KR20240067102A - 어류 사육용 조성물 및 어병에 대한 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

어류 사육용 조성물 및 어병에 대한 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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KR20240067102A
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가즈키 미카타
도시히로 가이
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스미또모 가가꾸 가부시키가이샤
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Abstract

락티신을 포함하는 어류 사육용 조성물, 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함하는 어류 사육용 조성물이 제공된다. 락티신을 어류의 생물에 시용하는 것, 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 어류의 생물에 시용하는 것을 포함하는, 어류의 생물의 사육 방법이 제공된다. 락티신은 바람직하게는 락티신 Q이다.

Description

어류 사육용 조성물 및 어병에 대한 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 어류 사육용 조성물 및 어병에 대한 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 상기 조성물을 사용한 어류의 생물의 사육 방법에도 관한 것이다.
락토코커스·가르비에(Lactococcus garvieae)는 어류의 생물에 감염하고, 연쇄상 구균증을 야기한다. 연쇄상 구균증은 방어 양식에 있어서 가장 피해액수가 큰 어병이다. 종래는 치어에 백신을 주사해서 연쇄상 구균증의 유행에 대비하고 있었다. 그러나, 신형 병원균이 출현하여 백신을 투여해도 연쇄상 구균증의 발증을 막을 수 없다고 하는 문제가 발생하고 있다.
국제공개 제2006/033352호(특허문헌 1)에는, 유산균에 의해 산생된 항균 펩티드인 락티신 Q가 새롭게 보고되고 있다. 국제공개 제2017/069227호(특허문헌 2)에는, 락티신을 포함하는 헬스케어 조성물이 개시되어 있다. 중국 특허출원 공개 제103214583호 명세서(특허문헌 3)에는, 락티신 Q와 SUMO의 융합 단백질이 개시되어 있다.
국제공개 제2006/033352호 국제공개 제2017/069227호 중국 특허출원 공개 제103214583호 명세서
본 발명은 어병을 억제하는 새로운 조성물 및 사육 방법을 제공할 것을 목적으로 한다.
본 발명은 이하에 예시되는 항목에 관한 것이다.
[1] 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 상기 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 어류의 생물의 사육용 조성물.
[2] 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 상기 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 락토코커스·가르비에에 의한 어류의 병에 대한 예방 또는 치료용 조성물.
[3] 상기 락티신은, (a) 내지 (c)의 어느 서열을 포함하고, 또한 항균 활성을 갖는 펩티드인, [1] 또는 [2]에 기재된 조성물;
(a) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열,
(b) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여, 69% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
(c) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여, 1 이상 16 이하의 아미노산 잔기가 결손, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열.
[4] 상기 락티신은, 락티신 Q 및 락티신 Z에서 선택되는 적어도 하나이고, 상기 락티신 유전자는, 락티신 Q 유전자 및 락티신 Z 유전자에서 선택되는 적어도 하나인, [1] 내지 [3]의 어느 것에 기재된 조성물.
[5] 상기 락티신 유전자를 갖는 세균은, NITE BP-03536인, [1] 내지 [4]의 어느 것에 기재된 조성물.
[6] 상기 어류는 농어목 또는 연어목인, [1] 내지 [5]의 어느 것에 기재된 조성물.
[7] 상기 조성물은, 사료, 사료 첨가제, 사육수, 사육수 첨가제 또는 주사제인, [1] 내지 [6]의 어느 것에 기재된 조성물.
[8] [1] 내지 [7]의 어느 것에 기재된 조성물을 어류의 생물에 시용하는 것을 포함하는, 어류의 생물의 사육 방법.
[9] [1] 내지 [7]의 어느 것에 기재된 조성물을 어류의 생물에 시용하는 것을 포함하는, 락토코커스·가르비에에 의한 어류의 병에 대한 예방 또는 치료 방법.
[10] 상기 시용은 경구 투여, 침지 투여 또는 주사 투여인, [8] 또는 [9]에 기재된 방법.
[11] 상기 어류는 농어목 또는 연어목인, [8] 내지 [10]의 어느 것에 기재된 방법.
[12] 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 상기 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 락토코커스·가르비에에 대한 증식 억제제 또는 살균제.
[13] 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 상기 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 락토코커스·가르비에에 접촉시키는 것을 포함하는, 락토코커스·가르비에의 증식 억제 또는 살균 방법.
[14] 수탁 번호가 NITE BP-03536인 세균.
[15] [14]에 기재된 세균의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물.
[16] 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 상기 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 어류의 생물에 시용하는 것을 포함하는, 어류의 생물의 사육 방법.
[17] 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 상기 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 어류의 생물에 시용하는 것을 포함하는, 락토코커스·가르비에에 의한 어류의 병에 대한 예방 또는 치료 방법.
[18] 상기 락티신은, (a) 내지 (c)의 어느 서열을 포함하고, 또한 항균 활성을 갖는 펩티드인, [16] 또는 [17]에 기재된 방법;
(a) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열,
(b) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여, 69% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
(c) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여, 1 이상 16 이하의 아미노산 잔기가 결손, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열.
[19] 상기 락티신은, 락티신 Q 및 락티신 Z에서 선택되는 적어도 하나이고, 상기 락티신 유전자는, 락티신 Q 유전자 및 락티신 Z 유전자에서 선택되는 적어도 하나인, [16] 내지 [18]의 어느 것에 기재된 방법.
[20] 상기 락티신 유전자를 갖는 세균은, NITE BP-03536인, [16] 내지 [19]에 기재된 방법.
[21] 상기 시용은, 경구 투여, 침지 투여 또는 주사 투여인, [16] 내지 [20]의 어느 것에 기재된 방법.
[22] 상기 어류는 농어목 또는 연어목인, [16] 내지 [21]의 어느 것에 기재된 방법.
본 발명에 따르면, 어병을 억제하는 새로운 조성물 및 사육 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 락티신 Z의 아미노산 서열의 상동성 해석 결과이다.
도 2는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 아우레오신 A53 패밀리(WP_123311236.1)의 아미노산 서열의 상동성 해석 결과이다.
도 3은 실험 1에 있어서, NITE BP-03536의 (A) 콜로니의 형상 및 (B) 그람 염색 결과를 도시하는 도면이다.
도 4는 실험 2에 있어서, NITE BP-03536의 항균 활성 시험을 설명하는 도면이다.
도 5는 실험 3에 있어서, 락토코커스·가르비에에 폭로한 방어의 생존수를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태에 대해서 상세히 설명한다. 또한, 본 발명은 이하의 실시 형태에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에 있어서 「A 내지 B」라고 하는 형식의 표기는, 범위의 상한 하한(즉 A 이상 B 이하)을 의미하고, A에 있어서 단위의 기재가 없고, B에 있어서만 단위가 기재되어 있는 경우, A의 단위와 B의 단위는 동일하다.
