saponin III、Bersamasaponiside、Putrajia-Saponin IV、Trichoside A、Trichoside B、Saponaside A、Trichoside C、Gypsoside、Nutanoside、Dianthoside C、SaponasideD的皂角苷提取物，来自七页树属马栗的七叶皂甙或来自Gyposophilla struthium的sapoalbin，优选皂角苷提取物皂树(Quillaja saponaria)Molina和Quil A。另外，皂角苷可以包括如美国专利US5,679,354所述的来自具有8-11个糖类部分的βAmytin型皂树(Quillaja saponaria)Molina的糖基化三萜类皂角苷。本文定义的皂角苷包括可与其它材料结合的皂角苷，例如在美国专利US5,679,354所述的类免疫激发复合体(“ISCOM”)构建体中。皂角苷也包括来自上述任一构建体的类皂角苷分子，例如GPI-0100，例如美国专利US6,262,029所述的。优选，本发明的皂角苷是来自皂树(Quillaia saponaria)树皮的中极两性天然产物。优选，它们由平均分子重量(M_w)为2000的三萜类糖苷混合物组成。发明的特别优选实施方案是此混合物的纯化级分。

本发明进一步提供了在哺乳动物宿主中利用疫苗诱导产生抵御各种类型及亚型流感病毒的抗体的方法，作为抵御流感的手段。疫苗制剂与其它制剂相比显示导致很强的全面抗体滴度，及很强的血凝素-抑制抗体滴度。此外，疫苗制剂在鼠模型上显示提供抵御流感激发的保护。相比常规生产的流感免疫原，通过本发明生产的蛋白具有增强的免疫原性和功效、生产成本更低并具有更短的生产周期。

附图说明

图1.抗原激发的脾细胞的淋巴细胞增殖。

图2.抗原激发的脾细胞的IFN-γ产量。

图3.抗原激发的脾细胞的IL-5产量。

图4.H5 HA ELISA抗体滴度。

图5.H3 HA ELISA抗体滴度。

发明详述

本发明提供了用合适的表达质粒转化的稳定昆虫细胞系中生产和分泌出来的流感重组亚单位蛋白。将含或不含佐剂的重组蛋白单独使用或一起结合使用以致于它们有效诱导能抑制体外测定中血凝反应的强抗体应答。此抗体应答是体内抵御流感感染的表现。当结合使用时，除了诱导相关抗体应答外，重组蛋白也诱导细胞免疫应答，其进一步增强疫苗制剂的功效。合适抗原的使用，含或不含佐剂或佐剂组合物，能被用于诱导特定的免疫应答，其导致能抵御流感的抗体。

本发明的优选实施方案中，在利用昆虫细胞的真核表达系统中生产重组流感亚单位蛋白，其是本文所述疫苗制剂的组分。昆虫细胞是可选的真核表达系统，其能在提供简单并相对价廉的培育条件的同时提供表达适当折叠的及翻译后的改良蛋白。多数昆虫细胞表达系统基于来自杆状病毒的载体的使用，以驱动重组蛋白的表达。使用来自杆状病毒的载体的表达不是基于使用稳定的表达细胞系。而是这些系统依赖于每次生产循环的宿主细胞的感染。结果，所需产物通过杆状病毒载体的超表达也导致病毒产生，其导致宿主细胞的溶解。基于通过整合表达盒进宿主细胞基因组中产生稳定细胞系的表达系统能用于多代所需产物的表达。此提供了给定产物生产中更高水平的一致性。黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)表达系统(“果蝇表达系统”或“果蝇系统”)(Johansen，H.等，Genes Dev.(1989)3：882-889；Ivey-Hoyle，M.，Curr.Opin.Biotechnol.(1991)2：704-707；Culp，J.S.，等，Biotechnology(NY)(1991)9：173-177)是基于用于重组蛋白表达的稳定转化细胞系的生成。此昆虫细胞表达系统显示出从不同来源成功生产出多种蛋白。最重要的是，此表达系统中生产的重组蛋白显示保留相应天然蛋白的构建体和功能特征。在果蝇表达系统中成功表达的蛋白实例包括HIV gp120(Culp，J.S.，等，Biotechnology(NY)(1991)9：173-177；Ivey-Hoyle，M.，Curr.Opin.Biotechnol.(1991)2：704-707，人多巴胺β-水解酶(Bin等，Biochem J.(1996)313：57-64)，人血管细胞粘附蛋白(Bernard等，Cytotechnology(1994)15：139-144)，和登革热包膜糖蛋白(Modis等，PNAS USA(2003)100：6986-6991；Modis等，Nature(2004)427(6972)313-319；和Modis等，J.Virol.(2005)79(2)：1223-1231；，和Zhang等，Structure(2005)12(9)：1607-1618)。HBI也测定到果蝇表达系统产生的亚单位蛋白产生较优的免疫原材料。例如，可比较的果蝇-表达的登革热E蛋白和毕赤氏酵母-表达的登革热E蛋白的蚀斑减少中和滴度(PRNT₈₀)比较显示两个系统分别在1∶400-1∶1600和＜1∶10-1∶80的范围，对于免疫使用了等剂量。这些实施例中，果蝇表达蛋白的表达水平均高于所用其它系统表达的等同蛋白，更重要的是，基于功能和/或构建体研究表达的果蝇产物质量较高。

更优选的实施方案中，用作表达流感重组亚单位蛋白的宿主细胞的昆虫细胞是黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)S2细胞系或来源于黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)S2细胞系(Schneider，J.Embryol.Exp.Morph.(1972)27：353-365)。

与其它用于表达在流感疫苗制剂中使用的亚单位的异源表达系统相反，果蝇表达系统提供了稳定持续的昆虫细胞培养系统，其能生产大量的保持相关免疫性质的天然样亚单位蛋白。

尽管果蝇表达系统能生产构建体和免疫相关的蛋白，但不是所有表达异源蛋白或蛋白截断形式的尝试都是成功的。因此，需要系统评价来测定在S2细胞表达系统中表达特定异源蛋白亚单位的能力。不能在S2细胞系统中充分表达的蛋白及其亚单位的实例包括登革热蛋白和肝炎C NS3蛋白，全长登革热NS1蛋白的截断形式，全长登革热E蛋白的特定截断形式，全长疟疾LSA-1蛋白的截断形式，和MSP-1蛋白的疟疾p19亚单位。

另外，为了疫苗的最佳功效，将用于疫苗制剂的特定蛋白接受合适佐剂和给药方式的选择。例如，alhydrogel在许多情况下激发不错的Th2应答。但是，Th1应答需要使用如GPI-0100的佐剂。这两种佐剂的结合也导致另一种依赖于所用疫苗抗原的免疫应答。经皮下途径的接种能用于一些疫苗，同时肌内途径好于其它。

本发明的焦点集中在两种特定的甲型流感亚型上，H3N2和H5N1。为了用于H3N2亚型，A/Fujian/411/02流感菌株用作HA基因的来源。为了用于H5N1亚型，使用A/Hong Kong/156/97和A/Indonesia/5/05两种菌株。A/Hong Kong/156/97菌株用作HA和M1的来源，同时A/Indonesia/5/05仅用于HA序列。编码这些特定流感菌株及多数其它菌株的不同蛋白的核苷酸序列在GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)和ISD(www.flu.lanl.gov)数据库中可用。用于装配和表达上述流感亚单位的相同方法能延伸至所有甲型流感亚型和菌株。

本发明中，通过可操作地将这样蛋白的编码序列与分泌信号序列连接以致表达产物分泌至培养基中来评价从果蝇S2细胞表达和分泌流感亚单位蛋白HA和M1。为了表达和分泌HA和M1，利用tPA(组织血纤维蛋白溶酶原催化剂)分泌信号。所有编码所述流感亚单位蛋白的核苷酸序列合成制得(DNA2.0，Menlo Park，CA)并来源于GenBank和ISD数据库中可用的序列。编码流感亚单位蛋白的特定合成DNA序列也是昆虫细胞中表达的最佳化密码子。利用标准重组DNA方法将编码本文所述序列的亚单位蛋白克隆至处于果蝇MtnA(金属硫蛋白)启动子控制下的果蝇表达质粒中。然后将含有克隆流感序列的果蝇表达质粒用于转化果蝇S2细胞。

