CN116271106A - 慢病毒载体LentilAlpha在制备治疗α-地中海贫血药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种慢病毒载体LentilAlpha在制备治疗α‑地中海贫血药物中的应用，所述慢病毒载体包括pCCL‑SIN‑cPPT‑MCS‑RbPA骨架和顺次连接的A调控序列、第一α‑globin表达盒与第二α‑globin表达盒。本发明慢病毒载体LentiAlpha增强了α‑珠蛋白基因的特异性高表达，降低了载体大小从而提高了病毒包装效率；在LentiAlpha转导的HBA KO小鼠胎肝单个核细胞体外红系分化中能检测到人α‑珠蛋白的表达。慢病毒载体LentiAlpha能挽救HBA KO小鼠胎肝细胞造血重建的小鼠致死表型，并在小鼠外周血中检测到人α‑珠蛋白的表达。

Description

慢病毒载体LentilAlpha在制备治疗α-地中海贫血药物中的 应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种慢病毒载体LentilAlpha在制备治疗α-地中海贫血药物中的应用。

背景技术

地中海贫血是一种世界上最常见的单基因常染色体隐性遗传性疾病，以小细胞低色素性贫血为特征，流行于地中海国家、东南亚、非洲、中东和印度。

α-地中海贫血是由于α-珠蛋白基因突变或缺失致使α-珠蛋白生成减少或缺如，最终导致溶血性贫血。正常人的α-珠蛋白合成是由16号染色体（16p13.3）上4个α-珠蛋白基因（每条染色体上有2个α-珠蛋白基因，α1和α2）调控的，这种基因型通常被写为αα/αα。在胎儿和成人的血红蛋白合成中α-珠蛋白链都是必不可少的。不平衡的交叉或重组引起大的α-珠蛋白基因片段缺失，从而导致α-地中海贫血综合症，但少数是由于突变引起的。α-地中海贫血分为缺失型和非缺失型。据估计，全球约5%的人口携带至少一个α-珠蛋白基因变异。

α-地中海贫血临床表现包括从几乎无症状，到轻度的小细胞低色素性贫血，直到致死的溶血性贫血。临床表型严重程度与四个α-珠蛋白基因变异的拷贝数直接相关。一个α-珠蛋白基因缺失（-α/αα）称为“静止型α-地中海贫血”。两个α-珠蛋白基因缺失（--/αα或-α/-α）就是通常所说的 “轻型α-地中海贫血”，表现为小细胞增多与血红蛋白减少，但很少出现贫血症状（一般无贫血）。上述这两种情况通常不需要治疗。三个α-珠蛋白基因缺失（--/-α）导致HbH (β4)血红蛋白的大量产生，也被称为“HbH病” ，表现为低色素性中重度溶血性贫血和脾肿大。缺失型的HbH病患者需要间歇性的输血治疗，尤其在疾病间歇发作的时候，但是有些患者也需要定期的输血治疗。四个α-珠蛋白基因全部缺失（--/--）导致HbBart’s (γ4) 血红蛋白的产生，个体无任何α-珠蛋白表达，导致胎儿水肿和新生儿阶段的死亡，被称为“Hb Bart’s胎儿水肿综合症”。中国南方最常见的缺失类型是东南亚缺失（--^SEA）。

非缺失型α-地中海贫血是由α-珠蛋白基因突变导致的α珠蛋白基因缺陷 (α^T) 所致。非缺失型突变能够生成不稳定的血红蛋白，通常沉淀在红细胞内，形成不溶的包涵体，对红细胞有较强的破坏作用而导致溶血性贫血。中国南方常见的非缺失类型是HbConstant Spring (HbCS)、Hb Quong Sze (HbQS) 和 Hb Westmead (HbWS)。HbCS是最普遍的非缺失型突变，高发于中国和部分东南亚国家。

非缺失型α-地中海贫血的临床表现多种多样，通常比缺失型α-地中海贫血更加严重。非缺失型“HbH病”（--/α^Tα）患者经常从童年开始就有严重的贫血，脾肿大，铁负载，以及各种各样的临床并发症，包括感染，腿溃疡，胆结石，叶酸缺乏，血栓。在我国，HbH病中HbCS(--^SEA/α^CSα)、HbQS (--^SEA/α^QSα) 和 HbWS (--^SEA/α^WSα) 约占总数的30%，患者除了依靠长期输血或者骨髓移植治疗外，无任何治疗手段，难度及费用与输血依赖性β-地中海贫血的治疗相当。

输血治疗是目前临床缓解中、重度地中海贫血症状的常规方案，但是长期大量输血却会加重患者铁离子沉积，最终因铁超载导致器官衰竭而死亡。为了防止铁超载相关风险，患者必须坚持同时接受铁螯合治疗方案。长期大量输血，不仅严重降低了患者的生存质量，而且给家庭和社会带来了巨大的负担。

异体骨髓移植也存在一些重大风险，如移植过程中的感染、移植失败和移植物抗宿主病（GvHD），其中一些甚至是致命的。但由于合适供者来源受限及费用昂贵，大部分患者难以得到及时的救治。因此基于基因治疗的自体造血干细胞移植目前正成为“一站式”治愈α-地中海贫血的新希望，其最大的优势在于不需要骨髓捐赠和异体移植，而且有望实现一次治疗永久性“治愈”，可取代异体骨髓移植的治疗方案。