[어류의 생물의 사육용 조성물]
본 발명의 일 실시 형태에 따른 어류의 생물의 사육용 조성물은, 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함한다. 본 발명에 관한 어류의 생물의 사육용 조성물은, 락토코커스·가르비에에 의한 어류의 연쇄상 구균증을 억제할 수 있다.
락티신은 락티신 Q 및 락티신 Z에서 선택되는 적어도 하나여도 된다. 락티신은 바람직하게는 락티신 Q이다.
본 명세서에 있어서, 락티신은 하기 (a) 내지 (c)의 어느 서열을 포함하는 펩티드여도 된다. 락티신은 락토코커스·가르비에에 대한 항균 활성을 가져도 된다.
(a) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열,
(b) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여, 69% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
(c) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여, 1 이상 16 이하의 아미노산 잔기가 결손, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열.
락티신은 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대하여 예를 들어 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드여도 된다. 상기 아미노산 서열의 동일성의 상한은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 100% 이하여도 된다.
락티신은 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대하여, 예를 들어 1 이상 15 이하, 14 이하, 13 이하, 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하 또는 2 이하의 아미노산 잔기가 결손, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드여도 된다.
아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가의 일례는, 단백질의 기능이 정상적으로 유지되는 보존적 변이이다. 보존적 변이의 대표적인 것은, 보존적 치환이다. 보존적 치환이란, 치환 부위가 방향족 아미노산인 경우에는, Phe, Trp, Tyr간에서, 치환 부위가 소수성 아미노산인 경우에는, Leu, Ile, Val간에서, 극성 아미노산인 경우에는, Gln, Asn간에서, 염기성 아미노산인 경우에는, Lys, Arg, His간에서, 산성 아미노산인 경우에는, Asp, Glu간에서, 히드록실기를 갖는 아미노산인 경우에는, Ser, Thr간에서 서로 치환하는 변이이다. 보존적 치환이라 간주되는 치환으로서는, 예를 들어 Ala로부터 Ser 또는 Thr로의 치환, Arg로부터 Gln, His 또는 Lys로의 치환, Asn으로부터 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp로의 치환, Asp로부터 Asn, Glu 또는 Gln으로의 치환, Cys로부터 Ser 또는 Ala로의 치환, Gln으로부터 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg로의 치환, Glu로부터 Gly, Asn, Gln, Lys 또는 Asp로의 치환, Gly로부터 Pro로의 치환, His로부터 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr로의 치환, Ile로부터 Leu, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Leu로부터 Ile, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Lys로부터 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg로의 치환, Met로부터 Ile, Leu, Val 또는 Phe로의 치환, Phe로부터 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu로의 치환, Ser으로부터 Thr 또는 Ala로의 치환, Thr으로부터 Ser 또는 Ala로의 치환, Trp로부터 Phe 또는 Tyr로의 치환, Tyr으로부터 His, Phe 또는 Trp로의 치환 및Val로부터 Met, Ile 또는 Leu로의 치환을 들 수 있다.
락티신은 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드여도 된다. 서열 번호 1은 NITE BP-03536의 게놈 서열로부터 예측된 락티신 Q의 아미노산 서열이다. 서열 번호 3은 락토코커스·락티스의 게놈 서열로부터 예측된 락티신 Z의 아미노산 서열이다. 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 락티신 Z의 아미노산 서열과의 동일성(Identity)은 94%이고, 유사성(Positive)은 98%이다(도 1). 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 락티신 Z의 아미노산 서열 사이에서의 아미노산 잔기의 치환은 3개이고, 그 중 2개는 보존적 치환이다. 락티신 Z는 락티신 Q와 상동성이 매우 높다.
상동성 검색의 결과에 의하면, 락티신 Q와 락티신 Z의 다음에 상동성이 높은 공지된 펩티드는, 아우레오신 A53 패밀리(WP_123311236.1)이다. 아우레오신 A53의 아미노산 서열을 서열 번호 4에 나타낸다. 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 아우레오신 A53 패밀리(WP_123311236.1)의 아미노산 서열과의 동일성은 68%이고, 유사성은 88%이다(도 2). 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 아우레오신 A53 패밀리(WP_123311236.1)의 아미노산 서열 사이에서의 아미노산 잔기의 치환은 17개이며, 그 중 11개는 보존적 치환이다.
락티신의 아미노산 서열의 N 말단의 메티오닌은, 통상 포르밀화(N-포르밀메티오닌)되어 있다. 포르밀화된 메티오닌은, 추가로 산화되어 있어도 된다.
락티신은 화학적으로 합성된 것이어도 되고, 락티신 유전자를 갖는 미생물 내에서 산생된 것이어도 된다. 본 실시 형태의 일 측면에 있어서, 락티신은 유기 합성의 방법을 사용해서 합성된 것이어도 되고, 유전자 공학적인 방법을 사용해서 합성된 것이어도 된다. 락티신 유전자는, 내재성이어도 되고, 외래성이어도 된다.
락티신 유전자는, 상술한 락티신을 코드하는 유전자여도 되고, 락티신 Q 유전자 및 락티신 Z 유전자에서 선택되는 적어도 하나여도 된다. 락티신 유전자는, 바람직하게는 락티신 Q 유전자이다.
락티신 유전자를 갖는 세균으로서, NITE BP-03536을 들 수 있다. NITE BP-03536은, 수탁 번호 NITE BP-03536(수령 번호 NITE ABP-03536)(수령일: 2021년 9월 14일)으로서, 독립행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터(NPMD, 주소: 우편 292-0818 지바현 기사라즈시 가즈사 카마타리 2-5-8 122호실)에 부다페스트 조약에 기초하여 국제 기탁되어 있는 세균이다. NITE BP-03536은 유산균의 1종인 락토코커스·락티스(Lactococcus lactis)에 속하는 세균이다. NITE BP-0536의 균학적 성질에 대해서는, 후술하는 표 1, 2 및 도 3에 나타낸다.
NITE BP-03536은 발효 식품 중에 존재하기 때문에, 어류의 생물의 사육에 사용할 때의 환경에의 영향이 적고, 사람에 대한 안전성도 높다고 생각된다. 상기 세균은, 단리된 세균이어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 따른 어류의 생물의 사육용 조성물은 NITE BP-03536의 세균 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함한다. 균체는 식품 속 또는 환경 속에서 단리된 것이어도 되고, 배양된 것이어도 된다. 균체는 사균이어도 생균이어도 된다. 균체는 배양액, 완충액 등에 존재하고 있는 것이어도 되고, 이들을 농축해서 액체를 제외한 것 또는 그 동결 건조물이어도 되고, 동결 스톡이어도 된다.
