CN113046392A

CN113046392A - 治疗β-球蛋白功能缺失的重组慢病毒载体及制备方法和应用

Info

Publication number: CN113046392A
Application number: CN201911379764.5A
Authority: CN
Inventors: 欧阳文杰; 刘超; 董国艺; 李静; 顾颖; 侯勇
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Hemu Gene Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2039-12-27
Also published as: CN113046392B

Abstract

本申请公开了一种治疗β‑球蛋白功能缺失的重组慢病毒载体及制备方法和应用。本申请的重组慢病毒载体，其基因元件由依序连接的左侧慢病毒长末端重复序列、慢病毒逆响应元件、中心多嘌呤序列、β‑球蛋白基因的基因座调控序列、第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β‑球蛋白基因和右侧慢病毒长末端重复序列组成。本申请的重组慢病毒载体，通过基因元件的优化和改进，提高了基因转导效率，且在造血干细胞向红系分化过程中可以高效表达β‑球蛋白基因，从而可以有效降低病毒使用量，在增加安全性的同时，降低治疗成本。本申请的重组慢病毒载体为β‑球蛋白功能缺失导致的β‑地中海贫血和镰刀型贫血提供了一种新的治疗工具和方案。

Description

治疗β-球蛋白功能缺失的重组慢病毒载体及制备方法和应用

技术领域

本申请涉及β-球蛋白功能缺失疾病治疗领域，特别是涉及一种治疗β-球蛋白功能缺失的重组慢病毒载体及制备方法和应用。

背景技术

β-球蛋白基因(HBB)突变会造成严重的遗传性疾病，包括基因功能缺失导致的β-地中海地贫和第六个氨基酸位点Glu突变至Val的基因点突变造成的镰刀型贫血症。HBB基因突变影响β-球蛋白的生产，造成红细胞中α-球蛋白和β-球蛋白不平衡，以及血红蛋白异常，进而导致红细胞生成障碍和溶血性贫血。

目前，输血依耐型重症β-地贫患者(TDT)的常规治疗是规律输血和充分祛铁治疗。一位地贫患者按50岁寿命计算，其终身输血和祛铁治疗的费用约为480万元，是绝大多数家庭不可承受的沉重负担。长期大量的输血量，对地方血库也造成相当大的压力。许多患者由于无法做到规律输血和祛铁治疗，导致发育不良，脾肿大等并发症；而输血引起的铁超负载又会对心脏和其他器官造成损伤，严重时危及生命。使用增加γ球蛋白表达或减少α球蛋白表达的小分子化学药物，可能改善β-地贫的症状。此类药物包括羟基脲、5-氮杂胞苷、阿糖胞苷、马利兰和异烟肼等，相关临床研究正在进行中，尚未有获批上市的药物。临床上可以治愈地贫的方法是异体造血干细胞移植(allo-HSCT)，可分为全相合和半相合移植。然而，若无直系的兄弟姐妹，全相合配型几率极低，只有万分之几的配型几率；而半相合移植中发生移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)的风险较高，对患者年龄限制严格，一般不能大于6岁。由于上述原因，allo-HSCT在地中海贫血治疗中不能被广泛应用。

基因治疗，是通过收集患者自体造血干细胞，利用慢病毒转染将功能β-球蛋白重新导入细胞，再将改造后的自体造血干细胞回输患者。基因治疗技术不存在HLA配型的限制，同时极大降低了移植造成的抗宿主病风险，并且可以像骨髓移植一样实现一次治疗，终身治愈的效果，为患者带来了新的希望。

在针对β-球蛋白功能缺失的疾病，如β-地贫和镰刀型贫血等，的基因治疗中，携带目的基因的慢病毒载体起到关键的作用，开发一种可以高效和特异表达β-球蛋白的慢病毒载体显得尤其重要。

目前，已开发并被报道应用于临床的两个慢病毒载体分别是BB305和GLOBE。BB305表达携带T87Q突变的β-球蛋白，可以在地贫和镰刀贫血症中应用，但其制造成本高昂；GLOBE携带的是野生型β-球蛋白，可应用于地贫治疗，但理论上无法有效治疗镰刀贫血症。这两种慢病毒载体的序列都未公开。并且，BB305病毒可能由于病毒构造原因，生产工艺复杂、成本高，最终产品售价高达180万美元。另外，据报道，BB305和GLOBE病毒转染造血干细胞的效率在30％左右，VCN在1左右，还有进一步提升的空间。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的治疗β-球蛋白功能缺失的重组慢病毒载体及制备方法和应用。

本申请具体采用了以下技术方案：

本申请的第一方面公开了一种治疗β-球蛋白功能缺失的重组慢病毒载体，该重组慢病毒载体包括基因元件，该基因元件由依序连接的左侧慢病毒长末端重复序列(5’LTR)、慢病毒逆响应元件(RRE)、中心多嘌呤序列(cPPT)、β-球蛋白基因的基因座调控序列(HBBLCR)、第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因(HBB^T87Q)和右侧慢病毒长末端重复序列(3’LTR)组成。

需要说明的是，本申请的重组慢病毒载体采用新设计的β-球蛋白基因的基因座调控序列，以及第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因，在导入造血干细胞后，可以在干细胞向红细胞分化过程中高效表达β-球蛋白基因，达到治疗因β-球蛋白功能缺失导致的β-地中海贫血和镰刀型贫血症的目的。

优选的，本申请的重组慢病毒载体中，左侧慢病毒长末端重复序列依序的U3区域被替换为异源的强启动子。

优选的，异源的强启动子为巨细胞病毒启动子(CMVpromoter)。

需要说明的是，慢病毒载体的左侧和右侧慢病毒长末端重复序列依序均由U3区域、R区域和U5区域组成；本申请将左侧慢病毒长末端重复序列依序的U3区域替换为异源的强启动子，可以提高病毒基因组序列的转录和包装效率。其中，具体的异源的强启动子可以根据需求而定，一般为巨细胞病毒启动子。

优选的，本申请的重组慢病毒载体中，右侧慢病毒长末端重复序列的U3区被修饰和替换为SV40多聚腺苷酸型号。

需要说明的是，在提高转录效率的同时，由于3’LTR U3区域在病毒复制中是作为5’LTRU3区域复制的模板，该区域的缺失会导致整合到宿主基因组的病毒序列无法通过自我复制包装出子代病毒，从而可以提高病毒载体的安全性。可以理解，修饰和替换为SV40多聚腺苷酸型号只是一种比较常规的操作方式，不排除还可以采用其它方式缺失或失活3’LTR U3区域。

优选的，本申请的重组慢病毒载体中，左侧慢病毒长末端重复序列为SEQ ID NO.1所示序列；慢病毒逆响应元件为SEQ ID NO.2所示序列；中心多嘌呤序列为SEQ ID NO.3所示序列；β-球蛋白基因的基因座调控序列为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示序列；第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因为SEQ ID NO.4所示序列；右侧慢病毒长末端重复序列为SEQ ID NO.5所示序列。

优选的，β-球蛋白基因的基因座调控序列为SEQ ID NO.7所示序列。

优选的，本申请的重组慢病毒载体采用的慢病毒骨架载体为pLenti载体。

本申请的第二方面公开了一种慢病毒，该慢病毒中含有本申请的重组慢病毒载体。

本申请的第三方面公开了本申请的重组慢病毒载体或本申请的慢病毒在制备治疗β-球蛋白功能缺失的疾病的药物中的应用。

需要说明的是，本申请的重组慢病毒载体以及包装本申请重组慢病毒载体的慢病毒能够治疗β-球蛋白功能缺失导致的疾病，因此，可以用于制备相应的药物。

本申请的第四方面公开了本申请的重组慢病毒载体的制备方法，包括以下步骤：

采用慢病毒骨架载体上的多克隆位点中的一对限制性内切酶，将慢病毒骨架载体线性化；

采用根据线性化的慢病毒骨架载体设计的Gibson组装引物分别扩增β-球蛋白基因的基因座调控序列和第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因；

采用Gibson组装法将扩增的β-球蛋白基因的基因座调控序列和第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因组装到慢病毒骨架载体，获得本申请的重组慢病毒载体。

优选的，本申请的制备方法中，所采用的一对限制性内切酶为EcoRV和BamHI。

优选的，本申请的制备方法中，所采用的Gibson组装引物包括LCR片段Gibson组装引物对、HBB编码区片段1Gibson组装引物对、HBB编码区片段2Gibson组装引物对；LCR片段Gibson组装引物对的正向引物为SEQ ID NO.12所示序列，反向引物为SEQ ID NO.13所示序列；HBB编码区片段1Gibson组装引物对的正向引物为SEQ ID NO.14所示序列，反向引物为SEQ ID NO.15所示序列；HBB编码区片段2Gibson组装引物对的正向引物为SEQ ID NO.16所示序列，反向引物为SEQ ID NO.17所示序列。

需要说明的是，本申请的制备方法，其关键在于采用Gibson组装法进行重组慢病毒载体的重组；其中，EcoRV和BamHI限制性内切酶只是本申请的一种实现方式中具体采用的两个限制性内切酶，不排除还可以采用其它限制性内切酶组合；Gibson组装引物是根据Gibson组装法原理设计的，能够扩增靶标序列的引物，可以理解，在本申请Gibson组装引物的基础上还可以在其5’端或3’端增加或减少若干碱基，只要不影响其对靶标序列的扩增和Gibson组装即可。

本申请的第五方面公开了一种用于制备治疗β-球蛋白功能缺失的重组慢病毒载体的试剂盒，该试剂盒中包含Gibson组装引物，Gibson组装引物包括LCR片段Gibson组装引物对、HBB编码区片段1Gibson组装引物对、HBB编码区片段2Gibson组装引物对；LCR片段Gibson组装引物对的正向引物为SEQ ID NO.12所示序列，反向引物为SEQ ID NO.13所示序列；HBB编码区片段1Gibson组装引物对的正向引物为SEQ ID NO.14所示序列，反向引物为SEQ ID NO.15所示序列；HBB编码区片段2Gibson组装引物对的正向引物为SEQ ID NO.16所示序列，反向引物为SEQ ID NO.17所示序列。

优选的，本申请的试剂盒中还包含pLenti载体。

优选的，本申请的试剂盒中还包含Gibson组装法相关试剂。

需要说明的是，本申请的试剂盒可以用于制备本申请的治疗β-球蛋白功能缺失的重组慢病毒载体，为了使用方便，本申请将其中关键的Gibson组装引物包含在试剂盒中，其它试剂包括pLenti载体和Gibson组装法相关试剂可以根据需求组合到本申请的试剂盒中，或者直接购买获得。

本申请的有益效果在于：

本申请治疗β-球蛋白功能缺失的重组慢病毒载体，通过对基因元件进行优化和改进，提高了基因转导效率，且在造血干细胞向红系分化过程中可以高效表达β-球蛋白基因，从而可以有效降低病毒使用量，在增加安全性的同时，降低治疗成本。本申请的重组慢病毒载体为β-球蛋白功能缺失导致的β-地中海贫血和镰刀型贫血提供了一种新的治疗工具和方案。

附图说明

图1是本申请实施例中重组慢病毒载体的基因元件组成结构示意图；

图2是本申请实施例中不同LCR片段与HBB编码区序列组合构建的结构示意图；

图3是本申请实施例中不同异种启动子的病毒包装滴度检测结果；

图4是本申请实施例中不同异种启动子的重组慢病毒载体感染-28S突变的K562细胞系的HBB基因的相对表达水平检测结果；

图5是本申请实施例中不同重组慢病毒载体感染造血干细胞后的HBB基因表达效率检测结果；

图6是本申请实施例中不同重组慢病毒载体感染造血干细胞后的CFU克隆中单位VCN表达的HBB基因T87Q突变型荧光定量比例检测结果；

图7是本申请实施例中重组慢病毒BGI103、重组慢病毒BGI106和重组慢病毒BGI107的HBB基因T87Q突变型荧光定量表达比例与VCN的相关性分析结果；

图8是本申请实施例中重组慢病毒载体BGI103、重组慢病毒载体BGI106和重组慢病毒载体BGI107在造血干细胞诱导红系分化第七天HBB基因T87Q突变型与野生型荧光定量相对表达水平以及VCN结果；

图9是本申请实施例中病人骨髓造血干转导重组慢病毒载体BGI103后在体外诱导红系分化第七天时HBB基因T87Q突变型与野生型荧光定量相对表达水平以及VCN结果；

图10是本申请实施例中病人骨髓造血干转导重组慢病毒载体BGI103后在体外诱导红系分化第十四天HPLC峰图；

图11是本申请实施例中造血干细胞转导重组慢病毒载体BGI103后在半固体培养基自发分化形成的克隆形态观察结果；

图12是本申请实施例中健康婴儿脐带血造血干细胞按照MOI 20分别转导101-107慢病毒载体后分化形成各克隆团的数量和所占比例检测结果。

具体实施方式

虽然目前已经有针对β-球蛋白功能缺失的疾病的基因治疗慢病毒载体BB305和GLOBE，但是，GLOBE无法有效治疗镰刀贫血症；并且，更为重要的是，BB305和GLOBE的序列都没有公开，BB305更是价格高昂。

为了研发一种表达更加高效、成本更低的治疗β-球蛋白功能缺失的重组慢病毒载体，本申请发明人对重组慢病毒载体的基因调控区、目的基因区以及病毒骨架上的功能区域等基因元件进行了大量组合、筛选和优化，验证不同组合和优化方案获得的重组慢病毒载体在造血干细胞中的表达效率和特异性，以及生产工艺的可重复性，最终获得本申请的治疗β-球蛋白功能缺失的重组慢病毒载体，即依序包括左侧慢病毒长末端重复序列(5’LTR)、慢病毒逆响应元件(RRE)、中心多嘌呤序列(cPPT)、β-球蛋白基因的基因座调控序列(HBB LCR)、第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因(HBB^T87Q)和右侧慢病毒长末端重复序列(3’LTR)等基因元件的重组慢病毒载体，本申请的一种实现方式中最优的重组慢病毒载体标记为pLentiBGI103。

本申请的重组慢病毒载体，能够在人造血干细胞中高效表达，该重组慢病毒载体生产的复制缺陷型慢病毒，可以用于β-地中海贫血和镰刀型贫血症的治疗。本申请的重组慢病毒载体基于第三代慢病毒载体，针对造血干细胞和红系前体细胞进行优化，携带外源的β-球蛋白和其调控区域，在导入造血干细胞后，可以在干细胞向红细胞分化过程中高效表达β-球蛋白基因，达到治疗β-地中海贫血和镰刀型贫血症的目的。

本申请使用的慢病毒载体为复制缺陷型，完全敲除病毒原有基因，本身不具有致病性，在辅助质粒协助下，生产的慢病毒可高效感染造血干细胞，并且以一种安全的方式将携带目的片段整合到造血干细胞的基因组中，并随着造血干细胞向红系分化过程中高效表达β-球蛋白基因。

本申请的重组慢病毒载体具有以下优点：

1)该重组慢病毒载体，使用新的设计和组合，可高效生产GMP病毒，降低病毒成本；

2)该重组慢病毒载体携带的β-球蛋白带有T87Q的位点改进，可用于镰刀贫血症的治疗；

3)该重组慢病毒载体生产的慢病毒，可在较低病毒转染复数(MOI)和较短孵育时间的条件下，对造血干细胞进行高效转染，并表达β-球蛋白；降低转染病毒使用量和缩短体外培养时间，有利于保证造血干细胞的活力和干性，提高基因治疗的安全性。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、试验方法