目前针对α-地中海贫血的基因治疗，在国际上未受到重视，由于普遍认为轻型α-地中海贫血无需治疗，重型α-地中海贫血新生儿期无法存活，并且低估了大量输血依赖的非缺失型HbH α-地中海贫血患者的治疗需求，导致研发资金投入极少，更没有相关基因治疗药物的研发。但是，在我国南方地区包括广东省，广西省和云南省等，α-地中海贫血是影响最大，发病率最高的遗传病之一，并且其基因突变类型具有明显的种族特征和地域差异，临床需求迫切。

发明内容

解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一种慢病毒载体LentilAlpha在制备治疗α-地中海贫血药物中的应用，有望能一次性治愈，使中重型α-地中海贫血患者摆脱输血依赖。

技术方案：慢病毒载体LentilAlpha在制备治疗α-地中海贫血药物中的应用，所述慢病毒载体包括pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA骨架、A调控序列、第一α-globin表达盒和第二α-globin表达盒，且 A调控序列、第一α-globin表达盒和第二α-globin表达盒从5’端到3’端顺次连接，所述第一α-globin表达盒包括依次连接的B启动子序列、C增强子序列和D1基因序列，所述第二α-globin表达盒包括依次连接的B启动子序列、C增强子序列和D2基因序列，所述A调控序列为2.7kb β-LCR调控序列，其中β-LCR为β-globin locus control region的简写；所述B启动子序列为β-globin启动子序列；所述C增强子序列为chimeric intron增强子序列；所述D1基因序列为氨基酸经密码子优化的人α-globin基因编码区序列，所述D2基因序列为人α-globin基因编码区序列。

优选的，所述pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA骨架的序列如SEQ ID No:1所示。

优选的，所述2.7kb β-LCR调控序列如SEQ ID No:2所示，

ggcctcaagatgataacttttattttctggacttgtaatagctttctcttgtattcaccatgttgtaactttcttagagtagtaacaatataaagttattgtgagtttttgcaaacacagcaaacacaacgacccatatagacattgatgtgaaattgtctattgtcaatttatgggaaaacaagtatgtactttttctactaagccattgaaacaggaataacagaacaagattgaaagaatacattttccgaaattacttgagtattatacaaagacaagcacgtggacctgggaggagggttattgtccatgactggtgtgtggagacaaatgcaggtttataatagatgggatggcatctagcgcaatgactttgccatcacttttagagagctcttggggaccccagtacacaagaggggacgcagggtatatgtagacatctcattctttttcttagtgtgagaataagaatagccatgacctgagtttatagacaatgagcccttttctctctcccactcagcagctatgagatggcttgccctgcctctctactaggctgactcactccaaggcccagcaatgggcagggctctgtcagggctttgatagcactatctgcagagccagggccgagaaggggtggactccagagactctccctcccattcccgagcagggtttgcttatttatgcatttaaatgatatatttattttaaaagaaataacaggagactgcccagccctggctgtgacatggaaactatgtagaatattttgggttccatttttttttccttctttcagttagaggaaaaggggctcactgcacatacactagacagaaagtcaggagctttgaatccaagcctgatcatttccatgtcatactgagaaagtccccacccttctctgagcctcagtttctctttttataagtaggagtctggagtaaatgatttccaatggctctcatttcaatacaaaatttccgtttattaaatgcatgagcttctgttactccaagactgagaaggaaattgaacctgagactcattgactggcaagatgtccccagaggctctcattcagcaataaaattctcaccttcacccaggcccactgagtgtcagatttgcatgctctagctgagctcagaagagtcaagcatttgcctaaggtcggacatgtcagaggcagtgccagacctatgtgagactctgcagctactgctcatgggccctgtgctgcactgatgaggaggatcagatggatggggcaatgaagcaaaggaatcattctgtggataaaggagacagccatgaagaagtctatgactgtaaatttgggagcaggagtctctaaggacttggatttcaaggaattttgactcagcaaacacaagaccctcacggtgactttgcgagctggtgtgccagatgtgtctatcagaggttccagggagggtggggtggggtcagggctggccaccagctatcagggcccagatgggttataggctggcaggctcagataggtggttaggtcaggttggtggtgctgggtggagtccatgactcccaggagccaggagagatagaccatgagtagagggcagacatgggaaaggtgggggaggcacagcatagcagcatttttcattctactactacatgggactgctcccctatacccccagctaggggcaagtgccttgactcctatgttttcaggatcatcatctataaagtaagagtaataattgtgtctatctcatagggttattatgaggatcaaaggagatgcacactctctggaccagtggcctaacagttcaggacagagctatgggcttcctatgtatgggtcagtggtctcaatgtagcaggcaagttccagaagatagcatcaaccactgttagagatatactgccagtctcagagcctgatgttaatttagcaatgggctgggaccctcctccagtagaaccttctaaccagctgctgcagtcaaagtcgaatgcagctggttagactttttttaatgaggatctcgggaggcggaggttgcagtgagctgagatcgtgccactgcactccagcctgggggacagagcacattataattaactgttattttttacttggactcttgtggggaataagatacatgttttattcttatttatgattcaagcactgaaaatagtgtttagcatccagcaggtgcttcaaaaccatttgctgaatgattactatactttttacaagctcagctccctctatcccttccagcatcctcatctctgattaaataagcttcagtttttccttagttcctgttacatttctgtgtgtctccattagtgacctcccatagtccaagcatgagcagttctggccaggcccctgtcggggtcagtgccccacccccgccttctggttctgtgtaaccttctaagcaaaccttctggctcaagcacagcaatgctgagtcatgatgagtcatgctgaggcttagggtgtgtgcccagatgttctcagcctagagtgatgactcctatctgggtccccagcaggatgcttacagggcagatggcaaaaaaaaggagaagctgaccacctgactaaaactccacctcaaacggcatcataaagaaaatggatgcctgagacagaatgtgacatat。

