CN111278978B - 使细菌能够通过葡萄糖依赖性生存力特异性靶向实体肿瘤的核酸系统 - Google Patents

使细菌能够通过葡萄糖依赖性生存力特异性靶向实体肿瘤的核酸系统 Download PDF

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Abstract

提供了一个核酸系统，其被引入细菌菌株以产生在实体肿瘤中生长但不在非肿瘤组织中生长的基因工程化细菌菌株，所述核酸系统包含：编码毒素基因的第一DNA片段，所述毒素基因表达杀死所述基因工程化细菌菌株的毒素；编码解毒剂基因的第二DNA片段，所述解毒剂基因表达使所述毒素无效的解毒剂；第一启动子，其控制所述解毒剂基因的转录，使得葡萄糖抑制所述解毒剂基因的转录；以及第一组成型启动子，其引起毒素基因的组成型表达；其中所述第二DNA片段在实体肿瘤中转录，但在非肿瘤组织中不转录。

Description

使细菌能够通过葡萄糖依赖性生存力特异性靶向实体肿瘤的 核酸系统
技术领域
本发明涉及核酸系统。特别地，本发明涉及赋予细菌靶向实体肿瘤能力的核酸系统。
背景技术
大多数抗肿瘤药物针对所有活跃分裂的细胞起作用，导致严重的甚至致命的副作用。当全身施用时，靶向疗法必须能够区分肿瘤与非肿瘤组织，以便治疗原发性和播散性肿瘤。
以前的靶向治疗依赖于非生物药物。当全身递送时，非生物药物在血流中显著稀释，仅有一小部分可用于肿瘤。此外，非生物药物依赖于肿瘤血管来递送，因此不能有效地扩散至血管化差和低氧的肿瘤组织。因此，在过去的几十年中，已经评估了各种专性或兼性厌氧菌在靶向肿瘤方面的安全性和有效性，所述专性或兼性厌氧菌能够进行递送后繁殖并偏爱血管化不良的肿瘤组织。这些肿瘤靶向的厌氧菌如梭状芽孢杆菌和沙门氏菌可作为肿瘤杀伤剂的载体，实现肿瘤的靶向治疗。在一些情况下，发现工程化专性厌氧菌显示增加的肿瘤选择性。尽管有这些进展，但肿瘤靶向细菌的临床应用仍然远非现实，因为它们的肿瘤特异性不足。
鉴于对具有改善肿瘤特异性的靶向治疗的需求，非常需要破坏肿瘤但使正常组织保持完整的肿瘤靶向系统、药剂和方法。
发明内容
一个示例性实施方案是引入细菌菌株以产生基因工程化细菌菌株的核酸系统。所得到的基因工程化细菌菌株在实体肿瘤中生长，但不在非肿瘤组织中生长。所述核酸系统包括第一DNA片段、第二DNA片段、第一启动子和第一组成型启动子。第一DNA片段编码毒素基因，该毒素基因表达杀死基因工程化细菌菌株的毒素。第二DNA片段编码解毒剂基因，其表达使毒素无效的解毒剂。第一启动子控制解毒剂基因的转录，使得葡萄糖抑制解毒剂基因的转录。第一组成型启动子引起毒素基因的组成型表达。第二DNA片段在实体肿瘤中转录，但在非肿瘤组织中不转录。
本文讨论了其他示例性实施例。
附图说明
图1A显示了根据一个示例性实施方案将细菌靶向低葡萄糖环境的毒素-解毒剂遗传系统。
图1B显示了根据一个示例性实施方案，使用CcdB作为毒素、CcdA作为解毒剂，构建将大肠杆菌靶向低葡萄糖环境的核酸系统的示意图。
图1C显示了根据一个示例性实施方案的药物递送系统，其包括将抗癌药物递送至实体肿瘤的基因工程化细菌。所述抗癌药物包括但不限于由工程化细菌产生的抗癌分子或化合物或者由细菌表达并能够触发抗癌免疫应答的抗原。
图1D显示了根据一个示例性实施方案在具有0mM至4mM不同葡萄糖浓度的M63琼脂上划线以寻找在葡萄糖存在下不能生长但在葡萄糖不存在下生长的克隆。
图2A显示了根据一个示例性实施方案，在静脉注射细菌(107/小鼠)后15天，基因工程化菌株JY1和JY6和未修饰的命名为MG1655的野生型大肠杆菌菌株在Bagg白化体/c(BALB/c)小鼠的CT26(鼠结肠直肠癌细胞系)肿瘤中的定殖。
图2B显示了根据一个示例性实施方案，在静脉注射细菌(107/小鼠)后15天，细菌JY1、JY6和MG1655菌株在CT26肿瘤BALB/c小鼠肝脏中的定殖。
图2C显示了根据一个示例性实施方案，在静脉注射细菌(107/小鼠)后15天，细菌菌株JY1、JY6和MG1655在具有CT26肿瘤的BALB/C小鼠肝脏中定殖的百分比。
图2D显示了根据一个示例性实施例，在静脉注射细菌(107/小鼠)后7天，细菌菌株JY1、JY6和MG1655在具有HCT116(人结肠直肠癌细胞系)肿瘤的裸鼠的肿瘤中的定殖。
图2E显示了根据一个示例性实施方案，在静脉注射细菌(107/小鼠)后7天，细菌菌株JY1、JY6和MG1655在具有HCT116肿瘤的裸鼠肝脏中的定殖。
图2F显示了根据一个示例性实施方案，在静脉注射细菌(107/小鼠)后7天，细菌菌株JY1、JY6和MG1655在具有HCT116肿瘤的裸鼠肝脏中定殖的百分比。
图3A显示了根据一个示例性实施方案，细菌菌株JYH1和SH1hly在携带皮下SW480(人结肠直肠癌细胞系)肿瘤的裸鼠的肝脏和脾脏中的定殖。
图3B显示了根据一个示例性实施方案，在携带皮下SW480肿瘤的裸鼠中被细菌菌株JYH1和SH1hly感染的肝脏和脾脏的百分比。
图3C显示了根据一个示例性实施方案用细菌菌株SH1hly处理的小鼠中形成的肝脓肿。
图3D显示了根据一个示例性实施方案，来自携带皮下SW480肿瘤的裸鼠的苏木精和伊红(H&E)染色的肝脏切片的显微图像，所述裸鼠用磷酸盐缓冲盐水(PBS)、菌株SH1hly和JYH1处理。
图4显示了根据一个示例性实施方案静脉注射JYH1菌株对免疫活性BALB/c小鼠CT26肿瘤的靶向效果。
图5显示了根据一个示例性实施方案，通过在葡萄糖缺乏区选择性存活和生长来构建靶向实体肿瘤的基因工程化细菌菌株的方法。
图6A显示了根据一个示例性实施方案，大肠杆菌SH1和大肠杆菌MG1655对SW480和HCT116细胞的体外细胞毒性作用。
图6B显示了根据一个示例性实施方案，大肠杆菌SH1和大肠杆菌MG1655对ASPC-1、Mia-capa-2和panc-1细胞的体外细胞毒性作用。
图7A显示了根据一个示例性实施例的静脉注射的大肠杆菌JYH1对HCT116肿瘤在裸鼠中生长的抑制作用。
图7B显示了根据一个示例性实施方案的静脉注射大肠杆菌JYH1对SW480肿瘤在裸鼠中生长的抑制作用。
图7C显示了根据一个示例性实施方案，在0-55天内将PBS静脉注射到小鼠中治疗SW480肿瘤的代表性照片。
图7D显示了根据一个示例性实施方案，在0-90天内将JYH1静脉注射到小鼠中治疗SW480肿瘤的代表性照片。
具体实施方式
示例性实施方案涉及一种核酸系统。将所述核酸系统导入细菌菌株，以使基因工程化细菌菌株靶向实体肿瘤，但使正常组织保持完整。
低氧(hypoxia)是肿瘤微环境的特征之一，最常用于将细菌靶向实体肿瘤。然而，严格靶向低氧的专性厌氧菌局限于实体肿瘤的坏死区，而兼性厌氧菌定殖于整个实体肿瘤，但由于其对低氧靶向的不严格而感染正常组织。根据本发明的实施例通过向细菌中引入核酸系统解决了这些技术问题，所述核酸系统通过调节细菌的葡萄糖依赖性存活力来改善细菌的肿瘤特异性。