균체 배양물은 세균의 분비물, 대사물 등을 포함해도 된다. 균체 배양물에는, 세균이 산생하는 펩티드, 단백질, 당, 효소, 유기산 및 이들을 포함하는 배지(액체 배지 및 고형 배지)가 포함될 수 있다. 균체 배양물은 세균을 배양한 후의 상청이어도 된다. 배양 상청은, 예를 들어 세균을 배양한 액체 배지로부터 원심 분리, 여과 조작 등에서 세균을 제거해서 얻을 수 있다.
NITE BP-03536은, 유산균의 통상 배양 방법에 따라서 배양할 수 있다. 대표적인 배양 방법으로서는, MRS(de Man, Rogosa and Sharpe) 액체 배지 또는 MRS 한천 배지를 사용해서 온도 30℃에서 배양하는 방법을 들 수 있다.
균체 또는 균체 배양물의 추출물은, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물이 갖는 락토코커스·가르비에에 대한 항균 활성을 상실하지 않도록 조제된다. 추출물은, 예를 들어 세균의 균체 또는 균체 배양물을 초음파 파쇄, 비즈 마쇄, 동결 융해, 화학적 용해 등의 처리를 하는 것에 의해 얻을 수 있다. 추출물은 균체 또는 균체 배양물을 염석, 한외 여과, 이온 교환 크로마토그래피 또는 유기 용매를 사용한 액상 추출 등을 행하고 있을 수 있어서도 된다. 이들 처리는 적절히 조합시켜서 행할 수 있다. 추출물은 세균의 균체의 단편, 핵산, 펩티드, 단백질, 당 및 효소를 포함할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 세균의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을「균체 조제물」이라고도 기재한다.
본 명세서에 있어서, 어류는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 농어목, 연어목, 복어목, 가자미목, 뱀장어목, 청어목, 대구목, 쏨뱅이목, 잉어목, 청어목, 숭어목이어도 된다. 농어목은 전갱이과, 고등어과, 농어과, 도미과, 볼락과, 성댓과, 쥐노래미과, 둑중갯과, 돛새치과, 꼬치고깃과, 갈치과, 선농어과, 하스돔과, 돌돔과, 보리멸과, 뿔돔과, 바리과, 촉수과, 비늘돔과, 놀래기과 등을 포함한다. 전갱이과는, 방어속(방어, 잿방어, 부시리, 낫잿방어 등), 흑점줄전갱이속(흑점줄전갱이 등), 전갱이속(전갱이 등)을 포함한다. 고등어과는 고등어속(참고등어, 망치고등어, 대서양고등어 등), 다랑어속(참다랑어, 대서양다랑어, 황다랑어 등)을 포함한다. 농어과는 농어속(농어 등)을 포함한다. 도미과는 청돔속(청돔 등), 참돔속(참돔), 붉돔속(붉돔 등)을 포함한다. 연어목은 연어과를 포함한다. 연어과는, 태평양연어속(무지개송어, 아틀란틱 연어 등), 연어속(연어, 은연어 등)을 포함한다. 복어목은 복어과, 쥐치과를 포함한다. 쥐치과는 쥐치속(쥐치 등), 말쥐치속(말쥐치 등)을 포함한다.
어류의 생물의 사육용 조성물은, 어류의 생물에 시용될 수 있다. 어류의 생물에 어류의 생물의 사육용 조성물을 시용하는 방법으로서는, 어류의 생물을 사육하는 물과 어류의 생물의 사육용 조성물을 혼합하는 방법을 들 수 있다. 어류의 생물을 사육하는 물과 어류의 생물의 사육용 조성물을 혼합하는 방법으로서는, 어류의 생물의 사육용 조성물을 수중에 낙하시키는 방법, 어류의 생물의 사육용 조성물이 정치된 사육조에 물을 주입하는 방법, 물에 녹인 어류의 생물의 사육용 조성물을 어류의 생물을 사육하는 물에 첨가하는 방법 등을 들 수 있다. 어류의 생물의 사육용 조성물은, 자동적으로 일정의 간격으로 어류의 생물에 부여되어도 된다.
어류의 생물의 사육용 조성물은, 경구 투여 조성물이어도 된다. 경구 투여 조성물은, 어류의 생물에 경구 투여되는 조성물이면 특별히 한정되지 않는다. 어류 사육용 조성물은 어류용 사료(이하 「어류용 사료」로 기재하기도 한다) 또는 사료 첨가제여도 된다. 경구 투여 조성물은, 어류의 생물이 사육되고 있는 환경(예를 들어 사육수)에 첨가되어, 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물이 환경 속에 녹어들어, 환경 속에서 사육되는 어류의 생물에 경구적으로 섭취되어도 된다. 어류 경구 투여 조성물은 투여된 어류의 생물의 락토코커스·가르비에에 의한 감염증을 억제할 수 있다. 백신을 1마리씩에 주사하는 종래의 어병의 억제 방법에 비해, 본 발명에 관한 경구 투여 조성물을 투여하는 방법은 투여의 부담을 경감할 수 있다. 또한, 본 발명에 관한 경구 투여 조성물은, 어종이 한정되지 않고, 광범위한 생물종의 사육에 이용할 수 있다.
어류용 사료는, 통상 어류의 생물의 사육, 양식에 사용되는 성분이면 임의의 성분을 포함하고 있어도 되고, 임의의 제조 방법에 있어서 제조되어도 된다. 어류용 사료의 조성은, 어류의 종류 및 생육 스테이지에 따라 적절히 선택할 수 있다. 어류용 사료에는, 예를 들어 오징어 밀, 크릴새우 밀, 피시 밀, 대두유박 및 콘 글루텐 밀 등의 단백질원, 그리고 글루텐 및 전분 등의 결합제를 포함해도 된다. 어류용 사료는, 사료용에 허용되는 공지된 담체 또는 첨가제를 포함해도 되고, 에리트로마이신 제제, 암피실린 제제, 프라지콴텔 제제, 염화 리소자임 제제, 염산 옥시테트라사이클린 제제, 스피라마이신 제제, 니푸르스틸렌산나트륨 제제, 염산린코마이신 제제, 플루메퀸 제제 및 글루타티온 제제 등의 수산 생물용 의약품, 비타민 C, 비타민 B1, 비타민 A, 비타민 D 및 비타민 E 등의 비타민류, 그리고 리신, 메티오닌 및 히스티딘 등의 아미노산류 등의 영양 보급 물질, β-카로틴, 아스타크산틴 및 칸타크산틴 등의 색소, 칼슘 및 규산 등의 미네랄류, 미량 금속, 그리고 보존료 등을 포함해도 된다.