优选的，所述β-globin启动子序列如SEQ ID No:3所示，

tacgtaaatacacttgcaaaggaggatgtttttagtagcaatttgtactgatggtatggggccaagagatatatcttagagggagggctgagggtttgaagtccaactcctaagccagtgccagaagagccaaggacaggtacggctgtcatcacttagacctcaccctgtggagccacaccctagggttggccaatctactcccaggagcagggagggcaggagccagggctgggcataaaagtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacacca。

优选的，所述chimeric intron增强子序列如SEQ ID No:4所示，

gccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggcccctctgctaaccatgttcatgccttcttctctttcctacagctcctgggcaacgtgctggttgttgtgctgtctcatcattttggcaaa。

优选的，所述经氨基酸密码子优化的人α-globin基因编码区序列如SEQ ID No:5所示，

gccaccatggtgctgagccccgccgacaagaccaacgtgaaggccgcctggggcaaggtgggcgctcacgctggagagtacggcgccgaggccctggagaggatgtttctgagctttcccaccaccaagacctacttcccccacttcgacctgtctcacggaagtgcccaggtgaagggacacggcaaaaaggtggctgacgccctgaccaacgccgtggcccacgtggacgacatgcccaacgccctgagcgccctgagcgacctgcacgctcacaagctgagagtggatccagtgaacttcaagctgctgtctcactgcctgctggtgaccctggccgcccatctgcccgctgaatttacccccgccgtgcacgccagcctggacaagttcctggcttccgtgagcaccgtgctgacctccaagtataggtga。

优选的，所述人α-globin基因编码区序列如SEQ ID No:6所示，

gccaccatggtgctgtctcctgccgacaagaccaacgtcaaggccgcctggggtaaggtcggcgcgcacgctggcgagtatggtgcggaggccctggagaggatgttcctgtccttccccaccaccaagacctacttcccgcacttcgacctgagccacggctctgcccaggttaagggccacggcaagaaggtggccgacgcgctgaccaacgccgtggcgcacgtggacgacatgcccaacgcgctgtccgccctgagcgacctgcacgcgcacaagcttcgggtggacccggtcaacttcaagctcctaagccactgcctgctggtgaccctggccgcccacctccccgccgagttcacccctgcggtgcacgcctccctggacaagttcctggcttctgtgagcaccgtgctgacctccaaataccgttaa。

有益效果：两个主要的上游调控元件，分别为人β-珠蛋白基因簇的位点控制区(LCR) 和人α-珠蛋白基因簇的远端调控区 (MSCR)，在调控这两个基因簇的表达中发挥关键作用。研究过程中发现，在β-珠蛋白基因簇LCR调控下的人α-样珠蛋白基因表现出与在MSCR调控下的人α-珠蛋白基因簇 (野生型) 类似的发育阶段的开关模式；本发明慢病毒载体LentiAlpha包含红系特异人β-珠蛋白启动子和β-珠蛋白基因调控序列（β-LCR），以及2个拷贝的人α-珠蛋白基因序列，增强了α-珠蛋白基因的特异性高表达；删除了β-珠蛋白基因的所有内含子序列，降低了载体大小从而显著提高了病毒包装效率；进行了基因编码区密码子优化，并加入了增强子元件以提高珠蛋白基因表达效率；利用质粒转染HEK293T细胞产慢病毒工艺，提升病毒产量，降低病毒载体对受试细胞潜在致癌风险；将慢病毒载体LentiAlpha转导小鼠胎肝单个核细胞，用HPLC (高效液相色谱法) 检测人α-珠蛋白表达水平。慢病毒载体LentiAlpha能挽救HBA KO (包括Hba-a1&Hba-a2基因敲除) 小鼠胎肝细胞造血重建的小鼠致死表型，并且在小鼠外周血中能检测到人α-珠蛋白的表达。

附图说明

图1是本发明慢病毒载体的示意图；

图2是实施例1中PCR鉴定HBA KO基因型时扩增产物的电泳图，其中，M1为100bpDNA Ladder，M2为DL5000 DNA Marker，9和3均为小鼠的编号；

图3是实施例1中慢病毒载体LentiAlpha转导野生型 (WT) 和HBA 敲除(KO) 小鼠胎肝单个核细胞体外红系分化后，HPLC检测人α-珠蛋白结果图。其中，A为正常人外周血红细胞 (内参)，B和C分别为WT小鼠和KO小鼠胎肝单个核细胞空白对照 (blank, 未感染慢病毒)，D和E分别为WT和KO小鼠胎肝单个核细胞被LentiAlpha (即508A) 慢病毒转导；