优选实施方案中，在C-端截断HA蛋白以除去膜跨越区段，来允许可溶亚蛋白的分泌。可溶膜少锚亚单位指的是HA胞外域(跨膜锚定蛋白的表面暴露区段)。截断并分泌的HA亚单位被设计成保留病毒表面呈现的膜锚定HA的暴露部分的天然样特征，并且能在加进疫苗制剂时诱导强免疫应答。HA胞外域含所有的HA1区段和约三分之二的HA2区段(截断在HA2区段)。特别地，在全长序列(包括分泌信号)的氨基酸Gly₅₂₀截断H3 HA蛋白，在全长序列(包括分泌信号)的氨基酸Gly₅₂₁截断H5 HA蛋白。H3 HA蛋白情况下，在氨基酸Gly₅₂₀被截断的C-端部分；H5 HA蛋白情况下，在氨基酸Gly₅₂₁被截断的C-端部分；本文被称为“标称(nominal)胞外域”。截断点可改变高达标称胞外域长度的10％，只要这种变化不影响保留可溶HA亚单位蛋白的抗原决定部位的构象(胞外域)。为了表达，除去天然分泌信号序列，因为将表达质粒提供的异源分泌信号(tPA)用于指导流感亚单位的分泌。表达的H3 HA胞外域蛋白序列是SEQ ID NO：1，表达的H5 HA HongKong胞外域蛋白序列和H5 HA Indonesia胞外域蛋白序列分别是SEQID NO：2和SEQ ID NO：3。HA胞外域亚单位通过其所来源的HA亚型命名后缀HA-Ecto，例如H3 HA-Ecto。

可替换的实施方案中，如下描述了由HA分子进一步截断构建的HA亚基的表达，即截断比HA序列N-端的胞外域和区段除去的除去了更多的C-端。这些HA的进一步截断设计成表达HA亚单位，其导致在免疫作用上对HA分子天然暴露表面更强的免疫应答。这种胞外域的进一步截断通过除去全部HA2区段(代表约三分之一的全长HA蛋白的C-端区段)和HA N-端区段的小区段来产生。N-端和C-端截断的亚单位包围HA区段被称为球形头部，并因而指代HA-头部。C-端截断对于所有“头部”亚单位是在不变的点。特别地，“头部”亚单位对于H3HA-头部在Arg₃₂₉被截断，对于H5 HA-头部在Arg₃₂₆被截断(为此目的的氨基酸数目基于成熟的HA蛋白并不包括分泌信号)。H3 HA-头部和H5 HA-头部的特定N-端截断和C-端截断本文被称为“标称HA-头部”。N-端和C-端的截断点可以改变高达标称HA-头部长度的10％，只要这种变化不影响残余可溶HA-头部上抗原决定部位的构象。“头部”亚单位通过N-端截断位置来辨别。例如，名为“H3 HA-A19-头部”的亚单位来源于H3亚型并在Ala₁₉(A19)N-端截断。此外，编号基于成熟的HA蛋白。H3和H5表达的HA-头部序列分别显示在附录A的列1和2，相对于相应的HA胞外域序列。附录A通过引用被结合到本文中。H3 HA-A19-头部的氨基酸序列是SEQ ID NO：4。H3 HA-G49-头部的氨基酸序列是SEQ ID NO：5。H5HA-A9-头部的氨基酸序列是SEQ ID NO：6。H5 HA-G39-头部的氨基酸序列是SEQ ID NO：7。

更优选的实施方案中，多聚体形式的HA被表达。类似上述HA胞外域的HA序列通过36个残基的氨基酸序列与HA胞外域序列的C-端融合来进一步改变。该分泌的融合HA亚单位形成三聚分子，显示保留HA蛋白的天然样特征如位于病毒表面并能在加进疫苗制剂时诱导强免疫应答。36个残基氨基酸序列的29个氨基酸来源于抗菌素T4fibritin蛋白序列其被称为“foldon”序列(另外的7个氨基酸作为HA序列和foldon序列之间的间隔)。foldon序列，其位于fibritin蛋白的C-端，必然通过非共价结合集合fibritin的三个单体形成三聚体分子。“HA foldons”通过胞外域的C-端(H3为Gly₅₂₀，H5为Gly₅₂₁)与含36个氨基酸foldon的序列融合来构建。此HA胞外域与foldon序列的融合的表达导致产生可溶共价连接的三聚体HA亚单位。HA foldons通过所来源的HA亚型命名后缀“HA-foldon”，例如“H5HA-foldon”。H3 HA-foldon和H5 HA-foldon共同被称为“HA-foldons”，单独被称为“HA-foldon”。表达H3-foldon亚单位和H5-foldon亚单位的蛋白序列分别如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。

优选实施方案中，表达了表示全长天然M1蛋白的H5N1 M1亚单位。氨基酸1至252编码M1蛋白。表达的M1蛋白序列为SEQ ID NO：10所示。SEQ ID NO：1至10的氨基酸序列可以具有高达10％的残基取代，只要这种取代不影响抗原决定部位构象。

稳定转化的S2细胞系表达分泌的流感重组亚单位蛋白，如下所述并用于优选的疫苗制剂，通过如下所述的多种方法首先纯化。优选的纯化方法生产保留天然构象的蛋白。

优选的实施方案中，加入本文所述果蝇-表达的流感重组亚单位蛋白的疫苗制剂，含或不含一种或多种佐剂，提高强免疫应答。这种疫苗制剂的使用诱导强血凝素抗体滴度，例如，≥1∶40。这种疫苗制剂特别能诱导高血凝素抗体滴定得到其它重组表达流感蛋白不诱导有效免疫应答的事实的支持。此外，疫苗制剂能抵御鼠模型上流感激发。更多的描述单独组分特征及此疫苗制剂显著功效的细节如下。

另一个实施方案，疫苗制剂特征在于使用低剂量能诱导特定有效免疫应答的重组亚单位蛋白。低剂量定义为15μg或更少的重组蛋白。此与其它需要更高剂量达到适度免疫应答的流感重组亚单位蛋白形成对照。

因而，本发明涉及并提供作为防止或削弱流感病毒感染手段的疫苗制剂。如本文所用的，疫苗据说是防止或削弱疾病如果它对个体的给药导致个体对疾病的完全或部分免疫，即对疾病症状的完全或部分抑制。

为了使受试者对流感免疫，含一种或多种亚单位的疫苗制剂通过常规免疫方案，通常不局限于疫苗的多样给药，来给受试者给药。发明免疫原组合物在多样给药中的使用可能导致抗体水平的提高和免疫受试者表达的免疫球蛋白所有组分的多样性。

免疫原组合物的给药典型的是通过注射，如肌肉或皮下；然而其它给药的全身方式也可使用。

根据本发明，免疫原组合物的“有效剂量”是足够达到所需生物效应。通常，所需提供组合物有效量的剂量根据这样的因素如受试者年龄、基因背景、环境和性别而变化。发明的免疫原制备能通过有效量的单一剂量或复合剂量来执行。发明组合物的有效量可在每剂1-100μg之间变化，更优选在每剂1-15μg之间。

尽管上面的描述和下面的实施例主要涉及来自A型亚型H3N2和H5N1的流感亚单位HA和M1的表达，但是方法和疫苗制剂能延伸至其它A型亚型和B型流感和C型流感。

实施例

下面的实施例说明了利用稳定转化的昆虫细胞系的流感亚单位蛋白HA蛋白和M1蛋白的有效表达。为了这些实施例的目的，利用果蝇表达系统。也说明了表达重组亚单位蛋白的纯化。

实施例进一步说明了果蝇表达重组蛋白用作免疫原时导致加强的生物相关的免疫应答。显示的结果表明来自天然流感蛋白HA和M1的单独流感亚单位蛋白或这些相同亚单位蛋白的各种组合能增强抵御鼠模型上的激发。因而，来自稳定转化昆虫细胞的重组表达HA蛋白和M1蛋白的利用导致较好的免疫原组合物和满足上述技术问题的需要和解决。

实施例1

来自H5N1和H3N2亚型的流感HA胞外域的表达和纯化

一系列为培养的果蝇细胞中异源重组目标蛋白的表达和选择设计的表达质粒用于所述工作。关于表达质粒制备的细节，参见美国专利US5,550,043、US5,681,713、US5,705,359、和US6,046,025，其内容通过引用结合到本文中。特别地，用于此工作的两个质粒是pMttbns和pCoHygro。pMttbns表达载体含有以下因子：果蝇金属硫蛋白启动子(Mtn)、人组织血纤维蛋白溶酶原催化剂(tPA)单序列、和SV40早期聚腺苷酸化信号(Culp等，Biotechnology(1991)9：173-177)。pCoHygro质粒提供了潮霉素的可选标记(Van der Straten，Methodsin Mol.and Cell Biol.(1989)1：1-8)。潮霉素基因在果蝇COPIA转座因子长端重复序列的转录控制下。通过去除含外部Xho I位点的15个碱基对BamHI区段来改变pMttbns载体。此改进的载体，称为pMttΔXho，允许利用Bgl II和Xho I特别位点的插入区段的直接克隆。关于表达质粒制备和在果蝇表达系统中使用的细节，参见普通转让的美国专利US6,165,477、US6,416,763、US6,432,411、和US6,749,857，其内容通过引用结合到本文中。除非本文另外定义的，这种普通转让专利中所用的和关于果蝇表达系统的术语定义适用本文。这种普通转让专利中克隆进质粒的DNA序列当然区别于本文公开的克隆流感序列，并被其取代。