어류용 사료는, 사육되는 어류의 종류 및 크기 등에 따라서 임의의 형상, 크기를 가져도 된다. 어류용 사료는, 예를 들어 건조 원료를 혼합 및 분쇄한 분말상사료, 분체를 고형화한 고형화 사료(드라이 펠릿), 수분을 포함한 페이스트상의 사료(모이스트 펠릿), 산미끼(어류의 생선토막) 등이어도 된다. 어류용 사료의 제조 방법의 일례로서, 먼저 일반적인 분말의 어류 양식용 사료와, 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 혼합한다. 이 혼합물을 성형, 예를 들어 파스타 머신 또는 시린지를 사용해서 압출 성형한다. 마지막으로 성형물을, 예를 들어 60℃ 내지 65℃에서 2시간 정도 건조시킴으로써, 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 어류용 사료를 얻을 수 있다. 어류용 사료의 기타 일례로서, 일반적인 분말의 어류 양식용 사료에 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 묻힌 사료, 분말의 어류 양식용 사료를 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 액체(배양 상청 등)에 침지한 사료를 들 수 있다.
어류용 사료에 포함되는 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 양은, 락토코커스·가르비에에 대한 항균 활성을 나타내는 정도면 특별히 한정되지 않고, 락토코커스·가르비에의 균체 밀도, 사육 장소, 사육 온도, 산소 농도, 사육 밀도, 대상 어류의 종류 등에 적합한 양이면 된다. 어류용 사료 중 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 합계량은, 예를 들어 1×103 내지 1×1012cfu(콜로니 형성 단위)/g이어도 되고, 1×104 내지 1×1012cfu/g이어도 되고, 1×105 내지 1×1012cfu/g이어도 된다. 상기 콜로니 형성 단위는, 한천 평판 배양법에 의해 구할 수 있다. 어류용 사료 중 락티신 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 합계량(함유 비율)은, 사료 중량에 대하여 0.001질량% 내지 30질량%, 바람직하게는 0.01질량% 내지 10질량%여도 된다. 당해 합계량은, 천칭 등으로 칭량 가능하다.
어류용 사료 첨가제는, 특별히 한정되지 않고, 일반적인 어류용 양식용 사료에 첨가할 수 있는 첨가제이면 된다. 사료 첨가제는 액체 또는 분말이어도 되고, 동결 건조되어 있어도 된다. 사료 첨가제는 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물 자체여도 된다. 사료 첨가제는 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 어류용 사료에 부착, 흡수 또는 혼합시키기 쉽게 하기 위한 액체, 전착제 등을 포함해도 된다. 사료 첨가제는, 사료 중에 포함되는 락티신 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 합계량이 상술한 범위로 되도록 사료에 첨가되는 것이 바람직하다.
락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 사료는, 1일 1회 또는 복수회로 나누어서 급이되어도 된다. 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 사료는, 수일에 1회 급이되어도 된다. 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 사료를 급이하는 기간은, 대상 어류의 종류 등에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 사료는, 양식(사육)의 전체 기간에 있어서 계속해서 급이되어도 되고, 일부 기간에만 급이되어도 된다. 「일부 기간」이란, 예를 들어 사육의 전체 기간의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 50% 이상, 70% 이상 또는 90% 이상의 기간이어도 된다. 본 실시 형태의 일 측면에 있어서, 상술한 「일부 기간」의 상한값은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 사육의 전체 기간의 100% 미만이어도 되고, 99% 이하여도 된다. 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 사료를 급이하는 기간은, 예를 들어 1개월 내지 3년이어도 된다. 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 사료는, 임의의 기간에서 급이의 계속과 중단을 반복해도 된다.
어류의 생물의 사육용 조성물은, 침지 투여 조성물이어도 된다. 침지 투여 조성물은, 사육수 또는 사육수 첨가제여도 된다. 사육수는 어류의 생물의 사육에 통상 사용되는 액체여도 되고, 담수, 기수 또는 해수(인공적으로 조제된 해수를 포함한다)여도 된다. 어류의 생물의 사육은, 자연의 환경 중, 양식지 또는 수조에서 행해도 된다. 사육수는 에어레이션이 행해지고 있어도 된다. 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 사육수는, 락토코커스·가르비에에 대한 항균 활성을 갖는다. 이 사육수 속에 침지된 어류의 생물은, 락토코커스·가르비에에 의한 감염증이 억제될 수 있다. 침지 투여 조성물은 투여된 어류의 생물 락토코커스·가르비에에 의한 감염증을 억제할 수 있다. 백신을 1마리씩 주사하는 종래의 어병의 억제 방법에 비해, 본 발명에 관한 침지 투여 조성물에 어류의 생물을 침지시키는 방법은, 투여의 부담을 경감할 수 있다. 본 발명에 관한 침지 투여 조성물은, 어종이 한정되지 않고, 광범위한 생물종의 사육에 이용할 수 있다.
사육수 속의 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 함유량은, 락토코커스·가르비에에 대한 항균 활성을 나타내는 정도이면 특별히 한정되지 않고, 락토코커스·가르비에의 균체 밀도, 사육 장소, 사육 온도, 산소 농도, 사육 밀도, 대상 어류의 종류 등에 적합한 양이면 된다. 사육수 속의 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 합계량은, 예를 들어 1×102 내지 1×1010cfu/mL여도 되고, 1×103 내지 1×1010cfu/mL여도 되고, 1×104 내지 1×1010cfu/mL여도 된다. 상기 콜로니 형성 단위는, 한천 평판 배양법에 의해 구할 수 있다. 사육수에 포함되는 락티신 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 합계의 농도는, 특별히 한정되지 않고, 0.1 내지 100,000ppm이어도 되고, 1 내지 100,000ppm이어도 되고, 10 내지 100,000ppm이어도 된다. 락티신 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 합계량은, 천칭 등으로 칭량 가능하다. 구해진 합계량에 기초하여, 사육수에 대한 질량비로부터 농도를 산출하는 것이 가능하다.
사육수 첨가제는, 특별히 한정되지 않고, 일반적인 어류의 생물의 사육수에 첨가할 수 있는 첨가제이면 된다. 사육수 첨가제는 액체 또는 분말이어도 되고, 동결 건조되어 있어도 된다. 사육수 첨가제는 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물 자체여도 된다. 사육수 첨가제는 사육수 속에 포함되는 락티신 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 합계량이 상술한 범위로 되도록 사육수에 첨가되는 것이 바람직하다.
