CN103348007A - 在植物中产生病毒样颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了在植物中产生病毒样颗粒(VLP)的方法和包含VLP的组合物。所述方法包括将包含调节区的核酸引入到植物或植物的一部分中，所述调节区在所述植物中有活性并且与嵌合核苷酸序列可操作地相连接，所述嵌合核苷酸序列串联地编码与流感跨膜结构域和胞质尾区相融合的来自病毒三聚体表面蛋白或其片段的胞外域，所述胞外域来自非流感病毒三聚体表面蛋白并且相对于所述流感跨膜结构域和所述胞质尾区是异源的。在允许表达所述核酸的条件下孵育所述植物或所述植物部分，从而产生所述VLP。还提供了由该方法产生的VLP。

Description

在植物中产生病毒样颗粒
技术领域
本发明涉及在植物中产生嵌合病毒蛋白质。更具体地，本发明还涉及在植物中产生包含嵌合病毒蛋白质的病毒样颗粒。
背景技术
疫苗接种(vaccination)通过诱导对象在感染前进行防御而提供对抗由类似病原体(agent)所导致之疾病的保护。常规地，这通过使用感染性病原体(infectious agent)(如免疫原)的活的减毒形式或完整的灭活形式来完成。为了避免使用完整的病毒(例如死病毒或减毒病毒)作为疫苗的危险，将重组病毒蛋白质(例如亚单位)用作疫苗。肽疫苗和亚单位疫苗均受到许多潜在的局限。亚单位疫苗可展现出较差的免疫原性(由于不正确折叠)、较差的抗原呈递或者糖类和脂质组成的差异。主要的问题是很难确保经改造蛋白质的构象模仿该抗原在其自然环境中的构象。必须使用合适的佐剂和(在肽的情况中)载体蛋白以加强免疫应答。另外，这些疫苗主要引起体液应答，因此可能无法引发有效的免疫。亚单位疫苗对于疾病常常是无效的，但可证明完整的灭活病毒提供对所述疾病的保护。
病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)对于免疫原性组合物的内含物而言是潜在的候选物。VLP与成熟的病毒体非常类似，但是它们不含有病毒基因组物质。因此，VLP本身是非复制性的，这使得它们作为疫苗施用是安全的。另外，可将VLP改造以在VLP的表面上表达病毒糖蛋白，这是它们最天然的生理构型。此外，由于VLP类似完整的病毒体并且是多价的微粒结构，所以VLP在诱导针对糖蛋白的中和抗体中可比可溶性包膜蛋白抗原更有效。
已在用于疫苗目的的昆虫和哺乳动物系统中产生了超过三十种不同病毒的VLP(Noad，R.和Roy，P.，2003，Trends Microbiol11：438-44)。数项研究已证明，重组流感蛋白质在使用哺乳动物表达质粒或杆状病毒载体的细胞培养物中自装配成VLP(例如Gomez-Puertas等，1999，J.Gen.Virol，80，1635-1645；Neumann等，2000，J.Virol.，74，547-551；Latham和Galarza，2001，J.Virol.，75，6154-6165)。
Gomez-Puertas等(1999，J.Gen.Virol.，80，1635-1645)证明，流感VLP的高效形成取决于病毒蛋白质的表达水平。Neumann等(2000，J.Virol.，74，547-551)建立了基于哺乳动物表达质粒的系统，其用于完全从克隆的cDNA产生感染性流感病毒样颗粒。Latham和Galarza(2001，J.Virol.，75，6154-6165)报道了在用共表达HA、NA、M1和M2基因的重组杆状病毒感染的昆虫细胞中形成流感VLP。该研究证明，流感病毒体蛋白质在真核细胞中共表达后进行自装配，并且证明M1基质蛋白对于VLP的产生是必需的。
在数种表达系统(包括杆状病毒、牛痘病毒、果蝇(DS-2)细胞、Vero细胞和酵母球芽(yeast spheroblast))中，Pr55gag从人类免疫缺陷病毒(HIV)的表达导致了在形态上类似于不成熟HIV病毒体的病毒样颗粒(VLP)的装配和释放(由Deml等，2005，Molecular Immunology42：259-277综述)。
HIV包膜蛋白gp160可并入Gag来源的VLP。然而，尽管Pr55gag的高表达，但是仅合并了有限数目的包膜蛋白。Wang等示出，将HIV包膜蛋白的跨膜结构域和胞质尾区(cytosolic tail)结构域(TM/CT)用另一病毒包膜蛋白(包括流感血凝素)的那些替换导致了提高包膜蛋白并入到Pr55gag来源的VLP中(Journal of Virology，2007，81：10869-10878)。还示出，当在使用杆状病毒表达系统昆虫细胞中共表达时，包含HATM/CT的嵌合HIV包膜蛋白并入到流感M1来源的VLP中(WO2008/005777)。
流感病毒穿入细胞取决于HA依赖性受体介导的内吞作用。流感病毒感染周期是从病毒体表面HA蛋白与含有唾液酸的细胞受体(糖蛋白和糖脂)结合开始的。神经氨酸酶(neuraminidase，NA)蛋白介导对唾液酸受体的处理。在含有流感病毒体的内化内体(internalized endosome)的酸性界限内，HA蛋白发生构象变化，这导致病毒与细胞膜融合，病毒脱壳以及M2介导的从核衣壳相关核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)释放M1蛋白，M1蛋白迁移到细胞核中用于病毒RNA合成。Latham和Galarza，200，J.Virol.75，6154-6165)报道了在用共表达HA、NA、M1和M2基因的重组杆状病毒感染的昆虫细胞中形成流感VLP。另外，Gomez-Puertas等，2000，J Virol.74，11538-11547)教导，除了血凝素(HA)以外，流感病毒的基质蛋白(M1)对于VLP从昆虫细胞出芽也是必需的。然而，Chen等(2007，J.Virol.81，7111-7123)教导了M1可能不是VLP形成所必需的。
大多数经表征的出芽机制使用宿主的空泡蛋白分选(vacuolar proteinsorting，VPS)途径(参见Chen和Lamb，Virology372，2008)。已经显示了许多包膜病毒与VPS途径的蛋白质相互作用，这需要运输所需的内体分选复合物(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)蛋白复合物的作用(参见Chen和Lamb2008的表I)。在病毒的核心和基质蛋白上发现了与VPS途径的蛋白质相互作用的后期蛋白结构域(late protein domain)，因此VPS依赖性出芽需要存在基质或核心蛋白。流感HA的胞质尾区的棕榈酰化对于出芽是必需的，但是机制仍不清楚，可能涉及其他表面蛋白结构域的参与。出芽的最低要求仍尚未知晓，不能排除胞外域参与该过程。另外，植物中的VPS途径尚不清楚(参见Schellmann S.，和Pimpl P.，Current Op Plant Biol12：670-676，200)。
已知流感的出芽不依赖于VPS途径。流感病毒的出芽涉及Rab11途径(Bruce等，J.Virol84：5848-5859，2010)。Rab蛋白是位于细胞内运输小泡(transport vesicle)之表面的GTP酶锚(GTPase anchor)，并且它们参与从供体区室(donor compartment)形成小泡、运输、停靠(docking)对接和与接受体区室(acceptor compartment)融合(Vazquez-Martinez和Malagon Frontiers，Endocrinology2：1-9，2011)。在植物中已经鉴别了Rab11途径的组分。然而，植物的运输组分已经进化，导致植物内膜系统的数个特定特性(包括例如大且专化的液泡，高尔基体堆叠的快速移动和内体区室的独特组织)和扩大数量的Rab GTP酶(Rojo E.，和Deneke J.，Plant Phys147：1493-1503，2008)。流感颗粒或病毒出芽取决于Rab11(Bruce等，J.Virol84：5848-5859，2010)，但是尚未鉴别出与Rab11或Rab11相关蛋白质相互作用的蛋白质或蛋白质结构域。然而，还不知道可能对于出芽过程和VLP产生所必需的HA的最小结构域。
在植物中，如果在叶绿体中对积累没有进行改造，那么HIV Pr55gag以极其低的水平积累(Meyers等，2008，BMC Biotechnology8：53；Scotti等，2010，Planta229：1109-1122)。然而，在叶绿体中的积累与合并正确折叠的HIV包膜蛋白不相符，因为后者的成熟和折叠需要分泌途径特异性的翻译后修饰。Rybicki等(2010，Plant Biotechnology Journal8：620-637)指出“...似乎没有人在植物中以合理的产量成功地表达完整的HIV Envgp160蛋白或甚至是所述蛋白的大部分...”。
狂犬病病毒(rabies virus，RV)是弹状病毒科(Rhabdoviridae)的成员。像该科的大部分成员一样，RV为不分节负链RNA病毒(non-segmented，negative stranded RNA virus)，其基因组编码五种病毒蛋白质：RNA依赖性RNA聚合酶(L)；核蛋白(N)；磷酸化蛋白质(P)；位于病毒蛋白质包膜内侧的基质蛋白(M)；以及外表面糖蛋白(G)。Dietzschold B等(1991)，Crit.Rev.Immunol.10：427-439。
用于狂犬病的基于细胞培养的疫苗局限于在细胞培养物中培养的灭活病毒菌株。这些疫苗包含培养在细胞培养物中的病毒。当前生物技术方法针对表达狂犬病病毒的外壳蛋白基因以开发可用作活性疫苗的安全重组蛋白质。已经显示在中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达狂犬病病毒糖蛋白(Burger等，1991)。获得了与从病毒感染细胞分离的与G蛋白共迁移的67K的全长糖基化蛋白质。
WO/1993/001833教导了在含有RNA基因组的杆状病毒表达系统中产生病毒样颗粒(VLP)，该基因组包含由狂犬病M蛋白和狂犬病M1蛋白的鞘包围的3′结构域和填充结构域(filler domain)。VLP还包含狂犬病G蛋白的脂质包膜。
水痘带状疱疹病毒(Varicella Zoster virus，VZV)(还称为人疱疹病毒3(HHV-3))是病毒的疱疹病毒科(Herpesviridae)的α疱疹病毒亚科(alphaherpesvirus)的成员。先前已经从不同疱疹病毒科成员产生了表达糖蛋白或壳皮蛋白(tegument protein)的VLP。从用1型单纯性疱疹病毒(HSV-1)、马疱疹病毒(EHV-1)或假狂犬病病毒感染的细胞获得了包含包膜的壳皮蛋白的轻颗粒(L-颗粒)(McLauchlan和Rixon(1992)J.Gen.Virol.73：269-276；美国专利No.5,384,122)。可从用存在病毒DNA复制抑制子的HSV-1感染的细胞产生不同类型的VLP，称为前病毒DNA复制包膜颗粒(pre-viral DNA replication enveloped particle，PREP)。PREP在结构上与L-颗粒类似，但是含有不同的蛋白质组成(Dargan等(1995)J.Virol.69：4924-4932；美国专利No.5,994,116)。通过使用由酵母Ty逆转录转座子编码的蛋白质p1的技术产生了从VZV表达gE蛋白片段的杂合VLP(Garcia-Valcarcel等(1997)Vaccine15：709-719；Welsh等(1999)J.Med.Virol.59：78-83；美国专利No.6,060,064)。US2011/0008838描述了嵌合VLP，其包含至少一种VZV蛋白质，但是不包含酵母Ty蛋白。所述嵌合VLP包含病毒核心蛋白(例如流感M1或新城疫蛋白M)以及至少一种水痘带状疱疹病毒(VZV)蛋白质。
2003年新进化的冠状病毒(coronavirus，CoV)的传播引起了严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)大流行的全球性威胁(Kuiken，T.等，2003，Lancet362：263-270)。正如其他冠状病毒，采用典型的外围投影(peripheral projection)，SARS-CoV具有包膜颗粒的形态，称为“冠状物(corona)”或“刺突(spike)”，其围绕病毒核心的表面(Ksiazek，T.G.等，2003，N Engl J Med348：1953-1966；Lin，Y.等，2004，Antivir Ther9：287-289)。冠状病毒颗粒核心的外部是一层脂质包膜，其主要含有三种膜蛋白，最丰富的M(膜)蛋白、小的E(包膜)蛋白和S(刺突)蛋白。S蛋白的同三聚体共同地形成上述冠状物，其参与病毒与宿主受体结合、用于病毒进入的膜融合、细胞至细胞传播和冠状病毒的组织嗜性(tissue tropism)。
杆状病毒表达系统已经用于产生SARS病毒VLP(Ho，Y.等，2004，Biochem Biophys Res Commun318：833-838；Mortola，E.和Roy，P.，2004，FEBS Lett576：174-178)。然而，由于昆虫细胞与哺乳动物细胞之间的固有差异，在昆虫细胞(SF9)中装配的VLP在直径上展现出110nm大小，这比真正的SARS-CoV病毒体的78nm大得多(Lin，Y.等，2004，supra，和Ho，Y.等，2004，supra)。另外，基于昆虫细胞之SARS-VLP的免疫原性尚未被研究。另一些研究人员还尝试将哺乳动物表达系统用于产生SARS VLP(Huang，Y.等，2004，J Virol78：12557-65)。然而，VLP的细胞外释放并不高效并且VLP的产量不令人满意。例如，WO/2005/035556描述了在哺乳动物中制备包含表达SARS-CoV E-蛋白、SARS-CoV M-蛋白和SARS-CoV S-蛋白的一种或更多种重组载体的SARS-CoV-病毒样颗粒(SARS-CoV-VLP)的系统。
在任何系统中，VLP的形成对于蛋白质的结构提出了相当大的要求——改变蛋白质序列的伸展对多肽本身的表达可不具有很大的影响，但是结构研究缺乏证明这种改变对形成VLP之作用的结构研究。蛋白质的多个区域和结构的合作随着病毒一起进化并且在不丧失VLP形成下可能不可修正类似的改变。
为了改进作为候选疫苗的VLP，除了昆虫细胞和哺乳动物细胞之外，需要开发其他表达系统。因此，需要评估植物表达系统产生嵌合蛋白质VLP的能力。特别是需要鉴别将装配成VLP之病毒蛋白质的最小数目并且需要评价这些VLP的形态和免疫原性。
发明概述
本发明涉及在植物中产生嵌合病毒蛋白质。更具体地，本发明还涉及在植物中产生包含嵌合病毒蛋白质的病毒样颗粒。
本发明提供了在植物中产生病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括，
a)将包含调节区的核酸引入到所述植物或所述植物的一部分中，所述调节区在所述植物中有活性并且与嵌合核苷酸序列可操作地相连接，所述嵌合核苷酸序列串联地编码与流感跨膜结构域和胞质尾区相融合的来自病毒三聚体表面蛋白或其片段的胞外域，所述胞外域来自非流感病毒三聚体表面蛋白并且相对于所述流感跨膜结构域和所述胞质尾区是异源的，以及
b)在允许表达所述核酸的条件下孵育所述植物或所述植物部分，从而产生所述VLP。
如上所述的方法还包括收获所述植物并纯化所述VLP的步骤(c)。另外，所述VLP可不含有病毒基质或核心蛋白。
本发明提供了上述方法，其中来自所述病毒三聚体表面蛋白或其片段的所述胞外域可源自逆转录病毒科(Retroviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、痘病毒科(Poxviridae)或丝状病毒科(Filoviridae)的病毒。来自所述病毒三聚体表面蛋白的所述胞外域可源自例如，慢病毒属(Lentivirus)、狂犬病病毒属(Lyssavirus)、水痘病毒属(Varicellovirus)、冠状病毒属(Coronavirus)或埃博拉病毒属(Ebolavirus)。来自所述病毒三聚体表面蛋白的所述胞外域可源自例如但不限于HIV、狂犬病病毒、VZV、RSV、SARS病毒、埃博拉病毒、麻疹、腮腺炎(Mumps)、水痘、巨细胞病毒、埃博拉/丝状病毒、疱疹病毒、EB病毒(Epstein-Barr virus)或天花。天然形式的所述病毒三聚体表面蛋白可包含胞外域和跨膜结构域/胞质尾区，例如但不限于F蛋白(RSV、麻疹病毒、腮腺炎、新城疫)、S蛋白(SARS病毒)、env蛋白(HIV)、G蛋白(狂犬病)、包膜糖蛋白(包括E、B、C、I、H)(VZV、巨细胞病毒、疱疹病毒、EB病毒)、GP糖蛋白(埃博拉(ebola)、马尔堡(marburg))，血凝素(天花病毒、牛痘病毒)。
