JP2016505604A - 細菌を用いた癌治療用組成物およびその製造のための菌の使用 - Google Patents

Abstract

【課題】エンドトキシン活性および／または発熱性を顕著に低下させるような実質的に非生菌であるグラム陰性菌生物を含有する組成物、ならびに当該グラム陰性菌生物を用いた癌治療方法を提供する。【解決手段】癌であると診断された哺乳動物に、エンドトキシン活性および／または発熱性を顕著に低下させるような実質的に非生菌であるグラム陰性菌を、癌の増殖や転移を抑制するのに十分な量にて投与する癌治療方法を提供する。また、細菌外膜中のリポ多糖を大量に失わせる遺伝的欠損を有する生菌または非生菌のグラム陰性菌生物を投与する方法を提供する。さらに、ポリミキシンおよびグルタルアルデヒドで処理を行うことにより、グラム陰性菌中のエンドトキシン活性および／または発熱性を低下させる方法を提供する。【選択図】図８

Description

本願は、参照することにより本明細書に組み込まれる、２０１３年１月２日出願の米国仮出願第６１／７４８３６９号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）の利益を主張する。
本開示は、グラム陰性菌を含む組成物、および当該グラム陰性菌を投与することによる癌治療方法に関するものである。

細菌感染症にかかった患者における癌の退縮の関連性については、少なくとも１８６８年にはすでに観察および報告されている。弱毒化サルモネラ生菌を固形腫瘍型担がん動物に全身投与することで、腫瘍を治療できることが報告されている。例えば、特許文献１および非特許文献１を参照されたい。また、弱毒化グラム陽性結核菌（ＢＣＧ）を膀胱内投与（非全身投与）することは、膀胱の上皮内癌（ＣＩＳ）の治療および予防策として米国で承認されている。

グラム陰性サルモネラ生菌を用いた腫瘍治療の改善策についても、特定の栄養要求性変異株に対して報告されている。例えば、非特許文献２、特許文献２、および非特許文献３を参照されたい。

ｍｓｂＢ遺伝子座に欠損を有するサルモネラ菌が作製されている。これは、細胞外膜において、リピドＡのＬＰＳ欠乏末端ミリストイル化を発現させるものである。これらｍｓｂＢ−サルモネラ菌株で処理されたマウス体内および豚体内におけるＴＮＦ−アルファの誘導は、野生型細菌によって誘導されたうちのそれぞれ３３％、１４％であった。例えば、非特許文献４および特許文献３を参照されたい。ＶＮＰ２０００９菌株を含むこのような生の生物を投与することは、皮下移植されたＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ、ならびにマウス体内で成長したヒト腫瘍異種移植片Ｌｏｘ、ＤＬＤ−１、Ａ５４９、ＷｉＤｒ、ＨＴＢ１７７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１の成長を阻害することが報告されている（非特許文献５）。サルモネラ菌株ＶＮＰ２０００９もまた、最大耐量および低用量メトロノミクス法の両手法において、化学療法剤シクロホスファミドの抗腫瘍効果を改善させることが報告されている（非特許文献６）。

リピドＡを生成できず、かつ細胞外膜においてＬＰＳが欠乏するグラム陰性菌の条件突然変異体が作製されたが、この変異体は生命体にとって有毒であることが報告されている。例えば、３−デオキシ−Ｄ−マンノオクツロソン酸塩（Ｋｄｏ）の合成の変異体阻害、またはＫｄｏ分子のリピドＩＶ_Ａへの組み込みの変異体阻害が、リピドＡおよびＬＰＳの合成、並びにＬＰＳ前駆体のグラム陰性菌外膜への局在化を妨げる。リピドＩＶ_Ａとは、糖化が不足しているＬＰＳ前駆体である。これらの変異体の活性化は、細菌生存率の低下につながる（非特許文献７、非特許文献８、および非特許文献９）。

外部から加えられた化合物の使用により、ＫｄｏのリピドＩＶ_Ａへの組み込み、リピドＡの合成、および細胞外膜への局在化を阻害することも可能である。Ｇｏｌｄｍａｎらは（非特許文献１０）、特にＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノオクツロソン酸シチジリルトランスフェラーゼ活性を阻害し、これにより、２−ケト３−デオキシ−Ｄ−マンノオクツロソン酸塩（Ｋｄｏ）の、グラム陰性菌のリピドＩＶ_Ａ内への組み込みを遮断する抗菌剤について言及している。ＬＰＳ合成が止むと、リピドＩＶ_Ａと構造が類似する分子が蓄積することが判明し、細菌の増殖が止まる。著者らは、ＬＰＳ前駆体リピド種ＩＶ_ＡへのＫｄｏの添加が、ネズミチフス菌ＬＴ２および大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）のどちらにおいても、リピドＡ−Ｋｄｏ_２形成の主要経路であると結論付けている。

最近になって、リピドＡまたは６−アシルリピド多糖を含むＬＰＳが細胞外膜において不足しているものの、生存率は維持しているグラム陰性菌の変異体が作製された。例えば、特許文献４では、３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクト−２−ウロソン酸（Ｋｄｏ）の合成において欠陥を有する大腸菌Ｋ−１２株ＫＰＭ２２が報告されている。ＫＰＭ２２には、大部分がリピドＩＶ_Ａから成る細胞外膜（ＯＭ）がある。この生物の生存率は、細胞内膜から外膜へのリピドＩＶ_Ａの移送を促進するセカンドサイト抑制遺伝子（ｓｅｃｏｎｄ‐ｓｉｔｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）の存在によって得られる。この抑制遺伝子は、細胞内膜内におけるリピドＩＶ_Ａの蓄積といった毒性副作用を軽減し、ＯＭ生合成を支えるのに十分な量のＬＰＳ前駆体をもたらすことが報告されている。最大１μｇ／ｍＬのＬＰＳ前駆体添加量におけるヒト単核細胞によるＴＮＦ−アルファ分泌誘導に対する不能性として測定するに、この菌株から作製されたＬＰＳ前駆体には、エンドトキシン活性がほとんどない。非特許文献１１も参照されたい。

感染や敗血症性ショックと関わる用量制限副作用は、癌患者に対する生菌の全身投与を著しく制限する。この制限は、野生型細菌とも関連するし（例えば、非特許文献１２を確認のために参照されたい。）、また、腫瘍組織内で選択的に増殖し、修飾リピドＡを発現する、遺伝子的に弱毒化された細菌とも関連する（非特許文献１３を参照されたい。）。この制限は、癌治療において加熱死菌の活用をもたらした。例えば、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、特許文献５、特許文献６、および確認のために非特許文献１２を参照されたい。しかし、非感染性で、死滅した細菌でもなお、ＬＰＳ由来エンドトキシンや他の細胞成分と関連した、かなりの用量制限毒性を誘発する。この毒性は発熱性であり、敗血症性ショック症状をもたらし得る。したがって、細菌を用いた癌治療にはさらなる改良が必要である。

米国特許第６６８５９３５号明細書 米国特許出願公開第２００９／０３００７７９号明細書 米国特許第７３５４５９２号明細書 米国特許出願公開第２０１０／０２７２７５８号明細書 米国特許第８０３４３５９号明細書 欧州特許第１７６５３９１号明細書 米国特許第７４５２５３１号明細書 米国特許出願公開第２０１１／０２２４０９７号明細書 米国特許第４４３６７２７号明細書

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本発明は、癌であると診断された哺乳動物（例えばヒト）中の癌を、当該哺乳動物に所定量のグラム陰性菌を投与することにより治療するための組成物および方法を提供する。

ここで、前記菌は、（ｉ）非生菌、または哺乳動物体内において実質的に非生菌であり、（ｉｉ）エンドトキシン活性および／または発熱性を顕著に低下させ、そして（ｉｉｉ）癌細胞の増殖または転移能を抑制するのに十分な量が投与される、ものである。

いくつかの実施形態では、哺乳動物への投与に先立ち、（ｉ）放射線、（ｉｉ）化学滅菌、（ｉｉｉ）エンドトキシン（例えば、ポリミキシンＢまたはポリミキシンＥ）を不活性化する抗生物質、または（ｉｖ）ＫＤＯ２−リピドＩＶ_Ａの生合成を阻害するような抗生物質、による処理を行うことで、グラム陰性菌が非生菌化または実質的に非生菌化される。

何れか一つ以上の前記処理に代えて、または加えて、グラム無陰性菌は、ＫＤＯ２−リピドＩＶ_Ａの生合成を阻害または一部阻害する、或いは、ＫＤＯ２−リピドＩＶ_ＡのＯ−アシル化を防ぐ遺伝子欠損をさらに有する。

ＫＤＯ２−リピドＩＶ_ＡのＯ−アシル化を阻害または一部阻害する遺伝子欠損は、例えばｍｓｂＢやｌｐｘＭ遺伝子座を機能的に阻害する欠損を含む。

本開示の一態様において、組成物は、実質的に非生菌であり、エンドトキシン活性および／または発熱性を顕著に低下させるグラム陰性菌と、薬学上許容可能な賦形剤とを含有する。一実施態様では、グルタルアルデヒドを用いた処理により、グラム陰性菌を非生菌化した。また別の実施態様では、ポリミキシンＢまたはポリミキシンＥを用いた処理により、エンドトキシン活性および／または発熱性が低下した。さらなる実施態様では、グルタルアルデヒドを用いた処理により、エンドトキシン活性および／または発熱性が低下した。

別の態様として、癌であると診断された哺乳動物を治療するために、エンドトキシン活性および／または発熱性を顕著に低下させる実質的に非生菌のグラム陰性菌を所定量投与することを含み、投与される量が癌細胞の増殖または転移を阻害するのに十分な量である方法が提供される。

さらに別の態様として、本開示は、癌であると診断された哺乳動物（例えばヒト）に対し所定量のグラム陰性菌を投与することにより、哺乳動物の癌を治療する方法を提供する。ここで前記菌は、生菌であり、弱毒化はされていてもされていなくともよく、細胞外膜においてリポ多糖を顕著にまたは完全に消失させる遺伝子欠損を有する。また、その投与量は、癌細胞の増殖または転移能を阻害するのに十分な量である。

一実施態様では、本開示は、癌であると診断された哺乳動物に対し、細胞外膜においてリポ多糖を顕著に消失させる遺伝子欠損を有する生菌または非生菌のグラム陰性菌生物を所定量投与することを含む癌治療方法を提供する。その投与量は、癌細胞の増殖を阻害するのに十分な量である。

いくつかの実施態様では、前記遺伝子欠損は、ＫＤＯ２−リピドＩＶ_Ａの生合成を阻害または一部阻害し、或いは、ＫＤＯ２−リピドＩＶ_ＡのＯ−アシル化を防ぐ。

いくつかの実施態様では、癌は固形腫瘍である。

他の実施態様では、前記哺乳動物は、例えばシクロホスファミドなどの化学療法剤を追加投与される。また他の実施態様では、前記哺乳動物は、免疫機能阻害受容体の拮抗薬、または、例えばＴ細胞受容体やＴ細胞受容体リガンド（例えばＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２）の機能を阻害する受容体作動薬を追加投与される。

他の実施態様では、前記哺乳動物は、例えばＴ細胞受容体を刺激する作動薬などの、免疫機能刺激受容体の作動薬を追加投与される。好適な受容体ターゲットとしては、例えばＧＩＴＲ、４−１ＢＢ、ＣＤ４０、ＯＸ４０が挙げられる。

他の実施態様では、前記哺乳動物は、例えばインターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン−２、およびインターロイキン−１２などの免疫機能刺激サイトカインを追加投与される。