图1A显示了包括组成型表达的毒素编码基因和在葡萄糖抑制型启动子控制下的解毒剂编码基因的核酸系统100。根据一个示例性实施方案，核酸系统赋予细菌靶向低葡萄糖环境的能力。
毒素解毒剂遗传系统使细菌能够在葡萄糖缺乏的环境中选择性生长，但在葡萄糖存在下死亡。由于葡萄糖缺乏是实体肿瘤微环境的特征，因此，当全身应用时，配备有所述核酸系统的细菌可以特异性靶向实体肿瘤。肿瘤细胞通常由于快速细胞生长和过量葡萄糖消耗以及血液供应不足而缺乏葡萄糖。假定1g组织为1ml，肿瘤组织中葡萄糖浓度为0.123-0.424mM，正常组织中葡萄糖浓度为1.22-1.29mM。毒素-解毒剂核酸系统使细菌能够在低葡萄糖环境下选择性生长。
核酸系统赋予细菌在低葡萄糖条件下选择性生长的能力，这是肿瘤微环境的特征。由于肿瘤微环境处于强烈免疫抑制的状态，细菌(例如大肠杆菌)具有优先在实体肿瘤中生长并在较小程度上定植于正常组织的内在能力。在此基础上，靶向低葡萄糖环境的核酸系统赋予细菌如大肠杆菌更高的肿瘤选择性，其细菌本身不具有足够的肿瘤特异性，从而提高了细菌介导的肿瘤治疗的安全性。
在一个示例性实施方案中，作为肿瘤靶向系统的核酸系统被整合到细菌的染色体中，使得细菌不仅仅依赖于它们肿瘤靶向的天然能力，并且进而细菌的安全性得到改善。在一个示例性实施方案中，将核酸系统插入质粒中。在一个示例性实施方案中，核酸系统是葡萄糖传感(glucose-sensing)系统或模块。
在一个示例性实施方案中，携带核酸系统的细菌通过靶向低葡萄糖环境而严格定殖(colonize)实体肿瘤。
在一个示例性实施方案中，核酸系统包括毒素编码基因、解毒剂编码基因、控制解毒剂编码基因转录的葡萄糖抑制型启动子和引起毒素编码基因组成型表达的组成型启动子。
在一个示例性实施方案中，在具有生理水平葡萄糖的环境中，毒素组成型表达，而处于葡萄糖抑制的启动子的控制下，解毒剂表达被葡萄糖抑制。携带核酸系统的细菌在具有生理水平葡萄糖的环境中不生长，因为解毒剂不表达以中和毒素。在低葡萄糖环境中，毒素和解毒剂都被表达。携带核酸系统的细菌在低葡萄糖环境中生长，因为解毒剂中和了毒素。
在一个示例性实施方案中，核酸系统包括毒素编码基因、解毒剂编码基因、控制毒素编码基因转录的葡萄糖诱导型启动子和引起解毒剂编码基因组成型表达的组成型启动子。
在一个示例性实施方案中，在具有生理水平的葡萄糖的环境中，解毒剂组成型表达，而处于葡萄糖诱导的启动子控制下，毒素表达由葡萄糖诱导。携带核酸系统的细菌在具有生理水平葡萄糖的环境中不生长，因为毒素表达的水平高于解毒剂的表达，从而杀死细菌。在低葡萄糖环境中，毒素不表达，使得细菌存活和生长。
在一个示例性实施方案中，低葡萄糖环境包括浓度低于0.424mM的葡萄糖。在一个示例性实施方案中，高葡萄糖环境包括浓度高于1.22mM的葡萄糖。在一个示例性实施方案中，低葡萄糖环境具有浓度为0.123-0.424mM的葡萄糖。在一个示例性实施方案中，高葡萄糖环境具有浓度为1.22-1.29mM的葡萄糖。
在一个示例性实施方案中，在实体肿瘤中，表达的解毒剂的水平高于或等于表达的毒素的水平，使得毒素的毒性被解毒剂拮抗。
在一个示例性实施方案中，肿瘤靶向核酸系统是包括编码表达毒素的毒素基因的第一DNA片段、编码表达使毒素无效的解毒剂基因的第二DNA片段、第一启动子和第一组成型启动子的核酸系统。第一组成型启动子引起毒素基因的组成型表达。第一启动子在葡萄糖浓度的控制下调节第二DNA片段的转录，使得第二DNA片段在低葡萄糖环境下或在不存在葡萄糖的情况下转录，但在存在葡萄糖或在高葡萄糖环境下不转录。在一个示例性实施方案中，第二DNA片段在不存在葡萄糖的情况下转录，但在M63培养基中浓度等于或高于1mM的高葡萄糖环境下不转录。
在一个示例性实施方案中，第一启动子控制解毒剂基因的转录，使得葡萄糖抑制解毒剂基因的转录。第二DNA片段在实体肿瘤中转录，但在非肿瘤组织中不转录。
在一个示例性实施方案中，肿瘤靶向核酸系统是包括编码表达毒素的毒素基因的第一DNA片段、编码表达使毒素无效的解毒剂基因的第二DNA片段、第二启动子和第二组成型启动子的核酸系统。第二组成型启动子引起解毒剂基因的组成型表达。第二启动子在葡萄糖浓度的控制下调节第一DNA片段的转录，使得第一DNA片段在高葡萄糖环境下或在生理水平的葡萄糖存在下转录，但在葡萄糖不存在或在低葡萄糖环境下不转录。在一个示例性实施方案中，第一DNA片段在不存在葡萄糖时不转录，但在M63培养基中在浓度等于或高于1mM的高葡萄糖环境下转录。
在一个示例性实施方案中，第二启动子控制毒素基因的转录，使得葡萄糖诱导毒素基因的转录。第一DNA片段在非肿瘤组织中转录，但在实体肿瘤中不转录。
在一个示例性实施方案中，第一DNA片段如SEQ ID No.1所示。在一个示例性实施方案中，第二DNA片段如SEQ ID No.2所示。
在一个示例性实施方案中，第一DNA片段位于第二DNA片段的上游。在一个示例性实施方案中，第一DNA片段位于第一启动子的上游。在一个示例性实施方案中，第一DNA片段位于第二DNA片段的下游。在一个示例性实施方案中，第二启动子位于第一DNA片段的上游。在一个示例性实施方案中，所述第一组成型启动子位于所述第一DNA片段的上游。在一个示例性实施方案中，所述第二组成型启动子位于第二DNA片段的上游。在一个示例性实施方案中，第一启动子如SEQ ID No.3所示。
在一个示例性实施方案中，核酸系统包括由5-6个核苷酸组成的随机序列，并且位于第二DNA片段的紧接上游和第一启动子的下游。在一个示例性实施方案中，随机序列是GCCTT或TGTCT。
在一个示例性实施方案中，核酸系统包括由5-6个核苷酸组成的随机序列，并且位于第一DNA片段的紧接上游和第二启动子的下游。
在一个示例性实施方案中，核酸系统包括由5-6个核苷酸组成的随机序列，并且替换位于第二DNA片段紧接上游的细菌的原始或天然5-6个核苷酸。
在一个示例性实施方案中，核酸系统包括由5-6个核苷酸组成的随机序列，并且替换位于第一DNA片段紧接上游的细菌的原始或天然5-6个核苷酸。
在一个示例性实施方案中，核酸系统包括由5-6个核苷酸组成的随机序列，并且替换第一启动子的原始或天然5-6个核苷酸。在一个示例性实施方案中，核酸系统包括由5-6个核苷酸组成的随机序列，并且替换第二启动子的原始或天然5-6个核苷酸。
在一个示例性实施方案中，随机序列位于第一启动子的下游。在一个示例性实施方案中，随机序列位于第二DNA片段的上游。
在一个示例性实施方案中，随机序列位于第二启动子的下游。在一个示例性实施方案中，随机序列位于第一DNA片段的紧接上游。
在一个示例性实施方案中，所述核酸系统包括编码可选择标记(selectablemarker)的第三DNA片段。在一个示例性实施方案中，所述标记是氯霉素可选择标记(CmR)。在一个示例性实施方案中，所述可选择标记是氯霉素抗性盒。在一个示例性实施方案中，第三DNA片段如SEQ ID No.4所示。