本发明还包括上述方法，其中所述流感跨膜结构域和胞质尾区获自H5(A/印度尼西亚/05/2005)或H3(A/布里斯班/10/2007)。所述跨膜结构域和胞质尾区可包含SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42中所限定的核苷酸序列。
本发明还提供了上述方法，其中在所述引入步骤(步骤a)中，所述核酸在所述植物中瞬时表达。或者，在所述引入步骤(步骤a)中，所述核酸可在所述植物中稳定表达。
本发明还包括上述方法，其中在所述引入步骤(步骤a)中，向所述植物中引入一种或多于一种另外的核酸，其选自编码一种或多于一种伴侣蛋白、质子通道蛋白、蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)或其组合的核苷酸序列。
本发明提供了由上述方法产生的VLP。所述VLP的所述嵌合病毒三聚体表面蛋白可包含植物特异性N-聚糖或经修饰N-聚糖。所述VLP还可包含源自所述植物的一种或多于一种脂质。
本发明包括组合物，其包含用于诱导免疫应答的有效剂量的上述VLP和可药用载体。
本发明涉及由逆转录病毒科、弹状病毒科、疱疹病毒科、冠状病毒科或丝状病毒科的病毒产生嵌合病毒三聚体表面蛋白以及在植物中产生包含这些嵌合病毒三聚体表面蛋白的病毒样颗粒。
另外，本发明涉及在植物中产生人类免疫缺陷病毒(HIV)、狂犬病病毒、水痘带状疱疹病毒(VZV)、严重急性呼吸综合症(SARS)病毒或埃博拉病毒的嵌合三聚体表面蛋白。本发明涉及在植物中产生HIV、狂犬病、VZV、SARS和埃博拉嵌合病毒样颗粒。
根据本发明，提供了在植物中产生嵌合HIV、狂犬病、VZV、SARS或埃博拉VLP的方法，其包括将与在所述植物中有活性的调节区可操作地相连接的编码HIV、狂犬病、VZV、SARS或埃博拉病毒蛋白质的核酸引入到所述植物或所述植物的一部分中，以及在允许所述核酸表达的条件下孵育所述植物或所述植物部分，从而产生所述嵌合HIV、狂犬病、VZV、SARS或埃博拉VLP。
本发明还提供了包含嵌合HIV、狂犬病、VZV、SARS或埃博拉蛋白质的VLP。可通过如本发明所提供的方法产生所述VLP。也可在植物内产生HIV、狂犬病、VZV、SARS或埃博拉VLP。
根据本发明，由HIV、狂犬病、VZV、SARS或埃博拉来源的蛋白质产生的嵌合VLP或VLP不包含M1蛋白。已知所述M1蛋白结合RNA，可认为所述RNA是VLP制备物中的污染物。当为抗原性(VLP)产品获得监管部门批准时，RNA的存在是不期望的，因此没有RNA的嵌合VLP制备物可以是有利的。
尽管天然HIV Env蛋白在植物中难以积累，但是与来自流感HA之跨膜(TM)和胞质尾区(CT)结构域相融合的嵌合HIV Env蛋白在植物中以高水平积累并且在不存在核心蛋白或基质蛋白下出芽进入到HIVVLP中。
该发明概述不一定描述本发明的所有特征。
附图简述
通过参照附图的以下描述，本发明的这些和其他特征会更加显而易见，其中：
图1示出了根据本发明多个实施方案的HIV的数个核苷酸和氨基酸序列以及表达盒。图1A示出了HIV ConSΔCFI的共有核酸序列(SEQ IDNO：1)(天然信号肽用粗体表示，天然跨膜和胞质结构域用下划线表示)。图1B示出了寡核苷酸IF-ApaI-SpPDI.c的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。图1C示出了寡核苷酸SpPDI-HIV gp145.r的核苷酸序列(SEQ IDNO：3)。图1D示出了寡核苷酸IF-SpPDI-gp145.c的核苷酸序列(SEQ IDNO：4)。图1E示出了寡核苷酸WtdTm-gp145.r的核苷酸序列(SEQ IDNO：5)。图1F示出了995号表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)，从PacI(启动子上游)至AscI(紧邻NOS终止子下游)。消除的SbfI限制性位点用粗体表示。PDISP-HIV ConS ΔCFI用下划线表示。图1G示出了PDISP-HIV ConS ΔCFI的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。图1H示出了995号构建体的示意图。
图2示出了根据本发明多个实施方案的HIV的数个核苷酸和氨基酸序列以及表达盒。图2A示出了寡核苷酸IF-H3dTm+gp145.r的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)。图2B示出了寡核苷酸Gp145+H3dTm.c的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)。图2C示出了寡核苷酸H3dTm.r的核苷酸序列(SEQID NO：10)。图2D示出了997号表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)，从PacI(启动子上游)至AscI(紧邻NOS终止子下游)。消除的SbfI限制性位点用粗体表示。PDISP-HIV Con S ΔCFI-A/布里斯班/10/2007H3TM+CT用下划线表示。图2E示出了PDISP-HIV ConS ΔCFI-A/布里斯班/10/2007H3TM+CT的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。图2F示出了997号构建体的示意图。
图3示出了根据本发明多个实施方案的HIV的数个核苷酸和氨基酸序列以及表达盒。图3A示出了寡核苷酸IF-H5dTm+gp145.r的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)。图3B示出了寡核苷酸Gp145+H5dTm.c的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)。图3C示出了寡核苷酸IF-H5dTm.r的核苷酸序列(SEQ ID NO：15)。图3D示出了999号表达盒的核苷酸序列(SEQ IDNO：16)，从PacI(启动子上游)至AscI(紧邻NOS终止子下游)。消除的SbfI限制性位点用粗体表示。PDISP-HIV ConS ΔCFI-A/印度尼西亚/5/2005H5TM+CT用下划线表示。图3E示出了PDISP-HIV ConSΔCFI-A/印度尼西亚/5/2005H5TM+CT的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)。图3F示出了999号构建体的示意图。
图4示出了根据本发明多个实施方案的p19的氨基酸序列和数个表达盒。图4A示出了172号表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：18)，从XmaI(质体蓝素(plastocyanin)启动子上游)至EcoRI(紧邻质体蓝素终止子下游)。TBSV P19核酸序列用下划线表示。图4B示出了TBSV P19沉默抑制子的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)。图4C示出了172号构建体的示意图。
图5示出了如本文中所述表达的嵌合HIV Env基因的示意图。
图6示出了在农杆菌渗入的(agroinfiltrated)本塞姆氏烟草(Nicotianabenthamiana)叶中HIV Env蛋白表达的Western印迹分析。泳道1至4，在从模拟渗入的植物提取的20μg叶蛋白质中的分别为100、50、10和5ng的重组HIV-1gp160(ab68171)(阳性对照)。泳道5，来自模拟渗入的植物的20μg蛋白质(阴性对照)。泳道6至8，从AGL1/995渗入的叶提取的蛋白质(分别为20μg、10μg和2μg，用从模拟渗入的植物提取的叶蛋白质补充至20μg)。泳道9和10，从AGL1/997渗入的叶提取的蛋白质(分别为20μg和10μg，用从模拟渗入的植物提取的叶蛋白质补充至20μg)。泳道11和12，从AGL1/999渗入的叶提取的蛋白质(分别为20μg和10μg，用从模拟渗入的植物提取的叶蛋白质补充至20μg)。
图7示出了通过尺寸排阻色谱表征HIV ConSΔCFI来源的构建体。采用校准的S-500高分辨率柱通过凝胶过滤分离来自用产生Env/H5嵌合蛋白之AGL1/999渗入的叶的蛋白质提取物。(A)通过使用抗gp120抗体的免疫检测揭示了洗脱级分的HIV Env蛋白质含量。泳道1至4，在从模拟渗入的植物提取的20μg叶蛋白质中的分别为100、50、10和5ng的重组HIV-1gp160(ab68171)(阳性对照)。泳道5，来自模拟渗入的植物的20μg蛋白质(阴性对照)。泳道6，从AGL1/999渗入的叶提取的20μg蛋白质。泳道7至18，来自凝胶过滤色谱的洗脱级分7至18。(B)来自凝胶过滤色谱的洗脱级分7至18的相对蛋白质含量。
图8示出了根据本发明多个实施方案的狂犬病的数个核苷酸和氨基酸序列以及表达盒。图8A示出了构建体1074(在含有质体蓝素-P19-质体蓝素沉默抑制子的载体上的C-2X35S-狂犬病糖蛋白G(RabG)+H5A/印度尼西亚/5/2005跨膜结构域和胞质尾区(TM+CT)-NOS)的示意图。图8B示出了引物IF-RabG-S2+4.c(SEQ ID NO：32)。图8C示出了引物RabG+H5dTm.r(SEQ ID NO：33)。图8D示出了合成的Rab G基因(对应于来自Genebank检索号EF206707的nt3317～4891；天然信号肽用粗体表示，天然跨膜和胞质结构域用下划线表示；SEQ ID NO：34)。图8E示出了引物IF-H5dTm.c(SEQ ID NO：35)。图8F示出了构建体141，从左至右t-DNA(下划线)。具有质体蓝素-P19-质体蓝素沉默抑制子表达盒的2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS表达系统(SEQ ID NO：36)。图8G示出了构建体141的示意图。在示意图上注释了用于质粒线性化的SbfI和StuI限制性酶位点。图8H示出了1074号表达盒的核苷酸序列，从2X35S启动子至NOS终止子。PDISP-Rab G-A/印度尼西亚/5/2005H5TM+CT用下划线表示(SEQ ID NO：37)。图8I示出了PDISP-Rab G-A/印度尼西亚/5/2005H5TM+CT的氨基酸序列(SEQ ID NO：38)。图8J示出了构建体144的核苷酸序列，从左至右t-DNA(下划线)。引入到具有质体蓝素-P19-质体蓝素沉默抑制子表达盒之BeYDV+复制酶表达系统中的2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS(SEQ ID NO：39)。图8K示出了构建体144的示意图。在示意图上注释了用于质粒线性化的SbfI和StuI限制性酶位点。图8L示出了1094号表达盒的核苷酸序列，从右至左BeYDV LIR。PDISP-Rab G-A/印度尼西亚/5/2005H5TM+CT用下划线表示(SEQ IDNO：40)。图8M示出了1094号构建体的示意图。图8N示出了在植物中狂犬病G蛋白表达的免疫印迹分析。狂犬病G蛋白在与PDI Sp(构建体1071)、BeYDV+rep、H5A/Indo TM+CT结构域或其组合的融合体(fusion)中表达。更具体地，构建体1074是狂犬病G蛋白与PDI Sp和H5A/Indo TM+CT结构域的融合体。构建体1094是狂犬病G蛋白与BeYDV+rep、PDI Sp和H5A/Indo TM+CT结构域的融合体。构建体1091是狂犬病G蛋白与PDI Sp和BeYDV+rep的融合体。图8O示出了对由构建体1074和构建体1094表达之蛋白质的浓缩和澄清提取物之尺寸排阻色谱的免疫印迹分析。
图9A示出了由构建体1074表达的纯化狂犬病G蛋白的免疫印迹分析。图9B示出了源自构建体1074之表达的纯化VLP的透射电子显微镜照片。
图10示出了用于制备A-2X35S-水痘带状疱疹病糖蛋白E(VZVgE)+H5A/印度尼西亚/5/2005跨膜结构域和胞质尾区(TM+CT)-NOS(946号构建体)的序列。图10A示出了引物IF-wtSp-VZVgE.c(SEQ ID NO：20)；图10B示出了引物IF-H5dTm+VZVgE.r(SEQ ID NO：21)。图10C示出了合成的VZV gE基因(SEQ ID NO：22；对应于来自Genebank检索号AY013752.1的nt3477～5348)(天然信号肽用粗体表示，天然跨膜和胞质结构域用下划线表示)。图10D示出了用于VZVgE+H5dTm.c的引物(SEQ ID NO：23)。图10E示出了946号表达盒(SEQ ID NO：24)，从PacI(启动子上游)至AscI(紧邻NOS终止子下游)。VZV gE-A/印度尼西亚/5/2005H5TM+CT用下划线表示。图10F示出了VZV gE-A/印度尼西亚/5/2005H5TM+CT的氨基酸序列(SEQ ID NO：25)。图10G示出了946号构建体的示意图。
图11A示出了水痘带状疱疹病毒(VZV)E蛋白表达的免疫印迹分析。泳道1至5，分别为500、100、50、10和5ng重组VZV gE(阳性对照)。泳道6，来自模拟渗入的叶的提取物(阴性对照)。泳道7～9，来自构建体946的分别为20、10和2μg提取物的重组蛋白质。构建体946包含具有野生型信号肽和H5A/Indo TM+CT结构域的VZV gE基因。图11B示出了对粗提取物(构建体946)之尺寸排阻色谱的表达免疫印迹分析。
图12示出了根据本发明多个实施方案的SARS病毒的数个核苷酸和氨基酸序列以及表达盒。图12A示出了916号构建体(B-2X35S-严重急性呼吸综合征病毒糖蛋白S(SARS gS)+H5A/印度尼西亚/5/2005跨膜结构域和胞质尾区(TM+CT)-NOS)的示意图。图12B示出了引物IF-wtSp-SARSgS.c(SEQ ID NO：26)。图12C示出了引物IF-H5dTm+SARSgS.r(SEQ ID NO：27)。图12D示出了合成的SARS gS基因(SEQ ID NO：28；对应于来自Genebank检索号AY278741.1的nt21492～25259；天然信号肽用粗体表示，天然跨膜和胞质结构域用下划线表示)。图12E示出了引物SARSgS+H5dTm.c(SEQ ID NO：29)。图12F示出了916号表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：30)，从PacI(启动子上游)至AscI(紧邻NOS终止子下游)。SARS gS-A/印度尼西亚/5/2005H5TM+CT用下划线表示。图12G示出了SARS gS-A/印度尼西亚/5/2005H5TM+CT的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)。图12H示出了严重急性呼吸综合征(SARS)病毒蛋白S表达的免疫印迹分析。构建体916包含具有野生型信号肽以及H5A/Indo跨膜和胞质尾区结构域的SARS gS基因。泳道1，来自模拟渗入的植物的提取物(阴性对照)。泳道2至4，来自构建体916的重组蛋白质(20、10和5μg提取物)。