图4是实施例1中转导野生型和HBA KO小鼠胎肝单个核细胞体外红系分化中检测人α-珠蛋白表达情况的WB结果图；

图5是实施例1 中慢病毒载体LentiAlpha能挽救HBA KO小鼠胎肝细胞造血重建的小鼠致死表型，并且在小鼠外周血中能检测到人α-珠蛋白的表达。其中，A为LentiAlpha可挽救HBA KO (--/--) 胎肝细胞造血重建的小鼠致死表型；B为造血重建后小鼠随着移植后时间的延长，体重恢复并超过辐照前体重水平；C为LentiAlpha在小鼠外周血中持续表达人α-珠蛋白。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明：

主要仪器：

台式离心机（Eppendorf 5424R）、恒温水浴锅（上海知信 ZX-S24）、恒温摇床（上海智诚分析ZXY-240）、凝胶成像系统（天能 Tanon-1600）、恒温细菌培养箱（上海博讯 BPX-162）、基因扩增仪（杭州博日TC-96/G/H(b)）、金属浴（大龙HCM100-pro）、电泳仪（北京六一DYY-6C）、生物安全柜(海尔 HR40-IIA2)、二氧化碳培养箱（Thermo 150i）、荧光显微镜（ZEISS AX10）、AKTA-avant150 (Cytiva 28976337)、AKTA-Fluxs（Cytiva 29038437）、高效液相色谱（Thermo Ultimate 3000）；

主要材料和试剂：

内切酶XhoI（Thermo FD0694）、内切酶MluI（Thermo FD0564）、内切酶KpnI（ThermoFD0524）、琼脂糖DNA凝胶回收与纯化试剂盒（Axygen AP-GX-50）、PCR试剂盒（TOYOBO KMM-201）、T4 DNA连接酶（Thermo EL0014）、卡那霉素（Sigma K1377）、DH5α（Takara 9057）、ViraPower™ Lentiviral Packaging Mix（invitrogen K497500）、UFP-750-E-3X2MA(Cytiva 56-4101-55)、UFP-750-E-2U（Cytiva 11-0005-50）、Capto-Core700（Cytiva17548102）、Capto-Q impres(Cytiva 17547010)、DMEM培养基（Gibco 11995065）、opti-MEM培养基(Gibco 11058021)、DPBS (Gibco 14190144)、胰酶（Gibco 25200072）、IMDM培养基(Gibco 12440053)、FBS（Gibco 10100147）、TFA(Thermo 85183)、乙腈(Fisher ChemicalA995-4)，Percoll (Cytiva, 17089102)，EasySep Buffer (stemcell, 20144)。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购。

实施例

1. LentiAlpha慢病毒载体的构建：LentiAlpha慢病毒载体为pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-pHBB-CI-α-globin-OPT-pHBB-CI-α-globin-WT-RbPA，简称为GMCN-508A，包括pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA骨架（SEQ ID No:1）、2.7kb β-LCR调控序列（简称LCR2.7K）（SEQID No:2）、β-globin启动子序列（简称pHBB）（SEQ ID No:3）、chimeric intron增强子序列（简称CI）（SEQ ID No:4）、经氨基酸密码子优化的人α-globin基因编码区序列（简称α-globin-OPT）（SEQ ID No:5）和人α-globin基因编码区序列（简称α-globin-WT）（SEQ IDNo:6）。

1.1 以本公司载体质粒pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA（SEQ ID No:1）作为制备慢病毒载体的载体，将其用限制性内切酶XhoI和MluI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收得到pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA骨架片段；

将2.7kb β-LCR调控序列（SEQ ID No:2）进行PCR扩增，且5’端加上保护碱基和XhoI酶切位点，3’端加上保护碱基和MluI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用XhoI和MluI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收2.7kb β-LCR（LCR2.7K）片段，所用PCR引物为LCR2.7K-1（SEQ ID No:10）和LCR2.7K-2（SEQ ID No:11），

SEQ ID No:10：ccctcgaggcctcaagatgataacttttattttc

SEQ ID No:11：cgacgcgtatatgtcacattctgtctcaggcatc。

1.2 将胶回收的pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA载体片段和LCR2.7K片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应10-20min得到连接产物。

1.3 将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5α，轻轻混匀，冰浴25-35min；于41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液在36.5-37.5℃振荡培养40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h。

1.4 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA质粒，进行XhoI和MluI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此获得pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA质粒。

1.5 将pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA质粒用限制性内切酶MluI和KpnI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA载体片段；

将两个α-globin表达盒拼接并做基因合成：第一表达盒由B启动子序列、C增强子序列和D1基因序列依次连接构成，第二表达盒由B启动子序列、C增强子序列和D2基因序列依次连接构成，所述B启动子序列为β-globin启动子序列（简称pHBB）（SEQ ID No:3）；所述C增强子序列为chimeric intron增强子序列（简称CI）（SEQ ID No:4）；所述D1基因序列为经密码子优化的人α-globin基因编码区序列（简称α-globin-OPT）（SEQ ID No:5），D2基因序列为人α-globin基因编码区序列（简称α-globin-WT）（SEQ ID No:6），拼接合成后得到排列为pHBB-CI-α-globin-OPT-pHBB-CI-α-globin-WT的序列，将该序列进行PCR扩增，且5’端加上保护碱基和MluI酶切位点，3’端加上保护碱基和KpnI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用MluI和KpnI于36.5-37.5℃进行双酶切0.8-1.2h，琼脂糖电泳后切胶回收pHBB-CI-α-globin-OPT-pHBB-CI-α-globin-WT片段，所用PCR引物为P1-β-promoter（SEQ ID No:12）和P2-α-WT（SEQ ID No:13），