1.重组慢病毒载体构建

本例的重组慢病毒载体，如图1所示，主要由以下元件组成：左侧慢病毒长末端重复序列(5’LTR)，慢病毒逆响应元件(RRE)，中心多嘌呤序列(cPPT)，HBB基因座调控序列(LCR)，第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因序列(HBB^T87Q)，和右侧慢病毒长末端重复序列(3’LTR)。慢病毒的长末端重复序列(LTR)，可进一步分为U3、R和U5三个区域，本例所用到的病毒载体的左侧长末端重复序列(5’LTR)的U3区被替换为一个异源的强启动子，本例分别采用了巨细胞病毒启动子(CMVpromoter)和RSV启动子进行试验，提高病毒基因组序列的转录和包装效率。右侧慢病毒长末端重复序列(3’LTR)的U3区被进一步修饰和替换为SV40多聚腺苷酸型号(即SV40 polyA)，从而可以提高病毒载体的安全性。

本例采用的5’LTR为SEQ ID NO.1所示序列；RRE为SEQ ID NO.2所示序列；cPPT为SEQ ID NO.3所示序列；HBB^T87Q为SEQ ID NO.4所示序列；3’LTR为SEQ ID NO.5所示序列。

本例分别采用了SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11所示序列的LCR进行试验，对比分析不同LCR序列获得的重组慢病毒载体，从而筛选出最佳的β-球蛋白基因的基因座调控序列。

左侧慢病毒长末端重复序列SEQ ID NO.1：

5’-GGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA-3’

慢病毒逆响应元件SEQ ID NO.2：

5’-AGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCT-3’

中心多嘌呤序列SEQ ID NO.3：

5’-TTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAATTCAAAATTTT-3’

第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因序列SEQ ID NO.4：

5’-TACACTTGCAAAGGAGGATGTTTTTAGTAGCAATTTGTACTGATGGTATGGGGCCAAGAGATATATCTTAGAGGGAGGGCTGAGGGTTTGAAGTCCAACTCCTAAGCCAGTGCCAGAAGAGCCAAGGACAGGTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCATGTGGAGACAGAGAAGACTCTTGGGTTTCTGATAGGCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCCAGCTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACGCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGATAAGTAACAGGGTACAGTTTAGAATGGGAAACAGACGAATGATTGCATCAGTGTGGAAGTCTCAGGATCGTTTTAGTTTCTTTTATTTGCTGTTCATAACAATTGTTTTCTTTTGTTTAATTCTTGCTTTCTTTTTTTTTCTTCTCCGCAATTTTTACTATTATACTTAATGCCTTAACATTGTGTATAACAAAAGGAAATATCTCTGAGATACATTAAGTAACTTAAAAAAAAACTTTACACAGTCTGCCTAGTACATTACTATTTGGAATATATGTGTGCTTATTTGCATATTCATAATCTCCCTACTTTATTTTCTTTTATTTTTAATTGATACATAATCATTATACATATTTATGGGTTAAAGTGTAATGTTTTAATATGTGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATCTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCACCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCCACAAGTATCACTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAATGATGTATTTAAATTATTTCTGAATATTTTACTAAAAAGGGAATGTGGGAGGTCAGTGCATTTAAAACATAAAGAAATGAAGAGCTAGTTCAAACCTTGGGAAAATACACTATATCTTAAACTCCATGAAAGAAGGTGAGGCTGCAAACAGCTAATGCACATTGGCAACAGCCCCTGATGCATATGCCTTATTCATCCCTCAGAAAAGGATTCAAGTAGAGGCTTGATTTGGAGGTTAAAGTTTTGCTATGCTGTATTTTACATTACTTATTGTTTTAGCTGTCCTCATGAATGTCTTTTCACTACCCATTTGCTTATCCTGCATCTCTCAGCCTTGA-3’

右侧慢病毒长末端重复序列SEQ ID NO.5：

5’-TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGATAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA-3’

β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI101，即SEQ ID NO.6：

5’-GAGGCCTCAAGATGATAACTTTTATTTTCTGGACTTGTAATAGCTTTCTCTTGTATTCACCATGTTGTAACTTTCTTAGAGTAGTAACAATATAAAGTTATTGTGAGTTTTTGCAAACACAGCAAACACAACGACCCATATAGACATTGATGTGAAATTGTCTATTGTCAATTTATGGGAAAACAAGTATGTACTTTTTCTACTAAGCCATTGAAACAGGAATAACAGAACAAGATTGAAAGAATACATTTTCCGAAATTACTTGAGTATTATACAAAGACAAGCACGTGGACCTGGGAGGAGGGTTATTGTCCATGACTGGTGTGTGGAGACAAATGCAGGTTTATAATAGATGGGATGGCATCTAGCGCAATGACTTTGCCATCACTTTTAGAGAGCTCTTGGGGACCCCAGTACACAAGAGGGGACGCAGGGTATATGTAGACATCTCATTCTTTTTCTTAGTGTGAGAATAAGAATAGCCATGACCTGAGTTTATAGACAATGAGCCCTTTTCTCTCTCCCACTCAGCAGCTATGAGATGGCTTGCCCTGCCTCTCTACTAGGCTGACTCACTCCAAGGCCCAGCAATGGGCAGGGCTCTGTCAGGGCTTTGATAGCACTATCTGCAGAGCCAGGGCCGAGAAGGGGTGGACTCCAGAGACTCTCCCTCCCATTCCCGAGCAGGGTTTGCTTATTTATGCATTTAAATGATATATTTATTTTAAAAGAAATAACAGGAGACTGCCCAGCCCTGGCTGTGACATGGAAACTATGTAGAATATTTTGGGTTCCATTTTTTTTTCCTTCTTTCAGTTAGAGGAAAAGGGGCTCACTGCACATACACTAGACAGAAAGTCAGGAGCTTTGAATCCAAGCCTGATCATTTCCATGTCATACTGAGAAAGTCCCCACCCTTCTCTGAGCCTCAGTTTCTCTTTTTATAAGTAGGAGTCTGGAGTAAATGATTTCCAATGGCTCTCATTTCAATACAAAATTTCCGTTTATTAAATGCATGAGCTTCTGTTACTCCAAGACTGAGAAGGAAATTGAACCTGAGACTCATTGACTGGCAAGATGTCCCCAGAGGCTCTCATTCAGCAATAAAATTCTCACCTTCACCCAGGCCCACTGAGTGTCAGATTTGCATGCACTAGAGCTCAGAAGAGTCAAGCATTTGCCTAAGGTCGGACATGTCAGAGGCAGTGCCAGACCTATGTGAGACTCTGCAGCTACTGCTCATGGGCCCTGTGCTGCACTGATGAGGAGGATCAGATGGATGGGGCAATGAAGCAAAGGAATCATTCTGTGGATAAAGGAGACAGCCATGAAGAAGTCTATGACTGTAAATTTGGGAGCAGGAGTCTCTAAGGACTTGGATTTCAAGGAATTTTGACTCAGCAAACACAAGACCCTCACGGTGACTTTGCGAGCTGGTGTGCCAGATGTGTCTATCAGAGGTTCCAGGGAGGGTGGGGTGGGGTCAGGGCTGGCCACCAGCTATCAGGGCCCAGATGGGTTATAGGCTGGCAGGCTCAGATAGGTGGTTAGGTCAGGTTGGTGGTGCTGGGTGGAGTCCATGACTCCCAGGAGCCAGGAGAGATAGACCATGAGTAGAGGGCAGACATGGGAAAGGTGGGGGAGGCACAGCATAGCAGCATTTTTCATTCTACTACTACATGGGACTGCTCCCCTATACCCCCAGCTAGGGGCAAGTGCCTTGACTCCTATGTTTTCAGGATCATCATCTATAAAGTAAGAGTAATAATTGTGTCTATCTCATAGGGTTATTATGAGGATCAAAGGAGATGCACACTCTCTGGACCAGTGGCCTAACAGTTCAGGACAGAGCTATGGGCTTCCTATGTATGGGTCAGTGGTCTCAATGTAGCAGGCAAGTTCCAGAAGATAGCATCAACCACTGTTAGAGATATACTGCCAGTCTCAGAGCCTGATGTTAATTTAGCAATGGGCTGGGACCCTCCTCCAGTAGAACCTTCTAACCAGCTGCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATCGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGGGACAGAGCACATTATAATTAACTGTTATTTTTTACTTGGACTCTTGTGGGGAATAAGATACATGTTTTATTCTTATTTATGATTCAAGCACTGAAAATAGTGTTTAGCATCCAGCAGGTGCTTCAAAACCATTTGCTGAATGATTACTATACTTTTTACAAGCTCAGCTCCCTCTATCCCTTCCAGCATCCTCATCTCTGATTAAATAAGCTTCAGTTTTTCCTTAGTTCCTGTTACATTTCTGTGTGTCTCCATTAGTGACCTCCCATAGTCCAAGCATGAGCAGTTCTGGCCAGGCCCCTGTCGGGGTCAGTGCCCCACCCCCGCCTTCTGGTTCTGTGTAACCTTCTAAGCAAACCTTCTGGCTCAAGCACAGCAATGCTGAGTCATGATGAGTCATGCTGAGGCTTAGGGTGTGTGCCCAGATGTTCTCAGCCTAGAGTGATGACTCCTATCTGGGTCCCCAGCAGGATGCTTACAGGGCAGATGGCAAAAAAAAGGAGAAGCTGACCACCTGACTAAAACTCCACCTCAAACGGCATCATAAAGAAAATGGATGCCTGAGACAGAATGTGACATATTCTAGAATATATTATTTCCTGAATATATATATATATATACACATATACGTATATATATATATATATATATATTTGTTGTTATCAATTGCCATAGAATGATTAGTTATTGTGAATCAAATATTTATCTTGCAGGTGGCCTCTATACCTAGAAGCGGCAGAATCAGGCTTTATTAATACATGTGTATAGATTTTTAGGATCTATACACATGTATTAATATGAAACAAGGATATGGAAGAGGAAGGCATGAAAACAGGAAAAGAAAACAAACCTTGTTTGCCATTTTAAGGCACCCCTGGACAGCTAGGTGGCAAAAGG-3’

β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI103，即SEQ ID NO.7：

5’-GAGGCCTCAAGATGATAACTTTTATTTTCTGGACTTGTAATAGCTTTCTCTTGTATTCACCATGTTGTAACTTTCTTAGAGTAGTAACAATATAAAGTTATTGTGAGTTTTTGCAAACACAGCAAACACAACGACCCATATAGACATTGATGTGAAATTGTCTATTGTCAATTTATGGGAAAACAAGTATGTACTTTTTCTACTAAGCCATTGAAACAGGAATAACAGAACAAGATTGAAAGAATACATTTTCCGAAATTACTTGAGTATTATACAAAGACAAGCACGTGGACCTGGGAGGAGGGTTATTGTCCATGACTGGTGTGTGGAGACAAATGCAGGTTTATAATAGATGGGATGGCATCTAGCGCAATGACTTTGCCATCACTTTTAGAGAGCTCTTGGGGACCCCAGTACACAAGAGGGGACGCAGGGTATATGTAGACATCTCATTCTTTTTCTTAGTGTGAGAATAAGAATAGCCATGACCTGAGTTTATAGACAATGAGCCCTTTTCTCTCTCCCACTCAGCAGCTATGAGATGGCTTGCCCTGCCTCTCTACTAGGCTGACTCACTCCAAGGCCCAGCAATGGGCAGGGCTCTGTCAGGGCTTTGATAGCACTATCTGCAGAGCCAGGGCCGAGAAGGGGTGGACTCCAGAGACTCTCCCTCCCATTCCCGAGCAGGGTTTGCTTATTTATGCATTTAAATGATATATTTATTTTAAAAGAAATAACAGGAGACTGCCCAGCCCTGGCTGTGACATGGAAACTATGTAGAATATTTTGGGTTCCATTTTTTTTTCCTTCTTTCAGTTAGAGGAAAAGGGGCTCACTGCACATACACTAGACAGAAAGTCAGGAGCTTTGAATCCAAGCCTGATCATTTCCATGTCATACTGAGAAAGTCCCCACCCTTCTCTGAGCCTCAGTTTCTCTTTTTATAAGTAGGAGTCTGGAGTAAATGATTTCCAATGGCTCTCATTTCAATACAAAATTTCCGTTTATTAAATGCATGAGCTTCTGTTACTCCAAGACTGAGAAGGAAATTGAACCTGAGACTCATTGACTGGCAAGATGTCCCCAGAGGCTCTCATTCAGCAATAAAATTCTCACCTTCACCCAGGCCCACTGAGTGTCAGATTTGCATGCACTAGAGCTCAGAAGAGTCAAGCATTTGCCTAAGGTCGGACATGTCAGAGGCAGTGCCAGACCTATGTGAGACTCTGCAGCTACTGCTCATGGGCCCTGTGCTGCACTGATGAGGAGGATCAGATGGATGGGGCAATGAAGCAAAGGAATCATTCTGTGGATAAAGGAGACAGCCATGAAGAAGTCTATGACTGTAAATTTGGGAGCAGGAGTCTCTAAGGACTTGGATTTCAAGGAATTTTGACTCAGCAAACACAAGACCCTCACGGTGACTTTGCGAGCTGGTGTGCCAGATGTGTCTATCAGAGGTTCCAGGGAGGGTGGGGTGGGGTCAGGGCTGGCCACCAGCTATCAGGGCCCAGATGGGTTATAGGCTGGCAGGCTCAGATAGGTGGTTAGGTCAGGTTGGTGGTGCTGGGTGGAGTCCATGACTCCCAGGAGCCAGGAGAGATAGACCATGAGTAGAGGGCAGACATGGGAAAGGTGGGGGAGGCACAGCATAGCAGCATTTTTCATTCTACTACTACATGGGACTGCTCCCCTATACCCCCAGCTAGGGGCAAGTGCCTTGACTCCTATGTTTTCAGGATCATCATCTATAAAGTAAGAGTAATAATTGTGTCTATCTCATAGGGTTATTATGAGGATCAAAGGAGATGCACACTCTCTGGACCAGTGGCCTAACAGTTCAGGACAGAGCTATGGGCTTCCTATGTATGGGTCAGTGGTCTCAATGTAGCAGGCAAGTTCCAGAAGATAGCATCAACCACTGTTAGAGATATACTGCCAGTCTCAGAGCCTGATGTTAATTTAGCAATGGGCTGGGACCCTCCTCCAGTAGAACCTTCTAACCAGCTGCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATCGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGGGACAGAGCACATTATAATTAACTGTTATTTTTTACTTGGACTCTTGTGGGGAATAAGATACATGTTTTATTCTTATTTATGATTCAAGCACTGAAAATAGTGTTTAGCATCCAGCAGGTGCTTCAAAACCATTTGCTGAATGATTACTATACTTTTTACAAGCTCAGCTCCCTCTATCCCTTCCAGCATCCTCATCTCTGATTAAATAAGCTTCAGTTTTTCCTTAGTTCCTGTTACATTTCTGTGTGTCTCCATTAGTGACCTCCCATAGTCCAAGCATGAGCAGTTCTGGCCAGGCCCCTGTCGGGGTCAGTGCCCCACCCCCGCCTTCTGGTTCTGTGTAACCTTCTAAGCAAACCTTCTGGCTCAAGCACAGCAATGCTGAGTCATGATGAGTCATGCTGAGGCTTAGGGTGTGTGCCCAGATGTTCTCAGCCTAGAGTGATGACTCCTATCTGGGTCCCCAGCAGGATGCTTACAGGGCAGATGGCAAAAAAAAGGAGAAGCTGACCACCTGACTAAAACTCCACCTCAAACGGCATCATAAAGAAAATGGATGCCTGAGACAGAATGTGACATATTCTAG-3’