图13示出了根据本发明多个实施方案的埃博拉的数个核苷酸和氨基酸序列以及表达盒。图13A示出了引物IF-Opt_EboGP.s2+4c的核苷酸序列(SEQ ID NO：43)。图13B示出了引物H5iTMCT+Opt_EboGP.r的核苷酸序列(SEQ ID NO：44)。图13C示出了经优化合成的GP基因的核苷酸序列(对于野生型基因序列而言对应于来自Genebank检索号AY354458的nt6039～8069。针对密码子使用(codon usage)和GC含量、删除隐蔽剪接位点、Shine-Delgarno序列、RNA促降解序列(RNA destabilizingsequence)以及原核生物核糖体进入位点对序列(SEQ ID NO：45)进行优化；天然信号肽用粗体表示，天然跨膜和胞质结构域用下划线表示)。图13D示出了引物opt_EboGP+H5iTMCT.c的核苷酸序列(SEQ IDNO：46)。图13E示出了构建体1192的示意图。在示意图上注释了用于质粒线性化的SacII和StuI限制性酶位点。图13F示出了构建体1192的核苷酸序列，从左至右t-DNA边界(下划线)。具有质体蓝素-P19-质体蓝素沉默抑制子表达盒的2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS(SEQ ID NO.47)。图13G示出了1366号表达盒的核苷酸序列，从2X35S启动子至NOS终止子。来自A/印度尼西亚/5/2005序列之扎伊尔95埃博拉病毒-H5TM+CT的PDISP-GP用下划线表示(SEQ ID NO：48)。图13H示出了来自A/印度尼西亚/5/2005之扎伊尔95埃博拉病毒-H5TM+CT的PDISP-GP的氨基酸序列(SEQ ID NO：49)。图13I示出了1366号构建体的示意图。图13J示出了埃博拉病毒糖蛋白(GP)蛋白质表达的免疫印迹分析。在从模拟渗入的植物提取的20μg蛋白质中加入(spike)五百纳克并且作为阳性对照进行加载(C+)。作为阴性对照而加载从模拟渗入的植物提取的20微克蛋白质(C-)。构建体1366包含具有野生型信号肽和H5A/IndoTM+CT结构域的埃博拉病毒GP基因。括号中的数字表示用于制备用于渗入之接种物的初始细菌培养物的量。(200)表示200ml培养物与2.3L渗入缓冲液混合，(400)表示400ml培养物与2.1L渗入缓冲液混合。
发明详述
以下是对一个优选实施方案的描述。
本发明涉及病毒样颗粒(VLP)。更具体地，本发明涉及包含嵌合病毒蛋白质的VLP以及在植物中产生嵌合VLP的方法。VLP包含融合(嵌合)蛋白，其包含与跨膜结构域和胞质尾区结构域(TM/CT)相融合的串联的来自病毒三聚体表面蛋白(病毒的三聚体表面蛋白)或其片段的胞外域。所述来自病毒三聚体表面蛋白的胞外域相对于所述TM/CT是异源的。TM/CT为来自流感血凝素(HA)的TM/CT。
病毒三聚体表面蛋白(也称为病毒的三聚体表面蛋白)是见于包膜病毒表面上的三聚体(一般为同三聚体)形式的蛋白质并且包含位于各单体之C-末端的跨膜结构域和胞质尾区结构域(TM/CT)以及位于各单体之N-末端区域的胞外域。病毒三聚体表面蛋白可以是糖蛋白或包膜蛋白。三聚体为由三个通常为非共价连接的蛋白质形成的大分子复合物。不希望受理论限制，蛋白质的三聚化结构域可能对于此类三聚体的形成是重要的。因此，病毒三聚体表面蛋白或其片段的单体可包含三聚化结构域。病毒三聚体表面蛋白或其片段还包含胞外域。三聚体表面蛋白的胞外域暴露于外部环境并且不包含跨膜结构域和胞质尾区结构域。如本文中描述的，来自病毒三聚体表面蛋白的胞外域不源自流感病毒。如果如本文中描述的使用病毒三聚体表面蛋白的片段，那么优选地，该病毒三聚体表面蛋白保持形成三聚体的能力。
通过使用本领域技术人员已知的方法可容易地鉴别出病毒三聚体表面蛋白的跨膜结构域和胞质尾区(TM/CT)、流感蛋白质的TM/CT、或这二者，例如，通过例如使用跨膜预测程序(例如蛋白质分析专家系统(Expert Protein Analysis System)；由瑞士生物信息学研究所(SwissInstitute of Bioinformatics)运作的ExPASy.org；或稠密对齐表面法(DenseAlignment Surface Method)，Cserzo M.，等1997，Prot.Eng.第10卷，第6期，673-676；Lolkema J.S.1998，FEMS Microbiol Rev.22，第4期，305-322)测定蛋白质之氨基酸序列的疏水程度，通过测定蛋白质之氨基酸序列的亲水性分布图(例如Kyte-Doolittle亲水性分布图)，通过测定三维蛋白质结构以及鉴定膜中热力学稳定的结构(例如单个α螺旋、数个跨膜α螺旋的稳定复合物、跨膜β桶(beta barrel)、β-螺旋或在膜中热力学稳定的任何其他结构)。一经鉴别，病毒三聚体表面蛋白的TM/CT区域可替换为从如下文描述的流感病毒获得的跨膜结构域和胞质尾区。
根据本发明多个实施方案的嵌合VLP包含病毒的三聚体表面蛋白或其片段，来自其的跨膜结构域和胞质尾区结构域(TM/CT)被替换为从流感HA获得的TM/CT。病毒三聚体表面蛋白相对于TM/CT是异源的。所述病毒三聚体表面蛋白或其片段可源自但不限于逆转录病毒科、弹状病毒科、疱疹病毒科、冠状病毒科、副黏病毒科、痘病毒科或丝状病毒科的病毒。所述病毒三聚体表面蛋白可源自例如慢病毒属、狂犬病病毒属、水痘病毒属、冠状病毒属或埃博拉病毒属。病毒三聚体表面蛋白可源自例如但不限于HIV、狂犬病病毒、VZV、RSV、SARS病毒、埃博拉病毒、麻疹、腮腺炎、水痘、巨细胞病毒、埃博拉/丝状病毒、疱疹病毒、EB病毒或天花。所述病毒三聚体表面蛋白可以是例如三聚体表面蛋白并且在其天然形式中可包含跨膜结构域/胞质尾区，例如但不限于：
a.F蛋白(副黏病毒科：RSV、麻疹、腮腺炎、新城病)；
b.S蛋白(冠状病毒科：SARS病毒)；
c.env蛋白(逆转录病毒科：HIV)；
d.G蛋白(弹状病毒科：狂犬病)；
e.包膜糖蛋白如E、B、C、I、H(疱疹病毒科：VZV、巨细胞病毒、疱疹病毒、EB病毒)；
f.GP糖蛋白(丝状病毒科：埃博拉、马尔堡)；
g.血凝素(痘病毒科：天花病毒、牛痘病毒)。
可根据本发明使用的数种病毒三聚体表面蛋白的非限制性实例在下文中更详细地描述。
HIV
本发明提供了包含嵌合人类免疫缺陷(HIV)蛋白质的VLP和产生嵌合HIV VLP的方法，嵌合HIV蛋白质包含具有例如流感血凝素(HA)的一部分(例如跨膜结构域和胞质尾区结构域(TM/CT))和HIV Env蛋白的融合蛋白。
本发明提供了核酸，其包含与在植物中有活性之调节区可操作地相连接的编码嵌合HIV蛋白质的核苷酸序列。
另外，本发明提供了在植物中产生嵌合HIV VLP的方法。本方法涉及将与在植物中有活性之调节区可操作地相连接的编码嵌合HIV蛋白质的核酸引入植物或植物的一部分中，以及在允许表达所述核酸的条件下孵育所述植物或植物部分，从而产生所述嵌合HIV VLP。
本发明还提供了包含嵌合HIV蛋白质的VLP。可通过本发明所提供的方法产生所述VLP。
狂犬病病毒
本发明还提供了包含嵌合狂犬病病毒蛋白质的VLP和产生嵌合狂犬病病毒VLP的方法，嵌合狂犬病病毒蛋白质包含具有例如流感血凝素(HA)的一部分(例如跨膜结构域和胞质尾区结构域(TM/CT))和狂犬病G蛋白的融合蛋白。
本发明提供了核酸，其包含与在植物中有活性之调节区可操作地相连接的编码嵌合狂犬病病毒蛋白质的核苷酸序列。
另外，本发明提供了在植物中产生嵌合狂犬病病毒VLP的方法。所述方法涉及将与在植物中有活性之调节区可操作地相连接的编码嵌合狂犬病病毒蛋白质的核酸引入植物或植物的一部分中，以及在允许表达所述核酸的条件下孵育所述植物或植物部分，从而产生嵌合狂犬病病毒VLP。
本发明还提供了包含嵌合狂犬病病毒蛋白质的VLP。可通过本发明所提供的方法产生所述VLP。
VZV
本发明还涉及包含嵌合水痘带状疱疹病毒(VZV)蛋白质的VLP和产生嵌合VZV VLP的方法，所述嵌合VZV蛋白质包含具有例如流感血凝素(HA)的一部分(例如跨膜结构域和胞质尾区结构域(TM/CT))和VZV糖蛋白E的融合蛋白。
本发明提供了核酸，其包含与在植物中有活性之调节区可操作地相连接的编码嵌合VZV蛋白质的核苷酸序列。
另外，本发明提供了在植物中产生嵌合VZV VLP的方法。本方法涉及将与在植物中有活性之调节区可操作地相连接的编码嵌合VZV蛋白质的核酸引入到植物或植物的一部分中，以及在允许表达所述核酸的条件下孵育所述植物或植物部分，从而产生所述嵌合VZV VLP。
本发明还提供了包含嵌合VZV蛋白质的VLP。可通过本发明所提供的方法产生所述VLP。
SARS
本发明还针对包含嵌合严重急性呼吸综合征(SARS)病毒蛋白质的VLP和产生嵌合SARS病毒VLP的方法，所述嵌合SARS蛋白质包含具有例如流感血凝素(HA)的一部分(例如跨膜结构域和胞质尾区结构域(TM/CT))和SARS糖蛋白S的融合蛋白。
本发明提供了核酸，其包含与在植物中有活性之调节区可操作地相连接的编码嵌合SARS蛋白质的核苷酸序列。
另外，本发明提供了在植物中产生嵌合SARS病毒VLP的方法。本方法涉及将与在植物中有活性之调节区可操作地相连接的编码嵌合SARS病毒蛋白质的核酸引入到植物或植物的一部分中，以及在允许表达所述核酸的条件下孵育所述植物或植物部分，从而产生嵌合SARS VLP。
本发明还提供了包含嵌合SARS病毒蛋白质的VLP。可通过本发明所提供的方法产生所述VLP。
埃博拉
本发明还涉及包含嵌合埃博拉病毒蛋白质的VLP和产生嵌合埃博拉VLP的方法，所述嵌合埃博拉病毒蛋白质包含具有例如流感血凝素(HA)的一部分(例如跨膜结构域和胞质尾区结构域(TM/CT))和埃博拉病毒包膜糖蛋白的融合蛋白。
本发明提供了核酸，其包含与在植物中有活性之调节区可操作地相连接的编码嵌合埃博拉病毒蛋白质的核苷酸序列。
另外，本发明提供了在植物中产生嵌合埃博拉VLP的方法。所述方法涉及将与在植物中有活性之调节区可操作地相连接的编码嵌合埃博拉病毒蛋白质的核酸引入到植物或植物的一部分中，以及在允许表达所述核酸的条件下孵育所述植物或植物部分，从而产生嵌合埃博拉病毒VLP。
本发明还提供了包含嵌合埃博拉病毒蛋白质的VLP。可通过本发明所提供的方法产生所述VLP。
嵌合化和VLP形成
水泡性口炎病毒(弹状病毒如狂犬病)和单纯疱疹病毒(疱疹病毒如水痘带状疱疹病毒)均以VSP4依赖性方式出芽(Taylor等J.Virol81：13631-13639，2007；Crump等，J.Virol81：7380-7387，2007)。由于VSP4与基质蛋白的晚期结构域(late domain)相互作用，这表明基质蛋白对于出芽以及作为推论对于VLP产生是必需的。然而，如本文中所述，当TM/CT结构域被流感HA的那些替换时可在没有基质蛋白下产生狂犬病和VZV VLP。不希望受理论限制，这表明嵌合化可消除对用于针对狂犬病和VZV之VLP形成的基质蛋白共表达的依赖性。
上述病毒三聚体表面蛋白的胞外域与跨膜结构域和胞质尾区结构域(TM/CT)相融合，使得病毒三聚体表面蛋白相对于TM/CT是异源的。所述TM/CT可以是来自流感血凝素(HA)的TM/CT，例如来自H5或H3的TM/CT，例如但不限于A/印度尼西亚/5/05亚型(H5N1；“H5/Indo”；GenBank检索号ABW06108.1)、H5A/越南/1194/2004(A-越南；GenBank检索号ACR48874.1)、H5A/安徽/1/2005(A-安徽；GenBank检索号ABD28180.1)；H3A/布里斯班/10/2007(“H3/Bri”；GenBank检索号ACI26318.1)、H3A/威斯康星/67/2005(A-WCN；GenBank检索号ABO37599.1)。数个H3和H5序列边界的TM/CT描述于WO2010/148511中(其通过引用并入本文中)。例如，对于TM/CT而言认为没有限制的氨基酸序列可包括：
H5(A/印度尼西亚/05/2005)TM/CT(SEQ ID NO：41)：
QILSIYSTVASSLALAIMMAGLSLWMCSNGSLQCRICI
H3(A/布里斯班/10/2007)TM/CT(SEQ ID NO：42)：
DWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI
和编码SEQ ID NO：41或42之氨基酸序列的任何核苷酸序列。
本发明中所涉及的特定核酸序列可与在严格杂交条件下与本文中限定的一个或多于一个核苷酸序列相杂交的序列或该序列之互补序列“基本同源”或“基本类似”。当在整个核苷酸序列的限定长度上有至少约70％或更优选75％的核苷酸匹配时，序列为“基本同源”或“基本类似”，前提是这样的同源序列展现出本文中所述序列或编码产物的一个或多于一个的特性。例如，与从H3或H5获得的跨膜结构域和胞质尾区结构域相融合的来自病毒三聚体表面蛋白的基本同源的胞外域、与H3或H5之TM/CT基本同源的并与来自病毒三聚体表面蛋白之胞外域相融合的跨膜结构域和胞质尾区，或者基本同源的TM/CT和来自病毒三聚体表面蛋白的基本同源的胞外域二者，形成VLP。嵌合蛋白质的正确折叠对于蛋白质稳定性、多聚体形成、VLP形成和功能可以是重要的。蛋白质折叠可受一个或更多个因素影响，包括但不限于蛋白质序列，蛋白质相对丰度，细胞内拥挤程度(degree of intracellular crowding)，可与折叠的、部分折叠的或未折叠的蛋白质结合或瞬时缔合(transiently associated)的辅因子的可用性。
可使用例如在DNASIS(使用例如但不限于以下参数：GAP罚分为5，顶部对角的#为5，固定GAP罚分为10，K串(k-tuple)为2，浮动缺口(floating gap)为10，并且窗口大小为5)内提供的核苷酸序列比较程序来确定此类序列相似性。然而，用于比较的比对序列的其他方法为本领域所熟知，例如Smith&Waterman(1981，Adv.Appl.Math.2：482)、Needleman&Wunsch(J.Mol.Biol.48：443，1970)、Pearson&Lipman(1988，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA85：2444)的算法，以及通过这些算法的计算机化实施(GAP、BESTFIT、FASTA和BLAST，可通过HIN使用。)，或者通过手工比对和目视检查(参见，例如，Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等编1995增刊)，或者在严格条件下使用Southern或Northern杂交(参见Maniatis等，in Molecular Cloning(ALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，1982)。优选地，基本同源的序列在整个分子之限定长度上展现出至少约80％和最优选至少约90％的序列相似性。
一种这样的严格杂交条件的一个实例可以是在65℃下于4×SSC中杂交过夜(约16～20小时)，然后在65℃下于0.1×SSC中洗涤1小时，或在65℃下于0.1×SSC中洗涤两次(每次20或30分钟)。或者，一个示例性的严格杂交条件可以是在42℃下于50％甲酰胺、4×SSC中过夜(16～20小时)，然后在65℃下于0.1×SSC中洗涤1小时，或在65℃下于0.1×SSC中洗涤2次(每次20或30分钟或者过夜(16～20小时))，或者在65℃下于Church水性磷酸盐缓冲液(7％SDS；0.5M NaPO4缓冲液(pH7.2)；10mM EDTA)中杂交，在50℃下于0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤2次(每次20或30分钟)，或者对于独特序列区域在65℃下于2×SSC、0.1％SDS中洗涤2次(每次20或30分钟)。
编码嵌合多肽、嵌合蛋白质、融合蛋白、嵌合病毒蛋白质或嵌合病毒三聚体表面蛋白的核酸可被描述为“嵌合核酸”或“嵌合核苷酸序列”。例如(不认为这是限制性的)，包含嵌合HIV蛋白质、嵌合狂犬病病毒蛋白质、嵌合VZV蛋白质、嵌合SARS或嵌合埃博拉病毒蛋白质的病毒样颗粒可被描述为“嵌合VLP”。