いくつかの実施態様では、グラム陰性菌はサルモネラ菌または大腸菌類である。

別の実施態様では、本開示は、グラム陰性菌をポリミキシンＢおよびグルタルアルデヒドを用いて処理することにより、前記菌におけるエンドトキシン活性および／または発熱性を消失または低下させる方法を提供する。一実施態様では、生存率が０％にまで低下し、エンドトキシン活性または発熱性が約９０％または９６％低下した。

ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）を用いた大腸菌の培養が、細菌細胞に関連するエンドトキシン活性のレベルを低下させることを示す図である。この点については実施例２でより詳細に記述する。 ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）を用いた大腸菌の培養が、細胞の生存率を低下させることを示す図である。この点については実施例２でより詳細に記述する。 グルタルアルデヒド（ＧＡ）を用いた大腸菌の培養が、細菌細胞に関連するエンドトキシン活性のレベルを低下させることを示す図である。詳細は実施例３に記載されているとおりである。 グルタルアルデヒド（ＧＡ）を用いた大腸菌の培養が、細胞の生存率を低下させることを示す図である。詳細は実施例３に記載されているとおりである。 未処理の大腸菌（図５Ａ）、１０００μｇ/ｍＬのＰＭＢで処理した大腸菌（図５Ｂ）、１％のＧＡで処理した大腸菌（図５Ｃ）、またはＰＭＢおよびＧＡの両方で処理をした大腸菌（図５Ｄ）の透過型電子顕微鏡画像である。この画像より、いずれの処理を行った後も細菌は無傷であることがわかる。詳細は実施例４に記載されているとおりである。 マウス皮下におけるマウスＢ１６Ｆ１０メラノーマの増殖について、ＰＭＢおよびＧＡで処理した大腸菌の用量依存効果を示すグラフである。詳細は実施例７に記載されているとおりである。 マウス皮下におけるマウスＢ１６Ｆ１０メラノーマの増殖について、未処理の大腸菌および１％のＧＡで処理を行った大腸菌の用量依存効果を示すグラフである。詳細は実施例８に記載されているとおりである。 マウス皮下におけるＣＴ２６マウス結腸直腸癌の増殖について、ＰＭＢおよびＧＡで処理を行った大腸菌の用量依存効果を示すグラフであり、図８Ａは、持続的にシクロホスファミドを用いなかった場合および用いた場合を示し、図８Ｂは、持続的に抗マウスＣＴＬＡ−４抗体を用いなかった場合および用いた場合を示す。詳細は実施例９に記載されているとおりである。

本明細書では、エンドトキシンおよび／または発熱活性を著しく低下させる非生菌グラム陰性菌生物を含有する組成物と、癌にかかった哺乳動物に対し、エンドトキシンまたは発熱活性を著しく低下させる非生菌グラム陰性菌生物を所定量投与することを含み、投与量が癌の増殖や転移を阻害するのに十分な量である癌治療方法とが提供される。

細菌を介した抗腫瘍活性をもたらすメカニズムとしては、腫瘍組織内での生菌生物の選択的増殖と、宿主免疫反応の刺激、特にはＬＰＳ（エンドトキシン）を介した宿主単核細胞からの殺腫瘍サイトカインの放出の誘導が、可能性として挙げられる。しかし、生菌の増殖およびＬＰＳ（エンドトキシン）を介したサイトカインの誘導（ＬＰＳがｍｓｂＢ変異体で弱毒化されていても）は、生菌を用いた哺乳動物の治療に関わる用量制限毒性をもたらすと考えられている。Ｔｏｓｏらが（非特許文献１３）、ｍｓｂＢで弱毒化したサルモネラ生菌を用いて癌患者を治療したところ、用量制限毒性は菌血症やサイトカイン放出に伴う副作用などを含んでいた。ヒト腫瘍をマウスに異種移植したモデルで見られる場合と比較し、腫瘍組織中の細菌増殖はより低く、サイトカインを介した毒性に対する感度はより高かった。生菌による全身増殖、および／または一つの第２級アシル鎖が欠乏しているＬＰＳを一部介したサイトカイン関連の毒性が、弱毒化されたグラム陰性生菌をマウス以外の哺乳動物（ヒトなど）に安全かつ効果的に投与することを妨げていると考えられている。マウスは、細菌感染およびサイトカイン誘導により生じる関連した敗血症に対し、比較的耐性があることで知られている。

理論に縛られることを望むものではないが、エンドトキシン活性および／または発熱性を顕著に低下させる死菌または非生菌のグラム陰性菌生物は、生きている菌生物または生菌生物を使用する場合と比べ、毒性が低くかつ癌治療に対しより効果的な量で癌患者に投与されることができると考えられている。生菌生物は、個々の患者の正常組織や腫瘍組織の中で実験者がコントロールできないような種々の態様で増殖し、治療効果が発揮されない程度に不十分に増殖したり、過剰に増殖したりして、結果として許容できないほどの毒性を生じる。また、エンドトキシン活性および／または発熱性を顕著に低下させる死菌または非生菌のグラム陰性菌生物は、野生型レベルのエンドトキシン活性および／または発熱性を生じる死菌を使用する場合と比べ、毒性が低くかつ癌治療に対しより効果的な量で癌患者に投与されることができるとも考えられている。

さらに、細菌外膜中の糖化リピドＡやＬＰＳの量を著しく減少させる、ＬＰＳの形成における遺伝子欠損を有するグラム陰性生菌生物は、哺乳類宿主中でのさらなる増殖を防ぐように弱毒化した生菌として投与するか、死菌として投与するかにかかわらず、癌治療に有用であるとも考えられている。このような生物は機能性ＬＰＳ分子が不足しており内毒素性ショックを引き起こしたり宿主免疫システムに刺激を与えたりするが、グラム陰性菌には、宿主の自然または複合自然（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｎｎａｔｅ）の適用性免疫反応を刺激し、腫瘍細胞を死滅させたり腫瘍の増殖を抑制するような別の特性があると考えられている。

本明細書に開示された一実施態様では、癌治療に使用されるグラム陰性生物は、非細菌性タンパク質（例えば、腫瘍特異性抗原）をコードしたり発現させたりするＤＮＡを有しない。したがって、腫瘍抗原に対する特定の免疫学的反応を直接誘発しない点において、このグラム陰性生物は癌ワクチンではない。そのかわり、この生物は、一般的には宿主自然免疫反応と、可能性として間接的に適応性抗腫瘍免疫反応とを刺激する免疫補助剤または生物学的修飾物質（ＢＲＭ）として機能する。いくつかの実施態様では、このグラム陰性生物は、腫瘍サイト中またはその周辺に直接注射され、または全身投与されて腫瘍中またはその周辺に蓄積された。この生物に対する増大した自然免疫反応は、副次的に腫瘍に対する反応になることもある。加えて、または代わりとして、この生物に対する免疫反応が、適応性抗腫瘍反応に加わることのできる既存の腫瘍抗原特有免疫細胞を刺激または活性化することもあり得る。

代替的な実施態様では、グラム陰性生物が、例えば腫瘍特異性抗原を含む非細菌性タンパク質や免疫システム刺激タンパク質の発現をコードするＤＮＡを発現させる。あらためて、この生物を腫瘍サイト中もしくはその周辺に、または全身に注射し、この生物、腫瘍特異性抗原、またはその両方に対する先天性または適応性免疫反応を誘発することができる。

本明細書で使用される「腫瘍特異性抗原」とは、腫瘍によって発現されるが、その腫瘍の元となった生物の正常細胞からは発現されない抗原を指す。「腫瘍関連抗原」とは、腫瘍によって発現され、またその腫瘍の元となった生物の正常細胞からも限られた程度で発現される抗原を指す。限られた程度での発現は、腫瘍細胞中よりも低いレベルで正常細胞中に発現すること、限られた種類の正常細胞中で発現すること、または胎児成育期のみに正常細胞により発現すること（すなわち胎児性抗原）を示し得る。本明細書において使用されるとおり、抗原とは、抗体または免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）によって免疫反応に認識され得る任意の分子である。

本明細書に記載される「免疫補助剤」および「生物学的修飾物質」とは、抗原、腫瘍、腫瘍関連細胞に対する免疫反応を強める任意の物質を指す。したがって、外来抗原、または疾病起因もしくは疾病関連細胞に発現した新抗原、あるいは構造的改変または構造的異常レベルの既存抗原に対して、免疫システムがより活発に反応するよう刺激する目的で、免疫補助剤や生物学的修飾物質が使用される。しかし、いくつかの実施形態では、例えば腫瘍特異的もしくは腫瘍関連抗原、またはサイトカインやケモカインといったヒト免疫活性タンパク質を発現する組み換え型グラム陰性菌を本願明細書に開示される方法において使用することが検討されている。代替的な実施形態では、サイトカインやケモカインなどの、精製した免疫活性タンパク質を、投与前にグラム陰性生物と混合するか、またはグラム陰性生物の注入前もしくは後に投与した。

本明細書に記載される「哺乳動物」には、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジなどの任意の哺乳類が含まれる。好ましい哺乳動物はヒトである。

「グラム陰性菌」とは、グラム染色として知られる手法の一部である第１塩基染色（例えば、クリスタルバイオレット）を保持しない細菌を指す。典型的なグラム染色では、まず細胞をスライドに熱固定し、塩基性染料（例えば、クリスタルバイオレット）で染色する。このとき、グラム陰性菌もグラム陽性菌もともに染色される。次にスライドを媒染剤（例えば、グラム染色用ヨウ素）で処理し、媒染剤が塩基性染料（例えば、クリスタルバイオレット）と結合すると共に塩基性染料を細胞中に取り込む。この細胞をアセトンかアルコールで洗浄し、異なる色の第２染料（例えば、サフラニン）で対比染色する。グラム陽性生物は初めに染色されたバイオレットを保持する一方、グラム陰性生物は有機洗浄剤により脱色され、対比染色を示す。典型的なグラム陰性菌には、特に限定されることなく、大腸菌種、赤痢菌種、サルモネラ菌種、カンピロバクター菌種、ナイセリア菌種、ヘモフィラス菌種、アエロモナス菌種、フランシセラ菌種、エルシニア菌種、クレブシエラ菌種、ボルデテラ菌種、レジオネラ菌種、コリネバクテリウム菌種、シトロバクター菌種、クラミジア菌種、ブルセラ菌種、シュードモナス菌種、ヘリコバクター菌種、ビブリオ菌種が含まれる。

グラム陰性生物には、多くの無害共生生物に加え、サルモネラ菌、大腸菌、ペスト菌、クレブシエラおよび赤痢菌、プロテウス、腸内細菌、セラチア菌、シトロバクター菌といったよく知られた多くの病原体が属する腸内細菌科という大きなファミリーが含まれる。腸内細菌科を構成する菌は、この科に属する菌種のうちいくつかが動物の腸内に生存することから、腸内細菌と呼ばれる。

腸内細菌科は桿菌であり、一般的に１〜５μｍの長さを持つ。腸内細菌科の菌は通性嫌気性菌にあり、糖を発酵させて乳酸やその他種々の最終生成物を生成する。多くは硝酸塩を亜硝酸塩に還元し、シトクロムＣ酸化酵素をほとんど有しない。また多くは運動用の鞭毛を有するが、非運動性の菌もある。腸内細菌科の菌は無胞子菌である。

