BR122020003297B1 - método de produção de partícula tipo vírus em plantas, as referidas partículas e composições compreendendo as mesmas - Google Patents

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Marc-Andre D'Aoust
Manon Couture
Pierre-Olivier Lavoie
Louis-Philippe Vezina
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Abstract

A presente invenção refere-se a um método de produção de uma partícula tipo vírus (VLP) em uma planta e composições compreendendo VLPs são providos. O método envolve introdução de um ácido nucleico compreendendo uma região reguladora ativa na planta e operativamente ligado a uma sequência de nucleotídeo quimérica codificando, em série, um ectodomínio de uma proteína de superfície trimérica do vírus, ou um fragmento da mesma, fusionado a um domínio transmembrana de influenza e cauda citoplasmática, na planta, ou porção da planta, o ectodomínio é de uma proteína de superfície trimérica do vírus não influenza e heterólogo com relação ao domínio transmembrana de influenza e a cauda citoplasmática. A planta ou porção da planta é incubada sob condições que permitam a expressão do ácido nucleico, desta maneira produzindo a VLP. A VLP produzida através deste método é também provida.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se à produção de proteínas de vírus quiméricas em plantas. Mais especificamente, a presente invenção refere-se também à produção de partículas tipo vírus compreendendo proteínas de vírus quiméricas em plantas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] A vacinação provê proteção contra doença causada por um agente similar ao induzir um indivíduo a montar uma defesa antes da infecção. Convencionalmente, isso tem sido realizado através do uso de formas atenuadas vivas ou inativadas integrais dos agentes infecciosos como imunógenos. Para evitar o perigo do uso do vírus integral (tal como vírus morto ou atenuado) como uma vacina, proteínas virais recombinantes, por exemplo, subunidades, têm sido obtidas como vacinas. Ambas as vacinas de peptídeo e subunidade estão sujeitas a várias limitações potenciais. As vacinas de subunidade podem exibir imunogenicidade pobre, devido à dobra incorreta, apresentação de antígeno pobre ou diferenças em composição de carboidrato e lipídeo. Um grande problema é a dificuldade em assegurar que a conformação das proteínas engenheiradas imite aquela dos antígenos em seu ambiente natural. Adjuvantes adequados e, no caso de peptídeos, proteínas transportadoras, devem ser usados para reforçar a resposta imune. Ainda, essas vacinas elicitam principalmente respostas humorais e então podem falhar em evocar imunidade eficaz. As vacinas de subu- nidade são frequentemente ineficazes para doenças em que vírus ina- tivado integral pode ser demonstrado prover proteção.
[003] Partículas tipo vírus (VLPs) (Virus-like Particles) são candidatos potenciais para inclusão em composições imunogênicas. VLPs lembram muito vírions maduros, mas elas não contêm material genô- mico viral. Desta maneira, VLPs são de natureza não replicativa, o que as torna seguras para administração como uma vacina. Ainda, VLPs podem ser engenheiradas para expressar glicoproteínas virais sobre a superfície da VLP, que é sua configuração fisiológica mais nativa. Além disso, uma vez que VLPs lembram vírions intactos e são estruturas em partícula multivalentes, VLPs podem ser mais eficazes na indução de anticorpos de neutralização para a glicoproteína do que os antígenos de proteína de envelope solúveis.
[004] VLPs para mais de trinta vírus diferentes foram geradas em sistemas de inseto e mamífero para propósito de vacina (Noad, R. e Roy, P., 2003, Trends Microbiol. 11:438-44). Vários estudos demonstraram que proteínas de influenza recombinantes realizam automonta- gem em VLPs em cultura celular usando vetores de plasmídeo ou ba- culovírus de expressão em mamífero (por exemplo, Gomez-Puertas e outros, 1999, J. Gen. Virol., 80, 1635-1645; Neumann e outros, 2000, J. Virol., 74, 547-551; Lathan e Galarza, 2001, J. Virol. 75, 6154-6165).
[005] Gomez-Puertas e outros (1999, J. Gen. Virol., 80, 16351645) demonstraram que formação eficiente de VLPs de influenza de-pende dos níveis de expressão de proteínas virais. Neumann e outros (2000, J. Virol., 74, 547-551) estabeleceram um sistema baseado em plasmídeo de expressão em mamífero para geração de partículas tipo vírus influenza infeccioso totalmente a partir de cDNAs. Latham e Galarza (2001, J. Virol., 75, 6154-6165) relataram a formação de VLPs de influenza em células de inseto infectadas com genes HA, NA, M1 e M2 co-expressando baculovírus recombinante. Esse estudo demonstrou que proteínas do vírion de influenza realizam automontagem quando da co-expressão em células eucarióticas e que a proteína de matriz M1 era requerida para produção de VLP.
[006] Em vários sistemas de expressão, incluindo baculovírus, vírus vaccinia, células de drosophila (DS-2), células Vero e esferoblas- tos de levedura, expressão de Pr55gag a partir do vírus da imunodeficiência humano (HIV) resulta em montagem e liberação de partículas tipo vírus (VLPs), similares em morfologia a virions de HIV imaturos (revisto por Deml e outros, 2005, Molecular Immunology 42: 259-277).
[007] Proteína de envelope de HIV gp160 pode ser incorporada a VLPs derivadas de Gag. No entanto, apenas um número limitado de proteínas de envelope é incorporado apesar da expressão alta de Pr55gag. Wang e outros mostraram que substituição do domínio trans- membrana e domínios de cauda citosólica (TM/CT) (Transmembrane Domain/Cytosolic Tail) da proteína de envelope do HIV por aqueles de outra proteína de envelope viral, incluindo hemaglutinina de influenza, resultou em um aumento em incorporação de proteína de envelope em VLPs derivadas de Pr55gag (Journal of Virology, 2007, 81: 1086910878). Proteína de envelope de HIV quimérica compreendendo HA TM/CT foi também mostrada ser incorporada a VLPs derivadas de M1 de influenza quando co-expressa em células de inseto usando um sistema de expressão de baculovírus (W02008/005777).
[008] Penetração do vírus influenza em uma célula depende da endocitose mediada por receptor dependente de HA. 0 ciclo de infecção pelo vírus influenza é iniciado pela ligação da proteína HA da superfície do vírion a um receptor celular contendo ácido siálico (glico- proteínas e glicolipídeos). A proteína neuraminidase (NA) faz a mediação do processamento de receptores de ácido siálico. Nos confina- mentos ácidos de endossomas internalizados contendo um vírion de influenza, a proteína HA sofre mudanças conformacionais que levam à fusão de membranas virais e celulares, retirada de revestimento de vírus e liberação mediada por M2 de proteínas M1 de ribonucleoprote- ínas (RNPs) associadas ao nucleocapsídeo, que migram para o núcleo da célula para síntese de RNA viral. Latham e Galarza, 200, J. Virol. 75,6154-6165) relataram a formação de VLPs de influenza em células de inseto infectadas com baculovírus recombinante co-expressando genes HA, NA, M1 e M2. Ainda, Gomez-Puertas e outros, 2000, J. Virol . 74, 11538-11547) ensinam que, em adição à hemaglutinina (HA), a proteína de matriz (M1) do vírus influenza é essencial para brotação de VLP a partir de células de inseto. No entanto, Chen e outros (2007, J. Virol. 81, 7111-7123) ensinam que M1 pode não ser requerida para formação de VLP.
[009] A maioria dos mecanismos de brotação caracterizados usa um curso de seleção de proteína vacuolar (VPS) (Vacuolar Protein Sorting) do hospedeiro (vide Chen e Lamb, Virology 372, 2008). Muitos vírus envelopados foram mostrados interagir com proteínas do curso de VPS, requerendo a ação de complexos de proteína de complexo de seleção endossomal requerido para transporte (ESCRT) (Endossomal Sorting Complex Required for Transport) (vide Tabela 1 de Chen e lamb, 2008). O domínio de proteína tardio que interage com proteínas do curso de VPS é encontrado em proteínas de núcleo e matriz de vírus, e então brotação dependente de VPS requer a presença de proteínas de matriz ou núcleo. Palmitoilação da cauda citosólica de HA de influenza é requerida para brotação, mas o mecanismo não é bem compreendido e envolvimento de outros domínios de proteína de superfície pode acontecer. As necessidades mínimas para brotação permanecem desconhecidas e a participação do ectodomínio neste processo não pode ser descartada. Ainda, o curso de VPS em plantas é pobremente conhecido (vide Schellmann, S. e Pimpl, P., Current Op. Plant Biol. 12: 670-676, 200).
[0010] Brotação de influenza é conhecida ser independente do curso de VPS. Brotação de vírus influenza envolve curso de Rab11 (Bruce e outros, J. Virol. 84: 5848-5859, 2010). Proteínas Rab são âncoras de GTPase posicionadas na superfície de vesículas de transporte dentro das células e elas estão envolvidas em formação de vesícula a partir do compartimento doador, transporte, ancoragem e fusão a compartimento aceitador (Vazquez- Martinez e Malagon Frontiers in Endocrinology 2:1-9, 2011). Componentes do curso de Rab11 foram identificados em plantas. No entanto, os componentes de tráfego de plantas se desenvolveram levando a várias características específicas do sistema de endomembrana da planta, incluindo, por exemplo, um vacúolo grande e especializado, movimento rápido de pilhas de Golgi e organização única de compartimentos endossomais e um número expandido de GTPases de Rab (Rojo, E. e Deneke, J., Plant Phys. 147: 1493-1503, 2008). Brotação de partícula ou vírus influenza é dependente de Rab11 (Bruce e outros, J. Virol. 84: 5848-5859, 2010), mas a proteína ou domínio de proteína que interage com Rab11 ou proteínas associadas a Rab11 não foi identificado. No entanto, o domínio ou domínios mínimos de HA que podem ser necessários para o processo de brotação e produção de VLP são desconhecidos.
[0011] Em plantas, Pr55gag de HIV acumula em níveis extremamente baixos se não engenheirada para acúmulo em cloroplastos (Meyers e outros, 2008, BMC Biotechnology 8: 53. Scotti e outros, 2010, Plant 229: 1109-1122). Acúmulo em cloroplasto, no entanto, é incompatível com a incorporação de proteína de envelope de HIV corretamente dobrada uma vez que a maturação e a dobra da última requerem modificações pós-traducionais específicas do curso de secreção. Rybicki e outros (2010, Plant Biotechnology Journal 8: 620-637) citam "... parece que ninguém expressou com sucesso proteína gp160 Env de HIV ou nem mesmo a maior parte da proteína, em plantas em rendimento ra-zoável...".
[0012] O vírus da raiva (RV) (Rabies Virus) é um membro da famí lia Rhabdoviridae. Tal como a maioria dos membros desta família, RV é um vírus de RNA de fita negativa, não segmentada, cujo genoma codifica cinco proteínas virais. Polimerase de RNA dependente de RNA (L); uma nucleoproteína (N); uma proteína fosforilada (P); uma proteína de matriz (M) localizada no lado interno do envelope da proteína viral; e uma glicoproteína de superfície externa (G). Dletzschold, B. e outros (1991), Crit. Rev. Immunol. 10: 427-439.
[0013] Vacinas baseadas em cultura celular para raiva são limitadas ao cultivo de linhagens inativadas do vírus em culturas celulares. Essas vacinas compreendem o vírus cultivado em culturas celulares. Abordagens biotecnológicas atuais têm como objetivo expressão do gene da proteína revestida do vírus da raiva para desenvolver uma proteína recombinante segura que pudesse ser implantada como uma vacina ativa. Expressão estável de glicoproteína do vírus da raiva foi mostrada em células de Ovário de Hamster Chinês (Burger e outros, 1991). Uma proteína glicosilada, de comprimento integral, de 67 K que co-migrou com a proteína G isolada de células infectadas com vírus, foi obtida.
[0014] O WO/1993/001833 ensina produção de partículas tipo vírus (VLPs) em um sistema de expressão de baculovírus contendo um genoma de RNA incluindo um domínio 3' e um domínio de enchimento circundado por um revestimento de proteína M da raiva e proteína M1 da raiva. A VLP também inclui um envelope de lipídeo de proteína G da raiva.
[0015] O Vírus Varicella Zoster (VZV) (Varicella Zoster Virus), também conhecido como herpesvírus 3 humano (HHV-3), é um membro da subfamília de herpesvírus alfa da família Herpesviridae de vírus. VLPs expressando glicoproteínas ou proteínas do tegumento foram previamente geradas a partir de membros da família de herpesví- rus diferentes. Partículas leves (partículas L) compreendidas de prote ínas do tegumento envelopadas foram obtidas de células infectadas com vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1), herpesvirus equino tipo 1 (EHV-1) ou vírus da pseudoraiva (McLauchlan e Rixon (1992) J. Gen. Virol. 73: 269-276; Pat. U.S. No. 5.384.122). Um tipo diferente de VLP, denominadas partículas envelopadas de replicação de DNA pré-viral (PREPs) (Pre-Viral DNA Replication Enveloped Particles), poderia ser gerado a partir de células infectadas com HSV-1 na presença de inibidores de replicação de DNA viral. As PREPs lembravam partículas L estruturalmente, mas continham uma composição de proteína distinta (Dargan e outros (1995) J. Virol. 69: 4924-4932; Pat. U.S. No. 5.994.116). VLPs híbridas expressando fragmentos da proteína gE de VZV foram produzidas através de uma técnica usando proteína p1 codificada por retrotransposon Ty de levedura (Garcia-Valcarcel e outros (1997) Vaccine 15: 709-719; Welsh e outros (1999) J. Med. Virol. 59: 78-83; Pat. U.S. No. 6.060.064). A US 2011/0008838 descreve VLPs quiméricas que compreendem pelo menos uma proteína de VZV, mas não compreendem uma proteína Ty de levedura. As VLPs quiméricas compreendem uma proteína de núcleo viral tal como proteína M1 de influenza ou a M da doença de Newcastle e pelo menos uma proteína do vírus varicela zoster (VZV).
[0016] A disseminação de um coronavírus (CoV) recém- desenvolvido causou uma ameaça global de pandemia de Síndrome Respiratória Aguda Severa (SARS) (Severe Acute Respiratory Syndrome ) em 2003 (Kuiken, T. e outros, 2003, Lancet 362: 263-270). Como com outros coronavírus, SARS-CoV tem a morfologia de partículas envelopadas com projeções periféricas típicas, chamadas "coroas" ou "espículas" (spikes), circundando a superfície de um núcleo viral (Ksiazek, T. G. e outros, 2003, N. Engl. J. Med. 348: 1953-1966; Lin, Y. e outros, 2004, Antivir. Ther. 9: 287-289). Fora do núcleo da partícula do coronavírus está uma camada envelope de lipídeo con tendo principalmente três proteínas transmembrana, a proteína M mais abundante (membrana), a proteína E pequena (envelope) e a proteína S (spike). Os homotrímeros da proteína S formam coletivamente a coroa mencionada acima, que está envolvida em ligação viral a receptores hospedeiros, fusão de membrana para entrada viral, disseminação célula-para-célula e tropismo de tecido de coronavírus.
[0017] Sistemas de expressão de baculovírus têm sido usados para produzir VLPs de SARS (Ho, Y. e outros, 2004, Biochem. Biophys. Res. Commun. 318: 833-838; Mortola, E. e Roy, P., 2004, FEBS Lett. 576: 174-178). No entanto, devido às diferenças intrínsecas entre células de inseto e células de mamífero, as VLPs montadas nas células de inseto (SF9) exibiram um tamanho de 110 nm de diâmetro, que é muito maior do que os 78 nm dos vírions de SARS-CoV autênticos (Lin, Y. e outros, 2004, supra e Ho, Y. e outros, 2004, supra). Além disso, a imunogenicidade das SARS-VLP baseadas em célula de inseto permanece sem investigação. Outros pesquisadores também tentaram usar sistemas de expressão de mamífero para produzir SARS de VLPs (Huang, Y. e outros, 2004, J. Viriol. 78: 12557-65). No entanto, a liberação extracelular de VLPs não é eficiente, e o rendimento de VLPs não é satisfatório. Por exemplo, o WO2005/035556 descreve um sistema para fabricação de partículas tipo vírus de SARS-CoV (VLPs- SARS-CoV) compreendendo um ou mais vetores recombinantes que expressam a proteína E de SARS-CoV, a proteína M de SARS-CoV e a proteína S de SARS-CoV em células de mamífero.
[0018] Formação de VLPs, em qualquer sistema, impõe demandas consideráveis à estrutura das proteínas - alteração das extensões de sequência de uma proteína pode não ter muito efeito sobre a expressão do polipeptídeo em si, no entanto, faltam estudos estruturais para demonstrar o efeito de tais alterações sobre a formação de VLPs. A cooperação das várias regiões e estruturas da proteína se desenvol- veu com o vírus e pode não ser condescendente a alterações similares sem perda de formação de VLP.
[0019] Para melhorar as VLPs como candidatos à vacina outros sistemas de expressão além de células de inseto e mamífero precisam ser explorados. Há então uma necessidade em avaliar a habilidade do sistema de expressão de planta em produzir VLPs de proteína quimérica produzida. Em particular, há a necessidade de identificar o número mínimo de proteínas de vírus que vão se montar VLPs e avaliar a morfologia e a imunogenicidade dessas VLPs.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0020] A presente invenção refere-se à produção de proteínas de vírus quiméricas em plantas. Mais especificamente, a presente invenção refere-se também à produção de partículas o tipo vírus compreendendo proteínas de vírus quiméricas em plantas.
[0021] A presente invenção provê um método de produção de uma partícula tipo vírus (VLP) em uma planta compreendendo. a) introdução de um ácido nucleico compreendendo uma região reguladora ativa na planta e ligada operativamente a uma sequência de nucleotídeo quimérica codificando, em série, um ectodomí- nio de uma proteína de superfície trimérica do vírus ou um fragmento da mesma, fusionado a um domínio transmembrana e cauda citoplas- mática de influenza, na planta, ou porção da planta, o ectodomínio é de uma proteína de superfície trimérica do vírus não influenza e hete- rólogo com relação ao domínio transmembrana e cauda citoplasmática de influenza, e b) incubação da planta ou porção da planta sob condições que permitam a expressão do ácido nucleico, desta maneira produzindo a VLP.
[0022] Os métodos conforme acima descrito podem compreender ainda a etapa (c) de colheita da planta e purificação da VLP. Ainda, a VLP pode não conter uma proteína de matriz ou núcleo virai.
[0023] A presente invenção provê o método descrito acima, em que o ectodomínio da proteína de superfície trimérica do vírus ou fragmento da mesma pode ser derivado de vírus da família Retroviridae, Rhabdoviridae, Herpesviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae, Pox- viridae ou Filoviridae. O ectodomínio da proteína de superfície trimérica do vírus pode ser derivado, por exemplo, do gênero Lentivirus, Lyssavirus, Varicellovirus, Coronavirus ou Ebolavirus. O ectodomínio da proteína de superfície trimérica do vírus pode ser derivado de, por exemplo, mas não limitado a, HIV, vírus da raiva, VZV, RSV, vírus SARS, vírus Ebola, Sarampo, Caxumba, Varicella, Citomegalovírus, Ebola/Filovírus, Herpesvirus, vírus Epstein-Barr ou Smallpox. A proteína de superfície trimérica do vírus em sua forma nativa pode compreender um ectodomínio e um domínio transmembrana/cauda citoplas- mática, por exemplo, mas não limitado a, proteína F (RSV, Sarampo, Caxumba, Doença de Newcastle), proteína S (SARS), proteína env (HIV), proteína G (raiva), glicoproteína de envelope incluindo E, B, C, I, H (VZV, citomegalovírus, herpesvírus, vírus Epstein-barr), glicoproteína GP (ebola, marburgo), hemaglutinina (vírus da varíola, vírus vaccí- nia).