在一个示例性实施方案中，第三DNA片段位于第一DNA片段的下游和第一启动子的上游。在一个示例性实施方案中，第三片段位于第二DNA片段的下游和第二启动子的上游。
在一个示例性实施方案中，所述核酸系统包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4。在一个示例性实施方案中，所述核酸系统包括驱动ccdB表达的组成型启动子，如SEQ ID No.5所示。在一个示例性实施方案中，所述核酸系统包含如SEQ ID No.6所示的rrnB转录终止区，在一个示例性实施方案中，所述核酸系统如SEQ ID No.7所示，在一个示例性实施方案中，所述核酸系统如SEQ ID No.8所示。
在一个示例性实施方案中，核酸系统包括毒素基因、解毒剂基因、控制解毒剂基因转录的第一启动子和毒素基因的组成型启动子。在一个示例性实施方案中，核酸系统包括毒素基因、解毒剂基因、控制毒素基因转录的第二启动子和解毒剂基因的组成型启动子。
在一个示例性实施方案中，所述细菌菌株是革兰氏阳性细菌菌株。在一个示例性实施方案中，所述细菌菌株是革兰氏阴性细菌菌株。
在一个示例性实施方案中，细菌菌株是大肠杆菌。在一个示例性实施方案中，所述细菌菌株选自由大肠杆菌MG1655和大肠杆菌SH1组成的组。
图1B示出了根据一个示例性实施方案的用于构建将大肠杆菌靶向低葡萄糖环境的核酸系统的示意图110。图1B显示了采用随机化的、葡萄糖抑制的乳糖启动子(Plac)和CcdA/CcdB毒素-解毒剂对构建了将大肠杆菌靶向低葡萄糖环境的核酸系统。
CcdB是一种杀死宿主细菌的毒素，而CcdA是一种中和CcdB的解毒剂。在肿瘤靶向的核酸系统中，CcdB组成型表达，而CcdA表达在葡萄糖抑制的乳糖(lac)启动子控制下被葡萄糖抑制。在低葡萄糖环境中，携带该核酸系统的细菌生长良好，因为解毒剂CcdA被去抑制从而中和了CcdB。在生理水平的葡萄糖存在下，CcdA表达被关闭，CcdB被释放以杀死细菌。
在一个示例性实施方案中，在肿瘤靶向的核酸系统中，CcdA组成型表达，而CcdB的表达在葡萄糖诱导的启动子的控制下由葡萄糖诱导。在低葡萄糖环境中，携带这种核酸系统的细菌生长良好，因为毒素CcdB被抑制。在生理水平的葡萄糖存在下，CcdB表达被启动以杀死细菌。
如图1B所示，由5-6个核苷酸(nnnnn)组成的随机化片段替换了ccdA基因起始密码子紧接上游的原始或天然5-6个核苷酸(第二DNA片段的一个实施例)。该随机化片段中的不同序列导致ccdA表达的不同水平。在某些序列中，肿瘤中的葡萄糖水平低到足以激活CcdA的表达以拮抗CcdB的毒性，而正常组织中的葡萄糖水平高到足以在lac启动子的控制下关闭CcdA的表达。在图1B的核酸系统中也使用了可选择标记，例如氯霉素可选择标记(CmR)。
将随机化片段(核酸系统的随机库或DNA库)中具有不同序列的核酸系统插入大肠杆菌染色体中，然后将细菌在含有葡萄糖(Glc(+))或不含葡萄糖(Glu(-))的溶菌肉汤(lysogeny broth(LB))琼脂平板上划线，以筛选在葡萄糖存在下不能生长但在葡萄糖不存在下生长的细菌。箭头112指示在葡萄糖阴性培养基中生长但在含葡萄糖的培养基中不生长的克隆。在一个示例性实施方案中，LB琼脂平板上葡萄糖的浓度是0mM或5mM。
图1C显示了药物递送系统120，其包括基因工程化细菌122，该细菌不仅特异性靶向实体肿瘤，而且通过产生抗癌分子或化合物和/或表达引发抗癌免疫应答的抗原而将抗癌药物124递送至实体肿瘤。
基因工程化细菌122将药物124递送至实体肿瘤并杀死肿瘤细胞。基因工程化细菌122包括本文讨论的核酸系统，使得细菌在实体肿瘤中生长，但不在非肿瘤组织中生长。
提供以下实施例来说明各种实施方案。
实施例1
材料和方法
靶向低葡萄糖环境的工程化大肠杆菌的随机库的构建：
本实施例设计的肿瘤靶向核酸系统由组成型表达的ccdB基因和lac启动子控制下的葡萄糖抑制ccdA基因组成。解毒剂CcdA在生理水平的葡萄糖存在下被抑制，因此毒素CcdB杀死细菌。相反，由于CcdA的表达被去抑制并抵消CcdB的作用，所以细菌在低葡萄糖生长条件下是活的。为了提高CcdA在低葡萄糖条件下在lac启动子控制下拮抗CcdB的能力，或者为了增强CcdB在葡萄糖存在下杀死细菌的能力，通过随机化ccdA基因起始密码子紧接上游的5个核苷酸来构建肿瘤靶向核酸系统的随机库。为了促进通过λ-Red重组技术对染色体进行遗传工程改造，将可选择标记(氯霉素可选择标记(CmR))包括在图1B所示的肿瘤靶向核酸系统中。
具体而言，如图1B所示，通过重叠聚合酶链反应(PCR)生成含有在组成型启动子控制下的ccdB基因、可选择标记(例如loxP-cat-loxP盒)、5个核苷酸(5nt)随机化区和在葡萄糖抑制型启动子(例如lac启动子)控制下的ccdA基因的一组DNA片段(即肿瘤靶向核酸系统)。5nt随机化区允许生成核酸系统的随机库。可选择标记使得可以通过重组工程将核酸系统插入细菌的染色体。然后，使用λ-Red重组工程技术，将核酸系统的库插入大肠杆菌的染色体中。在缺乏葡萄糖的LB培养基中恢复1小时后，将细菌培养物涂布在补充了抗生素(12.5g/ml氯霉素，如果是使用loxP-cat-loxP盒用作可选择标记的话)的缺乏葡萄糖的LB琼脂上。在32℃过夜培养后，在琼脂上形成单独菌落。每个菌落来源于具有在低葡萄糖条件下选择性生长的潜力的单个大肠杆菌的复制，这些菌落形成推定的肿瘤靶向细菌的随机库。在此，CcdB-CcdA对可以被其他毒素-解毒剂对替代。
针对靶向葡萄糖缺乏环境的细菌的库筛选：
使用葡萄糖缺乏的LB培养基进行库筛选，筛选在低葡萄糖条件下选择性生长的细菌。为了筛选随机库，将每个克隆在葡萄糖缺乏的LB琼脂和添加5mM葡萄糖的LB琼脂上划线。在37℃过夜培养后，使用基本培养基M63琼脂进一步评估发现在缺乏葡萄糖的LB琼脂上容易生长但在葡萄糖阳性的LB琼脂上不生长的克隆。除了30mM甘油之外，M63琼脂中还补充了浓度不断增加的葡萄糖。这里，可以用非大肠杆菌MG1655的细菌菌株，使用相同的策略筛选肿瘤靶向的细菌。
工程化细菌的肿瘤靶向功效的体内评估：
六至八周龄裸鼠用于人类癌细胞系的肿瘤移植，六至八周龄免疫活性BALB/c小鼠用于鼠源细胞系的肿瘤移植。将1×107的细菌注射到每只小鼠的尾静脉中。在细菌注射后每三天使用数字卡尺(digital caliper)测量肿瘤大小。在实验结束时，将小鼠安乐死，并取出其肿瘤和器官以确定菌落形成单位。具体地，将1克组织在1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中匀浆。将所得组织悬浮液连续稀释并铺板，并对稀释悬浮液的菌落形成单位进行计数。根据稀释率计算每种组织中的细菌数。如果细菌存在于肿瘤中但不存在于器官中，则认为它们能够特异性靶向肿瘤。