「ベクター」とは、別の核酸を運ぶことができ、別の核酸に対して核酸単体としてリンクする核酸分子を指す。ベクターが動作可能にリンクされて遺伝子の発現を可能にするベクターを、本明細書中では「発現ベクター」という。本明細書で使われる「発現システム」は、発現ベクター中の配列がＲＮＡに転写され、それがＲＮＡ構造に折り込まれ、またはタンパク質に翻訳されるのを可能にする成分の組み合わせを示す。発現システムは、市販もしくは既知の方法で容易に作成できるインビトロ発現システムであったり、発現ベクターを有する真核性もしくは原核性宿主細胞といったインビボ発現システムであったりする。一般的に、ＤＮＡ遺伝子組み換え技術に有用な発現ベクターとは、通常、ベクター形状では細菌染色体と結合されていない環状二本鎖ＤＮＡを指す「プラスミド」のことである。従来技術において周知のその他の発現ベクターも発現システムにおいて使用することができる（例えば、コスミッドベクター、ファージミッドベクター、バクテリオファージベクター）。

「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）といったポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、および適切な場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）を指す。この用語は、核酸類似体から形成されたＲＮＡ類似体またはＤＮＡ類似体、および、本明細書に記載されている実施態様で適用可能なように、一本鎖（センス鎖またはアンチセンス鎖）や二本鎖のポリ核酸も、均等物として含むように理解されるべきである。

本明細書で使用されている「調整」は、上方調整（活性化または刺激（例えば、苦痛を与えたり、強化させることによって））と下方調整（阻害または抑制（例えば、拮抗させたり、減少させたり、阻害することによって））との両方を指す。「誘発性がある」とは、特に、構成要素ではないけれども刺激（例えば、温度、重金属、その他培地添加物）に対する反応として生じる遺伝子発現を指す。

Ａ．細菌生物の候補
本明細書に記載された方法に用い得る細菌生物の候補は、グラム陰性であり、且つ、野生型生物としてエンドトキシン活性を有するものに由来する。典型的なグラム陰性菌には、特に限定されることなく、大腸菌種、赤痢菌種、サルモネラ菌種、カンピロバクター菌種、ナイセリア菌種、ヘモフィラス菌種、アエロモナス菌種、フランシセラ菌種、エルシニア菌種、クレブシエラ菌種、ボルデテラ菌種、レジオネラ菌種、コリネバクテリウム菌種、シトロバクター菌種、クラミジア菌種、ブルセラ菌種、シュードモナス菌種、ヘリコバクター菌種、ビブリオ菌種が含まれる。またグラム陰性生物は、腸内細菌科、シュードモナス科、ナイセリア科、ベイヨネラ科、バクテロイデス科、ビブリオ科、パスツレラ科、フソバクテリア科に属するものであり得る。いくつかの実施態様において、候補生物は、サルモネラ菌種と大腸菌種である。

一つの候補であるサルモネラ生物、ＶＮＰ２０００９がＬｕｏらによって記述されている（非特許文献５）。ＶＮＰ２０００９は、ｍｓｂＢ部位やｐｕｒＩ部位が除去されたネズミチフス遺伝子改変菌株である。ＶＮＰ２０００９生菌を１×１０^４から３×１０^６ｃｆｕ／マウスの範囲で腫瘍を抱えたマウスに静脈投与することは、皮下移植されたＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ、および異種移植されたヒト腫瘍Ｌｏｘ、ＤＬＤ−１、Ａ５４９、ＷｉＤｒ、ＨＴＢ１７７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の増殖を阻害した。静脈投与されたＶＮＰ２０００９もまた、これらの動物における肺転移の成長を阻害した。特許文献３を参照されたい。

別の候補であるサルモネラ生物は、非特許文献２１に記載されたＳＬ３２３５である。ＳＬ３２３５は弱毒化されたサルモネラ菌株であり、生菌投与すると、マウス体内での形質細胞腫腫瘍の増殖を治癒できる。

さらに別の候補であるサルモネラには、非特許文献２で報告されている栄養要求性変異体が含まれる。ネズミチフス菌Ａ１−Ｒ変異体はロイシン−アルギニンに対して栄養要求性を示し、高い抗腫瘍毒性（ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）を有する。ビトロでは、Ａ１−Ｒは腫瘍細胞を感染させ核破壊を起こす。Ａ１−Ｒの投与は、ヌードマウスに同所移植されたヒト前立腺癌またはヒト乳癌の転移を治癒する。原発性骨肉腫または肺転移を有するヌードマウスに静脈投与（ｉ．ｖ．）されたＡ１−Ｒは、特に転移に対して、有効である。Ａ１−Ｒはまた、ヌードマウスに脾臓内投与した場合、膵臓癌の肝臓への転移（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）に有効だと報告されている。特許文献２、非特許文献３も参照されたい。

固形腫瘍の治療に適した種々のグラム陰性生物が特許文献１で報告されている。これらの生物は、投与されると腫瘍の中で優先的に複製するためスーパー感染性と呼ばれる。例えばネズミチフス菌のような腫瘍特異的変異体サルモネラ菌種がスーパー感染性として含まれる。単純ヘルペスウィルスからのチミジン・キナーゼ、大腸菌からのシトシン・デアミナーゼ、またはヒト・ミクロソームｐ−４５０オキシドレダクターゼといった自殺遺伝子を含有するサルモネラ菌種の腫瘍特異的変異体もスーパー感染性として説明されている。非特許文献１も参照されたい。

一実施態様では、生物として大腸菌を選択した。とりわけ検討した菌株は、大腸菌株２６１７−１４３−３１２、（Ｍｉｇｕｌａ）Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ（ＡＴＣＣ（登録商標）１３０７０（商標））である。使用可能な追加の大腸菌株には、ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ（登録商標）４７０７６）やＫＹ８２８４（ＡＴＣＣ（登録商標）２１２７２）が含まれる。

本明細書に記載された方法に使用されたグラム陰性生物は、野生型生物とは異なるＤＮＡを含んだり発現したりする組み換え生物である必要はない。しかし、いくつかの実施態様においては、原生種ではない分子を発現させるように生物を改変してもよい。例えば特許文献７では、一つ以上の初期エフェクター分子を固形腫瘍サイトに運ぶための弱毒化した腫瘍標的細菌ベクターを調製して使用することが報告されている。この方法によれば、宿主に全身投与すると毒性を発し得るエフェクター分子を、弱毒化して宿主に対する毒性を低減させた腫瘍標的細菌によって、腫瘍部分に局所的に運ぶことができる。具体的には、弱毒化した腫瘍標的細菌は、一つ以上の初期エフェクター分子をコードするよう改変された通性好気性菌または通性嫌気性菌となり得る。初期エフェクター分子には、ＴＮＦサイトカイン科、抗血管新生因子、および細胞毒性ポリペプチドもしくはペプチドに属するものが含まれる。本開示の初期エフェクター分子は、例えば悪性腫瘍癌、メラノーマ、リンパ腫、肉腫、またはこれらの腫瘍の転移といった固形腫瘍癌の治療に有用である。

Ｂ．細菌エンドトキシン活性の低下
細菌生物のエンドトキシン活性および／または発熱性の低下には、種々の方法を用いることができる。本明細書で使用されているように、「エンドトキシン活性」とは、発熱や敗血症性ショックを含む毒性を発生し得るグラム陰性菌の部分を指す。エンドトキシンに寄与する毒性の影響は、グラム陰性菌の外膜中に存在する、または外膜に由来する、リポ多糖分子の糖化リピドＡ部分と関連することが判明している。

「リポ多糖（ＬＰＳ）」とは、共有結合により結合したリピドおよび多糖（グリコフォスホリピド）からなる巨大分子を指す。ＬＰＳは３つの構成：１）Ｏ抗原、２）コアオリゴ糖、および３）リピドＡからなる。Ｏ抗原はグリカンを繰り返し単位とする高分子で、コアオリゴ糖に結合しており、ＬＰＳ分子の最外領域を構成する。コアオリゴ糖はリピドＡに直接結合し、通常ヘプトーズや３−デオキシ−Ｄ−マンノオクツロン酸（ケト−デオキシオクツロン酸塩、ＫＤＯとしても知られる）といった糖を含む。リピドＡは複数の脂肪酸と連結したリン酸化グルコサミン二糖類である。脂肪酸はＬＰＳを細菌膜中に留め、残りのＬＰＳは細胞表面から突出する。ＬＰＳが突然変異したり取り除かれたりすると、細菌が死ぬ場合がある。

エンドトキシン活性はＬＰＳのリピドＡ領域部分に存在する。細菌細胞が免疫システムによって溶解すると、リピドＡを含有する膜断片が一連の循環中に放出され、発熱、下痢、また可能性としては致命的ショック（エンドトキシン性または敗血症性ショックと呼ばれる）を引き起こす。ＬＰＳの毒性は、哺乳類免疫システムのＢ細胞やマクロファージとの相互作用を通じ、リピドＡによって発現する。この過程は、宿主にとって致命的な結果をもたらし得る、炎症誘発性サイトカイン、主に腫瘍壊死要因（ＴＮＦ）を分泌させる。リピドＡは、ビボにおけるマウスＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞だけでなく、ビトロにおけるヒトＴ−リンパ球（Ｔｈ−１）をも活性化させる。この特性は、宿主の免疫システムが、種々のサイズのＬＰＳ糖鎖に対する特定の既往ＩｇＧ抗体反応を高めることを可能にする。これらより、近年ＬＰＳは、インビボにおけるＴ細胞依存性抗原として認識されている。

エンドトキシン活性は従来技術において良く知られた方法で測定することができ、例えば、カブトガニの血液を用いたカブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）評価は、ごく低レベルのＬＰＳまで検出できる。エンドトキシン活性があると、酵素カスケードを経た増幅があるため、カブトガニ血液ライセート試薬が凝固してしまう。ＬＡＬ評価のゲル凝固タイプ、比濁タイプ、比色タイプは市販されている。例えば、ニュージャージー州ＡｌｌｅｎｄａｌｅのＬｏｎｚａ社，およびメリーランド州ＧｅｒｍａｎｔｏｗｎのＣｌｏｇｅｎ Ｌａｂｓ社を参照されたい。

Ｈｙｇｌｏｓ社（ドイツ、ミュンヘン地区）のＥｎｄｏＬＩＳＡ（登録商標）など、酵素関連免疫吸着測定法（エライザ診断）に基づくエンドトキシン活性評価も知られている。この評価法では、固相に結合されたＬＰＳ特異ファージ・タンパク質を使用してＬＰＳを捉え、洗浄工程の後に、組み換えファクターＣを添加することによりＬＰＳの存在を決定する。ファクターＣは、ＬＰＳで活性化されると、化合物を分断して蛍光を発する。カブトガニ血液ライセート試薬中に存在するファクターＣは、通常、酵素前駆体として存在し、ＬＡＬ試験において発生する凝固カスケードのプライマーである。

エンドトキシン活性は、インビトロの主要末梢血単核から、或いは、エンドトキシン源候補で動物を処理し、処理後１−４時間経った動物から得られたプラズマ中のＴＮＦ−アルファのレベルを測定することにより、ＴＮＦ−アルファ分泌の誘発を評価することによっても測定できる。哺乳類の主要末梢血単核細胞はＬｏｎｚａ社（Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ニュージャージー州、米国）などの会社から購入できる。細胞上清またはプラズマ中のＴＮＦ−アルファレベルは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州、米国）、Ａｂｃａｍ社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、マサチューセッツ州、米国）、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国）などから購入可能なエライザ診断キットで決定できる。

エンドトキシン活性はまた、静脈投与された生物またはその誘導体に対するウサギの発熱性（直腸温度の上昇）を測定することによってもインビボ評価できる。

グラム陰性生物のエンドトキシン活性および／または発熱性は、野生型生物のものと比較して、著しく低下させることができるかもしれない。エンドトキシン活性の著しい低下率は約７０％よりも大きいことが好ましく、約７５％よりも大きいことがより好ましく、約８０％よりも大きいことがより好ましく、約８５％よりも大きいことがより好ましく、約９０％よりも大きいことがより好ましく、約９５％よりも大きいことがさらに好ましく、約９９％よりも大きいことがさらにより好ましい。