β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI104，即SEQ ID NO.8：

5’-AGGATCCCTTGAGCTCAGGAGGTCAAGGCTGCAGTGAGACATGATCTTGCCACTGCACTCCAGCCTGGACAGCAGAGTGAAACCTTGCCTCACGAAACAGAATACAAAAACAAACAAACAAAAAACTGCTCCGCAATGCGCTTCCTTGATGCTCTACCACATAGGTCTGGGTACTTTGTACACATTATCTCATTGCTGTTCATAATTGTTAGATTAATTTTGTAATATTGATATTATTCCTAGAAAGCTGAGGCCTCAAGATGATAACTTTTATTTTCTGGACTTGTAATAGCTTTCTCTTGTATTCACCATGTTGTAACTTTCTTAGAGTAGTAACAATATAAAGTTATTGTGAGTTTTTGCAAACACAGCAAACACAACGACCCATATAGACATTGATGTGAAATTGTCTATTGTCAATTTATGGGAAAACAAGTATGTACTTTTTCTACTAAGCCATTGAAACAGGAATAACAGAACAAGATTGAAAGAATACATTTTCCGAAATTACTTGAGTATTATACAAAGACAAGCACGTGGACCTGGGAGGAGGGTTATTGTCCATGACTGGTGTGTGGAGACAAATGCAGGTTTATAATAGATGGGATGGCATCTAGCGCAATGACTTTGCCATCACTTTTAGAGAGCTCTTGGGGACCCCAGTACACAAGAGGGGACGCAGGGTATATGTAGACATCTCATTCTTTTTCTTAGTGTGAGAATAAGAATAGCCATGACCTGAGTTTATAGACAATGAGCCCTTTTCTCTCTCCCACTCAGCAGCTATGAGATGGCTTGCCCTGCCTCTCTACTAGGCTGACTCACTCCAAGGCCCAGCAATGGGCAGGGCTCTGTCAGGGCTTTGATAGCACTATCTGCAGAGCCAGGGCCGAGAAGGGGTGGACTCCAGAGACTCTCCCTCCCATTCCCGAGCAGGGTTTGCTTATTTATGCATTTAAATGATATATTTATTTTAAAAGAAATAACAGGAGACTGCCCAGCCCTGGCTGTGACATGGAAACTATGTAGAATATTTTGGGTTCCATTTTTTTTTCCTTCTTTCAGTTAGAGGAAAAGGGGCTCACTGCACATACACTAGACAGAAAGTCAGGAGCTTTGAATCCAAGCCTGATCATTTCCATGTCATACTGAGAAAGTCCCCACCCTTCTCTGAGCCTCAGTTTCTCTTTTTATAAGTAGGAGTCTGGAGTAAATGATTTCCAATGGCTCTCATTTCAATACAAAATTTCCGTTTATTAAATGCATGAGCTTCTGTTACTCCAAGACTGAGAAGGAAATTGAACCTGAGACTCATTGACTGGCAAGATGTCCCCAGAGGCTCTCATTCAGCAATAAAATTCTCACCTTCACCCAGGCCCACTGAGTGTCAGATTTGCATGCACTAGGGATCCACTTGCCCAGTGTTCTTCCTTAGTTCCTACCTTCGACCTTGATCCTCCTTTATCTTCCTGAACCCTGCTGAGATGATCTATGTGGGGAGAATGGCTTCTTTGAGAAACATCTTCTTCGTTAGTGGCCTGCCCCTCATTCCCACTTTAATATCCAGAATCACTATAAGAAGAATATAATAAGAGGAATAACTCTTATTATAGGTAAGGGAAAATTAAGAGGCATACGTGATGGGATGAGTAAGAGAGGAGAGGGAAGGATTAATGGACGATAAAATCTACTACTATTTGTTGAGACCTTTTATAGTCTAATCAATTTTGCTATTGTTTTCCATCCTCACGCTAACTCCATAAAAAAACACTATTATTATCTTTATTTTGCCATGACAAGACTGAGCTCAGAAGAGTCAAGCATTTGCCTAAGGTCGGACATGTCAGAGGCAGTGCCAGACCTATGTGAGACTCTGCAGCTACTGCTCATGGGCCCTGTGCTGCACTGATGAGGAGGATCAGATGGATGGGGCAATGAAGCAAAGGAATCATTCTGTGGATAAAGGAGACAGCCATGAAGAAGTCTATGACTGTAAATTTGGGAGCAGGAGTCTCTAAGGACTTGGATTTCAAGGAATTTTGACTCAGCAAACACAAGACCCTCACGGTGACTTTGCGAGCTGGTGTGCCAGATGTGTCTATCAGAGGTTCCAGGGAGGGTGGGGTGGGGTCAGGGCTGGCCACCAGCTATCAGGGCCCAGATGGGTTATAGGCTGGCAGGCTCAGATAGGTGGTTAGGTCAGGTTGGTGGTGCTGGGTGGAGTCCATGACTCCCAGGAGCCAGGAGAGATAGACCATGAGTAGAGGGCAGACATGGGAAAGGTGGGGGAGGCACAGCATAGCAGCATTTTTCATTCTACTACTACATGGGACTGCTCCCCTATACCCCCAGCTAGGGGCAAGTGCCTTGACTCCTATGTTTTCAGGATCATCATCTATAAAGTAAGAGTAATAATTGTGTCTATCTCATAGGGTTATTATGAGGATCAAAGGAGATGCACACTCTCTGGACCAGTGGCCTAACAGTTCAGGACAGAGCTATGGGCTTCCTATGTATGGGTCAGTGGTCTCAATGTAGCAGGCAAGTTCCAGAAGATAGCATCAACCACTGTTAGAGATATACTGCCAGTCTCAGAGCCTGATGTTAATTTAGCAATGGGCTGGGACCCTCCTCCAGTAGAACCTTCTAACCAGCTGCTGCAGTCAAAGTCGAATGCAGCTGGTTAGACTTTTTTTAATGAGAAAATCTGGGCATGGTGTCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGTGGGTGGACTGCTTGGAGCTCAGGAGTTCAAGACCATCTTGGACAACATGGTGATACCCTGCCTCTACAAAAAGTACAAAAATTAGCCTGGCATGGTGGTGTGCACCTGTAATCCCAGCTATTAGGGTGGCTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATCGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGGGACAGAGCACATTATAATTAACTGTTATTTTTTACTTGGACTCTTGTGGGGAATAAGATACATGTTTTATTCTTATTTATGATTCAAGCACTGAAAATAGTGTTTAGCATCCAGCAGGTGCTTCAAAACCATTTGCTGAATGATTACTATACTTTTTACAAGCTCAGCTCCCTCTATCCCTTCCAGCATCCTCATCTCTGATTAAATAAGCTTCAGTTTTTCCTTAGTTCCTGTTACATTTCTGTGTGTCTCCATTAGTGACCTCCCATAGTCCAAGCATGAGCAGTTCTGGCCAGGCCCCTGTCGGGGTCAGTGCCCCACCCCCGCCTTCTGGTTCTGTGTAACCTTCTAAGCAAACCTTCTGGCTCAAGCACAGCAATGCTGAGTCATGATGAGTCATGCTGAGGCTTAGGGTGTGTGCCCAGATGTTCTCAGCCTAGAGTGATGACTCCTATCTGGGTCCCCAGCAGGATGCTTACAGGGCAGATGGCAAAAAAAAGGAGAAGCTGACCACCTGACTAAAACTCCACCTCAAACGGCATCATAAAGAAAATGGATGCCTGAGACAGAATGTGACATATTCTAGAATATATTATTTCCTGAATATATATATATATATACACATATACGTATATATATATATATATATATATTTGTTGTTATCAATTGCCATAGAATGATTAGTTATTGTGAATCAAATATTTATCTTGCAGGTGGCCTCTATACCTAGAAGCGGCAGAATCAGGCTTTATTAATACATGTGTATAGATTTTTAGGATCTATACACATGTATTAATATGAAACAAGGATATGGAAGAGGAAGGCATGAAAACAGGAAAAGAAAACAAACCTTGTTTGCCATTTTAAGGCACCCCTGGACAGCTAGGTGGCAAAAGGCCTGTGCTGTTAGAGGACACATGCTCACATACGGGG-3’

β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI105，即SEQ ID NO.9：

5’-GTGGACCTGGGAGGAGGGTTATTGTCCATGACTGGTGTGTGGAGACAAATGCAGGTTTATAATAGATGGGATGGCATCTAGCGCAATGACTTTGCCATCACTTTTAGAGAGCTCTTGGGGACCCCAGTACACAAGAGGGGACGCAGGGTATATGTAGACATCTCATTCTTTTTCTTAGTGTGAGAATAAGAATAGCCATGACCTGAGTTTATAGACAATGAGCCCTTTTCTCTCTCCCACTCAGCAGCTATGAGATGGCTTGCCCTGCCTCTCTACTAGGCTGACTCACTCCAAGGCCCAGCAATGGGCAGGGCTCTGTCAGGGCTTTGATAGCACTATCTGCAGAGCCAGGGCCGAGAAGGGGTGGACTCCAGAGACTCTCCCTCCCATTCCCGAGCAGGGTTTGCTTATTTATGCATTTAAATGATATATTTATTTTAAAAGAAATAACAGGAGACTGCCCAGCCCTGGCTGTGACATGGAAACTATGTAGAATATTTTGGGTTCCATTTTTTTTTCCTTCTTTCAGTTAGAGGAAAAGGGGCTCACTGCACATACACTAGACAGAAAGTCAGGAGCTTTGAATCCAAGCCTGATCATTTCCATGTCATACTGAGAAAGTCCCCACCCTTCTCTGAGCCTCAGTTTCTCTTTTTATAAGTAGGAGTCTGGAGTAAATGATTTCCAATGGCTCTCATTTCAATACAAAATTTCCGTTTATTAAATGCATGAGCTAAGACTGAGCTCAGAAGAGTCAAGCATTTGCCTAAGGTCGGACATGTCAGAGGCAGTGCCAGACCTATGTGAGACTCTGCAGCTACTGCTCATGGGCCCTGTGCTGCACTGATGAGGAGGATCAGATGGATGGGGCAATGAAGCAAAGGAATCATTCTGTGGATAAAGGAGACAGCCATGAAGAAGTCTATGACTGTAAATTTGGGAGCAGGAGTCTCTAAGGACTTGGATTTCAAGGAATTTTGACTCAGCAAACACAAGACCCTCACGGTGACTTTGCGAGCTGGTGTGCCAGATGTGTCTATCAGAGGTTCCAGGGAGGGTGGGGTGGGGTCAGGGCTGGCCACCAGCTATCAGGGCCCAGATGGGTTATAGGCTGGCAGGCTCAGATAGGTGGTTAGGTCAGGTTGGTGGTGCTGGGTGGAGTCCATGACTCCCAGGAGCCAGGAGAGATAGACCATGAGTAGAGGGCAGACATGGGAAAGGTGGGGGAGGCACAGCATAGCAGCATTTTTCATTCTACTACTACATGGGACTGCTCCCCTATACCCCCAGCTAGGGGCAAGTGCCTTGACTCCTATGTTTTCAGGATCATCATCTATAAAGTAAGAGTAATAATTGTGTCTATCTCATAGGGTTATTATGAGGCTGAATGATTACTATACTTTTTACAAGCTCAGCTCCCTCTATCCCTTCCAGCATCCTCATCTCTGATTAAATAAGCTTCAGTTTTTCCTTAGTTCCTGTTACATTTCTGTGTGTCTCCATTAGTGACCTCCCATAGTCCAAGCATGAGCAGTTCTGGCCAGGCCCCTGTCGGGGTCAGTGCCCCACCCCCGCCTTCTGGTTCTGTGTAACCTTCTAAGCAAACCTTCTGGCTCAAGCACAGCAATGCTGAGTCATGATGAGTCATGCTGAGGCTTAGGGTGTGTGCCCAGATGTTCTCAGCCTAGAGTGATGACTCCTATCTGGGTCCCCAGCAGGATGCTTACAGGGCAGATGGCAAAAAAAAGGAGAAGCTGACCACCTGACTAAAACTCCACCTCAAACGGCATCATAAAGAAAATGGATGCCTGAGACAGAATGTGACATATTCTAGAATATATTATTTCCTGAA-3’

β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI106，即SEQ ID NO.10：

5’-AGGATCCCTTGAGCTCAGGAGGTCAAGGCTGCAGTGAGACATGATCTTGCCACTGCACTCCAGCCTGGACAGCAGAGTGAAACCTTGCCTCACGAAACAGAATACAAAAACAAACAAACAAAAAACTGCTCCGCAATGCGCTTCCTTGATGCTCTACCACATAGGTCTGGGTACTTTGTACACATTATCTCATTGCTGTTCATAATTGTTAGATTAATTTTGTAATATTGATATTATTCCTAGAAAGCTGAGGCCTCAAGATGATAACTTTTATTTTCTGGACTTGTAATAGCTTTCTCTTGTATTCACCATGTTGTAACTTTCTTAGAGTAGTAACAATATAAAGTTATTGTGAGTTTTTGCAAACACAGCAAACACAACGACCCATATAGACATTGATGTGAAATTGTCTATTGTCAATTTATGGGAAAACAAGTATGTACTTTTTCTACTAAGCCATTGAAACAGGAATAACAGAACAAGATTGAAAGAATACATTTTCCGAAATTACTTGAGTATTATACAAAGACAAGCACGTGGACCTGGGAGGAGGGTTATTGTCCATGACTGGTGTGTGGAGACAAATGCAGGTTTATAATAGATGGGATGGCATCTAGCGCAATGACTTTGCCATCACTTTTAGAGAGCTCTTGGGGACCCCAGTACACAAGAGGGGACGCAGGGTATATGTAGACATCTCATTCTTTTTCTTAGTGTGAGAATAAGAATAGCCATGACCTGAGTTTATAGACAATGAGCCCTTTTCTCTCTCCCACTCAGCAGCTATGAGATGGCTTGCCCTGCCTCTCTACTAGGCTGACTCACTCCAAGGCCCAGCAATGGGCAGGGCTCTGTCAGGGCTTTGATAGCACTATCTGCAGAGCCAGGGCCGAGAAGGGGTGGACTCCAGAGACTCTCCCTCCCATTCCCGAGCAGGGTTTGCTTATTTATGCATTTAAATGATATATTTATTTTAAAAGAAATAACAGGAGACTGCCCAGCCCTGGCTGTGACATGGAAACTATGTAGAATATTTTGGGTTCCATTTTTTTTTCCTTCTTTCAGTTAGAGGAAAAGGGATCCACTTGCCCAGTGTTCTTCCTTAGTTCCTACCTTCGACCTTGATCCTCCTTTATCTTCCTGAACCCTGCTGAGATGATCTATGTGGGGAGAATGGCTTCTTTGAGAAACATCTTCTTCGTTAGTGGCCTGCCCCTCATTCCCACTTTAATATCCAGAATCACTATAAGAAGAATATAATAAGAGGAATAACTCTTATTATAGGTAAGGGAAAATTAAGAGGCATACGTGATGGGATGAGTAAGAGAGGAGAGGGAAGGATTAATGGACGATAAAATCTACTACTATTTGTTGAGACCTTTTATAGTCTAATCAATTTTGCTATTGTTTTCCATCCTCACGCTAACTCCATAAAAAAACACTATTATTATCTTTATTTTGCCATGACAAGACTGAGCTCAGAAGAGTCAAGCATTTGCCTAAGGTCGGACATGTCAGAGGCAGTGCCAGACCTATGTGAGACTCTGCAGCTACTGCTCATGGGCCCTGTGCTGCACTGATGAGGAGGATCAGATGGATGGGGCAATGAAGCAAAGGAATCATTCTGTGGATAAAGGAGACAGCCATGAAGAAGTCTATGACTGTAAATTTGGGAGCAGGAGTCTCTAAGGACTTGGATTTCAAGGAATTTTGACTCAGCAAACACAAGACCCTCACGGTGACTTTGCGAGCTGGTGTGCCAGATGTGTCTATCAGAGGTTCCAGGGAGGGTGGGGTGGGGTCAGGGCTGGCCACCAGCTATCAGGGCCCAGATGGGTTATAGGCTGGCAGGCTCAGATAGGTGGTTAGGTCAGGTTGGTGGTGCTGGGTGGAGTCCATGACTCCCAGGAGCCAGGAGAGATAGACCATGAGTAGAGGGCAGACATGGGAAAGGTGGGGGAGGCACAGCATAGCAGCATTTTTCATTCTACTACTACATGGGACTGCTCCCCTATACCCCCAGCTAGGGGCAAGTGCCTTGACTCCTATGTTTTCAGGATCATCATCTATAAAGTAAGAGTAATAATTGTGTCTATCTCATAGGGTTATTATGAGGATCAAAGGAGATGCACACTCTCTGGACCAGTGGCCTAACAGTTCAGGACAGAGCTATGGGCTTCCTATGTATGGGTCAGTGGTCTCAATGTAGCAGGCAAGTTCCAGAAGATAGCATCAACCACTGTTAGAGATATACTGCCAGTCTCAGAGCCTGATGTTAATTTAGCAATGGGCTGGGACCCTCCTCCAGTAGAACCTTCTAACCAGCTGCTGCAGTCAAAGTCGAATGCAGCTGGTTAGACTTTTTTTAATGATTTGGGAGGCTGAGGTGGGTGGACTGCTTGGAGCTCAGGAGTTCAAGACCATCTTGGACAACATGGTGATACCCTGCCTCTACAAAAAGTACAAAAATTAGCCTGGCATGGTGGTGTGCACCTGTAATCCCAGCTATTAGGGTGGCTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATCGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGGGACAGAGCACATTATAATTAACTGTTATTTTTTACTTGGACTCTTGTGGGGAATAAGATACATGTTTTATTCTTATTTATGATTCAAGCACTGAAAATAGTGTTTAGCATCCAGCAGGTGCTTCAAAACCATTTGCTGAATGATTACTATACTTTTTACAAGCTCAGCTCCCTCTATCCCTTCCAGCATCCTCATCTCTGATTAAATAAGCTTCAGTTTTTCCTTAGTTCCTGTTACATTTCTGTGTGTCTCCATTAGTGACCTCCCATAGTCCAAGCATGAGCAGTTCTGGCCAGGCCCCTGTCGGGGTCAGTGCCCCACCCCCGCCTTCTGGTTCTGTGTAACCTTCTAAGCAAACCTTCTGGCTCAAGCACAGCAATGCTGAGTCATGATGAGTCATGCTGAGGCTTAGGGTGTGTGCCCAGATGTTCTCAGCCTAGAGTGATGACTCCTATCTGGGTCCCCAGCAGGATGCTTACAGGGCAGATGGCAAAAAAAAGGAGAAGCTGACCACCTGACTAAAACTCCACCTCAAACGGCATCATAAAGAAAATGGATGCCTGAGACAGAATGTGACATATTCTAGAATATATTATTTCCTGAATATATATATATATATACACATATA-3’