[0024] A presente invenção inclui também o método conforme acima descrito, em que o domínio transmembrana de influenza e a cauda citoplasmática são obtidos de H5 (A/Indonesia/05/2005) ou H3 (A/Brisbane/ 10/2007). O domínio transmembrana e a cauda citoplas- mática podem compreender a sequência de nucleotídeo definida na SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 42.
[0025] A presente invenção também provê o método conforme acima descrito, em que na etapa de introdução (etapa a), o ácido nu- cleico é transientemente expresso na planta. Alternativamente, na etapa de introdução (etapa a), o ácido nucleico pode ser estavelmente expresso na planta.
[0026] A presente invenção inclui também o método conforme acima descrito, em que, na etapa de introdução (etapa a), um ou mais de um ácido nucleico adicional, selecionado do grupo de uma sequência de nucleotídeo codificando uma ou mais de uma proteína chapero- na, proteína de canal de próton, inibidor de protease ou uma combinação dos mesmos, é introduzido na planta.
[0027] A presente invenção provê uma VLP produzida através do método descrito acima. A proteína de superfície trimérica do vírus quimérica da VLP compreende N-glicanos específicos de planta ou N- glicanos modificados. A VLP pode também compreender um ou mais de um lipídeo derivado da planta.
[0028] A presente invenção inclui uma composição compreendendo uma dose eficaz da VLP conforme acima descrito para indução de uma resposta imune e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0029] A presente invenção refere-se à produção de proteína de superfície trimérica do vírus quimérica de vírus da família Retroviridae, Rhabdoviridae, Herpesviridae, Coronaviridae ou Filoviridae e produção de partículas tipo vírus compreendendo essa proteína de superfície trimérica do vírus quimérica em plantas.
[0030] Ainda, a presente invenção refere-se à produção de proteína de superfície trimérica quimérica de Vírus da imunodeficiência humana (HIV), Vírus da raiva, Vírus Varicella Zoster (VZV), Vírus da sín- drome respiratória aguda severa (SARS) ou vírus Ebola. A presente invenção refere-se à produção de partículas tipo vírus quiméricas de HIV, Raiva, VZV, SARS e Ebola em plantas.
[0031] De acordo com a presente invenção é provido um método de produção de VLPs de HIV, raiva, VZV, SARS ou Ebola quiméricas em uma planta compreendendo introdução de um ácido nucleico codificando uma proteína de vírus HIV, raiva, VZV, SARS ou Ebola quimé- rica operativamente ligada a uma região reguladora ativa na planta, dentro da planta, ou porção da planta, e incubação da planta ou porção da planta sob condições que permitam a expressão do ácido nu- cleico, desta maneira produzindo as VLPs de HIV, raiva, VZV, SARS ou Ebola quiméricas.
[0032] A presente invenção provê ainda uma VLP compreendendo uma proteína de HIV, raiva, VZV, SARS ou Ebola quimérica. A VLP pode ser produzida através do método conforme provido pela presente invenção. A VLP de HIV, raiva, VZV, SARS ou Ebola pode ser também produzida dentro de uma planta.
[0033] VLPs quiméricas, ou VLPs, produzidas a partir de proteínas derivadas de HIV, raiva, VZV, SARS ou Ebola, de acordo com a presente invenção, não compreendem proteína M1. A proteína M1 é conhecida se ligar a RNA que pode ser considerado um contaminante de uma preparação de VLP. A presença de RNA é indesejada quando da obtenção de aprovação reguladora para um produto antigênico (VLP), desta maneira uma preparação de VLP quimérica sem RNA pode ser vantajosa.
[0034] Embora proteína Env de HIV nativa acumule pobremente em plantas, uma proteína Env de HIV quimérica, fusionada a domínios transmembrana (TM) e cauda citoplasmática (CT) de HA de influenza, acumula em nível alto, e brota em VLPs de HIV na ausência de proteína de núcleo ou matriz, em plantas.
[0035] Este sumário da invenção não descreve necessariamente todas as características da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0036] Essas e outras características da invenção se tornarão mais aparentes a partir da descrição que segue em que referência é feita aos desenhos apensos.
[0037] A Figura 1 mostra várias sequências de nucleotídeo e ami- no e cassetes de expressão para HIV de acordo com várias modalidades da presente invenção. A Figura 1A mostra uma sequência de ácido nucleico de consenso (SEQ ID NO:1) de HIV ΔCFI ConS (Peptídeo sinal nativo em negrito, domínios transmembrana e citosólicos nativos estão sublinhados). A Figura 1B mostra uma sequência de nucleotídeo de oligonucleotídeo IF-ApaI-SpPDI.c (SEQ ID NO:2). A Figura 1C mostra uma sequência de nucleotídeo de oligonucleotídeo SpPDI-HIV gp145.r (SEQ ID NO:3). A Figura 1D mostra uma sequência de nucleo-tídeo de oligonucleotídeo IF-SpPDI-gp145.c (SEQ ID NO:4). A Figura 1E mostra uma sequência de nucleotídeo de oligonucleotídeo WtdTm- gp145.r (SEQ ID NO:5). A Figura 1F mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:6) de cassete de expressão número 995, de PacL (a montante do promotor) para AscI (imediatamente a jusante do termi- nador de NOS). O sítio de restrição SbfI eliminado está em negrito. PDISP-HIV ConS ΔCFI está sublinhado. A Figura 1G mostra uma sequência de aminoácido de PDISP-HIV CoS ΔCFI (SEQ ID NO:7). A Figura 1H mostra uma representação esquemática de construto número 995.
[0038] A Figura 2 mostra várias sequências de nucleotídeo e aminoácido e cassetes de expressão para HIV de acordo com várias modalidades da presente invenção. A Figura 2A mostra uma sequência de nucleotídeo de oligonucleotídeo IF-H3dTm+gp145.r (SEQ ID NO:8). A Figura 2B mostra uma sequência de nucleotídeo de oligonucleotídeo Gp145+H3dTm.c (SEQ ID NO:9). A Figura 2C mostra uma sequência de nucleotídeo de oligonucleotídeo H3dTm.r (SEQ ID NO:10). A Figura 2D mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:11) de cassete de expressão número 997, de PacI (a montante do promotor) para AscI (imediatamente a jusante do terminador de NOS). O sítio de restrição SbfI eliminado está em negrito. PDISP-HIV Con S ΔCFI- A/Brisbane/10/2007 H3 TM+CT está sublinhado. A Figura 2E mostra uma sequência de aminoácido de PDISP-HIV ConS ΔCFI-A/Brisbane/ 10/2007 H3 TM+CT (SEQ ID NO:12). A Figura 2F mostra uma representação esquemática de construto número 997.
[0039] A Figura 3 mostra várias sequências de nucleotídeo e aminoácido e cassetes de expressão para HIV de acordo com várias modalidades da presente invenção. A Figura 3A mostra uma sequência de nucleotídeo de oligonucleotídeo IF-H5dTm+gp145.r (SEQ ID NO:13). A Figura 3B mostra uma sequência de nucleotídeo de oligonucleotídeo Gp145+H5dTm.c (SEQ ID NO:14). A Figura 3C mostra uma sequência de nucleotídeo de oligonucleotídeo IF-H5dTm.r (SEQ ID NO:15). A Figura 3D mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:16) de cassete de expressão número 999, de PaCl (a montante do promotor) para AscI (imediatamente a jusante do terminador de NOS). O sítio de restrição Sbfl eliminado está em negrito. PDISP-HIV ConS ΔCFI-A/Indonesia/5/2005 H5 TM+CT está sublinhado. A Figura 3E mostra uma sequência de aminoácido de PDISP-HIV ConS ΔCFI- A/Indonesia/5/205 H5 TM+CT (SEQ ID NO:17). A Figura 3F mostra uma representação esquemática de construto número 999.
[0040] A Figura 4 mostra uma sequência de aminoácido e vários cassetes de expressão para p19 de acordo com várias modalidades da presente invenção. A Figura 4A mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:18) de cassete de expressão número 172, de Xmal (a montante do promotor de plastocianina) para EcoRI (imediatamente a jusante do terminador de plastocianina). A sequência de ácido nucleico de P19 de TBSV está sublinhada. A Figura 4B mostra uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO:19) de supressor de silenciamento de P19 de TBSV. A Figura 4C mostra uma representação de construto número 172.
[0041] A Figura 5 mostra uma representação esquemática de genes de Env de HIV quiméricos expressos conforme aqui descrito.
[0042] A Figura 6 mostra uma análise Western blot de expressão de proteína de Env de HIV em folhas de Nicotiana benthamiana agroinfiltradas. Raias 1 a 4, gp160 de HIV-1 recombinante (ab68171), 100, 50, 10 e 5 ng, respectivamente, em 20 μg de proteínas de folha extraídas de plantas falso-infiltradas (controles positivos). Raia 5, 20 μg de proteínas de plantas falso-infiltradas (controle negativo). Raias 6 a 8, proteínas extraídas de folhas infiltradas com AGL1/995 (20 μg, 10 μg e 2 μg, respectivamente, completado para 20 μg com proteínas de folha extraídas de plantas falso-infiltradas). Raias 9 e 10, proteínas extraídas de folhas infiltradas com AGL1/997 (20 μg e 10 μg, respectivamente, completado para 20 μg com proteínas de folha extraídas de plantas falso infiltradas). Raias 11 e 12, proteínas extraídas de folhas infiltradas com AGL1/999 (20 μg e 10 μg, respectivamente, completado para 20 μg com proteínas de folha extraídas de plantas falso- infiltradas).
[0043] A Figura 7 mostra uma caracterização de estruturas derivadas de ΔCFI ConS de HIV através de cromatografia de exclusão de tamanho. Extratos de proteína de folhas infiltradas com AGL1/999, produzindo proteína quimérica Env/H5, foram separados através de filtragem em gel em uma coluna de alta resolução S-500 calibrada. (A) O teor de proteína Env de HIV de frações de eluição foi revelado através de imunodetecção usando anticorpos anti-gp120. Raias 1 a 4, gp160 de HIV-1 recombinante (ab68171), 100, 50, 10 e 5 ng, respectivamente, em 20 μg de proteínas de folha extraídas de plantas falso- infiltradas (controles positivos). Raia 5, 20 μg de proteínas de plantas falso-infiltradas (controle negativo). Raia 6, 20 μg de proteínas extraídas de folhas infiltradas com AGL1/999. Raias 7 a 18, frações de elui- ção 7 a 18 de cromatografia de filtragem em gel. (B) Teor de proteína relativo de frações de eluição 7 a 18 da cromatografia de filtragem em gel.
[0044] A Figura 8 mostra várias sequências de nucleotídeo e amino e cassetes de expressão para raiva de acordo com várias modalidades da presente invenção. A Figura 8A mostra um esquema de construto 1074 (C-2X35S-Glicoproteina G da Raiva (RabG)+domínio transmembrana e cauda citoplasmática (TM+CT) H5 A/lndonesia/5/2005-NOS em vetor contendo inibidor de silenciamento de Plastocianina-P19-Plastocianina. A Figura 8B mostra iniciador lF- RabG-S2+4.c (SEQ ID NO:32). A Figura 8C mostra iniciador RabG+H5dTm.r (SEQ ID NO: 33). A Figura 8D mostra gene Rab G sintetizado (correspondendo a nt 3317-4891 de número de acesso GenBank EF206707; peptídeo sinal nativo em negrito, domínios transmembrana e citosólicos nativos estão sublinhados; SEQ ID NO: 34). A Figura 8E mostra iniciador IF-H5dTm.c (SEQ ID NO:35). A Figura 8F mostra construto 141 de t-DNA da esquerda para a direita (sublinhado). Sistema de expressão 2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS com cassete de expressão de inibidor de silenciamento de Plastocianina- P19-Plastocianina (SEQ ID NO:36). A Figura 8G mostra uma representação esquemática de construto 141. Sítios de enzima de restrição SbfI e StuI usados para linearização de plasmídeo são anotados na representação. A Figura 8H mostra a sequência de nucleotídeo de cassete de expressão número 1074 do promotor 2X35S para termina- dor de NOS. PDISP-Rab G-A/Indonesia/5/2005 H5 TM+CT está sublinhado (SEQ ID NO:37). A Figura 8I mostra a sequência de aminoácido de PDISP-Rab G-A/Indonesia/5/2005 H5 TM+CT (SEQ ID NO:38).A Figura 8J mostra a sequência de nucleotídeo para construto 144 de t- DNA da esquerda para a direita (sublinhado).2X35S-CPMV-HT- PDISP-NOS em BeYDV+sistema de expressão de replicase com cassete de expressão de inibidor de silenciamento de Plastocianina-P19- Plastocianina (SEQ ID NO:39). A Figura 8K mostra uma representação esquemática de construto 144.Sítios de enzima de restrição Sbfl e Stul usados para linearização de plasmídeo são anotados na representação. A Figura 8L mostra a sequência de nucleotídeo de cassete de expressão número 1094 da direita para a esquerda BeYDV LIR.PDISP- Rab G-A/Indonesia/5/2005 H5 TM+CT está sublinhado (SEQ ID NO:40). A Figura 8M mostra uma representação esquemática de cons- truto número 1094. A Figura 8N mostra análise Immunoblot de expressão de proteína G da raiva em planta. A proteína G da raiva foi expressa em fusão com Ps PDI (construto 1071), BeYDV + rep, domínio TM+CT H5A/Indo ou uma combinação deles. Mais especificamente, o construto 1074 é uma fusão de proteína G da raiva com Ps PDI e domínios TM+CT H5A/Indo. O construto 1094 é uma fusão de proteína G da raiva com BeYDV + rep, Ps PDI e domínios TM+CT H5A/Indo. O construto 1091 é uma fusão de proteína G da raiva com Sp PDI e Be- YDV + rep. A Figura 8O mostra análise Immunoblot de cromatografia de exclusão de tamanho em extratos concentrados e purificados de proteína expressa a partir do construto 1074 e do construto 1094.
[0045] A Figura 9A mostra análise Immunoblot da proteína G da raiva purificada expressa a partir do construto 1074. A Figura 9B mostra uma foto de microscopia de transmissão eletrônica da VLP purificada derivada de expressão de construto 1074.
[0046] A Figura 10 mostra sequências para preparar A-2X35S- gli- coproteína E de Vírus Varicella Zoster (VZVgE)+ domínio transmembrana e cauda citoplasmática (TM+CT) H5 A/Indonesia/5/2005-NOS (Construto número 946). A Figura 10A mostra iniciador IF-wtSp- VZVgE.c (SEQ ID NO:20); A Figura 10B mostra iniciador IF- H5dTm+VZVgE.r (SEQ ID NO:21). A Figura 10C mostra gene gE de VZV sintetizado (SEQ ID NO:22; correspondendo a nt 3477-5348 de número de acesso GenBank AY013752.1) (Peptídeo sinal nativo em negrito, domínios transmembrana e citosólicos nativos estão sublinhados). A Figura 10D mostra iniciador para gE de VZV+H5dTm.c (SEQ ID NO:23). A Figura 10E mostra cassete de expressão número 946 (SEQ ID NO:24), de Pacl (a montante do promotor) para Ascl (imediatamente a jusante do terminador de NOS). gE VZV-TM+TC H5 A/Indonesia/5/2005 sublinhados. A Figura 10F mostra sequência de aminoácido de gE de VZV-TM+CT H5 A/Indonesia/5/2005 (SEQ ID NO:25). A Figura 10G mostra uma representação esquemática de construto número 946.
[0047] A Figura 11A mostra análise Immunoblot de expressão de proteína E do Vírus Varicella Zoster (VZV). Raias 1 a 5, gE de VZV recombinante, 500, 100, 50, 10 e 5 ng, respectivamente (controles positivos). Raia 6, extrato de folhas falso-infiltradas (controles negativos). Raias 7-9, proteína recombinante do construto 946, 20, 10 e 2 μg de extrato, respectivamente. O construto 946 compreende gene E de VZV com peptídeo sinal do tipo selvagem e domínio TM+CT H5A/Indo. A Figura 11B mostra análise Immunoblot de expressão de cromatografia de exclusão de tamanho em extratos brutos (construto 946).
[0048] A Figura 12 mostra várias sequências de nucleotídeo e amino e cassetes de expressão para SARS de acordo com várias modalidades da presente invenção. A Figura 12A mostra um esquema de construto número 916 (B-2X35S - glicoproteína S do Vírus da Síndro- me Respiratória Aguda Severa (gS SARS)+domínio transmembrana e cauda citoplasmática (TM+CT) H5 A/Indonesia/5/2005-NOS. A Figura 12B mostra iniciador IF-wtSp-SARSgS.c (SEQ ID NO:26). A Figura 12C mostra iniciador IF-H5dTm+SARSgS.r (SEQ ID NO:27). A Figura 12D mostra gene gS de SARS sintetizado (SEQ ID NO:28; correspondendo a nt 21492-25259 do número de acesso GenBank AY278741.1; peptídeo sinal em negrito, domínios transmembrana e citosólicos nativos estão sublinhados). A Figura 12E mostra iniciador SARSgS+H5dTm.c SEQ ID NO:29). A Figura 12F mostra a sequência de nucleotídeo de cassete de expressão número 916 (SEQ ID NO:30), de Pacl (a mon- tando do promotor) para Asci (imediatamente a jusante do terminador deNOS).gS de SARS-TM+CT H5 A/lndonesia/5/2005 sublinhado. A Figura 12G mostra a sequência de aminoácido de gS de SARS- TM+CT H5 A/lndonesia/5/2005 (SEQ ID NO:31). A Figura 12H mostra análise de Immunoblot de expressão de proteína S do Virus da sin- drome respiratória aguda severa (SARS). O construto 916 compreende gene gS de SARS com peptideo sinal do tipo selvagem e domínio transmembrana e cauda citosólica H5 A/Indo. Raia 1, extrato de plantas falso-infiltradas (controles negativos). Raias 2 a 4, proteína recombinante do construto 916 (20, 10 e 5 μg de extrato).