SEQ ID No:12：cgacgcgttacgtaaatacacttgcaaaggagg

SEQ ID No:13：ggggtaccttaacggtatttggaggtcagcacg。

1.6 将胶回收的pCCL-SIN-cPPT-LCR2.7K-RbPA载体片段和pHBB-CI-α-globin-OPT-pHBB-CI-α-globin-WT片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应10-20min。

1.7 将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5α，轻轻混匀，冰浴25-35min；于41.5-42.5℃热休克70-100s，立刻冰浴2-5min，加入无抗生素的LB 培养液36.5-37.5℃振荡培养40-80min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素的LB琼脂平板上，36.5-37.5℃倒置培养12-16h。

1.8 挑取单克隆菌落接种于含有卡那霉素LB液体培养液中36.5-37.5℃振荡14-18h；用质粒提取试剂盒提取GMCN-508A质粒，进行MluI和KpnI双酶切鉴定后进行测序鉴定，至此LentiAlpha慢病毒载体GMCN-508A构建成功，其质粒图谱如图1所示。

2. 慢病毒的生产和纯化

2.1 将成功构建的GMCN-508A质粒与慢病毒包装试剂盒质粒Mix按照1：3的比例共转染前一天接种于10层细胞工厂的HEK293T细胞，转染后6小时更换新鲜DMEM培养基，72小时后收取上清液用于层析纯化。

2.2 纯化采用切向流过滤-层析系统，利用core700层析，Q ImpRes层析纯化工艺，纯化得慢病毒，具体纯化过程如下：

①Benzonase treatment（核酸酶消化）：用25U/mL的Benzonase于37℃处理1小时，去除转染过程残留的质粒DNA和裂解细胞释放的基因组等污染物；

② MF(澄清):病毒收获液经过滤（0.45μm）的处理，以除去HEK293T细胞及碎片等不溶性微粒，提高溶液的澄清度，以便后续的层析纯化处理；

③UF/DF（浓缩洗滤）：澄清消化后样品采用截留分子量750kDa的UFP-750-E-3X2MA中空纤维进行浓缩洗滤，小分子杂质可以有效去除，从而达到了提纯的目的；

④SEC（分子排阻层析）： UF/DF后的样品通过平衡过后的Capto Core700填料进行进一步纯化，将大于700kDa的病毒等颗粒经外水体积排出收集，分子量更小的杂质进入填料孔内吸附其中；

⑤IEX（阴离子交换层析）：分子排阻层析后的样品通过Capto Q impres填料进行精纯，将病毒样品上样至平衡后的Capto Q impres填料中，此时杂质不会被填料吸附而排出，随后通过1M NaCl步级梯度将病毒洗脱；

⑥Preparation（制剂）：将IEX后的病毒液通过截留分子量750kDa UFP-750-E-2U的中空纤维进行浓缩换盐，将病毒置换在含有2 vol.% HSA 的PBS中；

⑦Storage（保存）：将病毒采用0.2μm膜过滤，分装，于-80℃保存。

3. 以体外诱导野生型和HBA KO小鼠胎肝单个核细胞红系分化为模型，验证野生型LentiAlpha慢病毒递送α-珠蛋白系统有效性：利用步骤2.2获得的慢病毒（上述第2部分制备和纯化的慢病毒）转导野生型和HBA KO小鼠胎肝单个核细胞，进行红系分化，体外诱导培养6天，检测人α-珠蛋白的表达情况。具体方法如下：

3.1 构建 HBA KO (包括Hba-a1&Hba-a2 基因敲除) 小鼠：采用CRISPR/Cas9技术，利用非同源重组修复引入突变的方式，造成Hba-a1&Hba-a2基因蛋白读码框移码，功能缺失。简要过程如下：通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA；将Cas9 mRNA和gRNA显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠。PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得阳性F1代小鼠。

3.2 将HBA KO杂合子小鼠进行IVF (体外受精和胚胎移植) 获得ICR孕鼠。

3.3 解剖ICR孕鼠获得E14.5小鼠胚胎和胎肝

细胞间放入剪子和尖镊，照紫外，动物房取出ICR孕鼠，处死放酒精杯，带入细胞间。解剖取出胚胎，放含DPBS (Gibco 14190144) 的培养皿中。用两个尖镊分离出小鼠胚胎的胎肝，尽量分离干净。放入含1 mL buffer1 (EasySep Buffer, stemcell 20144) 的EP管，放冰上保存备用。