“嵌合蛋白质”或“嵌合多肽”还指融合蛋白，其意指包含来自两个或多于两个来源之氨基酸序列的蛋白质或多肽，例如但不限于来自病毒三聚体表面蛋白或其片段的胞外域，例如F蛋白(例如，RSV、麻疹、腮腺炎、新城病)、S蛋白(例如，SARS病毒)、env蛋白(HIV)、G蛋白(狂犬病)、包膜糖蛋白如E、B、C、I、H(VZV、巨细胞病毒、疱疹病毒、EB病毒)、GP糖蛋白(例如，埃博拉、马尔堡)、血凝素(例如天花病毒、牛痘病毒)，以及例如HA的TM/CT(其融合为单个多肽)。嵌合蛋白质或多肽可包含与该多肽或蛋白质之其余部分相同或异源的信号肽。
术语“信号肽”为本领域所熟知并且通常指通常见于多肽的N-端的短(约5～30个氨基酸)氨基酸序列，其可指导新翻译之多肽转运至特定细胞器或辅助多肽链之特定区域(相对于其他)的定位。作为非限制性实例，信号肽可靶向蛋白质向内质网的转运和/或有助于新生多肽相对于膜锚定结构域之近N-端结构域的定位，以辅助成熟蛋白质(例如(不认为这是限制性的)成熟HA蛋白)的切割和折叠。
信号肽(SP)可以是蛋白质或病毒蛋白质原有的，或者信号肽可相对于被表达之蛋白质或病毒蛋白质的一级序列是异源的。蛋白质或病毒蛋白质可包含来自第一流感类型、亚型或菌株的信号肽，而HA其余部分来自一种或多于一种不同流感类型、亚型或菌株。例如，HA亚型B H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9或B型流感病毒的天然信号肽可用于在植物系统中表达嵌合病毒蛋白质。在本发明的一些实施方案中，SP可以是B型流感H1、H3或H5；或者是H1/Bri、H1/NC、H5/Indo、H3/Bri或B/Flo亚型。在一些实施方案中，SP可以是HIV Env蛋白、狂犬病G蛋白、VZV糖蛋白E、SARS糖蛋白S或埃博拉病毒包膜糖蛋白。
信号肽也可以是非天然的，例如来自蛋白质、病毒蛋白质、病毒三聚体表面蛋白或非病毒三聚体表面蛋白的病毒血凝素，或者来自植物、动物或细菌多肽。可使用的信号肽的非限制性实例为苜蓿蛋白质二硫键异构酶(alfalfa protein disulfide isomerase)(PDI SP；检索号Z11499的32～103位核苷酸)。
因此，本发明提供了包含天然或非天然信号肽的嵌合病毒蛋白质以及编码此类嵌合病毒蛋白质的核酸。
所表达的嵌合病毒蛋白质的正确折叠对蛋白质稳定性、多聚体形成、VLP形成、嵌合病毒蛋白质的功能和嵌合病毒蛋白质通过抗体的识别等特征可以是重要的。蛋白质的折叠和积累可受一个或更多个因素影响，包括但不限于：蛋白质序列，蛋白质相对丰度，细胞内拥挤程度，细胞区室中的pH，可与折叠的、部分折叠的或未折叠的蛋白质结合或瞬时缔合的辅因子的可用性，一种或更多种伴侣蛋白的存在情况，等。
热休克蛋白(heat shock protein，Hsp)或应激蛋白是伴侣蛋白的实例，其可参与多种细胞过程，包括蛋白质合成、细胞内运输、防止错误折叠、防止蛋白质凝集、蛋白质复合物的装配和接装配、蛋白质折叠、以及蛋白质解聚。此类伴侣蛋白的实例包括但不限于Hsp60、Hsp65、Hsp70、Hsp90、Hsp100、Hsp20-30、Hsp10、Hsp100-200、Hsp100、Hsp90、Lon、TF55、FKBP、亲环蛋白(cyclophilin)、ClpP、GrpE、泛素、钙联接蛋白(calnexin)和蛋白质二硫键异构酶(参见，例如Macario，A.J.L.，ColdSpring Harbor Laboratory Res.25：59-70.1995；Parsell，D.A.&Lindquist，S.Ann.Rev.Genet.27：437-496(1993)；美国专利No.5,232,833)。如本文中所述，伴侣蛋白(例如但不限于Hsp40和Hsp70)可用于确保嵌合病毒蛋白质的折叠。
Hsp70的实例包括来自哺乳动物细胞的Hsp72和Hsc73、来自细菌(特别是分枝杆菌，例如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(例如卡介苗(Bacille-Calmette Guerin)：本文中称为Hsp71))的DnaK。来自大肠杆菌、酵母和其他原核生物的DnaK，以及来自真核生物(例如拟南芥(A.thaliana))的BiP和Grp78(Lin等，2001(Cell Stress andChaperones6：201-208))。Hsp70的一个具体实例是拟南芥Hsp70(由Genbank ref：AY120747.1编码)。Hsp70能够特异性地结合ATP以及未折叠多肽和肽，从而参与蛋白质折叠和解折叠以及参与蛋白质复合物的装配和接装配。
Hsp40的实例包括来自原核生物(例如大肠杆菌和分枝杆菌)的DnaJ以及来自真核生物(例如苜蓿)的HSJ1、HDJ1和Hsp40(Frugis等，1999.Plant Molecular Biology40：397-408)。Hsp40的一个具体实例是紫花苜蓿(M.sativa)MsJ1(Genbank ref：AJ000995.1)。Hsp40在蛋白质折叠、耐热性和DNA复制等细胞活动中作为分子伴侣而发挥作用。
在各Hsp中，Hsp70及其辅伴侣分子(co-chaperone)Hsp40参与在合成完成前稳定翻译和新合成的多肽。不希望受理论限制，Hsp40与未折叠(新生或新转移的)多肽的疏水补丁(hydrophobic patch)相结合，因而有利于Hsp70-ATP复合物与该多肽的相互作用。ATP水解导致多肽、Hsp70和ADP之间形成稳定的复合物并释放Hsp40。Hsp70-ADP复合物与多肽之疏水补丁的缔合阻止所述复合物与其他疏水补丁的相互作用，并防止不正确折叠以及与其他蛋白质形成凝集体(综述见于Hartl，FU.1996.Nature381：571-579)。
天然伴侣蛋白能够有利于低水平重组蛋白质的正确折叠，然而当表达水平提高时，大量的天然伴侣蛋白可变为限制因素。经农杆菌渗入之叶中嵌合病毒蛋白质的高水平表达可导致嵌合病毒蛋白质在胞质溶胶中累积，而与一种或多于一种伴侣蛋白(例如Hsp70、Hsp40或者Hsp70及Hsp40二者)的共表达可降低错误折叠或凝集之蛋白质的水平，并提高蛋白质(其展现出允许发生病毒样颗粒形成的三级和四级结构特征)的数目。
因此，本发明还提供了在植物中产生嵌合病毒蛋白质VLP的方法，其中将编码嵌合病毒蛋白质的第一核酸与编码伴侣蛋白的第二核酸共表达。第一和第二核酸可在同一步骤中引入植物，或者可先后引入植物。
根据本发明，由病毒来源的蛋白质产生的嵌合VLP不包含病毒基质或核心蛋白。病毒基质蛋白是组织并维持病毒体结构的蛋白质。病毒基质蛋白一般直接与细胞膜相互作用并且可参与出芽过程。病毒核心蛋白是组成核衣壳之一部分的蛋白质并且通常直接与病毒核酸相缔合。病毒基质或核心蛋白的实例为流感M1、RSV M和逆转录病毒gag蛋白。已知M1蛋白结合RNA(Wakefield L.，和Brownlee G.G.，Nucl Acids res11：8569-8580，1989)，而RNA是VLP制备物中的污染物。当获得嵌合VLP产品的监管部门审批时，不期望存在RNA，因此不含RNA的VLP制备物可以是有利的。
在本申请中使用的术语“调节区”、“调节元件”或“启动子”意指反映通常(但不总是)位于基因的蛋白质编码区上游的一部分核酸，其可由DNA或RNA或者DNA和RNA二者构成。当调节区有活性并与目的基因可操作地缔合或可操作地相连接时，可导致所述目的基因的表达。调节元件能够介导器官特异性，或控制发育基因或时序基因的活化。“调节区”可包括启动子元件、展现出基础启动子活性的核心启动子元件、可响应于外部刺激而诱导的元件、介导启动子活性的元件(例如负调节元件或转录增强子)。本文中使用的“调节区”还可包括转录后有活性的元件，例如调节基因表达的调节元件(例如翻译和转录增强子、翻译和转录抑制子)、上游活化序列以及mRNA不稳定性决定子(mRNA instability determinant)。这后几种元件中的几种可位于编码区附近。
在本公开的上下文中，术语“调节元件”或“调节区”通常是指一般(但不总是)位于结构基因的编码序列上游(5’)的DNA序列，其通过提供对RNA聚合酶和/或转录所需其他因子的识别来控制编码区在特定位点起始表达。然而，应理解，位于内含子内或序列3’端的其他核苷酸序列也可有助于调节目的编码区的表达。提供对RNA聚合酶或其他转录因子之识别以确保在特定位点起始的调节元件的一个实例是启动子元件。大多数(但不是全部)真核生物启动子元件含有TATA盒，其是由腺苷和胸苷核苷酸碱基对构成的保守核酸序列，一般位于转录起始位点上游约25个碱基对处。启动子元件包含负责起始转录的基础启动子元件以及修饰基因表达的其他调节元件(如上文所列举)。
存在数种类型的调节区，包括受发育调节的、诱导型的或组成型的调节区。受发育调节的调节区或对所控制基因的差异表达进行控制的调节区在特定器官或器官之组织内、在该器官或组织的发育期间的特定时间被活化。然而，受发育调节的一些调节区也可偏好性地在某些器官或组织内在特定发育阶段有活性，它们还可以以受发育调节的方式有活性，或在植物内的其他器官或组织中有基础水平的活性。组织特异性调节区的实例(例如参见特异性调节区)包括napin启动子和cruciferin启动子(Rask等，1998，J.Plant Physiol.152：595-599；Bilodeau等，1994，Plant Cell14：125-130)。叶特异性启动子的实例包括质体蓝素启动子(参见US7,125,978，其通过引用并入本文)。
诱导型调节区是能够响应于诱导物而直接或间接活化一种或更多种DNA序列或基因之转录的调节区。当不存在诱导物时，DNA序列或基因将不会被转录。通常，特异性结合诱导型调节区以活化转录的蛋白因子可以以无活性形式存在，然后通过诱导物直接或间接地转化成活性形式。然而，也可以不存在蛋白因子。诱导物可以是化学剂，例如蛋白质、代谢物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物；或者通过加热、冷却、盐或毒性元素直接施加的生理应激，或通过病原体或致病物(disease agent)(例如病毒)的作用间接产生的生理应激。可通过向细胞或植物外部施加诱导物(例如通过喷雾、浇水、加热或类似方法)使含有诱导型调节区的植物细胞暴露于诱导物。诱导型调节元件可源自植物基因或非植物基因(例如Gatz，C.和Lenk，LR.P.，1998，Trends Plant Sci.3，352-358；其通过引用并入本文)。可能的诱导型启动子的实例包括但不限于四环素诱导型启动子(Gatz，C.，1997，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.BioI.48，89-108；其通过引用并入本文)、类固醇诱导型启动子(Aoyama.T.和Chua，N.H.，1997，Plant1.2，397-404；其通过引用并入本文)和乙醇诱导型启动子(Salter，M.G.，等，1998，Plant10urnal16，127-132；Caddick，M.X.，et al，1998，Nature Biotech.16，177-180，其通过引用并入本文)、细胞分裂素(cytokinin)诱导型IB6和CKI1基因(Brandstatter，I.和K.ieber，1.1.，1998，Plant Cell10，1009-1019；Kakimoto，T.，1996，Science274，982-985；其通过引用并入本文)以及生长素(auxin)诱导型元件DR5(Ulmasov，T.，等，1997，Plant Cell9，1963-1971；其通过引用并入本文)。
组成型调节区指导基因在整个植物的各部分中表达，以及在整个植物发育过程中持续表达。已知的组成型调节元件的实例包括与如下相关的启动子：CaMV35S转录物(Odell等，1985，Nature，313：810-812)、水稻肌动蛋白1(Zhang等，1991，Plant Cell，3：1155-1165)、肌动蛋白2(An等，1996，Plant J.，10：107-121)或tms2(U.S.5,428,147，其通过引用并入本文)以及磷酸丙糖异构酶1(Xu等，1994，Plant Physiol.106：459-467)基因、玉米泛素1基因(Cornejo等，1993，Plant Mol.BioI.29：637-646)、拟南芥泛素1和6基因(Holtorf等，1995，Plant Mol.BioI.29：637-646)以及烟草翻译起始因子4A基因(Mandel等，1995，Plant Mol.BioI.29：995-1004)。
本文中使用的术语“组成型”不一定是指受组成型调节区控制的基因在所有细胞类型中以相同水平表达，而是指所述基因在很多种细胞类型中表达，但是常常观察到不同的丰度。组成型调节元件可与另一些序列偶联以进一步增强与其可操作地相连接之核苷酸序列的转录和/或翻译。例如，CMPV-HT系统源自豇豆花叶病毒(cowpea mosaic virus，CPMV)的非翻译区，并表明增强相关编码序列的翻译。“天然”意指核酸或氨基酸序列是天然的，或“野生型”。“可操作地相连接”意指特定序列(例如调节元件和目的编码区)直接或间接地相互作用以实现预期功能(例如介导或调节基因表达)。可操作地相连接之序列的相互作用可例如通过与所述可操作地相连接之序列相互作用的蛋白质来介导。
可在包含基于病毒的(DNA或RNA)表达系统的表达系统中表达嵌合蛋白质或多肽，该表达系统例如但不限于基于豇豆花叶病毒组(comovirus)的表达盒(expression cassette)和基于双粒病毒组(geminivirus)的扩增元件。
本文中描述的表达系统可包含基于双分体病毒(bipartite virus)或具有二重基因组(bipartite genome)之病毒的表达盒。例如，双分体病毒可以为豇豆花叶病毒科(Comoviridae)。豇豆花叶病毒科的属包括豇豆花叶病毒属(Comovirus)、线虫传多面体病毒属(Nepovirus)、蚕豆病毒属(Fabavirus)、樱桃锉叶病毒属(Cheravirus)和温州蜜柑矮缩病毒属(Sadwavirus)。豇豆花叶病毒属包括豇豆花叶病毒(Cowpea mosaicvirus，CPMV)、豇豆重型花叶病毒(Cowpea severe mosaic virus，CPSMV)、南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus，SqMV)、红三叶草斑驳病毒(Red clover mottle virus，RCMV)、菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottlevirus，BPMV)、芜菁环斑病毒(Turnip ringspot virus，TuRSV)、蚕豆真花叶病毒(Broad bean true mosaic virus，BBtMV)、蚕豆染色病毒(Broad bean stain virus，BBSV)、萝卜花叶病毒(Radish mosaic virus，RaMV)。包含可用于本发明多个方面之增强子元件的豇豆花叶病毒属RNA-2序列的实例包括但不限于：CPMV RNA-2(GenBank检索号NC_003550)、RCMV RNA-2(GenBank检索号NC_003738)、BPMVRNA-2(GenBank检索号NC_003495)、CPSMV RNA-2(GenBank检索号NC_003544)、SqMV RNA-2(GenBank检索号NC_003800)、TuRSVRNA-2(GenBank检索号NC_013219.1)、BBtMV RNA-2(GenBank检索号GU810904)、BBSV RNA2(GenBank检索号FJ028650)、RaMV(GenBank检索号NC_003800)。
双分体豇豆花叶病毒属的RNA基因组的片段被称为RNA-1和RNA-2。RNA-1编码涉及复制的蛋白质，而RNA-2编码细胞至细胞移动所必需的蛋白质和两种衣壳蛋白。可使用任何合适的基于豇豆花叶病毒属的盒包括CPMV、CPSMV、SqMV、RCMV或BPMV，例如表达盒可基于CPMV。
