JP2022141602A - 組換え麻疹ウイルス - Google Patents
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Abstract
【課題】ＣＯＶＩＤ－１９に対する生ワクチンとして有用な組換え麻疹ウイルス、及び当該組換え麻疹ウイルスの製造に使用するベクターの提供。【解決手段】麻疹ウイルスゲノム中のＮ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、組換え麻疹ウイルス；前記タンパク質が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はその部分タンパク質である、前記組換え麻疹ウイルス；及び、配列番号２で表される塩基配列中の１６８６番目の塩基から１６９４番目の塩基までの領域に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、ＤＮＡ。【選択図】なし
Description
新規性喪失の例外適用申請有り
本発明は、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）に対するワクチンとして有用な組換え麻疹ウイルスに関する。
ＣＯＶＩＤ－１９は、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Severe Acute Respiratory Syndrome CoronaVirus 2）を原因病原体とする感染症である。コロナウイルスは、スパイク糖タンパク質が、宿主細胞表面受容体のアンジオテンシン変換酵素と相互作用することにより、宿主細胞へ侵入する。
ＣＯＶＩＤ－１９はパンデミックを起こし、世界的な脅威となっている。２０１９年１２月に最初の感染が報告されて以降、感染者数及び死亡者数は増加しており、おさまる気配はない。このパンデミックを収束させるには、治療薬又はワクチンの開発が最も重要であり、優れたワクチン開発に対する要望は世界的に高い。また、各国で開発されるワクチンは、自国優先的に供給されるため、我が国独自な開発も求められている。
ワクチンは、生ワクチンと不活化ワクチンに大別される。現在各国で開発研究が行われているＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチンは、その多くが不活化ウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質、又は当該タンパク質を体内で発現させるための核酸（ｍＲＮＡ、ＤＮＡ）等のいわゆる不活化ワクチンであり、主に液性免疫を誘導する抗体誘導型ワクチンである。これらの不活化ワクチンは、免疫持続期間が短く、頻回投与せねばならず、製剤も大量に準備する必要がある。また、ＣＯＶＩＤ－１９では、抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）が起こることが示唆されており、頻回投与が誘導する多量の抗体による重症化の副作用も懸念されている。
一方で、麻疹は、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae)、モービリウイルス属（Morbillivirus)に分類される麻疹ウイルス（Measles Virus)により引き起こされる。麻疹ウイルスの外部のエンベロプには、血球凝集素（Ｈ）タンパク質とフュージョン（Ｆ）タンパク質が存在しており、内部のカプシドには、螺旋形のネガティブのＲＮＡゲノムと共に、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、ホスホ（Ｐ）タンパク質、及びラージ（Ｌ）タンパク質、及びマトリックス（Ｍ）タンパク質が存在している。麻疹ウイルスゲノムは、ウイルスの複製に関与するリーダー配列とトレーラー配列を両端にもち、その間に３’末端から順に、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｈ、及びＬタンパク質をコードする遺伝子が存在している。Ｐ遺伝子領域からは、Ｐタンパク質以外にも、Ｖタンパク質とＣタンパク質も翻訳される。
麻疹は、急性の全身感染症であり、肺炎や脳炎などの重篤な病を引き起こすこともある。麻疹ウイルスは、感染力が非常に強く、また、空気感染、飛沫感染、接触感染などの様々な経路で感染する。麻疹は、根本治療薬はなく、ワクチン接種が最も有効な予防法である。麻疹に対するワクチンとしては、麻疹ウイルスを細胞培養で継代して弱毒化した生ワクチンが使用されている。
麻疹生ワクチンは、強い細胞性免疫誘導することや、終生免疫といわれる極めて長い免疫持続を示す等の優れた特徴を持つ。さらに、麻疹生ワクチンは、既に５０年以上に渡り世界中で用いられており、ヒトでの安全性も確認されている。そこで、麻疹ワクチンとして有用な麻疹弱毒株ウイルスのゲノムＲＮＡに他の疾患の原因微生物の遺伝子等を挿入した遺伝子組換えウイルスベクターを用いて、他の疾患に対する生ワクチンが開発されている。例えば、麻疹ウイルスゲノムに、ニパウイルスの膜タンパク質をコードするＦ遺伝子やＧ遺伝子を挿入した組換え麻疹ウイルスは、麻疹とニパウイルス感染症の両方に対する２価ワクチンとして機能する（特許文献１）。また、麻疹ウイルスゲノムに、マラリア原虫のタンパク質の遺伝子を挿入した組換え麻疹ウイルスは、麻疹とマラリア感染症の両方に対する２価ワクチンとして機能する（特許文献２）。
Rota et al, Virus Research, 1994, vol.31(3), p.317-330.
本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９に対する生ワクチンとして有用な組換え麻疹ウイルス、及び当該組換え麻疹ウイルスの製造に使用するベクターを提供することを主たる目的とする。
本発明者らは、鋭意研究した結果、麻疹ウイルスゲノムのｃＤＮＡ中に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はその部分タンパク質をコードする遺伝子を挿入した組換え麻疹ウイルスが、ＣＯＶＩＤ－１９に対する生ワクチンとして有用であることを見出し、本発明を完成させた。
本発明に係る組換え麻疹ウイルス等は、下記の通りである。
［１］ 麻疹ウイルスゲノム中のＮ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質又はその部分タンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、組換え麻疹ウイルス。
［２］ 前記タンパク質が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はその部分タンパク質である、前記［１］の組換え麻疹ウイルス。
［３］ 前記麻疹ウイルスゲノムが、配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＲＮＡである、前記［１］又は［２］の組換え麻疹ウイルス。
［４］ 前記［１］～［３］のいずれかの組換え麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡ。
［５］ 配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなる、ＲＮＡ。
［６］ 配列番号２で表される塩基配列中の１６８６番目の塩基から１６９４番目の塩基までの領域に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、ＤＮＡ。
［７］ 配列番号１で表される塩基配列の１６８６番目の塩基から１６９４番目の塩基までにあるＦｓｅ Ｉ認識配列に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質又はその部分タンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、ＤＮＡ。
［８］ 配列番号３で表される塩基配列からなる、ＤＮＡ。
［９］前記［６］～［８］のいずれかのＤＮＡを含む、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクター。
［１０］ 配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡを含む、プラスミドベクター。
［１１］ 前記［６］～［８］のいずれかのＤＮＡを含むＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクターと、麻疹ウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質、及びＬタンパク質の発現ベクターとを、前記ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを転写することができるＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞にトランスフェクションし、前記細胞内で組換え麻疹ウイルスを製造する、組換え麻疹ウイルスの製造方法。
［１２］ 前記［１］～［３］のいずれかの組換え麻疹ウイルス及び薬学的に許容される担体を含む、医薬用組成物。
［１３］ 麻疹及びＣＯＶＩＤ－１９に対する２価ワクチンとして使用される、前記［１２］の医薬用組成物。
［１］ 麻疹ウイルスゲノム中のＮ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質又はその部分タンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、組換え麻疹ウイルス。