β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI107，即SEQ ID NO.11：

5’-ATTCCTAGAAAGCTGAGGCCTCAAGATGATAACTTTTATTTTCTGGACTTGTAATAGCTTTCTCTTGTATTCACCATGTTGTAACTTTCTTAGAGTAGTAACAATATAAAGTTATTGTGAGTTTTTGCAAACACAGCAAACACAACGACCCATATAGACATTGATGTGAAATTGTCTATTGTCAATTTATGGGAAAACAAGTATGTACTTTTTCTACTAAGCCATTGAAACAGGAATAACAGAACAAGATTGAAAGAATACATTTTCCGAAATTACTTGAGTATTATACAAAGACAAGCACGTGGACCTGGGAGGAGGGTTATTGTCCATGACTGGTGTGTGGAGACAAATGCAGGTTTATAATAGATGGGATGGCATCTAGCGCAATGACTTTGCCATCACTTTTAGAGAGCTCTTGGGGACCCCAGTACACAAGAGGGGACGCAGGGTATATGTAGACATCTCATTCTTTTTCTTAGTGTGAGAATAAGAATAGCCATGACCTGAGTTTATAGACAATGAGCCCTTTTCTCTCTCCCACTCAGCAGCTATGAGATGGCTTGCCCTGCCTCTCTACTAGGCTGACTCACTCCAAGGCCCAGCAATGGGCAGGGCTCTGTCAGGGCTTTGATAGCACTATCTGCAGAGCCAGGGCCGAGAAGGGGTGGACTCCAGAGACTCTCCCTCCCATTCCCGAGCAGGGTTTGCTTATTTATGCATTTAAATGATATATTTATTTTAAAAGAAATAACAGGAGACTGCCCAGCCCTGGCTGTGACATGGAAACTATGTAGAATATTTTGGGTTCCATTTTTTTTTCCTTCTTTCAGTTAGAGGAAAAGGGGCTCACTGCACATACACTAGACAGAAAGTCAGGAGCTTTGAATCCAAGCCTGATCATTTCCATGTCATACTGAGAAAGTCCCCACCCTTCTCTGAGCCTCAGTTTCTCTTTTTATAAGTAGGAGTCTGGAGTAAATGATTTCCAATGGCTCTCATTTCAACCTGAACCCTGCTGAGATGATCTATGTGGGGAGAATGGCTTCTTTGAGAAACATCTTCTTCGTTAGTGGCCTGCCCCTCATTCCCACTTTAATATCCAGAATCACTATAAGAAGAATATAATAAGAGGAATAACTCTTATTATAGGTAAGGGAAAATTAAGAGGCATACGTGATGGGATGAGTAAGAGAGGAGAGGGAAGGATTAATGGACGATAAAATCTACTACTATTTGTTGAGACCTTTTATAGTCTAATCAATTTTGCTATTGTTTTCCATCCTCACGCTAACTCCATAAAAAAACACTATTATTATCTTTATTTTGCCATGACAAGACTGAGCTCAGAAGAGTCAAGCATTTGCCTAAGGTCGGACATGTCAGAGGCAGTGCCAGACCTATGTGAGACTCTGCAGCTACTGCTCATGGGCCCTGTGCTGCACTGATGAGGAGGATCAGATGGATGGGGCAATGAAGCAAAGGAATCATTCTGTGGATAAAGGAGACAGCCATGAAGAAGTCTATGACTGTAAATTTGGGAGCAGGAGTCTCTAAGGACTTGGATTTCAAGGAATTTTGACTCAGCAAACACAAGACCCTCACGGTGACTTTGCGAGCTGGTGTGCCAGATGTGTCTATCAGAGGTTCCAGGGAGGGTGGGGTGGGGTCAGGGCTGGCCACCAGCTATCAGGGCCCAGATGGGTTATAGGCTGGCAGGCTCAGATAGGTGGTTAGGTCAGGTTGGTGGTGCTGGGTGGAGTCCATGACTCCCAGGAGCCAGGAGAGATAGACCATGAGTAGAGGGCAGACATGGGAAAGGTGGGGGAGGCACAGCATAGCAGCATTTTTCATTCTACTACTACATGGGACTGCTCCCCTATACCCCCAGCTAGGGGCAAGTGCCTTGACTCCTATGTTTTCAGGATCATCATCTATAAAGTAAGAGTAATAATTGTGTCTATCTCATAGGGTTATTATGAGGATCAAAGGAGATGCACACTCTCTGGACCAGTGGCCTAACAGTTCAGGACAGAGCTATGGGCTTCCTATGTATGGGTCAGTGGTCTCAATGTAGCAGGCAAGTTCCAGAAGATAGCATCAACCACTGTTAGAGATATACTGCCAGTCTCAGAGCCTGATGTTAATTTAGCAATGGGCTGGGACCCTCCTCCAGTAGAACCTTCTAACCAGCTGCTGCAGTCAAAGTCGAATGCAGCTGAAAATCTGGGCATGGTGTCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGTGGGTGGACTGCTTGGAGCTCAGGAGTTCAAGACCATCTTGGACAACATGGTGATACCCTGCCTCTACAAAAAGTACAAAAATTAGCCTGGCATGGTGGTGTGCACCTGTAATCCCAGCTATTAGGGTGGCTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATCGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGGGACAGAGCACATTATAATTAACTGTTATTTTTTACTTGGACTCTTGTGGGGAATAAGATACATGTTTTATTCTTATTTATGATTCAAGCACTGAAAATAGTGTTTAGCATCCAGCAGGTGCTTCAAAACCATTTGCTGAATGATTACTATACTTTTTACAAGCTCAGCTCCCTCTATCCCTTCCAGCATCCTCATCTCTGATTAAATAAGCTTCAGTTTTTCCTTAGTTCCTGTTACATTTCTGTGTGTCTCCATTAGTGACCTCCCATAGTCCAAGCATGAGCAGTTCTGGCCAGGCCCCTGTCGGGGTCAGTGCCCCACCCCCGCCTTCTGGTTCTGTGTAACCTTCTAAGCAAACCTTCTGGCTCAAGCACAGCAATGCTGAGTCATGATGAGTCATGCTGAGGCTTAGGGTGTGTGCCCAGATGTTCTCAGCCTAGAGTGATGACTCCTATCTGGGTCCCCAGCAGGATGCTTACAGGGCAGATGGCAAAAAAAAGGAGAAGCTGACCACCTGACTAAAACTCCACCTCAAACGGCATCATAAAGAAAATGGATGCCTGAGACAGAATGTGACATATTCTAGAATATATTATTTCCTGAATATATATATATATATACACATATACGTATATATATATATATATATATATTTGTTGTTATCAATTGCCATAGAATGATTAGTTATTGTGAATCAAATATTTATCTTGCAGGTGGCCTCTATACCTAGAAGCGGCAGAATCAGGCTTTATTAATACATGTGTATAGATTTTTAGGATCTATACACATGTATTAATATGAAACAAGGATATGGAAGAGGAAGGCATGAAAACAGGAAAAGAAAACAAACCTTGTTTGCCATTTTAAGGCACCCCTGGACAGCTAGGTGGCAAAAGGCCTGTGCTGTTAGAGGACACATGCTCACATACGGGG-3’

本例使用的慢病毒骨架载体为pLenti。选择pLenti载体多克隆位点的一对限制性内切酶将载体线性化，本例具体采用的是EcoRV和BamHI，然后根据线性化载体末端序列设计Gibson组装引物分别扩增HBB LCR区域和编码区片段，然后通过一步Gibson组装反应将两个片段插入到目的载体。

其中，Gibson组装引物包括LCR片段Gibson组装引物对、HBB编码区片段1Gibson组装引物对和HBB编码区片段2Gibson组装引物对；LCR片段Gibson组装引物对的正向引物为SEQ ID NO.12所示序列，反向引物为SEQ ID NO.13所示序列；HBB编码区片段1Gibson组装引物对的正向引物为SEQ ID NO.14所示序列，反向引物为SEQ ID NO.15所示序列；HBB编码区片段2Gibson组装引物对的正向引物为SEQ ID NO.16所示序列，反向引物为SEQ IDNO.17所示序列。

SEQ ID NO.12：

5’-CTTAAAGGTACCCTCGAGATATCTCCGCAGTGTCTTGCGTCTC-3’

SEQ ID NO.13：

5’-GGATCCGAATTCGATATCGGTTGGCAGTGACTCCGTC-3’

SEQ ID NO.14：5’-GATATCGAATTCGGATCCTACACTTGCA-3’

SEQ ID NO.15：5’-ATGTGTACGTACCCTGTTACTTATCCCCTTCCTAT-3’

SEQ ID NO.16：5’-CAGGGTACGTACACATATTGACCAAATCAGGGTA-3’

SEQ ID NO.17：

5’-CTACGTAGCGGCCGCTAGCGGATCCGTCAAGGCTGAGAGATGCAG GATAAGCA-3’

第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因序列(HBB^T87Q)(SEQ ID NO.4)以及HBB基因座调控序列(LCR)是由北京六合华大基因科技有限公司进行全基因合成并构建到pMV载体上。以SEQ ID NO.4所示序列的第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因序列(HBB^T87Q)为模板，使用SEQ ID NO.14和15以及SEQ ID NO.16和17所示序列的Gibson组装引物分别扩增出二号内含子372bp缺失的第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因片段1和2并回收，使用SEQ ID NO.14和17所示序列的Gibson组装引物扩增出全长的第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因片段并回收，分别以SEQ ID NO.6至11所示序列的HBB基因座调控序列(LCR)为模板，使用SEQ ID NO.12和13所示序列的Gibson组装引物扩增出HBB基因座调控序列(LCR)并回收，取0.2pmol的二号内含子372bp缺失的β-球蛋白基因片段1，片段2和HBB基因座调控序列(LCR)以及0.05pmol的线性化的pLenti载体，或取0.2pmol的全长β-球蛋白基因片段和HBB基因座调控序列(LCR)以及0.05pmol的线性化的pLenti载体混合并使用去离子水将总体积补至10μL，加入10μL的2×Gibson assemblymastermix(NEB，E2611L)混匀。将组装反应液置于50℃条件下反应1小时，然后立即置于冰上冷却。使用Stbl3感受态细胞进行热激转化，在氨苄青霉素抗性的固体LB平板上37℃培养16小时，挑单克隆测序鉴定。

其中，采用β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI101和二号内含子372bp缺失的第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因序列组装的重组慢病毒载体标记为重组慢病毒载体pLentiBGI101，相应的慢病毒即重组慢病毒BGI101；采用β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI101和全长的第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因序列组装的重组慢病毒载体标记为重组慢病毒载体pLentiBGI102，相应的慢病毒即重组慢病毒BGI102；采用β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI103和二号内含子372bp缺失的第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因序列组装的重组慢病毒载体标记为重组慢病毒载体pLentiBGI103，相应的慢病毒即重组慢病毒BGI103；采用β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI104和二号内含子372bp缺失的第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因序列组装的重组慢病毒载体标记为重组慢病毒载体pLentiBGI104，相应的慢病毒即重组慢病毒BGI104；采用β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI105和二号内含子372bp缺失的第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因序列组装的重组慢病毒载体标记为重组慢病毒载体pLentiBGI105，相应的慢病毒即重组慢病毒BGI105；采用β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI106和二号内含子372bp缺失的第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因序列组装的重组慢病毒载体标记为重组慢病毒载体pLentiBGI106，相应的慢病毒即重组慢病毒BGI106；采用β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI107和二号内含子372bp缺失的第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因序列组装的重组慢病毒载体标记为重组慢病毒载体pLentiBGI107，相应的慢病毒即重组慢病毒BGI107。

重组慢病毒载体如图2所示。图2中，pLentiBGI101、pLentiBGI102、pLentiBGI103、pLentiBG104、pLentiBGI105、pLentiBGI106和pLentiBGI107，即依序为重组慢病毒载体pLentiBGI101、重组慢病毒载体pLentiBGI102、重组慢病毒载体pLentiBGI103、重组慢病毒载体pLentiBGI104、重组慢病毒载体pLentiBGI105、重组慢病毒载体pLentiBGI106和重组慢病毒载体pLentiBGI107。

2.慢病毒包装

本例的重组慢病毒载体可以与三代慢病毒包装质粒系统(pLP1,pLP2和pLP/VSVG)共转染293T细胞。具体操作如下：

将4×10⁵数量的293T细胞接种到DMEM高糖完全培养基的10cm细胞培养皿中，37℃、5％CO₂培养24h至细胞密度达到70-80％。其中，DMEM高糖完全培养基中包含10％FBS、1％双抗、1％GlutaMAX、1％MEM NEAA。

取12μg重组慢病毒载体，7.8μg psPAX2和4.2μg pMD2.G质粒使用Lipofectamine3000Transfection Reagent(Invitrogen，L3000001)转染293T细胞，培养24小时后收集细胞培养上清液，使用0.45μm膜过滤，向50mL滤液中加入全能核酸酶(Benzonase)5μL，37℃消化2h，将消化后的病毒上清液转移至超速离心管中，30000g离心2h，倒去上清，使用含人血清白蛋白的培养基500μL重悬病毒，按照50μL一管分装，置于-80℃长期保存。