果蝇表达系统被报道表达高水平适当折叠的蛋白(Culp等Biotechnology(1991)9：173-177，Bernard等Cytotechnology(1994)15：139-144，Bin等Biochem J.(1996)313：57-64，Incardona和Rosenberry，Mol.Biol.of the Cell(1996)7：595-611)。基于果蝇金属硫蛋白(Mtn)启动子的表达载体提供了异源蛋白的调节表达(Van der Straten，Methods in Mol.and CellBiol.(1989)1：1-8)，Johansen，H.等，Genes Dev.(1989)3：882-889；，和Culp等Biotechnology(1991)9：173-177)。利用Mtn表达质粒的果蝇表达系统的使用允许能有效保留并且能表达高产高质蛋白的稳定转化体的生成。通过加入硫酸铜诱导表达。

编码流感亚单位蛋白的果蝇表达质粒通过在果蝇表达载体pMttΔXho中插入合适基因的确定区段来构建。流感基因的合适区段通过基因合成生成(DNA2.0，Menlo Park，CA)。除了所关心合适基因的合成，基因也是昆虫细胞中最佳表达的密码子。合成基因也包括为了与必需控制因子一起克隆的合适限制性内切核酸酶切割位点，例如终止密码子。合成的流感基因克隆进用Bgl II和Xho I消化的pMttΔXho载体。克隆进pMttΔXho的Bgl II位点导致4个氨基酸Gly-Ala-Arg-Ser因与tPA分泌信号序列的融合而加入表达蛋白的氨基端。对所有构建体进行测序以证实被引入的多种组分是正确的并且合适读框被保留。

从ATCC获得的果蝇S2细胞(Schneider，J.Embryol.Exp.Morph.(1972)27：353-365)用于S2系统。使细胞适应于在Excell 420培养基(JRH Biosciences，Lenexa，KS)中生长并且本文所述的所有步骤和培养均在Excell 420培养基中。细胞培养的第5天和第7天之间传代并且典型地以1x10⁶个细胞/ml的密度接种表达质粒并在26℃下培育。含编码流感亚单位蛋白序列的表达质粒通过磷酸钙方法转化进S2细胞中。为了用潮霉素B选择，细胞与pCoHygro质粒以20μg表达质粒比1μg pCoHygro的比率共同转化。转化后，耐潮霉素的细胞，0.3mg/ml，被选择。一旦稳定的细胞系被选择，就将它们用来评价合适产物的表达。培养基的5毫升等份试样被以2x10⁶个选择的细胞/ml接种，用0.2mM CuSO₄诱导，在26℃下培育7天。培养物用来评价细胞相关的区段和培养基中亚单位蛋白的表达。蛋白通过SDS-PAGE分离并用考马斯蓝着色或着色到硝化纤维上。被表达的给定目标蛋白的特定抗体用于探测蛋白质印迹。通过SDS-PAGE凝胶的考马斯着色在果蝇培养物中易检测到1mg/L或更高的表达水平。为了生产更大量的产物，转化的果蝇S2细胞作为悬浮培养物在旋转烧瓶或生物反应器中培育。

H3N2菌株A/Fujian/411/02的全长HA基因(HAO)编码566个氨基酸残基的蛋白。特别地，所用序列来自登录号ISDN38157(ISD，www.flu.lanl.gov)的核苷酸序列。非截断蛋白序列在N-端和C-端膜锚处含有16个氨基酸分泌信号序列。为了表达可溶H3 HA胞外域(H3HA-Ecto)，N-和C-截断的分子被表达其在全长蛋白的Gln₁₇至Gly₅₂₆序列(HA2的残基175，似X31晶体构建体的C-端，Wilson等Nature(1981)289：366-373)中。

含(“装载”)H3 HA-Ecto亚单位蛋白合成基因的pMttΔXho表达质粒用于转化S2细胞。在选择稳定细胞系上，细胞被筛选用来表达分泌形式的H3 HA-Ecto蛋白。所述H3 HA-Ecto亚单位的表达导致预料分子重量的均一产物。分泌的H3 HA-Ecto的糖基化模式是均一的因为用PNGase处理导致与7个糖基化位点存在符合的改变。分泌到S2细胞培养基中的H3 HA-Ecto目标蛋白的表达水平估计在30μg/ml至40μg/ml之间。

A/Hong Kong/156/97(H5N1)菌株的全长HA基因(HA0)编码568个氨基酸残基的蛋白。特别地，所用序列来自登录号AF046088(Genbank，www.ncbi.nlm.nih.gov)的核苷酸序列。HA0蛋白序列在N-端和C-端膜锚处含有16个氨基酸分泌信号序列。为了表达可溶H5HA分子(胞外域)，N-和C-截断的分子被表达其在全长蛋白的Asp₁₇至Gly₅₂₁序列(HA2的残基175，似X31晶体构建体的C-端，Wilson等.Nature(1981)289：366-367)中。A/Hong Kong/156/97(H5N1)菌株的HA在HA1/HA2接点含有一段6个碱性氨基酸残基其编码弗林蛋白酶切割位点。在S2细胞表达时分裂该位点。

含(“装载”)H5 HA-Ecto亚单位蛋白合成基因的pMttΔXho表达质粒用于转化S2细胞。在选择稳定细胞系上，细胞被筛选用来表达分泌形式的H5HA-Ecto蛋白。所述H5 HA-Ecto亚单位的表达在非还原条件下导致由许多条带(+或-10kD)组成的产物，这些条带预料的分子重量范围内。因为分泌的H5 HA-Ecto的糖基化模式似乎基于用PNGase在还原条件下处理导致与5个糖基化位点存在符合的改变而均一。因此，表达的多带模式似乎是分子折叠变化的结果。分泌到S2细胞培养基中的H5 HA-Ecto目标蛋白的表达水平估计为约5μg/ml。

两个H5N1菌株的HA蛋白在编码弗林蛋白酶切割位点的HA1/HA2接点含有碱性氨基酸残基链。在S2细胞中表达时分裂该位点。H5HA-Ecto的可选形式也被表达。这些可选形式通过在弗林蛋白酶切割位点形成突变其阻止表达上H5 HA-Ecto亚单位的蛋白酶切割来制得。含有弗林蛋白酶切割位点(Arg-Lys-Lys-Arg)的八个氨基酸序列，HongKong菌株的Arg₃₃₉-Glu-Arg-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg和Indonesia菌株的Arg₃₃₉-Glu-Arg-Ser-Arg-Lys-Lys-Arg，除去并由4个氨基酸序列Lys-Gln-Thr-Arg替换。这些H5 HA胞外域的变化形式分别称为H5-HK-HA-Ecto-mut和H5-Indo-HA-Ecto-mut。

含H5 HA-Ecto-mut亚单位合成基因的pMttΔXho表达质粒用于转化S2细胞。在选择稳定细胞系上，筛选细胞用来表达分泌形式的H5HA-Ecto-mut蛋白。H5 HA-Ecto-mut亚单位的表达导致比H5 HA-Ecto亚单位更均一的保护。分泌到S2培养物培养基中的H5-HK-HA Ecto和H5-Indo-HA Ecto蛋白的表达水平估计分别为5μg/ml至10μg/ml和10μg/ml至15μg/ml。H5 HA-Ecto、H3 HA-Ecto和其衍生物(不受限地包括H5-HK-HA-Ecto-mut和H5-Indo-HA-Ecto-mut)共同被称为“血凝素胞外域蛋白亚单位群”和单独被称为“血凝素胞外域蛋白亚单位”。

标准层析方法用于分离来自S2培养物上清液的分泌的重组流感HA亚单位蛋白。为了生产用于治疗人的材料，创造能被可行测量和用作当前良好生产规范(“cGMP”)生产工艺的方法的需要影响了方法发展成果。基于发明者以前免疫亲和层析(“IAC”)的成功，此方法是发明者发展成果的主要焦点。如本领域所知，选择用于纯化的抗体的重要标准是相关杂交瘤或其抗体的有效性，大批有效，其限制了能用来评价IAC中使用的试剂。

非免疫亲和纯化方法如Vanlandschoot等的方法(Arch.Virol.(1996)141：1715-1726)，其最初用于纯化作为草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)-9(Sf9)细胞分泌产物表达的A/Victoria/3/75(H3N2)HA，也用来评价来自S2培养物上清液的分泌的流感HA-Ecto亚单位的纯化。关于H3 HA-Ecto亚单位，两步纯化方法被发展。大批收获被用缓冲液A(20mM磷酸钠，pH 7.0)稀释三分之一，再装入SP-凝胶(GE Healthcare，Piscataway，NJ)柱中，其随后用冲洗缓冲液B(50mM磷酸钠，pH 7.0)冲洗直至达到基线吸光度。被结合的H3 HA-Ecto被用含0.5M NaCl的缓冲液B洗脱。从SP-凝胶洗脱的产物再用缓冲液C(0.1M磷酸钠，pH 7.0)稀释二分之一，再装入陶瓷羟磷灰石层析柱(CHT；Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，其再用缓冲液C冲洗直至达到基线吸光度。被结合的H3 HA胞外域被用pH 7.0的0.5M磷酸钠洗脱。产物为鉴定而被浓缩及通过超滤来缓冲交换。