在一个示例性实施方案中，肿瘤靶向的核酸系统由组成型表达的ccdB基因、CmR盒和lac启动子控制的ccdA组成，5nt随机序列位于其起始密码子的紧接上游。这些元件不必按照图1B所示的顺序放置。在一个示例性实施方案中，所述肿瘤靶向的核酸系统由组成型表达的ccdA基因、CmR盒和葡萄糖诱导的启动子控制的ccdB组成，5nt随机序列位于其起始密码子的紧接上游。ccdB-ccdA对可以被其它毒素-抗毒素对所取代。CmR可以被其它可选择标记替代。随机序列中的核苷酸数目不限于五个。
实施例2
在本实施例中使用大肠杆菌MG1655。组成型表达的CcdB、lac启动子控制的CcdA、lac启动子和CmR用于构建肿瘤靶向核酸系统。ccdB基因位于CmR盒的上游，CmR盒位于lac启动子的上游。通过在ccdA基因紧接上游的lac启动子中插入随机片段(在本实施例中为5个核苷酸)产生推定的肿瘤靶向的细菌的随机库。随机库在大肠杆菌菌株MG1655中通过染色体建立。在该随机库中，每个大肠杆菌MG1655变体在染色体中均带有一个lac启动子变体，该lac启动子变体在随机域(randomized domain)中具有独特的5个核苷酸序列。筛选随机库以搜索在低葡萄糖条件下选择性生长的细菌克隆。具体地，该库建立在葡萄糖贫乏的LB琼脂上。然后将所得大肠杆菌克隆分别在含5mM葡萄糖的LB琼脂和不含葡萄糖的LB琼脂上划线，以筛选在葡萄糖存在下不能生长但在葡萄糖不存在下生长的那些。筛选大约1500个克隆，发现6个克隆在葡萄糖阴性培养基中优先生长。
图1D显示了六个大肠杆菌克隆在基本培养基M63琼脂上对葡萄糖的敏感性的图130。纯化6个克隆，过夜培养，并连续稀释。在补充有从0mM Glu至4mM Glu的递增浓度的葡萄糖(Glu)的基本培养基M63中分别滴加10μL稀释的悬浮液，以验证其表型。在6个克隆中，第1和第6个克隆在葡萄糖-阴性培养基琼脂上生长良好，但在葡萄糖存在下生长不良。相反，第2、第3、第4和第5个克隆在葡萄糖-阴性和葡萄糖-阳性培养基琼脂中都显示相当大的生长。鉴于此，第1和第6个克隆(图1D中方框内)是肿瘤靶向细菌的候选者，并分别命名为JY1和JY6(也命名为JY8)。如果进行更多的文库筛选，则可以鉴定出更多的葡萄糖-传感克隆。
在JY1克隆的染色体ccdA基因上游的随机序列是GCCTT。JY1的核苷酸序列包括SEQID NO.5所示的序列。在克隆JY6染色体ccdA基因上游的随机序列是TGTCT。
菌株JY1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号14577。菌株JY6保藏在CGMCC，保藏号为14578。
实施例3
工程化的大肠杆菌变体JY1和JY6对葡萄糖敏感，在葡萄糖存在下无法体外生长。本实施例提供了体内实验和数据，表明肿瘤中的葡萄糖水平低到JY1和JY6足以存活和生长。JY1和JY6分别注射到具有CT26(鼠结肠直肠癌细胞系)肿瘤(107cfu/小鼠)的具有免疫活性的BALB/c小鼠的尾静脉中。亲本菌株MG1655用作对照。尾静脉注射后15天，分析细菌在肿瘤和肝中的分布。选择肝脏用于分析是因为它比其它器官更容易受到细菌感染。
图2A-2F显示了大肠杆菌JY1和JY6特异性靶向小鼠的肿瘤。误差棒，SEM.*P＜0.05，**P＜0.01。
图2A显示BALB/c小鼠中每克CT26肿瘤的菌落形成单位(CFU)200。如图2A所示，JY1、JY6和MG1655在BALB/c可比性地定殖在小鼠中的CT26肿瘤，它们在肿瘤中的水平超过108cfu/g。这些数据表明JY1和JY6都是免疫活性BALB/c小鼠携带的CT26肿瘤中的良好定殖菌。
图2B显示了在具有CT26肿瘤的BALB/c小鼠中每克肝脏CFU210。如图2B所示，JY1没有在具有CT26肿瘤的BALB/c小鼠的肝脏中定殖。JY6在具有CT26的BALB/c小鼠的肝脏中定殖的程度低于MG1655。图2C表示在具有CT26肿瘤的BALB/C小鼠中JY1、JY6和MG1655定殖肝的百分比220。如图2C所示，JY6在20％的具有CT26肿瘤的BALB/C小鼠肝脏中检出(5只中的1只)，JY1在任何小鼠肝脏中都没有检出，而MG1655定殖发生在60％小鼠肝脏中(5只中的3只)。这些结果表明JY1和JY6比MG1655更特异于肿瘤，JY1比JY6更特异于肿瘤。
进一步的涂板分析表明，JY1也在免疫活性小鼠的血液和包括脾、心、肺和肾在内的器官中缺失。尽管JY1和JY6显示出在CT26肿瘤中定殖的能力，但JY1在特异性靶向免疫活性小鼠的肿瘤方面优于JY6。
在携带皮下HCT116(人结肠直肠癌细胞系)肿瘤的免疫受损裸鼠中进行类似的实验。在尾静脉注射细菌(107cfu/小鼠)后7天，分析细菌在肿瘤和肝中的分布。图2D显示了每克裸鼠HCT116肿瘤的CFU230。如图2D所示，JY1、JY6和MG1655在裸鼠中定殖了HCT116肿瘤。图2E显示了具有HCT116肿瘤的裸鼠中每克肝脏CFU 240。如图2E所示，JY1没有在HCT116肿瘤裸鼠的肝脏中定殖。JY6在HCT116肿瘤裸鼠肝脏中的定殖程度低于MG1655。图2F显示在具有HCT116的裸鼠中JY1、JY6和MG1655定殖肝脏的百分比250。如图2F所示，JY6和MG1655分别在28.57％(7只中的2只)和85.71％(7只中的6只)的裸鼠肝脏中得到检测。同样，JY1在任何小鼠的肝脏中都不存在(n＝6)。这些结果表明JY1和JY6在免疫受损免疫低下小鼠中比MG1655对肿瘤更特异，JY1在免疫受损小鼠中比JY6对肿瘤更特异。
为了保证JY1不感染正常组织，进一步检查细菌处理组中每只小鼠的脾、心、肺和肾的匀浆悬浮液和血液。所有这些都不具JY1。尽管JY1避免了感染器官，但它很容易在HCT116肿瘤中定殖，并且在肿瘤中的水平达到3.79×107cfu/g(图2D)。综合考虑，体内数据表明JY1和JY6细菌携带的肿瘤靶向核酸系统使它们能特异性地靶向免疫活性和免疫受损的小鼠的实体肿瘤，而JY1在靶向实体肿瘤的能力上优于JY6。
实施例4
接下来，将由JY1携带的靶向葡萄糖的核酸系统移植到大肠杆菌SH1的染色体中，以表明该核酸系统并不局限于特定的细菌菌株。
从健康女性志愿者提供的粪便样本中分离出大肠杆菌SH1。将粪便样品重悬于PBS缓冲液中，并涂布在补充有1mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和X-gal(0.06mg/ml)的LB琼脂上。大肠杆菌形成蓝色菌落与其它细菌种类区分。SH1是粪便大肠杆菌分离株之一。SH1菌株保藏于CGMCC，保藏号为14580。
得到的重组大肠杆菌菌株称为JYH1。所述菌株JYH1保藏于CGMCC，保藏号14579。