グラム陰性生物のエンドトキシン活性を低下させるのに、種々の方法が利用可能である。その方法には、ＬＰＳと結合する試薬またはＬＰＳの生成を阻害する試薬を用いた生物の処理や、ＬＰＳを改変したりＬＰＳの生成を阻害したりするように細菌生物を遺伝子操作することが含まれる。

一実施態様では、エンドトキシンを不活性化する抗生物質で細菌生物を処理することにより、エンドトキシン活性または発熱性を低下することができる。これに適する抗生物質はポリミキシンＢまたはポリミキシンＥである。例えば、Ｃｏｏｐｅｒｓｔｏｃｋらは、ポリミキシンＢを用いた処理が、百日咳菌、大腸菌、インフルエンザ菌、緑膿菌を含むグラム陰性菌ワクチンにおけるＬＰＳの抗炎症反応を低下させると、非特許文献２２の中で報告している。抗生物質量や処理条件を決定することは、当業者の技術範囲内のことである。一実施態様では、ポリミキシンＢかＥかを問わず、１ｍＬあたり１×１０^７から５×１０^１０の細菌に対し、約３ｍｇから５０００ｍｇの濃度のポリミキシンを用いることができる。別の実施態様では、ポリミキシンの濃度は、１ｍＬあたり１×１０^７から５×１０^１０の細菌に対し、約２００ｍｇから５０００ｍｇとすることができる。また、一実施態様では、１０分から４時間の間、または約３０分から約３時間の間、抗生物質を細菌に付与した。一実施態様では、ＭｇＣｌ_２の形でのマグネシウム（Ｍｇ）の存在下で細菌を増殖させ、細菌完全性を維持するのに適切な温度にて、ＭｇＣｌ_２の存在下でポリミキシンを用いて処理をした。一実施態様では、増殖培地におけるＭｇＣｌ_２濃度を約０．５ｍＭから約５．０ｍＭ、または約２ｍＭとし、処理培地におけるＭｇＣｌ_２濃度を約５．０ｍＭから約３０ｍＭ、または約２０ｍＭとした。一実施態様では、処理培地の温度を約２℃から約１０℃、または約４℃とした。細胞完全性は、３０００ｘｇで１０分間遠心分離を行った後の明確に規定されたペレットにおける回復効率、および、電子顕微鏡法により決定した。好ましい実施態様では、処理および洗浄後の細菌回復は約８０％よりも高く、電子顕微鏡法では細菌は無傷に見えた。

別の実施態様では、ＫＤＯ２−リピドＩＶ_Ａの生合成を阻害することで知られる抗生物質で細菌生物を処理することにより、エンドトキシン活性を低下させることができた。例えば、非特許文献１０は、ＣＴＰ:ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノオクツロソン酸シチジリル基転移酵素の活性を特異的に阻害し、３−デオキシ−Ｄ−マンノオクツロソン酸（ＫＤＯ）がグラム陰性生物のＬＰＳ内に入り込むことを抑えるのに有用な抗生剤ＩＩＩを含む抗生剤について説明している。ＬＰＳ合成が止むと、細菌の増殖も止む。ＬＰＳ前駆体種であるリピドＡへのＫＤＯの添加は、ネズミチフス菌および大腸菌のどちらにおいても、リピドＡ−ＫＤＯ形成の主要経路である。一実施態様では、抗生物質は抗生剤ＩＩＩであり、グラム陰性菌は、適量（例えば５ｍｇ／ｍＬから５００ｍｇ／ｍＬ）かつ適切な時間（例えば２から８時間）で処理された。

エンドトキシン活性の低下は、生物に遺伝的欠損を導入することでも達成できる。本明細書の「欠損」とは、遺伝子または遺伝子の発現に関しては、遺伝子が通常の（野生型）遺伝子とは異なるか、または遺伝子の発現が野生型遺伝子の場合と比較して低いレベルであることを指す。欠損遺伝子はその遺伝子中の変異体から生じることもあるし、その遺伝子の発現を制御する変異体から生じることもある（例えば、転写または転写後）。

一実施態様では、エンドトキシン活性の低下は、ＫＤＯ２−リピドＩＶ_Ａの生合成を阻害する遺伝的欠損を導入することによっても達成できる。例えば、Ｗｏｏｄａｒｄらは、特許文献４において、非毒性のグラム陰性生菌（例えば大腸菌）は、外膜中のＬＰＳが著しく不足していると報告している。また筆者らは、大腸菌Ｋ−１２の菌株であるＫＰＭ２２は、３−デオキシ−Ｄ−マンノオクツロソン酸（Ｋｄｏ）の合成において欠損があると説明している。ＫＰＭ２２は、糖化をほとんど有しないＬＰＳ前駆体であるリピドＩＶ_Ａで主に構成される外膜（ＯＭ）を有する。生物の生存率は、リピドＩＶ_Ａを内膜（ＩＭ）から外膜へと運ぶセカンドサイト抑制遺伝子の存在により達成される。この抑制遺伝子は、内膜中のリピドＩＶ_Ａの蓄積の毒性副作用を軽減し、ＯＭ生合成を補助するのに十分な量のＬＰＳ前駆体をもたらすと報告されている。非特許文献１１も参照されたい。

別の実施形態では、Ｂｒａｍｈｉｌｌらが、特許文献８で、ＴＬＲ４／ＭＤ２の作動薬として働くリピドＡまたは６−アシルリポ多糖のようなリガンドを実質的に持たない外膜を有するグラム陰性生菌について説明している。Ｂｒａｍｈｉｌｌによれば、このような細菌は、アラビノース−５−リン酸イソメラーゼの低下した活性と、一つ以上の抑制遺伝子変異体とを、例えば輸送体中に有してリピドＩＶ_Ａを運ぶための輸送体の容量を高め、或いは、膜タンパク質ＹｈｊＤ中に有し得る。一つ以上の遺伝子（例えばＩｐｘL，ＩｐｘＭ，ｐａｇＰ，ＩｐｘＰおよび／またはｅｐｔＡ）を著しく取り除くか、および／または一つ以上の酵素（例えばＬｐｘＬ，ＬｐｘＭ，ＰａｇＰ，ＬｐｘＰおよび／またはＥｐｔＡ）を著しく不活性化することができる。

別の実施形態では、Ｋｄｏの合成を妨げるような遺伝子欠損を導入することによりエンドトキシン活性を低下することができるかも知れない。例えば、Ｒｉｃｋら（非特許文献７）は、ＬＰＳの３−デオキシ−Ｄ−マンノオクツロン酸（ケトデオキシオクトン酸）領域内での合成において欠損を有し、増殖のためにＤ−アラビノース−５−リン酸を要するネズミチフス栄養要求性変異体について報告している。この変異体の欠損は、Ｄ−アラビノース−５−リン酸に対して親酵素の３５倍の見掛けＫ（ｍ）を有する改変ケトデオキシオクトン酸−８−リン酸合成酵素（ｋｄｓＡ）に起因していた。これは、変異体菌株を、完全なＬＰＳの増殖および合成に関して、外因性Ｄ−アラビノース−５−リン酸に依存させた。別の例では、Ｂｅｌｕｎｉｓらは、非特許文献８において、大腸菌中のＫｄｏ転移酵素（ｋｄｔＡ）遺伝子を阻害し、ＫｄｏがリピドＩＶ_Ａ内に組み込まれることを抑制した。この変異体は致死であるが、温度感受性プラスミドコードＫｄｔＡの条件付き存在下により救済することができる。Ｋｄｏ合成経路中での条件付き変異体の成長は、細菌の増殖を許容し、非許容状態下に移されることで、エンドトキシン活性が顕著に低下された非生菌を作り出すのに十分な増殖または生存をもたらす。

ＬＰＳ由来のエンドトキシンに加え、外膜タンパク質、線毛（ｆｉｍｂｒｉａｅ、ｐｉｌｉ）、リポペプチド、リポタンパク質などを含むグラム陰性生物の様々な他の構成成分も、発熱性や敗血症性ショックを誘発、寄与し得る（非特許文献２３に説明されている）。発熱性は、ラビット方法という従来周知の方法で測定することができる。ラビット方法は、推定発熱物質を静脈投与した後の直腸温度の評価を含む。

ポリミキシンＢとグルタルアルデヒトとの混合物でグラム陰性生物を処理すると、ラビット体内での発熱性の低下が３０倍となることが判明している。一実施形態では、１０００μｇ／ｍＬのポリミキシンＢと１％のグルタルアルデヒドを用いることで、ラビット体内で測った発熱性の低下が３０倍となった。発熱性は、ポリミキシンＢとＬＰＳとの反応、およびグルタルアルデヒドのＬＰＳおよび／または他の細菌構成成分との反応性の組み合わせにより低下する。ここにおいて、グルタルアルデヒドは、細菌も死滅させるので、二つの役割を果たす。したがって、一実施形態では、１０００μｇ／ｍＬのポリミキシンＢと１％のグルタルアルデヒドとの組み合わせでグラム陰性菌微生物を処理することにより、グラム陰性菌微生物のエンドトキシン活性と発熱性を低下させる方法と、グラム陰性菌微生物を殺菌する方法とが提案されている。別の実施形態では、グラム陰性菌は、一回投与量を約３μｇ／ｍＬから約１０００μｇ／ｍＬの範囲としたポリミキシンＢと、一回投与量を約０．１％から約１．０％の範囲としたグルタルアルデヒドとの組み合わせで処理されている。さらなる実施形態では、ポリミキシンＢの一回投与量の範囲を約１００μｇ／ｍＬから約１０００μｇ／ｍＬとし、グルタルアルデヒドは約０．５％から約１．０％の投与量範囲とした。加えて、グラム陰性菌は、例えば一回投与量の範囲が約１０００μｇ／ｍＬから約３０００μｇ／ｍＬのポリミキシンＢと、一回投与量の範囲が約０．５％から約１．０％のグルタルアルデヒドとを用いて処理することもできる。別の態様として、グラム陰性菌を、例えば一回投与量の範囲が約３０００μｇ／ｍＬから約５０００μｇ／ｍＬのポリミキシンＢと、一回投与量の範囲が約０．５％から約２．０％のグルタルアルデヒドとを用いて処理することもできる。一実施形態では、エンドトキシン活性が約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９２％低下し、発熱性が約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％、または約９７％低下した。

Ｃ．細菌の非生菌化
本開示の方法による投与に用いられる細菌は、投与前または投与に際して、非生菌化または実質的に非生菌化した。「非生菌」というのは、生物を外からの試薬で処理することにより死滅させること、および／または生物が哺乳動物の宿主内で生存できなくさせる変異体を含むことを意味する。実質的に非生菌とは、その生存率が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上低下した菌株である。死滅していないか、または完全には死滅しきれていない細菌に対する好ましい実施形態において、細菌は、哺乳動物体内で増殖できない程度にまで更に処理または改変された。ＬＰＳが実質的に作られないようないくつかの実施形態では、非生菌、弱毒化菌、または生菌の投与を検討した。