H5 HA-Ecto和H5 HA-Ecto-mut亚单位通过三步层析法来纯化。用缓冲液A(25mM Tris-HCl，pH 8.8，+0.05％tween-20)将稀释大批收获物稀释四分之一，再装载至CHT柱上，其随后用缓冲液A冲洗直至达到基线吸光度。被结合的H5 HA-Ecto被用pH 7.45，+0.05％tween-20的50mM磷酸钠洗脱。洗脱产物装入用缓冲液A平衡的Q-凝胶(GE Healthcare，Piscataway，NJ)柱中。柱用缓冲液A冲洗，再用含50mM NaCl的缓冲液A冲洗。被结合的H5 HA-Ecto被用含1MNaCl的缓冲液A冲洗。Q-凝胶产物通过大小排阻层析在SephacrylS-100柱(1.5x 95.5cm)上进一步分馏，使用pH 7.2的11mM磷酸缓冲盐(140mM NaCl)作为柱缓冲液。含H5 HA-Ecto的级分为鉴定而汇集和浓缩。

实施例2

来自H3N2和H5N1亚型的流感HA“头部”的表达和纯化

为了表达能引起更强免疫应答的可溶形式HA，实施例1所述的胞外域亚单位在N-端和C-端进一步被截断。N-端和C-端被截断的亚单位包围HA区段被称为球形头部，并因此被称为HA-头部。对于所有“头部”亚单位，C-端截断是恒定点。特别地，对于H3 HA-头部，“头部”亚单位在Arg₃₂₉被截断；对于H5 HA-头部，“头部”亚单位在Arg₃₂₆被截断(为此目的的氨基酸数目基于不包括分泌信号的成熟HA蛋白，与实施例1中编号基于含分泌信号的全长序列相反)。两个N-端截断为H3-头部和H5-头部制得。当两个亚型间截断的编号不相配时，截断是基于蛋白序列排列的等份量。第一个N-端截断在Ala残基，H5在Ala₉和H3在Ala₁₉获得。第二个N-端截断在Gly残基，H5在Gly₃₉和H3在Gly₄₉获得。“头部”亚单位通过N-端截断的位置指明，特别关于上述截断，亚单位被称为H5 HA-A9-头部、H5 HA-G39、H3 HA-A19-头部、和H3-HA-G49-头部。

用于克隆、转化、表达和鉴定HA-头部亚单位的方法与实施例1所述方法相同。在选择稳定细胞系上，细胞被筛选用来表达分泌形式的HA-头部。所述HA-头部亚单位的表达对于H5来源的头部导致预期分子重量的均一产物而H3来源的头部的表达导致预期分子重量(+或-10kD)范围内的多电泳带。分泌到S2培养物培养基中的H3 HA-头部和H5 HA-头部的表达水平分别为约5μg/ml和约20μg/ml。

H5 HA-头部的纯化通过非免疫亲和纯化方法来完成。大批收获被用缓冲液A(20mM磷酸钠，pH 6.2)稀释三分之一，再装入CHT柱中，其用缓冲液A冲洗直至达到基线吸光度。流经中未结合的材料，其含H5 HA-头部，被直接装入SP-凝胶柱中，其用缓冲液A冲洗直至达到基线吸光度。结合的H5 HA-头部被用含0.1M NaCl的缓冲液A洗脱。洗脱产物再通过大小排阻层析在Sephacryl S-100(GE Healthcare，Piscataway，NJ)柱(1.5x 95.5cm)上磨光，使用pH 7.2的11mM磷酸缓冲盐(140mM NaCl)作为柱缓冲液。含H5 HA-头部的级分为鉴定而汇集和浓缩。

实施例3

来自H3N2和H5N1亚型的流感HA“foldons”的表达和纯化

为了表达天然样三聚体形式组成的可溶多聚体形式的HA，36个氨基酸序列融合于实施例1所述HA-Ecto亚单位的C-端。融合于HA-Ecto亚单位的36个氨基酸序列中29个氨基酸来自抗菌素T4 fibritin蛋白序列其称为“foldon”序列(另外的7个氨基酸作为HA序列和foldon序列之间的间隔)。foldon序列，其位于fibritin蛋白的C-端，必然通过非共价结合集合fibritin的三个单体形成三聚体分子。HAfoldons通过胞外域的C-端(H3为Gly₅₂₀，H5为Gly₅₂₁)与含36个氨基酸foldon的序列融合来构建。此HA胞外域与foldon序列的融合的表达导致产生可溶非共价连接的三聚体HA亚单位。HA foldon通过所来源的HA亚型命名后缀HA-foldon，例如“H5 HA-foldon”。

用于克隆、转化、表达和鉴定HA-foldon亚单位的方法与实施例1所述方法相同。在选择稳定细胞系上，细胞被筛选用来表达分泌形式的HA-foldons。所述HA-foldon亚单位的表达导致预期分子重量的均一产物。分泌到S2培养物培养基中的H3 HA-foldon和H5 HA-foldon的表达水平分别估计为10μg/ml和15μg/ml。

H3 HA-foldon使用两步层析法来纯化。大批收获被用缓冲液A(20mM Tris-HCl，pH 8.0)稀释四分之一，再装入用缓冲液A平衡的Q-凝胶柱中。柱再用缓冲液B(20mM Tris-HCl，pH 5.0)冲洗直至达到基线吸光度。被结合的材料通过用含0.125M NaCl和1M NaCl的缓冲液B冲洗柱来洗脱。含H3 HA-foldon的0.125M NaCl级分用缓冲液B稀释二分之一再装入用缓冲液B平衡的SP-凝胶柱中。柱用含0.35MNaCl的缓冲液B冲洗直至达到基线吸光度。被结合的材料通过用含0.6M NaCl和1M NaCl的缓冲液B冲洗柱来洗脱。H3 HA-foldon在0.6MNaCl级分中被洗脱并随后为鉴定而被缓冲交换和超滤浓缩。

至于其它蛋白，IAC是H5 HA foldon的优选纯化方法。因为目前没有合适的抗体可用，目前用于纯化H5 HA foldon的方法是基于为纯化H5 HA胞外域和H3 HA foldon而发展的方法其利用Q-凝胶、SP-凝胶、和CHT层析基质。

实施例4

来自H5N1亚型的流感M1的表达和纯化

来自H5N1菌株A/Hong Kong/156/97的全长M1基因编码252个氨基酸蛋白。M1来源于也编码M2蛋白核苷酸序列的流感M序列。来自M序列编码Met₁至Lys₂₅₂的序列用于在S2细胞中表达M1蛋白。此序列来自登录号AF046090(GenBank，www.ncbi.nlm.nih.gov)所含H5N1M序列的核苷酸序列。尽管M1蛋白不是从细胞正常分泌的，但是为了此工作M1蛋白，如前定义的，连接于果蝇表达质粒的tPA分泌信号以生产分泌形式的截断M蛋白。

用于克隆、转化、表达和鉴定M1亚单位的方法是实施例1所述方法。在选择稳定细胞系上，细胞被筛选用来表达分泌形式的H5N1 M1目标蛋白。所述M1亚单位的表达导致预期分子重量的均一产物。分泌到S2培养物培养基中的H5N1 M1蛋白的表达水平分别估计为15μg/ml至20μg/ml。

不像HA，M1蛋白的层析纯化方法未在文献中报道，除了纯化His-tagged的重组M1蛋白的镍螯合柱(Hara等，Microbiol.Immunol.(2003)47：521-526；Watanabe等，J.Virol.(1996)70：241-247)。为了保留M1的天然构象，不优选添加His标记。其它纯化M1的方法是酸-氯仿-甲醇提取(Gregoriades，Virology(1973)54：369-383)和酸依赖的清洁剂提取(Zhirnov，Virology(1992)186：327-330)，两者均不适用生产目的。至于HA蛋白，使用单克隆抗体的IAC是纯化M1蛋白的优选方法。