将293T细胞消化吹打形成单细胞悬液，进行细胞计数后，使用DMEM(10％FBS)培养基稀释成1×10⁵cells/mL悬液，并加入终浓度为6μg/mL的polybrene(HexadimethrineBromide)，充分混匀按照1mL/孔加入12孔板中。取12μL病毒液按照五倍梯度做三个稀释度，c)按照10μL/孔加入到铺好细胞的12孔板中，每种稀释度做两个重复孔，阴性对照孔加入10μL DMEM培养基。将混合均匀的孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48小时。

消化收集细胞使用基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，DP304-03)提取细胞基因组，定量后将基因组浓度稀释到40ng/μL。标准品质粒稀释成1×10⁹拷贝/mL的标准液。依次进行十倍稀释，制备10⁸-10⁴拷贝/mL的稀释液。按照10μL反应体系加入2pmol荧光探针和引物混合物和4μL样品比例制备荧光定量反应液，分装到96孔荧光定量PCR板中，使用StepOnePlus Real-Time PCR System探针法标准程序进行荧光定量PCR反应。根据标准曲线，计算各个样品ApoB和Gag基因的拷贝数，通过Gag拷贝数/ApoB拷贝数计算VCN。按照以下公式计算病毒滴度：

Titer(TU/mL)＝(10^5(细胞数量)×VCN(平均每个细胞Gag基因拷贝数))/(病毒液体积(mL))

病毒滴度需达到1×10⁸TU/mL以上。

其中，荧光探针和引物混合物包括检测ApoB基因的特异性引物和探针，以及检测Gag基因的特异性引物和探针。ApoB基因的特异性引物的正向因为为SEQ ID NO.18所示序列，反向引物为SEQ ID NO.19所示序列，探针为SEQ ID NO.20所示序列，探针的5’端具有VIC荧光基团修饰，3’端具有TAMRA淬灭基团修饰。Gag基因的特异性引物的正向因为为SEQID NO.21所示序列，反向引物为SEQ ID NO.22所示序列，探针为SEQ ID NO.23所示序列，探针的5’端具有FAM荧光基团修饰，3’端具有TAMRA淬灭基团修饰。

SEQ ID NO.18：5’-TGAAGGTGGAGGACATTCCTCTA-3’

SEQ ID NO.19：5’-CTGGAATTGCGATTTCTGGTAA-3’

SEQ ID NO.20：5’-CGAGAATCACCCTGCCAGACTTCCGT-3’

SEQ ID NO.21：5’-GGTTGTAGCTGTCCCAGTATTTGTC-3’

SEQ ID NO.22：5’-GGAGCTAGAACGATTCGCAGTTA-3’

SEQ ID NO.23：5’-ACAGCCTTCTGATGTTTCTAACAGGCCAGG-3’

3.动员外周血造血干细胞分离和培养

患者或健康志愿者提前6天使用普乐沙福和非格司亭进行动员，通过单采机收集外周血单核细胞。利用Miltenyi磁珠分离试剂盒富集单核细胞中CD34+的造血干细胞。具体操作步骤如下：

加入0.3mL冷DPBS重悬单核细胞沉淀，转移到15mL圆底离心管中；加入0.1mLFcRblocking reagent和0.1mL CD34 microbeads，混匀；4℃孵育30min；加入5mLDPBS混匀，300g离心5min；弃上清，0.5mLDPBS重悬细胞；MS分离柱组装到磁力板上，加0.5mL冷DPBS浸润预处理；细胞悬浮液转移到MS分离柱上，柱子上液体流干时，加入0.5mL新的冷DPBS清洗；重复该步骤两次；取下磁力板上的MS分离柱，加入1mL冷DPBS，组装好分离柱配置的注射柄，轻轻推动注射柄，使分离柱上的目的细胞被冲洗到新的15mL离心管中；300g离心5min；收集CD34+造血干细胞。纯化的造血干细胞在添加了重组人细胞因子，促血小板生成素(TPO)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(FltL)和干细胞因子(SCF)的SCGM培养基中培养24h，细胞密度控制在1-4×10⁶细胞/mL。

4.慢病毒转染

将纯化的慢病毒载体在终浓度为8μg/mL鱼精蛋白(protamine)条件下与活化后的造血干细胞孵育24h，完成病毒转导；具体操作如下：

收集体外培养预激活24小时的CD34+细胞300g离心5min去除培养基，使用2mLDPBS重悬去除激活培养基，再次离心去除DPBS，使用CD34培养基重悬细胞，将细胞浓度调整为1×10⁵/mL，加入鱼精蛋白(protamine)至终浓度8μg/mL，吸取1mL细胞混合液到24孔板中，按MOI 10-20加入病毒液并混匀在37℃，5％CO₂培养箱孵育培养24小时后，重悬收集细胞，离心去除含有病毒液的培养基，使用DPBS清洗细胞后，添加新鲜培养基继续培养。

5.效果和安全性评估

收集纯化后或培养预激活的CD34+细胞到15mL离心管，300g离心5min；弃上清，加入5mL DPBS重悬，300g离心5min；加入预热好的含2％FBS的IMDM重悬细胞，将细胞浓度调整为5000个/mL；取300μL加入到3mL甲基纤维素培养基中(1:10)，剧烈振荡充分混匀；室温静置5-10分钟，排除培养基中的气泡；用巴士滴管吸取1.1mL细胞培养基，缓慢加入到35mm培养皿中；缓慢倾斜旋转培养皿，使粘稠的培养基均匀的铺满整个培养皿；将2个接种了细胞的培养皿放入1个100mm的大培养皿中，另将一个不盖盖子的35mm培养皿也置于100mm大培养皿中，并且在不带盖子的35mm培养皿中加入3mL的无菌水，盖上100mm大培养皿的盖子，置于37℃，5％CO₂，湿度>95％的培养箱中培养14-16天；培养14-16天后，用油性笔在35mm培养皿底部横竖画3-5条线；显微镜下观察与统计单克隆生长情况。评估感染后造血干细胞的增殖活性和干性。剩余细胞在体外条件诱导其向红系分化，具体操作步骤如下：收集培养24小时的CD34+细胞，300g离心5min；弃上清，加入3mL DPBS重悬；300g离心5min，弃上清；加入CD34+细胞重悬，按照5×10⁴/mL密度接种到培养板中；隔天换液，当细胞覆盖度达到80％时，按照一比三比例进行传代。

6.病毒感染效率评估

收集病毒感染后第三天和第五天的造血干细胞，300g离心5min收集细胞，加入2mLDPBS清洗两次彻底去除培养基，加入10μL细胞裂解液，充分震荡重悬细胞，使用以下程序裂解细胞：55℃10min，95℃2min，释放细胞基因组DNA。使用“2.慢病毒包装”中的探针法荧光定量PCR通过整合载体拷贝数除以内参基因拷贝数计算得到平均载体拷贝数(VCN)。

7.HBB表达水平检测

收集体外诱导红细分化第7天的造血干细胞和安全性评估实验中第十四天的CFU样品，300g离心5min收集细胞，加入2mL DPBS清洗两次彻底去除培养基，加入100μLTrizol试剂裂解细胞，按照Trizol试剂说明提取样品总RNA。使用PrimeScriptRT reagent Kit(TAKARA，RR047Q)去除残留基因组DNA后使用Oligo dT引物进行反转录。具体操作步骤如下：向10μL反应体系中加入1μg总RNA、2μL 5×gDNAEraserBuffer和1μLgDNA Eraser，混匀后室温孵育5分钟，向上述反应液中继续加入1μLPrimeScript RT Enzyme Mix I，2μLOligo dT(20μM)，4μL的5×PrimeScript Buffer 2和3μL去离子水，混匀后简短离心去除管壁液体。使用以下程序进行反转录反应：37℃15min，85℃5s，4℃∞，将反转录完成的cDNA使用去离子水稀释一倍保存备用。使用SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix(BIORAD，1725271)进行荧光定量PCR，具体操作步骤如下：按照10μL反应体系加入5μL2×SYBR Green supermix，0.03μL的100μM正向和反向引物混合物，4μL cDNA和0.94μL去离子水配置反应液，分装到96孔荧光定量PCR板中，使用StepOnePlus Real-Time PCR System染料法标准程序进行荧光定量PCR反应。根据Ct值计算基因相对表达水平：利用目的基因Ct值减去内参基因Ct值计算ΔCt，再用各样品的ΔCt减去对照样品的ΔCt得到ΔΔCt，则目的基因的相对表达水平是2^-ΔΔCt。

其中，正向和反向引物混合物包括检测内参基因GAPDH表达水平的引物对、检测T87Q突变体HBB基因表达水平的引物对和检测野生型HBB基因表达水平的引物对。检测内参基因GAPDH表达水平的引物对的正向引物为SEQ ID NO.24所示序列，反向引物为SEQ IDNO.25所示序列；检测T87Q突变体HBB基因表达水平的引物对的正向引物为SEQ ID NO.26所示序列，反向引物为SEQ ID NO.28所示序列；检测野生型HBB基因表达水平的引物对的正向引物为SEQ ID NO.27所示序列，反向引物为SEQ ID NO.28所示序列。

SEQ ID NO.24：5’-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3’

SEQ ID NO.25：5’-CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT-3’

SEQ ID NO.26：5’-TCAAGGGCACCTTTGCCCAG-3’

SEQ ID NO.27：5’-TCAAGGGCACCTTTGCCACA-3’

SEQ ID NO.28：5’-AATTCTTTGCCAAAGTGATGGG-3’

使用HPLC检测分化样品中HBB表达情况，具体操作步骤如下：取20μL样品1600rpm离心5分钟后，加入1mL去离子水，室温裂解10分钟；裂解完成后，血红蛋白从细胞中释放，溶液呈粉红色；裂解细胞台式离心机13200rpm离心10min，取上清4℃保存备用；取50μL用于HPLC分析，使用的HPLC分析仪器为：Agilent 1260infinity II，分析柱为：4.6-mmAeris3.6-mM Widepore C4200LC Column，150×4.6mm(Phenomenex,Torrance,CA,USA)，测量波长：220nm，按照标准流程进行HPLC分析。

8.病人样品评估病毒载体有效性

为了进一步验证我们的病毒载体在病人细胞上的治疗效果，本例取一例输血依赖的重症地贫患者(CD41-42/IVS-II-654)骨髓样本分离造血干细胞，并使用本例最终确定的用于基因治疗的重组慢病毒载体的慢病毒在体外转导后，诱导其向红系前体细胞分化，检测分化过程中造血干细胞的平均VCN，并分别采用荧光定量和HPLC两种方法评估HBB蛋白的表达水平。具体操作如下：

向骨髓样品中加入等体积体积DPBS颠倒混匀，室温静置10min；向50mL离心管加入20mL淋巴细胞分离液，取20mL稀释的骨髓样品小心铺到淋巴细胞分离液表面，使用水平转子离心机500g离心20min，注意将离心机设置为：升速3，降速0；吸取位于中间的白膜层细胞，加入5倍体积的DPBS混匀，300g离心10min，弃上清，加入15mL DPBS清洗一次，300g离心10min收集单核细胞备用。按照“3.动员外周血造血干细胞分离和培养”流程利用Miltenyi磁珠分离试剂盒分选CD34+造血干细胞。按照“4.慢病毒转染”的流程对造血干细胞进行慢病毒转导，然后分别按照“5.效果和安全性评估”、“6.病毒感染效率评估”和“7.HBB表达水平检测”的流程进行细胞分化、荧光定量和HPLC检测。

二、实验结果

1.重组慢病毒载体

各载体选择不同LCR片段与HBB编码区序列组合构建。将β-球蛋白基因的基因座调控序列(LCR)(SEQ ID NO.6-11)分别与第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因序列(HBB^T87Q)(SEQ ID NO.4)组合通过一步Gibson组装反应将两个片段插入到通过限制性内切酶EcoRV和BamHI线性化的pLenti载体，本例的重组慢病毒载体结构如图1所示，六个LCR获得的七个重组慢病毒载体如图2所示。

2.慢病毒载体骨架优化：

为了确定具有最优包装和感染效率的慢病毒载体骨架，本例采用β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI101和二号内含子372bp缺失的第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因序列组装的重组慢病毒载体pLentiBGI101和采用β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI101和全长的第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因序列组装的重组慢病毒载体pLentiBGI102，分别构建了CMV和RSV嵌和启动子的慢病毒载体，评估LentiBGI101和pLentiBGI102的病毒包装滴度水平，结果如图3所示。图3中，横坐标Lenti-BGI101对应的两个柱图依序为重组慢病毒BGI101采用RSV启动子和CMV启动子的病毒包装滴度分析结果；横坐标Lenti-BGI102对应的两个柱图依序为重组慢病毒BGI102采用RSV启动子和CMV启动子的病毒包装滴度分析结果。图3的结果显示，无论是重组慢病毒BGI101，还是重组慢病毒BGI102，CMV启动子的慢病毒载体在相同转染浓度下具有更高的滴度。

使用包装的HBB慢病毒载体pLentiBGI101和pLentiBGI102进一步感染-28S突变的K562细胞系，结果如图4所示。图4中，横坐标K562-WT是指野生型K562细胞系，没有进行慢病毒载体感染的HBB基因相对表达水平；横坐标K562-28S是指-28S突变的K562细胞系的HBB基因相对表达水平；Lenti-BGI101对应的两个柱图依序为采用RSV启动子的重组慢病毒载体pLentiBGI101和CMV启动子的重组慢病毒载体pLentiBGI101感染-28S突变的K562细胞系后的HBB基因相对表达水平；Lenti-BGI102对应的两个柱图依序为采用RSV启动子的重组慢病毒载体pLentiBGI102和CMV启动子的重组慢病毒载体pLentiBGI102感染-28S突变的K562细胞系后的HBB基因相对表达水平。图4的结果显示，-28S突变体K562细胞的HBB表达水平相较野生型K562细胞有了显著下降；无论是采用RSV启动子，还是CMV启动子，本例的重组慢病毒载体感染后的-28S突变体细胞系的HBB表达水平得到恢复，甚至优于野生型K562细胞；并且，CMV启动子病毒在相同MOI条件下具有更高的表达水平。

因此可以得出结论，CMV启动子的pLentiBGI慢病毒载体具有更高的包装和目的基因表达效率。

3.造血干细胞平均整合载体拷贝数(VCN)与HBB表达水平

使用构建的慢病毒载体感染造血干细胞后，在体外接种到半固体培养基中，使其分化并形成细胞克隆，检测各克隆团的平均整合载体拷贝数(VCN)与分化过程中野生型和T87Q突变体HBB的表达水平，评估目的基因表达效率，结果如图5所示。图5中，横坐标为不同CFU克隆，纵坐标为HBB基因T87Q突变型与野生型荧光定量表达水平比例；横坐标中BGI101表示重组慢病毒BGI101的CFU克隆，横坐标中BGI103表示重组慢病毒BGI103的CFU克隆，横坐标中BGI104表示重组慢病毒BGI104的CFU克隆，横坐标中BGI105表示重组慢病毒BGI105的CFU克隆，横坐标中BGI106表示重组慢病毒BGI106的CFU克隆，横坐标中BGI107表示重组慢病毒BGI107的CFU克隆，横坐标BGI101之前的一个克隆为未进行病毒转染的阴性对照，即Ctrl。图5的结果显示相同感染条件下重组慢病毒BGI103，重组慢病毒BGI106和重组慢病毒BGI107的阳性克隆更多且T87Q比例也更高。