細菌の非生菌化の好ましい方法は、ＬＰＳと結合してエンドトキシン活性をブロックするような化合物を用いた処理か、またはＬＰＳ生合成を妨げるような化合物を用いた処理である。ＬＰＳ結合およびＬＰＳ生合成の阻害のどちらの方法でも、細胞外皮の透過性上昇の結果として生存率が低下した。別の試みは、ＬＰＳ生合成経路における条件付き変異を用いることで細菌株を増殖させることである。この変異は、細菌株の増殖の間は抑制されており、その後、変異を活性化してＬＰＳ生合成を阻害する非許容状態へと移される。それぞれの例において、行われる工程は、各環境において、生存率を実質的に失活させつつ高い細菌細胞完全性を維持するように最適処理時間や化合物の最適投与量を決定することにより、細菌を非生菌化するものである。非生菌が１００％未満のケースでは、哺乳動物体内における生菌のさらなる増殖を防ぐ変異体を含む細菌を使用することができる（例えば、非特許文献２４、非特許文献２５に説明されるようなジアミノピメリン酸栄養要求株）。

代替的な、または追加の細菌非生菌化方法を望むなら、細菌を殺す好ましい方法は、電離放射線（ガンマ線や電子ビーム）があるが、湿式・乾式加熱、滅菌ガス・蒸気（非特許文献２６を参照されたい。）といった他の標準的な滅菌方法を用いることもできる。使用し得る追加の非標準的な最終滅菌手法としては、化学滅菌といった化学処理が挙げられ、これは非特許文献２７、および非特許文献２８にまとめられている。化学ガス、蒸気および液体滅菌剤の例としては、エチレンオキシドガス（ＥＯＧ）、二酸化塩素、気相過酸化水素水（ＶＨＰ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド（例えば、≧０．０５％、≧１０分間）、オルト−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）（例えば、≧０．１％、≧５分間）、およびフェノールが挙げられる。細菌の死滅方法は、生物の完全性に影響を及ぼし得る。例えば、放射線の使用とは対照的に、加熱は細菌完全性にダメージを与えることがある。本明細書で使用された細菌生物としては、完全無欠な生物や、生物を死滅させたときに生じ得る生物の一部退化した形態を含むが、細胞壁分画（調製物）または細胞壁骨格（特許文献９を参照されたい。）、細胞質分画、およびこれに類する他の細胞成分から分離された生物の細胞内分画までは含まれない。

Ｄ．組成物
一実施形態では、エンドトキシンおよび／または発熱活性を著しく低下させた非生菌グラム陰性菌生物と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含有する組成物が提案される。別の実施形態では、少なくとも約８０％の生物が非生菌、または少なくとも約９０％の生物が非生菌、または約１００％の生物が非生菌である。一実施形態では、生物は、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％低下した生存率を有している。

一実施形態では、エンドトキシンおよび／または発熱活性が約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％低下した。組成物は、エンドトキシンまたは発熱毒性の任意の予定減少量との組み合わせにおいて、任意の予定量の非生菌または生菌性の低下した細菌を含んでいてもよい。別の実施形態では、組成物は、少なくとも約９５％したエンドトキシン活性および発熱性を有する約１００％非生菌生物を含んでいる。

本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載されている種々の方法で処方することができる。一実施形態では、組成物は、本明細書中に記載されている生物と、薬学上許容可能な担体とを含んでいる。

「薬学上許容可能な担体」とは、組成物において使用され得る任意の希釈剤、賦形剤、または運搬体を指す。薬学上許容可能な担体には、イオン交換体；アルミナ；ステアリン酸アルミニウム；レシチン；ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質；リン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムなどの緩衝物質；植物性飽和脂肪酸の部分的グリセリド混合物；水；硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩などの塩または電解質、コロイドシリカ、３ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、羊毛脂が含まれる。適した調剤担体は、本技術分野において標準的な参考文献である非特許文献３０に記載されている。これらの担体は、経口錠剤、カプセル、エリキシル剤、シロップなどの意図する投与剤形の観点から選ばれ、従来の薬学上の慣行と合致する。

薬剤組成物は、従来周知の方法、中でも、発酵槽で微生物培養した後に、遠心分離による濃縮および洗浄、ろ過または透析、通常の造粒、混合、溶解、カプセル化、凍結乾燥、または乳化工程を経る方法により製造できる。組成物は、顆粒、沈殿物、粒子、フリーズドライ、回転乾燥、スプレードライパウダー、アモルファスパウダーを含む粉体、注射液、乳化液、エリキシル剤、懸濁液や溶液といった様々な剤形で製造できる。製剤処方は、任意に、安定剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ調整剤、またはこれらの組み合わせを含むこともできる。

薬剤組成物は、油、水、アルコール、これらの組み合わせなどの滅菌液を用いて、懸濁液や溶液として調製できる。薬学上適切な界面活性剤、懸濁剤、または乳化剤を、経口投与または非経口投与用に添加することができる。懸濁液は、ピーナツオイル、セサミオイル、コットンシードオイル、コーンオイル、オリーブオイルなどの油を含んでいてもよい。また、懸濁液調製物は、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、脂肪酸グリセリド、アセチル化脂肪酸グリセリドなどの脂肪酸エステルを含んでいてもよい。懸濁液調製物は、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサデシルアルコール、グリセロール、プロピレングリコールなどのアルコールを含んでもよい。ポリ（エチレングリコール）などのエーテル、鉱物油、ワセリンなどの石油炭化水素、そして水も懸濁液調製物に用いることができる。

組成物は、哺乳類、好ましくは人間に対して薬剤投与する目的で調製される。このような本発明の薬剤組成物は、非経口を含めた種々の方法で投与され得る。本明細書の「非経口」とは、皮下、静脈、筋肉、関節内、滑液嚢内、肋骨下、くも膜下、肝内、病巣内および頭蓋内の注射または点滴技術を含む。

滅菌注射可能な組成物の剤形としては、水性または油性の懸濁液が挙げられる。この懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤と、懸濁剤とを用いた従来公知の技術によって調剤することができる。滅菌注射可能な組成物は、例えば１，３−ブタンジオールの溶液などの、無毒で非経口摂取が可能な希釈液や溶媒の滅菌注射可能な溶液または懸濁液であり得る。中でも、使用される好ましい溶媒（ビークル）および溶剤は、水、リンガー溶液、生理食塩水である。加えて、滅菌された固定油は、溶剤または懸濁媒体として従来から使用されている。このため、合成モノ−またはジ−グリセリドなど任意の無菌性固定油を使用することができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、オリーブオイル、ひまし油などの天然の薬学上許容された天然オイルであるため、特にポリオキシエチル化された場合に、注射可能な剤形に調製するのに有用である。これらの油性溶液または油性懸濁液は、乳化物や懸濁液といった薬学上許容される投与剤形の調製に通常使用されているカルボキシメチルセルロースやそれに類似する分散剤などの長鎖アルコール希釈液や分散液を含んでいてもよい。その他広く使用されている界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（商品名）、Ｓｐａｎ（商品名）、その他の乳化剤、或いは、薬学上許容される固形、液体、その他の投与剤形の製造に通常使用されているバイオアベイラビリティ・エンハンサーもまた、調製用に使用することができる。組成物は、急速静注法や持続注入といった非経口投与用にも処方することができる。

Ｅ．癌治療方法
本明細書に記載された方法による治療に適する癌としては、一般的に上皮性悪性腫瘍癌、白血病またはリンパ腫、非上皮性悪性腫瘍（肉腫）である。上皮性悪性腫瘍癌としては、肛門、胆道、膀胱、乳、結腸、直腸、肺、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、腎臓、胆嚢および胆管、小腸、尿路、女性生殖系管、男性生殖系管、内分泌腺、甲状腺、および皮膚のものが挙げられる。その他適する癌としては、カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、頭頸部腫瘍、未知の原発性腫瘍、血管腫、黒色腫（メラノーマ）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、そして脳、神経、目、髄膜の腫瘍が挙げられる。

いくつかの実施形態では、治療対象の癌は、例えば上皮性悪性腫瘍、肉腫、メラノーマ、リンパ腫などの固形腫瘍を形成している。

本明細書に記載された癌治療は、癌の増殖や転移を阻害するのに十分な量のグラム陰性生物（生菌、死菌かはそれぞれの適正に応じて）を投与することにより実現する。本明細書において使用する「十分な量」の語は、被験者に有益な効果をもたらすのに十分な投与量（または連続投与量）のことをいう。任意の特定対象物に対する具体的な治療効果のある投与レベルは、治療対象の癌の種類、癌の重症度、特定の生物または混合組成物の活性度、投与経路、生物または混合組成物のクリアランス速度、治療時間、（もしあれば）生物と一緒に使用した薬、および被験者の年齢、体重、性別、食習慣、一般的な健康状態、そして医術および医療科学においてよく知られている同様の要因といった、様々な要因に依存する。「治療効果のある量」を決定するに当たって考慮される種々の一般的な事柄は、当業者の間でも知られており、例えば、非特許文献２９や、非特許文献３０にも記載されている。投与レベルは、典型的には約０．００１から１００ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲内に収まり；通常は約０．０５から１０ｍｇ／ｋｇ／日が化合物にとっての適用範囲である。投与された生物に対する投与レベルは、典型的には約１０^６から１０^１２／ｍ^２の範囲に収まる。組成物は、経脈管、静脈、動脈、筋肉、皮下などの非経口、経口、または同様の方法で投与することができる。細菌生物は、経脈管投与、静脈投与、動脈投与、筋肉投与、皮下投与、腹腔内投与、または膀胱内投与などの非経口投与することができる。

治療効果のある投与量は、従来周知の手法で推量できる。マウス腫瘍を有する免疫応答性マウス、またはヒト腫瘍が異種移植された免疫低下マウス（例えばヌードマウス）を用いた癌動物モデルが従来周知であり、参照のために本明細書に組み込まれている多くの文献でも広く説明されている。これらの情報は、ラット、イヌ、および／または人間以外の霊長類の安全性試験と併用することにより、ヒトにおける安全で可能性のある初期投与量を決定するのに活用されている。生物の投与量を推定するためのさらなる情報は、実際のヒトの癌で試験することにより得られる。例えば、Ｔｏｓｏらは（非特許文献１３、ページ１４２−１５２）、転移メラノーマを持つ患者に対してＶＮＰ２０００９生菌を投与したフェーズＩの臨床試験について報告している。患者は、１０（６）から１０（９）ｃｆｕ／ｍ（２）のＶＮＰ２０００９を３０分間ボーラス静脈注入された。最大許容投与量は３×１０（８）ｃｆｕ／ｍ（２）であった。１×１０（９）ｃｆｕ／ｍ（２）の投与を受けた患者には、血小板減少症、貧血症、持続性菌血症、高ビリルビン血症、下痢、嘔吐、吐き気、アルカリ性ホスファターゼの上昇、低リン血症などの用量制限毒性が見られた。

本発明の生物は薬学上許容できる剤形で投与することができる。「薬学上許容できる」とは、生物学的なものではないか、或いは望ましくないものではない原材料を指す。つまり、選択された生物または混合化合物と一緒に個体に投与しても、いかなる望ましくない生物学的効果も生じないし、他のいかなる投与剤とも有害な作用を起こさない原材料である。この点についてはより十分に上述されている。

本明細書に記載されている、ある状態や疾病のために対象を「治療する」とは、治癒することの他に、少なくともその状態や疾病の一症状を改善することも含むものと意図する。癌が治癒した時、癌が寛解した時、余命が統計上顕著に延びた時、腫瘍の進行にかかる時間が統計上顕著に延びた時、リンパ腫または造血器腫の各タイプに対して確立された標準基準に基づいてリンパ腫または造血器腫の全身腫瘍組織量が軽減した時、固形腫瘍における応答評価基準（非特許文献３１および非特許文献３２）に基づいて全身固形腫瘍組織量が減少した時に、癌患者が治療されたという。本明細書に記載されている「寛解」とは、以前癌の証拠が見られた患者の体内で増殖する癌細胞が存在しなくなることを指す。よって、寛解状態にある癌患者は、癌が治癒したか、癌は存在するものの容易に検出されない状態にある。したがって、腫瘍が成長できない時や転移できない時に癌が寛解したと言える。本明細書にある完全寛解とは、Ｘ線、ＭＲＩ、ＣＴ、ＰＥＴなどのイメージング診断や、血液や骨髄の生体検査といった診断法で示されるものとして、疾病が存在しないことを指す。癌患者が寛解に向かっても、癌が再発してぶり返すこともある。