3.4 提取小鼠胚胎组织基因组，并鉴定HBA KO基因型

3.4.1 提鼠尾基因组：小鼠组织置于50 μL裂解液中，95℃消化20min，加入50 μL中和液；

3.4.2 PCR鉴定HBA KO基因型，PCR反应体系和反应程序如下表1所示：

表1 PCR反应体系和反应程序

；

其中，PCR鉴定HBA KO的引物序列为：（从5’到3’）

HBA KO-F3：gaccagaggctccccatatg；HBA KO-R3：ttacccattgcctacccaca

PCR鉴定WT的引物序列为：（从5’到3’）

P3：gcctaccaggaccagaggct；P4: tgatggcagtttgggaagaag

PCR产物电泳图如图2所示，基因型鉴定结果如下表2所示：

表2 PCR鉴定HBA KO基因型结果

图2和表2表明：用F3/R3引物和P3/P4引物对小鼠胚胎组织基因组进行PCR，能够准确鉴定HBA KO纯合子、杂合子和野生型小鼠的基因型。

3.5 分离HBA KO和野生型小鼠胎肝单个核细胞

3.5.1 试剂配制

1) 配制1.5 M NaCl：称取8.775 g NaCl粉末，溶解于50 mL无菌注射用水中，并用容量瓶定容到100 mL，经0.22 μm针头滤器过滤除菌，保存备用；

2) 配制1.0890±0.0005 g/mL的Percoll 50 mL，具体过程为：32 mL的Percoll原液加入5 mL的1.5 M NaCl最终用H₂O补至50 mL。

3.5.2 单个核细胞分离

1) 将小鼠胎肝用注射器的活塞在40 μm滤器上碾磨，同时用含10 vol.% FBS的buffer1冲洗胎肝细胞，过滤细胞于50 mL离心管，补含10 vol.% FBS的buffer1至细胞悬液总体积为25 mL；

2) 取10 μL细胞，用台盼蓝染色并细胞计数，记录数据；

3) 将Percoll 1.089混匀，在离心管底部加入Percoll分离液，在分离液上加入稀释后的样品 (分离液与稀释后样品体积比例为3：4)，分离液体积：18 mL，样本体积：24 mL，总管数：1；

4) 离心机（Eppendorf，Centrifuge 5810R）温度为18℃，升速和降速为0，离心力为400×g，离心40 min；

5) 从离心机平缓的拿出离心管，观察白膜层，对离心管进行拍照；

6) 用移液枪吸出上层的血浆，保存在新无菌离心管中，若之后无用处可以处理掉；

7) 用移液枪吸出白膜层（单个核细胞层）转移至新无菌离心管中，用buffer1稀释分离液层细胞，取样计数，拍照；

8) 清洗白膜层中的分离液残留：用离心机温度为18°C，升速和降速为9，离心力为500×g，离心30min；

9) 弃上清至剩余5 mL，改用枪吸出上清至24孔板中，分别观察上清中有无细胞，若有大量细胞则重新离心，若无大量细胞，则加入buffer1至45 mL刻度线，计数，拍照；

10) 离心机温度为4°C，升速和降速为9，离心力为500×g，离心15min；

11) 弃上清至剩余5 mL，改用枪吸出上清至24孔板中，分别观察上清中有无细胞若有大量细胞则重新离心，若无大量细胞，则按照上一次计数的总数预估，加入培养基重悬细胞，用台盼蓝染色并细胞计数，记录数据；

12) 细胞冻存：细胞按照1×10⁷至1×10⁸cells/支去冻存，冻存液为与含10 vol.%FBS的Cryostor CS10混合液；冻存体积1mL，标记日期、冻存名称、冻存代次、冻存人、冻存细胞数；

13) 将KO和WT小鼠胎肝单个核细胞接种在增殖培养基（含IMDM培养基、BSA、FBS、β-mercaptoethanol、Dexamethasone、Cholesterol、IGF-1、Insulin、Transferrin、EPO、SCF、IL-3、L-glutamine、抗生素），37℃孵箱培养10-12小时，在感染LentiAlpha病毒前给细胞计数。

3.6 LentiAlpha分别转导野生型和HBA KO小鼠胎肝单个核细胞，并进行体外红系分化

① D0（慢病毒感染当天设为第0天）将小鼠胎肝以500×g转速，室温离心5 min，去除上清后，用新鲜分化培养基细胞吹打混匀后进行计数和细胞活率，按照2×10⁵cells/孔铺于含500 μL增殖培养基的24孔细胞培养板，慢病毒感染1天（下称药物处理组）。同时，另取 2.0×10⁵野生型和HBA KO小鼠胎肝单个核细胞不进行慢病毒感染，后续操作同药物处理组一致，作为空白阴性对照(Blank)；

按照下式计算加入病毒量：加入病毒量=细胞数*MOI/病毒感染滴度

本实施例LentiAlpha慢病毒按照MOI：50转导小鼠胎肝以500×g转速，室温离心5min，去除上清后，换新鲜增殖培养基；

② D1（第1天）慢病毒感染后24 h，以500×g转速，室温离心5 min，去除上清后，换新鲜增殖培养基；

③ D3（第3天）以500×g转速，室温离心5min，去除上清后，用新鲜分化培养基（含IMDM培养基、FBS、Transferrin、EPO、SCF、L-glutamine、MTG(1-Thioglycerol)、SerumReplacement、PFHM-II、抗生素）重悬细胞。继续培养，每日换液，至D6天收取细胞，用反向高效液相色谱（RP-HPLC）检测人α-珠蛋白的表达。