综合各克隆T87Q突变体mRNA的水平与平均VCN分析，结果如图6所示。图6中，横坐标BGI101表示重组慢病毒BGI101，BGI103表示重组慢病毒BGI103，BGI104表示重组慢病毒BGI104，BGI105表示重组慢病毒BGI105，BGI106表示重组慢病毒BGI106，BGI107表示重组慢病毒BGI107；纵坐标为HBB基因T87Q突变型荧光定量表达比例与VCN的比值，即各株慢病毒载体在造血干细胞CFU克隆中单位VCN表达的HBB基因T87Q突变型荧光定量比例。图6的结果显示，相同VCN条件下重组慢病毒BGI103，重组慢病毒BGI106和重组慢病毒BGI107的病毒具有更高的表达效率。

因此，对重组慢病毒BGI103、重组慢病毒BGI106和重组慢病毒BGI107的HBB基因T87Q突变型荧光定量表达比例与VCN进行相关性分析，结果如图7所示。图7中，横坐标为平均VCN值，纵坐标为HBB基因T87Q突变型荧光定量表达比例。图7的结果显示，重组慢病毒BGI103的病毒具有最理想的剂量依赖效应和最稳定的表达水平。

对重组慢病毒BGI103、重组慢病毒BGI106和重组慢病毒BGI107转导后的脐带造血干细胞进行体外诱导红系分化实验，检测诱导分化第七天样品的HBB表达水平，结果如图8所示。图8中，纵坐标为诱导分化七天的HBB相对表达量；横坐标VCN一行为相应的样品的VCN值；横坐标CB1-NC和CB2-NC表示两个不同来源脐带血样品的的阴性对照；CB1-BGI103-10和CB2-BGI103-10表示按MOI 10加入重组慢病毒BGI103的两个不同来源脐带血样品的重复试验，CB1-BGI103-20和CB2-BGI103-20表示按MOI 20加入重组慢病毒BGI103的两个不同来源脐带血样品的重复试验；CB1-BGI106-10和CB2-BGI106-10表示按MOI 10加入重组慢病毒BGI106的两个不同来源脐带血样品的重复试验，CB1-BGI106-20和CB2-BGI106-20表示按MOI 20加入重组慢病毒BGI106的两个不同来源脐带血样品的重复试验；CB1-BGI107-10和CB2-BGI107-10表示按MOI 10加入重组慢病毒BGI107的两个不同来源脐带血样品的重复试验，CB1-BGI107-20和CB2-BGI107-20表示按MOI 20加入重组慢病毒BGI107的两个不同来源脐带血样品的重复试验。图8的结果显示，重组慢病毒BGI103具有最高的表达效率，因此选择重组慢病毒BGI103的载体作为本例的基因治疗载体，即本例的重组慢病毒载体pLentiBGI103。

4.病人样品评估病毒载体有效性

荧光定量结果如图9所示，图9的纵坐标为病人骨髓造血干转导重组慢病毒载体BGI103后在体外诱导红系分化第七天时HBB基因T87Q突变型与野生型荧光定量相对表达水平，横坐标VCN一行为相应样品的VCN值，横坐标BM-Ctrl为病人骨髓造血干细胞未分化样品，BM-Ery为地贫患者骨髓造血干细胞红系分化样品，BM-BGI103-Ery为转导重组慢病毒载体BGI103的病人骨髓造血干细胞红系分化样品。图9的结果显示，转导重组慢病毒载体BGI103能够明显促进HBB基因表达。

HPLC结果如图10所示，图10为病人骨髓造血干转导重组慢病毒载体BGI103后在体外诱导红系分化第十四天HPLC峰图，CB为健康婴儿脐带血样品，PB为健康成年人外周血样品，CB CD34+为健康婴儿脐带血造血干细胞体外诱导红系分化样品，Ctrl和BGI103分别为地贫患者骨髓造血干细胞未转导和转导重组慢病毒载体BGI103后进行体外诱导红系分化样品。

β-球蛋白/α-球蛋白比值和γ-蛋白/α-球蛋白比值的统计结果如表1所示。

表1根据荧光定量结果统计的各蛋白的相对表达量

	β/α	γ/α
			CB	0.09	0.67
PB	0.79	0
			CBCD34+	0.40	0.71
PatCtrl	0	0.71
			Pat+BGI103	0.39	0.29

表1中，CB为健康婴儿脐带血样品，PB为健康成年人外周血样品，CB CD34+为健康婴儿脐带造血干细胞体外诱导红系分化样品，Pat Ctrl和Pat+BGI103分别为地贫患者骨髓造血干细胞未转导和转导重组慢病毒载体BGI103后进行体外诱导红系分化样品，表中数字为各样品HPLC结果中代表β-球蛋白与α-球蛋白以及γ-球蛋白与α-球蛋白的峰面积比值。

图9、图10和表1的结果显示，正常转导的病人骨髓样品平均VCN达到1.3，基本达到治疗所需VCN。且在体外诱导条件下，未经过病毒转导的病人造血干细胞HBB基因表达水平低于正常水平，通过慢病毒载体转导的病人造血干细胞HBB基因的表达水平有了显著提升，且增加的HBB mRNA主要来源于病毒载体所携带的T87Q突变体HBB基因。HPLC结果也显示转导前的样品分化后未能检测到β-球蛋白的峰，感染后可以观察到β-球蛋白峰显著升高，且β/α比值也达到接近健康人的水平，如表1所示。

5.病毒载体安全性评估

本例评估了采用不同LCR构建的重组慢病毒载体的安全性。为了评估病毒的安全性，本例将感染前后的造血干细胞接种在半固体培养基中进行细胞集落分析实验，结果如图11和图12所示。图11为造血干细胞转导重组慢病毒载体BGI103后在半固体培养基自发分化形成克隆形态，BM-100为地贫患者骨髓造血干细胞按照MOI 100转导重组慢病毒载体BGI103样品，CB-20、50和100为健康婴儿脐带血造血干细胞分别按照MOI 20、50和100转导重组慢病毒载体BGI103样品。图12为健康婴儿脐带血造血干细胞按照MOI 20分别转导重组慢病毒载体pLentiBGI101、重组慢病毒载体pLentiBGI102、重组慢病毒载体pLentiBGI103、重组慢病毒载体pLentiBGI104、重组慢病毒载体pLentiBGI105、重组慢病毒载体pLentiBGI106、重组慢病毒载体pLentiBGI107后分化形成各克隆团的数量和所占比例，各柱图中由上至下依序为CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM和CFU-GM，CFU-E为红细胞集落形成单位，BFU-E为爆式红细胞集落形成单位，CFU-GEMM为粒细胞-红细胞-巨噬细胞-巨核细胞集落形成单位，CFU-GM为含有超过40个以上粒细胞和巨噬细胞的集落，图中NC为没有转导重组慢病毒载体的阴性对照。

图11和图12的结果显示，病毒感染后的造血干细胞无论是克隆形态，还是各种不同克隆的数量和比例都没有显著变化，表明本例的重组慢病毒载体BGI103不会影响造血干细胞的分化潜能，是一种安全的基因治疗载体。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 治疗β-球蛋白功能缺失的重组慢病毒载体及制备方法和应用

<130> 19I29050

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 181

<212> DNA

<213> 左侧慢病毒长末端重复序列

<400> 1

gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60

ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 120

tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 180

a 181

<210> 2

<211> 234

<212> DNA

<213> 慢病毒逆响应元件

<400> 2

aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat 60

gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 120

gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180

gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcct 234

<210> 3

<211> 117

<212> DNA

<213> 中心多嘌呤序列

<400> 3

ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60

agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaattca aaatttt 117

<210> 4

<211> 2206

<212> DNA

<213> 第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因

<400> 4

tacacttgca aaggaggatg tttttagtag caatttgtac tgatggtatg gggccaagag 60

atatatctta gagggagggc tgagggtttg aagtccaact cctaagccag tgccagaaga 120

gccaaggaca ggtacggctg tcatcactta gacctcaccc tgtggagcca caccctaggg 180

ttggccaatc tactcccagg agcagggagg gcaggagcca gggctgggca taaaagtcag 240

ggcagagcca tctattgctt acatttgctt ctgacacaac tgtgttcact agcaacctca 300

aacagacacc atggtgcatc tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg 360

caaggtgaac gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc aggttggtat caaggttaca 420

agacaggttt aaggagacca atagaaactg ggcatgtgga gacagagaag actcttgggt 480

ttctgatagg cactgactct ctctgcctat tggtctattt tcccaccctt aggctgctgg 540

tggtctaccc ttggacccag aggttctttg agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg 600

ctgttatggg caaccctaag gtgaaggctc atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg 660

atggcctggc tcacctggac aacctcaagg gcacctttgc ccagctgagt gagctgcact 720

gtgacaagct gcacgtggat cctgagaact tcagggtgag tctatgggac gcttgatgtt 780

ttctttcccc ttcttttcta tggttaagtt catgtcatag gaaggggata agtaacaggg 840

tacagtttag aatgggaaac agacgaatga ttgcatcagt gtggaagtct caggatcgtt 900

ttagtttctt ttatttgctg ttcataacaa ttgttttctt ttgtttaatt cttgctttct 960

ttttttttct tctccgcaat ttttactatt atacttaatg ccttaacatt gtgtataaca 1020

aaaggaaata tctctgagat acattaagta acttaaaaaa aaactttaca cagtctgcct 1080

agtacattac tatttggaat atatgtgtgc ttatttgcat attcataatc tccctacttt 1140

attttctttt atttttaatt gatacataat cattatacat atttatgggt taaagtgtaa 1200

tgttttaata tgtgtacaca tattgaccaa atcagggtaa ttttgcattt gtaattttaa 1260

aaaatgcttt cttcttttaa tatacttttt tgtttatctt atttctaata ctttccctaa 1320

tctctttctt tcagggcaat aatgatacaa tgtatcatgc ctctttgcac cattctaaag 1380

aataacagtg ataatttctg ggttaaggca atagcaatat ctctgcatat aaatatttct 1440

gcatataaat tgtaactgat gtaagaggtt tcatattgct aatagcagct acaatccagc 1500

taccattctg cttttatttt atggttggga taaggctgga ttattctgag tccaagctag 1560

gcccttttgc taatcatgtt catacctctt atcttcctcc cacagctcct gggcaacgtg 1620

ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc aaagaattca ccccaccagt gcaggctgcc 1680

tatcagaaag tggtggctgg tgtggctaat gccctggccc acaagtatca ctaagctcgc 1740

tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc ctaagtccaa ctactaaact 1800

gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc taataaaaaa catttatttt 1860

cattgcaatg atgtatttaa attatttctg aatattttac taaaaaggga atgtgggagg 1920

tcagtgcatt taaaacataa agaaatgaag agctagttca aaccttggga aaatacacta 1980

tatcttaaac tccatgaaag aaggtgaggc tgcaaacagc taatgcacat tggcaacagc 2040

ccctgatgca tatgccttat tcatccctca gaaaaggatt caagtagagg cttgatttgg 2100

aggttaaagt tttgctatgc tgtattttac attacttatt gttttagctg tcctcatgaa 2160

tgtcttttca ctacccattt gcttatcctg catctctcag ccttga 2206

<210> 5

<211> 234

<212> DNA

<213> 右侧慢病毒长末端重复序列

<400> 5

tggaagggct aattcactcc caacgaagat aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 120