[0049] A Figura 13 mostra várias sequências de nucleotídeo e amino e cassetes de expressão para Ebola de acordo com várias modalidades da presente invenção. A Figura 13A mostra a sequência de nucleotídeo de iniciador IF-Opt_EboGP.s2+4c (SEQ ID NO:43). A Figura 13B mostra a sequência de nucleotídeo de iniciador H5iTMCT+Opt_EboGP.r (SEQ ID NO:44). A Figura 13C mostra a sequência de nucleotídeo de gene GP sintetizado otimizado (correspondendo a nt 6039-8069 de número de acesso GenBank AY354458 para sequência de gene do tipo selvagem. A sequência (SEQI D NO:45) foi otimizada para uso de códon e teor de GC, deleção de sítios de união crípticos, sequências Shine-Delgarno, sequência de desestabilização de RNA e sítios de entrada de ribossomo procariótico; Peptídeo sinal nativo em negrito, domínios transmembrana e citosólicos nativos estão sublinhados). A Figura 13D mostra a sequência de nucleotídeo de iniciador opt_EboGP+H5iTMCT.c (SEQ ID NO:46). A Figura 13E mostra a representação esquemática de construto 1192.Sítios de enzima de restrição Sacll e Stul usados para linearização de plasmídeo são anotados na representação. A Figura 13F mostra a sequência de nucleotí- deo para o construto 1192 de bordas de t-DNA da esquerda para a direita (sublinhado).2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS com cassete de ex pressão de inibidor de silenciamento de Plastocianina-P19- Plastocianina (SEQ ID NO:47). A Figura 13G mostra a sequência de nucleotídeo para cassete de expressão número 1366 do promotor de 2X35S para terminador de NOS.PDISP-GP de Ebolavirus Zaire 95 - TM+CT H5 de sequência de A/Indonesia/5/2005 está sublinhado (SEQ ID NO:48). A Figura 13H mostra a sequência de aminoácido de PDISP-GP de Ebolavirus Zaire 95 -TM+CT H5 de A/Indonesia/5/2005 (SEQ ID NO:49). A Figura 13I mostra uma representação esquemática de construto número 1366. A Figura 13J mostra uma análise Immunoblot de expressão de proteína de glicoproteína (GP) (Glycoprotein Pro-tein ) de vírus Ebola. Quinhentos nanogramas foram lançados em 20 μg de proteínas extraídas de plantas falso-infiltradas e carregados como controle positivo (C+). Vinte microgramas de proteínas extraídas de plantas falso-infiltradas foram carregados como controle negativo (C-). O construto 1366 compreende o gene de GP do vírus Ebola com peptídeo sinal do tipo selvagem e domínio TM+CT H5 A/Indo. Números em parênteses indicam a quantidade de cultura bacteriana inicial que foi usada na preparação do inócuo para infiltração (200) indica que 200 ml de cultura foram misturados com 2,3 L de tampão de infiltração e (400) indica que 400 ml de cultura foram misturados com 2,1 L de tampão de infiltração.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0050] A descrição que segue é de uma modalidade preferida.
[0051] A presente invenção refere-se a partículas tipo vírus (VLPs). Mais especificamente, a presente invenção refere-se a VLPs compreendendo proteínas de vírus quiméricas e métodos de produção de VLPs quiméricas em plantas. As VLPs compreendem uma proteína de fusão (quimérica) compreendendo, em série, um ectodomínio de uma proteína de superfície trimérica do vírus (proteína de superfície trimérica viral) ou fragmento da mesma, fusionado a um domínio transmembrana e domínio de cauda citosólico (TM/CT). O ectodomínio da proteína de superfície trimérica do vírus é heterólogo com relação a TM/CT. O TM/CT é um TM/CT de uma hemaglutinina de influenza (HA).
[0052] A proteína de superfície trimérica do vírus (também referida como proteína de superfície trimérica viral) é uma proteína encontrada na superfície de um vírus envelopado na forma de um trímero (geralmente homotrímero) e compreende um domínio transmembrana e domínio de cauda citoplasmática (TM/CT) posicionado na extremidade C- terminal de cada monômero e um ectodomínio posicionado na região N-terminal de cada monômero. A proteína de superfície trimérica do vírus pode ser uma glicoproteína ou uma proteína de envelope. Um trímero é um complexo macromolecular formado por três proteínas, geralmente não covalentemente ligadas. Sem desejar ser limitado pela teoria, o domínio de trimerização de uma proteína pode ser importante para a formação de tais trímeros. Desta maneira, monômeros da proteína de superfície trimérica do vírus ou seus fragmentos podem compreender um domínio de trimerização. A proteína de superfície triméri- ca do vírus ou fragmento da mesma compreende ainda um ectodomí- nio. O ectodomínio da proteína de superfície trimérica é exposto ao ambiente externo e não inclui um domínio transmembrana e domínio de cauda citoplasmática. Conforme aqui descrito, o ectodomínio da proteína de superfície trimérica do vírus não é derivado de um vírus influenza. Se um fragmento da proteína de superfície trimérica do vírus for usado conforme descrito aqui, é preferido que a proteína de superfície trimérica do vírus retenha a habilidade em formar um trímero.
[0053] O domínio transmembrana e a cauda citoplasmática (TM/CT) da proteína de superfície trimérica do vírus, o TM/CT da proteína de influenza, ou ambos, podem ser prontamente identificados usando métodos conforme conhecido por um versado na técnica, por exemplo, através da determinação do grau de hidrofobicidade de uma sequência de aminoácido da proteína, por exemplo, usando um programa de previsão de transmembrana (por exemplo, Expert Protein Analysis System; ExPASy.org, operado pelo Swiss Institute of Bioinformatics; ou o Dense Aligment Surface Method, Cserzo, M. e outros, 1997, Prot. Eng. Vol. 10, no. 6, 673-676; Lolkema, J.S., 1998, FEMS Microbiol Rev. 22, No. 4, 305-322), através da determinação do perfil de hidropatia da sequência de aminoácido da proteína (por exemplo, Perfil de Hidropatia Kyte-Doolittle), através da determinação da estrutura de proteína tridimensional e identificação da estrutura que é ter- modinamicamente estável em uma membrana (por exemplo, uma hélice alfa simples, um complexo estável de várias alfa hélices transmem- brana, um barril beta transmembrana, uma beta hélice ou qualquer estrutura que seja termodinamicamente estável em uma membrana). Uma vez identificada, a região TM/CT da proteína de superfície trimé- rica do vírus pode ser substituída com a transmembrana e cauda cito- plasmática obtidas de um vírus influenza conforme descrito abaixo.
[0054] A VLP quimérica de acordo com várias modalidades da presente invenção compreende uma proteína de superfície trimérica viral, ou um fragmento da proteína de superfície trimérica viral, a partir da qual o domínio transmembrana e os domínios de cauda citosólica (TM/CT) são substituídos com TM/CT obtido de uma HA de influenza. A proteína de superfície trimérica do vírus é heteróloga com relação ao TM/CT. A proteína de superfície trimérica do vírus, ou fragmento da mesma, pode ser derivada sem limitações de vírus da família Retro- viridae, Rhabdoviridae, Herpesviridae, Coronaviridae, Paramyxoviri- dae, Poxviridae ou Filoviridae. A proteína de superfície trimérica do vírus pode ser derivada, por exemplo, do gênero Lentivirus, Lyssavirus, Varicellovirus, Coronavirus ou Ebolavirus. A proteína de superfície trimérica do vírus pode ser derivada de, por exemplo, mas não limitado a, Vírus da raiva, VZV, RSV, virus SARS, virus Ebola, Sarampo, Caxumba, Varicella, Citomegalovirus, Ebola/Filovirus, Herpesvirus, Virus Epstein-Barr ou Smallpox. A proteina de superficie trimérica do virus pode ser, por exemplo, uma proteina de superficie trimérica e em sua forma nativa pode compreender um dominio transmembrana/cauda citoplasmática, por exemplo, mas não limitado a: a. Proteina F (paramyxoviridae: RSV, Sarampo, Caxumba, Doença de Newcastle); b. Proteina B (coronaviridae: SARS); c. Proteina env (retroviridae: HIV); d. Proteina G (rhabdoviridae: raiva); e. Glicoproteinas de envelope tais como E, B, C, I, H (her- pesviridae: VZV, citomegalovirus, herpesvirus, virus Epstein-barr); f. Glicoproteina de GP (filoviridae: ebola, Marburg); g. Hemaglutinina (poxviridae: virus da variola, virus vaccinia).
[0055] Exemplos não limitantes de várias proteinas de superficie trimérica do virus que podem ser usadas de acordo com a presente invenção são descritos em mais detalhes abaixo.
HIV
[0056] A presente invenção provê VLPs compreendendo proteina de virus da imunodeficiência humana (HIV) quimérica e métodos de produção de VLPs quiméricas, a proteina de HIV quimérica compreendendo uma proteina de fusão com, por exemplo, proteina de Env de HIV e uma porção de uma hemaglutinina (HA) de influenza, tal como o dominio transmembrana e o dominio de cauda citosólico (TM/CT).
[0057] A presente invenção provê um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotideo codificando uma proteina de HIV quimérica operativamente ligada a uma região reguladora ativa em uma planta.
[0058] Ainda, a presente invenção provê um método de produção de VLPs de HIV quiméricas em uma planta. O método envolve introdução de um ácido nucleico codificando uma proteína de HIV quimérica operativamente ligada a uma região reguladora ativa na planta, dentro da planta, ou porção da planta, e incubação da planta ou porção da planta sob condições que permitam a expressão do ácido nucleico, desta maneira produzindo as VLPs de HIV quiméricas.
[0059] A presente invenção provê ainda uma VLP compreendendo uma proteína de HIV quimérica. A VLP pode ser produzida através do método conforme provido pela presente invenção.
Vírus da Raiva
[0060] A presente invenção também provê VLPs compreendendo proteína de vírus da raiva quimérica e métodos de produção de VLPs da raiva quiméricas, a proteína do vírus da raiva quimérica compreendendo uma proteína de fusão com, por exemplo, proteína G da raiva e uma porção de uma hemaglutinina (HA) de influenza, tais como o domínio transmembrana e domínio de cauda citosólico (TM/CT).
[0061] A presente invenção provê um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína de vírus da raiva quimérica ligada operativamente a uma região reguladora ativa em uma planta.
[0062] Ainda, a presente invenção provê um método de produção de VLPs de vírus da raiva quiméricas em uma planta. O método envolve introdução de um ácido nucleico codificando uma proteína de vírus da raiva quimérica ligada operativamente a uma região reguladora ativa na planta, dentro da planta, ou porção da planta, e incubação da planta ou porção da planta sob condições que permitam a expressão do ácido nucleico, desta maneira produzindo as VLPs do vírus da raiva quiméricas.
[0063] A presente invenção provê ainda uma VLP compreendendo uma proteína de vírus da raiva quimérica. A VLP pode ser produzida através do método conforme provido pela presente invenção.
VZV
[0064] A presente invenção refere-se também a VLPs compreendendo proteína do Vírus Varicella Zoster (VZV) quimérica e métodos de produção de VLPs de VZV, a proteína de VZV quimérica compreendendo uma proteína de fusão com, por exemplo, glicoproteína E de VZV e uma porção de uma hemaglutinina (HA) de influenza, tal como o domínio transmembrana e domínio de cauda citosólico (TM/CT).
[0065] A presente invenção provê um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína de VZV quimérica operativamente ligada a uma região reguladora ativa em uma planta.
[0066] Ainda, a presente invenção provê um método de produção de VLPs de VZV quiméricas em uma planta. O método envolve introdução de um ácido nucleico codificando uma proteína de VZV quimérica operativamente ligada a uma região reguladora ativa na planta, dentro da planta, ou porção da planta, e incubação da planta ou porção da planta sob condições que permitam a expressão do ácido nu- cleico, desta maneira produzindo as VLPs de VZV quiméricas.
[0067] A presente invenção provê ainda uma VLP compreendendo uma proteína de VZV quimérica. A VLP pode ser produzida através do método conforme provido pela presente invenção.
SARS
[0068] A presente invenção refere-se também a VLPs compreendendo proteína do Vírus da Síndrome respiratória aguda severa (SARS) e métodos de produção de VLPs de SARS quiméricas, a proteína de SARS quimérica compreendendo uma proteína de fusão com, por exemplo, glicoproteína S de SARS e uma porção de uma hemaglu- tinina (HA) de influenza, tal como o domínio transmembrana e domínio de cauda citosólico (TM/CT).
[0069] A presente invenção provê um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína de SARS quimérica operativamente ligada a uma região reguladora ativa em uma planta.
[0070] Ainda, a presente invenção provê um método de produção de VLPs de SARS quiméricas em uma planta. O método envolve introdução de um ácido nucleico codificando uma proteína do vírus SARS quimérica operativamente ligada a uma região reguladora ativa na planta, dentro da planta, ou porção da planta, e incubação da planta ou porção da planta sob condições que permitam a expressão do ácido nucleico, desta maneira produzindo as VLPs de SARS quiméricas.
[0071] A presente invenção provê ainda uma VLP compreendendo uma proteína de vírus SARS quimérica. A VLP pode ser produzida através do método conforme provido pela presente invenção.
Ebola
[0072] A presente invenção refere-se também a VLPs compreendendo proteína do vírus Ebola quimérica e métodos de produção de VLPs de Ebola quiméricas, a proteína do vírus Ebola quimérica compreendendo uma proteína de fusão com, por exemplo, glicoproteína de envelope do vírus Ebola e uma porção de uma hemaglutinina (HA) de influenza, tal como o domínio transmembrana e domínio de cauda ci- tosólico (TM/CT).
[0073] A presente invenção provê um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína do vírus ebola quimérica operativamente ligada a uma região reguladora ativa em uma planta.
[0074] Adicionalmente, a presente invenção provê um método de produção de VLPs de Ebola quiméricas em uma planta. O método en- volve introdução de um ácido nucleico codificando uma proteína do vírus Ebola quimérica operativamente ligada a uma região reguladora ativa na planta, dentro da planta, ou porção da planta, e incubação da planta ou porção da planta sob condições que permitam a expressão do ácido nucleico, desta maneira produzindo as VLPs de vírus Ebola quiméricas.
[0075] A presente invenção provê ainda uma VLP compreendendo uma proteína de vírus Ebola quimérica. A VLP pode ser produzida através do método conforme provido pela presente invenção.
Quimerização e formação de VLP
[0076] Ambos o vírus da estomatite vesicular (um rhabdovirus tipo raiva) e o vírus Herpes Simplex (um herpesvírus tipo vírus varicela- zoster) brotaram de uma maneira dependente de VSP4 (Taylor e outros, J. Virol. 81: 13631-13639, 2007; Crump e outros, J. Virol. 81:7380-7387, 2007). Uma vez que VSP4 interage com o domínio tardio da proteína de matriz, isso sugere que a proteína de matriz é requerida para brotamento e, como um corolário, para produção de VLP. No entanto, conforme aqui descrito, VLPs de raiva e VZV podem ser produzidas sem proteína de matriz quando substituindo o domínio TM/CT com aqueles de HA de influenza. Sem desejar ser limitado pela teoria, isso sugere que quimerização pode eliminar a dependência da co-expressão de proteína de matriz para formação de VLP para raiva e VZV.
[0077] O ectodomínio da proteína de superfície trimérica viral conforme acima descrito é fusionado a um domínio transmembrana e domínio de cauda citosólico (TM/CT), de maneira que a proteína de superfície trimérica do vírus é heteróloga com relação a TM/CT. O TM/CT pode ser um TM/CT de uma hemaglutinina (HA) de influenza, por exemplo, o TM/CT de H5 ou H3, por exemplo, mas não limitado a, subtipo A/lndonesia/5/05 (H5N1; "H5/lndo"; No. Acesso GenBank ABW06108.1), H5 A/Vietnam/1194/2004 (A-Vietnam; No. Acesso GenBank ACR48874.1), H5 A/Anhui/1/2005 (A-Anhui; No. Acesso GenBank ABD28180.1); H3 A/Brisbane/10/2007 ("H3/Bri"; No. Acesso GenBank ACI26318.1), H3 A/Wisconsin/67/2005(A-WCN; No. Acesso GenBank ABO37599.1). Os TM/TC de limites de várias sequências de H3 e H5 são descritos no WO 2010/148511 (que é aqui incorporado a título de referência). Por exemplo, que não deve ser considerado limi- tante, a sequência de aminoácido para TM/CT pode incluir:H5 (A/Indonesia/05/2005) TM/CT (SEQ ID NO:41): QILSIYSTVASSLALAIMMAGLSLWMCSNGSLQCRICI H3 (A/Brisbane/10/2007) TM/CT (SEQ ID NO:42): DWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI e quaisquer sequências de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:41 ou 42.
[0078] Uma sequência de ácido nucleico específica referida na presente invenção pode ser "substancialmente homóloga" ou "substancialmente similar" a uma sequência ou uma sequência ou um complemento da sequência que hibridiza para uma ou mais de uma sequência de nucleotídeo conforme definido aqui sob condições de hibri- dização adstringentes. As sequências são "substancialmente homólogas" ou "substancialmente similares" quando pelo menos cerca de 70% ou mais preferivelmente 75% dos nucleotídeos são compatíveis em um comprimento definido da sequência de nucleotídeo contanto que tais sequências homólogas exibam uma ou mais de uma das propriedades da sequência ou do produto codificado conforme aqui descrito. Por exemplo, um ectodomínio substancialmente homólogo de uma proteína de superfície trimérica do vírus, fusionado a um domínio transmembrana e domínio de cauda citosólico obtido de H3 ou H5, um domínio transmembrana e cauda citosólico que é substancialmente homólogo ao TMCT de H3 ou H5 e fusionado a ectodomínio de uma proteína de superfície trimérica do vírus ou ambos um TM/CT substan-cialmente homólogo e um ectodomínio substancialmente homólogo de uma proteína de superfície trimérica do vírus formam uma VLP. Dobra correta da proteína quimérica pode ser importante para estabilidade da proteína, formação de multímeros, formação de VLPs e funcionamento. Dobra de uma proteína pode ser influenciada por um ou mais fatores incluindo, mas não limitado a, a sequência da proteína, a abundância relativa da proteína, o grau de coroamento intracelular, a disponibilidade de co-fatores que podem se ligar ou ser transientemente associados com a proteína dobrada, parcialmente dobrada ou não dobrada.
[0079] Tal similaridade de sequência pode ser determinada usando um programa de comparação de sequência de nucleotídeo, tal como aquele provido dentro de DNASIS (usando, por exemplo, mas não limitado a, os parâmetros que seguem: penalidade GAP 5, No. de diagonais top 5, penalidade GAP fixa 10, k-tuple 2, gap de flutuação 10 e tamanho da janela 5). No entanto, outros métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica, por exemplo, os algoritmos de Smith & Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482), Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444), e através de implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e BLAST, disponíveis através de NIH.), ou através de alinhamento manual e inspeção visual (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel e outros eds. 1995 suplemento) ou usando hibridização Southern ou Northern sob condições adstringentes (vide Maniatis e outros, em Molecular Cloning (A Laboratory Manual) , Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Preferivelmente, as sequências que são substancialmente homólogas exibem pelo menos cerca de 80% e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de similaridade de sequência em um comprimento definido da molécula.
[0080] Um exemplo de tais condições de hibridização adstringentes pode ser hibridização da noite para o dia (de a partir de cerca de 16-20 horas) em 4 X SSC a 65°C, seguido por lavagem em 0,1 X SSC a 65°C por uma hora ou 2 lavagens em 0,1 X SSC a 65°C cada por 20 ou 30 minutos. Alternativamente uma condição de hibridização adstringente exemplar poderia ser da noite para o dia (16-20 horas) em formamida 50%, 4 X SSC a 42°C, seguido por lavagem em 0,1 X SSC a 65°C por uma hora ou 2 lavagens em 0,1 X SSC a 65°C cada uma por 20 ou 30 minutos ou da noite para o dia (16-20 horas) ou hibridiza- ção em tampão de fosfato aquoso Church (SDS 7%; NaPO4 0,5M pH 7,2; EDTA 10 mM) a 65°C, com 2 lavagens ou a 50°C em 0,1 X SSC, SDS 0,1% por 20 ou 30 minutos cada ou 2 lavagens a 65°C em 2 XSSC, SDS 0,1% por 20 ou 30 minutos cada para regiões de sequência únicas.