［２］ 前記タンパク質が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はその部分タンパク質である、前記［１］の組換え麻疹ウイルス。
［３］ 前記麻疹ウイルスゲノムが、配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＲＮＡである、前記［１］又は［２］の組換え麻疹ウイルス。
［４］ 前記［１］～［３］のいずれかの組換え麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡ。
［５］ 配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなる、ＲＮＡ。
［６］ 配列番号２で表される塩基配列中の１６８６番目の塩基から１６９４番目の塩基までの領域に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、ＤＮＡ。
［７］ 配列番号１で表される塩基配列の１６８６番目の塩基から１６９４番目の塩基までにあるＦｓｅ Ｉ認識配列に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質又はその部分タンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、ＤＮＡ。
［８］ 配列番号３で表される塩基配列からなる、ＤＮＡ。
［９］前記［６］～［８］のいずれかのＤＮＡを含む、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクター。
［１０］ 配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡを含む、プラスミドベクター。
［１１］ 前記［６］～［８］のいずれかのＤＮＡを含むＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクターと、麻疹ウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質、及びＬタンパク質の発現ベクターとを、前記ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを転写することができるＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞にトランスフェクションし、前記細胞内で組換え麻疹ウイルスを製造する、組換え麻疹ウイルスの製造方法。
［１２］ 前記［１］～［３］のいずれかの組換え麻疹ウイルス及び薬学的に許容される担体を含む、医薬用組成物。
［１３］ 麻疹及びＣＯＶＩＤ－１９に対する２価ワクチンとして使用される、前記［１２］の医薬用組成物。
本発明に係る組換え麻疹ウイルスは、ＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチンとして有用である。
また、本発明に係るＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクターやこれを用いた組換え麻疹ウイルスの製造方法により、本発明に係る組換え麻疹ウイルスを製造することができる。
また、本発明に係るＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクターやこれを用いた組換え麻疹ウイルスの製造方法により、本発明に係る組換え麻疹ウイルスを製造することができる。
本発明及び本願明細書において、「麻疹ウイルスゲノム」とは、感染力を有する麻疹ウイルスを産生可能なゲノムＲＮＡであって、タンパク質をコードする外来遺伝子を有していないものを意味する。野外流行麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡであってもよく、麻疹弱毒化株のゲノムＲＮＡであってもよく、これらのゲノムＲＮＡに対して、タンパク質をコードする外来遺伝子の挿入以外の各種遺伝子改変処理を施したＲＮＡであってもよい。
本発明及び本願明細書において、「組換え麻疹ウイルス」とは、感染力を有する麻疹ウイルスであって、外来タンパク質を発現するウイルスを意味する。組換え麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡには、麻疹ウイルスのタンパク質をコードする遺伝子領域以外の領域に、タンパク質をコードする外来構造遺伝子が挿入されている。
本発明に係る組換え麻疹ウイルスは、麻疹ウイルスゲノム中のＮ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質又はその部分タンパク質をコードする遺伝子が挿入されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質又はその部分タンパク質をコードする遺伝子が、麻疹ウイルスゲノム中のＮ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に挿入された組換え麻疹ウイルスは、感染細胞内でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質又はその部分タンパク質を発現させ、これらのタンパク質に対する免疫を誘導する。また、当該組換え麻疹ウイルスは、麻疹ウイルスとしての機能も維持されているため、麻疹に対するワクチンとしても有効である。
本発明に係る組換え麻疹ウイルスは、感染した細胞内で発現させたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質又はその部分タンパク質に対する抗体産生を誘導する。このため、当該組換え麻疹ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して抗体産生を誘導し、ＣＯＶＩＤ－１９と麻疹に対して強い発症防御効果を有している。さらに、従来から使用されている麻疹生ワクチンと同様に、液性免疫のみならず細胞性免疫の誘導や、終生免疫と言われるほど長期間の免疫持続も期待できる。また、当該組換え麻疹ウイルスは、その投与によってＡＤＥが生ずる可能性は低いと期待される。従来の麻疹生ワクチンと同様に、比較的安価に生産でき、凍結乾燥製剤とすることも可能なため、コールドチェーンの問題も解決可能である。
本発明に係る組換え麻疹ウイルスの製造には、例えば、特開２００１－２７５６８４号公報に記載されている、イヌジステンパーウイルスの再構成に用いたリバースジェネティクス系を利用することができる。麻疹ウイルスは（－）鎖ＲＮＡウイルスに属しており、ウイルスゲノムの改変や外来遺伝子の導入は、麻疹ウイルスゲノムのｃＤＮＡに対して汎用されている遺伝子改変技術を利用して行うことができる。リバースジェネティクス系では、麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡのｃＤＮＡに外来遺伝子を導入した組換えｃＤＮＡから、感染能を有する組換え麻疹ウイルス粒子を製造する。製造された組換え麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡは、製造に用いた組換えｃＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＲＮＡである。
＜組換えｃＤＮＡ＞
具体的には、まず、麻疹ウイルスゲノムのｃＤＮＡに対して、Ｎ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質又はその部分タンパク質をコードする遺伝子を組み込み、組換えｃＤＮＡを得る。
具体的には、まず、麻疹ウイルスゲノムのｃＤＮＡに対して、Ｎ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質又はその部分タンパク質をコードする遺伝子を組み込み、組換えｃＤＮＡを得る。
本発明に係る組換え麻疹ウイルスの製造に用いられる麻疹ウイルスゲノムは、野外流行麻疹ウイルスに対して中和抗体を誘導することができる麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡであれば、特に限定されるものではない。当該麻疹ウイルスとしては、例えば、ＨＬ株、ＩＣＢ株等の天然のウイルス株であってもよく、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株、ＡＩＣ株等の弱毒化株であってもよく、これらに麻疹ウイルスに対する中和抗体の産生誘導を阻害しない範囲において遺伝子工学的な改変がなされたものであってもよい。
本発明に係る組換え麻疹ウイルスとしては、ＣＯＶＩＤ－１９に対するより高い発症防御効果が期待できることから、弱毒化株のゲノムＲＮＡに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質又はその部分タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだもの、又はこれに遺伝子工学的な改変がなされたものが好ましい。
麻疹ウイルスの弱毒化株としては、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ野生株を、麻疹非感受性動物由来の細胞で継代する等によって得られた株が挙げられる。各種公知の弱毒化株の全長ゲノムＲＮＡの配列同一性（Identity）とミスマッチ塩基の数（非特許文献１）を表１に示す。