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agca 234

<210> 6

<211> 2962

<212> DNA

<213> β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI101

<400> 6

gaggcctcaa gatgataact tttattttct ggacttgtaa tagctttctc ttgtattcac 60

catgttgtaa ctttcttaga gtagtaacaa tataaagtta ttgtgagttt ttgcaaacac 120

agcaaacaca acgacccata tagacattga tgtgaaattg tctattgtca atttatggga 180

aaacaagtat gtactttttc tactaagcca ttgaaacagg aataacagaa caagattgaa 240

agaatacatt ttccgaaatt acttgagtat tatacaaaga caagcacgtg gacctgggag 300

gagggttatt gtccatgact ggtgtgtgga gacaaatgca ggtttataat agatgggatg 360

gcatctagcg caatgacttt gccatcactt ttagagagct cttggggacc ccagtacaca 420

agaggggacg cagggtatat gtagacatct cattcttttt cttagtgtga gaataagaat 480

agccatgacc tgagtttata gacaatgagc ccttttctct ctcccactca gcagctatga 540

gatggcttgc cctgcctctc tactaggctg actcactcca aggcccagca atgggcaggg 600

ctctgtcagg gctttgatag cactatctgc agagccaggg ccgagaaggg gtggactcca 660

gagactctcc ctcccattcc cgagcagggt ttgcttattt atgcatttaa atgatatatt 720

tattttaaaa gaaataacag gagactgccc agccctggct gtgacatgga aactatgtag 780

aatattttgg gttccatttt tttttccttc tttcagttag aggaaaaggg gctcactgca 840

catacactag acagaaagtc aggagctttg aatccaagcc tgatcatttc catgtcatac 900

tgagaaagtc cccacccttc tctgagcctc agtttctctt tttataagta ggagtctgga 960

gtaaatgatt tccaatggct ctcatttcaa tacaaaattt ccgtttatta aatgcatgag 1020

cttctgttac tccaagactg agaaggaaat tgaacctgag actcattgac tggcaagatg 1080

tccccagagg ctctcattca gcaataaaat tctcaccttc acccaggccc actgagtgtc 1140

agatttgcat gcactagagc tcagaagagt caagcatttg cctaaggtcg gacatgtcag 1200

aggcagtgcc agacctatgt gagactctgc agctactgct catgggccct gtgctgcact 1260

gatgaggagg atcagatgga tggggcaatg aagcaaagga atcattctgt ggataaagga 1320

gacagccatg aagaagtcta tgactgtaaa tttgggagca ggagtctcta aggacttgga 1380

tttcaaggaa ttttgactca gcaaacacaa gaccctcacg gtgactttgc gagctggtgt 1440

gccagatgtg tctatcagag gttccaggga gggtggggtg gggtcagggc tggccaccag 1500

ctatcagggc ccagatgggt tataggctgg caggctcaga taggtggtta ggtcaggttg 1560

gtggtgctgg gtggagtcca tgactcccag gagccaggag agatagacca tgagtagagg 1620

gcagacatgg gaaaggtggg ggaggcacag catagcagca tttttcattc tactactaca 1680

tgggactgct cccctatacc cccagctagg ggcaagtgcc ttgactccta tgttttcagg 1740

atcatcatct ataaagtaag agtaataatt gtgtctatct catagggtta ttatgaggat 1800

caaaggagat gcacactctc tggaccagtg gcctaacagt tcaggacaga gctatgggct 1860

tcctatgtat gggtcagtgg tctcaatgta gcaggcaagt tccagaagat agcatcaacc 1920

actgttagag atatactgcc agtctcagag cctgatgtta atttagcaat gggctgggac 1980

cctcctccag tagaaccttc taaccagctg cgggaggcgg aggttgcagt gagctgagat 2040

cgtgccactg cactccagcc tgggggacag agcacattat aattaactgt tattttttac 2100

ttggactctt gtggggaata agatacatgt tttattctta tttatgattc aagcactgaa 2160

aatagtgttt agcatccagc aggtgcttca aaaccatttg ctgaatgatt actatacttt 2220

ttacaagctc agctccctct atcccttcca gcatcctcat ctctgattaa ataagcttca 2280

gtttttcctt agttcctgtt acatttctgt gtgtctccat tagtgacctc ccatagtcca 2340

agcatgagca gttctggcca ggcccctgtc ggggtcagtg ccccaccccc gccttctggt 2400

tctgtgtaac cttctaagca aaccttctgg ctcaagcaca gcaatgctga gtcatgatga 2460

gtcatgctga ggcttagggt gtgtgcccag atgttctcag cctagagtga tgactcctat 2520

ctgggtcccc agcaggatgc ttacagggca gatggcaaaa aaaaggagaa gctgaccacc 2580

tgactaaaac tccacctcaa acggcatcat aaagaaaatg gatgcctgag acagaatgtg 2640

acatattcta gaatatatta tttcctgaat atatatatat atatacacat atacgtatat 2700

atatatatat atatatattt gttgttatca attgccatag aatgattagt tattgtgaat 2760

caaatattta tcttgcaggt ggcctctata cctagaagcg gcagaatcag gctttattaa 2820

tacatgtgta tagattttta ggatctatac acatgtatta atatgaaaca aggatatgga 2880

agaggaaggc atgaaaacag gaaaagaaaa caaaccttgt ttgccatttt aaggcacccc 2940

tggacagcta ggtggcaaaa gg 2962

<210> 7

<211> 2651

<212> DNA

<213> β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI103

<400> 7

gaggcctcaa gatgataact tttattttct ggacttgtaa tagctttctc ttgtattcac 60

catgttgtaa ctttcttaga gtagtaacaa tataaagtta ttgtgagttt ttgcaaacac 120

agcaaacaca acgacccata tagacattga tgtgaaattg tctattgtca atttatggga 180

aaacaagtat gtactttttc tactaagcca ttgaaacagg aataacagaa caagattgaa 240

agaatacatt ttccgaaatt acttgagtat tatacaaaga caagcacgtg gacctgggag 300

gagggttatt gtccatgact ggtgtgtgga gacaaatgca ggtttataat agatgggatg 360

gcatctagcg caatgacttt gccatcactt ttagagagct cttggggacc ccagtacaca 420

agaggggacg cagggtatat gtagacatct cattcttttt cttagtgtga gaataagaat 480

agccatgacc tgagtttata gacaatgagc ccttttctct ctcccactca gcagctatga 540

gatggcttgc cctgcctctc tactaggctg actcactcca aggcccagca atgggcaggg 600

ctctgtcagg gctttgatag cactatctgc agagccaggg ccgagaaggg gtggactcca 660

gagactctcc ctcccattcc cgagcagggt ttgcttattt atgcatttaa atgatatatt 720

tattttaaaa gaaataacag gagactgccc agccctggct gtgacatgga aactatgtag 780

aatattttgg gttccatttt tttttccttc tttcagttag aggaaaaggg gctcactgca 840

catacactag acagaaagtc aggagctttg aatccaagcc tgatcatttc catgtcatac 900

tgagaaagtc cccacccttc tctgagcctc agtttctctt tttataagta ggagtctgga 960

gtaaatgatt tccaatggct ctcatttcaa tacaaaattt ccgtttatta aatgcatgag 1020

cttctgttac tccaagactg agaaggaaat tgaacctgag actcattgac tggcaagatg 1080

tccccagagg ctctcattca gcaataaaat tctcaccttc acccaggccc actgagtgtc 1140

agatttgcat gcactagagc tcagaagagt caagcatttg cctaaggtcg gacatgtcag 1200

aggcagtgcc agacctatgt gagactctgc agctactgct catgggccct gtgctgcact 1260

gatgaggagg atcagatgga tggggcaatg aagcaaagga atcattctgt ggataaagga 1320

gacagccatg aagaagtcta tgactgtaaa tttgggagca ggagtctcta aggacttgga 1380

tttcaaggaa ttttgactca gcaaacacaa gaccctcacg gtgactttgc gagctggtgt 1440

gccagatgtg tctatcagag gttccaggga gggtggggtg gggtcagggc tggccaccag 1500

ctatcagggc ccagatgggt tataggctgg caggctcaga taggtggtta ggtcaggttg 1560

gtggtgctgg gtggagtcca tgactcccag gagccaggag agatagacca tgagtagagg 1620

gcagacatgg gaaaggtggg ggaggcacag catagcagca tttttcattc tactactaca 1680

tgggactgct cccctatacc cccagctagg ggcaagtgcc ttgactccta tgttttcagg 1740

atcatcatct ataaagtaag agtaataatt gtgtctatct catagggtta ttatgaggat 1800

caaaggagat gcacactctc tggaccagtg gcctaacagt tcaggacaga gctatgggct 1860

tcctatgtat gggtcagtgg tctcaatgta gcaggcaagt tccagaagat agcatcaacc 1920

actgttagag atatactgcc agtctcagag cctgatgtta atttagcaat gggctgggac 1980

cctcctccag tagaaccttc taaccagctg cgggaggcgg aggttgcagt gagctgagat 2040

cgtgccactg cactccagcc tgggggacag agcacattat aattaactgt tattttttac 2100

ttggactctt gtggggaata agatacatgt tttattctta tttatgattc aagcactgaa 2160

aatagtgttt agcatccagc aggtgcttca aaaccatttg ctgaatgatt actatacttt 2220

ttacaagctc agctccctct atcccttcca gcatcctcat ctctgattaa ataagcttca 2280

gtttttcctt agttcctgtt acatttctgt gtgtctccat tagtgacctc ccatagtcca 2340

agcatgagca gttctggcca ggcccctgtc ggggtcagtg ccccaccccc gccttctggt 2400

tctgtgtaac cttctaagca aaccttctgg ctcaagcaca gcaatgctga gtcatgatga 2460

gtcatgctga ggcttagggt gtgtgcccag atgttctcag cctagagtga tgactcctat 2520

ctgggtcccc agcaggatgc ttacagggca gatggcaaaa aaaaggagaa gctgaccacc 2580

tgactaaaac tccacctcaa acggcatcat aaagaaaatg gatgcctgag acagaatgtg 2640

acatattcta g 2651

<210> 8

<211> 3900

<212> DNA

<213> β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI104

<400> 8

aggatccctt gagctcagga ggtcaaggct gcagtgagac atgatcttgc cactgcactc 60

cagcctggac agcagagtga aaccttgcct cacgaaacag aatacaaaaa caaacaaaca 120

aaaaactgct ccgcaatgcg cttccttgat gctctaccac ataggtctgg gtactttgta 180

cacattatct cattgctgtt cataattgtt agattaattt tgtaatattg atattattcc 240

tagaaagctg aggcctcaag atgataactt ttattttctg gacttgtaat agctttctct 300

tgtattcacc atgttgtaac tttcttagag tagtaacaat ataaagttat tgtgagtttt 360

tgcaaacaca gcaaacacaa cgacccatat agacattgat gtgaaattgt ctattgtcaa 420

tttatgggaa aacaagtatg tactttttct actaagccat tgaaacagga ataacagaac 480

aagattgaaa gaatacattt tccgaaatta cttgagtatt atacaaagac aagcacgtgg 540

acctgggagg agggttattg tccatgactg gtgtgtggag acaaatgcag gtttataata 600

gatgggatgg catctagcgc aatgactttg ccatcacttt tagagagctc ttggggaccc 660

cagtacacaa gaggggacgc agggtatatg tagacatctc attctttttc ttagtgtgag 720

aataagaata gccatgacct gagtttatag acaatgagcc cttttctctc tcccactcag 780

cagctatgag atggcttgcc ctgcctctct actaggctga ctcactccaa ggcccagcaa 840

tgggcagggc tctgtcaggg ctttgatagc actatctgca gagccagggc cgagaagggg 900

tggactccag agactctccc tcccattccc gagcagggtt tgcttattta tgcatttaaa 960

tgatatattt attttaaaag aaataacagg agactgccca gccctggctg tgacatggaa 1020

actatgtaga atattttggg ttccattttt ttttccttct ttcagttaga ggaaaagggg 1080

ctcactgcac atacactaga cagaaagtca ggagctttga atccaagcct gatcatttcc 1140

atgtcatact gagaaagtcc ccacccttct ctgagcctca gtttctcttt ttataagtag 1200

gagtctggag taaatgattt ccaatggctc tcatttcaat acaaaatttc cgtttattaa 1260

atgcatgagc ttctgttact ccaagactga gaaggaaatt gaacctgaga ctcattgact 1320

ggcaagatgt ccccagaggc tctcattcag caataaaatt ctcaccttca cccaggccca 1380

ctgagtgtca gatttgcatg cactagggat ccacttgccc agtgttcttc cttagttcct 1440

accttcgacc ttgatcctcc tttatcttcc tgaaccctgc tgagatgatc tatgtgggga 1500

gaatggcttc tttgagaaac atcttcttcg ttagtggcct gcccctcatt cccactttaa 1560

tatccagaat cactataaga agaatataat aagaggaata actcttatta taggtaaggg 1620

aaaattaaga ggcatacgtg atgggatgag taagagagga gagggaagga ttaatggacg 1680

ataaaatcta ctactatttg ttgagacctt ttatagtcta atcaattttg ctattgtttt 1740

ccatcctcac gctaactcca taaaaaaaca ctattattat ctttattttg ccatgacaag 1800

actgagctca gaagagtcaa gcatttgcct aaggtcggac atgtcagagg cagtgccaga 1860

cctatgtgag actctgcagc tactgctcat gggccctgtg ctgcactgat gaggaggatc 1920

agatggatgg ggcaatgaag caaaggaatc attctgtgga taaaggagac agccatgaag 1980

aagtctatga ctgtaaattt gggagcagga gtctctaagg acttggattt caaggaattt 2040

tgactcagca aacacaagac cctcacggtg actttgcgag ctggtgtgcc agatgtgtct 2100

atcagaggtt ccagggaggg tggggtgggg tcagggctgg ccaccagcta tcagggccca 2160

gatgggttat aggctggcag gctcagatag gtggttaggt caggttggtg gtgctgggtg 2220

gagtccatga ctcccaggag ccaggagaga tagaccatga gtagagggca gacatgggaa 2280

aggtggggga ggcacagcat agcagcattt ttcattctac tactacatgg gactgctccc 2340

ctataccccc agctaggggc aagtgccttg actcctatgt tttcaggatc atcatctata 2400

aagtaagagt aataattgtg tctatctcat agggttatta tgaggatcaa aggagatgca 2460

cactctctgg accagtggcc taacagttca ggacagagct atgggcttcc tatgtatggg 2520

tcagtggtct caatgtagca ggcaagttcc agaagatagc atcaaccact gttagagata 2580

tactgccagt ctcagagcct gatgttaatt tagcaatggg ctgggaccct cctccagtag 2640

aaccttctaa ccagctgctg cagtcaaagt cgaatgcagc tggttagact ttttttaatg 2700

agaaaatctg ggcatggtgt ctcacacctg taatcccagc actttgggag gctgaggtgg 2760

gtggactgct tggagctcag gagttcaaga ccatcttgga caacatggtg ataccctgcc 2820

tctacaaaaa gtacaaaaat tagcctggca tggtggtgtg cacctgtaat cccagctatt 2880

agggtggctg aggcaggaga attgcttgaa cccgggaggc ggaggttgca gtgagctgag 2940

atcgtgccac tgcactccag cctgggggac agagcacatt ataattaact gttatttttt 3000

acttggactc ttgtggggaa taagatacat gttttattct tatttatgat tcaagcactg 3060

aaaatagtgt ttagcatcca gcaggtgctt caaaaccatt tgctgaatga ttactatact 3120

ttttacaagc tcagctccct ctatcccttc cagcatcctc atctctgatt aaataagctt 3180

cagtttttcc ttagttcctg ttacatttct gtgtgtctcc attagtgacc tcccatagtc 3240

caagcatgag cagttctggc caggcccctg tcggggtcag tgccccaccc ccgccttctg 3300

gttctgtgta accttctaag caaaccttct ggctcaagca cagcaatgct gagtcatgat 3360

gagtcatgct gaggcttagg gtgtgtgccc agatgttctc agcctagagt gatgactcct 3420

atctgggtcc ccagcaggat gcttacaggg cagatggcaa aaaaaaggag aagctgacca 3480

cctgactaaa actccacctc aaacggcatc ataaagaaaa tggatgcctg agacagaatg 3540

tgacatattc tagaatatat tatttcctga atatatatat atatatacac atatacgtat 3600

atatatatat atatatatat ttgttgttat caattgccat agaatgatta gttattgtga 3660

atcaaatatt tatcttgcag gtggcctcta tacctagaag cggcagaatc aggctttatt 3720

aatacatgtg tatagatttt taggatctat acacatgtat taatatgaaa caaggatatg 3780

gaagaggaag gcatgaaaac aggaaaagaa aacaaacctt gtttgccatt ttaaggcacc 3840

cctggacagc taggtggcaa aaggcctgtg ctgttagagg acacatgctc acatacgggg 3900

<210> 9

<211> 1852

<212> DNA

<213> β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI105

<400> 9

gtggacctgg gaggagggtt attgtccatg actggtgtgt ggagacaaat gcaggtttat 60

aatagatggg atggcatcta gcgcaatgac tttgccatca cttttagaga gctcttgggg 120

accccagtac acaagagggg acgcagggta tatgtagaca tctcattctt tttcttagtg 180

tgagaataag aatagccatg acctgagttt atagacaatg agcccttttc tctctcccac 240

tcagcagcta tgagatggct tgccctgcct ctctactagg ctgactcact ccaaggccca 300

gcaatgggca gggctctgtc agggctttga tagcactatc tgcagagcca gggccgagaa 360

ggggtggact ccagagactc tccctcccat tcccgagcag ggtttgctta tttatgcatt 420

taaatgatat atttatttta aaagaaataa caggagactg cccagccctg gctgtgacat 480

ggaaactatg tagaatattt tgggttccat ttttttttcc ttctttcagt tagaggaaaa 540

ggggctcact gcacatacac tagacagaaa gtcaggagct ttgaatccaa gcctgatcat 600

ttccatgtca tactgagaaa gtccccaccc ttctctgagc ctcagtttct ctttttataa 660

gtaggagtct ggagtaaatg atttccaatg gctctcattt caatacaaaa tttccgttta 720