可选的纯化方法也被评价从而导致非免疫亲和纯化方法的发展。大批收获用2M硫酸钠稀释二分之一再装入用1M硫酸钠平衡的苯基凝胶(GE Healthcare，Piscataway，NJ)柱中。柱用1M硫酸钠冲洗直至达到基线吸光度。被结合的材料再用去离子水洗脱。水洗脱液直接装入用含150mM NaCl的缓冲液A(10mM磷酸钠，pH 5.5)平衡的SP-凝胶柱中。柱用含150mM NaCl的缓冲液A冲洗直至达到基线吸光度。被结合的材料通过含0.5M NaCl和1M NaCl的缓冲液A组成的分阶梯度来洗脱。M1蛋白在0.5M NaCl步骤中被洗脱并随后通过大小排阻层析在使用pH 7.2的11mM磷酸缓冲盐(140mM NaCl)作为柱缓冲液的Sephacryl S-100柱(1.5x 94cm)上进一步纯化。含M1蛋白的级分为鉴定而汇集和浓缩。

实施例5

鼠免疫原性研究#1

含和不含H5N1 M1的S2表达的H5 HA-头部在Balb/c鼠上的免疫原性

根据发明表达和纯化的H5抗原的免疫原性在Balb/c鼠上被评价。含和不含H5N1 M1蛋白的H5 HA-A9-头部用来检验免疫原能力。5-9只6-8周雌性Balb/c鼠的组通过皮下途径使用如下表1所述的重组抗原或合适对照来被免疫。疫苗作为抗原的一种制剂同时GPI-0100(250μg/剂)作为0.2ml总体积中的佐剂。动物接受两剂之间间隔4周的疫苗。最后一剂疫苗后7天，4只鼠/组被施与安乐死并脾被收集用来分析如下所述的细胞免疫应答。最后一剂疫苗后两周，余下的动物被施与安乐死并血清样本被收集。体液应答基于对免疫原特定的抗体的个体滴度来评定，如通过ELISA抗原结合来测定。另外，汇集等体积来自组内每个动物的血清并用来检验血凝抑制(HI)滴度。

表1：使用在果蝇S2表达系统中表达的H5 HA-头部的鼠免疫原性研究设计

组	佐剂(250μg)	疫苗抗原	抗原剂量(μg)	#鼠
组	佐剂(250μg)	疫苗抗原	抗原剂量(μg)	#鼠	1	GPI-0100	H5 HA头部	3	5
2	GPI-0100	H5 HA头部+H5 M1	3(每个抗原)	9	1	GPI-0100	H5 HA头部	3	5
2	GPI-0100	H5 HA头部+H5 M1	3(每个抗原)	9	3	GPI-0100	无	0	9

ELISA分析：流感蛋白(H5 HA头部蛋白和H5 M1蛋白)的抗体通过ELISA技术使用具有覆盖特定抗原的孔的小平板格式来滴定。涂层之后，孔用含缓冲液的血清或清蛋白来中断，然后用碱性磷酸酶或过氧化物酶共轭的次级抗体进行标准ELISA步骤。

HI分析：在南部研究学会(Frederick，MD)通过标准方法(Kendal等，CDC(1982)pB-17-B35)进行所述HI分析。

补体结合分析：使用定量微补体结合分析检验鼠血清与流感抗原的补体结合活性。商业上简单获得的补体(几内亚猪血清)、溶血素(兔抗绵羊红血球stromata血清)、和绵羊红血球(CedarlaneLaboratories，Hornby，Ontario，Canada)用作实验指示剂系统并且使用的最佳浓度通过预备滴定来测定(Lieberman，等，Infect.Immunol.(1979)23：509-521)。纯化抗原和鼠抗血清的稀释液混合并用稀释的补体缓冲在冰上培育16小时。无抗原或抗血清的对照被包括。使用溶血素预先培育增敏的绵羊红血球再加入抗原+抗血清+补体的混合物中并在37℃培育60分钟。离心反应混合物，在413nm处测定上清液的吸光度。所得溶血程度与通过抗原/抗血清结合的补体结合程度成反比，50％补体结合的抗血清稀释液能被测定。因而，不同流感抗原的抗血清的补体结合活性被直接比较。

脾细胞制备：第2剂后7天在组2和组3的4只鼠上都进行脾切除术。用每只鼠的脾制备脾细胞悬浮液，用NH₄Cl溶解红血球，最后在细胞培养基中冲洗和再次悬浮细胞颗粒。使用Coulter计数器对每个悬浮液进行细胞计数，用培养基稀释悬浮液至2x 10⁶个细胞/ml。来自个体鼠的脾细胞分别培养。

淋巴细胞增殖分析：每个脾细胞悬浮液的等分(0.1ml)分配到96孔细胞培养皿的孔中。各自的抗原再以终浓度5μg/ml(终体积0.2ml/孔)加到含每个细胞悬浮液的孔中(一式四份)。含未受激(无抗原的)细胞悬浮液的孔也被包括。培养物在37℃/5％CO₂/湿润地培育7天，再在每孔中(以0.01ml体积)加入1微居里滴定的(甲基-³H)胸腺嘧啶(6.7Ci/mmol；ICN Biomedicals，公司，Irvine，CA)，继续培育18小时。过后，细胞培养物被用真空驱动收割机系统(Filtermate，Perkin Elmer Life Sciences Co.，Boston MA)收集在玻璃纤维过滤板上并大冲洗。过滤板再被在顶级计算微板块闪烁和荧光计算器(Perkin Elmer Life Sciences Co.，Boston MA)中分析放射性。

细胞因子产量分析：每个脾细胞悬浮液的等分(0.5ml)分配到24孔细胞培养皿的孔中。5μg与用于淋巴细胞增殖相同的抗原再分配到含每个细胞悬浮液的孔中(终体积1.0ml/孔)。未受激的细胞悬浮液与对照被检验。培养物在在37℃/5％CO₂/湿润地培育4天。培养物上清液再被收集并冷冻用来分析特定的细胞因子。使用流式细胞计数珠子排列分析法(BD Biosciences Pharmingen公司，San Diego CA)分析脾细胞培养物上清液中的细胞因子。

表2.Balb/c鼠上H5 HA-头部诱导的HI抗体滴度

组	佐剂	疫苗抗原	抗原剂量(μg)	HI滴度
组	佐剂	疫苗抗原	抗原剂量(μg)	HI滴度	1	GPI-0100	H5 HA-头部	3	20
2	GPI-0100	H5 HA-头部+H5N1 M1	3(每个抗原)	254^a	1	GPI-0100	H5 HA-头部	3	20
2	GPI-0100	H5 HA-头部+H5N1 M1	3(每个抗原)	254^a	3	GPI-0100	无	0	＜10

^a使用滴度为320、320和160的一式三份分析的GMT。

表3.Balb/c鼠上H5 HA-头部诱导的ELISA抗体滴度

抗体滴定的结果显示所有抗原均诱导不错的ELISA抗体滴度。当鼠使用HA蛋白免疫时HI抗体滴度上升；当鼠同时使用HA和M1蛋白免疫时特别高的滴度(大于10倍更高)被诱导。

淋巴细胞增殖(图1)和细胞因子产量分析(图2和3)的结果表明流感抗原能引发不错的细胞免疫应答。当同时使用抗原和GPI-0100佐剂免疫时，鼠能通过IFN-γ和IL-5(还有TNF-α，IL-2，和IL-4；数据未示)的增殖和产出应答体外任何抗原的激发。此细胞媒介的免疫应答能对给特定群体的受试者如老年个体提供抵御流感的保护性免疫是至关重要的(McElhaney JE，等，J.Immunol.176：6333-6339，2006)。

实施例6

鼠免疫原性研究#2

S2表达的H5 HA-Ecto和H5 HA-头部亚单位在Balb/c鼠上的免疫原性

S2表达的H5 HA亚单位蛋白的免疫原性，特别是H5 HA-Ecto-mut和H5 HA-A9-头部，在Balb/c鼠上被评价。5-10只6-8周雌性Balb/c鼠的组通过肌肉途径使用重组抗原或合适对照来被免疫。疫苗作为抗原的一种制剂同时含或不含alhydrogel(0.5mg/剂)或GPI-0100(250μg/剂)作为0.2ml总体积中的佐剂。如下表4所示，动物接受两剂之间间隔4周的疫苗或者3剂前两剂之间间隔4周及第2剂和第3剂之间间隔6周的疫苗。最后一剂疫苗后两周，动物被施与安乐死并通过前面实施例4所述ELISA将血清样本用来检验与重组蛋白的反应性。结果如图4所示。

表4.H5 HA分子在Balb/c鼠上免疫原性研究评价的设计

组	佐剂	疫苗抗原和剂量(μg)	#鼠
组	佐剂	疫苗抗原和剂量(μg)	#鼠	1	Alhydrogel	无	5^#
2	Alhydrogel	15μg H5胞外域S2	5^#	1	Alhydrogel	无	5^#
2	Alhydrogel	15μg H5胞外域S2	5^#	3	GPI-0100	无	5^#
4	GPI-0100	15μg H5胞外域S2	10^*	3	GPI-0100	无	5^#
4	GPI-0100	15μg H5胞外域S2	10^*	5	GPI-0100	15μg H5 HA头部S2	5^#