[0081] Um ácido nucleico codificando um polipeptídeo quimérico, uma proteína quimérica, uma proteína de fusão, uma proteína viral quimérica ou proteína de superfície trimérica do vírus quimérica pode ser descrito como um "ácido nucleico quimérico" ou uma "sequência de nucleotídeo quimérica". Por exemplo, que não deve ser considerado limitante, uma partícula tipo vírus compreendendo uma proteína de HIV quimérica, proteína de vírus da raiva quimérica, proteína de VZV quimérica, proteína de SARS quimérica ou vírus Ebola quimérica pode ser descrita como uma "VLP quimérica".
[0082] Por "proteína quimérica" ou "polipeptídeo quimérico", também referida como uma proteína de fusão, quer dizer uma proteína ou polipeptídeo que compreende sequências de aminoácido de duas ou mais de duas fontes, por exemplo, mas não limitado a, um ectodomí- nio de uma proteína de superfície trimérica do vírus ou fragmento da mesma, por exemplo, uma proteína F (por exemplo, RSV, Sarampo, Caxumba, Doença de Newcastle), proteína S (por exemplo, SARS), proteína de env (HIV), proteína G (raiva), glicoproteínas de envelope tais como E, B, C, I, H (VZV, citomegalovírus, herpesvirus, vírus Epstein-barr), glicoproteína GP (por exemplo, ebola, Marburg), hemagluti- nina (por exemplo, vírus da varíola, vírus vaccínia) e, por exemplo, os TM/TC de HA, que são fusionados como um polipeptídeo simples. A proteína ou polipeptídeo quimérico pode incluir um peptídeo sinal que é igual ao, ou heterólogo com o, restante do polipeptídeo ou proteína.
[0083] O termo "peptídeo sinal" é bem conhecido na técnica e se refere em geral a uma sequência curta de aminoácidos (cerca de 5-30 aminoácidos), encontrada geralmente no terminal N de um polipeptí- deo que pode direcionar a translocação do polipeptídeo recém- traduzido para uma organela particular ou auxiliar no posicionamento de domínios específicos da cadeia de polipeptídeo com relação a outros. Como um exemplo não limitante, o peptídeo sinal pode direcionar a translocação da proteína para o retículo endoplásmico e/ou auxiliar no posicionamento do domínio proximal N-terminal com relação a um domínio âncora de membrana do polipeptídeo nascente para auxiliar em clivagem e dobra da proteína madura, por exemplo, que não deve ser considerada limitante, uma proteína de HA madura.
[0084] Um peptídeo sinal (PS) (SP-Signal Peptide) pode ser nativo para a proteína ou proteína de vírus, ou um peptídeo sinal pode ser heterólogo com relação à sequência primária da proteína ou proteína de vírus sendo expressa. Uma proteína ou proteína de vírus pode compreender um peptídeo sinal de um primeiro tipo, subtipo ou linhagem de influenza com o equilíbrio da HA de um ou mais de um tipo, subtipo ou linhagem de influenza diferente. Por exemplo, o peptídeo sinal nativo de subtipos de HA B H1, H2, H3, H5, H6, H7, H9 ou influ-enza tipo B pode ser usado para expressar a proteína de vírus quimérica em um sistema de planta. Em algumas modalidades da invenção, o SP pode ser de uma influenza tipo B, H1, H3 ou H5; ou do subtipo H1/Bri, H1/NC, H5/lndo, H3/Bri ou B/Flo. Em algumas modalidades, o SP pode ser de proteína Env de HlV, proteína G de raiva, glicoproteína E de VZV, glicoproteína S de SARS ou glicoproteína de envelope do vírus Ebola.
[0085] Um peptídeo sinal pode também ser não nativo, por exemplo, de uma proteína, proteína viral, uma proteína de superfície trimérica do vírus ou hemaglutinina de um vírus outra que não a proteína de superfície trimérica do vírus ou de um polipeptídeo de planta, animal ou bacteriano. Um exemplo não limitante de um peptídeo sinal que pode ser usado é aquele de dissulfeto isomerase da proteína da alfafa (PS de PDl; nucleotídeos 32-103 de No. de Acesso Z11499).
[0086] A presente invenção provê então uma proteína de vírus quimérica compreendendo um peptídeo sinal nativo ou um não nativo e ácidos nucleicos codificando tais proteínas de vírus quiméricas.
[0087] Dobra correta da proteína de vírus quimérica expressa pode ser importante para estabilidade da proteína, formação de multíme- ros, formação de VLPs, funcionamento da proteína de vírus quimérica e reconhecimento da proteína de vírus quimérica por um anticorpo, dentre outras características. Dobra e acúmulo de uma proteína podem ser influenciados por um ou mais fatores, incluindo, mas não limitado a, a sequência da proteína, a abundância relativa da proteína, o grau de coroamento intracelular, o pH em um compartimento celular, a disponibilidade de co-fatores que podem se ligar ou ser transientemente associados com proteína dobrada, parcialmente dobrada ou não dobrada, a presença de uma ou mais proteínas chaperona ou similar.
[0088] Proteínas de choque térmico (Hsp) (Heat Shock Proteins) ou proteínas de estresse são exemplos de proteínas chaperona que podem participar em vários processos celulares incluindo síntese de proteína, tráfego intracelular, prevenção de dobra errada, prevenção de agregação de proteína, montagem e desmontagem de complexos de proteína, dobra de proteína e desagregação de proteína. Exemplos de tais proteínas chaperona incluem, mas não estão limitados a, Hsp60, Hsp65, Hsp 70, Hsp90, HsplOO, Hsp20-30, Hsp10, Hsp100- 200, Hsp100, Hsp90, Lon, TF55, FKBPs, ciclofilinas, ClpP, GrpE, ubi- quitina, calnexina e proteínas dissulfeto isomerases (vide, por exemplo, Macario, A.J.L., Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25:59-70. 1995; Parsell, D.A. & Lindquist, S. Ann. Rev. Genet. 27:437-496 (1993); Patente U.S. No. 5.232.833). Conforme aqui descrito, proteínas chaperona, por exemplo, mas não limitado a Hsp40 e Hsp70, podem ser usadas para assegurar dobra de uma proteína de vírus quimérica.
[0089] Exemplos de Hsp70 incluem Hsp72 e Hsc73 de células de mamífero, DnaK de bactérias, particularmente micobactérias tais como Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium bovis (tal como Bacille-Calmette Guerin: referida aqui como Hsp7l). DnaK de Escherichia coli, levedura e outros procariontes e BiP e Grp78 de eucariontes, tais como A. thaliana (Lin e outros, 2001 (Cell Stress and Chaperones 6:201-208). Um exemplo particular de uma Hsp70 é Hsp70 de A. thaliana (codificada pela referência GenBank: AY120747.1). Hsp70 é capaz de se ligar especificamente a ATP bem como polipeptídeos e peptídeos não dobrados, desta maneira participando em dobramento e desdobramento de proteína bem como em montagem e desmontagem de complexos de proteína.
[0090] Exemplos de Hsp40 incluem DnaJ de procariontes tais como E. coli e micobactérias e HSJ1, HDJ1 e Hsp40 de eucariontes, tal como alfafa (Frugis e outros, 1999, Plant Molecular Biology 40:397408). Um exemplo particular de uma Hsp40 é MsJ1 de M. sativa (ref. GenBank: AJ000995.1). Hsp40 desempenha um papel como uma chaperona molecular em dobra de proteína, termotolerância e replica-ção de DNA, dentre outras atividades celulares.
[0091] Dentre Hsps, Hsp70 e sua co-chaperona, Hsp40, estão envolvidas na estabilização de tradução e polipeptídeos recém- sintetizados antes da síntese ser completada. Sem desejar ser limitado pela teoria, Hsp40 se liga aos fragmentos hidrofóbicos de polipeptídeos não dobrados (nascentes ou recém-transferidos), desta maneira facilitando a interação de complexo Hsp70-ATP com o polipeptídeo. Hidrólise de ATP leva à formação de um complexo estável entre o polipeptídeo, Hsp70 e ADP, e liberação de Hsp40. A associação de complexo Hsp70-ADP com os fragmentos hidrofóbicos de polipeptídeo previne sua interação com outros fragmentos hidrofóbicos, prevenindo a dobra incorreta e a formação de agregados com outras proteínas (revisto em Hartl, F.U., 1996, Nature 381:571-579).
[0092] Proteínas chaperona nativas podem ser capazes de facilitar dobra correta de níveis baixos de proteína recombinante, mas conforme os níveis de expressão aumentam, a abundância de chaperonas nativas pode se tornar um fator limitante. Níveis altos de expressão de proteína de vírus quimérica nas folhas agroinfiltradas podem levar ao acúmulo de proteína de vírus quimérica no citosol e co-expressão de uma ou mais de uma proteína chaperona tais como Hsp70, Hsp40 ou ambas Hsp70 e Hsp40 pode reduzir o nível de proteínas de dobra errada ou agregadas e aumentar o número de proteínas exibindo características estruturais terciárias e quaternárias que permitem a formação de partículas tipo vírus.
[0093] Desta maneira, a presente invenção também provê um método de produção de VLPs de proteína de vírus quimérica em uma planta, em que um primeiro ácido nucleico codificando uma proteína de vírus quimérica é co-expresso com um segundo ácido nucleico codificando uma chaperona. Os primeiro e segundo ácidos nucleicos podem ser introduzidos na planta na mesma etapa ou podem ser intro-duzidos na planta sequencialmente.
[0094] VLPs quiméricas produzidas a partir de proteínas derivadas de vírus, de acordo com a presente invenção, não compreendem proteína de matriz ou núcleo viral. Uma proteína de matriz viral é uma proteína que organiza e mantém estrutura de vírion. Proteínas de matriz viral geralmente interagem diretamente com membranas celulares e podem estar envolvidas no processo de brotamento. Proteínas de núcleo virais são proteínas que fazem parte do nucleocapsídeo e tipicamente estão diretamente associadas com o ácido nucleico viral. Exemplos de proteína de matriz ou núcleo viral são M1 de influenza, M de RSV e proteínas gag de retrovírus. A proteína M1 é conhecida se ligar a RNA (Wakefield L. e Brownlee G.G., Nucl Acids Res 11:85698580, 1989) que é um contaminante de preparação de VLP. A presença de RNA é indesejada quando da obtenção da aprovação reguladora para o produto de VLP quimérico, desta maneira uma preparação de VLP quimérica sem RNA pode ser vantajosa.
[0095] O uso do termo "região reguladora", "elemento regulador" ou "promotor" no presente pedido significa refletir uma porção de ácido nucleico tipicamente, mas não sempre, a montante da região de codificação de proteína de um gene, que pode ser compreendida ou de DNA ou RNA ou ambos DNA e RNA. Quando uma região reguladora é ativa, e em associação operativa, ou operativamente ligada, com um gene de interesse, isso pode resultar em expressão do gene de interesse. Um elemento regulador pode ser capaz de mediar especificidade de órgão ou controle de desenvolvimento ou ativação de gene temporal. Uma "região reguladora" pode incluir elementos promotores, elementos promotores de núcleo exibindo uma atividade de promotor basal, elementos que são induzíveis em resposta a um estímulo externo, elementos que fazem a mediação de atividade de promotor tais como elementos reguladores negativos ou aumentadores transcripcio- nais. "Região reguladora", conforme aqui usado, pode também incluir elementos que são ativos seguindo transcrição, por exemplo, elementos reguladores que modulam expressão de gene tais como aumenta- dores traducionais e transcripcionais, repressores traducionais e trans- cripcionais, sequências de ativação a montante e determinantes de instabilidade de mRNA. Vários desses últimos elementos podem estar localizados próximo da região de codificação.
[0096] No contexto da presente invenção, o termo "elemento regulador" ou "região reguladora" se refere tipicamente a uma sequência de DNA, geralmente, mas não sempre, a montante (5') da sequência de codificação de um gene estrutural, que controla a expressão da região de codificação através da provisão do reconhecimento para poli- merase de RNA e/ou outros fatores requeridos para transcrição iniciar em um sítio particular. No entanto, deve ser compreendido que outras sequências de nucleotídeo, localizadas dentro dos íntrons, ou 3' da sequência, podem também contribuir para a regulagem de expressão de uma região de codificação de interesse. Um exemplo de um ele-mento regulador que provê reconhecimento para polimerase de RNA ou outros fatores de transcrição para assegurar início em um sítio particular é um elemento promotor. A maior parte, mas não todos, os elementos promotores eucarióticos contêm uma caixa TATA, uma sequência de ácido nucleico conservada compreendida de pares de base de nucleotídeos de adenosina e timidina geralmente situados aproximadamente 25 pares de base a montante de um sítio de início de transcrição. Um elemento promotor compreende um elemento promotor basal, responsável pelo início de transcrição, bem como outros elementos reguladores (conforme listado acima) que modificam a ex-pressão do gene.
[0097] Há vários tipos de regiões reguladoras, incluindo aquelas que são reguladas pelo desenvolvimento, induzíveis ou constitutivas.Uma região reguladora que é regulada pelo desenvolvimento, ou controla a expressão diferencial de um gene sob seu controle, é ativada dentro de certos órgãos ou tecidos de um órgão em momentos específicos durante o desenvolvimento deste órgão ou tecido. No entanto, algumas regiões reguladoras que são reguladas pelo desenvolvimento podem ser preferivelmente ativas dentro de certos órgãos ou tecidos em estágios de desenvolvimento específicos, eles podem ser também ativos de uma maneira regulada pelo desenvolvimento ou em um nível basal em outros órgãos ou tecidos dentro da planta também. Exemplos de regiões reguladoras específicas de tecido, por exemplo, região reguladora específica de semente, incluem o promotor de napin, e o promotor da cruciferina (Rask e outros, 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau e outros, 1994, Plant Cell 14: 125-130). Um exemplo de um promotor específico de folha inclui o promotor da plastocia- nina (vide U.S. 7.125.978, que é aqui incorporada a título de referên-cia).
[0098] Uma região reguladora induzível é uma que é capaz de ativar diretamente ou indiretamente transcrição de uma ou mais sequências ou genes de DNA em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor as sequências ou genes de DNA não serão transcritos. Tipicamente o fator proteína que se liga especificamente a uma região reguladora induzível para ativar transcrição pode estar presente em uma forma inativa, que é então diretamente ou indiretamente convertido na forma ativa pelo indutor. No entanto, o fator proteína pode também estar ausente. O indutor pode ser um agente químico tal como uma proteína, metabolito, regulador de crescimento, herbicida ou composto fenólico ou um estresse fisiológico imposto diretamente por calor, frio, sal ou elementos tóxicos ou indiretamente através da ação de um pa- tógeno ou agente de doença tal como um vírus. Uma célula de planta contendo uma região reguladora induzível pode ser exposta a um in dutor através da aplicação externa do indutor à célula ou planta tal como através de pulverização, rega, aquecimento ou métodos similar. Elementos reguladores induzíveis podem ser derivados de genes ou de planta ou não planta (por exemplo, Gatz, C. e Lenk, L.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358; que é aqui incorporado a título de referência). Exemplos de promotores induzíveis potenciais incluem, mas não estão limitados a, promotor induzível por tetraciclina (Gatz, C., 1997, Ann. Ver. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108; que é aqui incorporado a título de referência), promotor induzível por esteroide (Aoyama, T. e Chua, N.H., 1997, Plant 1. 2, 397-404; que é aqui incorporado a título de referência) e promotor induzível por etanol (Salter, M.G. e outros, 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X. e ou- tros,1998, Nature Biotech. 16, 177-180, que são aqui incorporados a título de referência) genes IB6 e CKl 1 induzíveis por citocina (Brands- tatter, I. e K.ieber, 1.1..1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274,982-985; que são aqui incorporados a título de referência) e o elemento induzível por auxina, DR5 (Ulmasov, T. e outros, 1997, Plant Cell 9, 1963-1971; que é aqui incorporado a título de referência).
[0099] Uma região reguladora constitutiva direciona a expressão de um gene através das várias partes de uma planta e continuamente durante o desenvolvimento da planta. Exemplos de elementos reguladores constitutivos conhecidos incluem promotores associados com o transcrito de CaMV (Odell e outros, 1985, Nature, 313: 810-812), da actina 1 do arroz (Zhang e outros, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), ac- tina 2 (An e outros, 1996, Plant J., 10: 107-121) ou tms 2 (U.S. 5,428,147, que é aqui incorporada a título de referência) e genes da triosefosfato isomerase 1 (Xu e outros, 1994, Plant Physiol. 106: 459467), o gene da ubiquitina 1 do milho (Cornejo e outros, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), os genes 1 e 6 da ubiquitina da Arabidopsis (Holtorf e outros, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646) e o gene do fator 4A de início de tradução do tabaco (Mandel e outros, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 995-1004).
[00100] O termo "constitutivo" conforme aqui usado não indica ne-cessariamente que um gene sob controle da região reguladora constitutiva seja expresso no mesmo nível em todos os tipos de célula, mas que o gene é expresso em uma ampla gama de tipos de célula embora variação em abundância seja frequentemente observada. Elementos reguladores constitutivos podem ser acoplados a outras sequências para aumentar mais a transcrição e/ou tradução da sequência de nucleotídeo à qual eles estão operativamente ligados. Por exemplo, o sistema CPMV-HT é derivado das regiões não traduzidas do vírus do mosaico do Feijão de corda (CPMV) e demonstra tradução aumentada da sequência de codificação associada. Por "nativo" quer dizer que a sequência de ácido nucleico ou aminoácido é de ocorrência natural ou "do tipo selvagem". Por "operativamente ligado" quer dizer que as sequências particulares, por exemplo, um elemento regulador e uma região de codificação de interesse, interagem ou diretamente ou indire-tamente para realizar uma função pretendida, tal como mediação ou modulação de expressão de gene. A interação de sequências operativamente ligadas pode, por exemplo, ser mediada por proteínas que interagem com as sequências operativamente ligadas.
[00101] A proteína ou polipeptídeo quimérico pode ser expresso em um sistema de expressão compreendendo um sistema de expressão de base viral, DNA ou RNA, por exemplo, mas não limitado a, um cassete de expressão baseado em comovirus e elemento de amplificação baseado em geminivirus.
[00102] O sistema de expressão conforme aqui descrito pode compreender um cassete de expressão com base em um vírus bipartido ou um vírus com um genoma bipartido. Por exemplo, os vírus bipartidos podem ser da família Comoviridae. Gêneros da família Comoviridae incluem Comovirus, Nepovirus, Fabavirus, Cheravirus e Sadwavirus. Comovirus incluem Vírus do mosaico do feijão de corda (CPMV) (Cowpea mosaic virus), Vírus do mosaico severo do feijão de corda (CPSMV) (Cowpea Severe Mosaic Virus), Vírus do mosaico da abóbora (SqMV) (Squash Mosaic Virus), Vírus mosqueado do trevo vermelho (RCMV) (Red Clover Mottle Virus), Vírus mosqueado da vagem do feijão (BPMV) (Bean Pod Mottle Virus), Vírus da mancha anelar do nabo (TuRSV) (Turnip Ringspot Virus), Vírus do mosaico verdadeiro do feijão de fava (BBtMV) (Broad Bean True Mosaic Virus), Vírus da mancha do feijão de fava (BBSV) (Broad Bean Stain Virus), Vírus do mo-saico do rabanete (RaMV) (Radish Mosaic Virus). Exemplos de sequências de RNA-2 de comovirus compreendendo elementos aumen- tadores que podem ser úteis para vários aspectos da invenção incluem, mas não estão limitados a: RNA-2 de CPMV (No. Acesso GenBank NC_003550), RNA-2 de RCMV (No. Acesso GenBank NC_003738), RNA-2 de BPMV (No. Acesso GenBank NC_003495), RNA-2 de CPSMV (No. Acesso GenBank NC_003544), RNA-2 de SqMV (No. Acesso GenBank NC_003800), RNA-2 de TuRSV (No. Acesso GenBank NC_013219.1). RNA-2 de BBtMV (No. Acesso GenBank GU810904), RNA2 de BBSV (No. Acesso GenBank FJ028650), RaMV (No. Acesso GenBank NC_003800).