然后将JYH1静脉注射到具有皮下SW480(一种人结肠直肠癌细胞系)肿瘤的裸鼠中。在静脉注射细菌后90天，分析小鼠在肿瘤和器官中的细菌定殖。因为四只JYH1处理的小鼠的肿瘤完全治愈，所以在这个组中只有两个肿瘤可用于分析。从两个肿瘤之一中检测到JYH1，达到1.8×108cfu/g。
它显示了当模块或核苷酸系统被导入大肠杆菌SH1中时，得到的菌株不仅可以靶向肿瘤，而且可以治疗肿瘤。
图3A和3B示出了大肠杆菌JYH1特异性靶向SW480肿瘤，但未在裸鼠正常组织中定殖，而未被肿瘤靶向核苷酸体系统工程改造的同基因菌株(isogenic strain)SH1hly则在肿瘤和正常组织中定殖。*P＜0.05。误差棒，SEM。
图3A显示了在患有SW480的裸鼠中每克肝和脾组织CFU 300。图3B显示310％的肝脏和脾脏器官被JYH1和SH1hly感染。如图3A和3B所示，JYH1没有在肝或脾中定殖。所有JYH1处理的裸鼠的肝、脾、心脏、肺、肾都不具JYH1，这表明葡萄糖-传感模块能够将JYH1限制在肿瘤中，并且能够防止其长时间扩散到远处的器官。与JYH1相反，没有葡萄糖传感模块的同基因菌株SH1hly不仅定殖了肿瘤(9.35×108±5.97×108cfu/g，均值±SEM)，而且定殖了器官。当在第82天分析时，四只SH1hly处理的小鼠(80％，5只中的4只)的肝脏(6.0×1010±6.0×1010cfu/g，均值±SEM)和脾(1.85×105±9.74×104cfu/g，均值±SEM)被SH1hly感染。
在感染的小鼠中，一只小鼠出现肝脓肿，如图3C所示。照片320是在第82天对小鼠实施安乐死以供分析时拍摄的。
JYH1的肿瘤特异性和对葡萄糖传感的肿瘤靶向核酸系统的需求也可以通过肝切片330的苏木精和伊红(H&E)染色来证实，这表明JYH1处理的小鼠的肝脏正常，而SH1hly处理的小鼠肝脏发生大量的炎症浸润和脓肿，如图3D所示(比例尺，200μm)。综合考虑，这些数据证明葡萄糖传感的肿瘤靶向核酸系统优化了JYH1在裸鼠中的肿瘤特异性。
实施例5
测试JYH1在免疫活性小鼠中特异性地定殖肿瘤的能力。将JYH1静脉给药于携带CT26肿瘤的免疫活性BALB/c小鼠。细菌注射后14天，由于过度的肿瘤生长，所有小鼠被安乐死。图4显示BALB/c小鼠中每克正常组织和CT26肿瘤的CFU 400。对匀浆组织的铺板分析表明，在第14天，静脉注射的JYH1没有在免疫活性小鼠的任何受试器官中定殖，包括肝脏、脾脏、心脏、肺和肾脏。相反，如图4所示，JYH1在肿瘤中的水平达到4.67×107cfu/g(±1.62×107cfu/g)。这些数据与裸鼠的数据一起表明JYH1特异性靶向实体肿瘤，而与免疫系统的完整性无关。
图5显示了构建通过在葡萄糖缺乏环境中选择性生长而靶向实体肿瘤的基因工程化细菌菌株的方法500。
方框510说明了将核酸系统插入细菌菌株中。
在一个示例性实施方案中，核酸系统包括编码毒素的第一DNA片段、编码使毒素无效的解毒剂的第二DNA片段。核酸系统还包括控制第二DNA片段转录的第一启动子。所述核酸系统还包括引起第一DNA片段组成型表达的第一组成型启动子。
在一个示例性实施方案中，核酸系统包括编码毒素的第一DNA片段、编码使毒素无效的解毒剂的第二DNA片段。核酸系统还包括控制第一DNA片段转录的第二启动子。所述核酸系统还包括引起第二DNA片段组成型表达的第二组成型启动子。
在一个示例性实施方案中，毒素-解毒剂对包括但不限于CcdB-CcdA对。其它毒素-解毒剂对如AvrRxo1-Arc1、Hha-TomB和PaaA2-ParE2可用于替代CcdB-CcdA对。在一个示例性实施方案中，第一启动子包括但不限于lac启动子。lac启动子可以被其它葡萄糖抑制型启动子如gltA、sdhADC或tnaB的启动子所取代。在一个示例性实施方案中，第二启动子包括但不限于ptsG的启动子、fruB的启动子和ackA的启动子。
在一个示例性实施方案中，插入由5-6个核苷酸组成的随机序列以替换ccdA基因起始密码子紧接上游和第一启动子下游的天然5-6个核苷酸。
在一个示例性实施方案中，插入由5-6个核苷酸组成的随机序列以取代ccdB基因起始密码子紧接上游和第二启动子下游的天然5-6个核苷酸。
方框512说明了培养基因工程化细菌菌株的克隆。
在一个示例性实施方案中，将核酸系统移植到细菌菌株的染色体中。在一个示例性实施方案中，将核酸系统移植到质粒中，并将质粒插入细菌菌株中。在一个示例性实施方案中，细菌菌株包括但不限于大肠杆菌MG1655。其它大肠杆菌菌株如DH5α和CFT073和其它革兰氏阴性细菌如沙门氏菌和志贺氏菌属可以用于替代MG1655。在一个示例性实施方案中，包括核酸系统的细菌菌株的克隆在含有或不含葡萄糖的LB琼脂上培养。
方框514说明了选择在葡萄糖不存在下生长但在葡萄糖存在下不生长的克隆，从而获得肿瘤靶向的基因工程化细菌菌株。
在一个示例性实施方案中，选择在不含葡萄糖的LB琼脂中生长但在含5mM葡萄糖的LB琼脂中不生长的克隆，并将其鉴定为肿瘤靶向的细菌的潜在候选物。
在一个示例性实施方案中，在不含葡萄糖的M63琼脂中生长但在1-4mM的葡萄糖浓度下不生长的克隆被证实为肿瘤靶向的细菌的潜在候选物。
在一个示例性实施方案中，所述方法还包括当所述核酸系统包含第一启动子时，通过插入由5-6个核苷酸组成的随机序列以替换位于第二DNA片段紧接上游的天然核苷酸，从而产生所述核酸系统的随机库。
在一个示例性实施方案中，所述方法还包括当所述核酸系统包含第二启动子时，通过插入由5-6个核苷酸组成的随机序列以替换位于第一DNA片段紧接上游的天然核苷酸，从而产生所述核酸系统的随机库。
实施例6
本实施例表明大肠杆菌SH1对癌细胞系具有细胞毒性。SW480和HCT116是结肠直肠癌细胞系。ASPC-1、Mia-capa-2和panc-1是胰腺癌细胞系。将每种细胞系与大肠杆菌菌株SH1或MG1655以100的moi共培养。作为对照，细胞系也与单独的PBS共培养。4小时后，用PBS洗涤细胞，用1％结晶紫染色5分钟。再次洗涤染色的细胞，用95％乙醇脱色，并在570nm测量。使用下式计算被共培养的细菌杀死的细胞的百分比：(对照-处理)/对照×100。误差棒，SEM。***P＜0.001。
大肠杆菌SH1对人癌细胞系的体外细胞毒性作用600和602显示在图6A和6B中。图6A显示了大肠杆菌SH1对SW480和HCT116细胞具有细胞毒性作用，而大肠杆菌MG1655对这些细胞没有明显细胞毒性作用。图6B显示了大肠杆菌SH1对ASPC-1、Mia-capa-2和panc-1细胞具有细胞毒性作用，而大肠杆菌MG1655对这些细胞没有明显的细胞毒性作用。
实施例7
在本实施例中，评价了静脉注射的大肠杆菌JYH1对体内肿瘤生长的抑制作用。