“表达盒”指这样的核苷酸序列，其包含受用于在宿主细胞中转录目的核酸的适当启动子或其他调节元件控制并与其可操作地相连接的目的核酸。
表达系统还可包含来自双生病毒组的扩增元件，例如来自菜豆黄矮病毒(bean yellow dwarfvirus，BeYDV)的扩增元件。BeYDV属于适于双子叶植物的玉米线条病毒属(Mastrevirus)。BeYDV为具有单链环状DNA基因组的单组分并且可通过滚环机制进行复制以达到非常高的拷贝数。源自BeYDV的DNA复制子载体系统已经用于在植物中迅速高产量的蛋白质生产。
本文中使用的短语“复制元件”指包含双生病毒组基因组之一个或更多个长基因间隔区(long intergenic region，LIR)的至少一部分的核酸区段。本文中使用的“长基因间隔区”指包含能够通过双生病毒组Rep蛋白质介导切除和复制的rep结合位点的长基因间隔区的区域。在一些方面中，包含一个或更多个LIR的核酸片段还可包含双生病毒组基因组的短基因间隔区(short intergenic region，SIR)。本文中使用的“短基因间隔区”指互补链(玉米线条病毒属的短IR(SIR))。本文中可使用任何合适的双生病毒来源的复制元件。参见，例如，WO2000/20557；WO2010/025285；Zhang X.等(2005，Biotechnology and Bioengineering，第93卷，271-279)，Huang Z.等(2009，Biotechnology and Bioengineering，第103卷，706-714)，Huang Z.等(2009，Biotechnology and Bioengineering，第106卷，9-17)；其通过引用并入本文。
可作为来自嵌合核苷酸序列的转录物产生嵌合蛋白质或嵌合多肽，并且合成后对嵌合蛋白质或嵌合多肽进行切割，需要时进行缔合以形成多聚体蛋白质。因此，嵌合蛋白质或嵌合多肽还包含含有通过二硫键(disulphide bridge)缔合之亚单位的蛋白质或多肽(即，多聚体蛋白质)。例如，包含来自两个或多于两个来源之氨基酸序列的嵌合多肽可被加工成亚单位，并且该亚单位通过二硫键缔合以产生嵌合蛋白质或嵌合多肽。
根据本发明多个实施方案的嵌合病毒蛋白质包含来自流感HA的跨膜结构域和胞质尾区(TM/CT)。TM/CT可以是来自任何流感病毒类型或亚型(包括，例如B、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16类型或亚型)的天然HA TM/CT。H1、H3、H5或B类型或亚型的非限制性实例包括A/新喀里多尼亚/20/99亚型(H1N1)、H1A/加利福尼亚/04/09亚型(H1N1)、A/印度尼西亚/5/05亚型(H5N1)、A/布里斯班/59/2007、B/佛罗里达/4/2006和H3A/布里斯班/10/2007(参见例如WO2009/009876；WO2009/076778；WO2010/003225；WO2010/003235，其通过引用并入本文)。另外，TM/CT可以是那些HA TM/CT中的任何一个，其中缺失了1、2、3、4或5个氨基酸，或添加了1、2、3、4或5个氨基酸的任何种类间隔区或接头序列。
优选地，TM/CT来自H5或H3，例如但不限于A/印度尼西亚/5/05亚型(H5N1；“H5/Indo”；GenBank检索号ABW06108.1)、H5A/越南/1194/2004(A-越南；GenBank检索号ACR48874.1)、H5A/安徽/1/2005(A-安徽；GenBank检索号ABD28180.1)；H3A/布里斯班/10/2007(“H3/Bri”；GenBank检索号ACI26318.1)、H3A/威斯康星/67/2005(A-WCN；GenBank检索号ABO37599.1)。数个H3和H5序列边界的TM/CT描述于WO2010/148511(其通过引用并入本文)。TM/CT之氨基酸序列的非限制性实例包括SEQ ID NO：41和42，以及编码SEQID NO：41或42之氨基酸序列的任何核苷酸序列。
在流感病毒的血凝素中允许氨基酸变异。这样的变异提供了不断被鉴定的新菌株。新菌株之间的感染性可不同。然而，维持血凝素三聚体的形成(随后形成VLP)。因此，本发明提供了包含血凝素氨基酸序列的嵌合病毒蛋白质，或编码包含血凝素氨基酸序列之嵌合病毒蛋白质的核酸，所述嵌合病毒蛋白质在植物中形成VLP并且包括可开发的已知序列和变体HA序列。
术语“病毒样颗粒(VLP)”或者“病毒样颗粒”或“VLP”指自装配并且包含结构蛋白(例如嵌合病毒蛋白质)的结构。VLP和嵌合VLP通常在形态上和抗原性上与感染中产生的病毒体类似，但是缺乏足以复制的遗传信息，因此是非感染性的。可在合适的宿主细胞(包括植物宿主细胞)中产生VLP和嵌合VLP。从宿主细胞提取之后，在合适的条件下分离并进一步纯化后，VLP和嵌合VLP可作为完整结构来纯化。
本发明的嵌合VLP可以在特征在于缺少使蛋白质唾液酸化之能力的宿主细胞中产生，所述宿主细胞例如植物细胞、昆虫细胞、真菌和其他生物(包括海绵动物(sponge)、腔肠动物(coelenterara)、环节动物(annelida)、节肢动物(arthoropoda)、软体动物(mollusca)、线形动物(nemathelminthea)、担轮动物(trochelmintes)、扁形动物(plathelminthes)、毛颚动物(chaetognatha)、触手动物(tentaculate)、衣原体(chlamydia)、螺旋体(spirochetes)、革兰氏阳性细菌(gram-positivebacteria)、蓝细菌(cyanobacteria)、古细菌(archaebacteria)等。参见，例如Gupta等，1999.Nucleic Acids Research27：370-372；Toukach等，2007.Nucleic Acids Research35：D280-D286；Nakahara等，2008.Nucleic AcidsResearch36：D368-D371。
本发明还提供了从细胞的质膜获得脂质包膜的嵌合VLP，所述细胞中表达嵌合VLP。例如，如果嵌合病毒在基于植物的系统中表达，那么所得嵌合VLP可从该植物细胞的质膜获得脂质包膜。
通常，术语“脂质”指脂溶性的(亲脂性的)天然分子。根据本发明的一些方面，在植物中产生的嵌合VLP可与植物来源的脂质复合。植物来源的脂质可以是脂双层形式，并且还可包含围绕VLP的包膜。植物来源的脂质可包含产生VLP之植物的质膜的脂质组分，包括磷脂、甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯，以及脂溶性固醇或包含固醇的代谢物。实例包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、鞘糖脂、植物固醇或其组合。植物来源的脂质可作为替代地称为“植物脂质”。植物固醇的实例包括菜油固醇(campesterol)、豆固醇(stigmasterol)、麦角固醇(ergosterol)、菜子固醇(brassicasterol)、Δ-7-豆固醇、Δ-7-燕麦固醇(delta-7-avenasterol)、胡萝卜固醇(daunosterol)、谷固醇(sitosterol)、24-甲基胆固醇、胆固醇或β-谷固醇(参见，例如Mongrand等，2004)。本领域技术人员应理解，细胞质膜的脂质组成可随细胞或获得细胞之生物或物种的培养或生长条件而不同。通常，β-谷固醇是最大量的植物固醇。
细胞膜通常包含脂双层以及各种功能的蛋白质。在脂双层中可发现局部集中的特定脂质，称为“脂质筏(lipid raft)”。这些脂质筏微结构域可富含鞘脂和固醇。不希望受理论限制，脂质筏可在胞吞和胞吐作用、病毒或其他感染性病原体的进入或逸出(egress)、细胞间信号转导、与细胞或生物体的其他结构组分(例如细胞内和细胞外基质)相互作用中发挥重要作用。
在植物内产生的VLP可诱导包含植物特异性N-聚糖的嵌合病毒蛋白质。因此，本发明还提供了包含具有植物特异性N-聚糖之嵌合病毒蛋白质的VLP。
此外，植物中N-聚糖的修饰是已知的(参见例如U.S.60/944,344；其通过引用并入本文)，并且可产生具有经修饰N-聚糖的嵌合病毒蛋白质。可获得包含经修饰糖基化模式(例如岩藻糖基化降低、木糖基化降低、或岩藻糖基化和木糖基化二者均减少)之N-聚糖的嵌合病毒蛋白质，或者可获得具有经修饰糖基化模式的嵌合病毒蛋白质，其中蛋白质缺少岩藻糖基化、木糖基化或两者皆缺少，并包含提高的半乳糖基化。此外，与表达嵌合病毒蛋白质的野生型植物相比，翻译后修饰的调节(例如添加末端半乳糖)可导致所表达嵌合病毒蛋白质的岩藻糖基化和木糖基化降低。
例如(但不视为限制)，合成具有经修饰糖基化模式的嵌合病毒蛋白质可通过使嵌合病毒蛋白质与编码β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)(例如，但不限于哺乳动物GalT或人GalT，但是也可以使用其他来源的GalT)的核苷酸序列一起共表达来实现。还可将GalT的催化结构域与N-乙酰葡糖胺转移酶(GNT1)的CTS结构域(即胞质尾区、跨膜结构域、主干区(stem region))相融合以产生GNT1-GalT杂交酶(hybrid enzyme)，并且所述杂交酶可与嵌合病毒蛋白质共表达。嵌合病毒蛋白质还可与编码N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnT-III)(例如但不限于哺乳动物GnT-III或人GnT-III，还可使用其他来源的GnT-III)的核苷酸序列一起共表达。另外，还可使用包含与GnT-III相融合之GNT1的CTS的GNT1-GnT-III杂交酶。
因此，本发明还提供了包含具有经修饰N-聚糖的嵌合病毒蛋白质的VLP。
不希望受理论限制，嵌合病毒蛋白质上存在植物N-聚糖可通过促进抗原呈递细胞与嵌合病毒蛋白质的结合来刺激免疫应答。Saint-jore-Dupas等(2007)已提出使用植物N-聚糖来刺激免疫应答。此外，VLP的构象对于抗原的呈递可以是有利的，并且当与植物来源的脂质层复合时增强VLP的佐剂作用。
可通过例如血细胞凝集测定、电子显微镜或通过尺寸排阻色谱来评估VLP的结构和大小。
对于尺寸排阻色谱而言，可通过以下方法从植物组织提取总可溶性蛋白质：将冷冻粉碎的植物材料的样品在提取缓冲液中匀浆(Polytron)，并通过离心除去不溶性的物质。用冰冷的丙酮或PEG进行沉淀也可以是有益的。对可溶性蛋白质进行定量，并将提取物通过SephacrylTM柱(例如SephacrylTM S500柱)。Blue Dextran2000可用作校准标准。实施色谱之后，可通过免疫印迹进一步分析级分以确定级分的蛋白质全量(complement)。
经分离的级分可以是例如上清液(如果离心、沉降或沉淀)或滤液(如果过滤)，并且富含蛋白质或超结构蛋白质(例如花结样结构(rosette-likestructure)或更高级更高分子量的颗粒如VLP)。还可通过额外的离心步骤、沉淀、色谱步骤(例如尺寸排阻、离子交换、亲和色谱)切向流过滤(tangential flow filtration)或其组合来处理经分离的级分以对蛋白质或超结构蛋白质进行分离、纯化、浓缩或其组合。可通过例如非变性PAGE或SDS-PAGE、使用适当检测抗体的Western分析、毛细管电泳、电子显微镜或对本领域技术人员而言显然的任何其他方法来确证经纯化的蛋白质或超结构蛋白质的存在。
洗脱谱可根据所用洗脱条件而不同。图7、8O和11B示出了包含嵌合VLP之植物提取物的尺寸排阻色谱分析的洗脱谱。在这种情况中，在柱的空体积洗脱出包含嵌合HIV、嵌合狂犬病G和嵌合VZV病毒三聚体表面蛋白的VLP，从约级分13至14洗脱出花结和高分子量结构，以及在来自约15至约17的级分中洗脱出低分子量或可溶性形式的嵌合病毒三聚体表面蛋白。
可使用任何合适的方法(例如化学或生物化学提取)纯化或提取VLP。VLP对干燥、加热、pH、表面活性剂和去污剂相对敏感。因此，可用于使用这样的方法：使产量最大化、使具有细胞蛋白质之VLP级分的污染最小化、维持蛋白质或VLP和(需要时)缔合脂质包膜或膜的完整性的方法，使细胞壁松动以释放蛋白质或VLP的方法。例如，可使用产生原生质体/原生质球的方法(参见例如WO2011/035422，其通过引用并入本文)以获得本文中描述的VLP。尽可能减小或消除使用去污剂或表面活性剂(例如SDS或Triton X-100)可对提高VLP提取的产率有益。随后，可通过例如电子显微镜或通过如上所述尺寸排阻色谱来评估VLP的结构和大小。
本发明的一种或多于一种或更多种嵌合基因构建体可在由本发明的核苷酸序列、构建体或载体转化的任意合适的植物宿主中表达。合适宿主的实例包括但不限于农作物，包括苜蓿、油菜、芸苔属(Brassica spp.)、玉米、烟草属(Nicotiana spp.)、苜蓿、马铃薯、人参、豌豆、燕麦、稻、大豆、小麦、大麦、向日葵和棉花等。
本发明的一种或更多种嵌合基因构建体还可包含3’非翻译区。3’非翻译区是指这样的基因部分，其包含含有多腺苷酸化信号和能够影响mRNA加工或基因表达之任意其他调节信号的DNA区段。多腺苷酸化信号的特征一般在于向mRNA前体的3’端添加聚腺苷酸链(polyadenylic acidtrack)。多腺苷酸化信号常通过存在与规范形式5’AATAAA-3’的同源性来识别，但是也会出现变异。合适的3’区的非限制性实例是含有以下基因之多腺苷酸化信号的3’经转录的非翻译区：农杆菌(Agrobacterium)肿瘤诱导(tumor inducing，Ti)质粒基因(例如胭脂氨酸合成酶(nopalinesynthase，NOS)基因)、植物基因(例如大豆贮藏蛋白基因)、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚单位的基因(ssRUBISCO；US4,962,028；其通过引用并入本文)、在US7,125,978(其通过引用并入本文)中描述的用于调节质体蓝素表达的启动子。
需要时，本发明的一种或更多种嵌合基因构建体还可包含另外的增强子(翻译增强子或转录增强子)。增强子可位于转录序列的5′或3′。增强子区域是本领域技术人员公知的，并且可包括ATG起始密码子、邻近序列等。如果存在，起始密码子可在编码序列的阅读框内(“框内的”)，以提供经转录序列的正确翻译。
可使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔等将本发明的构建体引入到植物细胞中。此类技术的综述参见例如Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academy Press，纽约VIII，421-463页(1988)；Geierson和Corey，PlantMolecular Biology，第2版(1988)；以及Miki和Iyer；Fundamentals of Gene Transfer in Plants.Plant Metabolism，第2版，DT.Dennis，DHFurpin，DD Lefebrve，DB Layzell(编)，Addison Wesly，Langmans Ltd.London，561-579页(1997)。其他的方法包括直接DNA摄入、使用脂质体、电穿孔(例如使用原生质体)、显微注射、微粒(microprojectile)或晶须(whiskers)、以及真空渗入(vacuum infiltration)。参见例如Bilang等(Gene100：247-250(1991))、Scheid等(Mol.Gen.Genet.228：104-112，1991)、Guerche等(Plant Science52：111-116，1987)、Neuhause等(Theor.Appl Genet.75：30-36，1987)、Klein等，Nature327：70-73(1987)、Howell等(Science208：1265，1980)、Horsch等(Science227：1229-1231，1985)、DeBlock等，Plant Physiology91：694-701，1989)，Methods for PlantMolecular Biology(Weissbach和Weissbach编，Academic Press Inc.，1988)、Methods in Plant Molecular Biology(Schuler和Zielinski编，Academic Press Inc.，1989)、Liu和Lomonossoff(J.Virol Meth，105：343-348，2002)；美国专利No.4,945,050；5,036,006；和5,100,792，1995年5月10日提交的序列号为08/438,666的美国专利申请和1992年9月25日提交的序列号为07/951,715的美国专利申请)(所有这些文献均通过引用并入本文)。