宿主として用いる弱毒化株の種類に応じて、得られる組換え体麻疹ウイルスの特性に影響を受ける。本発明に係る組換え体麻疹ウイルスを作製するための宿主とする麻疹弱毒化株としては、配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＲＮＡをゲノムＲＮＡとして有する麻疹弱毒化株であることが好ましい。当該ゲノムＲＮＡは、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ Ｂ株（Ｒｕｂｅｏｖａｘ）の全長ゲノムＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｚ６６５１７）と、３０塩基が相違する。
本発明に係る組換え体麻疹ウイルスを作製する際に用いられる麻疹ウイルスゲノムのｃＤＮＡとしては、ウイルスを構成する蛋白質をコードするＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｈ、及びＬ遺伝子の各遺伝子間に適宜、外来構造遺伝子を挿入するための制限酵素認識配列を配置したＤＮＡを用いることができる。特に、Ｎ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に制限酵素認識配列が配置された麻疹ウイルスゲノムのｃＤＮＡ（以降において、「改変ｃＤＮＡ」ということがある。）を用いることが好ましい。
Ｎ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に配置する制限酵素認識配列としては、麻疹ウイルスゲノムのｃＤＮＡの全長で、Ｎ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に１か所のみ存在させることができる制限酵素認識配列であれば、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、Ｆｓｅ Ｉ等の認識配列を用いることができる。麻疹ウイルスゲノムのｃＤＮＡ中のウイルスを構成する蛋白質をコードする各遺伝子の間への制限酵素認識配列の挿入は、例えば、特許文献１及び特許文献２に記載の方法で行うことができる。
本発明に係る組換え体麻疹ウイルスを作製する際に用いられる改変ｃＤＮＡとしては、配列番号２で表される塩基配列中のＮ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に制限酵素認識配列を配置した塩基配列からなるＤＮＡが好ましく、配列番号２で表される塩基配列中のＮ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間にＦｓｅ Ｉ認識配列を配置した塩基配列からなるＤＮＡがより好ましく、配列番号１で表される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＴ４０９８８２）からなるＤＮＡがさらに好ましい。なお、配列番号１で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列中のＮ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間にある１６８６番目の塩基から１６９４番目の塩基までの領域に、Ｆｓｅ Ｉ認識配列を有している塩基配列である。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質又はその部分タンパク質としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面に存在しているタンパク質又はその部分タンパク質であればよい。本発明に係る組換え麻疹ウイルスとしては、ＣＯＶＩＤ－１９に対するより高い発症防御効果が期待できることから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はその部分タンパク質であることが好ましい。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はその部分タンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡの塩基配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＣ＿０４５５１２．２）に基づき、常法により得ることができる。なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質をコードする遺伝子領域は、ゲノムＲＮＡの２１５６３番目の塩基から２５３８４番目の塩基の領域である。
例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から抽出したゲノムＲＮＡと、ゲノムＲＮＡの塩基配列情報に基づいて設計したプライマーを用いて、ＲＴ－ＰＣＲを行うことにより、スパイクタンパク質又はその部分タンパク質をコードするｃＤＮＡの断片を合成することができる。プライマーの設計は、一般的にＰＣＲのプライマーを設計する際に使用されているソフトウェアを利用して行うことができる。スパイクタンパク質又はその部分タンパク質をコードするｃＤＮＡの断片を、Ｎ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に制限酵素認識配列を配置した改変ｃＤＮＡに挿入する場合には、当該制限酵素認識配列を５’末端に配置したプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行う。これにより、スパイクタンパク質又はその部分タンパク質をコードするｃＤＮＡの両末端に当該制限酵素認識配列が配置されたＤＮＡ断片を得ることができる。その他、化学合成によっても、スパイクタンパク質若しくはその部分タンパク質をコードするｃＤＮＡの全長のＤＮＡ断片や、当該ｃＤＮＡの両末端に制限酵素認識配列を配置したＤＮＡ断片を、製造することができる。
麻疹ウイルスゲノムのｃＤＮＡ中のＮ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質又はその部分タンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入することにより、組換えｃＤＮＡが得られる。制限酵素認識配列を利用した場合、制限酵素認識配列がＮ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に配置された改変ｃＤＮＡのＤＮＡ断片と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質又はその部分タンパク質をコードするｃＤＮＡの両端に当該制限酵素認識配列が配置されたＤＮＡ断片との両方を、制限酵素処理した後、これらをライゲーション反応により連結することによって、目的の組換えｃＤＮＡが得られる。
本発明に係る組換え麻疹ウイルスは、ＣＯＶＩＤ－１９と麻疹に対する発症防御能が保持される限りにおいて、ゲノムＲＮＡ中の任意の部位に塩基の挿入、欠失、又は置換等の改変がなされていてもよい。例えば、免疫原性に関与する遺伝子を不活化したり、ＲＮＡの転写効率や複製効率を高めたりするために、一部の麻疹ウイルスのＲＮＡ複製に関与する遺伝子を改変してもよい。具体的には、介在配列、リーダー部分の改変が挙げられる。
本発明に係る組換え麻疹ウイルスは、ＣＯＶＩＤ－１９と麻疹に対する発症防御能が保持される限りにおいて、ゲノムＲＮＡ中の任意の部位に、任意の他の外来遺伝子が挿入されていてもよい。挿入される他の外来遺伝子としては、宿主内で発現可能なウイルス、細菌及び寄生虫内の病原性を惹起する各種タンパク質をコードする遺伝子、各種サイトカインをコードする遺伝子、各種ペプチドホルモンをコードする遺伝子、抗体分子内の抗原認識部位をコードする遺伝子等があげられる。例えば、インフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、ＨＩＶ、デング熱ウイルス、ジフテリア、リーシュマニアなどの各種タンパク質をコードする遺伝子や、癌特異的マーカー分子に対するモノクローナル抗体の抗原認識部位遺伝子などが挙げられる。
＜ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクター＞
前記組換えｃＤＮＡを特定のプロモーターの下流に接続したＤＮＡを含むベクターを、本発明に係る組換え麻疹ウイルスの製造に用いることができる。本発明に係る組換え麻疹ウイルスは、ＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチンとして有効であり、当該ベクターは、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクターとして用いられる。ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクターは、プラスミドベクターであることが好ましいが、線状ＤＮＡベクターであってもよい。
前記組換えｃＤＮＡを特定のプロモーターの下流に接続したＤＮＡを含むベクターを、本発明に係る組換え麻疹ウイルスの製造に用いることができる。本発明に係る組換え麻疹ウイルスは、ＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチンとして有効であり、当該ベクターは、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクターとして用いられる。ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクターは、プラスミドベクターであることが好ましいが、線状ＤＮＡベクターであってもよい。
例えば、プロモーター配列を含むＤＮＡ断片と、前記組換えｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片とを、当該プロモーター配列の下流に当該組換えｃＤＮＡが接続されるように連結させ、この連結物をプラスミドに組み込むことにより、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクターを製造することができる。ＤＮＡ断片同士の連結やプラスミドへの挿入は、遺伝子組換え技術により行うことができる。
ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクターにおいて、前記組換えｃＤＮＡの上流のプロモーターとしては、公知のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが認識するプロモーターの中から適宜選択して用いることができる。当該プロモーターとしては、例えば、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター等が挙げられる。
ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクターとしては、具体的には、配列番号２で表される塩基配列中の１６８６番目の塩基から１６９４番目の塩基までの領域にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質をコードする遺伝子が挿入されているＤＮＡ、配列番号１で表される塩基配列の１６８６番目の塩基から１６９４番目の塩基までにあるＦｓｅ Ｉ認識部位にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質をコードする遺伝子が挿入されているＤＮＡ、又は、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡのいずれかのＤＮＡの上流にプロモーターを連結させたＤＮＡ断片が組み込まれたプラスミドベクターが好ましく、は配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡの上流に、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、又はＳＰ６プロモーターが連結されたＤＮＡ断片が組み込まれたプラスミドベクターがより好ましい。
＜遺伝子組換えベクター＞
Ｎ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に制限酵素認識配列を配置した改変ｃＤＮＡを含むプラスミドベクターを用いることにより、前記ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクターをより容易に製造することができる。当該プラスミドベクターのうち、特に、プロモーターの下流に、Ｎ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に制限酵素認識配列を配置した改変ｃＤＮＡを接続させたプラスミドベクターは、麻疹とその他の疾患に対する２価ワクチンを製造するための遺伝子組換えベクターとして有用である。
Ｎ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に制限酵素認識配列を配置した改変ｃＤＮＡを含むプラスミドベクターを用いることにより、前記ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクターをより容易に製造することができる。当該プラスミドベクターのうち、特に、プロモーターの下流に、Ｎ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に制限酵素認識配列を配置した改変ｃＤＮＡを接続させたプラスミドベクターは、麻疹とその他の疾患に対する２価ワクチンを製造するための遺伝子組換えベクターとして有用である。
プラスミドベクターへの改変ｃＤＮＡやプロモーター断片の挿入は、ライゲーション反応等の遺伝子改変技術により実施することができる。なお、当該改変ｃＤＮＡの上流に接続されるプロモーターとしては、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター等の公知ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが認識するプロモーターの中から適宜選択して用いることができる。
遺伝子組換えベクターに挿入する改変ｃＤＮＡとしては、配列番号２で表される塩基配列中の１６８６番目の塩基から１６９４番目の塩基までの領域に制限酵素認識配列を配置した塩基配列からなるＤＮＡが好ましく、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡがより好ましい。配列番号１で表される塩基配列がプロモーター配列の下流に接続された塩基配列を含むプラスミドベクターは、遺伝子組換えベクターとして非常に有用である。
例えば、配列番号１で表される塩基配列がプロモーター配列の下流に接続された塩基配列を含むプラスミドベクターに対して、遺伝子工学的操作により、配列番号１で表される塩基配列中のＦｓｅ Ｉ認識配列に、スパイクタンパク質又はその部分タンパク質をコードする遺伝子の両末端にＦｓｅ Ｉ認識配列が配置された塩基配列からなるＤＮＡ断片を組み込むことにより、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクターが製造できる。また、スパイクタンパク質又はその部分タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片に代えて、ＣＯＶＩＤ－１９と麻疹以外の他の疾患の予防に有効な免疫反応を誘導するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入することにより、麻疹と当該他の疾患の両方に対するワクチンとして有効な組換え麻疹ウイルスが製造可能なベクターを製造できる。
＜組換え麻疹ウイルスの製造方法＞
前記ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクターを、当該ベクターに組み込んだ麻疹ウイルスゲノムのｃＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを転写することができるＲＮＡポリメラーゼと、麻疹ウイルスの転写複製に必要な酵素群を全て備える細胞にトランスフェクションする。当該細胞内では、当該ポリメラーゼにより、当該ベクターに組み込んだ麻疹ウイルスゲノムのｃＤＮＡを鋳型として、組換え麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡが合成される。当該細胞内において、当該ゲノムＲＮＡと麻疹ウイルスの転写複製に必要な酵素群により、組換え麻疹ウイルスが製造される。すなわち、製造された組換え麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡは、製造に用いた組換えｃＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＲＮＡである。
前記ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクターを、当該ベクターに組み込んだ麻疹ウイルスゲノムのｃＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを転写することができるＲＮＡポリメラーゼと、麻疹ウイルスの転写複製に必要な酵素群を全て備える細胞にトランスフェクションする。当該細胞内では、当該ポリメラーゼにより、当該ベクターに組み込んだ麻疹ウイルスゲノムのｃＤＮＡを鋳型として、組換え麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡが合成される。当該細胞内において、当該ゲノムＲＮＡと麻疹ウイルスの転写複製に必要な酵素群により、組換え麻疹ウイルスが製造される。すなわち、製造された組換え麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡは、製造に用いた組換えｃＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＲＮＡである。
麻疹ウイルスゲノムのｃＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを転写するためのＲＮＡポリメラーゼとしては、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクターに組み込んだ麻疹ウイルスゲノムのｃＤＮＡの上流に接続したプロモーターに作用するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。麻疹ウイルスゲノムのｃＤＮＡの上流に接続したプロモーターがＴ７プロモーターの場合、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。当該ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞としては、例えば、予め、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現させる組換えワクシニアウイルスを感染させた細胞や、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を培養細胞の染色体に組み込んだＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ恒常発現株等が挙げられる。