图7A显示了静脉注射大肠杆菌JYH1对HCT116肿瘤在裸鼠中生长的抑制作用700。静脉注射JYH1抑制HCT116肿瘤在裸鼠中的生长。相反，JY1与PBS对照相比对肿瘤生长的影响很小。JY1-处理的小鼠的HCT116肿瘤与PBS-处理的对照组的生长同样好，而JYH1-处理的小鼠的HCT116肿瘤生长相对较慢，并且在静脉注射细菌后18-26天(107/小鼠)，其中50％(10只中的5只)开始消退。JYH1对HCT116肿瘤生长的抑制效果在100％的试验小鼠中都有表现(n＝10)，这表明其抗肿瘤效果明显好于JY1(Fisher精确试验，p＜0.0001)。
图7B显示了静脉注射大肠杆菌JYH1对裸鼠SW480肿瘤生长的抑制作用的分析702。图7C显示了0和55天的PBS处理小鼠中SW480肿瘤的代表性照片704。图7D显示了0天和90天的JYH1处理的小鼠中SW480肿瘤的代表性照片706。监测SW480肿瘤的生长长达90天。JYH1处理的小鼠(n＝6)在静脉注射JYH1后26-52天肿瘤消退，有效百分比为100％。其中，66.7％的小鼠(6只中的4只)的肿瘤消失，并且在实验结束时没有复发。剩余两只小鼠之一的肿瘤没有治愈，而是保持静止(quiescent)。仅一只小鼠的肿瘤复发(16.67％，6只中的1只)。相反，PBS处理的肿瘤都不退化或消失。这些数据进一步表明JYH1对体内肿瘤生长具有显著的抑制作用。
因此，在一个示例性实施方案中，当细菌具有肿瘤靶向核酸系统时，对肿瘤细胞和正常组织细胞都有毒性的细菌可以变得对肿瘤特异并抑制肿瘤生长而不影响正常组织。
本文所用的术语“治疗”是指减轻、缓解或改善疾病或病症症状、预防其它症状、缓解或预防症状的潜在代谢原因、抑制疾病或病症、阻止疾病或病症的发展、缓解疾病或病症、使疾病或病症消退、缓解由疾病或病症引起的病症、或预防性和/或治疗性地停止疾病或病症的症状的方法。
如本文所用，“紧接(immediately)”、“紧接上游”或“紧接下游”是指在一个DNA片段和另一个DNA片段之间没有其它核苷酸。
如本文所用，“系统”是指包括毒素基因、解毒剂基因及其相应启动子的组合或遗传回路。该系统的毒素基因和解毒剂基因可以以任何顺序放置。该系统的毒素基因和解毒剂基因可以位于相同的分子中或不同的分子中。在一个示例性实施方案中，毒素基因和解毒剂基因之一可以在细菌的染色体中，而另一个基因可以在同一细菌的质粒中。
序列表
<110> 新实有限公司（New Portal Limited）
<120> 使细菌能够通过葡萄糖依赖性生存力特异性靶向实体肿瘤的核酸系统
<130> N026.001.NPOCN
<160> 8
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 306
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 1
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<210> 2
<211> 219
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<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
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<211> 2710
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 另一个示例实施方案的核酸系统
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gttatacaca gccagtctgc aggtcgacca tagtgactgg atatgttgtg ttttacagta 720
ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta tatcatttta 780
cgtttctcgt tcagctttct tgtacaaagt ggtgatcaag cttgaaggta agcctatccc 840
taaccctctc ctcggtctcg attctacgcg taccggtcat catcaccatc accattgagt 900
ttaaacggtc tccagcttgg ctgttttggc ggatgagaga agattttcag cctgatacag 960
attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg cagtagcgcg 1020
gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc cgatggtagt 1080
gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat caaataaaac gaaaggctca 1140
gtcgaaagac tgggccttaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca agaattccga 1200
tcatattcaa taacccttaa tataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttattaggt 1260
ctgaagagga gtttacgtcc agccaagctt aggatcccgg gtaccgatat cggcagcatc 1320
acccgacgga ctttgcgccg aataaatacc tgtgacggaa gatcacttcg cagaataaat 1380
aaatcctggt gtccctgttg ataccgggaa gccctgggcc aacttttggc gaaaatgaga 1440
cgttgatcgg cacgtaagag gttccaactt tcaccataat gaagtaagat cactaccggg 1500
cgtatttttt gagttatcga gattttcagg agctaaggaa gctaaaatgg agaaaaaaat 1560
cactggatat accaccgttg atatatccca atggcatcgt aaagaacatt ttgaggcatt 1620
tcagtcagtt gctcaatgta cctataacca gaccgttcag ctggatatta cggccttttt 1680
aaagaccgta aagaaaaata agcacaagtt ttatccggcc tttattcaca ttcttgcccg 1740
ccagatgaat gctcatccgg aattccgtat ggcaatgaaa gacggtgagc tggtgatatg 1800