如下文所述，可使用瞬时表达法表达本发明的构建体(参见Liu和Lomonossoff，2002，Journal of Virological Methods，105：343-348；其通过引用并入本文)。或者，可使用基于真空的瞬时表达法，如Kapila等，1997(其通过引用并入本文)所述。这些方法可包括例如但不限于农杆菌接种法或农杆菌渗入法、注射器渗入法，然而，还可使用其他瞬时方法，如上所述。使用农杆菌接种法、农杆菌渗入法或注射器渗入法时，包含期望核酸的农杆菌混合物进入组织(例如叶、植物的地上部分(包括茎、叶和花)、植物的其他部分(茎、根、花)或整个植株)的细胞间隙中。穿过表皮后，农杆菌感染细胞并将t-DNA拷贝转移至细胞中。t-DNA以附加体形式转录并且其mRNA被翻译，导致在感染细胞中产生目的蛋白，然而，t-DNA在细胞核内的这种传递是瞬时的。
为了帮助鉴定转化植物细胞，可进一步处理本发明的构建体以使其包含植物选择标记。可用的选择标记包括提供针对化学品(例如抗生素，如庆大霉素、潮霉素、卡那霉素；或除草剂，如膦丝菌素(phosphinothrycin)、草甘膦(glyphosate)、氯磺隆(chlorosulfuron)等)之抗性的酶。类似地，可使用产生可通过颜色变化进行鉴别之化合物的酶(例如GUS(β-葡萄糖醛酸酶))或化学发光的酶(萤光素酶或GFP)。
作为本发明的一部分，还考虑含有本发明的嵌合基因构建体的转基因植物、植物细胞或种子。从植物细胞再生完整植物的方法也是本领域中已知的。通常，将经转化的植物细胞培养在适当的培养基中，该培养基可含有选择剂(例如抗生素)，其中使用选择标记以有利于鉴定经转化的植物细胞。愈伤组织(callus)一旦形成，可根据已知的方法施用适当的植物激素来促进芽的形成，并将芽移至生根培养基(rooting medium)中用于植物的再生。然后，通过种子或利用植物营养繁殖(vegetativepropagation)技术，该植物可反复用于形成子代。还可不使用组织培养物来产生转基因植物。
本发明包括核苷酸序列：
表1.序列识别码的列表。
Figure BDA00003547660900311
Figure BDA00003547660900331
Figure BDA00003547660900341
将在以下实施例中进一步举例说明本发明。
实施例
Figure BDA00003547660900351
Figure BDA00003547660900361
Figure BDA00003547660900371
实施例1：用HIV蛋白质装配表达盒
2X35S-CPMV HT-PDISP-HIV ConSΔCFI-NOS(995号表达盒)
如下所述，将编码与具有天然跨膜结构域和胞质尾区之HIV ConSΔCFI相融合的苜蓿DPI信号肽的序列克隆到2X35S-CPMV-HT表达系统中。首先，根据Liao等(2006，Virology353：268-282)公开的序列通过GeneArt AG(Regensburg，Germany)合成包含天然信号肽以及跨膜和胞质结构域之HIV ConSΔCFI基因的核酸序列。HIV ConSΔCFI的核酸序列如图1A所示(SEQ ID NO：1)。通过由Darveau等(Methods inNeuroscience26：77-85(1995))所示的基于RCP的连接方法，将苜蓿蛋白质二硫键异构酶的信号肽(PDISP)(32～103位核苷酸；检索号Z11499)与HIV ConSΔCFI相连接。在第一轮PCR中，利用540号构建体(对于540号构建体的序列，参见WO2010/003225的图52，SEQ ID NO：61，其通过引用并入本文)作为模板，使用引物IF-ApaI-SpPDI.c(图1B，SEQID NO：2)和SpPDI-HIV gp145.r(图1C，SEQ ID NO：3)扩增含有PDISP的片段。利用合成的ConSΔCFI片段(图1A，SEQ ID NO：1)作为模板，使用引物IF-SpPDI-gp145.c(图1D，SEQ ID NO：4)和WtdTm-gp145.r(图1E，SEQ ID NO：5)扩增含有没有天然信号肽之ConSΔCFI的第二片段。在第二轮PCR中，将引物IF-ApaI-SpPDI.c(图1B，SEQ ID NO：2)和WtdTm-gp145.r(图1E，SEQ ID NO：5)与来自第一轮PCR的作为模板的两个PCR产物一起使用。将所得PCR产物用ApaI限制性酶酶切消化并克隆到用ApaI-StuI酶切消化的修饰972构建体中。对经修饰的972接受体质粒(对于972号构建体的原始序列，参见WO2010/003225的图94，SEQ ID NO：134，其通过引用并入本文)进行处理以消除2X35S启动子上游的SbfI限制性位点。通过以下方法来消除SbfI位点，用SbfI酶切消化质粒972，用T4DNA聚合酶处理所得质粒以移除3’突出端，然后使经处理的质粒再连接，从而得到没有SbfI位点的经修饰972质粒。将所得构建体命名为995号(图1F，SEQ ID NO：6)。PDISP-HIV ConSΔCFI的氨基酸序列如图1G所示(SEQ ID NO：7)。995号质粒的示意图如图1H所示。该构建体不编码M1蛋白。
2X35S-CPMV HT-PDISP-HIV ConSΔCFI+H3A/布里斯斑/10/2007 (TmD+Cyto尾)-NOS(997号构建体)
使用由Darveau等(Methods in Neuroscience26：77-85(1995))所表述的基于PCR的连接方法，将编码与HIV ConSΔCFI以及与H3A/布里斯班/10/2007之跨膜和胞质结构域相融合的苜蓿DPI信号肽的序列克隆到2X35S-CPMV-HT表达系统中。在第一轮PCR中，利用995号构建体(图1F，SEQ ID NO：6)作为模板，使用引物IF-ApaI-SpPDI.c(图1B，SEQ ID NO：2)和IF-H3dTm+gp145.r(图2A，SEQ ID NO：8)扩增含有没有天然跨膜和胞质结构域之PDISP-HIV ConSΔCFI的片段。利用776号构建体(对于776号构建体的序列，参见WO2010/003225的图60，SEQID NO：69，其通过引用并入本文)作为模板，使用引物Gp145+H3dTm.c(图2B，SEQ ID NO：9)和H3dTm.r(图2C，SEQ ID NO：10)扩增含有H3A/布里斯班/10/2007之跨膜和胞质结构域的第二片段。然后将来自这两次扩增的PCR产物混合并作为模板用于使用IF-ApaI-SpPDI.c(图1B，SEQ ID NO：2)和H3dTm.r(图2C，SEQ ID NO：10)作为引物的第二轮扩增。之后用ApaI酶切消化第二PCR的产物并克隆到用ApaI和StuI限制性酶酶切消化的995号构建体(图1F，SEQ ID NO：6)中。将所得构建体命名为997号(图2D，SEQ ID NO：11)。PDISP-HIV ConSΔCFI-A/布里斯班/10/2007H3TM+CT的氨基酸序列如图2E所示(SEQID NO：12)。997质粒示意图如图2F所示。该构建体不编码M1蛋白。
2X35S-CPMV HT-PDISP-HIV ConSΔCFI-H5A/印度尼西亚/5/2005 (TmD+Cyto尾区)-NOS(999号构建体)
如下使用由Darveau等(Methods in Neuroscience26：77-85(1995))所表述的基于PCR的连接方法，将编码与HIV ConSΔCFI以及与H5A/印度尼西亚/5/2005之跨膜和胞质结构域相融合的苜蓿DPI信号肽的序列克隆到2X35S-CPMV-HT表达系统中。在第一轮PCR中，利用995号构建体(图1F，SEQ ID NO：6)作为模板，使用引物IF-ApaI-SpPDI.c(图1B，SEQ ID NO：2)和IF-H5dTm+gp145.r(图3A，SEQ ID NO：13)扩增含有没有天然跨膜和胞质结构域之PDISP-HIV ConSΔCFI的片段。利用972号构建体(对于972号构建体序列，参见WO2010/003225的图94，SEQ ID NO：134，其通过引用并入本文)作为模板，使用引物Gp145+H5dTm.c(图3B，SEQ ID NO：15)和IF-H5dTm.r(图3C，SEQID NO：15)扩增含有H5A/印度尼西亚/5/2005之跨膜和胞质结构域的第二片段。之后将来自这两次扩增的PCR产物混合并作为模板用于使用IF-ApaI-SpPDI.c(图1B，SEQ ID NO：2)和IF-H5dTm.r(图3C，SEQID NO：15)作为引物的第二轮扩增。之后用ApaI酶切消化第二PCR的产物并克隆到用ApaI和StuI限制性酶酶切消化的995号构建体(图1F，SEQ ID NO：6)中。将所得构建体命名为999号(图3D，SEQ ID NO：16)。PDISP-HIV ConSΔCFI-A/印度尼西亚/5/2005H5TM+CT的氨基酸序列如图3E所示(SEQ ID NO：17)。999号质粒示意图如图3F所示。该构建体不编码M1蛋白。
质体蓝素-P19-质体蓝素(构建体172号构建体)
如下所述，在苜蓿质体蓝素启动子与3’UTR和终止子之间克隆编码来自番茄丛矮病毒(Tomato Bushy Stunt Virus，TBSV)之P19沉默抑制子的序列。用限制性酶DraIII(起始ATG上游的84个碱基对)和SacI(终止密码子下游的9个碱基对)酶切消化R472号构建体(对于装配，参见WO2010/003225A1，其通过引用并入本文；对于R472质粒的示意图，参见WO2010/003225A1的图86)，以移除包含来自苜蓿质体蓝素启动子和编码TBSV P19沉默抑制子之序列的84bp的片段。将所得片段克隆到预先用DraIII和SacI酶切消化的构建体540(对于装配，参见WO2010/003225，其通过引用并入本文；对于540号质粒的示意图，参见同一专利的图6)中。将所得构建体命名为172号(SEQ ID NO：4A，图18)。TBSV P19蛋白质的氨基酸序列如图4B所示(SEQ ID NO：19)。172号质粒示意图如图4C所示。
植物生物质的制备、接种和农杆菌渗入
本文中使用的术语“生物质”和“植物物质”意指反映源自植物的任何物质。生物质或植物物质可包括整个植物、组织、细胞或其任何级分。另外，生物质或植物物质可包括细胞内植物组分、细胞外植物组分、植物的体液或固体提取物、或其组合。另外，生物质或植物物质可包括来自植物叶、茎、果实、根或其组合的植物、植物细胞、组织、液体提取物、或其组合。植物的一部分可包括植物物质或生物质。
在填装市售的泥炭藓(peat moss)基质的平地中由种子培养本塞姆氏烟草。使植物生长在温室中，16/8光照周期，温度方案为白天25℃/晚上20℃。播种3周后，挑出单个小植株，移栽到盆中，并在同样的环境条件下在温室中再生长3周。
在补充有10mM2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、20μM乙酰丁香酮(acetosyringone)、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧苄青霉素的YEB培养基(pH5.6)中培养用每种构建体转染的农杆菌，直至其OD600达到0.6至1.6。使用前将农杆菌悬液离心并重悬在渗入培养基(10mM MgCl2和10mM MES，pH5.6)中，然后储存在4℃过夜。在渗入当天，将分批培养物稀释成2.5倍培养物体积并在使用前温热。在20～40托(Torr)真空下，使本塞姆氏烟草的整个植株倒置于气密性不锈钢罐中的细菌悬液中2分钟。将植株移回温室中培养2～6天直至收获。除非另有指明，否则所有渗入均通过与菌株AGL1/172以1∶1的比率共渗入来进行。
通过使用“AGL1”前缀来表示包含本文中描述的多种构建体的根癌农杆菌(A.tumefaciens)菌株。例如，包含995号构建体的根癌农杆菌(参见图1H)命名为“AGL1/995”。
叶收获和总蛋白质提取
孵育后，收获植物的地上部分，冷冻在-80℃，破碎成碎片。通过将每个冷冻破碎植物材料的样品在3倍体积的冷的50mM Tris(pH8.0)、0.15M NaCl、0.1％Triton X-100和1mM苯甲基磺酰氟中匀浆(Polytron)而提取总可溶性蛋白质。匀浆后，于4℃下以10,000g对浆液离心10分钟，保存这些澄清的粗提物(上清液)用于分析。
蛋白质分析和免疫印迹
使用牛血清白蛋白作为参照标准，通过Bradford测定(Bio-Rad，Hercules，CA)对澄清粗提物的总蛋白质含量进行测定。通过SDS-PAGE分离蛋白质并电转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylene difulorid，PVDF)膜(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)上用于免疫检测。在免疫印迹之前，用Tris缓冲盐水中的5％脱脂乳和0.1％Tween-20(TBS-T)在4℃下封闭该膜16～18小时。
通过用1∶2500稀释的2μg/ml山羊多克隆抗gp120一抗(Abcam，ab21179)(在2％脱脂乳、0.1％TBS-Tween20中)孵育进行免疫印迹。在与1∶10000稀释的过氧化物酶缀合的驴抗山羊二抗(JIR705-035-147)(在0.1％TBS-Tween20中的2％脱脂乳中)孵育之后进行化学发光检测。使用鲁米诺(luminol)(Roche Diagnostics Corporation)作为底物，通过化学发光检测免疫反应性复合物。
实施例2：天然和嵌合HIV包膜蛋白在植物中的表达
HIV ConSΔCFI为gp41中具有缩短可变环、缺失切割位点、融合结构域和免疫显性区的共有序列HIV M组包膜蛋白。表明引起跨亚型中和抗体与豚鼠中野生型包膜蛋白的宽度或滴度类似或比其更大(Liao等，Virology(2006)353：268-282)。
图5示出了在该研究中使用的构建体，在995号构建体中，包含天然TM/CT的成熟HIV ConSΔCFI(后文称之为Env)的编码区受CPMV-HT表达系统的控制。在997和999号构建体中，HIV Env的TM/CT结构域被分别来自A/布里斯班/10/2007(H3N2)和A/印度尼西亚/05/2005(H5N1)之流感血凝素(HA)的那些替换。在所有情况中，植物来源的信号肽(来自苜蓿蛋白质二硫键异构酶(DPI)蛋白质)替换了天然HIV Env蛋白信号肽。
在经农杆菌渗入的本塞姆氏烟草中比较了来自构建体995、997和999的HIV Env的产生。通过Western印迹分析了来自用AGL1/995、AGL1/997和AGL1/999渗入之植物的蛋白质提取物，结果如图6所示，其中泳道1至4为包含不同量重组HIV-1gp160(ab68171)的阳性对照；泳道5，阴性对照；泳道6至8，从AGL1/995渗入的叶提取的蛋白质；泳道9和10，从AGL1/997渗入的叶提取的蛋白质；泳道11和12，从AGL1/999渗入的叶提取的蛋白质。
如图6所示，在用于检测的条件中可能没有检测到天然HIV Env的表达，确证HIV Env蛋白在植物中的先前报道的非常低的积累水平(Rybicki等，2010，Plant Biotechnology Journal8：620-637)。Env的嵌合形式(其中TM/CT结构域被替换为流感病毒H3(构建体#997)或H5(构建体#999)的结构域)以比天然形式高的多的水平积累。如上所述，#997和#999构建体不编码M1蛋白。