とくに断りがない限り、「著しく」とは約８０％よりも大きいことを意味し、約９０％よりも大きく、約９５％よりも大きく、そして約９９％よりも大きい。

Ｆ．癌治療の組み合わせ
本明細書に記載された癌治療方法は、宿主免疫応答を負に調節する一つ以上の受容体拮抗薬またはリガンドと一緒のグラム陰性生物の投与を採用してもよい。拮抗薬は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＴＬＡ−４に対するものでよく、通常は、例えば約０．０３ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇの範囲で、１週間から４週間ごとに静脈投与される。

プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）は、ヒトの体内ではＰＤＣＤ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＰＤ−１はまた、ＣＤ２７９（分化２７９のクラスタ）に分類される。ＰＤ−１は２６８のアミノ酸からなるＩ型膜タンパク質である。ＰＤ−１は、Ｔ細胞調節遺伝子（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）の拡大ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーのメンバーである。例えば、非特許文献３３を参照されたい。このタンパク質は、細胞外ＩｇＶ領域を有し、次いで膜貫通領域と細胞内尾部を有する。細胞内尾部は、免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフと免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ内に二つのリン酸化サイトを有する。これは、ＰＤ−１がＴＣＲシグナル伝達を負に調節することを示唆する。ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージの表面に発現する。ＰＤ−１は免疫反応の広域負調節剤である。

ＰＤ−１は、Ｂ７ファミリーのメンバーであるＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２の二つのリガンドを有する。例えば、非特許文献３４および非特許文献３５を参照されたい。ＰＤ−１は４０ｋＤａの１型膜貫通タンパク質であり、妊娠、同種移植、自己免疫疾患、肝炎中の免疫システムを抑制する主な役割を担っていることが報告されている。ＰＤ−Ｌ１タンパク質は、ＬＰＳやＧＭ−ＣＳＦ処理に対する反応としてマイクロファージや樹枝状細胞（ＤＣ）上で上方調整され、ＴＣＲやＢ細胞受容体シグナル伝達に対してはＴ細胞やＢ細胞上で上方調整される。ＰＤ−１受容体／ＰＤ−Ｌ１リガンド複合体の形成は、阻害シグナルを伝え、（免疫反応中の）リンパ節におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を減少させる。またＰＤ−１は、アポトーシスを通じて、リンパ節中の外来抗原特異性Ｔ細胞の蓄積をコントロールすることができる。ＰＤ−Ｌ２の発現はより制限されており、主に樹枝状細胞やいくつかの腫瘍株により発現する。

ＣＤ１５２（分化１５２のクラスタ）としても知られているＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４）は、免疫システムを下げるタンパク質受容体である。ＣＴＬＡ−４はヘルパー、エフェクター、および免疫制御性Ｔ細胞の表面に発現し、それにより細胞免疫が抗原を攻撃する。Ｔ細胞はＣＤ２８受容体を刺激することで働きはじめ、ＣＴＬＡ−４受容体を刺激することで働きを止めることができる。Ｔ細胞共刺激タンパク質のように、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８は、それぞれ、Ｂ７−１、Ｂ７−２とも呼ばれるＣＤ８０，ＣＤ８６と抗原の存在する細胞上で結合する。Ｔ細胞受容体およびＣＤ２８を通じたＴ細胞の活性化は、Ｂ７分子の抑制性受容体であるＣＴＬＡ−４の増加した発現を引き起こす。

ＣＴＬＡ−４やＰＤ−１に対する単クローン抗体（ｍＡｂｓ）により、Ｔ細胞活性を強化したり長くしたりすることができる。イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）およびトレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）はＣＴＬＡ−４を阻害する単クローン抗体であり、抗腫瘍免疫反応を誘発したり高めたりして、耐久性のある抗腫瘍効果をもたらすことが示されている。イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０またはＭＤＸ−１０１としても知られている）は、ブリストル・マイヤーズ スクイブ社（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）から商品名Ｙｅｒｖｏｙで、切除不能または転移性の悪性メラノーマの治療用として米国市場で販売されている。ＢＭＳ−９３６５５８（ＭＤＸ−１１０６）は、ＰＤ−１に対する単クローン抗体であり、ヒトの臨床試験において著しい抗腫瘍活性を示している。例えば、非特許文献３６、非特許文献３７、および非特許文献３８を参照されたい。

ＣＴＬＡ−４の阻害は、ＣＴＬＡ−４と免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖のＦｃから作られる融合タンパク質（ＣＴＬＡ４Ｉｇ）によっても得られる。例えば、非特許文献３９を参照されたい。

腫瘍ミクロ環境における免疫反応に対する負制御剤としてもう一つの重要なものは、シグナル伝達兼転写活性化（ＳＴＡＴ）シグナル反応性転写因子ＳＴＡＴ３である。腫瘍および関連する免疫細胞中でこの因子の活性が上昇する。腫瘍細胞中でのＳＴＡＴ３の活性化は、血管形成の刺激のみならず、生命力の強化、増殖、浸潤、転移に寄与する。免疫細胞中で上昇したＳＴＡＴ３活性は、Ｔｒｅｇ、Ｔｈ１７、骨髄由来抑制細胞などの免疫抑制細胞の、腫瘍ミクロ環境内での蓄積および活性化をもたらす。非特許文献４０を説明のために参照されたい。広く使用されている２型糖尿病薬であるメトホルミンやフェンホルミンは抗腫瘍活性があることが示されており、そのメカニズムとしては、ＳＴＡＴ３活性を阻害することで、抗腫瘍免疫抑制を減少させることが含まれると考えられている。非特許文献４１、非特許文献４２、非特許文献４３、非特許文献４４、非特許文献４５を説明のために参照されたい。本明細書に記載される癌治療方法は、グラム陰性生物を、ＳＴＡＴ３の発現または活性の阻害剤とともに投与することを採用してもよい。このような阻害剤としては、メトホルミンやフェンホルミンがある。メトホルミンは、例えば約５０ｍｇから約１０００ｍｇの範囲で、通常１日当たり１回から３回投与することができる。フェンホルミンは、一般的には約２０ｍｇから約８００ｍｇの範囲で、１日当たり１回から２回投与する。

本明細書に記載される癌治療方法は、グラム陰性生物を、宿主免疫反応を正に制御する一つ以上の受容体作動薬またはリガンドとともに投与することを採用してもよい。４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、またはＯＸ４０（ＣＤ１３４）に対する作動薬は、例えば約０．０３ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇの範囲で、１週間から４週間ごとに静脈投与することができる。

グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ４０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、共刺激ＴＮＦＲファミリーのメンバーであり、制御性およびエフェクターＴ細胞、並びに、免疫システムのその他細胞上に発現する。これらのタンパク質の活性化は、免疫機能の刺激または強化をもたらす。これら個々のタンパク質に対する単クローン抗体を活性化することは、前臨床モデルにおいて抗腫瘍活性を示しており、臨床開発へと進んでいる。非特許文献４６、非特許文献４７、非特許文献４８、非特許文献４９、非特許文献５０、非特許文献５１を参照されたい。

本明細書に記載された癌治療方法では、グラム陰性生物を、一つ以上の化学療法剤と共に投与することを採用してもよい。この様な剤としては、シクロホスファミドを含んでいてもよい。本明細書に記載された方法においてシクロホスファミドを使用する際には、５ｍｇ／ｍ^２から７５０ｍｇ／ｍ^２の範囲で、毎日または２１日ごとに、静脈投与または経口投与を試みた。別の方法として、シクロホスファミドは、例えば５ｍｇから１００ｍｇの投与量の低用量メトロノミクス法において、毎日、経口投与されてもよい。非特許文献６もまた参照されたい。

抗腫瘍免疫反応の刺激も、種々のサイトカインを用いて行われている。例えば、非特許文献５２および非特許文献５３を説明のために参照されたい。本明細書に記載された癌治療方法では、グラム陰性生物を、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、顆粒状マイクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン−２、インターロイキン−１２などの、組換発現または単離され、かつ精製されたサイトカインとともに投与することを採用してもよい。

本明細書に記載された癌治療方法では、組換発現または単離され、かつ精製されたインターフェロン−アルファとともに投与されたグラム陰性生物を使用してもよい。インターフェロン−アルファは、約３×１０^５から約３×１０^８ＩＵの範囲で、週に１、３、５、または７回、皮下、筋肉内、または静脈のいずれかで投与することができる。別の実施形態では、グラム陰性生物を、インターフェロン−ベータとともに投与してもよい。ある実施形態では、インターフェロン−ベータを、約０．０１ｍｇから約５ｍｇの範囲で、週に１回または一日おきに、皮下または静脈に投与する。インターフェロン−ガンマが一緒に投与され得る。一実施形態では、インターフェロン−ガンマは、約１×１０^５ＩＵから約１×１０^９ＩＵの範囲で、一回のみまたは毎日、皮下または静脈に投与され得る。

追加の方法では、インターロイキン（例えばインターロイキン−２やインターロイキン−１２）が一緒に投与され得る。一実施形態では、グラム陰性菌との組み合わせにおいて、インターロイキンが、約１×１０^４から約１×１０^７ＩＵの範囲で、週に一回から日に３回まで、静脈投与され得る。さらなる方法は、例えば、一般的に約５μｇから約５ｍｇの範囲の顆粒状マイクロファージコロニー刺激因子とともに、毎日または毎月、皮下、皮内、又は静脈にグラム陰性菌を投与することを含む。ここに記載されたいずれの組み合わせ治療においても、生物は、追加の癌治療を施す前又は後に投与するようにしている。また生物は、同時に投与することもできる。

以下の実施例は、本開示を説明する役目を果たす。これらの実施例は、本開示の範囲を何ら制限するものではない。

リポ多糖に関連したエンドトキシン活性の不活性化、および細胞完全性を失うことなくポリミキシンＢにより細菌細胞を死滅させるための最適条件は、３７℃にて、濃縮後期対数（増殖期）細菌（１０^９から１０^１１／ｍＬ）を、濃度１〜１００μｇ／ｍＬのポリミキシンＢを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、２分間から６時間の間の様々な時間にわたり培養することにより、各細菌株について決定する。生存率は、増殖可能な寒天プレート上にコントロールおよび処理済み細菌懸濁液を連続希釈プレーティングし、その後一晩培養し、コロニー計測することにより測定する。細胞完全性は、目視（顕微鏡）検査、および６００ｎｍにおける吸光度分析により測定する。エンドトキシン活性は、カブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）評価により測定する。可溶性のまたは過剰のポリミキシンおよび細胞残屑は、可溶性エンドトキシンも含め、０．９％のＮａＣｌ（通常の生理食塩水）を用いて遠心分離洗浄により取り除かれる。

別の方法として、条件付き突然変異の結果生じたＬＰＳ欠損を有する、無傷の、非生菌の単離のための最適条件は、細菌が非許容状態のＬＢ（溶原培地）媒質内で増殖され、数回にわたり取り除かれる点を除き、ポリミキシン処理に関して記述されたのと同様の方法で決定し、ポリミキシン処理に関して記述されたのと同様の分析および処理を経る。