[00103] Segmentos do genoma de RNA comoviral bipartido são referidos como RNA-1 e RNA-2. RNA-1 codifica as proteínas envolvidas em replicação enquanto RNA-2 codifica as proteínas necessárias para movimento célula-para-célula e das duas proteínas do capsídeo. Qualquer cassete baseado em comovirus adequado pode ser usado incluindo CPMV, CPSMV, SqMV, RCMV ou BPMV, por exemplo, o cassete de expressão pode ser baseado em CPMV.
[00104] "Cassete de expressão" se refere a uma sequência de nu- cleotídeo compreendendo um ácido nucleico de interesse sob o controle de, e operavelmente (ou operativamente) ligado a, um promotor apropriado ou outros elementos reguladores para transcrição do ácido nucleico de interesse em uma célula hospedeiro.
[00105] Os sistemas de expressão podem também compreender elementos de amplificação de um geminivirus, por exemplo, um elemento de amplificação do vírus anão amarelo do feijão (BeYDV) (Bean Yellow Dwarf Virus). BeYDV pertence ao gênero Mastreviruses adaptado para plantas dicotiledôneas. BeYDV é uma monopartícula tendo um genoma de DNA circular de fita simples e pode replicar em números de cópia muito altos através de um mecanismo de círculo rolante. Sistemas de vetor de replicon de DNA derivados de BeYDV têm sido usados para produção de proteína em alto rendimento rápida em plantas.
[00106] Conforme aqui usado, a expressão "elementos de amplificação" se refere a um segmento de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma porção de uma ou mais regiões intergênicas longas (LIR) (Long Intergenic Regions) de um genoma de geminivirus. Conforme aqui usado, "região intergênica longa" se refere a uma região de uma região intergênica longa que contém um sítio de ligação de rep capaz de mediar excisão e replicação por uma proteína Rep de geminivirus . Em alguns aspectos, o segmento de ácido nucleico compreendendo uma ou mais LIRs pode compreender ainda uma região inter- gênica curta (SIR) (Short Intergenic Region) de um genoma de gemini- vírus. Conforme aqui usado, "região intergênica curta" se refere a fita complementar (a IR curta (SIR) de um Mastrevirus). Qualquer elemento de amplificação derivado de geminivírus pode ser usado aqui. Vide, por exemplo, WO2000/20557; WO2010/025285; Zhang X. e outros (2005, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 93, 271-279), Huang Z. e outros (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, 706-714), Huang Z. e outros 2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 106, 9-17); que são aqui incorporados a título de referência).
[00107] A proteína quimérica ou o polipeptídeo quimérico pode ser produzido como um transcrito a partir de uma sequência de nucleotídeo quimérica e a proteína quimérica ou polipeptídeo quimérico clivado seguindo síntese e, conforme necessário, associado para formar uma proteína multimérica. Desta maneira, uma proteína quimérica ou um polipeptídeo quimérico também inclui uma proteína ou polipeptídeo compreendendo subunidades que são associadas através de pontes dissulfeto (isto é, uma proteína multimérica). Por exemplo, um polipep- tídeo quimérico compreendendo sequências de aminoácido de duas ou mais de duas fontes pode ser processado em subunidades, e as subunidades associadas através de pontes dissulfeto para produzir uma proteína quimérica ou polipeptídeo quimérico.
[00108] A proteína de vírus quimérica de acordo com várias modalidades da presente invenção compreende um domínio transmembrana e uma cauda citoplasmática (TM/CT) de uma HA de influenza. Os TM/CT podem ser TM/CT de HA nativos de qualquer tipo, subtipo de vírus influenza incluindo, por exemplo, tipos ou subtipos B, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 e H16. Exemplos não limitantes de tipos ou subtipos H1, H3, H5 ou B incluem o subtipo A/NewCaledonia/20/99 (H1N1), o subtipo H1 A/California/04/09 (H1N1), o subtipo A/lndonesia/5/05 (H5N1), o subtipo A/Brisbane/59/ 2007, o B/Florida/4/2006 e o H3 A/Brisbane/10/2007 (vide, por exemplo, WO2009/009876; WO 2009/076778; WO 2010/003225; WO 2010/ 003235, que são aqui incorporados a título de referência). Ainda, os TM/CT podem ser de qualquer um daqueles TM/CT de HA em que 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram deletados ou em que nenhum tipo de sequência espaçadora ou ligante de 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foi adicionado.
[00109] Preferivelmente, o TM/CT é de H5 ou H3, por exemplo, mas não limitado a, subtipo A/lndonesia/5/05 (H5N1; "H5/lndo"; No. Acesso GenBank ABW06108.1), H5 A/Vietnam/1194/2004(A-Vietnam; No. Acesso GenBank ACR48874.1), H5 A/Anhui/1/2005 (A-Anhui; No. Acesso GenBank ABD28180.1); H3 A/Brisbane/10/2007 ("H3/Bri"; No. Acesso GenBank ACI26318.1), H3 A/Wisconsin/67/2005(A-WCN; No. Acesso GenBank ABO37599.1). Os TM/CT de limites de várias sequências de H3 e H5 são descritos no WO 2010/148511 (que é aqui incorporado a título de referência). Exemplos não limitantes de sequências de aminoácido para os TM/CT incluem SEQ ID NOs:41 e 42 e qualquer sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de ami- noácido de SEQ lD NO:41 ou 42.
[00110] Variação de aminoácido é tolerada em hemaglutinina de vírus influenza. Tal variação provê novas linhagens que estão continuamente sendo identificadas. lnfectividade entre as novas linhagens pode variar. No entanto, formação de trímeros de hemaglutinina, que subsequentemente formam VLPs, é mantida. A presente invenção, então, provê uma proteína de vírus quimérica compreendendo uma sequência de aminoácido de hemaglutinina, ou um ácido nucleico codificando uma proteína de vírus quimérica compreendendo uma se-quência de aminoácido de hemaglutinina, que forma VLPs em uma planta, e inclui sequências conhecidas e sequências de HA variantes que possam se desenvolver.
[00111] O termo "partícula tipo vírus" (VLP) ou "partículas tipo vírus" ou "VLPs" se refere a estruturas que realizam automontagem e compreendem proteínas estruturais tal como proteína de vírus quimérica. VLPs e VLPs quiméricas são geralmente morfologicamente e antigeni- camente similares a vírions produzidos em uma infecção, mas não possuem informação genética suficiente para replicar e então são não infecciosas. VLPs e VLPs quiméricas podem ser produzidas em célu- las hospedeiro adequadas incluindo células hospedeiro de planta. Seguindo extração da célula hospedeiro e quando do isolamento e purificação adicional sob condições adequadas, VLPs e VLPs quiméricas podem ser purificadas como estruturas intactas.
[00112] As VLPs quiméricas da presente invenção podem ser produzidas em uma célula hospedeiro que é caracterizada por falta de habilidade em sialilar proteínas, por exemplo, uma célula de planta, uma célula de inseto, fungo e outros organismos incluindo esponja, celenterados, anelídeos, artrópodes, moluscos, nematelmínteos, tro- quelmínteos, platelmínteos, quetognatas, tentaculados, clamídia, espi- roquetas, bactérias gram-positivas, cianobactérias, arqueobactérias ou similar. Vide, por exemplo, Gupta e outros, 1999. Nucleic Acids Research 27:370-372; Toukach e outros, 2007. Nucleic Acids Research 35:D280-D286; Nakahara e outros, 2008. Nucleic Acids Research 36:D368-D371.
[00113] A invenção também prove VLPs quiméricas que obtêm um envelope de lipídeo a partir da membrana de plasma da célula em que as VLPs quiméricas são expressas. Por exemplo, se o vírus quimérico é expresso em um sistema à base de planta, a VLP quimérica resultante pode obter um envelope de lipídeo a partir da membrana de plasma da célula de planta.
[00114] Em geral, o termo "lipídeo" se refere a uma molécula de ocorrência natural, solúvel em gordura (lipofílica). Uma VLP quimérica produzida em uma planta de acordo com alguns aspectos da invenção pode ser complexada com lipídeos derivados de planta. Os lipídeos derivados de planta podem estar na forma de uma bicamada de lipídeo e podem ainda compreender um envelope circundando a VLP. Os lipídeos derivados de planta podem compreender componentes de lipídeo da membrana de plasma da planta em que a VLP é produzida, incluindo fosfolipídeos, tri-, di- ou monoglicerídeos, bem como esterol solúvel em gordura ou metabolites compreendendo esterol. Exemplos incluem fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilinosi- tol, fosfatidilserina, glicoesfingolipídeos, fitoesteróis ou uma combinação deles. Um lipídeo derivado de planta pode ser alternativamente referido como um 'lipídeo de planta'. Exemplos de fitoesteróis incluem campesterol, estigmasterol, ergoesterol, brassicasterol, delta-7- estigmasterol, delta-7-avenasterol, daunosterol, sitosterol, 24- metilcolesterol, colesterol ou beta-sitosterol - vide, por exemplo, Mongrand e outros, 2004. Como um versado na técnica compreenderia, a composição de lipídeo da membrana de plasma de uma célula pode variar com as condições de cultura ou crescimento da célula ou organismo, ou espécie, da qual a célula é obtida. Em geral, beta-sitosterol é o fitoesterol mais abundante.
[00115] Membranas celulares geralmente compreendem bicamadas de lipídeo, bem como proteínas para várias funções. Concentrações localizadas de lipídeos particulares podem ser encontradas na bica- mada do lipídeo, referidas como 'grandes quantidades de lipídeo'. Esses microdomínios de grandes quantidades de lipídeo podem ser enriquecidos em esfingolipídeos e esteróis. Sem desejar ser limitado pela teoria, grandes quantidades de lipídeo podem ter papéis significantes em endo e exocitose, entrada ou egresso de vírus ou outros agentes infecciosos, transdução de sinal intercelular, interação com outros componentes estruturais da célula ou organismo, tais como matrizes intracelulares e extracelulares.
[00116] A VLP produzida dentro de uma planta pode induzir uma proteína de vírus quimérica compreendendo N-glicanos específicos de planta. Desta maneira, a invenção também provê uma VLP compreendendo proteínas de vírus quiméricas tendo N-glicanos específicos de planta.
[00117] Ainda, modificação de N-glicano em plantas é conhecida (vide, por exemplo, U.S. 60/944.344; que é aqui incorporada a título de referência) e proteínas de vírus quiméricas tendo N-glicanos modificados podem ser produzidas. Proteínas de vírus quiméricas compreendendo um padrão de glicosilação modificado, por exemplo, com N- glicanos fucosilados, xilosilados, ou ambos fucosilados e xilosilados, reduzidos podem ser obtidas, ou proteínas de vírus quiméricas tendo um padrão de glicosilação modificado podem ser obtidas, em que a proteína não tem fucosilação, xilosilação, ou ambas, e compreende galactosilação aumentada. Ainda, modulação de modificações pós- traducionais, por exemplo, a adição de galactose terminal, pode resultar em uma redução de fucosilação e xilosilação das proteínas de vírus quiméricas expressas quando comparado com uma planta do tipo sel-vagem expressando proteínas de vírus quiméricas.
[00118] Por exemplo, que não deve ser considerado limitante, a síntese de proteínas de vírus quiméricas tendo um padrão de glicosilação modificado pode ser obtida através da co-expressão da proteína de vírus quimérica junto com uma sequência de nucleotídeo codificando beta-1,4-galactosiltransferase (GalT), por exemplo, mas não limitado a, GalT de mamífero, ou GalT humana, embora GalT de outras fontes possa ser também usada. O domínio catalítico de GalT pode também ser fusionado a um domínio de CTS (isto é, a cauda citoplasmática, domínio transmembrana, região de tronco) de N-acetilglicosaminil- transferase (GNT1), para produzir uma enzima híbrida GNT1-GalT e a enzima híbrida pode ser co-expressa com proteína de vírus quimérica. A proteína de vírus quimérica pode ser também co-expressa junto com uma sequência de nucleotídeo codificando N-acetilglicosaminiltrans- ferase III (GnT-lll), por exemplo, mas não limitado a, GnT-lll de mamífero ou GnT-lll de humano, GnT-lll de outras fontes podem ser também usada. Ainda, uma enzima híbrida GNT1-GnT-lll compreendendo o CTS de GNT1 fusionado a GnT-lll pode ser também usada.
[00119] Desta maneira, a presente invenção também provê VLPs compreendendo proteína de vírus quimérica tendo N-glicanos modificados.
[00120] Sem desejar ser limitado pela teoria, a presença de N- glicanos de planta em proteína de vírus quimérica pode estimular a resposta imune através da promoção da ligação de proteína de vírus quimérica por células apresentando antígeno. Estimulação da resposta imune usando N-glicano de planta foi proposta por Saint-Jore-Dupas e outros (2007). Ainda, a conformação da VLP pode ser vantajosa para a apresentação do antígeno, e aumentar o efeito adjuvante de VLP quando complexada com uma camada de lipídeo derivada de planta.
[00121] VLPs podem ser avaliadas quanto à estrutura e tamanho, por exemplo, ensaio de hemaglutinina, microscopia eletrônica ou através de cromatografia de exclusão de tamanho.
[00122] Para cromatografia de exclusão de tamanho, proteínas solúveis totais podem ser extraídas de tecido de planta através de homogeneização (Polytron) da amostra de material de planta moído congelado em tampão de extração, e material insolúvel removido através de centrifugação. Precipitação com acetona gelada ou PEG pode ser também benéfica. A proteína solúvel é quantificada e o extrato passado por uma coluna Sephacryl®, por exemplo, uma coluna Sephacryl® S500. Blue Dextran 2000 pode ser usado como um padrão de calibragem. Seguindo cromatografia, as frações podem ser analisadas adicionalmente através de immunoblot para determinar o complemento de proteína da fração.
[00123] A fração separada pode ser, por exemplo, um sobrenadan- te (se centrifugado, sedimentado ou precipitado) ou um filtrado (se filtrado) e é enriquecida com proteínas, ou proteínas de supraestrutura, tais como, por exemplo, estruturas tipo roseta ou partículas de ordem superior, de peso molecular maior, tais como VLPs. A fração separada pode ser processada adicionalmente para isolar, purificar, concentrar ou uma combinação deles, as proteínas, ou proteínas de supraestrutu- ra, através de, por exemplo, etapas de centrifugação adicionais, precipitação, etapas cromatográficas (por exemplo, exclusão de tamanho, troca de íon, cromatografia de afinidade), filtragem de fluxo tangencial ou suas combinações. A presença de proteínas purificadas, ou proteínas de supraestrutura, pode ser confirmada através de, por exemplo, análise Western, nativa ou SDS-PAGE, usando um anticorpo de detecção apropriado, eletroforese capilar, microscopia eletrônica ou qualquer outro método como seria evidente a um versado na técnica.
[00124] Os perfis de eluição podem variar dependendo das condições de eluição usadas. As Figuras 7, 8O e 11B mostram um exemplo de um perfil de eluição de uma análise de cromatografia de exclusão de tamanho de um extrato de planta compreendendo VLPs quiméricas. Neste caso, VLPs compreendendo proteínas de superfície triméri- cas de vírus HIV quiméricas, G da raiva quimérica e VZV quimérica eluem no volume de veio da coluna, rosetas e estruturas de peso molecular alto eluem mais ou menos a partir das frações 13 a 14, e forma solúvel, de peso molecular menor, das proteínas de superfície triméri- cas de vírus quiméricas eluem mais ou menos a partir das frações de 15 a cerca de 17.
[00125] As VLPs podem ser purificadas ou extraídas usando qualquer método adequado, por exemplo, extração química ou bioquímica. VLPs são relativamente sensíveis à dissecação, calor, pH, tensoativos e detergentes. Desta maneira, pode ser útil usar métodos que maximizem rendimentos, minimizem contaminação da fração de VLP com proteínas celulares, mantenham a integridade das proteínas, ou VLPs, e, em que necessário, o envelope ou membrana de lipídeo associado, métodos de afrouxamento da parede celular para liberar as proteínas, ou VLP. Por exemplo, métodos para produzir protoplasto e/ou esfero- plastos podem ser usados (vide, por exemplo, WO 2011/035422, que é aqui incorporado a título de referência) para obter VLPs conforme aqui descrito. Minimização ou eliminação do uso de detergência ou tensoativos tais como, por exemplo, SDS ou Triton X-100 pode ser benéfica para melhora do rendimento de extração de VLP. VLPs podem ser então avaliadas quanto à estrutura e tamanho através de, por exemplo, microscopia eletrônica ou através de cromatografia de exclusão de tamanho conforme acima mencionado.
[00126] O um ou mais de um ou mais construtos genéticos quiméricos da presente invenção podem ser expressos em qualquer hospedeiro planta adequado que é transformado pela sequência de nucleo- tídeo, ou construtos, ou vetores da presente invenção. Exemplos de hospedeiros adequados incluem, mas não estão limitados a, culturas agriculturais incluindo alfafa, canola, Brassica spp., milho, Nicotiana spp., alfafa, batata, ginseng, ervilha, aveia, arroz, soja, trigo, cevada, girassol, algodão e similar.
[00127] O um ou mais construtos genéticos quiméricos da presente invenção podem compreender ainda uma região não traduzida 3'. Uma região não traduzida 3' se refere àquela porção de um gene compreendendo um segmento de DNA que contém um sinal de poliadenilação e qualquer outro sinal regulador capaz de realizar processamento de mRNA ou expressão de gene. O sinal de poliadenilação é geralmente caracterizado por realização da adição de vestígios de ácido poliadení- lico à extremidade 3' do precursor de mRNA. Sinais de poliadenilação são geralmente reconhecidos pela presença de homologia com a forma canônica 5' AATAAA-3', embora variações não sejam incomuns. Exemplos não limitantes de regiões 3' adequadas são as regiões não traduzidas transcritas 3' contendo um sinal de poliadenilação de genes de plasmídeo de indução de tumor (Ti) (Tumor Inducing) de Agrobacterium, tal como gene da nopalina sintase (NOS), genes de planta tais como genes da proteína de armazenamento da soja, a subunidade pequena de ribulose-I, gene da 5-bifosfato carboxilase (ssRUBISCO; U.S. 4.962.028; que é aqui incorporado a título de referência), o promotor usado na regulagem da expressão de plastocianina, descrito na U.S. 7.125.978 (que é aqui incorporada a título de referência).