麻疹ウイルスの転写複製に必要な酵素群としては、麻疹ウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質、及びＬタンパク質が挙げられる。麻疹ウイルスの転写複製に必要な酵素群を全て備える細胞は、例えば、Ｎタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクター（Ｎタンパク質の発現ベクター）と、Ｐタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクター（Ｐタンパク質の発現ベクター）と、Ｌタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクター（Ｌタンパク質の発現ベクター）とを、共にトランスフェクションした細胞が挙げられる。
例えば、予め、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現させる組換えワクシニアウイルスを感染させた培養細胞に、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクター、Ｎタンパク質の発現ベクター、Ｐタンパク質の発現ベクター、及びＬタンパク質の発現ベクターを、共にトランスフェクションする。このトランスフェクションされた細胞内で、製造に用いた組換えｃＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＲＮＡをゲノムとする組換え麻疹ウイルスが構築される。
製造された組換え麻疹ウイルスは、ＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチンとして使用できる。すなわち、製造された組換え麻疹ウイルスは、感染した細胞内で増殖し、さらにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はその部分タンパク質が発現し、当該タンパク質に対する抗体の産生が誘導される。このため、当該組換え麻疹ウイルスは、麻疹に対するワクチンであるとともに、ＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチンとしても機能する。
＜医薬用組成物＞
本発明に係る組換え麻疹ウイルスと、薬学的に許容される担体とを適宜混合することにより、これらを含む、麻疹及びＣＯＶＩＤ－１９に対する２価ワクチンとして有用な医薬用組成物を製造することができる。組換え麻疹ウイルスと薬学的に許容される担体とを含む医薬用組成物の製造は、必要に応じて適宜添加剤を用いることにより、医薬品の製造の分野で通常用いられる方法により行うことができる。
本発明に係る組換え麻疹ウイルスと、薬学的に許容される担体とを適宜混合することにより、これらを含む、麻疹及びＣＯＶＩＤ－１９に対する２価ワクチンとして有用な医薬用組成物を製造することができる。組換え麻疹ウイルスと薬学的に許容される担体とを含む医薬用組成物の製造は、必要に応じて適宜添加剤を用いることにより、医薬品の製造の分野で通常用いられる方法により行うことができる。
薬学的に許容しうる担体とは、投与対象に有害な生理学的反応を引き起こさず、かつ薬効成分等の他の成分と有害な相互作用を生じないような希釈剤、賦形剤、結合剤、溶媒等である。当該担体としては、具体的には、例えば、水、生理食塩水、各種緩衝液等が用いられる。また、使用できる添加剤としては、アジュバント、希釈剤、賦形剤、結合剤、安定剤、等張化剤、緩衝剤、溶解補助剤、懸濁化剤、保存剤、凍害防止剤、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、静菌剤等が挙げられる。
免疫原性を高めるためのアジュバントとしては、医薬品分野で慣用のものを使用できる。具体的には、例えば、ＢＣＧ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ等の菌体、細胞壁、トレハロースダイマイコレート（ＴＤＭ）等の菌体成分、グラム陰性菌の内毒素であるリポ多糖類（ＬＰＳ）やリピドＡ画分、β－グルカン、Ｎ－アセチルムラミルジペプチド（ＭＤＰ）ペスタチン、レバミゾール等の合成化合物、胸腺ホルモン、胸腺因子、タフトシンなどの生体成分由来の蛋白、ペプチド性物質、フロインド不完全アジュバント、フロインド完全アジュバント等が挙げられる。
ワクチンの剤型は、液状、凍結物、及び凍結乾燥物のいずれであってもよい。適宜培地や培養細胞等で培養して得られた培養液を採取し、安定剤等の添加剤を添加して、小分瓶やアンプル等に分注後密栓して、液状ワクチンを製造することができる。分注後、徐々に温度を下降させて凍結したものが凍結ワクチンであり、凍害防止剤や結凍保護剤を添加しておく。分注した容器を凍結乾燥機中で凍結、次いで真空乾燥し、そのまま又は窒素ガスを充填して密栓すると、凍結乾燥ワクチンが得られる。液状ワクチンはそのまま、又は生理食塩水等で希釈して用いられる。凍結ワクチン及び乾燥ワクチンは、使用時にワクチンを溶解するための溶解用液が用いられる。溶解用液は、各種の緩衝液や生理食塩水である。
ワクチンの投与は、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与等により行うことができる。投与量は、被験者の年齢、体重、性別、投与方法等により異なり、特に限定されるものではないが、通常１回当たり１０４～１０７ ＴＣＩＤ５０の範囲が好ましく、少なくとも１０５ ＴＣＩＤ５０とするのが特に好ましい。投与は、麻疹ワクチンと同様に行うことが好ましい。
また、本発明に係る組換え麻疹ウイルスを、ヒトを含む各種動物に感染させた後、当該動物から採取した体液より抗血清等を得て、治療や診断に用いることもできる。
次に、実施例等により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
［実施例１］
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質（ＣｏＶ－Ｓ）遺伝子を持つ組換え麻疹ウイルス（ＭＶ－ＣｏＶＳ）を作製した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質（ＣｏＶ－Ｓ）遺伝子を持つ組換え麻疹ウイルス（ＭＶ－ＣｏＶＳ）を作製した。
＜ＣｏＶ－Ｓ遺伝子を持つ組換え麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡのｃＤＮＡを含むプラスミドｐＭＶ－ＣｏＶＳの調製＞
まず、配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＲＮＡがゲノムＲＮＡである麻疹弱毒化株である麻疹ウイルスからゲノムＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡを鋳型としてＲＴ－ＰＣＲを行い、全長ゲノムＲＮＡをいくつかの部分領域に分けてＲＴ－ＰＣＲを行い、得られた増幅断片を連結して、プラスミドｐＭＤＢ１に、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片がＴ７プロモーターの下流に連結されるように組み込まれたプラスミドｐＭＶ－Ｅｄを得た。
まず、配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＲＮＡがゲノムＲＮＡである麻疹弱毒化株である麻疹ウイルスからゲノムＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡを鋳型としてＲＴ－ＰＣＲを行い、全長ゲノムＲＮＡをいくつかの部分領域に分けてＲＴ－ＰＣＲを行い、得られた増幅断片を連結して、プラスミドｐＭＤＢ１に、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片がＴ７プロモーターの下流に連結されるように組み込まれたプラスミドｐＭＶ－Ｅｄを得た。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｖｅｒｏ細胞から抽出した全ＲＮＡを用いて、ＲＴ－ＰＣＲによって、ＣｏＶ－Ｓ遺伝子のｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを鋳型として、５’末端にＦｓｅ Ｉ認識配列を有するプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、両末端にＦｓｅ Ｉ認識配列を有する、スパイクタンパク質をコードするＤＮＡ断片（ＣｏＶ－Ｓ断片：配列番号４）を得た。
プラスミドｐＭＶ－ＥｄとＣｏＶ－Ｓ断片をＦｓｅ Ｉにより消化処理し、両者をライゲーションにより連結させて、ｐＭＶ－ＥｄのＦｓｅ Ｉ認識部位に挿入し、図１に示すゲノム構造のｃＤＮＡを有するプラスミドｐＭＶ－ＣｏＶＳを得た。
プラスミドｐＭＶ－ＥｄとＣｏＶ－Ｓ断片をＦｓｅ Ｉにより消化処理し、両者をライゲーションにより連結させて、ｐＭＶ－ＥｄのＦｓｅ Ｉ認識部位に挿入し、図１に示すゲノム構造のｃＤＮＡを有するプラスミドｐＭＶ－ＣｏＶＳを得た。
＜ＭＶ－ＣｏＶＳの再構成＞
麻疹ウイルスの複製に、プラスミドｐＧＥＭに麻疹ウイルスのＮタンパク質遺伝子を挿入したＮタンパク質発現ベクターｐＧＥＭ－ＮＰ、ｐＧＥＭに麻疹ウイルスのＰタンパク質遺伝子を挿入したＰタンパク質発現ベクターｐＧＥＭ－Ｐ、ｐＧＥＭに麻疹ウイルスのＬタンパク質遺伝子を挿入したＬタンパク質発現ベクターｐＧＥＭ－Ｌ、及びｐＭＶ－ＣｏＶＳを用いた。１ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）の入った１．５ｍＬ容サンプリングチューブに、２μｇのｐＧＥＭ－ＮＰ、２μｇのｐＧＥＭ－Ｐ、０．２μｇのｐＧＥＭ－Ｌ、及び２μｇのｐＭＶ－ＣｏＶＳを添加し、核酸溶液を調製した。別のサンプリングチューブに１ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭを分取し、これにトランスフェクション試薬「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ＬＴＸ」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を添加して混合した後、この状態で室温に５分間静置した。その後、当該トランスフェクション試薬溶液を前記核酸溶液と混合し、さらに室温で１５分間以上静置したものを、プラスミド溶液として用いた。