实施例3：嵌合HIV Env装配成病毒样颗粒
还检测了在不存在核心蛋白或基质蛋白下嵌合HIV Env在植物中装配成VLP的能力。使来自AGL1/997(Env/H3)和AGL1/999(Env/H5)的蛋白质提取物进行凝胶过滤色谱，然后对于Env含量使用山羊抗gp120抗体分析洗脱级分。图7A所示的Western印迹示出了，对于来自AGL1/999-渗入的植物的提取物，洗脱级分中的嵌合Env/H5含量在级分7至10中出现峰值，表明其以大于2百万道尔顿的非常高分子量的结构进行了装配。级分7至18中的相对蛋白质含量的检测清楚地示出了在级分11至18中洗脱出了很大一部分宿主蛋白质(图7B)。这些结果显示，Env/H5装配成了超过预期的同三聚体分子量之大小的高分子量结构。对于AGL1/997-渗入的植物中的Env/H3，获得了类似的结果。这些结果共同表明，嵌合HIV Env/H5在经农杆菌渗入的植物中以高水平积累，并且在不存在核心蛋白或基质蛋白下装配成了病毒样颗粒。这些结果还表明，流感病毒HA之TM/CT与非流感病毒抗原融合足以装配并释放呈现非流感病毒抗原的VLP。
实施例4：用狂犬病蛋白质装配表达盒
C-2X35S-CPMV HT-PDISP-狂犬病糖蛋白G(RabG)+H5A/印度尼西亚 /5/2005跨膜结构域和胞质尾区(TM+CT)-NOS(1074号构建体；图8A、 8H)
如下使用由Darveau等(Methods in Neuroscience26：77-85(1995))所示的基于PCR的连接方法，将编码与H5A/印度尼西亚/5/2005之跨膜和胞质结构域相融合的狂犬病糖蛋白G(RabG)胞外域的序列克隆到包含质体蓝素-P19-质体蓝素之质粒的2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS表达系统中。在第一轮PCR中，利用合成的Rab G基因(对应于来自Genebank检索号EF206707的nt3317～4891)(图8D，SEQ ID NO：34)作为模板，使用引物IF-RabG-S2+4.c(图8B，SEQ ID NO：32)和RabG+H5dTm.r(图8C，SEQ ID NO：33)扩增含有没有天然信号肽、跨膜和胞质结构域之Rab G胞外域的片段。利用972号构建体(对于972号构建体的序列，参见WO2010/003225的图94，SEQ ID NO：134，其通过引用并入本文)作为模板，使用引物IF-H5dTm.c(图8E，SEQ ID NO：35)和IF-H5dTm.r(图3C，SEQ ID NO：15)扩增包含H5A/印度尼西亚/5/2005之跨膜和胞质结构域的第二片段。之后，将来自这两次扩增的PCR产物混合并作为模板用于使用IF-RabG-S2+4.c(图8B，SEQ ID NO：32)和IF-H5dTm.r(图3C，SEQ ID NO：15)作为引物的第二轮扩增。通过Clontech(Mountain View，CA)使用In-Fusion克隆系统在2X35S-CPMV HT-NOS表达系统中具有苜蓿PDI信号肽的框内克隆所得片段。用SbfI和StuI限制性酶酶切消化构建体141(图8F、8G)并将其用于In-Fusion装配反应。141号构建体为意欲在基于CPMV HT的表达盒中“In Fusion”克隆目的基因的接受体质粒。其还合并了用于在苜蓿质体蓝素基因启动子和终止子下共表达TBSV P19沉默抑制子的基因构建体。载体为基于pCAMBIA的质粒并且从左至右t-DNA边界的序列如图8F所示(SEQ ID NO：36)。载体141的示意图如图8G所示。将所得构建体命名为1074号(图8H，SEQID NO：37)。PDISP-Rab G-A/印度尼西亚/5/2005H5TM+CT的氨基酸序列如图8I所示(SEQ ID NO：38)。1074质粒示意图如图8A所示。该构建体不编码M1蛋白。
引入BeYDV+复制酶扩增系统的D-2X35S-PDISP-狂犬病糖蛋白G (RabG)+H5A/印度尼西亚/5/2005跨膜结构域和胞质尾区(TM+CT) -NOS(1094号构建体；图8L、8M)
如下使用由Darveau等(Methods in Neuroscience26：77-85(1995))所表述的基于PCR的连接方法，将编码与H5A/印度尼西亚/5/2005之跨膜和胞质结构域相融合的狂犬病糖蛋白G(Rab G)胞外域的序列克隆到引入到含有质体蓝素-P19-质体蓝素表达盒之质粒的BeYDV+复制酶扩增系统中的2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS中。在第一轮PCR中，利用合成的Rab G基因(对应于来自Genebank检索号EF206707的nt3317～4891)(图8D，SEQ ID NO：34)作为模板，使用引物IF-RabG-S2+4.c(图8B，SEQ ID NO：32)和RabG+H5dTm.r(图8C，SEQ ID NO：33)扩增含有没有天然信号肽、跨膜和胞质结构域之Rab G胞外域的片段。利用972号构建体(对于972号构建体的序列，参见WO2010/003225的图94，SEQ ID NO：134，其通过引用并入本文)作为模板，使用引物IF-H5dTm.c(图8E，SEQ ID NO：35)和IF-H5dTm.r(图3C，SEQ ID NO：15)扩增包含H5A/印度尼西亚/5/2005之跨膜和胞质结构域的第二片段。之后，将来自这两次扩增的PCR产物混合并作为模板用于使用IF-RabG-S2+4.c(图8B，SEQ ID NO：32)和IF-H5dTm.r(图3C，SEQ ID NO：15)作为引物的第二轮扩增。通过Clontech(Mountain View，CA)使用In-Fusion克隆系统在引入到BeYDV+复制酶扩增系统的2X35S-CPMV HT-NOS表达盒中具有苜蓿PDI信号肽的框内克隆所得片段。用SbfI和StuI限制性酶酶切消化的构建体144并将其用于In-Fusion装配反应。144号构建体为意欲在引入BeYDV扩增系统的基于CPMV HT的表达盒中“InFusion”克隆目的基因的接受体质粒。其还合并了用于在苜蓿质体蓝素基因启动子和终止子下共表达TBSV P19沉默抑制子的基因构建体。载体为基于pCAMBIA的质粒并且从左至右t-DNA边界的序列如图8J所示(SEQ ID NO：39)。载体144的示意图如图8K所示。将所得构建体命名为1094号(图8L，SEQ ID NO：40)。PDISP-Rab G-A/印度尼西亚/5/2005H5TM+CT的氨基酸序列如图8I所示(SEQ ID NO：38)。1094号质粒示意图如图8M所示。该构建体不编码M1蛋白。
实施例5：嵌合狂犬病蛋白质在植物中的表达
G蛋白在与PDI Sp的融合体中表达(构建体1071)。构建体1074为狂犬病G蛋白与PDI Sp和H5A/Indo TM+CT结构域的融合体。构建体1094为狂犬病G蛋白与BeYDV+rep、PDI Sp和H5A/Indo TM+CT结构域的融合体。构建体1091为狂犬病病毒G蛋白与PDI Sp和BeYDV+rep的融合体。
在填装市售的泥炭藓基质的平地中由种子培养本塞姆氏烟草。使植物生长在温室中，16/8光照周期，温度方案为白天25℃/晚上20℃。播种3周后，挑出单个小植株(plantlet)，移栽到盆中，并在同样的环境条件下在温室中再生长3周。
在补充有10mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、20μM乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧苄青霉素的YEB培养基(pH5.6)中培养用每种构建体(构建体1071、1071、1074、1091和1094)转染的农杆菌，直至其OD600为0.6至1.6。使用前将农杆菌悬液离心并重悬在渗入培养基(10mM MgCl2和10mM MES，pH5.6)中，然后储存在4℃过夜。在渗入当天，将分批培养物稀释成2.5倍培养物体积并在使用前温热。在20～40托真空下，使本塞姆氏烟草的整个植株倒置于气密性不锈钢罐中的细菌悬液中2分钟。将植株移回温室中培养2～6天直至收获。除非另有指明，否则所有渗入均通过与菌株AGL1/172以1∶1比率共渗入来进行。
培养后，收获植物的地上部分，冷冻在-80℃，破碎成碎片。通过将每个冷冻破碎植物材料的样品在3倍体积的冷的50mM Tris(pH8.0)、0.15M NaCl、0.1％Triton X-100和1mM苯甲基磺酰氟中匀浆(Polytron)而提取总可溶性蛋白质。匀浆后，于4℃下以10,000g对浆液离心10分钟，保存这些澄清的粗提物(上清液)用于分析。
使用牛血清白蛋白作为参照标准，通过Bradford测定(Bio-Rad，Hercules，CA)对定澄清粗提物的总蛋白质含量进行测定。通过SDS-PAGE分离蛋白质并电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(RocheDiagnostics Corporation，Indianapolis，IN)上用于免疫检测。在免疫印迹之前，用Tris缓冲盐水中的5％脱脂乳和0.1％Tween-20(TBS-T)在4℃下封闭该膜16～18小时。
通过用0.5μg/ml Santa Cruz SE-57995一抗(在0.1％TBS-Tween20中的2％中)孵育进行免疫印迹。在与1∶10,000稀释的过氧化物酶缀合的山羊抗鼠二抗(JIR，115-035-146)(在0.1％TBS-Tween20中中的2％脱脂乳中)孵育之后进行化学发光检测。使用鲁米诺(Roche DiagnosticsCorporation)作为底物，通过化学发光检测免疫反应性复合物。
如图8N所示，狂犬病G蛋白在与PDI Sp(构建体1071)、BeYDV+rep(构建体1094或1091)、H5A/Indo TM+CT结构域(构建体1074)或其组合的融合体中表达。
实施例6：嵌合狂犬病病毒G蛋白装配成病毒样颗粒
还检测了在不存在核心蛋白或基质蛋白下嵌合狂犬病病毒G蛋白在植物中装配成VLP的能力。将来自使用构建体1074或构建体1094转化之植物的蛋白质提取物澄清并进行凝胶过滤色谱，然后使用Santa CruzSE-57995一抗分析洗脱级分的狂犬病G蛋白含量。图8O所示的Western印迹显示，来自经渗入植物的提取物，对于使用构建体1074产生的蛋白质，洗脱级分中的嵌合狂犬病G含量在级分8至14中出现峰值，对于使用构建体1094制备的蛋白质提取物，在级分8至12中洗脱出了大部分蛋白质，表明其以大于2百万道尔顿的非常高分子量的结构进行装配。这些结果显示，狂犬病G装配成了超过预期同三聚体分子量的大小的高分子量结构。
图9A示出了由构建体1074表达的经纯化的狂犬病G蛋白的免疫印迹分析。图9B示出了源自构建体1074之表达的经纯化的狂犬病G蛋白VLP的透射电子显微照片，显示了VLP的形态。
因此，狂犬病G在经农杆菌渗入的植物中以高水平积累并且在不存在核心蛋白或基质蛋白下装配成了病毒样颗粒。这些结果还表明，流感病毒HA之TM/CT结构域与非流感病毒抗原(例如狂犬病G蛋白)融合足以装配并释放呈现非流感抗原的VLP。
实施例7：用SARS装配表达盒
B-2X35S-CPMV HT-严重急性呼吸综合征病毒糖蛋白S(SARS gS)+H5A/ 印度尼西亚/5/2005跨膜结构域和胞质尾区(TM+CT)-NOS(916号构建 体；图12A、12F)
如下使用由Darveau等(Methods in Neuroscience26：77-85(1995))所表述的基于PCR的连接方法，将编码与H5A/印度尼西亚/5/2005之跨膜和胞质结构域相融合的SARS糖蛋白S(SARS gS)胞外域的序列克隆到2X35S-CPMV-HT表达系统中。在第一轮PCR中，利用合成的SARSgS基因(对应于来自Genebank检索号AY278741.1的nt21492～25259；图12D，SEQ ID NO：28)作为模板，使用引物IF-wtSp-SARSgS.c(图12B，SEQ ID NO：26)和IF-H5dTm+SARSgS.r(图12C，SEQ ID NO：27)扩增含有没有天然跨膜和胞质结构域之SARS gS胞外域的片段。利用972号构建体(对于972号构建体的序列，参见WO2010/003225的图94，SEQID NO：134，其通过引用并入本文)作为模板，使用引物SARSgS+H5dTm.c(图12E，SEQ ID NO：29)和IF-H5dTm.r(图3C，SEQ ID NO：15)扩增包含H5A/印度尼西亚/5/2005之跨膜和胞质结构域的第二片段。之后，将来自这两次扩增的PCR产物混合并作为模板用于使用IF-wtSp-SARSgS.c(图12B，SEQ ID NO：26)和IF-H5dTm.r(图3C，SEQ ID NO：15)作为引物的第二轮扩增。之后，用ApaI和StuI酶切消化第二PCR的产物并克隆到用ApaI和StuI限制性酶酶切消化的995号构建体(图1F，SEQ ID NO：6)中。将所得构建体命名为916号(图12F，SEQ ID NO：30)。SARS gS-A/印度尼西亚/5/2005H5TM+CT的氨基酸序列如图12G所示(SEQ ID NO：31)。质粒916示意图如图12A所示。该构建体不编码M1蛋白。
实施例8：利用具有或没有产生增强因子的嵌合SARS在植物中的表达实验
使用包含具有野生型信号肽以及H5A/Indo跨膜和胞质尾区结构域之SARS gS基因的构建体916表达SARS病毒蛋白质。
在填装市售的泥炭藓基质的平地中由种子培养本塞姆氏烟草。使植物生长在温室中，16/8光照周期，温度方案为白天25℃/晚上20℃。播种3周后，挑出单个小植株，移栽到盆中，并在同样的环境条件下在温室中再生长3周。
在补充有10mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、20μM乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧苄青霉素的YEB培养基(pH5.6)中培养用每种构建体(构建体916)转染的农杆菌，直至其OD600为0.6至1.6。使用前将农杆菌悬液离心并重悬在渗入培养基(10mM MgCl2和10mMMES，pH5.6)中，然后储存在4℃过夜。在渗入当天，将分批培养物稀释成2.5倍培养物体积并在使用前温热。在20～40托真空下，使本塞姆氏烟草的整个植株倒置于气密性不锈钢罐中的细菌悬液中2分钟。将植株移回温室中培养2～6天直至收获。除非另有指明，否则所有渗入均通过与菌株AGL1/172以1∶1比率共渗入来进行。
培养后，收获植物的地上部分，冷冻在-80℃，破碎成碎片。通过将每个冷冻破碎植物材料的样品在3倍体积的冷的50mM Tris(pH8.0)、0.15M NaCl、0.1％Triton X-100和1mM苯甲基磺酰氟中匀浆(Polytron)而提取总可溶性蛋白质。匀浆后，于4℃下以10,000g对浆液离心10分钟，保存这些澄清的粗提物(上清液)用于分析。
使用牛血清白蛋白作为参照标准，通过Bradford测定(Bio-Rad，Hercules，CA)对澄清粗提物的总蛋白质含量进行测定。通过SDS-PAGE分离蛋白质并电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Roche DiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN)上用于免疫检测。在免疫印迹之前，用Tris缓冲盐水中(TBS-T)5％脱脂乳和0.1％Tween-20(TBS-T)在4℃下封闭该膜16～18小时。