사육수 첨가제는, 어류의 생물의 사육을 개시하기 전의 사육수에 첨가되어도 되고, 어류의 생물의 사육을 행하고 있는 사육수에 첨가해도 된다. 사육수 첨가제를 사육수에 첨가하는 방법으로서는, 상술한 어류의 생물을 사육하는 물과 어류의 생물의 사육용 조성물을 혼합하는 방법과 마찬가지 방법을 들 수 있다.
락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 사육수에 어류의 생물을 침지하는 기간은, 적절히 선택할 수 있다. 어류의 생물의 사육의 전체 기간에 걸쳐서 계속해서 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 사육수로 어류의 생물을 사육해도 되고, 일부 기간에만 이 사육수에 어류를 침지해도 된다. 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 사육수 속에서 사육하는 기간은, 예를 들어 1개월 내지 3년이어도 된다. 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 사육수 속에서의 사육은, 임의의 기간에서 계속과 중단을 반복해도 된다.
어류의 생물의 사육용 조성물은, 주사 투여 조성물(주사제)이어도 된다. 주사 투여 조성물은, 투여된 어류의 생물 락토코커스·가르비에에 의한 감염증을 억제할 수 있다.
주사 투여 조성물은, 완충제, 등장화제, 무통화제, 방부제, 항균제, 항산화제 등을 더 포함해도 된다. 완충제로서, 인산염, 아세트산염, 탄산염, 시트르산염 등을 들 수 있다. 등장화제로서, 염화나트륨, 글리세린, D-만니톨 등을 들 수 있다. 무통화제로서, 벤질 알코올 등을 들 수 있다. 방부를 목적으로 한 약제로서, 티메로살, 파라옥시벤조산에스테르류, 페녹시에탄올, 클로로부탄올, 벤질 알코올, 페네틸 알코올, 데히드로아세트산, 소르브산, 각종 방부제, 항생 물질, 합성 항균제 등을 들 수 있다. 항산화제로서, 아황산염, 아스코르브산 등을 들 수 있다. 주사 투여 조성물은, 보존 및 효능의 보조제가 되는 광흡수 색소(리보플라빈, 아데닌, 아데노신 등), 안정화를 위한 킬레이트제 및 환원제(비타민 C, 시트르산 등), 탄수화물(소르비톨, 락토오스, 만니톨, 전분, 수크로오스, 글루코오스, 덱스트란 등), 카제인 소화물, 각종 비타민을 포함해도 된다.
주사 투여 조성물은 적당한 완충제에 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 첨가해서 얻을 수 있다. 주사 투여 조성물의 일례로서, 종래의 어류용 백신에 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 첨가해서 얻을 수 있다. 주사 투여 조성물은 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물 자체여도 된다.
주사 투여 조성물에 포함되는 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 양은, 락토코커스·가르비에에 대한 항균 활성을 나타내는 정도이면 특별히 한정되지 않고, 락토코커스·가르비에의 균체 밀도, 사육 장소, 사육 온도, 산소 농도, 사육 밀도, 대상 어류의 종류 등에 적합한 양이면 된다. 주사 투여 조성물 중의 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 합계량은, 예를 들어 1×103 내지 1×1012cfu(콜로니 형성 단위)/g이어도 되고, 1×104 내지 1×1012cfu/g이어도 되고, 1×105 내지 1×1012cfu/g이어도 된다. 주사 투여 조성물 중의 락티신 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 합계량은, 주사 투여 조성물 전체의 중량에 대하여 0.001질량% 내지 30질량%, 바람직하게는 0.01질량% 내지 10질량%여도 된다.
주사 투여 조성물은 어류의 생물에 대하여 1회 또는 복수회 투여되어도 된다. 주사 투여 조성물은, 예를 들어 어류의 생물의 근육 내 또는 복강 내에 투여된다. 1회의 투여량은 0.05mL 내지 3.0mL여도 된다. 투여하는 시기는 어류의 치어기, 유어기 또는 성어기여도 된다.
본 발명의 일 실시 형태는, 어류의 생물의 사육용 조성물의 제조에 있어서의 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 사용이다.
[어류의 생물의 사육 방법]
본 발명의 일 실시 형태에 따른 어류의 생물의 사육 방법은, 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 어류의 생물에 시용하는 것을 포함한다. 시용은, 경구 투여, 침지 투여 또는 주사 투여여도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 따른 어류의 생물의 사육 방법은, 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 어류의 생물에 섭취시키는 것을 포함한다. 락티신 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물은, 상기의 어류의 생물의 사육용 조성물로서 공급되어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 따른 어류의 생물의 사육 방법은, 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 사육수에 어류의 생물을 침지시키는 것을 포함한다. 락티신 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 사육수는, 상기의 어류의 생물의 사육용 조성물로서 공급되어도 된다.
어류의 생물의 사육 방법에 있어서, 어류의 생물의 사육용 조성물은, 상술한 어류의 생물을 사육하는 물과 어류의 생물의 사육용 조성물을 혼합하는 방법에 따라서 부여되어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 따른 어류의 생물의 사육 방법은, 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물의 추출물을 어류의 생물에 주사하는 것을 포함한다. 락티신 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물은, 상기의 어류의 생물의 사육용 조성물로서 공급되어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태는, 어류의 생물의 사육에 있어서의 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물의 추출물의 사용이다.
[락토코커스·가르비에에 의한 어류의 병에 대한 예방 또는 치료용 조성물]
본 발명의 일 실시 형태에 따른 락토코커스·가르비에(연쇄 구균)에 의한 어류의 병에 대한 예방 또는 치료용 조성물은, 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함한다. 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 균체의 균체 조제물을 사용하여, 락토코커스·가르비에에 의한 어류 감염증을 예방 또는 치료할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 치료에는, 증상의 완화, 증상의 호전 및 완치를 포함한다. 예방 또는 치료용 조성물은 동물용 의약품어도 된다.
락티신 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물은, 각각 락토코커스·가르비에에 대한 항균 활성을 나타내고, 락토코커스·가르비에의 증식을 억제하는 것 또는 락토코커스·가르비에를 살균할 수 있다. 락티신 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물은, 각각 구형(I형) 락토코커스·가르비에뿐만 아니고, 신형(II형) 락토코커스·가르비에에 대해서도 항균 활성을 나타낸다. 락티신 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물은, 각각 감염증의 원인균에 대하여 직접 항균 활성을 갖고, 감염증의 억제 기구가 숙주에 의존하지 않는다. 이 때문에, 대상 어류의 종류 또는 성장 스테이지에 관계없이, 보다 범용적으로 어류 감염증을 억제할 수 있다. 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 사용하면,보다 안정된 어류의 생물 양식이 가능해진다.