麻疹ウイルスの複製に、プラスミドｐＧＥＭに麻疹ウイルスのＮタンパク質遺伝子を挿入したＮタンパク質発現ベクターｐＧＥＭ－ＮＰ、ｐＧＥＭに麻疹ウイルスのＰタンパク質遺伝子を挿入したＰタンパク質発現ベクターｐＧＥＭ－Ｐ、ｐＧＥＭに麻疹ウイルスのＬタンパク質遺伝子を挿入したＬタンパク質発現ベクターｐＧＥＭ－Ｌ、及びｐＭＶ－ＣｏＶＳを用いた。１ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）の入った１．５ｍＬ容サンプリングチューブに、２μｇのｐＧＥＭ－ＮＰ、２μｇのｐＧＥＭ－Ｐ、０．２μｇのｐＧＥＭ－Ｌ、及び２μｇのｐＭＶ－ＣｏＶＳを添加し、核酸溶液を調製した。別のサンプリングチューブに１ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭを分取し、これにトランスフェクション試薬「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ＬＴＸ」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を添加して混合した後、この状態で室温に５分間静置した。その後、当該トランスフェクション試薬溶液を前記核酸溶液と混合し、さらに室温で１５分間以上静置したものを、プラスミド溶液として用いた。
６ウェルプレートに、１ウェル当たり、通常のトリプシン処理を施した培養細胞株ＢＨＫ－Ｔ７細胞を５×１０５個と２ｍＬの培養培地（２％のウシ胎児血清を含有させたＤＭＥＭ培地）とを添加し、５％ ＣＯ２、３７℃の条件下で６時間培養した。その後、各ウェルに、２００μＬのプラスミド溶液を滴下した。
前記６ウェルプレート内の細胞を２日間、５％ ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。２日目に培地を除去した後、ＶＰ－ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）に懸濁したＶｅｒｏ細胞を、１ウェル当たり５×１０５個になるように播種し、ＢＨＫ－Ｔ７細胞の上に重層した。当該プレートをさらに５％ ＣＯ２、３７℃の条件下で培養したところ、Ｖｅｒｏ細胞に細胞障害性効果（ＣＰＥ）が観察された。このＣＰＥは、ＢＨＫ－Ｔ７細胞内で再構成された組換え麻疹ウイルスＭＶ－ＣｏＶＳが感染したＶｅｒｏ細胞内で、ＭＶ－ＣｏＶＳが増殖したことを示す。
ＣＰＥが観察されたＶｅｒｏ細胞から抽出したＲＮＡを鋳型としてＲＴ－ＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ断片のシークエンス解析により、当該Ｖｅｒｏ細胞内で組換え麻疹ウイルスＭＶ－ＣｏＶＳが再構成されたことを確認した。
さらに、ＣＰＥが観察されたＶｅｒｏ細胞に対して、ＣｏＶ－Ｓに対する抗体（抗ＣｏＶ－Ｓ抗体）を一次抗体とした蛍光免疫染色を行った。まず、組換え麻疹ウイルスＭＶ－ＣｏＶＳをＶｅｒｏ細胞に感染させ、４８時間後に細胞を４％ パラホルムアルデヒドで固定し、０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で浸透化した。次いで、１０００倍希釈した抗ＣｏＶ－Ｓ抗体（マウス血清）を加えて室温１時間反応させた。抗ＣｏＶ－Ｓ抗体を除去し、ＰＢＳで３回洗浄させた後、Ａｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体を５００倍希釈して添加し、室温で３０分間インキュベートして反応させた。Ａｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体を除去し、ＰＢＳで５回洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡を用いてＭＶ－ＣｏＶＳ感染Ｖｅｒｏ細胞を観察した。
図２に、ＭＶ－ＣｏＶＳ感染Ｖｅｒｏ細胞の透過像画像（左図）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を蛍光免疫染色した画像（右図）を示す。図２に示すように、ＭＶ－ＣｏＶＳを感染させていないＶｅｒｏ細胞ではＡｌｅｘａ４８８蛍光は観察されなかったが、ＭＶ－ＣｏＶＳ感染Ｖｅｒｏ細胞ではＡｌｅｘａ４８８蛍光が観察された。この結果から、組換え麻疹ウイルスＭＶ－ＣｏＶＳが感染したＶｅｒｏ細胞内ではＣｏＶ－Ｓタンパク質が発現していること、すなわち、ＣｏＶ－Ｓタンパク質を発現する組換え麻疹ウイルスが作製できたことが確認された。
麻疹ウイルスを感染させていないＶｅｒｏ細胞（非感染細胞）と、麻疹ウイルスＭＶ－Ｅｄを感染させたＶｅｒｏ細胞（ＭＶ－Ｅｄ細胞）と、麻疹ウイルスＭＶ－ＣｏＶＳを感染させたＶｅｒｏ細胞（ＭＶ－ＣｏＶＳ細胞）に対して、麻疹ウイルスのＮタンパク質を認識する抗体（抗ＭＶ－Ｎ抗体）と抗ＣｏＶ－Ｓ抗体を用いたウェスタンブロッティング解析を行った。抗ＭＶ－Ｎ抗体と抗ウサギＩｇＧ抗体を用いたウェスタンブロットの結果を図３（左）に、抗ＣｏＶ－Ｓ抗体と抗マウスＩｇＧ抗体を用いたウェスタンブロットの結果を図３（右）に、それぞれ示す。ＭＶ－Ｅｄ細胞とＭＶ－ＣｏＶＳ細胞の両方において、ＭＶ－Ｎタンパク質のバンドが確認されたが（図３（左）、星印）、ＭＶ－ＣｏＶＳ細胞のみにおいて、ＣｏＶ－Ｓタンパク質のバンドが確認された（図３（右）、星印）。
＜麻疹ウイルスＭＶ－ＣｏＶＳによる抗体産生誘導＞
さらに、麻疹ウイルスＭＶ－ＣｏＶＳをハムスターに接種し、抗体産生が誘導されるかを調べた。具体的には、ハムスターに、麻疹ウイルスＭＶ－ＣｏＶＳを２回、腹腔内接種（ＩＰ）し、経時的に血液を採取し、血清中の抗ＣｏＶ－Ｓ抗体のタイターを測定した。２回目のウイルス接種は、最初の接種から５週目（３５日目）に行った。対照として、麻疹ウイルスＭＶ－Ｅｄを同様にしてハムスターに接種した。血清中の抗ＣｏＶ－Ｓ抗体のタイターを経時的に測定した。血清中の抗ＣｏＶ－Ｓ抗体のタイターは、血清を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。
さらに、麻疹ウイルスＭＶ－ＣｏＶＳをハムスターに接種し、抗体産生が誘導されるかを調べた。具体的には、ハムスターに、麻疹ウイルスＭＶ－ＣｏＶＳを２回、腹腔内接種（ＩＰ）し、経時的に血液を採取し、血清中の抗ＣｏＶ－Ｓ抗体のタイターを測定した。２回目のウイルス接種は、最初の接種から５週目（３５日目）に行った。対照として、麻疹ウイルスＭＶ－Ｅｄを同様にしてハムスターに接種した。血清中の抗ＣｏＶ－Ｓ抗体のタイターを経時的に測定した。血清中の抗ＣｏＶ－Ｓ抗体のタイターは、血清を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。
１回目のワクチン接種（０日目）からの、血清中の抗ＣｏＶ－Ｓ抗体のタイターの経時的な測定結果を図４に示す。麻疹ウイルスＭＶ－Ｅｄを接種したハムスターでは、血清中の抗ＣｏＶ－Ｓ抗体の産生は観察されなかった。これに対して、麻疹ウイルスＭＶ－ＣｏＶＳを２回接種したハムスターでは、血清中の抗ＣｏＶ－Ｓ抗体のタイターが上昇しており、２回のワクチン接種によって抗ＣｏＶ－Ｓ抗体の産生が誘導されていた。これらの結果が示すように、麻疹ウイルスＭＶ－ＣｏＶＳは、免疫誘導能があり、ＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチンの有用な候補である。
［実施例２］
実施例１で製造した麻疹ウイルスワクチンＭＶ－ＣｏＶＳの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の各ウイルス株に対する有効性を調べた。
実施例１で製造した麻疹ウイルスワクチンＭＶ－ＣｏＶＳの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の各ウイルス株に対する有効性を調べた。
＜ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス株＞
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２としては、武漢株１種（ＪＰＮ/Ｔｙ/ＷＫ－５２１株）、α株２種（ＱＨＮ００１株（α－１）、ＱＫ００２株（α－２））、β株１種（ＴＹ８－６１２株）、及びγ株２種（ＴＹ７－５０１株（γ－１）、ＴＹ７－５０３株（γ－２））を用いた。これらのウイルス株はいずれも、国立感染症研究所より分与されたものを用いた。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２としては、武漢株１種（ＪＰＮ/Ｔｙ/ＷＫ－５２１株）、α株２種（ＱＨＮ００１株（α－１）、ＱＫ００２株（α－２））、β株１種（ＴＹ８－６１２株）、及びγ株２種（ＴＹ７－５０１株（γ－１）、ＴＹ７－５０３株（γ－２））を用いた。これらのウイルス株はいずれも、国立感染症研究所より分与されたものを用いた。
＜ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス株間による病原性比較試験＞
まず、各ウイルス株をそれぞれハムスターに感染させ、その病原性を比較した。具体的には、体温測定チップを埋め込んだハムスターに、１×１０５ ＴＣＩＤ５０／匹（５０μＬ）のウイルスを経鼻接種させた。接種後、経時的に、体重測定と咽頭スワブ及び鼻洗浄液の採取を行った。また、接種後３日目又は６日目に剖検を行い、肺（右肺前葉、右肺中葉、右肺後葉、左肺葉）及び気管中のウイルス量を、各組織から抽出したＲＮＡを鋳型としたＲＴ－ｑＰＣＲ法により解析した。