[00128] Um ou mais dos construtos genéticos quiméricos da presente invenção podem também incluir aumentadores adicionais, au- mentadores de tradução ou transcrição, conforme necessário. Aumentadores podem estar localizados 5' ou 3' para a sequência sendo transcrita. Regiões aumentadoras são bem conhecidas do versado na técnica e podem incluir um códon de início ATG, sequências adjacentes ou similar. O códon de início, se presente, pode estar em fase com a estrutura de leitura ("em estrutura") da sequência de codificação para prover tradução correta da sequência transcrita.
[00129] Os construtos da presente invenção podem ser introduzidos em células de planta usando plasmídeos Ti, plasmídeos Ri, vetores de vírus de planta, transformação de DNA direta, microinjeção, eletropo- ração, etc. Para revisões de tais técnicas vide, por exemplo, Weissbach e Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson e Corey, Plant Molecular Biology , 2d Ed. (1988); e Miki e Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. Londres, pp. 561-579 (1997). Outros métodos incluem absorção de DNA direta, o uso de lipossomas, eletroporação, por exemplo, usando pro- toplastos, microinjeção, microprojéteis ou whiskers, e filtragem a vácuo. Vide, por exemplo, Bilang e outros (Gene 100: 247-250 (1991), Scheid e outros (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guerche e outros (Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhause e outros (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Klein e outros, Nature 327: 70-73 (1987); Howell e outros (Science 208: 1265, 1980), Horsch e outros (Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlock e outros, Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler e Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu e Lomonossoff (J. Virol. Meth., 105:343-348, 2002,), Pat. U.S. Nos. 4.945.050; 5.036.006; e 5.100.792, Pedidos de Patente U.S Nos. de Série 08/438,666, depositado em 10 de maio de 1995, e 07/951.715, depositado em 25 de setembro de 1992 (todos aqui incorporados a título de referência).
[00130] Conforme descrito abaixo, métodos de expressão transiente podem ser usados para expressar o construto da presente invenção (vide Liu e Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348; que é aqui incorporado a título de referência). Alternativamente, um método de expressão transiente baseado em vácuo, conforme descrito por Kapila e outros, 1997, que é aqui incorporado a título de referência, pode ser usado. Esses métodos podem incluir, por exemplo, mas não estão limitados a, um método de Agroinoculação ou Agroinfiltração, infiltração com seringa, no entanto, outros métodos transientes podem ser também usados conforme acima mencionado. Com Agroinoculação, Agro-infiltração, ou infiltração com seringa, uma mistura de Agrobacterium compreendendo o ácido nucleico desejado entra nos espaços intercelulares de um tecido, por exemplo, as folhas, porção aérea da planta (incluindo caule, folhas e flor), outra porção da planta (caule, raiz, flor) ou a planta inteira. Depois de cruzar a epiderme a Agrobacteria infecta e transfere cópias de t-DNA para as células. O t-DNA é epissomalmente transcrito e o DNA traduzido, levando à produção da proteína de interesse em células infectadas, no entanto, a passagem de t-DNA dentro do núcleo é transiente.
[00131] Para auxiliar na identificação de células de planta transfor- madas, os construtos da presente invenção podem ser manipulados adicionalmente para incluir marcadores selecionáveis de planta. Marcadores selecionáveis úteis incluem enzimas que proveem resistência a agentes químicos tal como um antibiótico, por exemplo, gentamicina, higromicina, canamicina ou herbicida tais como fosfinotricina, glifosato, clorossulfurom e similar. Similarmente, enzimas que proveem produção de um composto identificável por mudança de cor tal como GUS (beta-glucuronidase) ou luminescência, tal como luciferase ou GFP, podem ser usadas.
[00132] Também consideradas partes da presente invenção são plantas, células ou sementes de planta transgênicas contendo o cons- truto de gene quimérico da presente invenção. Métodos de regeneração de plantas integrais a partir de células de planta são também conhecidos na técnica. Em geral, células de planta transformadas são cultivadas em um meio apropriado, que pode conter agentes selecionados tais como antibióticos, em que marcadores selecionáveis são usados para facilitar a identificação de células de planta transformadas. Uma vez calo se formando, formação de broto pode ser encorajada através do emprego dos hormônios de planta apropriados de acor-do com métodos conhecidos e os brotos transferidos para meio de en-raizamento para regeneração de planta. As plantas podem então ser usadas para estabelecer gerações repetitivas, ou a partir de sementes ou usando técnicas de propagação vegetativas. Plantas transgênicas podem também ser geradas sem uso de culturas de tecido.
[00133] A presente invenção inclui sequências de nucleotídeo:
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[00134] A presente invenção será ilustrada adicionalmente nos exemplos que seguem. Exemplos Construtos
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Exemplo 1: Montagem de cassetes de expressão com proteína de HIV 2x35S-CMPV HT-PDISP-HIV ConS ΔCFI-NOS (construto número 995)
[00135] Uma sequência codificando peptídeo sinal de PDI de alfafa fusionado a ΔCFI ConS de HIV com domínio transmembrana nativo e cauda citosólica foi clonada em sistema de expressão 2X35S-CPMV- HT como segue. Primeiro, a sequência de ácido nucleico do gene de ΔCFI ConS de HIV, compreendendo o peptídeo sinal nativo e domínios transmembrana e citoplasmática, foi sintetizado pela GeneArt AG (Regensburg, Alemanha) de acordo com as sequências reveladas em Liao e outros (2006, Virology 353: 268-282). A sequência de ácido nu-cleico de ΔCFI ConS de HIV é apresentada na Figura 1A (SEQ ID NO:1). O peptídeo sinal da proteína dissulfeto isomerase de alfafa (PDISP) (nucleotídeos 32-103; No. Acesso Z11499) foi ligado a ΔCFI ConS de HIV através do método de ligação baseado em PCR apresentado por Darveau e outros (Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995)). Em uma primeira rodada de PCR, um fragmento contendo PDISP foi amplificado usando iniciadores IF-ApaI-SpPDI.c (Figura 1B, SEQ ID NO: 2) e SpPDI-HIV gp145.r (Figura 1C, SEQ ID NO: 3) com construto número 540 (vide Figura 52, SEQ ID NO: 61 do WO 2010/003225, que é aqui incorporado a título de referência, para a sequência de construto número 540) como molde. Um segundo fragmento contendo ΔCFI ConS sem o peptídeo sinal nativo foi amplificado usando iniciadores IF-SpPDI-gp145.c (Figura 1D, SEQ ID NO: 4) e WtdTm-gp145.r (Figura 1E, SEQ ID NO: 5) usando o segmento de ΔCFI ConS sintetizado (Figura 1A, SEQ ID NO: 1) como um molde. Em uma segunda rodada de PCR, os iniciadores IF-ApaI-SpPDI.c (Figura 1B, SEQ ID NO: 2) e WtdTm-gp145.r (Figura 1E, SEQ ID NO: 5) foram usados junto com ambos os produtos de PCR da primeira rodada de PCR como molde. O produto de PCR resultante foi digerido com enzima de restrição ApaI e clonado em um construto 972 modificado digerido com Apal-Stul. O plasmídeo aceitador 972 modificado (vide Figura 94, SEQ lD NO:134 do WO 2010/003225, que é aqui incorporado a título de referência, para sequência original de construto número 972) foi tratado para eliminar um sítio de restrição Sbfl a montante do promotor de 2X35S. O sítio Sbfl foi eliminado através de digestão do plasmídeo 972 com Sbfl, tratando o plasmídeo resultante com poli- merase de DNA T4 para remover a sobreposição 3' e religando o plasmídeo tratado, resultando no plasmídeo 972 modificado sem sítio Sbfl. O construto resultante recebeu o número 995 (Figura 1F, SEQ lD NO:6). A sequência de aminoácido de PDlSP-ΔCFl ConS de HlV é apresentada na Figura 1G (SEQ lD NO:7). A representação do plas- mídeo é apresentada na Figura 1H. Este construto não codifica uma proteína M1.
2X35S-CPMV HT -PDlSP-HlV ConS ΔCFl+ H3 A/Brisbane/10/2007 (TmD + cauda Cito)-NOS (construto número 997)
[00136] Uma sequência codificando peptídeo sinal de PDl de alfafa fusionado a ΔCFl ConS de HlV e aos domínios transmembrana e cito- sólico de H3 A/Brisbane/10/2007 foi clonada em sistema de expressão 2X35S-CPMV-HT usando o método de ligação baseado em PCR apresentado por Darveau e outros (Methods in Neuroscience 26: 7785 (1995)). Em uma primeira rodada de PCR, um fragmento compreendendo PDlSP-ΔCFl ConS de HlV sem os domínios transmembrana e citoplasmático nativos foi amplificado usando iniciadores lF-Apal- SpPDl.c (Figura 1B, SEQ lD NO: 2) e lF-H3dTm+gp145.r (Figura 2A, SEQ lD NO: 8), usando construto número 995 (Figura 1F, SEQ lD NO: 6) como molde. Um segundo fragmento contendo os domínios trans- membrana e citosólico de H3 A/Brisbane/10/2007 foi amplificado usando iniciadores Gp145+H3dTm.c (Figura 2B, SEQ lD NO: 9) eH3dTm.r (Figura 2C, SEQ lD NO: 10), usando construto número 776 (vide Figura 60, SEQ lD NO: 69 do WO 2010/003225, que é aqui in- corporado a título de referência, para sequência de construto número 776) como molde. Os produtos de PCR de ambas as amplificações foram então misturados e usados como molde para uma segunda rodada de amplificação usando IF-Apal-SpPDI.c (Figura 1B, SEQ ID NO: 2) e H3dTm.r (Figura 2C, SEQ ID NO: 10) como iniciadores. O produto da segunda PCR foi então digerido com Apal e clonado no construto número 995 (Figura 1F, SEQ ID NO:6) digerido com enzimas de restrição Apal e Stul. O construto resultante recebeu o número 997 (Figura 2D, SEQ ID NO:11). A sequência de aminoácido de PDISP-ΔCFI ConS de HIV-A/Brisbane/10/2007 H3 TM+CT 4 apresentada na Figura 2E (SEQ ID NO:12). A representação do plasmídeo 997 é apresentada na Figura 2F. Este construto não codifica uma proteína M1.
2X35S-CPMV HT-PDISP-HIV ConS ΔCFI-H5 A/Indonesia/5/ 2005 (TmD + cauda Cito)-NOS (construto número 999)
[00137] Uma sequência codificando peptídeo sinal de PDI de alfafa fusionado a ΔCFI ConS de HIV e aos domínios transmembrana e cito- sólico de H5 A/Indonesia/5/2005 foi clonada em sistema de expressão 2X35S-CPMV-HT como segue usando método de ligação baseado em PCR apresentado por Darveau e outros (Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995)). Em uma primeira rodada de PCR, um fragmento contendo PDISP-ΔCFI ConS de HIV sem os domínios transmembrana e citoplasmático nativos foi amplificado usando iniciadores IF-ApaI- SpPDI.c (Figura 1B, SEQ ID NO: 2) e IF-H5dTm+gp145.r (Figura 3A, SEQ ID NO: 13), usando construto número 995 (Figura 1F, SEQ ID NO: 6) como molde. Um segundo fragmento contendo os domínios transmembrana e citoplasmático de H5 Indonesia/5/2005 foi amplificado usando iniciadores Gp145+H5dTm.c (Figura 3B, SEQ ID NO:15) e IF-H5dTm.r (Figura 3C, SEQ ID NO:15), usando construto número 972 (vide Figura 94, SEQ ID NO:134 do WO 2010/003225, que é aqui incorporado a título de referência, para a sequência de construto número 972) como molde. Os produtos de PCR de ambas as amplificações foram então misturados e usados como molde para uma segunda rodada de amplificação usando IF-ApaI-SpPDI.c (Figura 1B, SEQ ID NO: 2) e IF-H5dTm.r (Figura 3C, SEQ ID NO: 15) como iniciadores. O produto da segunda PCR foi então digerido com ApaI e clonado no cons- truto número 995 (Figura 1F, SEQ ID NO:6) digerido com enzimas de restrição ApaI e StuI. O construto resultante recebeu o número 999 (Figura 3D, SEQ ID NO:6). A sequência de aminoácido de PDISP- ΔCFI ConS de HIV - A/Indonesia/5/2005 H5 TM+CT. TM+CT é apresentada na Figura 3E (SEQ ID NO: 17). A representação do plasmídeo 999 é apresentada na Figura 3F. Este construto não codifica uma proteína M1.
Plastocianina-P19-Plastocianina (construto número 172)
[00138] Uma sequência codificando supressor de silenciamento de P19 do Vírus do Enfezamento do Tomateiro (Tomato Bushy Stunt Virus ) (TBSV) foi clonada entre o promotor da plastocianina da alfafa e UTR 3' e terminador como segue. O construto número R472 (vide WO 2010/003225 A1, que é aqui incorporado a título de referência, para montagem e Figura 86 do WO 2010/003225 A1 para uma representação do plasmídeo R472) foi digerido com as enzimas de restrição DraIII (84 pares de base a montante do ATG inicial) e SacI (9 pares de base a jusante do códon de parada) para remover um fragmento compreendendo 84 pb do promotor da plastocianina da alfafa e a sequência codificando supressor de silenciamento de P19 de TBSV. O fragmento resultante foi clonado no construto 540 (vide WO 2010/003225, que é aqui incorporado a título de referência, para montagem e Figura 6 da mesma patente para uma representação de plasmídeo 540) previamente digerido com DralII e SacI. O construto resultante recebeu o número 172 (SEQ ID NO:4A, Figura 18). A sequência de aminoácidos da proteína P19 de TBSV é apresentada na Figura 4B (SEQ ID N0:19). Uma representação do plasmídeo 172 é apresentada na Figura 4C.
Preparação de biomassa de planta, inóculo e agroinfiltração
[00139] 0s termos "biomassa" e "matéria de planta" conforme aqui usado pretendem refletir qualquer material derivado de uma planta. Biomassa ou matéria de planta pode compreender uma planta inteira, tecido, células ou qualquer fração da mesma. Ainda, biomassa ou matéria de planta pode compreender componentes de planta intracelulares, componentes de planta extracelulares, extratos líquidos ou sólidos de plantas ou uma combinação dos mesmos. Ainda, biomassa ou matéria de planta pode compreender plantas, células de planta, tecido, um extrato líquido ou uma combinação dos mesmos, de folhas, caules, frutos, raízes de planta ou uma combinação dos mesmos. Uma porção de uma planta pode compreender matéria ou biomassa de planta.
[00140] Plantas de Nicotiana benthamiana foram cultivadas a partir de sementes em planícies cheias com um substrato de turfa comercial. As plantas foram deixadas crescer na estufa sob um fotoperíodo de 16/8 e um regime de temperatura de 25°C/dia/20°C noite. Três semanas após a semeadura, mudas individuais foram pegas, transplantadas em vasos e deixadas crescer na estufa por mais três semanas sob as mesmas condições ambientais.
[00141] Agrobacteria transfectada com cada construto foram cultivadas em um meio YEB suplementado com ácido 2-(N-morfolino)eta- nossulfônico (MES) 10 mM, acetosiringona 20 μm, 50 μg/ml de cana- micina e 25 μg/ml de carbenicilina pH 5,6 até que elas atingiram um OÜ600 entre 0,6 e 1,6. Suspensões de Agrobacterium foram centrifugadas antes do uso e ressuspensas em meio de infiltração (MgCh 10 mM e MES 10 mM pH 5,6) e armazenadas da noite para o dia a 4°C. No dia da infiltração, bateladas de cultura foram diluídas em 2,5 volumes de cultura e deixadas aquecer antes do uso. Plantas inteiras de N. benthamiana foram postas viradas para cima na suspensão bacteriana em um tanque de aço inoxidável hermético sob um vácuo de 20-40 Torr por 2 min. As plantas foram retornadas para a estufa para um período de incubação de 2-6 dias até a colheita. A menos que de outra maneira especificado, todas as infiltrações foram realizadas como co- infiltração com linhagem AGL/172 em uma razão 1:1.
[00142] Uma linhagem de tumefaciens compreendendo os vários construtos conforme aqui descrito é referida usando um prefixo "AGL1". Por exemplo, A. tumefacientes compreendendo o construto número 995 (vide Figura 1H) é chamada "AGL1/995".
Colheita de folha e extração de proteína total
[00143] Seguindo a incubação, a parte aérea de plantas foi colhida, congelada a -80°C e triturada em pedaços. Proteínas solúveis totais foram extraídas através de homogeneização (Polytron) de cada amostra de material de planta congelado-triturado em 3 volumes de Tris 50 mM pH 8.0 frio, NaCl 0,15 M, Triton X-100 0,1% e fluoreto de fenilme- tanossulfonila 1M. Após homogeneização, as pastas fluidas foram cen-trifugadas a 10.000 g por 10 minutos a 4°C e esses extratos brutos pu-rificados (sobrenadante) mantidos para análises.
Análise de proteína e immunoblotting
[00144] O teor de proteína total de extratos brutos purificados foi determinado através do ensaio Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) usando albumina de soro bovino como o padrão de referência. As proteínas foram separadas através de SDS-PAGE e eletrotransferidas para membranas de bifluoreto de polivinilideno (PVDF) (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) para imunodetecção. Antes do immunoblotting, as membranas foram bloqueadas com leite desnatado 5% e Tween-20 0,1% em solução salina tamponada com Tris (TBS-T) por 16-18 h a 4°C.
[00145] Immunoblotting foi realizado através de incubação com um anticorpo primário anti-gp120 policlonal de cabra (Abeam, ab21179) diluído 1:2500 em 2 μg/ml em leite desnatado 2% em TBS-Tween 20 0,1%. Detecção de quimioluminescência foi realizada após incubação com anticorpos secundários de burro anti-cabra conjugados com pero-xidase (JIR 705-035-147), diluídos 1:10000 em leite desnatado 2% em TBS-Tween 20 0,1%. Complexos imunorreativos foram detectados através de quimioluminescência usando luminol como o substrato (Roche Diagnostics Corporation).
Exemplo 2: Expressão de proteínas de envelope de HIV nativas e quiméricas em plantas
[00146] ΔCFI ConS de HIV é uma proteína de envelope do grupo M do HIV de consenso com alças variáveis encurtadas, deleção do sítio de clivagem, do domínio de fusão e de uma região imunodominante em gp41. Ela foi demonstrada elicitar anticorpos de neutralização de subtipo cruzado de amplitude e título similares ou maiores do que as proteínas de envelope do tipo selvagem em porquinhos-da-índia (Liao e outros, Virology (2006) 353: 268-282).
[00147] A Figura 5 apresenta os construtos usados neste estudo. No construto número 995, a região de codificação para o ΔCFI ConS de HIV (adiante referido Env), compreendendo o TM/CT nativo, foi posta sob o controle do sistema de expressão de CPMV-HT. Nos construtos números 997 e 999, os domínios TM/CT de Env de HIV foram substituídos por aqueles de hemaglutinina (HA) de influenza de A/Brisbane/10/2007 (H3N2) e A/Indonesia/05/2005 (H5N1), respectivamente. Em todos os casos, um peptídeo sinal de origem de planta - da proteína dissulfeto isomerase (PDI) da proteína da alfafa - substituiu o peptídeo sinal de proteína de Env de HIV.