ggatagtgtt cacccttgtt acaccgtttt ccatgagcaa actgaaacgt tttcatcgct 1860
ctggagtgaa taccacgacg atttccggca gtttctacac atatattcgc aagatgtggc 1920
gtgttacggt gaaaacctgg cctatttccc taaagggttt attgagaata tgtttttcgt 1980
ctcagccaat ccctgggtga gtttcaccag ttttgattta aacgtggcca atatggacaa 2040
cttcttcgcc cccgttttca ccatgggcaa atattatacg caaggcgaca aggtgctgat 2100
gccgctgacg attcaggttc atcatgccgt ttgtgatggc ttccatgtcg gcagaatgct 2160
taatgaatta caacagtact gcgatgagtg gcagggcggg gcgtaatttt tttaaggcag 2220
ttattggtgc ccttagatat caagcttagg atccggaacc cttaatataa cttcgtataa 2280
tgtatgctat acgaagttat taggtccctc gaagaggttc actaatgcag ctggcacgac 2340
aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact 2400
cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg 2460
agcggataac aatttcacac aggaaatgtc tatgaagcag cgtattacag tgacagttga 2520
cagcgacagc tatcagttgc tcaaggcata tgatgtcaat atctccggtc tggtaagcac 2580
aaccatgcag aatgaagccc gtcgtctgcg tgccgaacgc tggaaagcgg aaaatcagga 2640
ggggatggct gaggtcgccc ggtttattga aatgaacggc tcttttgctg atgagaacag 2700
ggactggtga 2710
<210> 8
<211> 2710
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 另一个示例实施方案的核酸系统
<400> 8
aacgcgtgga tccggcttac taaaagccag ataacagtat gcgtatttgc gcgctgattt 60
ttgcggtata agaatatata ctgatatgta tacccgaagt atgtcaaaaa gaggtgtgct 120
atgaagcagc gtattacagt gacagttgac agcgacagct atcagttgct caaggcatat 180
atgatgtcaa tatctccggt ctggtaagca caaccatgca gaatgaagcc cgtcgtctgc 240
gtgccgaacg ctggaaagcg gaaaatcagg aagggatggc tgaggtcgcc cggtttattg 300
aaatgaacgg ctcttttgct gacgagaaca gggactggtg aaatgcagtt taaggtttac 360
acctataaaa gagagagccg ttatcgtctg tttgtggatg tacagagtga tattattgac 420
acgcccgggc gacggatggt gatccccctg gccagtgcac gtctgctgtc agataaagtc 480
tcccgtgaac tttacccggt ggtgcatatc ggggatgaaa gctggcgcat gatgaccacc 540
gatatggcca gtgtgccggt ctccgttatc ggggaagaag tggctgatct cagccaccgc 600
gaaaatgaca tcaaaaacgc cattaacctg atgttctggg gaatataaat gtcaggctcc 660
gttatacaca gccagtctgc aggtcgacca tagtgactgg atatgttgtg ttttacagta 720
ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta tatcatttta 780
cgtttctcgt tcagctttct tgtacaaagt ggtgatcaag cttgaaggta agcctatccc 840
taaccctctc ctcggtctcg attctacgcg taccggtcat catcaccatc accattgagt 900
ttaaacggtc tccagcttgg ctgttttggc ggatgagaga agattttcag cctgatacag 960
attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg cagtagcgcg 1020
gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc cgatggtagt 1080
gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat caaataaaac gaaaggctca 1140
gtcgaaagac tgggccttaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca agaattccga 1200
tcatattcaa taacccttaa tataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttattaggt 1260
ctgaagagga gtttacgtcc agccaagctt aggatcccgg gtaccgatat cggcagcatc 1320
acccgacgga ctttgcgccg aataaatacc tgtgacggaa gatcacttcg cagaataaat 1380
aaatcctggt gtccctgttg ataccgggaa gccctgggcc aacttttggc gaaaatgaga 1440