ポリミキシン処理を行った細菌、または生理食塩水で洗浄された後期対数期ＬＰＳ変異体／欠損細菌は、抗凍結剤としてのトレハロースを用いてフリーズドライされる（例えば、非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９を参照されたい。）。希望に応じて、細菌の生存率は、細菌完全性を消失させることなく生存率を０％にまで低下させるのに十分な照射量のイオン化放射線を用いた処理によってさらに低下される。

フリーズドライされた細菌は、抗腫瘍試験に使用される前に、滅菌水中に再懸濁される。ＰＢＳで洗浄されたマウス癌細胞（Ｂ１６およびＢ１６Ｆ１０メラノーマ、ＣＴ−２６大腸癌、Ｐａｎｃ０２膵臓癌、またはルイス肺癌（細胞株に応じて１０^５〜１０^７細胞））は、毛を剃ったＣ５７ＢＬ／６マウスの背中に皮下移植される。マウスは無作為に選ばれ、腫瘍が最初に触診されたとき、腫瘍が平均体積で７５ｍｍ^３に達したとき、または腫瘍が平均体積で３００ｍｍ^３（ノギス計測により算出）に達したときから治療が開始される。再懸濁された細菌は、週に１回から２回、尾静脈または腹腔内（ｉ．ｐ．）より、０．１〜０．２ｍＬ注入量中１０^３から１０^１０の各投与量で注射される。Ｔ細胞受容体を対象とした抗体拮抗薬または抗体作動薬は、３〜１００ｍｇの各投与量で、週に１回から２回、腹腔内投与される。シクロホスファミドは、隔日ペースで５日間、１５０ｍｇ／ｋｇまでの投与量で（ＭＴＤ投与）、または飲料水中に毎日２５ｍｇ／ｋｇの投与量で（低用量メトロノミクス法投与）、腹腔内投与される。マウスは、週に２回体重を計測され、また、臨床観察が記録される。腫瘍測定（ノギス計測）は週に２回行われ、腫瘍が１０００ｍｍ^３に達したとき、壊死したとき、または１５％以上の減量が観察されたときは、マウスは安楽死させられる。犠牲となったマウスからは腫瘍が取り除かれて評量され、また最低限の解剖が行われる。もし長期的な腫瘍の退縮や治癒が観察された場合は、マウスは再び腫瘍細胞の移植に用いられる場合がある。

実施例２では、大腸菌株２６１７−１４３−３１２（Ｍｉｇｕｌａ）Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ（ＡＴＣＣ（登録商標）１３０７０）を使用した。この無害グラム陰性菌は、増殖するのに外来栄養のジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）を必要とする。哺乳動物はＤＡＰを作らないため、この菌株は生菌ではなく、哺乳動物体内において感染を起こすことはできない。加えて、ＤＡＰの栄養要求性は、インビトロ試験における汚染観察にも使用可能である。細菌は、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．５％のグルコース、および１ｍＭのＤＡＰを有するＬＢミラー培養液（Ｍｉｌｌｅｒ）中、３７℃下で、３００ｒｐｍにて一定振動させることにより、後期対数期（Ｏ．Ｄ．_６００に基づく）まで増殖された。培養物は、２０００×ｇにて１５分間の遠心分離、および、２０ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．５％のグルコース、および０．１ｍＭのＤＡＰを有する４℃のＬＢミラー培養液（ＰＭＢ処理培地）への再懸濁により、３回洗浄した。最終的な再懸濁は、Ｏ．Ｄ．_６００が１の場合に１．１２×１０^９菌／ｍＬに相当するとの基準の下、２×１０^１０菌／ｍＬにて行われた。各培養物試料は、さまざまな濃度のポリミキシンＢ（ＰＭＢ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ＃５２９１）を用いずに、および用いて、４℃、一定攪拌下にて１時間培養された。その後細菌は、３０００×ｇにて１０分間の遠心分離、および２×１０^９菌／ｍＬでの再懸濁により、４℃の未使用ＰＭＢ処理培地を用いて３回洗浄された。細菌回復効率はＯ．Ｄ．_６００を追跡することにより測定した。ＰＭＢ処理および洗浄後の細菌回復は、濃度３００μｇ／ｍＬまでのＰＭＢで処理したすべての試料において９０％よりも大きく、また濃度１０００μｇ／ｍＬのＰＭＢで処理した試料において８０％を超えた。

図１において、エンドトキシン活性は、未処理の、または処理された細菌培養物の連続希釈物を、カブトガニ血液ライセート（ＬＡＬ）Ｅｎｄｏｓａｆｅ Ｅｎｄｏｃｈｒｏｍｅ−Ｋ動態検査キット（サウスカロライナ州、チャールストン拠点のＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社製、Ｅｎｄｏｓａｆｅ）を用いて分析することにより測定された。未処理の培養物は、主として約５０〜１００エンドトキシン単位／１×１０^６菌を有していた。独立した４回の実験において、１０００μｇ／ｍＬのＰＭＢを用いた処理について同程度のエンドトキシンの低下が見られた（平均＝未処理の場合の１７％）。

図２において、細菌の生存率は、各試料を連続希釈し、２ｍＭのＭｇＣｌ_２および０．５％のグルコースを有し、かつ１ｍＭのＤＡＰを有する／有しない（それぞれ、生存率と汚染度を測定するため）ＬＢミラー寒天プレート上にその試料をプレーティングすることにより測定した。プレートは３７℃下で一晩培養され、各プレート上のコロニー数が計測され、そして各プレート上のコロニー数に希釈係数を掛けることにより、生存率が算出された。各懸濁液中の細菌の総数は、Ｏ．Ｄ．_６００に、Ｏ．Ｄ．_６００＝１あたり１．１２×１０^９菌／ｍＬの変換係数を掛けることにより算出した。生存率（％生菌）は、細菌総数に対する生菌／ｍＬのパーセントとして算出した。１０００μｇ／ｍＬのＰＭＢを用いた処理は、細菌の生存率を０％に低下させた。スケールアップした後続実験では、独立した４回の実験において、１０００μｇのＰＭＢが生存率を平均１１％まで低下させた。

実験は、処理前洗浄、グルタルアルデヒド（ＧＡ）処理、および処理後洗浄を、２０ｍＭのＭｇＣｌ_２を含むｐＨ７．５のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ＭｇおよびＣａを含まない）を用いて行ったことを除いては、実施例２に記載された方法で行った。ＧＡ処理後の細菌回復は、実験した全ての濃度において、典型的には８０〜１００％であった。図３は、１％のＧＡを用いた処理が、エンドトキシン活性を９６％低下させることを示す。濃度１％ＧＡ処理を用いた、２Ｌにスケールアップした実験では、エンドトキシン活性が未処理培養物に対して８２％低下した。

図４に示すように、ＧＡを用いた処理は、投与量が０．０５％を上回る場合は常に、１００％の殺菌をもたらした。

濃度１０００μｇ／ｍＬのＰＭＢ処理の後に、２Ｌの後期対数期の培養物を用いた１％のＧＡ処理を組み合わせることは、細菌の生存率を０％とし、またエンドトキシン活性を未処理培養物に対して９２％（１２倍）低下させた（表１）。

実施例４では、実施例２および３に記載された手順どおりに、細菌を培養し、１０００μｇ／ｍＬのＰＭＢ、１％のＧＡ、またはその両方を用いて処理した。試料は、ｐＨ７．５で１％ＧＡを含むＰＢＳで希釈され（そうでなければ、前もってＧＡにさらし）、１０分間固定させた。この菌を含んだ２５ｍＬの液滴がパラフィルム上に置かれ、あらかじめ０．１％のポリ−Ｌ−リシンでコーティングされた１００メッシュのフォルムバール＋カーボンＥＭグリッド（ペンシルバニア州、ハットフィールド拠点、ＥＭＳ社製）で覆われた。試料は１０分間付着させ、その後グリッドは２００ｍＬの水滴上にのせることで簡単に３回洗浄した。グリッドは、１００ｍＬの２％酢酸ウラニル水溶液の液滴上に１分間のせることでネガティブ染色した。余剰の染色剤は３Ｍ濾紙で吸い取り、自然乾燥した。試料は、ボトムマウントＥａｇｌｅ４Ｋ（１６メガピクセル）のディジタルカメラ（倍率１２００倍および１１０００倍）を備えた、ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｓｐｉｒｉｔ Ｇ２ ＢｉｏＴＷＩＮ透過型電子顕微鏡で可視化した。図５Ｂ、５Ｃ、５Ｄの画像は、本方法に従って行ったＰＭＢおよび／またはＧＡ処理は、細菌を無傷なままにし、好ましい結果となることを裏付ける。多糖類カプセルが未処理の細菌（図５Ａ）上に見られる（ぼやけた表面）が、これは処理されたすべての細菌（図５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ）においては取り除かれたか、艶消し（ｍａｔｔｅｄ ｄｏｗｎ）されたようである。

実施例５では、大腸菌類が培養され、そして１０００μｇ／ｍＬのＰＭＢと１％のＧＡとで処理されて、実施例２および実施例３に記載された方法で生存率およびエンドトキシンレベルが測定された。最終洗浄後、未処理の細菌、およびＰＭＢ＋ＧＡ処理された細菌を、０．５ｍＭのＭｇＣｌ_２および１２％のトレハロースを含むｐＨ７．５の５０％ＰＢＳ中に、濃度が１．１×１０^１１菌／ｍＬとなるよう再懸濁したのちに、この試料を等量分割し、急速冷凍し、そして−８０℃で保存した。発熱性閾値は、原則として、非特許文献２０に記載されているとおりに決まる。少なくとも２．０ｋｇの体重があるメスのニュージーランドシロウサギの成体を用いた。すべての動物は、発熱性テストの前に最長７日、疑似試験状態にした。投与量範囲は１投与あたり１匹のウサギを用いて検討し、その結果を１投与あたり２匹のウサギを用いて継続確認した。細菌は、注入できるように無菌食塩水で希釈した。すべての投与は１０ｍLを静脈内投与して行った。試験剤投与３時間のうちのいずれかの時点で０．５〜１．０℃の温度上昇をもたらした試験剤のうちの最も低い濃度が、発熱性閾値を表していると考えた。ベースライン、および試験剤の注入後１時間から３時間の間で３０分ごとに、直腸温度を記録した。未処理および処理された大腸菌類の保存に使われた生理食塩水希釈溶媒は、発熱性を示さないことが示された。２匹のウサギへの未処理の細菌３×１０^４の投与は、０．８℃および１．０℃の温度上昇をもたらした。ＰＭＢ＋ＧＡ処理された細菌３×１０^５の投与は、０．１℃より大きな温度上昇をもたらさなかったが、２匹のウサギへのＰＭＢ＋ＧＡ処理された細菌９×１０^５の投与は０．７℃および１．０℃の温度上昇をもたらし、発熱性閾値の差が３０倍であることを明示した。ＰＭＢはリポ多糖を介した発熱活性のみを失活させる可能性がある。一方、ＧＡはリポ多糖を介した発熱性も、細菌中の他の成分を介した発熱性も失活させるのかもしれない。

表１は、未処理の細菌、および１０００μｇ／ｍＬのＰＭＢと１％のＧＡとで処理された細菌の、ウサギを使った標準的なインビボ試験により測定された発熱性（熱性反応）閾値を示す。測定値をインビトロＬＡＬ評価で測定したエンドトキシンレベルと比較したところ、未処理の細菌の場合に対し、ＰＭＢ＋ＧＡ処理はエンドトキシンレベルを１２倍低下させるものの、同じ試料を介した発熱性は３０倍低下した。