まず、各ウイルス株をそれぞれハムスターに感染させ、その病原性を比較した。具体的には、体温測定チップを埋め込んだハムスターに、１×１０５ ＴＣＩＤ５０／匹（５０μＬ）のウイルスを経鼻接種させた。接種後、経時的に、体重測定と咽頭スワブ及び鼻洗浄液の採取を行った。また、接種後３日目又は６日目に剖検を行い、肺（右肺前葉、右肺中葉、右肺後葉、左肺葉）及び気管中のウイルス量を、各組織から抽出したＲＮＡを鋳型としたＲＴ－ｑＰＣＲ法により解析した。
各ウイルス株を接種させたハムスターの肺で増殖したウイルス量を測定した結果を図５に示す。いずれの株もハムスターの肺で増殖したことが確認された。中でも、β株では、他のウイルス株よりも、ウイルス増殖が早く抑えられる傾向が認められた。
＜ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンの有効性試験＞
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２としては、武漢株、α－１株、β株、及びγ－１株を用いた。
まず、ハムスターに、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンを２回、腹腔内接種（ＩＰ）した。２回目のウイルス接種は、最初の接種（接種０日目）から４週目（接種後２８日目）に行った。その後、最初のワクチン接種から３０日目に、各ハムスターに体温測定チップを埋め込み、次いで最初のワクチン接種から３５日目に、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス株間による病原性比較」と同様にして、ウイルス株を接種させた後、経時的に、体重測定と咽頭スワブ及び鼻洗浄液の採取を行い、ウイルス接種後３日目又は６日目（ワクチン接種後３８日目又は４１日目）に剖検を行い、肺及び気管中のウイルス量を解析した。加えて、各組織の病理組織学的解析も行った。対照として、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンを接種させていないハムスターに対しても同様にウイルス株を接種させ、解析を行った。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２としては、武漢株、α－１株、β株、及びγ－１株を用いた。
まず、ハムスターに、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンを２回、腹腔内接種（ＩＰ）した。２回目のウイルス接種は、最初の接種（接種０日目）から４週目（接種後２８日目）に行った。その後、最初のワクチン接種から３０日目に、各ハムスターに体温測定チップを埋め込み、次いで最初のワクチン接種から３５日目に、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス株間による病原性比較」と同様にして、ウイルス株を接種させた後、経時的に、体重測定と咽頭スワブ及び鼻洗浄液の採取を行い、ウイルス接種後３日目又は６日目（ワクチン接種後３８日目又は４１日目）に剖検を行い、肺及び気管中のウイルス量を解析した。加えて、各組織の病理組織学的解析も行った。対照として、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンを接種させていないハムスターに対しても同様にウイルス株を接種させ、解析を行った。
図６に、各ハムスターの体重変化を示す。図６（Ａ）がワクチン非接種群の結果であり、図６（Ｂ）がワクチン非接種群の結果である。ワクチン非接種群では、体重が６日間で１割程度減少した（図６（Ａ））。それに対して、ワクチン接種群では、顕著な体重減少は認められなかった（図６（Ｂ））。
ウイルス接種後６日目に行われた剖検で採取された肺を肉眼で観察したところ、ワクチン非接種群の肺は、肉眼所見として、顕著な肺炎像を示した。これに対して、ワクチン接種群の個体では、ほぼ正常であるか、又は一部の出血斑を認めたのみであった。つまり、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２による肺炎を強く抑制する優れた防御効果を示した。また、ワクチン接種によるウイルスの防御効果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のいずれの変異株に対しても同様に得られた。
ウイルス接種後３日目及び６日目に行われた剖検で採取された肺中の増殖したウイルス量を測定した結果を図７に示す。図７（Ａ）は、ウイルス接種後３日目のワクチン非接種群の結果であり、図７（Ｂ）は、ウイルス接種後３日目のワクチン接種群の結果である。図７（Ｃ）は、ウイルス接種後６日目のワクチン非接種群の結果であり、図７（Ｄ）は、ウイルス接種後６日目のワクチン接種群の結果である。ワクチン非接種群では、肺での高いウイルス増殖が認められた（図７（Ａ）及び（Ｃ））。これに対して、ワクチン接種群の個体では、ウイルス増殖が強く抑制されていた（図７（Ｂ）及び（Ｄ））。すなわち、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンは、肺でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２増殖を強く抑制しており、そのウイルス増殖抑制効果は、いずれの変異株に対しても同様に得られた。
［実施例３］
実施例１で製造した麻疹ウイルスワクチンＭＶ－ＣｏＶＳの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後における中和抗体産生の誘導能を調べた。
実施例１で製造した麻疹ウイルスワクチンＭＶ－ＣｏＶＳの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後における中和抗体産生の誘導能を調べた。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２としては、武漢株、α－１株、及びδ株（ＴＹ１１－９２７株）を用いた。δ株は、国立感染症研究所より分与されたものを用いた。
まず、ハムスターに、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンを２回、腹腔内接種（ＩＰ）した。２回目のウイルス接種は、最初の接種（接種０日目）から３週目（接種後２１日目）に行った。最初のワクチン接種から２８日目に、各ハムスターから血清を採取し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の武漢株、α－１株、及びδ株のそれぞれに対する中和抗体価を測定した。測定結果を図８（Ａ）に示す。
その後、最初のワクチン接種から３０日目に、各ハムスターに体温測定チップを埋め込み、次いで最初のワクチン接種から３５日目に、実施例２と同様にして、ウイルス株を接種させた。その後、ウイルス接種後３日目又は６日目（ワクチン接種後３８日目又は４１日目）のハムスターから血清を採取し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の武漢株、α－１株、及びδ株のそれぞれに対する中和抗体価を測定した。測定結果を図８（Ｂ）に示す。図８（Ｂ）中、「Ｄａｙ３」及び「Ｄａｙ６」は、それぞれ、ウイルス接種後３日目及び６日目のハムスターの血清の結果である。
図８（Ａ）に示すように、武漢株、α－１株、及びδ株のいずれに対しても、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンを２回接種後のハムスターの血清では、１０倍から１６０倍の中和抗体価を示すことが明らかとなった。また、図８（Ｂ）に示すように、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンを２回接種後、さらにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させたハムスターでは、漢株、α－１株、及びδ株のいずれに対しても、ワクチン接種後ウイルス接種前よりもさらに高い中和抗体価を示した。
［実施例４］
実施例１で製造した麻疹ウイルスワクチンＭＶ－ＣｏＶＳの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のδ株に対する有効性を調べた。
まず、ハムスターに、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンを２回、腹腔内接種（ＩＰ）した。２回目のウイルス接種は、最初の接種（接種０日目）から４週目（接種後２８日目）に行った。その後、最初のワクチン接種から３０日目に、各ハムスターに体温測定チップを埋め込み、次いで最初のワクチン接種から３５日目に、実施例２と同様にして、ウイルス株を接種させた後、ウイルス接種後３日目又は６日目（ワクチン接種後３８日目又は４１日目）に剖検を行い、肺及び気管中のウイルス量を解析した。加えて、各組織の病理組織学的解析も行った。対照として、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンを接種させていないハムスターに対しても同様にウイルス株を接種させ、解析を行った。
実施例１で製造した麻疹ウイルスワクチンＭＶ－ＣｏＶＳの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のδ株に対する有効性を調べた。