cgttgatcgg cacgtaagag gttccaactt tcaccataat gaagtaagat cactaccggg 1500
cgtatttttt gagttatcga gattttcagg agctaaggaa gctaaaatgg agaaaaaaat 1560
cactggatat accaccgttg atatatccca atggcatcgt aaagaacatt ttgaggcatt 1620
tcagtcagtt gctcaatgta cctataacca gaccgttcag ctggatatta cggccttttt 1680
aaagaccgta aagaaaaata agcacaagtt ttatccggcc tttattcaca ttcttgcccg 1740
ccagatgaat gctcatccgg aattccgtat ggcaatgaaa gacggtgagc tggtgatatg 1800
ggatagtgtt cacccttgtt acaccgtttt ccatgagcaa actgaaacgt tttcatcgct 1860
ctggagtgaa taccacgacg atttccggca gtttctacac atatattcgc aagatgtggc 1920
gtgttacggt gaaaacctgg cctatttccc taaagggttt attgagaata tgtttttcgt 1980
ctcagccaat ccctgggtga gtttcaccag ttttgattta aacgtggcca atatggacaa 2040
cttcttcgcc cccgttttca ccatgggcaa atattatacg caaggcgaca aggtgctgat 2100
gccgctgacg attcaggttc atcatgccgt ttgtgatggc ttccatgtcg gcagaatgct 2160
taatgaatta caacagtact gcgatgagtg gcagggcggg gcgtaatttt tttaaggcag 2220
ttattggtgc ccttagatat caagcttagg atccggaacc cttaatataa cttcgtataa 2280
tgtatgctat acgaagttat taggtccctc gaagaggttc actaatgcag ctggcacgac 2340
aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact 2400
cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg 2460
agcggataac aatttcacac aggaaagcct tatgaagcag cgtattacag tgacagttga 2520
cagcgacagc tatcagttgc tcaaggcata tgatgtcaat atctccggtc tggtaagcac 2580
aaccatgcag aatgaagccc gtcgtctgcg tgccgaacgc tggaaagcgg aaaatcagga 2640
ggggatggct gaggtcgccc ggtttattga aatgaacggc tcttttgctg atgagaacag 2700
ggactggtga 2710

Claims (12)

1.一种核酸系统，其被引入细菌菌株中以产生在实体肿瘤中生长但不在非肿瘤组织中生长的基因工程化细菌菌株，所述核酸系统包含：
编码毒素基因的第一DNA片段，所述毒素基因表达杀死所述基因工程化细菌菌株的毒素；
编码解毒剂基因的第二DNA片段，所述解毒剂基因表达使所述毒素无效的解毒剂；
第一启动子，其控制所述解毒剂基因的转录，使得葡萄糖抑制所述解毒剂基因的转录；以及
第一组成型启动子，其引起毒素基因的组成型表达；
其中所述第二DNA片段在实体肿瘤中转录，但在非肿瘤组织中不转录；
其中所述第一启动子是lac启动子；
其中毒素和解毒剂的对是CcdB-CcdA对；
核酸系统还包括：
由5-6个核苷酸组成的随机序列，并且其取代了基因工程化细菌菌株的原始5-6个核苷酸，其位于所述第二DNA片段的紧接上游；
其中所述随机序列是GCCTT或TGTCT。
2.根据权利要求1所述的核酸系统，其中所述第一启动子位于所述第二DNA片段的紧接上游。
3.根据前述权利要求1所述的核酸系统，其中所述第一组成型启动子位于所述第一DNA片段的紧接上游。
4.根据权利要求1所述的核酸系统，其中所述第一DNA片段如SEQ ID No. 1所示，并且所述第二DNA片段如SEQ ID No.2所示。
5.根据权利要求1所述的核酸系统，其中所述第一启动子如SEQ ID No.3所示。
6.根据权利要求1所述的核酸系统，其还包括：
编码氯霉素抗性盒的第三DNA片段，
其中第三DNA片段如SEQ ID No. 4所示。
7.根据权利要求1所述的核酸系统，其中所述细菌菌株选自由大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌组成的组。
8.根据权利要求1所述的核酸系统，其中所述细菌菌株是大肠杆菌MG1655或SH1。
9.根据权利要求1所述的核酸系统，其中所述核酸系统如SEQ ID No. 7或SEQ ID No.8所示。
10.一种构建靶向肿瘤的基因工程化细菌菌株的方法，所述方法包括：
将核酸系统插入细菌菌株中，所述核酸系统包括：
编码毒素基因的第一DNA片段，所述毒素基因表达杀死所述基因工程化细菌菌株的毒素；
编码解毒剂基因的第二DNA片段，所述解毒剂基因表达使毒素无效的解毒剂；
第一启动子，其控制所述解毒剂基因的转录，使得葡萄糖抑制所述解毒剂基因的转录；以及
第一组成型启动子，其引起毒素基因的组成型表达；
其中所述第一启动子是lac启动子；
其中毒素和解毒剂的对是CcdB-CcdA对；
通过插入由5-6个核苷酸组成的随机序列以替换位于第二DNA片段紧接上游的天然核苷酸，产生核酸系统的随机库；
培养包括所述核酸系统的所述基因工程化细菌菌株的克隆；以及
选择在葡萄糖不存在下生长但在葡萄糖存在下不生长的克隆，从而获得靶向肿瘤的基因工程化菌株，
其中所述第二DNA片段在实体肿瘤中转录，但在非肿瘤组织中不转录。
11.根据权利要求10所述的方法，其中选择在0 mM葡萄糖浓度下生长但在5 mM葡萄糖浓度下不生长的所述克隆作为靶向所述肿瘤的所述基因工程化细菌菌株。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述核酸系统是权利要求1-9中任一项的核酸系统。
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