예방 또는 치료용 조성물은, 경구 투여 조성물이어도 되고, 사료 또는 사료 첨가제의 형태로 어류의 생물에 투여되어도 된다. 예방 또는 치료용 조성물은, 어류의 생물의 사육에 사용되는 경구 투여 조성물에 포함될 수 있는 성분을 포함해도 된다. 예방 또는 치료용 조성물은, 공지된 락토코커스·가르비에에 대한 항균 활성을 갖는 성분 또는 어류의 면역 활성을 상승시키는 성분을 더 포함해도 된다. 예방 또는 치료 조성물의 형상, 제조 방법 및 투여 방법은, 어류의 생물의 사육에 사용되는 경구 투여 조성물의 형상, 제조 방법 및 투여 방법과 동일해도 된다. 예방 또는 치료용 조성물에 있어서의 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 함유량은, 투여된 어류의 생물에 있어서 락토코커스·가르비에에 의한 감염증을 예방 또는 치료할 수 있는 정도이면 특별히 한정되지 않고, 어류의 생물의 사육에 사용되는 경구 투여 조성물에 있어서의 함유량과 동일한 범위여도 된다.
예방 또는 치료용 조성물은, 침지 투여 조성물이어도 되고, 사육수 또는 사육수 첨가제의 형태여도 된다. 사육수 또는 사육수 첨가제인 예방 또는 치료용 조성물은, 어류의 생물의 사육에 사용되는 사육수 또는 사육수 첨가제와 같이 사용 또는 첨가되어도 된다. 예방 또는 치료용 조성물에 있어서의 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 함유량은, 침지된 어류의 생물에 있어서 락토코커스·가르비에에 의한 감염증을 예방 또는 치료할 수 있는 정도이면 특별히 한정되지 않고, 어류의 생물의 사육에 사용되는 사육수에 있어서의 함유량과 동일한 범위여도 된다.
예방 또는 치료용 조성물은, 주사 투여 조성물(주사제)이어도 된다. 예방 또는 치료용 조성물은, 상기 어류의 생물의 사육에 사용되는 주사 투여 조성물에 포함될 수 있는 성분을 포함해도 된다. 예방 또는 치료용 조성물은, 공지된 락토코커스·가르비에에 대한 항균 활성을 갖는 성분 또는 어류의 면역 활성을 상승시키는 성분을 더 포함해도 된다. 예방 또는 치료 조성물의 형상, 제조 방법 및 투여 방법은, 어류의 생물의 사육에 사용되는 주사 투여 조성물의 형상, 제조 방법 및 투여 방법과 동일해도 된다. 예방 또는 치료용 조성물에 있어서의 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 함유량은, 주사 투여된 어류의 생물에 있어서 락토코커스·가르비에에 의한 감염증을 예방 또는 치료할 수 있는 정도이면 특별히 한정되지 않고, 어류의 생물의 사육에 사용되는 주사 투여 조성물에 있어서의 함유량과 동일한 범위여도 된다.
본 발명의 일 실시 형태는, 락토코커스·가르비에에 의한 어류 감염증에 대한 예방 또는 치료용 조성물의 제조에 있어서의 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 사용이다.
[락토코커스·가르비에에 의한 어류의 병에 대한 예방 또는 치료 방법]
본 발명의 일 실시 형태에 따른 락토코커스·가르비에에 의한 어류의 병에 대한 예방 또는 치료 방법은, 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 어류의 생물에 시용하는 것을 포함한다. 시용은, 경구 투여, 침지 투여 또는 주사 투여여도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 따른 락토코커스·가르비에에 의한 어류의 병에 대한 예방 또는 치료 방법은, 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 어류의 생물에 섭취시키는 것을 포함한다. 락티신 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물은, 상기 예방 또는 치료용 조성물로서 어류의 생물에 공급되어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 따른 락토코커스·가르비에에 의한 어류의 병에 대한 예방 또는 치료 방법은, 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 사육수에 어류의 생물을 침지시키는 것을 포함한다. 락티신 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 사육수는, 상기 예방 또는 치료용 조성물로서 공급되어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 따른 락토코커스·가르비에에 의한 어류의 병에 대한 예방 또는 치료 방법은, 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 어류의 생물에 주사하는 것을 포함한다. 락티신 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물은, 상기 예방 또는 치료용 조성물로서 어류의 생물에 공급되어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태는, 락토코커스·가르비에에 의한 어류의 병에 대한 예방 또는 치료를 위한 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 사용이다.
[락토코커스·가르비에의 증식 억제제 또는 살균제 및 증식 억제 방법 또는 살균 방법]
본 발명의 일 실시 형태에 따른 락토코커스·가르비에의 증식 억제제 또는 살균제는, 락티신을 포함한다. 본 발명의 일 실시 형태에 따른 락토코커스·가르비에의 증식 억제제 또는 살균제는, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물을 포함한다. 락티신 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물은, 각각 락토코커스·가르비에의 증식을 억제하는 것 또는 락토코커스·가르비에를 살균할 수 있다. 증식 억제제 또는 살균제는, 어류의 생물의 사육용 조성물과 같은 형태여도 된다. 증식 억제제 또는 살균제는, 락토코커스·가르비에에 대하여 항균 활성을 갖는 물질을 더 포함해도 된다.
락토코커스·가르비에의 증식 억제제 또는 살균제에 포함되는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 함유량은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1×103 내지 1×1012cfu/mL여도 되고, 1×105 내지 1×1012cfu/mL여도 되고, 1×107 내지 1×1012cfu/mL여도 된다. 락토코커스·가르비에의 증식 억제제 또는 살균제에 포함되는 락티신 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 합계의 농도는, 특별히 한정되지 않고, 0.01 내지 100,000ppm이어도 되고, 0.1 내지 100,000ppm이어도 되고, 1 내지 100,000ppm이어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 따른 락토코커스·가르비에의 증식 억제 또는 살균 방법은, 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 락토코커스·가르비에에 접촉시키는 것을 포함한다. 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물과 락토코커스·가르비에를 접촉시키는 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어 락토코커스·가르비에가 존재하는 물에 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 첨가해도 되고, 락토코커스·가르비에가 존재하는 물체를 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 액체에 침지해도 된다. 락토코커스·가르비에가 감염한 숙주에 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 조성물을 섭취 시켜도 되고, 락토코커스·가르비에가 감염한 숙주에 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 사육수에 침지시켜도 된다. 락토코커스·가르비에가 감염한 숙주에 락티신 또는 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 포함하는 조성물을 주사해도 된다. 락티신 및 락티신 유전자를 갖는 균체의 균체 조제물은, 락토코커스·가르비에의 증식 억제제 또는 살균제의 형태로 사용되어도 된다.
본 발명의 일 실시 형태는, 락토코커스·가르비에의 증식 억제제 또는 살균제의 제조에 있어서의 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 사용이다.