まず、ハムスターに、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンを２回、腹腔内接種（ＩＰ）した。２回目のウイルス接種は、最初の接種（接種０日目）から４週目（接種後２８日目）に行った。その後、最初のワクチン接種から３０日目に、各ハムスターに体温測定チップを埋め込み、次いで最初のワクチン接種から３５日目に、実施例２と同様にして、ウイルス株を接種させた後、ウイルス接種後３日目又は６日目（ワクチン接種後３８日目又は４１日目）に剖検を行い、肺及び気管中のウイルス量を解析した。加えて、各組織の病理組織学的解析も行った。対照として、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンを接種させていないハムスターに対しても同様にウイルス株を接種させ、解析を行った。
ウイルス接種後６日目に行われた剖検で採取された肺を肉眼で観察したところ、ワクチン非接種群の肺は、肉眼所見として、顕著な肺炎像を示した。これに対して、ワクチン接種群の個体では、ワクチン非接種群で認められた出血、浮腫等はほとんど認められなかった。つまり、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２δ株による肺炎を強く抑制する優れた防御効果を示した。
ウイルス接種後３日目及び６日目に行われた剖検で採取された肺中の増殖したウイルス量を測定した結果を図９に示す。図９（Ａ）は、ウイルス接種後３日目のハムスターの結果であり、図９（Ｂ）は、ウイルス接種後６日目のハムスターの結果である。ワクチン非接種群では、いずれの肺葉においても、高いウイルス増殖が認められたが、ワクチン接種群の個体では、ワクチン非接種群と比較し有意にウイルス増殖が抑制されていた。すなわち、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンは、肺でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２δ株の増殖を強く抑制していた。
［実施例５］
実施例１で製造した麻疹ウイルスワクチンＭＶ－ＣｏＶＳの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後における細胞性免疫の誘導能を調べた。
実施例１で製造した麻疹ウイルスワクチンＭＶ－ＣｏＶＳの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後における細胞性免疫の誘導能を調べた。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２としては、武漢株、α－１株、β株、及びγ－１株を用いた。
まず、ハムスターに、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンを２回、腹腔内接種（ＩＰ）した。２回目のウイルス接種は、最初の接種（接種０日目）から３週目（接種後２１日目）に行った。最初のワクチン接種から２４日目に、各ハムスターに体温測定チップを埋め込み、次いで最初のワクチン接種から２８日目に、実施例２と同様にして、ウイルス株を接種させた。その後、ウイルス接種後３日目又は６日目（ワクチン接種後３１日目又は３４日目）のハムスターから血清を採取し、細胞性免疫の指標の一つである血清中のＩＦＮγ量を、ＥＬＩＳＡにより測定した。対照として、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンを接種していないハムスターにも同様にして、体温測定チップを埋め込み、ウイルス株を接種させ、ウイルス接種後３日目又は６日目の血清中のＩＦＮγ量を測定した。
まず、ハムスターに、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンを２回、腹腔内接種（ＩＰ）した。２回目のウイルス接種は、最初の接種（接種０日目）から３週目（接種後２１日目）に行った。最初のワクチン接種から２４日目に、各ハムスターに体温測定チップを埋め込み、次いで最初のワクチン接種から２８日目に、実施例２と同様にして、ウイルス株を接種させた。その後、ウイルス接種後３日目又は６日目（ワクチン接種後３１日目又は３４日目）のハムスターから血清を採取し、細胞性免疫の指標の一つである血清中のＩＦＮγ量を、ＥＬＩＳＡにより測定した。対照として、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンを接種していないハムスターにも同様にして、体温測定チップを埋め込み、ウイルス株を接種させ、ウイルス接種後３日目又は６日目の血清中のＩＦＮγ量を測定した。
各ハムスターの血清中ＩＦＮγ量の測定結果を図１０に示す。ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンで免疫していないハムスターでは、攻撃試験（ワクチン接種）後の血清中にＩＦＮγは検出されず、ＩＦＮγの産生誘導は観察されなかった。これに対して、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンで免疫したハムスターでは、いずれのウイルス株を接種させたハムスターであっても、血清に１０～３０ｐｇ／ｍＬのＩＦＮγが検出された。これらの結果から、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後に細胞性免疫が誘導されること、この細胞性免疫誘導能は、いずれのウイルス株に対しても発揮されることがわかった。
麻疹ウイルスは、感染した個体に対して、液性免疫と細胞性免疫の両者を誘導する。麻疹ウイルス感染では、特に細胞性免疫を強く誘導すると考えられている。細胞性免疫の傷害性Ｔ細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のうちの、スパイクタンパク質の抗体結合部位のアミノ酸に中和抗体の結合を回避する変異があるウイルス株においても、スパイクタンパク質を認識する。このため、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のいずれの変異株に対しても、細胞性免疫を誘導して抗ウイルス効果を発揮すると期待できる。実際に、本実験において、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンが、いずれの変異株による攻撃に対しても同様に高い防御効果を示した。従って、今後様々な抗体回避変異株が出てきても、ＭＶ－ＳＣｏＶ２ワクチンはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して高い有効性が期待できる。
Claims (13)
- 麻疹ウイルスゲノム中のＮ遺伝子領域とＰ遺伝子領域の間に、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、組換え麻疹ウイルス。
- 前記タンパク質が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又はその部分タンパク質である、請求項１に記載の組換え麻疹ウイルス。
- 前記麻疹ウイルスゲノムが、配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＲＮＡである、請求項１又は２に記載の組換え麻疹ウイルス。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載の組換え麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡ。
- 配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなる、ＲＮＡ。
- 配列番号２で表される塩基配列中の１６８６番目の塩基から１６９４番目の塩基までの領域に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、ＤＮＡ。
- 配列番号１で表される塩基配列の１６８６番目の塩基から１６９４番目の塩基までにあるＦｓｅ Ｉ認識配列に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、ＤＮＡ。
- 配列番号３で表される塩基配列からなる、ＤＮＡ。
- 請求項６～８のいずれか一項に記載のＤＮＡを含む、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクター。
- 配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡを含む、プラスミドベクター。
- 請求項６～８のいずれか一項に記載のＤＮＡを含むＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製造用ベクターと、麻疹ウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質、及びＬタンパク質の発現ベクターとを、前記ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを転写することができるＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞にトランスフェクションし、前記細胞内で組換え麻疹ウイルスを製造する、組換え麻疹ウイルスの製造方法。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載の組換え麻疹ウイルスと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬用組成物。
- 麻疹及びＣＯＶＩＤ－１９に対する２価ワクチンとして使用される、請求項１２に記載の医薬用組成物。
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