ttaaatgcat gagctaagac tgagctcaga agagtcaagc atttgcctaa ggtcggacat 780

gtcagaggca gtgccagacc tatgtgagac tctgcagcta ctgctcatgg gccctgtgct 840

gcactgatga ggaggatcag atggatgggg caatgaagca aaggaatcat tctgtggata 900

aaggagacag ccatgaagaa gtctatgact gtaaatttgg gagcaggagt ctctaaggac 960

ttggatttca aggaattttg actcagcaaa cacaagaccc tcacggtgac tttgcgagct 1020

ggtgtgccag atgtgtctat cagaggttcc agggagggtg gggtggggtc agggctggcc 1080

accagctatc agggcccaga tgggttatag gctggcaggc tcagataggt ggttaggtca 1140

ggttggtggt gctgggtgga gtccatgact cccaggagcc aggagagata gaccatgagt 1200

agagggcaga catgggaaag gtgggggagg cacagcatag cagcattttt cattctacta 1260

ctacatggga ctgctcccct atacccccag ctaggggcaa gtgccttgac tcctatgttt 1320

tcaggatcat catctataaa gtaagagtaa taattgtgtc tatctcatag ggttattatg 1380

aggctgaatg attactatac tttttacaag ctcagctccc tctatccctt ccagcatcct 1440

catctctgat taaataagct tcagtttttc cttagttcct gttacatttc tgtgtgtctc 1500

cattagtgac ctcccatagt ccaagcatga gcagttctgg ccaggcccct gtcggggtca 1560

gtgccccacc cccgccttct ggttctgtgt aaccttctaa gcaaaccttc tggctcaagc 1620

acagcaatgc tgagtcatga tgagtcatgc tgaggcttag ggtgtgtgcc cagatgttct 1680

cagcctagag tgatgactcc tatctgggtc cccagcagga tgcttacagg gcagatggca 1740

aaaaaaagga gaagctgacc acctgactaa aactccacct caaacggcat cataaagaaa 1800

atggatgcct gagacagaat gtgacatatt ctagaatata ttatttcctg aa 1852

<210> 10

<211> 3225

<212> DNA

<213> β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI106

<400> 10

aggatccctt gagctcagga ggtcaaggct gcagtgagac atgatcttgc cactgcactc 60

cagcctggac agcagagtga aaccttgcct cacgaaacag aatacaaaaa caaacaaaca 120

aaaaactgct ccgcaatgcg cttccttgat gctctaccac ataggtctgg gtactttgta 180

cacattatct cattgctgtt cataattgtt agattaattt tgtaatattg atattattcc 240

tagaaagctg aggcctcaag atgataactt ttattttctg gacttgtaat agctttctct 300

tgtattcacc atgttgtaac tttcttagag tagtaacaat ataaagttat tgtgagtttt 360

tgcaaacaca gcaaacacaa cgacccatat agacattgat gtgaaattgt ctattgtcaa 420

tttatgggaa aacaagtatg tactttttct actaagccat tgaaacagga ataacagaac 480

aagattgaaa gaatacattt tccgaaatta cttgagtatt atacaaagac aagcacgtgg 540

acctgggagg agggttattg tccatgactg gtgtgtggag acaaatgcag gtttataata 600

gatgggatgg catctagcgc aatgactttg ccatcacttt tagagagctc ttggggaccc 660

cagtacacaa gaggggacgc agggtatatg tagacatctc attctttttc ttagtgtgag 720

aataagaata gccatgacct gagtttatag acaatgagcc cttttctctc tcccactcag 780

cagctatgag atggcttgcc ctgcctctct actaggctga ctcactccaa ggcccagcaa 840

tgggcagggc tctgtcaggg ctttgatagc actatctgca gagccagggc cgagaagggg 900

tggactccag agactctccc tcccattccc gagcagggtt tgcttattta tgcatttaaa 960

tgatatattt attttaaaag aaataacagg agactgccca gccctggctg tgacatggaa 1020

actatgtaga atattttggg ttccattttt ttttccttct ttcagttaga ggaaaaggga 1080

tccacttgcc cagtgttctt ccttagttcc taccttcgac cttgatcctc ctttatcttc 1140

ctgaaccctg ctgagatgat ctatgtgggg agaatggctt ctttgagaaa catcttcttc 1200

gttagtggcc tgcccctcat tcccacttta atatccagaa tcactataag aagaatataa 1260

taagaggaat aactcttatt ataggtaagg gaaaattaag aggcatacgt gatgggatga 1320

gtaagagagg agagggaagg attaatggac gataaaatct actactattt gttgagacct 1380

tttatagtct aatcaatttt gctattgttt tccatcctca cgctaactcc ataaaaaaac 1440

actattatta tctttatttt gccatgacaa gactgagctc agaagagtca agcatttgcc 1500

taaggtcgga catgtcagag gcagtgccag acctatgtga gactctgcag ctactgctca 1560

tgggccctgt gctgcactga tgaggaggat cagatggatg gggcaatgaa gcaaaggaat 1620

cattctgtgg ataaaggaga cagccatgaa gaagtctatg actgtaaatt tgggagcagg 1680

agtctctaag gacttggatt tcaaggaatt ttgactcagc aaacacaaga ccctcacggt 1740

gactttgcga gctggtgtgc cagatgtgtc tatcagaggt tccagggagg gtggggtggg 1800

gtcagggctg gccaccagct atcagggccc agatgggtta taggctggca ggctcagata 1860

ggtggttagg tcaggttggt ggtgctgggt ggagtccatg actcccagga gccaggagag 1920

atagaccatg agtagagggc agacatggga aaggtggggg aggcacagca tagcagcatt 1980

tttcattcta ctactacatg ggactgctcc cctatacccc cagctagggg caagtgcctt 2040

gactcctatg ttttcaggat catcatctat aaagtaagag taataattgt gtctatctca 2100

tagggttatt atgaggatca aaggagatgc acactctctg gaccagtggc ctaacagttc 2160

aggacagagc tatgggcttc ctatgtatgg gtcagtggtc tcaatgtagc aggcaagttc 2220

cagaagatag catcaaccac tgttagagat atactgccag tctcagagcc tgatgttaat 2280

ttagcaatgg gctgggaccc tcctccagta gaaccttcta accagctgct gcagtcaaag 2340

tcgaatgcag ctggttagac tttttttaat gatttgggag gctgaggtgg gtggactgct 2400

tggagctcag gagttcaaga ccatcttgga caacatggtg ataccctgcc tctacaaaaa 2460

gtacaaaaat tagcctggca tggtggtgtg cacctgtaat cccagctatt agggtggctg 2520

aggcaggaga attgcttgaa cccgggaggc ggaggttgca gtgagctgag atcgtgccac 2580

tgcactccag cctgggggac agagcacatt ataattaact gttatttttt acttggactc 2640

ttgtggggaa taagatacat gttttattct tatttatgat tcaagcactg aaaatagtgt 2700

ttagcatcca gcaggtgctt caaaaccatt tgctgaatga ttactatact ttttacaagc 2760

tcagctccct ctatcccttc cagcatcctc atctctgatt aaataagctt cagtttttcc 2820

ttagttcctg ttacatttct gtgtgtctcc attagtgacc tcccatagtc caagcatgag 2880

cagttctggc caggcccctg tcggggtcag tgccccaccc ccgccttctg gttctgtgta 2940

accttctaag caaaccttct ggctcaagca cagcaatgct gagtcatgat gagtcatgct 3000

gaggcttagg gtgtgtgccc agatgttctc agcctagagt gatgactcct atctgggtcc 3060

ccagcaggat gcttacaggg cagatggcaa aaaaaaggag aagctgacca cctgactaaa 3120

actccacctc aaacggcatc ataaagaaaa tggatgcctg agacagaatg tgacatattc 3180

tagaatatat tatttcctga atatatatat atatatacac atata 3225

<210> 11

<211> 3416

<212> DNA

<213> β-球蛋白基因的基因座调控序列BGI107

<400> 11

attcctagaa agctgaggcc tcaagatgat aacttttatt ttctggactt gtaatagctt 60

tctcttgtat tcaccatgtt gtaactttct tagagtagta acaatataaa gttattgtga 120

gtttttgcaa acacagcaaa cacaacgacc catatagaca ttgatgtgaa attgtctatt 180

gtcaatttat gggaaaacaa gtatgtactt tttctactaa gccattgaaa caggaataac 240

agaacaagat tgaaagaata cattttccga aattacttga gtattataca aagacaagca 300

cgtggacctg ggaggagggt tattgtccat gactggtgtg tggagacaaa tgcaggttta 360

taatagatgg gatggcatct agcgcaatga ctttgccatc acttttagag agctcttggg 420

gaccccagta cacaagaggg gacgcagggt atatgtagac atctcattct ttttcttagt 480

gtgagaataa gaatagccat gacctgagtt tatagacaat gagccctttt ctctctccca 540

ctcagcagct atgagatggc ttgccctgcc tctctactag gctgactcac tccaaggccc 600

agcaatgggc agggctctgt cagggctttg atagcactat ctgcagagcc agggccgaga 660

aggggtggac tccagagact ctccctccca ttcccgagca gggtttgctt atttatgcat 720

ttaaatgata tatttatttt aaaagaaata acaggagact gcccagccct ggctgtgaca 780

tggaaactat gtagaatatt ttgggttcca tttttttttc cttctttcag ttagaggaaa 840

aggggctcac tgcacataca ctagacagaa agtcaggagc tttgaatcca agcctgatca 900

tttccatgtc atactgagaa agtccccacc cttctctgag cctcagtttc tctttttata 960

agtaggagtc tggagtaaat gatttccaat ggctctcatt tcaacctgaa ccctgctgag 1020

atgatctatg tggggagaat ggcttctttg agaaacatct tcttcgttag tggcctgccc 1080

ctcattccca ctttaatatc cagaatcact ataagaagaa tataataaga ggaataactc 1140

ttattatagg taagggaaaa ttaagaggca tacgtgatgg gatgagtaag agaggagagg 1200

gaaggattaa tggacgataa aatctactac tatttgttga gaccttttat agtctaatca 1260

attttgctat tgttttccat cctcacgcta actccataaa aaaacactat tattatcttt 1320

attttgccat gacaagactg agctcagaag agtcaagcat ttgcctaagg tcggacatgt 1380

cagaggcagt gccagaccta tgtgagactc tgcagctact gctcatgggc cctgtgctgc 1440

actgatgagg aggatcagat ggatggggca atgaagcaaa ggaatcattc tgtggataaa 1500

ggagacagcc atgaagaagt ctatgactgt aaatttggga gcaggagtct ctaaggactt 1560

ggatttcaag gaattttgac tcagcaaaca caagaccctc acggtgactt tgcgagctgg 1620

tgtgccagat gtgtctatca gaggttccag ggagggtggg gtggggtcag ggctggccac 1680

cagctatcag ggcccagatg ggttataggc tggcaggctc agataggtgg ttaggtcagg 1740

ttggtggtgc tgggtggagt ccatgactcc caggagccag gagagataga ccatgagtag 1800

agggcagaca tgggaaaggt gggggaggca cagcatagca gcatttttca ttctactact 1860

acatgggact gctcccctat acccccagct aggggcaagt gccttgactc ctatgttttc 1920

aggatcatca tctataaagt aagagtaata attgtgtcta tctcataggg ttattatgag 1980

gatcaaagga gatgcacact ctctggacca gtggcctaac agttcaggac agagctatgg 2040

gcttcctatg tatgggtcag tggtctcaat gtagcaggca agttccagaa gatagcatca 2100

accactgtta gagatatact gccagtctca gagcctgatg ttaatttagc aatgggctgg 2160

gaccctcctc cagtagaacc ttctaaccag ctgctgcagt caaagtcgaa tgcagctgaa 2220

aatctgggca tggtgtctca cacctgtaat cccagcactt tgggaggctg aggtgggtgg 2280

actgcttgga gctcaggagt tcaagaccat cttggacaac atggtgatac cctgcctcta 2340

caaaaagtac aaaaattagc ctggcatggt ggtgtgcacc tgtaatccca gctattaggg 2400

tggctgaggc aggagaattg cttgaacccg ggaggcggag gttgcagtga gctgagatcg 2460

tgccactgca ctccagcctg ggggacagag cacattataa ttaactgtta ttttttactt 2520

ggactcttgt ggggaataag atacatgttt tattcttatt tatgattcaa gcactgaaaa 2580

tagtgtttag catccagcag gtgcttcaaa accatttgct gaatgattac tatacttttt 2640

acaagctcag ctccctctat cccttccagc atcctcatct ctgattaaat aagcttcagt 2700

ttttccttag ttcctgttac atttctgtgt gtctccatta gtgacctccc atagtccaag 2760

catgagcagt tctggccagg cccctgtcgg ggtcagtgcc ccacccccgc cttctggttc 2820

tgtgtaacct tctaagcaaa ccttctggct caagcacagc aatgctgagt catgatgagt 2880

catgctgagg cttagggtgt gtgcccagat gttctcagcc tagagtgatg actcctatct 2940

gggtccccag caggatgctt acagggcaga tggcaaaaaa aaggagaagc tgaccacctg 3000

actaaaactc cacctcaaac ggcatcataa agaaaatgga tgcctgagac agaatgtgac 3060

atattctaga atatattatt tcctgaatat atatatatat atacacatat acgtatatat 3120

atatatatat atatatttgt tgttatcaat tgccatagaa tgattagtta ttgtgaatca 3180

aatatttatc ttgcaggtgg cctctatacc tagaagcggc agaatcaggc tttattaata 3240

catgtgtata gatttttagg atctatacac atgtattaat atgaaacaag gatatggaag 3300

aggaaggcat gaaaacagga aaagaaaaca aaccttgttt gccattttaa ggcacccctg 3360

gacagctagg tggcaaaagg cctgtgctgt tagaggacac atgctcacat acgggg 3416

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cttaaaggta ccctcgagat atctccgcag tgtcttgcgt ctc 43

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggatccgaat tcgatatcgg ttggcagtga ctccgtc 37

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gatatcgaat tcggatccta cacttgca 28

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgtgtacgt accctgttac ttatcccctt cctat 35

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cagggtacgt acacatattg accaaatcag ggta 34

<210> 17

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctacgtagcg gccgctagcg gatccgtcaa ggctgagaga tgcaggataa gca 53

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tgaaggtgga ggacattcct cta 23

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ctggaattgc gatttctggt aa 22

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cgagaatcac cctgccagac ttccgt 26

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ggttgtagct gtcccagtat ttgtc 25

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ggagctagaa cgattcgcag tta 23

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

acagccttct gatgtttcta acaggccagg 30

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

acccactcct ccacctttga 20

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ctgttgctgt agccaaattc gt 22

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tcaagggcac ctttgcccag 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tcaagggcac ctttgccaca 20

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

aattctttgc caaagtgatg gg 22

Claims

1.一种治疗β-球蛋白功能缺失的重组慢病毒载体，其特征在于：包括基因元件，所述基因元件由依序连接的左侧慢病毒长末端重复序列、慢病毒逆响应元件、中心多嘌呤序列、β-球蛋白基因的基因座调控序列、第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因和右侧慢病毒长末端重复序列组成。

2.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体，其特征在于：所述左侧慢病毒长末端重复序列的U3区域被替换为异源的强启动子；

优选的，所述异源的强启动子为巨细胞病毒启动子。

3.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体，其特征在于：所述右侧慢病毒长末端重复序列的U3区被修饰和替换为SV40多聚腺苷酸型号。

4.根据权利要求1-3任一项所述的重组慢病毒载体，其特征在于：所述左侧慢病毒长末端重复序列为SEQ ID NO.1所示序列；

所述慢病毒逆响应元件为SEQ ID NO.2所示序列；

所述中心多嘌呤序列为SEQ ID NO.3所示序列；

所述β-球蛋白基因的基因座调控序列为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示序列；

所述第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因为SEQ ID NO.4所示序列；

所述右侧慢病毒长末端重复序列为SEQ ID NO.5所示序列；

优选的，所述β-球蛋白基因的基因座调控序列为SEQ ID NO.7所示序列。

5.根据权利要求1-3任一项所述的重组慢病毒载体，其特征在于：所述重组慢病毒载体采用的慢病毒骨架载体为pLenti载体。

6.一种慢病毒，其特征在于：所述慢病毒中含有权利要求1-5任一项所述的重组慢病毒载体。

7.根据权利要求1-5任一项所述的重组慢病毒载体或权利要求6所述的慢病毒在制备治疗β-球蛋白功能缺失的疾病的药物中的应用。

8.根据权利要求1-5任一项所述的重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，

采用Gibson组装法将扩增的β-球蛋白基因的基因座调控序列和第87位苏氨酸突变为谷氨酰胺的β-球蛋白基因组装到慢病毒骨架载体，获得所述重组慢病毒载体。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述一对限制性内切酶为EcoRV和BamHI；

优选的，所述Gibson组装引物包括LCR片段Gibson组装引物对、HBB编码区片段1Gibson组装引物对、HBB编码区片段2Gibson组装引物对；

所述LCR片段Gibson组装引物对的正向引物为SEQ ID NO.12所示序列，反向引物为SEQID NO.13所示序列；

所述HBB编码区片段1Gibson组装引物对的正向引物为SEQ ID NO.14所示序列，反向引物为SEQ ID NO.15所示序列；

所述HBB编码区片段2Gibson组装引物对的正向引物为SEQ ID NO.16所示序列，反向引物为SEQ ID NO.17所示序列。

10.一种用于制备治疗β-球蛋白功能缺失的重组慢病毒载体的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包含Gibson组装引物，所述Gibson组装引物包括LCR片段Gibson组装引物对、HBB编码区片段1Gibson组装引物对、HBB编码区片段2Gibson组装引物对；

所述HBB编码区片段2Gibson组装引物对的正向引物为SEQ ID NO.16所示序列，反向引物为SEQ ID NO.17所示序列；

优选的，所述试剂盒中还包含pLenti载体；

优选的，所述试剂盒中还包含Gibson组装法相关试剂。