実施例６では、実施例２および実施例３に記載された手順に従い、大腸菌類を培養し、１０００μｇ／ｍＬのポリミキシンＢと１％のＧＡとで処理した。未処理の細菌および処理された細菌の冷凍ストックを３７℃下で急速解凍し、注入（静脈投与量≦３×１０^９細菌）できるように無菌食塩水で少なくとも１０倍に希釈するか、または注入（静脈投与量≧５×１０^９細菌）できるように、３０００×ｇで１０分間遠心分離した後に無菌食塩水で再懸濁した。細菌または溶媒は、尾静脈を通じて１００ｍＬを静脈注入した。

生後８週間のＣ５７ＢＬ／６またはＢＡＬＢ／ｃメスマウスを用い、試験の前に少なくとも７日間は環境順化させた。日に１〜２回、死亡観察および臨床観察を行った。注入時、および注入後１〜４時間の時点で追加観察を行った。溶媒には毒性がほとんどないことが確認された。症状観察も行ったが、それは以下に記載するものに限定されない：
皮膚、毛、目、粘膜、足取り、姿勢、および分泌／排せつといった処理に対する反応、または流涙、立毛、異常呼吸パターンといったその他の自律神経活動の兆候；発作の発生；通常覚醒の変化；過剰な毛繕いや反復旋回といった典型的な行動；異常行動（自傷行為）；こぶや腫れ物の発達（腫瘍、膿瘍など）；ストレスおよび／または呼吸器症状の信号上昇；注射箇所における刺激や炎症の兆候；消費する飲食物および糞尿物の変化。

複数回にわたる細菌投与試験を、週に２回、２週間（４処理）行った。動物の体重測定を含む毒性試験を行った。ＰＭＢ＋ＧＡ処理された細菌（投与量１×１０^９）について報告されている、複数回投与試験に使用したマウスは腫瘍を有していた。表２に報告されているその他の全てのマウスは腫瘍を有していなかった。

実施例７では、実施例２および実施例３に記載された手順に従い、１０００μｇ／ｍＬのＰＭＢと１％のＧＡとで処理された細菌（ＤＢ１０３）を調製した。生後８週間のＣ５７ＢＬ／６Ｊメスマウスに対し、注射する箇所の毛を剃り、右わき腹から２×１０^５のＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−６４７５）を皮下注入した。尾静脈を通じた静脈投与処置が３日後に開始され、週２回で計５回続けた。０．５ｍＭのＭｇＣｌ_２および１２％のトレハロースを含むｐＨ７．５の５０％ＰＢＳ溶液中に、濃度が１．１×１０^１１菌／ｍＬとなるように入れたＤＢ１０３を、無菌食塩水で１１倍（１×１０^９投与）または２２０倍（５×１０^７投与）に希釈し、最終的に１００ｍＬの量を注入した。溶媒コントロール処理グループについては、ストックしていた溶媒を１１倍に希釈した。腫瘍は、毎週２回ノギスで計測し、腫瘍体積は（長さ×幅^２）／２の計算式で算出した。化合物と関連した死亡は見られなかった。１×１０^９のＤＢ１０３で処理された２匹を除き、すべての動物で腫瘍が発達した。最大３％（低用量グループ）および７％（高用量グループ）の一時的な体重低下が見られたが、最終処理後に回復した（図６）。

実施例８では、実施例２および実施例３に記載された手順に従い、大腸菌類（未処理および１％ＧＡ処理）を調製した。実験は、腫瘍が触知できるようになった１１日目に処理を開始したことを除き、実施例７に記載された手順に従い行った。２４日以降は腫瘍の負担から各グループにおける動物数匹を安楽死させなければならなかったため、ほとんどのグループにおいてグループ測定の記録は行わなかった。腫瘍はすべての動物で発生した。１×１０^９ＧＡグループでの最大減量は１１％であった。毒性が未処理の大腸菌類１×１０^９の投与を不可能にした（表２を参照）。

実施例９では、実施例２および実施例３に記載された手順に従い、１０００μｇのＰＭＢと１％のＧＡとで処理された細菌（ＤＢ１０３）を調製した。実験は、１×１０^５のマウスＣＴ２６直腸癌細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの右わき腹から皮下投与したことを除き、実施例７に記載された手順に従い行った。ＤＢ１０３処理は、尾静脈を通じて静脈投与することで３日後に開始し、週２回で計６回続けた。シクロホスファミド（ＬＫＴラボラトリーズ社製、＃Ｃ９６０６）は、３日目から〜２０ｍｇ／ｋｇ／日（水中０．１３３ｍｇ／ｍＬ）で飲料水を通じて継続的に投与された。２００μＬのＰＢＳ中１００μｇの抗マウスＣＴＬＡ−４抗体（ＢｉｏＸｃｅｌｌ ＃ＢＥ０１６４）を３日目、６日目、９日目に腹腔内投与した。臨床観察及び死亡率は毎日記録した。腫瘍は、ノギスで毎週２回計測し、腫瘍体積は（長さ×幅^２）／２の計算式で算出した。腫瘍は溶媒グループのすべてのマウスで発生した。いずれのグループにおいても、減量および化合物関連の死は見られなかった。図８Ａおよび８Ｂでは、溶媒、低用量、および高用量ＤＢ１０３グループのデータは、同じであった。

本明細書で言及されているすべての特許および刊行物は、本開示が属する技術分野における当業者の技術水準を示すものである。すべての特許および刊行物は、各刊行物が具体的かつ個別に参照によって組み込まれた場合と同程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。

本明細書に例示的に記載された本開示は、本明細書に具体的に開示されていない、任意の構成要件や制限が存在しない場合でも、適切に実施されうる。したがって例えば、本明細書の例示の任意の文言「を有する（含む、含有する）」、「を実質的に有する（含む、含有する）」、「のみからなる」は、それぞれ他の２つの文言のいずれかに置き換えることができる。本明細書に記載された文言や表現は制限のためではなく説明のために使用したものであり、これらの文言や表現を使用することが全部または一部が示され記載されている均等な構成要素を排除することを意図するものではなく、特許請求の範囲の範囲内において種々変更を加え得ることはもちろん可能である。このように、たとえ本開示が好ましい実施例や選択的要素により具体的に記載されていても、本明細書で開示されたコンセプトの修正および変更は当業者に帰属し、そのような修正および変更は、特許請求の範囲に定義された開示の範囲に属すると理解すべきである。その他の実施形態は以下の特許請求の範囲に明記する。

Claims (38)

1. エンドトキシン活性および／または発熱性を顕著に低下させる実質的に非生菌であるグラム陰性菌生物と、
   薬学上許容可能な賦形剤と
   を含有する組成物。
2. 前記生物のうち、少なくとも約８０％が非生菌である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記生物のうち、少なくとも約９０％が非生菌である、請求項１に記載の組成物。
4. 前記生物のうち、約１００％が非生菌である、請求項１に記載の組成物。
5. エンドトキシン活性および／または発熱性を約７５％低下させる、請求項１から４のいずれか１項に記載の組成物。
6. エンドトキシン活性および／または発熱性を約８５％低下させる、請求項１から４のいずれか１項記載の組成物。
7. エンドトキシン活性および／または発熱性を約９５％低下させる、請求項１から４のいずれか１項記載の組成物。
8. 癌であると診断された哺乳動物に、エンドトキシン活性および／または発熱性を顕著に低下させる実質的に非生菌であるグラム陰性菌生物を投与すること
   を含む癌治療方法であって、
   当該投与量が、癌の増殖や転移を抑制するのに十分な量である癌治療方法。
9. 放射線を用いた処理により前記菌生物が実質的に非生菌化された、請求項８に記載の方法。
10. グルタルアルデヒドを用いた処理により、前記菌生物が実質的に非生菌化された、請求項８に記載の方法。
11. エンドトキシンを不活性化させる抗生剤を用いて前記菌生物を処理することにより、エンドトキシン活性および／または発熱性を低下する、請求項８に記載の方法。
12. 前記抗生剤が、ポリミキシンＢおよびポリミキシンＥからなる群から選択された、請求項１１に記載の方法。
13. グルタルアルデヒドを用いて前記菌生物を処理することにより、エンドトキシン活性および／または発熱性を低下する、請求項８に記載の方法。
14. ＫＤＯ２−リピドＩＶ_Ａの生合成を阻害することで知られる抗生剤を用いて前記菌生物を処理することにより、エンドトキシン活性および／または発熱性を低下する、請求項８に記載の方法。
15. 前記生物が、エンドトキシン活性および発熱性を大幅に低下させるのに十分な程度にＫＤＯ２−リピドＩＶ_Ａの生合成を阻害する遺伝子欠損を有する、請求項８に記載の方法。
16. 前記生物が、エンドトキシン活性および発熱性を大幅に低下させるのに十分な程度にＫＤＯ２−リピドＩＶ_ＡのＯ−アシル化反応を防ぐ遺伝子変異を有する、請求項８に記載の方法。
17. 前記欠損が、ｍｓｂＢまたはｌｐｘＭ遺伝子座に存在する、請求項１６に記載の方法。
18. 癌が固形腫瘍である、請求項８に記載の方法。
19. 前記哺乳動物に対し、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−Ｌ２からなる群から選択された、免疫機能を阻害するＴ細胞受容体またはＴ細胞受容体リガンドの拮抗薬を追加投与する、請求項８に記載の方法。
20. 前記哺乳動物に対し、メトホルミンおよびフェンホルミンからなる群から選択されたＳＴＡＴ３阻害剤を追加投与する、請求項８に記載の方法。
21. 前記ＳＴＡＴ３阻害剤がメトホルミンである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ＳＴＡＴ３阻害剤がフェンホルミンである、請求項２０に記載の方法。
23. 前記哺乳動物に対し、ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ、ＣＤ４０、およびＯＸ４０からなる群から選択された、免疫機能を刺激するＴ細胞受容体の作動薬を追加投与する、請求項８に記載の方法。
24. 前記哺乳動物に対し、化学療法剤を追加投与する、請求項８に記載の方法。
25. 前記化学療法剤がシクロホスファミドである、請求項２４に記載の方法。
26. 前記哺乳動物に対し、サイトカインを追加投与する、請求項８に記載の方法。
27. 前記サイトカインが、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン−２、およびインターロイキン−１２からなる群から選択されたものである、請求項２６に記載の方法。
28. 前記生物がサルモネラ菌である、請求項８から２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記生物が大腸菌類である、請求項８から２７のいずれか１項に記載の方法。
30. 癌であると診断された哺乳動物に、細菌外膜中のリポ多糖が実質的に失われる遺伝子欠損を有する非生菌、弱毒化菌、または生菌を投与すること
    を含む癌治療方法であって、
    当該投与量が、癌の増殖を抑制するのに十分な量である癌治療方法。
31. 前記遺伝子欠損が、ＫＤＯ２−リピドＩＶ_Ａの生合成反応経路を阻害する、請求項３０に記載の方法。
32. 前記癌が固形腫瘍である、請求項３０に記載の方法。
33. 前記哺乳動物がヒトである、請求項８から３２のいずれか１項に記載の方法。
34. 前記哺乳動物がイヌである、請求項８から３２のいずれか１項に記載の方法。
35. ポリミキシンおよびグルタルアルデヒドを用いてグラム陰性菌生物を処理することを含む、グラム陰性菌生物中のエンドトキシン活性および／または発熱性を消失および低下させる方法。
36. エンドトキシン活性または発熱性を約９０％低下させる、請求項３５に記載の方法。
37. エンドトキシン活性または発熱性を約９６％低下させる、請求項３５に記載の方法。
38. 生存率を０％にまで低下させる、請求項３５に記載の方法。