본 발명의 일 실시 형태는, 락토코커스·가르비에의 증식 억제 또는 살균을 위한 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 사용이다.
실시예
이하, 실시예를 들어서 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실험 1: NITE BP-03536의 분리 및 동정]
분리원(부추절임)을 멸균수와 함께 마쇄했다. 마쇄액을 적절히 희석해서 1/2MRS 액체 배지에 첨가하고, 집적 배양했다. 집적 배양액을 탄산칼슘 함유의 MRS 한천 배지에 도말하고, 헬로를 형성한 미생물을 분리했다. 이하, 이 분리주를 분리주 A라 한다. 과산화수소에 분리주 A의 배양액을 현탁한바, 기포가 발생하지 않았다. 분리주 A는 카탈라아제 활성을 갖지 않는 점에서, 유산균인 것이 확인되었다.
16S rRNA 유전자 해석, 형태 관찰 및 생리·생화학적 성상 시험에 의해, 분리주 A를 동정했다.
(1) 16S rRNA 유전자 해석
분리주 A로부터 게놈 DNA를 추출하고, 얻어진 게놈 DNA를 주형으로 하여, 클로닝용 정방향 프라이머 9F 및 클로닝용 역방향 프라이머 1510R(나카가와 야스요시 외: 유전자 해석법 16S rRNA 유전자의 염기 서열 결정법, 일본 방선균 학회편, 방선균의 분류와 동정, 88-117pp. 일본 학회 사무 센터, 2001)을 사용해서 16S rRNA 유전자의 PCR 증폭을 행하였다. PCR 증폭은 Tks Gflex DNA 폴리메라아제(다카라 바이오사제)를 사용해서 행하여, PCR 후의 증폭산물을 정제했다.
정제한 PCR 후의 증폭 산물을 사용해서 사이클 시퀀스 반응을 행하였다. 사이클 시퀀스 반응은 BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit를 사용해서 행하였다. 얻어진 반응액을 정제하고, 정제액을 DNA 시퀀스 해석(3130xl DNA Analyzer)에 제공하고, 분리주 A로부터 추출한 주형 DNA의 16S rRNA 유전자의 염기 서열을 결정했다. 시퀀스 해석용 프라이머로서는, 9F, 515F, 1099F, 536R, 926R, 1510R(나카가와 야스요시 외: 유전자 해석법 16S rRNA 유전자의 염기 서열 결정법, 일본 방선균 학회편, 방선균의 분류와 동정, 88-117pp. 일본 학회 사무 센터, 2001)을 사용했다.
분리주 A의 16S rRNA 유전자의 염기 서열을 미생물 동정 시스템 「ENKI」(테크노 스루가·연구소사제)을 사용하여, 미생물 동정 데이터베이스 DB-BA15.0(테크노 스루가·연구소(laboratory)사제), 국제 염기 서열 데이터베이스(DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank)에 대하여 BLAST 상동성 검색을 행하였다. 분리주 A의 16S rRNA 유전자의 염기 서열은, 락토코커스 락티스 subsp. 락티스(NCDO604; Accession No.AB100803)의 16S rRNA 유전자의 염기 서열에 대하여 동일성 99.93%, 락토코커스 락티스 subsp. 호르드니애(hordniae)(NCDO2181)의 16S rRNA 유전자의 염기 서열에 대하여 동일성 99.93%, 락토코커스 락티스 subsp. 트룩트애(tructae)(L105)의 16S rRNA 유전자의 염기 서열에 대하여 동일성 99.46%, 락토코커스 락티스 subsp. 크레모리스(cremoris)(NCDO607)의 16S rRNA 유전자의 염기 서열에 대하여 동일성 99.39%을 나타냈다.
(2) 형태 관찰 및 생리·생화학적 성상 시험
MRS 한천 배지에 분리주 A를 도포하고, 온도 30℃에서 48시간 호기 배양하고, 이하의 방법으로 세포 형태, 그람 염색성, 운동성 및 콜로니 형태를 관찰했다. 세포 형태는, 광학 현미경 BX50F4(올림푸스사제)에 의해 관찰했다. 그람 염색에서는 페이버 G「닛스이」(닛스이 세이야쿠사제)를 사용했다. 콜로니 형태는, 실체 현미경 SMZ800N(니콘사제)에 의해 관찰했다. Barrow & Feltham(Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria, 3rd ed. Cambridge: Cambridge University Press; 1993.)에 기재된 방법에 기초하여, 카탈라아제 반응, 옥시다아제 반응, 포도당으로부터의 산/가스 산생 및 포도당의 산화/발효(O/F)에 대해서 시험을 행하였다. API50CHB 키트(bio Merieux사 제조, 프랑스)를 사용해서, 세균의 생리·생화학적 성상 반응을 조사했다.
도 3의 (A)에 나타내는 바와 같이, 분리주 A는 원형의 콜로니를 형성했다. 도 3의 (B)에 나타내는 바와 같이, 분리주 A는 그람 염색성이 양성이었다. 분리주 A의 생리·생화학적 성상 시험 및 발효성 시험의 결과를 표 1 및 표 2에 나타낸다. 분리주 A는 운동성을 나타내지 않는 그람 양성의 난 원구상이며, 아포를 형성하지 않고, 카탈라아제 반응 및 옥시다아제 반응은 음성을 나타내고, 글루코오스를 발효했다. 이들의 성상은, 16S rDNA 부분 염기 서열 해석의 결과, 귀속의 가능성이 나타내진 락토코커스속의 성상과 일치했다. API 키트를 사용해서 행한 발효성 시험의 결과, 분리주 A는 리보오스, D-크실로오스, 갈락토오스, 만니톨 및 말토오스 등을 발효하고, 멜리비오스 및 멜레치토오스 등을 발효하지 않았다. 분리주 A는 아르기닌 디히드롤라아제 활성을 나타냈다. 분리주 A는 15℃에서 생육하고, 4% NaCl존재 하에서도 생육했다. 이들 성상으로부터, 분리주 A는 락토코커스 락티스 subsp. 락티스에 속하는 신규 분리주인 것을 알 수 있다. 분리주 A를 NITE BP-03536(수령 번호: NITE ABP-03536)로서 국제 기탁했다.
NITE BP-03536의 게놈 DNA의 서열 해석을 행한 결과, NITE BP-03536은 항균 펩티드로서 기지의 락티신 Q 유전자를 갖고 있었다. NITE BP-03536이 갖는 락티신 Q 유전자의 아미노산 서열 및 DNA 서열을 서열 번호 1 및 2에 각각 나타낸다.