*每组中5只鼠接受两次免疫，其它5只接受三次免疫。

^#每组中5只鼠接受三次免疫

使用HA胞外域或HA“头部”的ELISA抗体滴定结果表明重组蛋白是产生免疫性的。当使用佐剂时使用任何抗原都能达到特别高的抗体滴度，特别在佐剂是GPI-0100时。在佐剂对照组中没有可测的抗体滴度上升(数据未示)。

实施例7

鼠免疫原性研究#3

含和不含H5N1 M1的S2表达的H3 HA-Ecto在Balb/c鼠上的免疫原性

含或不含H5 M1亚单位的S2表达的H3 HA-Ecto亚单位的免疫原性在Balb/c鼠上被评价。5-10只6-8周雌性Balb/c鼠的组通过肌肉途径使用重组抗原或合适对照来被免疫。疫苗作为抗原的一种制剂同时含或不含矾(0.5mg/剂)或GPI-0100(250μg/剂)作为0.2ml总体积中的佐剂。如下表5所示，动物接受两剂之间间隔4周的疫苗或者3剂之间间隔3周的疫苗。最后一剂疫苗后两周，动物被施与安乐死并通过前面实施例4所述ELISA将血清样本用来检验与重组蛋白的反应性。结果如图5所示。

表5.H3 HA分子在Balb/c鼠上免疫原性研究评价的设计

组	佐剂	疫苗抗原和剂量(μg)	鼠
组	佐剂	疫苗抗原和剂量(μg)	鼠	6	Alhydrogel	无	5
7	Alhydrogel	5μg H3 HA胞外域	5	6	Alhydrogel	无	5
7	Alhydrogel	5μg H3 HA胞外域	5	8	Alhydrogel	5μg H3 HA胞外域+1μg H5 M1	5
9	GPI-0100	无	5	8	Alhydrogel	5μg H3 HA胞外域+1μg H5 M1	5
9	GPI-0100	无	5	10	GPI-0100	5μg H3 HA胞外域	5

结果表明H3 HA抗原产生免疫性。当佐剂使用矾或GPI-0100时，免疫原性提高。将M1加入免疫疫苗中没有显著影响HA抗原的滴度。在佐剂对照组中没有可测的抗体滴度上升(数据未显示)。

实施例8

鼠免疫原性研究#4

+/-M1蛋白的S2表达的H3 HA分子在Balb/c鼠上的免疫原性

含和不含M1蛋白(1-5μg)的S2表达的H3 HA头部和H3 HA胞外域分子(1-15μg)的免疫原性在Balb/c鼠上被评价。5-10只6-8周雌性Balb/c鼠的组通过肌肉途径使用重组抗原或合适对照来被免疫。疫苗作为抗原的一种制剂同时含或不含矾(0.5mg/剂)作为0.2ml总体积中的佐剂或GPI-0100(250μg/剂)作为0.2ml总体积中的佐剂。动物接受3剂之间间隔3周的疫苗。最后一剂疫苗后两周，动物被施与安乐死并通过前面实施例5所述ELISA将血清样本用来检验与重组蛋白的反应性。

结果表明重组蛋白的免疫原性，甚至抗原低剂量时。使用佐剂的疫苗接种引发更高水平的抗体。

实施例9

鼠免疫原性研究#5

+/-M1蛋白的S2表达的H5 HA分子在Balb/c鼠上另外的免疫原性

一剂量内含或不含H5 M1蛋白的S2表达的H5 HA分子的全胞外域头部或foldons的免疫原性在Balb/c鼠上被进一步评价。5-10只6-8周雌性Balb/c鼠的组通过肌肉途径使用重组抗原或合适对照来被免疫。疫苗作为抗原的一种制剂同时含或不含矾(0.5mg/剂)或GPI-0100(250μg/剂)作为0.2ml总体积中的佐剂。动物接受2剂之间间隔4周的疫苗或者3剂之间间隔3周的疫苗。最后一剂疫苗后两周，动物被施与安乐死并通过前面实施例5所述ELISA将血清样本用来检验与重组蛋白的反应性。

实施例10

鼠免疫原性研究#6

一剂量内含或不含M1蛋白的S2表达的H3HA-Ecto或H3HA-foldon亚单位在Balb/c鼠上的免疫原性

一剂量内含或不含M1蛋白的S2表达的H3 HA-Ecto或H3HA-foldon亚单位的免疫原性在Balb/c鼠上被评价。6-8周雌性Balb/c鼠的组通过肌肉途径使用重组抗原或合适对照来被免疫。疫苗作为抗原的一种制剂同时含或不含alhydrogel(0.5mg/剂)或GPI-0100(250μg/剂)作为0.2ml总体积中的佐剂。动物接受两剂之间间隔4周的疫苗或者3剂之间间隔3周的疫苗。最后一剂疫苗后两周，动物被施与安乐死并通过前面实施例5所述ELISA将血清样本用来检验与重组蛋白的反应性。

实施例11

鼠激发研究

进行流感激发研究以评价不同的最佳疫苗制剂。Mock抗原用作对照。鼠被最低量地免疫两次，最大量地免疫三次，间隔28天使用1-50μgH5抗原(胞外域，胞外域+M1或foldon)。下面实施例中，最后一次免疫后两周，鼠被用致命剂量的A/Vietnam/1203/04激发。感染后14天，观察鼠的发病率和死亡率。从鼠中取出肺以使用标准方法测定病毒滴度(Lu，等，J.of Virol.(1999)7：5903-5911)。

鼠激发研究的结果显示本文所述H5疫苗抗原保护鼠抵御野生型H5病毒的致命激发。另外，肺中病毒滴度大大降低。

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序列表

<210>SEQ ID NO：1来自昆虫细胞中表达的流感菌株A/Fujian/411/02的H3 HA-Ecto

<211>508

<212>PRT

<213>甲型流感病毒-A/Fujian/411/02菌株

<400>1

Gly Ala Arg Ser Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr

1 5 10 15

Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr

20 25 30

Ile Thr Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln

35 40 45

Ser Ser Ser Thr Gly Gly Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp

50 55 60

Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys

65 70 75 80

Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys

85 90 95

Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu

100 105 110

Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser

115 120 125

Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys

130 135 140

Arg Arg Ser Asn Lys Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His

145 150 155 160

Leu Lys Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu

165 170 175

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp

180 185 190

Ser Asp Gln Ile Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Ile Thr Val

195 200 205

Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg

210 215 220

Pro Arg Val Arg Asp Val Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile

225 230 235 240

Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile

245 250 255

Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met

260 265 270

Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro

275 280 285

Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile

290 295 300

Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu

305 310 315 320

Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe

325 330 335

Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp

340 345 350

Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala

355 360 365

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370 375 380

Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu

385 390 395 400

Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr

405 410 415

Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu

420 425 430

Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met

435 440 445

Asn Lys Leu Phe Glu Arg Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu

450 455 460

Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala

465 470 475 480

Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg

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Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly

500 505

<210>SEQ ID NO：2来自昆虫细胞中表达的流感菌株A/HongKong/156/97的H5 HA-Ecto

<211>509

<212>PRT

<213>甲型流感病毒-A/Hong Kong/156/97菌株

<400>2

Gly Ala Arg Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser

1 5 10 15

Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His

20 25 30

Ala Gln Asp Ile Leu Glu Arg Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu

35 40 45

Asn Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp

50 55 60

Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp

65 70 75 80

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Gly Asn Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile

100 105 110

Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asn

115 120 125

His Asp Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Arg

130 135 140

Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Ala

145 150 155 160

Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu

165 170 175

Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr

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Lys Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr

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Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn

210 215 220

Gly Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn

225 230 235 240

Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr

245 250 255

Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu

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Leu Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala

275 280 285

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Glu Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly

30 5310 315 320

Leu Arg Asn Thr Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu

325 330 335

Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val

340 345 350

Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr

355 360 365

Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn

370 375 380

Lys Val Asn Ser Ile Ile Asn Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val

385 390 395 400

Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys

405 410 415

Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu

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Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn

435 440 445

Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala

450 455 460

Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn

465 470 475 480

Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr

485 490 495

Ser Glu Glu Ala Arg Leu Asn Arg Glu Glu Ile Ser Gly

500 505

<210>SEQ ID NO：3来自昆虫细胞中表达的流感菌株A/Indonesia/5/05的H5 HA-Ecto

<211>509

<212>PRT

<213>甲型流感病毒-A/Indonesia/5/05

<400>3

Gly Ala Arg Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser

1 5 10 15

Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His

20 25 30

Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu

35 40 45

Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp

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Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp

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Gly Ser Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile

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Pro Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr

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Leu Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala

275 280 285

Ile Asn Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly

290 295 300

Glu Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly

305 310 315 320

Leu Arg Asn Ser Pro Gln Arg Glu Arg Ser Arg Lys Lys Arg Gly Leu

325 330 335

Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val

340 345 350

Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr

355 360 365

Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn

370 375 380

Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val

385 390 395 400

Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys

405 410 415

Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu

420 425 430

Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn

435 440 445

Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala

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Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn

465 470 475 480

Glu Cys Met Glu Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr

485 490 495

Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly

500 505

<210>SEQ ID NO：4来自昆虫细胞中表达的流感菌株A/Fujian/411/02的H3 HA-A19-头

部

<211>315

<212>PRT

<213>甲型流感病毒

<400>3

Gly Ala Arg Ser Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr

1 5 10 15

Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser

20 25 30

Ser Thr Gly Gly Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu

35 40 45

Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly

50 55 60

Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr

65 70 75 80

Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser

85 90 95

Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn

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Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys Arg Arg

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Ser Asn Lys Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Lys

130 135 140

Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys Phe

145 150 155 160

Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Ser Asp

165 170 175

Gln Ile Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr

180 185 190

Lys Arg Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg

195 200 205

Val Arg Asp Val Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys

210 215 220

Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro

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Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser

245 250 255

Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly

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Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr

275 280 285

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305 310 315

<210>SEQ ID NO：5来自昆虫细胞中表达的流感菌株A/Fujian/411/02的H3 HA-A49-头

部

<211>285

<212>PRT

<213>甲型流感病毒

<400>4

Gly Ala Arg Ser Gly Gly Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp

1 5 10 15

Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys

20 25 30

Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys

35 40 45

Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu

50 55 60

Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser

65 70 75 80

Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys

85 90 95

Arg Arg Ser Asn Lys Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His

100 105 110

Leu Lys Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu

115 120 125

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp

130 135 140

Ser Asp Gln Ile Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Ile Thr Val

145 150 155 160

Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg

165 170 175

Pro Arg Val Arg Asp Val Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile

180 185 190

Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile

195 200 205

Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met

210 215 220

Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro

225 230 235 240

Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile

245 250 255

Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu

260 265 270

Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg

275 280 285

<210>SEQ ID NO：6来自昆虫细胞中表达的流感菌株A/HongKong/156/97的H5 HA-A9-头

部

<211>322

<212>PRT

<213>甲型流感病毒

<400>5

Gly Ala Arg Ser Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met

1 5 10 15

Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile Leu Glu Arg Thr

20 25 30

His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu

35 40 45

Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp

50 55 60

Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Ser

65 70 75 80

Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn Asp Tyr Glu Glu

85 90 95

Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile

100 105 110

Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser Ser Gly Val Ser

115 120 125

Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Arg Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val

130 135 140

Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr

145 150 155 160

Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His

165 170 175

Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr

180 185 190

Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Glu

195 200 205

Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe

210 215 220

Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn

225 230 235 240

Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly

245 250 255

Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr

260 265 270

Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser Met Pro Phe His

275 280 285

Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser

290 295 300

Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Thr Pro Gln Arg Glu

305 310 315 320

Arg Arg

<210>SEQ ID NO：7来自昆虫细胞中表达的流感菌株A/HongKong/156/97的H5 HA-G39-

头部

<211>292

<212>PRT

<213>甲型流感病毒

<400>6

Gly Ala Arg Ser Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys Pro Leu

1 5 10 15

Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met

20 25 30

Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys

35 40 45

Ala Ser Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn Asp Tyr

50 55 60

Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile

65 70 75 80

Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser Ser Gly

85 90 95

Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Arg Ser Ser Phe Phe Arg Asn

100 105 110

Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg

115 120 125

Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile

130 135 140

His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln Asn Pro

145 150 155 160

Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val

165 170 175

Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Met

180 185 190

Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn Phe Glu

195 200 205

Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile Val Lys

210 215 220

Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly Asn Cys

225 230 235 240

Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser Met Pro

245 250 255

Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val

260 265 270

Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Thr Pro Gln

275 280 285

Arg Glu Arg Arg

290

<210>SEQ ID NO：8来自昆虫细胞中表达的流感菌株A/Fujian/411/02的H5 H3-foldon

<211>544

<212>PRT

<213>甲型流感病毒

<400>8

Gly Ala Arg Ser Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr

1 5 10 15

Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr

20 25 30

Ile Thr Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln

35 40 45

Ser Ser Ser Thr Gly Gly Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp

50 55 60

Gly Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys

65 70 75 80

Asp Gly Phe Gln Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys

85 90 95

Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu

100 105 110

Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser

115 120 125

Phe Asn Trp Thr Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys

130 135 140

Arg Arg Ser Asn Lys Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His

145 150 155 160

Leu Lys Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu

165 170 175

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp

180 185 190

Ser Asp Gln Ile Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Ile Thr Val

195 200 205

Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg

210 215 220

Pro Arg Val Arg Asp Val Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile

225 230 235 240

Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile

245 250 255

Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met

260 265 270

Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro

275 280 285

Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile

290 295 300

Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu

305 310 315 320

Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe

325 330 335

Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp

340 345 350

Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala

355 360 365

Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asn Gln Ile Asn Gly Lys

370 375 380

Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu

385 390 395 400

Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr

405 410 415

Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu

420 425 430

Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met

435 440 445

Asn Lys Leu Phe Glu Arg Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu

450 455 460

Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala

465 470 475 480

Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg

485 490 495

Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

500 505 510

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln

515 520 525

Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu

530 535 540

<210>SEQ ID NO：9来自昆虫细胞中表达的流感菌株A/Indonesia/5/05的H5 HA-foldon

<211>545

<212>PRT

<213>甲型流感病毒

<400>9

Gly Ala Arg Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser

1 5 10 15

Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His

20 25 30

Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu

35 40 45

Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp

50 55 60

Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp

65 70 75 80

Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro

85 90 95

Gly Ser Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile

100 105 110

Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp

115 120 125

His Glu Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser

130 135 140

Pro Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr

145 150 155 160

Tyr Pro Thr Ile Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu

165 170 175

Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr

180 185 190

Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr

195 200 205

Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn

210 215 220

Gly Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn

225 230 235 240

Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr

245 250 255

Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu

260 265 270

Leu Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala

275 280 285

Ile Asn Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly

290 295 300

Glu Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly

305 310 315 320

Leu Arg Asn Ser Pro Gln Arg Glu Arg Ser Arg Lys Lys Arg Gly Leu

325 330 335

Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val

340 345 350

Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr

355 360 365

Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn

370 375 380

Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val

385 390 395 400

Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys

405 410 415

Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu

420 425 430

Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn

435 440 445

Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala

450 455 460

Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn

465 470 475 480

Glu Cys Met Glu Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr

485 490 495

Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Gly Gly Gly

500 505 510

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly

515 520 525

Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe

530 535 540

Leu

545

<210>SEQ ID NO：10来自昆虫细胞中表达的流感菌株A/HongKong/156/97的H5 N1基质1

<211>256

<212>PRT

<213>甲型流感病毒-A/Hong Kong/156/97菌株

<400>7

Gly Ala Arg Ser Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu

1 5 10 15

Ser Ile Ile Pro Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu

20 25 30

Glu Asp Val Phe Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu

35 40 45

Trp Leu Lys Thr Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu

50 55 60

Gly Phe Val Phe Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg

65 70 75 80

Arg Arg Phe Val Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn

85 90 95

Met Asp Arg Ala Val Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Glu Met Thr

100 105 110

Phe His Gly Ala Lys Glu Val Ala Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu

115 120 125

Ala Ser Cys Met Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Thr Val Thr Thr

130 135 140

Glu Val Ala Leu Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp

145 150 155 160

Ala Gln His Arg Ser His Arg Gln Met Ala Thr Thr Thr Asn Pro Leu

165 170 175

Ile Arg His Glu Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala

180 185 190

Met Glu Gln Met Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu

195 200 205

Val Ala Ser Gln Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly

210 215 220

Thr His Pro Ser Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asp Asp Leu Ile Glu Asn