3.7 RP-HPLC检测α-/β-珠蛋白的比值，实验方法如下：

3.7.1 样品处理

①收取细胞，500×g离心5 min，弃上清；

②加100 μL水重悬，-80℃冷冻10 min，37℃快速融化，振荡混匀；

③如此反复冻融三次以充分裂解细胞；

④9000×g，4℃离心10 min，收取上清进行检测。

3.7.2 缓冲液配制

① Buffer A：含1.2%TFA (体积比) 的水溶液，pH3.0；

② Buffer B：含0.08%TFA (体积比) 的乙腈溶液。

3.7.3 检测程序见下表3：

表3 RP-HPLC检测珠蛋白程序

3.7.4 RP-HPLC结果分析如图3所示，LentiAlpha能够在WT和HBA KO小鼠胎肝单个核细胞的体外红系分化中表达人α-珠蛋白。其中α-/β-珠蛋白的比值结果如下表4所示：

表4：RP-HPLC检测各样品α-/β-珠蛋白的比值结果

，

由表4可知：野生型小鼠胎肝单个核细胞体外红系分化中，经LentiAlpha转导的药物处理组的(human-α) / (mouse-β)-珠蛋白的比值为9%。但是，在HBA KO小鼠胎肝单个核细胞体外红系分化中，经LentiAlpha转导的药物处理组的(human-α) / (mouse-β)-珠蛋白的比值为23%。可见LentiAlpha可以在小鼠胎肝单个核细胞体外红系分化中表达，并且在HBA KO组中人α-珠蛋白的表达量更高。

3.8 WB检测人α-珠蛋白的表达，实验方法如下：

3.8.1 蛋白质提取

①离心收集细胞沉淀，加入含蛋白酶抑制剂Cocktail和PMSF的RIPA裂解液，放置在冰上裂解一个小时；

②4℃，16000×g离心15分钟，小心吸取上清，转移到新的1.5 mLEP管中，得到的蛋白上清可以-80℃保存，也可置于冰上进行下一步的实验。

3.8.2 蛋白质浓度测定：采用BCA法测定蛋白浓度，每个样品设置2个复孔，每个标准品设置2个复孔：

①按照A液：B液=1:50的比例配制BCA工作溶液，200 μL/复孔；

②用倍比稀释法稀释标准品原液，设置2 μg/μL、1 μg/μL、0.5 μg/μL、0.25 μg/μL、0.125 μg/μL和0 μg/μL的六个浓度梯度；

③将样品蛋白进行3倍稀释，按照25 μL/复孔的量稀释；

④将BCA工作溶液加入到96孔板中，然后加入稀释后的标准品或样品，37℃孵育10-15分钟；

⑤在562 nm波长下，测定各孔的吸光度值（OD值）；

⑥根据标准品的OD和对应的浓度值绘制标准曲线，计算各样品的浓度；

⑦调整各样品到同一浓度，加入6 ×Loading Buffer，混匀，95℃变性10分钟。

3.8.3 蛋白质电泳分离

①根据蛋白分子量的大小，配制12% SDS-PAGE凝胶；

②根据蛋白表达量的不同，取5-50 μg蛋白进行上样，先80 V电压进行电泳，使蛋白在浓缩胶里充分浓缩，当观察到Marker分开之后，说明蛋白已经进入分离胶，此时可将电压调到100 V进行电泳，用于不同分子量蛋白的分离，直到样品电泳至分离胶底部则完成电泳。

3.8.4 蛋白质转膜

①将PVDF膜泡入甲醇中，活化至少1分钟，之后放入1×转膜液中待用；

②按照海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵的顺序组装一个“三明治”结构；

③采用300 mA的恒流模式，冰上转膜2.5小时，将蛋白从SDS-PAGE凝胶转移到PVDF膜。

3.8.5 蛋白质封闭

①配制5%脱脂奶粉作为封闭液（溶解在0.1% TBST中）；

②将PVDF膜剪角标记正反面，将正面（紧挨SDS-PAGE胶的一面）朝上浸泡在5% 脱脂奶粉中，摇床上封闭30分钟左右。

3.8.6 抗体杂交

①将PVDF膜放入0.1%TBST中洗去封闭液，然后放入稀释的一抗（用购买的Western专用一抗稀释液稀释），4℃摇床孵育过夜；

②第二天回收一抗溶液，并用0.1% TBST洗PVDF膜三次，每次5-10分钟；

③根据一抗的种属来源选择对应的HRP标记的二抗，并稀释二抗（用5%脱脂奶粉稀释），将PVDF膜和二抗在室温孵育1小时；

④弃掉二抗，0.1% TBST洗3次，每次5分钟。

3.8.7 显影成像

①按照1:1的比例混合ECL超敏发光液A液和B液，注意避光；

②在膜上滴加配好的ECL发光液，在天能化学发光仪中进行显色；

③保存曝光的蛋白条带。

3.8.8 WB结果如图4所示：用只能识别人α-珠蛋白的抗体(Santa Cruz, sc-514378)的WB结果显示：LentiAlpha在野生型和HBA KO小鼠胎肝单个核细胞体外红系分化中，都能检测到人α-珠蛋白的表达，并且在HBA KO组中人α-珠蛋白的表达量更高。另外，用能识别小鼠和人α-珠蛋白的抗体(Proteintech, 14537-1-AP) 的WB结果显示：野生型小鼠胎肝单个核细胞体外红系分化中，能检测到小鼠α-珠蛋白的表达，而HBA KO组则没有小鼠α-珠蛋白的表达。WB结果与上述的HPLC结果保持一致。