Figure pct00001
Figure pct00002
[실험 2: 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 항균 활성 시험]
NITE BP-03536의 균체 조제물이, 락토코커스·가르비에 I형(TUMSAT-K9408주) 및 II형(TUMSAT-LgN1주)의 증식을 억제할지를 검증했다. 도 4를 참조하여 실험 방법을 설명한다. 270μL의 Todd-Hewitt(TH) 배지에 락토코커스·가르비에(약 105cfu/mL)를 3μL 첨가하여, 락토코커스·가르비에를 포함하는 균액 10을 준비했다. 이 균액 10에 NITE BP-03536의 균체 조제물 11을 30μL 첨가하고, 25℃로 8시간 진동 배양했다. 5μL의 균 배양액 13을 TH 한천 배지 14에 적하하고, 25℃에서 12시간 배양 후에 락토코커스·가르비에의 콜로니 15가 형성되는지를 관찰했다. 관찰된 콜로니가 5개 이하인 경우, 항균 활성이 있다고 판단했다. 실험에 사용한 NITE BP-03536의 균체 조제물은, 이하의 방법으로 조제했다. 먼저, NITE BP-03536을 MRS Broth에서 온도 30℃에서 배양하고, 배양액을 얻었다. 그 후, 상기 배양액을 원심 분리함으로써 균체를 침전시켜서, 배양 상청을 회수했다. 회수한 배양 상청을 한외 여과막(머크 밀리포아사, AMICON ULTRA-153 KDa cutoff)을 사용해서 10배로 농축함으로써, 균체 조제물을 얻었다. 네거티브 컨트롤로서는, NITE BP-03536의 균체 조제물 11 대신에, 유산균용 배지(MRS Broth)를 락토코커스·가르비에를 포함하는 균액 10에 첨가했다. 항균 활성 시험의 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
락티신 유전자를 갖는 NITE BP-03536의 배양 상청은 락토코커스·가르비에 I형및 II형의 증식을 억제했다. 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물은 락토코커스·가르비에에 대한 항균 활성을 갖는 것이 나타내졌다.
[실험 3: 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물의 경구 투여에 의한 어류의 연쇄상 구균증의 예방 또는 치료 효과의 검증]
방어에 NITE BP-03536의 균체 조제물을 경구 투여하고, 연쇄상 구균증에 의한 사망이 억제될지를 검증했다. 방어의 치어(모자코)를 1구당 25마리의 2개의 시험구로 나누고, 하기의 사료를 부여했다.
(1) 컨트롤: 통상의 사료(피드 원 가부시키가이샤, 하마치 육성용 EP 사료)
(2) NITE BP-03536의 배양 상청에 사료를 침지한 것(0.3mL/g사료)
NITE BP-03536의 배양 상청은, 이하의 방법으로 조제했다. 먼저, 당해 유산균(NITE BP-03536)을 MRS Broth에서 온도 30℃에서 배양하고, 배양액을 얻었다. 그 후, 상기 배양액을 원심 분리함으로써 균체를 침전시켜서, 상기 배양 상청을 회수했다.
방어의 치어를 인공 해수(도미타 세이야쿠 가부시키가이샤제)를 순환시킨 수조에서 약 1주일 순화 사육한 후, 시험을 개시했다. 사육 수온은 23 내지 25℃였다. 시험 개시 시의 방어의 치어의 추정 체중은 약 20g이었다. 상기의 사료를 1일 1회 포식시켰다. 공급 개시로부터 2주일 후, 락토코커스·가르비에 II형(18-15주)를 1×108cfu/mL에서 포함하는 사육수에 1시간 방어를 침지하고, 락토코커스·가르비에를 감염시켰다. 감염 후, 방어를 원래의 수조로 되돌려서 추가로 2주일 상기의 사료를 투여해서 사육을 계속했다. 시험 후의 방어의 생존수를 표 4 및 도 5에 나타낸다. 도 5에 있어서, 종축은 락토코커스·가르비에에 감염시킨 방어의 생존수를 나타내고, 횡축은 락토코커스·가르비에를 감염시키고 나서의 사육 일수를 나타내고 있다.
Figure pct00004
NITE BP-03536의 균체 조제물을 경구 투여한 방어는, 컨트롤에 비하여 생존율이 상승하고 있었다. 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 어류의 생물에 경구 투여함으로써, 연쇄상 구균증에 의한 사망을 억제할 수 있는 것이 나타났다. 또한, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 조제물을 어류의 생물에 경구 투여 함으로써, 락토코커스·가르비에의 감염이 억제되고 있는 것이 나타내졌다.
10: 락토코커스·가르비에를 포함하는 균액, 11: NITE BP-03536의 균체 조제물, 13: 균 배양액, 14: TH 한천 배지, 15: 콜로니.
독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터 NITEBP03536 20210914
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Claims (15)

  1. 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 상기 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 어류의 생물의 사육용 조성물.
  2. 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 상기 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 락토코커스·가르비에에 의한 어류의 병에 대한 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 락티신은 (a) 내지 (c)의 어느 서열을 포함하고, 또한 항균 활성을 갖는 펩티드인, 조성물;
    (a) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열,
    (b) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여, 69% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
    (c) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여, 1 이상 16 이하의 아미노산 잔기가 결손, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 락티신은 락티신 Q 및 락티신 Z에서 선택되는 적어도 하나이고, 상기 락티신 유전자는 락티신 Q 유전자 및 락티신 Z 유전자에서 선택되는 적어도 하나인, 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 락티신 유전자를 갖는 세균은 NITE BP-03536인, 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 어류는 농어목 또는 연어목인, 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 사료, 사료 첨가제, 사육수, 사육수 첨가제 또는 주사제인, 조성물.
  8. 제1항에 기재된 조성물을 어류의 생물에 시용하는 것을 포함하는, 어류의 생물의 사육 방법.
  9. 제2항에 기재된 조성물을 어류의 생물에 시용하는 것을 포함하는, 락토코커스·가르비에에 의한 어류의 병에 대한 예방 또는 치료 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 시용은 경구 투여, 침지 투여 또는 주사 투여인, 방법.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 어류는 농어목 또는 연어목인, 방법.
  12. 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 상기 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 락토코커스·가르비에에 대한 증식 억제제 또는 살균제.
  13. 락티신, 락티신 유전자를 갖는 세균의 균체 또는 균체 배양물 및 상기 균체 또는 균체 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 락토코커스·가르비에에 접촉시키는 것을 포함하는, 락토코커스·가르비에의 증식 억제 또는 살균 방법.
  14. 수탁 번호가 NITE BP-03536인 세균.
  15. 제14항에 기재된 세균의 균체 혹은 균체 배양물 또는 이들의 추출물.
KR1020247012945A 2021-09-30 2022-09-29 어류 사육용 조성물 및 어병에 대한 예방 또는 치료용 조성물 KR20240067102A (ko)

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