[00148] Produção de Env de HIV a partir dos construtos 995, 997 e 999 foi comparada em plantas Nicotiana benthamiana agroinfiltradas. Extratos de proteína de plantas infiltradas com AGL1/1995, AGL1/997 e AGL1/999 foram analisados através de western blot e os resultados são mostrados na Figura 6, em que as raias 1 a 4 são controles positivos contendo várias quantidades de HIV-1 recombinante gp160 (ab68171); raia 5, controle negativo; raias 6 a 8, proteínas extraídas de folhas infiltradas com AGL1/995; raias 9 e 10, proteínas extraídas de folhas infiltradas com AGL1/997; raias 11 e 12, proteínas extraídas de folhas infiltradas com AGL1/999.
[00149] Conforme mostrado na Figura 6, expressão de Env de HIV nativo não poderia ser detectada nas condições usadas para detecção, confirmando o nível de acúmulo muito baixo anteriormente relatado para proteína Env de HIV em plantas (Rybicki e outros, 2010, Plant Biotechnology Journal 8: 620-637). As formas quiméricas de Env, em que os domínios TM/CT foram substituídos por aqueles de influenza H3 (construto no. 997) ou H5 (construto no. 999) acumularam em níveis muito maiores do que a forma nativa. Conforme acima mencionado, os construtos No. 997 e No. 999 não codificam uma proteína M1.
Exemplo 3. Montagem de Env de HIV quimérica em partículas tipo vírus
[00150] A capacidade da Env de HIV quimérica em montar VLP em planta em ausência de proteína de núcleo ou matriz foi também examinada. Extratos de proteína de AGL1/997 (Env/H3) e AGL1/999 (Env/H5) foram submetidos à cromatografia de filtragem em gel seguido por análise de frações de eluição quanto ao teor de Env usando anticorpos anti-gp120 de cabra. O Western blot apresentado na Figura 7A mostra que para extratos de plantas infiltradas com AGL1/999, o teor de Env/H5 quimérica em frações de eluição atinge o pico nas frações 7 a 10, indicando sua montagem em estruturas de peso molecular muito alto de mais de 2 milhões de daltons. Exame do teor de proteína relativo nas frações 7 a 18 mostra claramente que a maioria das proteínas hospedeiro eluiu nas frações 11 a 18 (Figura 7B). Esses resultados mostram que Env/H5 monta estruturas de peso molecular alto de tamanho além daquele do peso molecular esperado do homotríme- ro. Resultados similares foram obtidos para plantas infiltradas com Env/H3 em AGL1/997. Juntos esses resultados demonstram que Env de HIV/H5 acumulou em nível alto em plantas agroinfiltradas e montou partículas tipo vírus na ausência de proteínas de núcleo ou matriz. Esses resultados também demonstram que a fusão de domínios TM/CT de HA de influenza a antígenos não influenza é suficiente para montar e liberar VLPs apresentando o antígeno não influenza.
Exemplo 4: Montagem de cassetes de expressão com Proteína da Raiva C-2X35S-CPMV HT-PDISP-Glicoproteína G da Raiva (RabG)+domínio transmembrana e cauda citoplasmática H5 A/Indonesia/5/2005 (TM+ CT)-NOS (Construto número 1074; Figuras 8A, 8H)
[00151] Uma sequência codificando ectodomínio da glicoproteína G da Raiva (Rab G) fusionado aos domínios transmembrana e citosólico de H5 A/Indonesia/5/2005 foi clonada em sistema de expressão 2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS em um plasmídeo contendo cassete de expressão de Plastocianina-P19-Plastocianina como segue usando o método de ligação baseado em PCR apresentado por Darveau e outros (Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995)). Em uma primeira rodada de PCR, um fragmento contendo ectodomínio de Rab G sem o peptídeo sinal nativo, domínios transmembrana e citoplasmático foi amplificado usando iniciadores IF-RabG-S2+4.c (Figura 8B, SEQ ID NO:32) e RabG+H5dTm.r (Figura 8C, SEQ ID NO:33) usando gene de Rab G sintetizado (correspondendo a nt3317-4891 de número de acesso GenBank EF206707) (Figura 8D, SEQ ID NO:34) como molde. Um segundo fragmento contendo os domínios transmembrana e cito- plasmático de H5 A/Indonesia/5/2005 foi amplificado usando iniciadores IF-H5dTm.c (Figura 8E, SEQ ID NO:35) e IF-H5dTm.r (Figura 3C, SEQ ID NO:15), usando construto número 972 (vide Figura 94, SEQ ID NO:134 do WO 2010/003225, que é aqui incorporado a título de re-ferência, para a sequência de construto número 972) como molde. Os produtos de PCR de ambas as amplificações foram então misturados e usados como molde para uma segunda rodada de amplificação usando IF-RabG-S2+4.c (Figura 8B, SEQ ID NO:32) e IF-H5dTm.r (Figura 3C, SEQ ID NO:15) como iniciadores. O fragmento resultante foi clonado em estrutura com peptídeo sinal de PDI de alfafa em sistema de expressão 2x35S-CPMV HT-NOS usando o sistema de clonagem Em Fusão da Clontech (Mountain View, CA). O construto 141 (Figuras 8F, 8G) foi digerido com enzimas de restrição Sbfl e Stul e usado para a reação de montagem Em Fusão. O construto número 141 é um plasmídeo aceitador pretendido para clonagem "Em Fusão" de genes de interesse em um cassete de expressão baseado em CPMV HT. Ele também incorpora um construto de gene para a co-expressão do supressor de P19 de TBSV de silenciamento sob promotor e terminador do gene da Plastocianina da alfafa. O vetor é um plasmídeo baseado em pCAMBIA e a sequência das bordas de t-DNA da esquerda para a direita é apresentada na Figura 8F (SEQ ID NO:36). Uma representação esquemática do vetor 141 é apresentada na Figura 8G. O construto resultante recebeu o número 1074 (Figura 8H, SEQ ID NO:37). A sequência de aminoácido de PDISP - Rab G - A/Indonesia/5/2005 H5 TM+CT é apresentada na Figura 81 (SEQ ID NO:38). A representação do plasmídeo 1074 é apresentada na Figura 8A. Este construto não codifica uma proteína M1.
D-2X35S-PDISP-Glicoproteína G da Raiva (RabG)+domínio trans-membrana e cauda citoplasmática H5 A/Indonesia/5/2005 (TM+CT)- NOS no sistema de amplificação de BeYDV + replicase (Construto número 1094; Figura 8L, 8M)
[00152] Uma sequência codificando ectodomínio da glicoproteína G da Raiva (Rab G) fusionado aos domínios transmembrana e citosólico de H5 A/Indonesia/5/2005 foi clonada no sistema de expressão 2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS no sistema de expressão BeYDV+repli- case em um plasmídeo contendo cassete de expressão de Plastocia- nina-P19-Plastocianina como segue usando o método de ligação baseado em PCR apresentado por Darveau e outros (Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995)). Em uma primeira rodada de PCR, um fragmento contendo ectodomínio de Rab G sem o peptídeo sinal nativo, domínios transmembrana e citoplasmáticos foi amplificado usando iniciadores IF-RabG-S2+4.c (Figura 8B, SEQ ID NO:32) e RabG+H5dTm.r (Figura 8C, SEQ ID NO:33) usando gene de Rab G sintetizado (correspondendo a nt3317-4891 de número de acesso GenBank EF206707) (Figura 8D, SEQ ID NO:34) como molde. Um segundo fragmento contendo os domínios transmembrana e citoplasmático de H5 A/Indonesia/ 5/2005 foi amplificado usando iniciadores IF-H5dTm.c (Figura 8E, SEQ ID NO:35) e IF-H5dTm.r (Figura 3C, SEQ ID NO:15), usando construto número 972 (vide Figura 94, SEQ ID NO:134 do WO 2010/003225, que é aqui incorporado a título de referência, para a sequência de construto número 972) como molde. Os produtos de PCR de ambas as amplificações foram então misturados e usados como molde para uma segunda rodada de amplificação usando IF-RabG-S2+4.c (Figura 8B, SEQ ID NO:32) e IF-H5dTm.r (Figura 3C, SEQ ID NO:15) como iniciadores. O fragmento resultante foi clonado em estrutura com peptídeo sinal de PDI de alfafa em cassete de expressão 2X35S-CPMV HT- NOS em sistema de amplificação de BeYDV+replicase usando sistema de clonagem Em Fusão da Clontech (Mountain View, CA). O construto 144 foi digerido com enzimas de restrição Sbfl e Stul e usado para a reação de montagem Em Fusão. O construto número 141 é um plas- mídeo aceitador pretendido para clonagem "Em Fusão" de genes de interesse em um cassete de expressão baseado em CPMV HT no sistema de amplificação de BeYDV. Ele também incorpora um construto de gene para a co-expressão do supressor de silenciamento de P19 de TBSV sob promotor e terminador do gene da Plastocianina da alfafa. O vetor é um plasmídeo baseado em pCAMBIA e a sequência das bordas de t-DNA da esquerda para a direita é apresentada na Figura 8F (SEQ ID NO:39). Uma representação esquemática do vetor 144 é apresentada na Figura 8K. O construto resultante recebeu o número 1094 (Figura 8L, SEQ ID NO:40). A sequência de aminoácido de PDISP - Rab G - A/Indonesia/5/2005 H5 TM+CT é apresentada na Figura 81 (SEQ ID NO:38). A representação do plasmídeo 1094 é apresentada na Figura 8M. Este construto não codifica uma proteína M1.
Exemplo 5: Expressão de proteínas da Raiva quiméricas em plantas
[00153] Proteína G foi expressa em fusão com Ps de PDI (construto 1071). O construto 1074 é uma fusão de proteína G da raiva com Ps de PDI e domínios TM+CT H5A/Indo. O construto 1094 é uma fusão de proteína G da raiva com BeYDV + rep, Ps de PDI e domínios TM/CT H5A/Indo. O construto 109 é uma fusão de proteína G da raiva com Ps de PDI e BeYDV + rep.
[00154] Plantas de Nicotiana benthamiana foram cultivadas a partir de sementes em planícies cheias com um substrato de turfa comercial. As plantas foram deixadas crescer na estufa sob um fotoperíodo de 16/8 e um regime de temperatura de 25°C dia/20°C noite. Três semanas após a semeadura, mudas individuais foram pegas, transplantadas em vasos e deixadas crescer na estufa por mais três semanas sob as mesmas condições ambientais.
[00155] Agrobacteria transfectadas com cada construto (construtos 1071, 1071, 1074, 1091 e 1094) foram cultivadas em um meio YEB suplementado com ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES) 10 mM, 20 μM de acetosiringona, 50 μg/ml de canamicina e 25 μg/ml de carbenicilina pH 5,6 até que atingissem um OD600 entre 0,6 e 1,6. Sus-pensões de Agrobacterium foram centrifugadas antes do uso e res- suspensas em meio de filtragem (MgCh 10 mM e MES 10 mM, pH 5,6) e armazenadas da noite para o dia a 4°C. No dia da infiltração, bateladas de cultura foram diluídas em 2,5 volumes de cultura e deixadas aquecer antes do uso. Plantas inteiras de N. benthamiana foram postas viradas para cima na suspensão bacteriana em um tanque de aço inoxidável hermético sob um vácuo de 20-40 Torr por 2 min. As plantas foram retornadas para a estufa por um período de incubação de 26 dias até a colheita. A menos que de outro modo especificado, todas as infiltrações foram realizadas como co-infiltração com linhagem AGL1/172 em uma razão 1:1.
[00156] Seguindo a incubação, a parte aérea das plantas foi colhida, congelada a -80°C e triturada em pedaços. Proteínas solúveis totais foram extraídas através de homogeneização (Polytron) de cada amostra de material de planta congelado-triturado em 3 volumes de Tris 50 mM pH 8,0 frio, NaCl 0,15 M, Triton X-100 0,1% e fluoreto de fenilmetanossulfonila 1M. Após homogeneização, as pastas fluidas foram centrifugadas a 10.000 g por 10 minutos a 4°C e esses extratos brutos purificados (sobrenadante) mantidos para análises.
[00157] O teor de proteína total de extratos brutos purificados foi determinado através do ensaio Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) usando albumina de soro bovino como o padrão de referência. As proteínas foram separadas através de SDS-PAGE e eletrotransferidas para membranas de bifluoreto de polivinilideno (PVDF) (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) para imunodetecção. Antes do immunoblotting, as membranas foram bloqueadas com leite desnatado 5% e Tween-20 0,1% em solução salina tamponada com Tris (TBS-T) por 16-18 h a 4°C.
[00158] Immunoblotting foi realizado através de incubação com 0,5 ug/ul de anticorpo primário Santa Cruz SE-57995 em leite desnatado 2% em TBS-Tween 20 0,1%. Detecção de quimioluminescência foi re alizada após incubação com anticorpo de cabra anti-camundongo con-jugado à peroxidase, JIR, anticorpo secundário 115-035-146 diluído 1:10.000 em leite desnatado 2% em TBS-Tween 20 0,1%. Complexos imunorreativos foram detectados através de quimioluminescência usando luminol como o substrato (Roche Diagnostics Corporation).
[00159] Conforme mostrado na Figura 8N, a proteína G da raiva foi expressa em fusão com Ps de PDI (construto 1071), BeYD + rep (construtos 1094 ou 1091), domínios TM+CT H5A/Indo (construto 1074) ou uma combinação dos mesmos.
Exemplo 6: Montagem de proteína G da Raiva quimérica em partículas tipo vírus
[00160] A capacidade da proteína G da raiva quimérica em montar em VLP em planta em ausência de proteína de matriz foi também examinada. Extratos de proteína de plantas transformadas usando construto 1074 ou construto 1094 foram purificados e submetidos à cromatografia de filtragem em gel seguido por análise de frações de eluição quanto ao teor de G da raiva usando anticorpos primários Santa Cruz SE-57995. O Western blot apresentado na Figura 80 mostra que em extratos de plantas infiltradas, o teor de G da raiva quimérica em frações de eluição atinge o pico nas frações 8 a 14 para proteína produzida usando construto 1074, e frações com a maioria da proteína eluindo nas frações 8 a 12 para extratos de proteína preparados usando o construto 1094, indicando sua montagem em estruturas de peso molecular muito alto de mais de 2 milhões de daltons. Esses resultados mostram que G da raiva monta estruturas de peso molecular alto de tamanho além daquele do peso molecular esperado do homotríme- ro.
[00161] A Figura 9A mostra análise immunoblot da proteína G da raiva purificada expressa a partir do construto 1074. A Figura 9B mostra uma foto de microscopia eletrônica de transmissão da VLP de pro teína G da raiva purificada derivada da expressão do construto 1074 mostrando morfologia de VLP.
[00162] Desta maneira, G da raiva acumulou em níveis altos em plantas agroinfiltradas e montou partículas tipo vírus na ausência de matriz de núcleo ou proteína de matriz. Esses resultados também demonstram que a fusão de domínios TMCT de HA de influenza a antí- geno não influenza, tal como proteína G da raiva, é suficiente para montar e liberar VLPs apresentando o antígeno não influenza.
Exemplo 7: Montagem de cassetes de expressão com SARS B-2X35S-CPMV HT-Glicoproteína S do Vírus da Síndrome Respiratória Aguda Severa (SARS gS)+domínio transmembrana e cauda cito- plasmática H5 A/lndonesia/5/2005 (TM+CT)-NOS (Construto número 916; Figuras 12A, 12F)
[00163] Uma sequência codificando ectodomínio da glicoproteína S de SARS (gS de SARS) fusionado aos domínios transmembrana e ci- tosólico de H5 A/lndonesia/5/2005 foi clonada em sistema de expressão 2X35S-CPMV-HT como segue usando o método de ligação baseado em PCR apresentado por Darveau e outros (Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995)). Em uma primeira rodada de PCR, um fragmento contendo ectodomínio de gS de SARS sem domínios trans- membrana e citoplasmático nativos foi amplificado usando iniciadores IF-wtSp-SARSgS.c (Figura 12B, SEQ lD NO:26) e lF- H5dTm+SARSgS.r (Figura 12C, SEQ ID NO:27), usando gene de gS de SARS sintetizado (correspondendo a nt21492-25259 de número de acesso GenBank AY278741.1; Figura 12D, SEQ ID NO:28) como molde. Um segundo fragmento contendo os domínios transmembrana e citoplasmático de H5 A/lndonesia/5/2005 foi amplificado usando iniciadores SARSgS+H5dTm.c (Figura 12E, SEQ ID NO:29) e IF-H5dTm.r (Figura 3C, SEQ ID NO: 15), usando construto número 972 (vide Figura 94, SEQ ID NO: 134 do WO 2010/003225, que é aqui incorporado a título de referência, para a sequência de construto número 972) como molde. Os produtos de PCR de ambas as amplificações foram então misturados e usados como molde para uma segunda rodada de ampli-ficação usando IF-wtSp-SARSgS.c (Figura 12B, SEQ ID NO:26) e IF- H5dTm.r (Figura 3C, SEQ ID NO: 15) como iniciadores. O produto da segunda PCR foi então digerido com ApaI e Stul e clonado em cons- truto número 995 (Figura 1F, SEQ ID NO:6) digerido com enzimas de restrição ApaI e Stul. O construto resultante recebeu o número 916 (Figura 12F, SEQ ID NO:3O). A sequência de aminoácido de gS de- SARS - A/Indonesia/5/2OO5H5 TM+CT 4 apresentada na Figura 12G (SEQ ID NO:31). A representação do plasmídeo 916 é apresentada na Figura 12A. Este construto não codifica uma proteína M1.
Exemplo 8: Experimentos de expressão com SARS quimérico com e sem produção de fatores de aumento em planta
[00164] Proteínas de SARS foram expressas usando construto 916 compreendendo gene de gS de SARS com peptídeo sinal do tipo sel-vagem e domínios transmembrana e cauda citosólicos H5A/Indo.
[00165] Plantas de Nicotiana benthamiana foram cultivadas a partir de sementes em planícies cheias com um substrato de turfa comercial. As plantas foram deixadas crescer na estufa sob um fotoperíodo 16/8 e um regime de temperatura de 25°C dia/2O°C noite. Três semanas após a semeadura, mudas individuais foram pegas, transplantadas em vasos e deixadas crescer na estufa por mais três semanas sob as mesmas condições ambientais.
[00166] Agrobacteria transfectadas com cada construto (construto 916) foram cultivadas em um meio YEB suplementado com ácido 2-(N- morfolino)etanossulfônico (MES) 1O mM, acetosiringona 2O μm, 5O μg/ml de canamicina e 25 μg/ml de carbenicilina pH 5,6 até que elas atingiram um OD6OO entre O,6 e 1,6. Suspensões de Agrobacterium foram centrifugadas antes do uso e ressuspensas em meio de infiltração (MgCh 10 mM e MES 10 mM pH 5,6) e armazenadas da noite para o dia a 4°C. No dia da infiltração, bateladas de cultura foram diluídas em 2,5 volumes de cultura e deixadas aquecer antes do uso. Plantas inteiras de N. benthamiana foram postas viradas para cima na suspensão bacteriana em um tanque de aço inoxidável hermético sob um vácuo de 20-40 Torr por 2 min. As plantas foram retornadas para a estufa para um período de incubação de 2-6 dias até a colheita. A menos que de outra maneira especificado, todas as infiltrações foram realizadas como co-infiltração com linhagem AGL/172 em uma razão 1:1.