225 230 235 240

Leu Gln Ala Tyr Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys

245 250 255

Claims

1.一种生产重组亚单位流感疫苗的方法，包括：

表达和分泌重组流感血凝素胞外域蛋白亚单位，其中该蛋白亚单位缺失C-端跨膜锚，并作为可溶蛋白从稳定转化的昆虫细胞中分泌出来；和

配制所述重组蛋白亚单位以生产免疫原性组合物，其在接种了免疫原性组合物的宿主中诱导血凝素抗体滴度的产生。

2.一种生产重组亚单位流感疫苗的方法，包括：

表达和分泌重组流感血凝素头部蛋白亚单位，其中该蛋白亚单位缺失C-端跨膜锚和N-端部分，并作为可溶蛋白从稳定转化的昆虫细胞中分泌出来；和

3.一种生产重组亚单位流感疫苗的方法，包括：

表达和分泌重组流感血凝素胞外域蛋白亚单位，其中该蛋白亚单位缺失C-端跨膜锚，并作为可溶蛋白从稳定转化的昆虫细胞中分泌出来；

表达和分泌重组流感基质1蛋白亚单位，其中该蛋白亚单位缺失C-端跨膜锚，并作为可溶四聚体蛋白从稳定转化的昆虫细胞中分泌出来；和

配制所述重组血凝素胞外域蛋白亚单位和基质1蛋白亚单位以生产免疫原性组合物，其在接种了免疫原性组合物的宿主中诱导血凝素抗体滴度的产生。

4.一种生产重组亚单位流感疫苗的方法，包括：

表达和分泌重组流感血凝素头部蛋白亚单位，其中该蛋白亚单位缺失C-端跨膜锚和N-端部分并作为可溶蛋白从稳定转化的昆虫细胞中被分泌出；

表达和分泌重组流感基质1蛋白亚单位，其中该蛋白亚单位缺失C-端跨膜锚并作为可溶四聚体蛋白从稳定转化的昆虫细胞中分泌出来；和

配制所述重组血凝素头部蛋白亚单位和基质1蛋白亚单位以生产免疫原性组合物，其在接种了免疫原性组合物的宿主中诱导血凝素抗体滴度的产生。

5.一种生产重组亚单位流感疫苗的方法，包括：

表达和分泌重组流感HA-foldon亚单位，其中该蛋白亚作为可溶蛋白从稳定转化的昆虫细胞中分泌出来；和

6.一种生产重组亚单位流感疫苗的方法，包括：

表达和分泌重组流感HA-foldon亚单位，其中该蛋白亚作为可溶蛋白从稳定转化的昆虫细胞中分泌出来；

配制所述重组HA-foldon亚单位和基质1蛋白亚单位以生产免疫原性组合物，其在接种了免疫原性组合物的宿主中诱导血凝素抗体滴度的产生。

7.权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中所述的流感病毒是甲型流感病毒。

8.权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中流感病毒株选自H5和H3。

9.权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中在标称胞外域长度的10％内截断血凝素蛋白亚单位的羧基端部分。

10.权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中所述的稳定转化的昆虫细胞是黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)S2细胞。

11.权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中配制免疫原性组合物进一步包括在免疫原性组合物中包括一种或多种佐剂。

12.权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中配制免疫原性组合物进一步包括在免疫原性组合物中包括一种或多种选自皂甙和矾的佐剂。

13.权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中配制免疫原性组合物进一步包括在免疫原性组合物中包括GPI-0100佐剂。

14.权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中配制免疫原性组合物进一步包括在免疫原性组合物中包括药物学上可接受的赋形剂。

15.权利要求1、2、3、4、5或6所述的方法，其中所述的蛋白亚单位通过免疫亲和层析纯化。

16.权利要求1或3所述的方法，其中所述的重组流感血凝素胞外域蛋白亚单位具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

17.权利要求2或4所述的方法，其中所述的重组流感血凝素头部蛋白亚单位具有选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的氨基酸序列。

18.权利要求2或4所述的方法，其中所述的血凝素头部蛋白亚单位的截断点选自N-端、C-端、N-端和C-端，其中一个或两个端点可以在标称HA-头部长度的至多10％范围内改变。

19.权利要求3、4或6所述的方法，其中所述的重组流感基质1蛋白亚单位具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

20.权利要求5或6所述的方法，其中所述的重组流感HA-foldon亚单位具有选自SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的氨基酸序列。

21.一种启动受试者免疫原性应答的方法，包括以治疗上可接受的方式将治疗有效量的权利要求1、2、3、4、5或6的免疫原性组合物给予所述受试者。

22.一种包括重组亚单位流感疫苗的免疫原性组合物，该疫苗包括重组流感血凝素胞外域蛋白亚单位，其中该蛋白亚单位缺失C-端跨膜锚，并作为可溶蛋白从稳定转化的昆虫细胞中表达和分泌。

23.一种包括重组亚单位流感疫苗的免疫原性组合物，该疫苗包括重组流感血凝素头部蛋白亚单位，其中该血凝素头部蛋白亚单位缺失C-端跨膜锚和N-端部分，并且作为可溶蛋白从稳定转化的昆虫细胞中表达和分泌。

24.一种包括重组亚单位流感疫苗的免疫原性组合物，该疫苗包括重组流感血凝素胞外域蛋白亚单位，其中该血凝素胞外域蛋白亚单位缺失C-端跨膜锚并作为可溶蛋白从稳定转化的昆虫细胞中表达和分泌，

与重组流感基质1蛋白亚单位组合，其中该基质1蛋白亚单位缺失C-端跨膜锚并作为可溶四聚体蛋白从稳定转化的昆虫细胞中表达和分泌。

25.一种包括重组亚单位流感疫苗的免疫原性组合物，该疫苗包括重组流感血凝素头部蛋白亚单位，其中该血凝素头部蛋白亚单位缺失C-端跨膜锚和N-端部分，并且作为可溶蛋白从稳定转化的昆虫细胞中表达和分泌，

26.一种包括重组亚单位流感疫苗的免疫原性组合物，该疫苗包括重组流感HA-foldon蛋白亚单位，其中该蛋白亚单位作为可溶蛋白从稳定转化的昆虫细胞中表达和分泌。

27.一种包括重组亚单位流感疫苗的免疫原性组合物，包括重组流感HA-foldon蛋白亚单位，其中HA-foldon蛋白亚单位作为可溶蛋白从稳定转化的昆虫细胞中表达和分泌，

28.权利要求22、23、24、25、26或27的免疫原性组合物，其中所述的流感病毒是甲型流感病毒。

29.权利要求22、23、24、25、26或27的免疫原性组合物，其中流感病毒株选自H5和H3。

30.权利要求22、23、24、25、26或27的免疫原性组合物，其中在标称胞外域长度的10％内截断血凝素蛋白亚单位的羧基端部分。

31.权利要求22、23、24、25、26或27的免疫原性组合物，其中稳定转化的昆虫细胞是黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)S2细胞。

32.权利要求22、23、24、25、26或27的免疫原性组合物，其中免疫原性组合物进一步包括一种或多种佐剂。

33.权利要求22、23、24、25、26或27的免疫原性组合物，其中免疫原性组合物进一步包括一种或多种选自皂甙和矾的佐剂。

34.权利要求22、23、24、25、26或27的免疫原性组合物，其中免疫原性组合物进一步包括GPI-0100佐剂。

35.权利要求22、23、24、25、26或27的免疫原性组合物，其中免疫原性组合物进一步包括药物学上可接受的赋形剂。

36.权利要求22、23、24、25、26或27的免疫原性组合物，其中所述的蛋白亚单位通过免疫亲和层析纯化。

37.权利要求22、23、24、25、26或27的免疫原性组合物，其中在疫苗中将该免疫原性组合物给予受试者。

38.权利要求22或24的免疫原性组合物，其中所述的重组流感血凝素胞外域蛋白亚单位具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQID NO：3的氨基酸序列。

39.权利要求22或24的免疫原性组合物，其中所述的重组流感血凝素胞外域蛋白亚单位具有与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸至少95％序列同一性的氨基酸序列。

40.权利要求22或24的免疫原性组合物，其中所述的重组流感血凝素胞外域蛋白亚单位具有与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸至少90％序列同一性的氨基酸序列。

41.权利要求23或25的免疫原性组合物，其中所述的重组流感血凝素头部蛋白亚单位具有选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：7的氨基酸序列。

42.权利要求23或25的免疫原性组合物，其中所述的重组流感血凝素头部蛋白亚单位具有与选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：7的氨基酸至少95％序列同一性的氨基酸序列。

43.权利要求23或25的免疫原性组合物，其中所述的重组流感血凝素头部蛋白亚单位具有与选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：7的氨基酸至少90％序列同一性的氨基酸序列。

44.权利要求23或25的免疫原性组合物，其中所述的血凝素头部蛋白亚单位的截断点选自N-端、C-端、N-端和C-端，其中一个或两个端点可以在标称HA-头部长度的10％范围内改变。

45.权利要求24、25或27的免疫原性组合物，其中所述的重组流感基质1蛋白亚单位具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

46.权利要求24、25或27的免疫原性组合物，其中所述的重组流感基质1蛋白亚单位具有与SEQ ID NO：10至少95％序列同一性的氨基酸序列。

47.权利要求24、25或27的免疫原性组合物，其中所述的重组流感基质1蛋白亚单位具有与SEQ ID NO：10至少90％序列同一性的氨基酸序列。

48.权利要求26或27的免疫原性组合物，其中所述的重组流感HA-foldon亚单位具有选自SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的氨基酸序列。

49.权利要求26或27的免疫原性组合物，其中所述的重组流感HA-foldon亚单位具有与选自SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的氨基酸至少95％序列同一性的氨基酸序列。

50.权利要求26或27的免疫原性组合物，其中所述的重组流感HA-foldon亚单位具有与选自SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的氨基酸至少90％序列同一性的氨基酸序列。