4.慢病毒载体LentiAlpha能挽救HBA KO小鼠胎肝细胞造血重建的小鼠致死表型，并且在小鼠外周血中能检测到人α-珠蛋白的表达，实验方法如下：

4.1将小鼠胎肝用注射器的活塞在40 μm滤器上碾磨，同时加含10 vol.% FBS 的buffer1冲洗胎肝细胞，过滤细胞于50 mL离心管，然后加入红细胞裂解液除去红细胞。

4.2 LentiAlpha分别转导HBA KO和WT小鼠胎肝细胞。

4.3受体小鼠辐照：将C57 CD45.1雌性小鼠取出，带包装盒进行X-射线照射（辐照参数：以0.8 Gy/min，需要照射10 min, 总的辐照剂量是8.0 Gy），所有辐照后小鼠都服用添加恩诺沙星的饮用水，放在新动物房饲养以备注射。

4.4 慢病毒感染后细胞收集：慢病毒感染24h后，将未感染病毒 (LentiAlpha-)以及病毒感染后(LentiAlpha+) 的细胞分别收集起来，并在每孔加入1mL DPBS清洗。将细胞悬液离心，上清液弃掉，并分别加入1~2 mL DPBS，混匀细胞。将细胞悬液集中到1个15 mL离心管中，加DPBS至10 mL刻度线，用台盼蓝染色计数，混匀后离心，弃上清。根据细胞计数结果，调整所加PBS的体积。

4.5 尾静脉注射辐照后受体小鼠：受体小鼠辐照后饲养4-5小时后，进行细胞尾静脉注射。移植当天记作Day 0，在移植前称Day 0天的小鼠体重。

4.6 造血重建小鼠数据采集：对造血重建小鼠进行观察称重收集小鼠外周血用于检测外源人α-珠蛋白的表达。LentiAlpha能挽救HBA KO小鼠胎肝细胞造血重建的小鼠致死表型 (图5中A)。随着移植后时间的延长，造血重建小鼠体重恢复，并超过辐照前体重水平(图5中B)，并且在小鼠外周血能检测到人α-珠蛋白的表达也逐渐增加 (图5中C)。

本实施例结果证明：本发明制备的LentiAlpha慢病毒 (GMCN-508A)，转导野生型和HBA KO小鼠胎肝单个核细胞体外红系分化中都能检测到人α-珠蛋白的表达，并且在HBAKO小鼠胎肝单个核细胞中表达量更高。LentiAlpha能挽救HBA KO小鼠胎肝细胞造血重建的小鼠致死表型，并且在小鼠外周血中能检测到人α-珠蛋白的表达。此项目技术有望达到改善及治愈患者α-地中海贫血的效果；所制得的慢病毒及经基因修饰后的造血干细胞可作为α-地中海贫血的基因治疗药物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.慢病毒载体LentilAlpha在制备治疗α-地中海贫血药物中的应用，其特征在于：所述慢病毒载体包括pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA骨架、A调控序列、第一α-globin表达盒和第二α-globin表达盒，且 A调控序列、第一α-globin表达盒和第二α-globin表达盒从5’端到3’端顺次连接，所述第一α-globin表达盒包括依次连接的B启动子序列、C增强子序列和D1基因序列，所述第二α-globin表达盒包括依次连接的B启动子序列、C增强子序列和D2基因序列，所述A调控序列为2.7kb β-LCR调控序列，其中β-LCR为β-globin locus control region的简写；所述B启动子序列为β-globin启动子序列；所述C增强子序列为chimeric intron增强子序列；所述D1基因序列为经氨基酸密码子优化的人α-globin基因编码区序列，所述D2基因序列为人α-globin基因编码区序列。

2.根据权利要求1所述的慢病毒载体LentilAlpha在制备治疗α-地中海贫血药物中的应用，其特征在于：所述pCCL-SIN-cPPT-MCS-RbPA骨架的序列如SEQ ID No:1所示。

3.根据权利要求1所述的慢病毒载体LentilAlpha在制备治疗α-地中海贫血药物中的应用，其特征在于：所述2.7kb β-LCR调控序列如SEQ ID No:2所示。

4.根据权利要求1所述的慢病毒载体LentilAlpha在制备治疗α-地中海贫血药物中的应用，其特征在于：所述β-globin启动子序列如SEQ ID No:3所示。

5.根据权利要求1所述的慢病毒载体LentilAlpha在制备治疗α-地中海贫血药物中的应用，其特征在于：所述chimeric intron增强子序列如SEQ ID No:4所示。

6.根据权利要求1所述的慢病毒载体LentilAlpha在制备治疗α-地中海贫血药物中的应用，其特征在于：所述经氨基酸密码子优化的人α-globin基因编码区序列如SEQ ID No:5所示。

7.根据权利要求1所述的慢病毒载体LentilAlpha在制备治疗α-地中海贫血药物中的应用，其特征在于：所述人α-globin基因编码区序列如SEQ ID No:6所示。

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