[00167] Seguindo a incubação, a parte aérea de plantas foi colhida, congelada a -80°C e triturada em pedaços. Proteínas solúveis totais foram extraídas através de homogeneização (Polytron) de cada amostra de material de planta congelado-triturado em 3 volumes de Tris 50 mM pH 8.0 frio, NaCl 0,15 M, Triton X-100 0,1% e fluoreto de fenilme- tanossulfonila 1M. Após homogeneização, as pastas fluidas foram cen-trifugadas a 10.000 g por 10 minutos a 4°C e esses extratos brutos pu-rificados (sobrenadante) mantidos para análises.
[00168] O teor de proteína total de extratos brutos purificados foi determinado através do ensaio Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) usando albumina de soro bovino como o padrão de referência. As proteínas foram separadas através de SDS-PAGE e eletrotransferidas para membranas de bifluoreto de polivinilideno (PVDF) (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) para imunodetecção. Antes do immunoblotting, as membranas foram bloqueadas com leite desnatado 5% e Tween-20 0,1% em solução salina tamponada com Tris (TBS-T) por 16-18 h a 4°C.
[00169] Immunoblotting foi realizado através de incubação com 2 ug/ml de um anticorpo primário IMG-690 Imgenex em leite desnatado 2% em TBS-Tween 20 0,1%. Detecção de quimioluminescência foi realizada após incubação com IgG de camundongo anti-coelho conjugado à peroxidase, JIR, anticorpo secundário 115-035-144 diluído 1:10.000 em leite desnatado 2% em TBS-Tween 20 0,1%. Complexos imunor- reativos foram detectados através de quimioluminescência usando luminol como o substrato (Roche Diagnostics Corporation).
[00170] A Figura 12H mostra análise Immunoblot de expressão de proteína S do vírus da síndrome respiratória aguda severa (SARS) em tabaco. Expressão de construto 916 (gene de gS de SARS com peptí- deo sinal do tipo selvagem e domínios transmembrana e de cauda ci- tosólica H5A/Indo) é observada.
Exemplo 9: Montagem de cassetes de expressão com proteína de VZV A-2X35S-CPMV HT-Glicoproteína E do vírus Varicella Zoster (VZV gE)+domínio transmembrana e cauda citoplasmática (TM+CT) de H5 A/Indonesia/5/2005 -NOS (Construto número 946)
[00171] Uma sequência codificando ectodomínio de glicoproteína E de VZV (gE de VZV) fusionado aos domínios transmembrana e citosó- lico de H5 A/Indonesia/5/2005 foi clonada em sistema de expressão 2X35S-CPMV-HT como segue usando o método de ligação baseado em PCR apresentado por Darveau e outros (Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995)). Em uma primeira rodada de PCR, um fragmento contendo ectodomínio de gE de VZV sem os domínios transmembrana e citoplasmático nativos foi amplificado usando iniciadores IF-wtSp- VZVgE.c (Figura 10A, SEQ ID NO:20) e IF-H5dTm+VZVgE.r (Figura 10B, SEQ ID NO:21), usando gene de gE de VZV sintetizado (correspondendo a nt3477-5348 de número de acesso GenBank AY013752.1; Figura 10C, SEQ ID NO:22) como molde. Um segundo fragmento contendo os domínios transmembrana e citoplasmático de H5 A/Indo- nesia/5/2005 foi amplificado usando iniciadores VZVgE+H5dTm.c (Figura 10D, SEQ ID NO:23) e IF-H5dTm.r (Figura 3C, SEQ ID NO: 15), usando construto número 972 (vide Figura 94, SEQ ID NO: 134 do WO 2010/003225, que é aqui incorporado a título de referência, para a se-quência do construto número 972) como molde. Os produtos de PCR de ambas as amplificações foram então misturados e usados como molde para uma segunda rodada de amplificação usando IF-wtSp- VZVgE.c (Figura 10A, SEQ ID NO:20) e IF-H5dTm.r (Figura 3C, SEQ ID NO: 15) como iniciadores. O produto da segunda PCR foi então digerido com ApaI e Stul e clonado no construto número 995 (Figura 1F, SEQ ID NO:6) digerido com enzimas de restrição ApaI e Stul. O construto resultante recebeu o número 946 (Figura A5, SEQ ID NO:A5). A sequência de aminoácido de VZV gE - A/Indonesia/5/2005 H5 TM+CT é apresentada na Figura 10F (SEQ ID NO:25). A representação do plasmídeo 946 é apresentada na Figura 10G. Este construto não codifica uma proteína M1.
Exemplo 10: Expressão de proteínas de VZV quiméricas em plantas
[00172] Expressão da proteína E do Vírus Varicella Zoster (VZV) foi demonstrada usando construto 946 compreendendo gene de gE de VZV com peptídeo sinal do tipo selvagem e domínio TM+CT H5A/Indo.
[00173] Plantas de Nicotiana benthamiana foram cultivadas a partir de sementes em planícies cheias com um substrato de turfa comercial. As plantas foram deixadas crescer na estufa sob um fotoperíodo 16/8 e um regime de temperatura de 25°C dia/20°C noite. Três semanas após a semeadura, mudas individuais foram pegas, transplantadas em vasos e deixadas crescer na estufa por mais três semanas sob as mesmas condições ambientais.
[00174] Agrobacteria transfectadas com cada construto (construto 946) foram cultivadas em um meio YEB suplementado com ácido 2-(N- morfolino)etanossulfônico (MES) 10 mM, acetosiringona 20 μm, 50 μg/ml de canamicina e 25 μg/ml de carbenicilina pH 5,6 até que elas atingiram um OD600 entre 0,6 e 1,6. Suspensões de Agrobacterium foram centrifugadas antes do uso e ressuspensas em meio de infiltração (MgCh 10 mM e MES 10 mM pH 5,6) e armazenadas da noite para o dia a 4°C. No dia da infiltração, bateladas de cultura foram diluídas em 2,5 volumes de cultura e deixadas aquecer antes do uso. Plantas inteiras de N. benthamiana foram postas viradas para cima na suspensão bacteriana em um tanque de aço inoxidável hermético sob um vácuo de 20-40 Torr por 2 min. As plantas foram retornadas para a estufa para um período de incubação de 2-6 dias até a colheita. A menos que de outra maneira especificado, todas as infiltrações foram realizadas como co-infiltração com linhagem AGL/172 em uma razão 1:1.
[00175] Seguindo a incubação, a parte aérea de plantas foi colhida, congelada a -80°C e triturada em pedaços. Proteínas solúveis totais foram extraídas através de homogeneização (Polytron) de cada amostra de material de planta congelado-triturado em 3 volumes de Tris 50 mM pH 8,0 frio, NaCl 0,15 M, Triton X-100 0,1% e fluoreto de fenilme- tanossulfonila 1M. Após homogeneização, as pastas fluidas foram cen-trifugadas a 10.000 g por 10 minutos a 4°C e esses extratos brutos pu-rificados (sobrenadante) mantidos para análises.
[00176] O teor de proteína total de extratos brutos purificados foi determinado através do ensaio Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) usando albumina de soro bovino como o padrão de referência. As proteínas foram separadas através de SDS-PAGE e eletrotransferidas para membranas de bifluoreto de polivinilideno (PVDF) (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) para imunodetecção. Antes do immunoblotting, as membranas foram bloqueadas com leite desnatado 5% e Tween-20 0,1% em solução salina tamponada com Tris (TBS-T) por 16-18 h a 4°C.
[00177] Immunoblotting foi realizado através de incubação com 1 ug/ul de mAb de camundongo antiproteína gE de VZV (abcam, ab52549) como anticorpo primário em leite desnatado 2% em TBS- Tween 20 0,1%. Detecção de quimioluminescência foi realizada após incubação com anticorpo de cabra anticamundongo conjugado à pero-xidase, JIR, 115-035-146 como anticorpo secundário diluído 1:10.000 em leite desnatado 2% em TBS-Tween 20 0,1%. Complexos imunor- reativos foram detectados através de quimioluminescência usando luminol como o substrato (Roche Diagnostics Corporation).
[00178] A Figura 11 A mostra análise Immunoblot de expressão de proteína E do Vírus Varicella Zoster (VZV) nas Raias 7-9 do construto 946 (20, 10 e 2 μg de extrato, respectivamente). Raias 1 a 5, controles positivos - gE de VZV recombinante, 500, 100, 50, 10 e 5 ng, respecti-vamente; Raia 6 controle negativo.
[00179] A capacidade de proteína E de VZV quimérica em montar VLP em planta na ausência de proteína de núcleo ou matriz foi também examinada. Extratos de proteína de plantas transformadas usando construto 946 foram purificados e submetidos à cromatografia de filtragem em gel seguido por análise de frações de eluição para quanto à proteína E de VZV usando anticorpo primário mAb de camundongo antiproteína gE de VZV (abcam, ab52549). O Western blot apresentado na Figura 11B mostra que em extratos de plantas infiltradas, frações de eluição de proteína E de VZV atingem o pico nas frações 10 a 13, indicando montagem de proteína VZV E em estruturas de peso molecular muito alto de mais de 2 milhões de daltons. Esses resultados mostram que proteína E de VZV monta estruturas de peso molecular alto de tamanho além daquele do peso molecular esperado do homotrímero.
[00180] Desta maneira, proteína E de VZV acumulou em níveis altos em plantas agroinfiltradas e montou partículas do tipo vírus na ausência de proteína de núcleo ou matriz. Esses resultados também demonstram que a fusão dos domínios TM/CT de HA de influenza a antí- geno não influenza, tal como proteína E de VZV, é suficiente para montar e liberar VLPs apresentando o antígeno não influenza.
Exemplo 11: Montagem de cassete de expressão com glicoproteína (GP) do vírus Ebola guimérica A-2X35S-CPMV HT-PDISP-GP de Ebolavirus Zaire (EboGP)+domínio transmembrana e cauda citoplasmática de H5 A/lndonesia/5/2005 (TM+CT)-NOS (Construto número 1366)
[00181] Uma seguência codificando o ectodomínio de glicoproteína (GP) do vírus Ebola da linhagem Zaire 1995 fusionado aos domínios transmembrana e citosólico de H5 A/lndonesia/5/2005 foi clonada em sistema de expressão 2X35S-CPMV HT-PDISP-NOS em um plasmí- deo contendo cassete de expressão de Plastocianina-P19-Plastocia- nina como segue usando o método de ligação baseado em PCR apresentado por Darveau e outros (Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995)). O gene de GP de Ebola foi otimizado para uso de códon e para teor de GC da seguência de gene do tipo selvagem (correspondendo a nt 6039-8069 de número de acesso GenBank AY354458). Sítios de união crípticos, seguências Shine-Delgarno, seguências de deses- tabilização de RNA e sítios de entrada de ribossomo procariótico foram então removidos da seguência otimizada para evitar estrutura ou se- guência indesejada. Em uma primeira rodada de PCR, um fragmento do gene de GP otimizado contendo a seguência codificando o ecto- domínio (sem o peptídeo sinal e os domínios transmembrana e cito- plasmático) foi amplificado usando iniciadores IF-Opt_EboGP.s2+4c (Figura 13A, SEQ ID NO: 43) e H5iTMCT+Opt_EboGP.r (Figura 13B, SEQ ID NO: 44), com o gene de GP sintetizado (Figura 13C, SEQ ID NO:45) como molde. Um segundo fragmento contendo os domínios transmembrana e citoplasmático de H5 de Influenza A/Indonesia/5/ 2005 foi amplificado usando os iniciadores Opt_EboGP+H5iTMCT.c (Figura 13D, SEQ ID NO: 46) e IF-H5dTm.r (Figura 3C, SEQ ID NO: 15), usando o construto número 972 (vide Figura 94, SEQ ID NO: 134 do WO 2010/003225, gue é agui incorporado a título de referência, pa- ra a sequência do construto número 972) como molde. Os produtos de PCR de ambas as amplificações foram então misturados e usados como molde para uma segunda rodada de amplificação usando IF- Opt_EboGP.s2+4c (Figura 13A, SEQ ID NO: 43) e IF-H5dTm.r (Figura 3C, SEQ ID NO: 15) como iniciadores. O produto de PCR resultante foi clonado em estrutura com peptídeo sinal de PDI de alfafa em sistema de expressão 2X35S-CPMV HT-NOS usando sistema de clonagem Em Fusão da Clontech (Mountain View, CA). O construto 1192 (Figura 13E) foi digerido com enzimas de restrição Sacll e Stul e usado para a reação de montagem Em Fusão. O construto número 1192 é um plasmídeo aceitador pretendido para clonagem "Em Fusão" de genes de interesse em estrutura com um peptídeo sinal de PDI de alfafa em um cassete de expressão baseado em CPMV HT. Ele também incorpora um construto de gene para a co-expressão do supressor de si- lenciamento de P19 de TBSV sob promotor e terminador do gene de Plastocianina da alfafa. O vetor é um plasmídeo baseado em pCAM- BIA e a sequência das bordas de DNA da esquerda para a direita é apresentada na Figura 13F (SEQ ID NO:47). O construto resultante recebeu o número 1366 (Figura 13G, SEQ ID NO:48). A sequência de aminoácido de PDISP-GP de Ebolavirus Zaire 95-H5 TM+CT de A/Indonesia/5/2005 é apresentada na Figura 13H (SEQ ID NO:49). A representação do plasmídeo 1366 é apresentada na Figura 13I.
Exemplo 12. Expressão de GP do vírus Ebola quimérica em plantas
[00182] Expressão da glicoproteína (GP) do vírus Ebola (EV) foi demonstrada usando o construto 1366, compreendendo gene de GP de EV com peptídeo sinal do tipo selvagem e domínios TM+CT de H5A/Indo.
[00183] Plantas de Nicotiana benthamiana foram cultivadas a partir de sementes em planícies cheias com um substrato de turfa comercial. As plantas foram deixadas crescer na estufa sob um fotoperíodo 16/8 e um regime de temperatura de 25°C dia/20°C noite. Três semanas após a semeadura, mudas individuais foram pegas, transplantadas em vasos e deixadas crescer na estufa por mais três semanas sob as mesmas condições ambientais.
[00184] Agrobacteria transfectadas com cada construto (construto 946) foram cultivadas em um meio YEB suplementado com ácido 2-(N- morfolino)etanossulfônico (MES) 10 mM, acetosiringona 20 μm, 50 μg/ml de canamicina e 25 μg/ml de carbenicilina pH 5,6 até que elas atingiram um OD600 entre 0,6 e 1,6. Suspensões de Agrobacterium foram centrifugadas antes do uso e ressuspensas em meio de infiltração (MgCl2 10 mM e MES 10 mM pH 5,6) e armazenadas da noite para o dia a 4°C. No dia da infiltração, bateladas de cultura foram diluídas em 2,5 volumes de cultura e deixadas aquecer antes do uso. Plantas inteiras de N. benthamiana foram postas viradas para cima na suspensão bacteriana em um tanque de aço inoxidável hermético sob um vácuo de 20-40 Torr por 2 min. As plantas foram retornadas para a estufa para um período de incubação de 2-6 dias até a colheita.
[00185] Seguindo a incubação, a parte aérea de plantas foi colhida, congelada a -80°C e triturada em pedaços. Proteínas solúveis totais foram extraídas através de homogeneização (Polytron) de cada amostra de material de planta congelado-triturado em 3 volumes de Tris 50 mM pH 8.0 frio, NaCl 0,15 M, Triton X-100 0,1% e fluoreto de fenilme- tanossulfonila 1M. Após homogeneização, as pastas fluidas foram cen-trifugadas a 10.000 g por 10 minutos a 4°C e esses extratos brutos pu-rificados (sobrenadante) mantidos para análises.
[00186] O teor de proteína total de extratos brutos purificados foi determinado através do ensaio Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) usando albumina de soro bovino como o padrão de referência. As proteínas foram separadas através de SDS-PAGE e eletrotransferidas para membranas de bifluoreto de polivinilideno (PVDF) (Roche Diag- nostics Corporation, Indianapolis, IN) para imunodetecção. Antes do immunoblotting, as membranas foram bloqueadas com leite desnatado 5% e Tween-20 0,1% em solução salina tamponada com Tris (TBS-T) por 16-18 h a 4OC.
[00187] Immunoblotting foi realizado através de incubação com 150 ng/ml de anti-GP de Ebola Zaire de coelho purificado por afinidade (IBT Services, 0301-012) como anticorpo primário em leite desnatado 2% em TBS-Tween 20 0,1%. Detecção de quimioluminescência foi realizada após incubação com anticorpos secundários de cabra anticoelho conjugados à peroxidase (JIR 11-035-144), diluídos 1:7500 em leite desnatado 2% em TBS-Tween 20 0,1%. Complexos imunorreati- vos foram detectados através de quimioluminescência usando luminol como o substrato (Roche Diagnostics Corporation). A Figura 13J mostra análise Immunoblot de expressão de GP do vírus Ebola quimérica em extratos de proteína de plantas transformadas com construto número 1366. O resultado obtido mostra que GP de Ebola quimérica é transientemente expressa.
[00188] Todas as citações são aqui incorporadas a título de referência.
[00189] A presente invenção foi descrita com relação a uma ou mais modalidades. No entanto, será aparente aos versados na técnica que muitas variações e modificações podem ser feitas sem se afastar do escopo da invenção conforme definido nas reivindicações.

Claims (9)

1. Método de produção de uma partícula tipo vírus (VLP) em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende: a) expressão de uma proteína de superfície viral quimérica compreendendo, em série, um ectodomínio de uma proteína de superfície trimérica do vírus, fusionado a um domínio transmembrana de influenza e domínio de cauda citoplástica (TM/CT), na planta, ou porção da planta, em que o TM/CT é de uma hemaglutinina de influenza e a proteína de superfície trimérica do vírus é derivado de uma proteína env do vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) ou uma proteína G de víbus da raiva, e b) incubação da planta ou porção da planta sob condições que permitam a expressão da proteína de superfície viral quimérica, desta maneira produzindo a VLP, a VLP compreendendo proteínas virais, em que as proteínas virais consistem em proteínas de superfície quiméricas virais, em que a VLP não contém uma matriz viral ou uma proteína central.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de: c) coleta da planta e purificação da VLP.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa de expressão (etapa a), um ou mais de uma proteína adicional é expressa, a proteína selecionada dentre o grupo de uma ou mais de uma proteína chaperona, proteína de canal de próton, inibidor de protease, ou uma combinação dos mesmos.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa de expressão (etapa a), o domínio trans- membrana de influenza e o domínio de cauda citoplasmática são um domínio transmembrana H5 e domínio de cauda citoplasmática, ou um domínio transmembrana H3 e um domínio de cauda citoplasmática.
5. VLP, caracterizada pelo fato de que é produzida através do método como definido na reivindicação 4.
6. VLP de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de vírus quimérica carregando N-glicanos específicos de planta ou N-glicanos modificados.
7. VLP de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais de um lipídeo derivado da planta.
8. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a VLP como definida na reivindicação 5 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio transmembrana de influenza e o domínio de cauda citoplasmática é obtido de H5 (A/lndonesia/05/2005) e consiste essencialmente na sequência de nucleotídeo definida na SEQ lD NO: 41 ou o domínio transmembrana de influenza e o domínio de cauda citoplasmática é obtido de H3 (A/Brisbane/10/2007) e consiste es-sencialmente na sequência definida na SEQ lD NO: 42.
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