通过用2μg/ml Imgenex.IMG-690一抗(在0.1％TBS-Tween20中的2％脱脂乳中)孵育进行免疫印迹。在与1∶10,000稀释的过氧化物酶缀合的小鼠抗兔IgG二抗(JIR，115-035-144)(在0.1％TBS-Tween20中的2％脱脂乳中)孵育之后进行化学发光检测。使用鲁米诺(RocheDiagnostics Corporation)作为底物，通过化学发光检测免疫反应性复合物。
图12H示出了在烟草中表达严重急性呼吸综合征(SARS)病毒蛋白质S的免疫印迹分析。观察到了构建体916(具有野生型信号肽以及H5A/Indo跨膜和胞质尾区结构域的SARS gS基因)的表达。
实施例9：用VZV蛋白质装配表达盒
A-2X35S-CPMV HT-水痘带状疱疹病毒糖蛋白E(VZVgE)+H5A/印度尼西亚/5/2005跨膜结构域和胞质尾区(TM+CT)-NOS(946号构建体)
如下使用由Darveau等(Methods in Neuroscience26：77-85(1995))所表述的基于PCR的连接方法，将编码与H5A/印度尼西亚/5/2005之跨膜和胞质结构域相融合的VZV糖蛋白E(VZV gE)胞外域的序列克隆到2X35S-CPMV-HT表达系统中。在第一轮PCR中，利用合成的VZV gE基因(对应于来自Genebank检索号AY013752.1的nt3477～5348；图10C，SEQ ID NO：22)作为模板，使用引物IF-wtSp-VZVgE.c(图10A，SEQ IDNO：20)和IF-H5dTm+VZVgE.r(图10B，SEQ ID NO：21)扩增含有没有天然跨膜和胞质结构域之VZV gE胞外域的片段。利用972号构建体(对于972号构建体的序列，参见WO2010/003225的图94，SEQ ID NO：134，其通过引用并入本文)作为模板，使用引物VZVgE+H5dTm.c(图10D，SEQ ID NO：23)和IF-H5dTm.r(图3C，SEQ ID NO：15)扩增包含H5A/印度尼西亚/5/2005之跨膜和胞质结构域的第二片段。之后，将来自这两次扩增的PCR产物混合并作为模板用于使用IF-wtSp-VZVgE.c(图10A，SEQ ID NO：20)和IF-H5dTm.r(图3C，SEQ ID NO：15)作为引物的第二轮扩增。之后，用ApaI和StuI酶切消化第二PCR的产物并克隆到用ApaI和StuI限制性酶酶切消化的995号构建体(图1F，SEQ IDNO：6)中。将所得构建体命名为946号(图A5，SEQ ID NO：A5)。VZVgE-A/印度尼西亚/5/2005H5TM+CT的氨基酸序列如图10F所示(SEQID NO：25)。质粒946示意图如图10G所示。该构建体不编码M1蛋白。
实施例10：嵌合VZV蛋白质在植物中的表达
使用包含具有野生型信号肽和H5A/Indo TM+CT结构域之VZV gE基因的构建体946表明了水痘带状疱疹病毒(VZV)E蛋白的表达。
在填装市售的泥炭藓基质的平地中由种子培养本塞姆氏烟草。使植物生长在温室中，16/8光照周期，温度方案为白天25℃/晚上20℃。播种3周后，挑出单个小植株，移栽到盆中，并在同样的环境条件下在温室中再生长3周。
在补充有10mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、20μM乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧苄青霉素的YEB培养基(pH5.6)中培养用每种构建体(构建体946)转染的农杆菌，直至其OD600为0.6至1.6。使用前将农杆菌悬液离心并重悬在渗入培养基(10mM MgCl2和10mMMES，pH5.6)中，然后储存在4℃过夜。在渗入当天，将分批培养物稀释成2.5倍培养物体积并在使用前温热。在20～40托真空下，使本塞姆氏烟草的整个植株倒置于气密性不锈钢罐中的细菌悬液中2分钟。将植株移回温室中培养2～6天直至收获。除非另有指明，否则所有渗入均通过与菌株AGL1/172以1∶1比率共渗入来进行。
培养后，收获植物的地上部分，冷冻在-80℃，破碎成碎片。通过将每个冷冻破碎植物材料的样品在3倍体积的冷的50mM Tris(pH8.0)、0.15M NaCl、0.1％Triton X-100和1mM苯甲基磺酰氟中匀浆(Polytron)而提取总可溶性蛋白质。匀浆后，于4℃下以10,000g对浆液离心10分钟，保存这些澄清的粗提物(上清液)用于分析。
使用牛血清白蛋白作为参照标准，通过Bradford测定(Bio-Rad，Hercules，CA)对澄清粗提物的总蛋白质含量进行测定。通过SDS-PAGE分离蛋白质并电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Roche DiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN)上用于免疫检测。在免疫印迹之前，用Tris缓冲盐水中的5％脱脂乳和0.1％Tween-20(TBS-T)在4℃下封闭该膜16～18小时。
通过用作为一抗的1μg/ml小鼠mAb抗VZVgE蛋白(abcam，ab52549)(在0.1％TBS-Tween20中的2％脱脂乳中)孵育进行免疫印迹。在与1∶10,000稀释的过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠二抗(JIR，115-035-146)(在0.1％TBS-Tween20中的2％脱脂乳中)孵育之后进行化学发光检测。使用鲁米诺(Roche Diagnostics Corporation)作为底物，通过化学发光检测免疫反应性复合物。
图11A示出了在泳道7～9中由构建体946表达水痘带状疱疹病毒(VZV)E蛋白的免疫印迹分析(分别为20、10和2μg提取物)。泳道1至5，阳性对照——重组VZV gE，分别为500、100、50、10和5ng；泳道6，阴性对照。
还检测了在不存在核心蛋白或基质蛋白下嵌合VZV E蛋白在植物中装配成VLP的能力。将来自使用构建体946转化之植物的蛋白质提取物澄清并进行凝胶过滤色谱，然后对于VZV E蛋白使用小鼠mAb抗VZVgE蛋白(abcam，ab52549)一抗对的洗脱级分进行分析。图11B所示的Western印迹显示，在来自经渗入的植物的提取物中，嵌合VZV E蛋白洗脱级分在级分10至13中出现峰值，表明VZV E蛋白以大于2百万道尔顿的非常高分子量的结构进行装配。这些结果显示，VZV E蛋白装配成了超过预期同三聚体分子量的大小的高分子量结构。
因此，VZV E蛋白在经农杆菌渗入的植物中以高水平积累并且在不存在核心蛋白或基质蛋白下装配成了病毒样颗粒。这些结果还表明，流感病毒HA之TM/CT结构域与非流感病毒抗原(例如VZV E蛋白)融合足以装配并释放呈现非流感病毒抗原的VLP。
实施例11：用嵌合埃博拉病毒糖蛋白(GP)装配表达盒
A-2X35S-CPMV HT-PDISP-扎伊尔埃博拉病毒GP(EboGP)+H5A/印度尼西亚/5/2005跨膜结构域和胞质尾区(TM+CT)-NOS(1366号构建体)
如下使用由Darveau等(Methods in Neuroscience26：77-85(1995))所示的基于PCR的连接方法，将编码与H5A/印度尼西亚/5/2005之跨膜和胞质结构域相融合的来自菌株扎伊尔1995之埃博拉病毒糖蛋白(GP)的胞外域的序列克隆到在包含质体蓝素-P19-质体蓝素表达盒之质粒的2X35S-CPMV HT-PDISP-NOS表达系统中。对于密码子使用和对于GC含量从野生型基因序列(对应于来自GenBank检索号AY354458的nt6039～8069)对埃博拉GP基因进行优化。之后，从经优化的序列移除隐蔽剪接位点、Shine-Delgarno序列、RNA促降解序列和原核生物核糖体进入位点，以避免不期望的结构和序列。在第一轮PCR中，利用合成的GP基因(图13C，SEQ ID NO：45)作为模板，使用引物IF-Opt_EboGP.s2+4c(图13A，SEQ ID NO：43)和H5iTMCT+Opt_EboGP.r(图13B，SEQ ID NO：44)扩增包含编码胞外域之序列(没有信号肽以及跨膜和胞质结构域)的经优化GP基因的片段。利用972号构建体(对于972号构建体的序列，参见WO2010/003225的图94，SEQ ID NO：134，其通过引用并入本文)作为模板，使用引物Opt_EboGP+H5iTMCT.c(图13D，SEQ ID NO：46)和IF-H5dTm.r(图3C，SEQ ID NO：15)扩增包含来自流感病毒A/印度尼西亚/5/2005之H5的跨膜和胞质结构域的第二片段。之后，将来自这两次扩增的PCR产物混合并作为模板用于使用IF-Opt_EboGP.s2+4c(图13A，SEQ ID NO：43)和IF-H5dTm.r(图3C，SEQ ID NO：15)作为引物的第二轮扩增。之后，通过Clontech(Mountain View，CA)使用In-Fusion克隆系统在2X35S-CPMV HT-NOS表达载体中具有苜蓿PDI信号肽的框内克隆所得PCR产物。用SacII和StuI限制性酶酶切消化构建体1192(图13E)并将其用于In-Fusion装配反应。1192号构建体是意欲在基于CPMV HT的表达盒中具有苜蓿PDI信号肽的框内“In-Fusion”克隆目的基因的接受体质粒。其还合并了用于在苜蓿质体蓝素基因启动子和终止子下共表达TBSV P19沉默抑制子的基因构建体。该载体是基于pCAMBIA的质粒并且从左至右t-DNA边界的序列如图13F所示(SEQ ID NO：47)。将所得构建体命名为1366号(图13G，SEQ ID NO：48)。来自A/印度尼西亚/5/2005之扎伊尔95埃博拉病毒-H5TM+CT的PDISP-GP的氨基酸序列如图13H所示(SEQ ID NO：49)。1366质粒示意图如图13I所示。
实施例12：嵌合埃博拉病毒GP在植物中的表达
使用包含具有野生型信号肽和H5A/Indo TM+CT结构域之EV GP基因的构建体1366表明了埃博拉病毒(EV)糖蛋白(GP)的表达。
在填装市售的泥炭藓基质的平地中由种子培养本塞姆氏烟草。使植物生长在温室中，16/8光照周期，温度方案为白天25℃/晚上20℃。播种3周后，挑出单个小植株，移栽到盆中，并在同样的环境条件下在温室中再生长3周。
在补充有10mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、20μM乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧苄青霉素的YEB培养基(pH5.6)中培养用每种构建体(构建体946)转染的农杆菌，直至其OD600为0.6至1.6。使用前将农杆菌悬液离心并重悬在渗入培养基(10mM MgCl2和10mMMES，pH5.6)中，然后储存在4℃过夜。在渗入当天，将分批培养物稀释成2.5倍培养物体积并在使用前温热。在20～40托真空下，使本塞姆氏烟草的整个植株倒置于气密性不锈钢罐中的细菌悬液中2分钟。将植株移回温室中培养2～6天直至收获。
培养后，收获植物的地上部分，冷冻在-80℃，破碎成碎片。通过将每个冷冻破碎植物材料的样品在3倍体积的冷的50mM Tris(pH8.0)、0.15M NaCl、0.1％Triton X-100和1mM苯甲基磺酰氟中匀浆(Polytron)而提取总可溶性蛋白质。匀浆后，于4℃下以10,000g对浆液离心10分钟，保存这些澄清的粗提物(上清液)用于分析。
使用牛血清白蛋白作为参照标准，通过Bradford测定(Bio-Rad，Hercules，CA)对澄清粗提物的总蛋白质含量进行测定。通过SDS-PAGE分离蛋白质并电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Roche DiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN)上用于免疫检测。在免疫印迹之前，用Tris缓冲盐水中的5％脱脂乳和0.1％Tween-20(TBS-T)在4℃下封闭该膜16～18小时。
通过用作为一抗的150ng/ml亲和纯化的兔抗埃博拉GP扎伊尔(IBTBioservices，0301-012)(在0.1％TBS-Tween20中的2％脱脂乳中)孵育进行免疫印迹。在与1∶7500稀释的过氧化物酶缀合的山羊抗兔二抗(JIR11-035-144)(在0.1％TBS-Tween20中的2％脱脂乳中)孵育之后进行化学发光检测。使用鲁米诺(Roche Diagnostics Corporation)作为底物，通过化学发光检测免疫反应性复合物。图13J示出了在来自用1366号构建体转化之植物的蛋白质提取物中表达嵌合埃博拉病毒GP的免疫印迹分析。所获得的结果显示，嵌合埃博拉病毒GP瞬时表达。
所有的引文通过引用据此合并。
针对一个或更多个实施方案描述了本发明。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，可在不背离权利要求书中限定的本发明的范围下进行多种改变和修改。

Claims (16)

1.在植物中产生病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：
a)将包含调节区的核酸引入到所述植物或所述植物的一部分中，所述调节区在所述植物中有活性并且与嵌合核苷酸序列可操作地相连接，所述嵌合核苷酸序列串联地编码与流感跨膜结构域和胞质尾区相融合的来自病毒三聚体表面蛋白或其片段的胞外域，所述胞外域来自非流感病毒三聚体表面蛋白并且相对于与所述流感跨膜结构域和所述胞质尾区是异源的，以及
b)在允许表达所述核酸的条件下孵育所述植物或所述植物部分，从而产生所述VLP。
2.权利要求1的方法，其中来自所述病毒三聚体表面蛋白或其片段的所述胞外域源自逆转录病毒科、弹状病毒科、疱疹病毒科、冠状病毒科、副黏病毒科、痘病毒科或丝状病毒科的病毒。
3.权利要求1的方法，其中来自所述病毒三聚体表面蛋白或其片段的所述胞外域源自慢病毒属、狂犬病病毒属、水痘病毒属、冠状病毒属或埃博拉病毒属。
4.权利要求1的方法，其中来自所述病毒三聚体表面蛋白或其片段的所述胞外域源自人类免疫缺陷病毒(HIV)、狂犬病病毒、水痘带状疱疹病毒(VZV)、严重急性呼吸综合征(SARS)病毒、埃博拉病毒、麻疹、腮腺炎、水痘、巨细胞病毒、埃博拉/丝状病毒、疱疹病毒、EB病毒或天花。
5.权利要求1的方法，其中来自所述病毒三聚体表面蛋白或其片段的所述胞外域源自F蛋白、S蛋白、env蛋白、G蛋白、E包膜糖蛋白、B包膜糖蛋白、C包膜糖蛋白、I包膜糖蛋白、H包膜糖蛋白、GP糖蛋白或血凝素。
6.权利要求1的方法，其中在所述引入步骤(步骤a)中，所述核酸在所述植物中瞬时表达。
7.权利要求1的方法，其中在所述引入步骤(步骤a)中，所述核酸在所述植物中稳定表达。
8.权利要求1的方法，其还包括以下步骤：
c)收获所述植物并纯化所述VLP。
9.权利要求1的方法，其中，在所述引入步骤(步骤a)中，向所述植物引入一种或多于一种另外的核酸，其选自编码一种或多于一种伴侣蛋白、质子通道蛋白、蛋白酶抑制剂或其组合的核苷酸序列。
10.权利要求1的方法，其中所述VLP不含有病毒基质或核心蛋白。
11.权利要求1的方法，其中在所述引入步骤(步骤a)中，所述流感跨膜结构域和胞质尾区为H5跨膜结构域和胞质尾区或H3跨膜结构域和胞质尾区。
12.VLP，其通过权利要求11的方法产生。
13.权利要求12的VLP，其包含携带植物特异性N-聚糖或经修饰N-聚糖的嵌合病毒蛋白质。
14.权利要求12的VLP，其包含源自所述植物的一种或多于一种脂质。
15.组合物，其包含用于诱导免疫应答的有效剂量的权利要求12的VLP和可药用载体。
16.权利要求1的方法，其中所述流感跨膜结构域和胞质尾区获自H5(A/印度尼西亚/05/2005)并且包含SEQ ID NO：41中所限定的核苷酸序列，或者所述流感跨膜结构域和胞质尾区获自H3(A/布里斯班/10/2007)并且包含SEQ ID NO：42中所限定的序列。
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